[go: up one dir, main page]

CZ2190U1 - Směrované polymerní konjugáty cyklosporinu - Google Patents

Směrované polymerní konjugáty cyklosporinu Download PDF

Info

Publication number
CZ2190U1
CZ2190U1 CZ19942318U CZ231894U CZ2190U1 CZ 2190 U1 CZ2190 U1 CZ 2190U1 CZ 19942318 U CZ19942318 U CZ 19942318U CZ 231894 U CZ231894 U CZ 231894U CZ 2190 U1 CZ2190 U1 CZ 2190U1
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cyclosporin
mol
bound
units
targeted
Prior art date
Application number
CZ19942318U
Other languages
English (en)
Inventor
Alexandr Rndr. Csc. Jegorov
Vladimír Ing. Csc. Maťha
Karel Ulbrich
Jiří Strohalm
Blanka Říhová
Lubor Fornůsek
Original Assignee
Alexandr Rndr. Csc. Jegorov
Vladimír Ing. Csc. Maťha
Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr
Mikrobiologický Ústav Av Čr
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alexandr Rndr. Csc. Jegorov, Vladimír Ing. Csc. Maťha, Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr, Mikrobiologický Ústav Av Čr filed Critical Alexandr Rndr. Csc. Jegorov
Publication of CZ2190U1 publication Critical patent/CZ2190U1/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)

Description

Oblast techniky
Technické řeěení polymerních konjugátů
cyklosporinů s účinkem imunosupresním, které sestávají inertního polymerní ho nosiče na nějž jsou kovalentně vázány cyklické undek a pep ti d y cyklosporiny spolu s proti látkami,
je dosahováno cílené směrovaného imunosupresní ho účin ku.
Dosavadní ...s.t.ay techniky.
Cyklosporin A je cyklický undekapeptid, jehož struktura je popsána vzorcem;
MeBm t-tx-Abu-Sar—MeLeu-Va 1 -MeLeu-A 1 a-< D) -A 1 a-MeL.eu-MeL.eu—NeVa 1,
1 2 3 4 '5 6 z s · 9 10 11
kde MeBmt je HQOC-CH(NHCHs : )—CH(OH)- -CH(CH3) -OH--CH=CH-CH3,
1 2 7; 4 5 6 7 8
tj. (2S,3R,4R,6E)-3-hydroxy-4-methy 1 -2-methy1amino-6-Dktenová kyselina
Vedle cyklosporinu by 1 a isolována řada
L cyklosporinů, které jsou odvozeny od cyklosporinu A substitucí jednotlivých aminokyselin
13, 19B7
). Tyto cyklosporiny jsou přirozeným něk terých kultivac í druhů deuteromycet a vysokoprodukčních kmenů jsou hub, průmyslově např produkovány rodu Tolypocladium.
(Československé AO 2624 a AO 2625 ). Nevýhodou přírodních cyklosporinů je, že nemají aktivní skupinu, která by mohla být použita např, k vazbě na nosič, vyjma —OH skupiny, jejíž chemická vazba však vede ke ztrátě aktivity derivátů. Semisyntetický je možno připravit deriváty nesoucí funkční skupinu aniž by byla imunosupresní aktivita cyk1osporinů (Československé PV
6498/89 a PV 6499/89 ). AIternativním, avšak náročnějším způsobem přípravy je totální syntéza, pomocí níž byly připraveny i některé další deriváty cyklosporinů s různými funkčními skupinami ( evropské patenty EP 34567 a EP 194972, Progress in the Chemistry of Drganic Natural Products 50, 124, 1986 ) .
Cyk1osporin A je v humánní medicíně používán jako imunosupresivum při transplantacích, mimoto cyklosporiny vykazují účinky antiarythmické, antiparasitické, napomáhají při léčbě autoimunitních onemocnění včetně AIDS a jsou testovány i pro další klinické indikace. Vedle léčebného působení vykazují cyk1osporiny i nepříznivé vedlejší účinky, podmíněné poměrně vysokou terapeutickou dávkou, jenž spočívají v jejich nefrotoxicitě (Transplant. Proceedings 17, neurotoxicitě (Transplant. Proceedings 20, a hepatotoxicitě (Transplant.
Proceedings 15,
Suppl.
1983).
Podstata tec.hnick.éhQ.. řešení
Odstranění této nevýhody je dosahováno způsobem podle technického řešení, jehož podstatou ... je cílené směrování cyklosporinů navázaných na inertní polymerní nosič spolu s protilátkami jakožto determinantami specifického účinku.
Výhoda uvedeného způsobu spočívá v tom, že při použití takto c íleně směrovaných polymernich konjugátů cyklosporinů je možno použ í t nižší množství účinné, látky, jimiž jsou navázané cy k1osporiny, ve srovnání s použitím čistých cyklosporinů, přičemž hlavní tom, že cíleným směrováním jsou zároveň podstatně sníženy nežádoucí vedlejší účinky.
Směrovaný polymermí konjugát cyklosporinů se vyznačuje tím, že jako polymerní nosič obsahuje 40-700 zpolymerizovaných monomerních jednotek tvořených z 20-99X mol. biologicky inertních hydrofilních jednotek jimiž jsou N-(2-hydroxypropy1ímethakry1amid, N-viny1pyrrolidon nebo kyseliny akrylová a methakrylová ve formě sodných solí, s výhodou N-(2-hydroxypropy1)methakry1 amid, 0,1-25% mol. jednotek methakryloylovaných aminokyselin nebo methakryloylovaných oligopeptidů s terminálně vázaným cyk1osporinem a 0-10% mol. jednotek methakry1oylovaných aminokyselin nebo oligopeptidů, ke kterým je navázána protilátka jakožto determinanta transportu k cíleným buňkám.
Uvedené směrované polymerní konjugáty cyklosporinu jsou v případě použití N-(2-hydroxypropy1)methakrylamidu jako základní monomerní jednotky popsány vzorcem:
-E-CH2-C(CH3)(CD-Ri)-3x-E-t-CH2-C(CH3)(C0-R2)-Jy-L-CH--C(CHs) (C0-R-, )-j2-, kde x je v rozmezí 20-99% mol., y je v rozmezí 0,1-25% mol., z je v rozmezí 0-10% mol., R± je NH-CHs-CH(OH)-CH3, R2 je aminokyselina nebo cligopeptidická , sekvence s terminálně navázaným cyklosporinem a R-< je aminokyselina nebo oligopeptidická sekvence s navázanou protilátkou. V případě použití jiných výše uvedených hydrofiIních monomerů jako základních monomem í ch jednotek jsou směrované polymerní konjugáty cyklosporinu popsány analogickým.-vzorcem, kde výraz pro x = 20-99% odpovídá molárnímu zastoupení daného monomeru. nebo součtu molárního zastoupení více těchto monomerů v případě, že jsou pro kopolymeraci použity jejich směsi.
Biologicky účinnou složkou polymern í ho konjugátu cyklosporinu je cyklosporin kcvalentně vázaný na aminokyselinu nebo oligopeptidickou sekvenci. K vazbě na aminokyselinu nebo oligopeptidickou sekvenci se používají cyklospcriny vykazující požadované immunosupresní nebo jiné biologické aktivity, které zároveň ve své struktuře nesou dostatečně chemicky reaktivní funkční skupiny, s výhodou primární nebo sekundární aminoskupinu, skupinu hydrazinovou nebo aldehydickou. S výhodou lze použít zejména semisyntetické deriváty přírodních cyklosporinů, jimiž jsou např. deriváty cyklosporinu A popsané v československých Fv
6498/89 a PV 6499/89. Alternativně lze použít deriváty s méně reaktivními funkčními skupinami aktivované běžně známými postupy, např. prostřednictvím karbodiimidíl nebo bifunkčních aktivních esterů. Podle typu derivátu cyklosporinu je jeho cyklický skelet vázán buú přímo na terminální aminokyselinu, tj. amidickou vazbou v případě amino-cyklosporinu, nebo prostřednictvím bifunkčního raménka, tj. např. diaminu vázaného jednak amidicky na terminální aminokyselinu, lou konjugací volnou aminoskupinou diaminu a následnou redukcí na nosič se používají běžné biogenní aminokyseliny, jako jsou slanin, am i n o k a p ronov á kyselina nebo fenylalanin, případně jejich oligopeptidické sekvence, např
GlyGly,
GlyPheLeuGly,
G1yLeuPheG1y, LeuGlyLeuGly, GlyLeuGly nebo GlyValGly. S výhodou se používají polymerní konju.gáty cyklosporinu s oligopeptidickými sekvencemi mezi polymerním nosičem a cyklosporinem, které jsou štěpitelné vnitrobuněčnými (lysosomálními) enzymy.
K cílenému směrování se používají bilkoviny, pro které je na cílové tkáni exprimován receptor.
Cílené směrování účinku polymerních konjugátů cyklosporinu je dosahováno navázáním protilátek proti receptářům exprimovaným jako jsou anti Thy 1.2 u myšího systému nebo pan T,
t. j . anti
CD3 u lidí. Směrování za účelem zvýšení imunosupresivního účinku je alternativně dosahováno protilátkami namířenými proti tzv. CD determinantám, exprimovaným na površích B nebo T buněk, protilátkami proti ostatním receptorftm na buňkách imunitního systému jakými jsou makrofágy, žírné buňky a tělní buňky exprimující MHC antigeny I nebo II třídy.
Směrování biologického účinku je alternativně dosahováno např. některými hormony, karbohydráty, lektiny a v případě léčby autoimunitních chorob anti idiotypovými proti látkami. Směrování je dosahováno jak polyk.lonálními tak monoklonálními proti 1átkami. Protilátky se váží na nosič buii specificky, tj. bez zásahu do vazebného místa protilátky, např. přes Fc fragment, nebo nespecificky prostřednictvím volných aminoskupin.
Syntéza polymerních konjugátů cyklosporinu se provádí buů třístupňové nebo dvoustupňové. Při třístupňovém provedení se v prvém stupni připraví polymerní nosič opatřený vhodnými •funkčními skupinami pro vazbu cyklosporinu a protilátky. Ve druhém stupni se navazuje vhodný derivát cyklosporinu a ve třetím stupni se na zbylé funkční skupiny navazuje protilátka. Při tomto způsobu provedení jsou jak cyklosporin, tak protilátka vázány na stejný aminokyselinový nebo oligopeptidický fragment. Při dvoustupňovém provedení se v prvém stupni kopolymer připravuje již z monomeru s navázanými cyk 1 osporinem a kopolymerace se provád í spolu metak roy1aminokyselinami nebo me t ha k roy1o1 i gope p t i dy nesoucími vazebná místa pro vazbu proti látky, ve druhem kroku se na volná vazebná místa váže protilátka. Při tomto dvoustupňovém způsobu provedení mohou být cyklosporin a protilátka vázány prostřednictvími různých fragmentů.
Při třístupňovém provedení syntézy se kopolymer tvořený
40-700 monomerními jednotkami v prvé fázi připravuje radikálovou kopolymerací 20-99% mol. monomerních jednotek jednoho nebo více biologicky inertních hydrcfilních monomerů, s výhodou monomerních jednotek N-<2-hydroxypropy1)methakry1 amidu, a 0,1-30% mol.
jednotek p-nitrofenylesteru methakry1oy1 ováné aminokyseliny nebo oligopeptidu. Alternativně se v prvé fázi připravuje kopolymer radikálovou kopolymerací 20-97% mol. monomerních jednotek N-(2-hydroxypropy1)methakrylamidu s 0,1-30% mol. jednotek methakryoy1 ováných derivátů aminokyselin nebo oligopeptidů zakončených funkční skupinou -CO-NH-(CHz>n-NHz , kde η = 1 až 8. Obdobný polymerní nosič je možno připravit tak, že se provede aminolýza polymeru nesoucího aktivní estery 100-200 násobným přebytkem např. ethy1endiaminu nebo hexamethylendiaminu.
V druhém stupni se váže derivát cyklosporinu a to buů aminolytickou reakcí esterových vazeb polymerního nosiče aminonebo hydrazoderivátém cyklosporinu nebo alternativně se provádí kondenzace aldehydické skupiny cyklosporinu s aminoskupinou polymeru a následně je vzniklá vazba stabilizována redukcí natriumborohydridem za vzniku sekundárního aminu. Vazba cyklosporinu na polymerní nosič se provádí v polárních rozpouštědlech nebo jejich dimethy1sulfoxidu, dimethy1formamidu ethane1u nebo methanolu. Oddělení nezreagovaného cyklosporinu se provádí opakovaným srážením polymeru do nepolárních rozpouštědel, např do smési množství stanovuje po polymeru 6
N kyselinou chlorovodí kovou a vyjadřuje se jako poměr aminokyselin pocházej í c í ch cyklosporinu a vazebné aminokyseliny nebo
Ve třetí m se provádí vaz t<a vazebná místa polymeru
Reakce se provád í ve vodném pufru buč aminoly tickoLi reakcí aktivních esterů.
polymeru volnými aminoskupínámi protilátky nebo reaguje aldehydická skupina proti látky, ískaná oxidací Fc roztokem jodistanu sodného, s volnými aminoskupinami na polymeru a výsledná vazba se stabilizuje vhodným redukčním činidlem, např.
borohydridem sodným nebo kyanoborohydridem sodným
Při dvoustupňovém provedení syntézy polymerních konjugátů se kopolymer tvořený 40-700 monomemími jednotkami v prvé fázi připravuje radikálovou kopo!ymerací 20-99% mol monomem ích jednotek jednoho nebo více biologicky inertních hydrofilních híonomerů, výhodou monomem ích jednotek
N-< 2-hydroxypropy1)methekry1 amidu,
0,1-25% mol jednotek methakroyl oligopeptidy1 cyklosporinu a s 0,
1-10% mol jednotek methakrylaylovaným derivátem aminokyseliny nebo oli gopeptidu zakončeným skupinou NH-(CHz>nNHz, až 8, nebo s p-nitrofenylesterem, výhodou se používá v druhém stupni se pak na polymer váže /i* protilátka obdobným způsobem jak bylo popsáno u třístupňové syntézy, tj. aminolýzou p-nitrofenylesteru nebo prostřednictvím reakce oxidovaného Fc fragmentu s volnými aminoskupinami polymeru.
Technické řešení je dále objasněno na příkladech provedení, jimiž ovšem není jeho rozsah omezen ani vyčerpán.
Příklady' provedení
Příklad 1:
Radikálovou srážecí kopcdymerací 3,0g
N-(2-hydroxypropy1)methakry1 amidu s 0,57 g methakry1oy1 ováného p-nitrefenylového esteru glycy1feny1alany11eucy1glycinu v 32,6 ml acetonu za iniciace O,1S g azo-bis-isobutyronítri 1u při 50 °C, (polymerizační směs byla do skleněné ampule, doba probublána žárovkovým dusíkem, zatavena polymerace 24 hod) byl připraven polymer o molelulové hmotnosti
21O0O, R2 v postranních řetězcích 4% mol zakončených reaktivním p-nitrofenylevým esterem, y = 4.
0.19 g derivátu cyklosporinu A, kde je namísto MeBmt aminokyselina o vzorci HOOC-CH<NHCH3)-CH(OH)-CH(CH3)-(CH2)ENHNH2 (CyA-CH2-NHNH2), bylo rozpuštěno ve
2,1 ml dimethyIsulfoxidu a vzniklý roztok by 1 přidán k roztoku
1,7 g polymerního nosiče, připraveného pod 1 e
Příkladu 1, dimethy1su1τo hodinách byla reakce ukončena vysrážením polymeru do
60,0 íti 1 ±>měsi aceton ether Isl a produkt byl přečištěn dvojnásobnými přesrážením methanolu do téže směsi,
P2= GlyF‘heLeuGlyNHNH-CH2-CyA. Obsah navázaného cyklosporinu byl stanoven na 9,5% hmot analýzou aminokyselin v hydrolyzátu polymeru >
Příklad
Stejným postupem jako v.
příkladu 2, byl navázán na polymerní prekusor připravený podle příkladu 1, derivát cyklosporinu G, kde je namísto
MeBmt aminokyselina vzorci
HODC-CH(NHCH3 )-CH ( OH ) -CH ( CH3 )-(CH2 )3-CH(CH3 ) NH-(CH2 )2-NH2 ( i-CyG-CH2-NH-( CH2 )2 NH2 ) . Namísto O,19 g CyA-CH2-NHNH2 bylo použito 0,19 g i—CyG—CH2 —NH (CH2 )2 NH2 , R2 — GlyPhcLeuGlyNH(CH2)2—
NH-<CH2)-(i-CyG). Obsah navázaného cyklosporinu byl stanoven
10,1% hmot, analýzou aminokyselin v hydrolyzátu polymeru.
Příklad 4:
1,0 9 palymerního nosiče připraveného podle příkladu by lo rozpuštěno ve 4 ml methanolu a dále bylo přidáno 2 ml čerstvě destilovaného ethylendiaminu.
Směs byla míchána 4 hodiny při pokojové, teplotě a přebytek aminu byl vakuově odpařen, byl rozpuštěn v 5,5 ml methanolu a byl přečištěn opakovaným vysrážením po přidání 300 ml směs - diethylether 151. Obsah volných aminoskupin v stanoven na 3,8% mol., R2 = GlyPheLeuGlyNH(CH2)2NH2 připraveného polymerního nosiče byl rozpuštěn v 10 ml a. byl přidán roztok 0,11 g derivátu cyklosporinu methanolu, kde je namísto MeBmt aminokyselina HOOC-CH(NHCHs )-CH(DH)-CH(CH3 )-(CH2 UCHO (CyA-CHD). Po byla reakční směs ochlazena borohydridu sodného. Pa dalších za vakua, polymer byl rozpuštěn na
Polymer dvak rát i aceton polymeru byl 1,0 g takto methanolu A v 1 m 1 o vzorci 4 hodinách °C a bylo přidáno 20 mg minutách byl methanol odpařen ve 20 ml vody a přečištěn gelovou chromatografii na koloně plněné Sephadexem G-25 s použitím vody jako eluentu. Přečištěný polymer byl lyofi 1 izován, R2 = GlyPheLeuGlyNH (Cf-lz >2NH—CH2-CyA. Obsah navázaného cyklosporinu byl stanoven na 9,2% hmot. analýzou aminokyselin v hydrolyzátu polymeru.
Příklad 5;
Radikálovou srážecí kopolymerací 3,0g
N- (2-hydro;:ypropy 1 )methakrylamidu s 1,2 g methakry loy 1 ováného ρ-nitrefeny levého esteru glycy1 fenylalany11eucy1glycinu v 32,6 ml acetonu za iniciace 0,18 g azo-bis-isDbutyronitrilu při 50 C, (polymerizační směs byla do skleněné ampule, doba probublána žárovkovým dusíkem, zatavena polymerace 24 hod) byl připraven polymer o molelulové hmotnosti
18000, R;
GlyPheLeuGlyONp nesouc í v postranních řetězcích 9% mol. oligopeptidických sekvencí
Příklad 6:
vazba cyklosporinu byla provedena podle příkladu 2 s polymerním nosičem připraveným podle příkladu 5. Analýzou bylo zjištěno, že polymer obsahoval 9,6% hmot, cyklosporinu a přibližně 4% mol. nezreagovaných DNp skupin, R2 = GlyPheLeuGly- NHNH-CHz-CyA, R3 = GlyPheLeuGlyONp, x = 91, y je přibližně 2, z je přibližně 4. 200 mg takto připraveného polymeru bylo rozpuštěno v 1,6 ml 0,15 1*1 chloridu sodného, dále bylo přidáno 1,3 ml borátového pufru o pH 8 a roztek byl ochlazen na 4 °C. Za míchání byl přidán 5-6% roztok 67 mg protilátek v PBS pufru a po dobu dvou hodin bylo pH reakční směsi udržováno na hodnotě 7,5 pomocí nasyceného roztoku tetraboritanu sodného. Po této době bylo pH reakční směsi zvýšeno na hodnotu 9,0 přídavkem tetraboritanu sodného a reakce byla prováděna dále 3 hodiny. Po této době byl vzniklý polymer, kde R3 je nyní GlyPheLeuGly-NHPr, NHFr je protilátka vázaná amidickou chromatografií na koloně plněné Sephadexem
G-15 a vymyt pufrem o pH 7,2. Tento roztok byl použit pro biologické testování
Charakterizace konjugátu byla provedena gelovou chromatografií na koloně plněné Sepharosou 4B a 6B, 1:1 hmot, a elektroforézy
Z hmotnostní bilance vyplynulo, že vzorek hmot, protilátek. a 7,2% hmot. navázaného cy k1esporinu.
Příklad 7:
1,5 g . polymerního nosiče připraveného podle příkladu 5 bylo rozpuštěno v 6 ml methanolu a za intensivního míchání bylo přidáno 6 ml ethy1endiaminu. Po 4 hodinách míchání byly nezreagovaný ethy1endiamin a methanol odpařeny na vakuové odparce. Ddparek byl rozpuštěn v 11 ml methanolu. a přečištěn dvakrát opakovaným vysrážením po přidání 400 ml směsi aceton - diethylether 1:1 obj. K 1 g takto modifikovaného polymeru, kde Rz = G1 yPheLeuGlyNH(CHz)zNHz, x = 91, y = 9, rozpuštěnému v 10 ml methanolu byl přidán roztok 200 mg derivátu cyklosporinu A, kde je namísto MeBmt aminokyselina o vzorci H00C-CH(NHCH3)CH(CH3 ) — (CHz)4 —CHD (CyA-CHO), rozpuštěného ve 2 ml methanolu. Po 4 hodinách byla reakční směs ochlazena na 0 C a bylo přidáno 30 mg borohydridu sodného a při této teplotě byla reakce prováděna hodinu.
Methanol byl odpařen na vakuové odparce, odparek byl ve 20 ml vody a přečištěn gelovou chromatografií na koloně 4 •í 40 cm plněné Sephadexem G-25.
Ana 1ý zou bylo zjištěno, že takto připravený polymer, kde R2
GlyPheLeuGlyNH(CH2IzNH-ObCyA, obsahuje
17% hmot navázaného cyk1aspoňinu
700 mg □ pH 4,0
M chlorid sodný na výslednou koncentraci přidáno 26 ml směs byla za protilátky odděleny c>d solí na koloně plněné Sephadexem G-25 a jejich roztok byl zahuštěn mg/ml. 1 cyklosporinem byl rozpuštěn v 7 ml 0,1 1*1 acetátového pufru o pH
4,0 obsahujícího 0,15 1*1 chloridu sodného a po ochlazení na 4 °C byl přidán roztok
530 mg oxidovaných protilátek v
16,5 ml acetátovém pufru. Za míchán i bylo pH roztoku upraveno na 8, pomocí nasyceného roztoku tetraboritanu sodného a směs byla míchána dalších 16 hodin. Za téže teploty bylo přidáno mg kyanoborohydridu sodného a po 2 hodinách míchání by 1 produkt čištěn gelovou chromatografií ha koloně cm plněné
Sephadexem G-25 a eluován fosfátovým pufrem o
Konjugát byl charakterizován gelovou chromatografií elektroforézou a koncentrace konjugátu v roztoku byla stanovena z obsahu sušiny po lyoŤilisaci odsolenéhD vzorku hmotnostní bilance vyplynulo, že vzorek obsahuje celkově 25% hmot, protilátek, 12,8% hmot.
navázaného cyklosporinu a koncentrace činí 20 mg/ml, kde R2
GlyPheLeuGlyNH(CHc>2NH CH CyA,R3
G1y P heLeuG1y NH(CH2)2NH-CH2P r,
CH2FT je protilátka vázaná prostřednictvím oxidovaného Fc fragmentu
Příklad 8:
200 mg
-CyA, 60 mg Ma-GlyGly-NH-(CH2>2~
-NHa a 800 mg N-(2-hydroxy propy 1 ) methak.ry lamidu, kde Na je methakryloy1, byla prováděna v acetonu za iniciace 0,6% hmot, azo-bis—ieobuty ron i tr i 1 u, při 50 °C, v atmosféře dusíku, v zatavené skleněné ampuli, při celkové koncentraci 12% hmot, monomerů v polymerizačni smési, po dobu 24 hodin. Aceton byl odpařen na vakuové odparce, odparek byl rozpuštěn ve vodě a čištěn gelovou chromatografií na koloně 4 x 40 cm plněné Sephadexem G-25 s použitím vody jako eluentu a lyofi 1izován. vazba protilátek čistění konjugátu bylo provedeno podle příkladu
7. Připravený konjugát obsahoval 10% hmot, cyk1osporinu a 25% hmot· protilátek, R2 = GlyPheLeuGly— NH— (CH2 '2 — —NH—CH2—CyA, Ry = G1yGly—NH-(CH2>2NH-CH2Pr, kde CH2FT je protilátka vázaná prostřednictvím oxidovaného Fc fragmentu.
Příklad
Z čerstvé lidské heparinizované krve byly izolovány lidské lymŤocyty a umístěny do tkáňové kultury. Jejich citlivost na působení anti CD protilátkou směrovaného cyklosporinu, připraveného podle příkladu 6, kde jako protilátka byl vázán králičí anti CD3 IgG, byla testována inhibicí proliferace, navozené v kultuře buněčným mitogenem Concanavalinem A a testované jako inkorporace 3H-thymidinu. Bylo zjištěno, že směrovaný cyklosporin výrazně snižuje proliferaci T buněk až do koncentrace 100 ng/ml. . Tento výsledek prokazuje, že vazba cyklosporinu na polymerní nosič nesnižuje jeho farmakologickou aktivitu.
Příklad 10:
Inhibiční účinek. anti Thy 1.2 protilátkou směrovaného cyklosporinu, připraveného podle příkladu 7, kde jako protilátka byl vázán králičí anti Thy 1.2 IgG, byl testován in vitro na smíšené kultuře myších splenocytú. Ddpovídajícími buňkami byly splenocyty H-2a, stimulujícími buňkami splenocyty H-2b. Bylo zjištěno, že proliferace H-2a buněk navozená přítomností
1Ξ cizorodých buněk H-2b je snížena až do koncentrace 10
- 100 ng/iril. Tento výsledek dokládá, že farmakologická aktivita směrovaného cyklosporinu není vazbou na polymerní nosič sn í žena.
Příklad 11:
Nefrotoxicita směrovaného cyklosporinu připraveného podle příkladů 6 a 7 byla testována na samcích kmene Wistar. Pokusné skupině byla po dobu 10 dnů podávána dávka odpovídající 50 mg cyklosporinu, navázaného v směrovaném konjugátu, v přepočtu na kg váhy intraperitonealně. Kontrolní skupině byla podávána dávka 50 mg na kg dnech byla provedena histologie ledvin, thymu, jater a sleziny. Bylo zjištěno, že zatímco volný cyklosporin A podávaný v této dávce vyvolává těžká poškození ledvin, která se projevuj í jako toxické tubulární leze proximálních tubulů, podávání směrovaného konjugátu cyklosporinu žádné pathologické poškození ledvin nevyvolávalo.
Průmyslová využitelnost
Technické řešení je využitelné v medicíně při transplantacích orgánů, kdy je nezbytné dočasně utlumit některé složky imunity a’umožnit přijetí transplantovaného orgánu a dále při indikacích, kdy lze pomocí ovlivnění buněk imunitního systému přispět k léčení chorobných stavů, tj. např. při léčení autoimunitních onemocnění.

Claims (4)

1. Směrované pólyměrní konjugáty cyklosporirm vyznačené tím, že jako polymerní nosiče obsahu j í 40-700 zpolymerizovaný o h monomerních jednotek tvořených z 20-97% mol. biologicky inertních hydrofilních jednotek jimiž jsou. N-(2-hydroxypropy1)methakry1 amid, N-viny1pyrrolidon nebo kyseliny akrylová a methakrylová ve formě sodných solí, s výhodou N-(2-hydroxypropy1)methakry1 amid, 0,1-25% mol. jednotek methakry1oy1 ováných aminokyselin nebo methakry1oy1ovaných oligopeptidfl s terminálně vázaným cyklosporinem a Λχ10% mol.
jednotek methakry1oy1 ováných aminokyselin nebo oligopeptidO, ke kterým je navázána protilátka jakožto determinanta transportu k cíleným buňkám.
<V»£-FCÍsM
2. Směrované polymerní konjugáty cyklosporinu podle teeeta 1 vyznačené tím, že k vazbě na nosič jsou použity cyklosporiny nesoucí funkční skupiny aldehydickou, hydrazinovou nebo primární aminoskupinu.
3. Směrované polymerní konjugáty cyklosporinu podle 1 vyznačené tím, že protilátky použité pro cílové směrování jsou vázány prostřednictvím volných aminoskupin nebo oxidovaného Fc fragmentu.
4. Směrované polymerní konjugáty cyklosporinu vyznačené tím, že protilátky jsou směrovány proti receptorům exprimovaným na povrchu T lymfocytfi.
CZ19942318U 1991-02-01 1991-02-01 Směrované polymerní konjugáty cyklosporinu CZ2190U1 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS91251A CZ279785B6 (cs) 1991-02-01 1991-02-01 Směrované polymerní konjugáty cyklosporinu

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2190U1 true CZ2190U1 (cs) 1994-07-14

Family

ID=5334297

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19942318U CZ2190U1 (cs) 1991-02-01 1991-02-01 Směrované polymerní konjugáty cyklosporinu
CS91251A CZ279785B6 (cs) 1991-02-01 1991-02-01 Směrované polymerní konjugáty cyklosporinu

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS91251A CZ279785B6 (cs) 1991-02-01 1991-02-01 Směrované polymerní konjugáty cyklosporinu

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0536343B1 (cs)
AT (1) ATE128033T1 (cs)
CA (1) CA2079590A1 (cs)
CZ (2) CZ2190U1 (cs)
DE (1) DE69204954D1 (cs)
WO (1) WO1992013569A1 (cs)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0961793A4 (en) * 1997-02-11 2000-09-06 Council Of The Queensland POLYMERS CONTAINING PEPTIDES
US7732404B2 (en) 1999-12-30 2010-06-08 Dexcel Ltd Pro-nanodispersion for the delivery of cyclosporin
WO2004082629A2 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Albany Molecular Research, Inc. Novel cyclosporins
JP2008514702A (ja) 2004-09-29 2008-05-08 エーエムアール テクノロジー インコーポレイテッド 新規シクロスポリン類似体およびそれらの薬学的使用
US7378391B2 (en) 2004-09-29 2008-05-27 Amr Technology, Inc. Cyclosporin alkyne analogues and their pharmaceutical uses
US7361636B2 (en) 2004-10-06 2008-04-22 Amr Technology, Inc. Cyclosporin alkynes and their utility as pharmaceutical agents

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8500209D0 (en) * 1985-01-04 1985-02-13 Ceskoslovenska Akademie Ved Synthetic polymeric drugs
DE3513572A1 (de) * 1985-04-16 1986-10-16 Karl Prof. Dr.med. 7302 Ostfildern Theurer Herstellung von praeparaten zur spezifischen beeinflussung der humoralen und zellulaeren immunreaktion
JPH04502328A (ja) * 1988-12-05 1992-04-23 ザ・トラステイーズ・オブ・コロンビア・ユニヴアーシテイ・イン・ザ・シテイ・オブ・ニユー・ヨーク シクロスポリンａの新規誘導体、それに対する抗体及びその使用

Also Published As

Publication number Publication date
EP0536343A1 (en) 1993-04-14
CS25191A3 (en) 1992-08-12
WO1992013569A1 (en) 1992-08-20
ATE128033T1 (de) 1995-10-15
DE69204954D1 (de) 1995-10-26
EP0536343B1 (en) 1995-09-20
CA2079590A1 (en) 1992-08-02
CZ279785B6 (cs) 1995-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108452321B (zh) 一种带酸性自稳定接头的抗体-药物偶联物
CN111542344B (zh) 包含单分子量聚肌氨酸的配体-药物-缀合物
JP2023061938A (ja) ビス連結による細胞毒性剤の共役
US6436386B1 (en) Hydroxyapatite-targeting poly (ethylene glycol) and related polymers
US7041818B2 (en) DDS compound and method for measurement thereof
US8372422B2 (en) Hydroxyapatite-targeting poly(ethylene glycol) and related polymers
CZ308395A3 (en) Complex for b12 vitamin reception, process of its preparation, compositions containing thereof and its use
JPH06256222A (ja) ポリエチレンオキシド改質プロテイン及びポリペプチドのシクロデキストリンとの凍結乾燥複合体
CA2101361A1 (en) Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances
TW201400131A (zh) 自行穩定之接合劑共軛物
JP2515389B2 (ja) ス―パ―オキサイドディスムタ―ゼ結合体
EP0325270A2 (en) Anticancer conjugates
CZ2190U1 (cs) Směrované polymerní konjugáty cyklosporinu
CN115151278B (zh) 用于核酸疗法的靶向肿瘤的多肽纳米颗粒递送系统
CN115957338B (zh) 一种高稳定性的靶向接头-药物偶联物
CN114191564A (zh) 一种非天然鹅膏毒肽类抗体偶联物
JPH11124396A (ja) 樹状ポリペプチド
KR102668425B1 (ko) 분해성 폴리에틸렌글리콜 결합체
WO2022154116A1 (ja) 化合物またはその塩、およびそれらにより得られる抗体
KR102668424B1 (ko) 분해성 폴리에틸렌글리콜 유도체
CN109311910B (zh) 他克莫司偶联物、其组合物、及其用途
JPH0742316B2 (ja) オシド単位の酸化およびシツフ塩基の形成により変性されたリボソ−ム不活性化糖タンパク、およびこの糖タンパクを含む生体内持続性免疫毒素
Weltzien et al. Acidic “Peptidophospholipids”, a new class of hapten-bearing cell surface modifying reagents
EP0595743B1 (fr) Dérivés bi-haptènes liant le technétium ou le rhénium, procédé de préparation, application diagnostic et thérapeutique, kits et réactifs immunologiques.
CA2000157A1 (fr) Vecteurs synthetiques de faible poids moleculaire specifiques de recepteurs a sucre, conjugues en comportant et procedes de preparation