CZ202462A3 - Metoda rozlišení meiotických a mitotických vad při preimplantačním a prenatálním vyšetření - Google Patents

Abstract

Řešením je metoda, která umožňuje zjistit, zda trisomie zjištěné ve vzorku z preimplantačního nebo prenatálního testování jsou meiotického nebo mitotického původu a umožňuje detekovat triploidii, a to bez potřeby současného vyšetření vzorku od jednoho nebo obou rodičů, což je významné pro další diagnostický a terapeutický proces. Postup je vhodný k vyšetření trisomie kteréhokoliv chromozomu nebo více chromozomů s výjimkou chromozomu Y a k vyšetření triploidie. Metoda je založena na zjištění, že při meiotické trisomii nebo triploidii je na úsecích chromozomů vyšší hodnota heterozygozity a nižší frekvence homozygotních DNA markerů, což lze detekovat molekulárně genetickými metodami.

Description

Metoda rozlišení meiotických a mitotických vad při preimplantačním a prenatálním vyšetření

Oblast techniky

Tento vynález se obecně týká preimplantačního a prenatálního testování genetických vad u člověka. Vynález poskytuje možnost zjistit původ chromozómových trisomií, tedy zda k nim došlo v průběhu vývoje pohlavních buněk, z nichž vzniklo embryo (meiotické chyby), nebo až během buněčného dělení v časném embryu (mitotické chyby), a to bez nutnosti použití dodatečných vzorků, které představují např. vzorky DNA otce nebo matky. Vynález rovněž umožňuje detekci triploidií bez nutnosti použití dodatečných vzorků DNA. Rozlišení mitotických a meiotických vad je významné zejména z hlediska posouzení, zda jde o postižení všech buněk nebo o mozaiku buněk normálních a trisomických, což je zásadně významné pro volbu dalších diagnostických a léčebných postupů.

Dosavadní stav techniky

Početní vady chromozomů jsou příčinou potrácení a porodů dětí s vrozenými vadami. Jejich vlivu na průběh těhotenství lze zabránit včasným preimplantačním nebo prenatálním testováním. V současné době je preimplantační a prenatální testování nedílnou součástí postupů při léčbě poruch plodnosti a prevence geneticky podmíněných vrozených vad, ať už jsou způsobeny genomovými, chromozómovými nebo genovými vadami (Greco E et al. Int J Mol Sci. 2020 Jun 19;21( 12):4381). Cílem vyšetření je zjistit přítomnost chromozómových vad a určit, zda se jedná o vadu vzniklou při vývoji oocytů nebo spermií v těle rodičů nebo po oplození při vývoji embrya.

Meiotické vady vznikají při vývoji spermií (Ioannou D et al. Reproduction. 2019 Jan;157(l):R15R31) nebo oocytů (MacLennan M et al. Semin Cell Dev Biol. 2015 Sep;45:68-76.) v procesu zvaném meióza.

Člověk má v každé somatické buňce 23 párů chromozomů. Z toho 22 párů jsou homologní chromozomy, označované jako autozomy, a jeden pár pohlavních chromozomů o konstituci XX u ženy a XY u muže. Homologní chromozomy mají shodné rozložení alel, tedy shodné uspořádání genů. Jeden z dvojice chromozomů pochází od otce, druhý od matky příslušného jedince, proto se homologní chromozomy navzájem liší obsahem variabilních sekvencí nukleotidů. Variabilní sekvence, jinak též polymorfismy, jsou úseky deoxyribonukleové kyseliny, které zpravidla nekódují proteiny a umožňují rozlišit deoxyribonukleovou kyselinu různých jedinců navzájem. Po proběhlé replikaci deoxyribonukleové kyseliny je každý chromozom složen ze dvou shodných (sesterských) chromatid, které se rozcházejí do dceřiných buněk během tzv. mitózy.

Při vývoji pohlavních buněk dochází v procesu zvaném meióza k redukci počtu chromozomů i chromatid na poloviční počet, a to tak, že z každé dvojice homologních chromozomů zůstane na konci meiózy jedna kombinovaná chromatida. Každý chromozom ve kmenové buňce spermie a ve kmenové buňce vajíčka obsahuje dvojici homologních chromozomů, každý tvořený dvojicí sesterských chromatid. Na začátku meiózy se dvojice homologních chromozomů spojí, takže vznikne čtveřice chromatid. Jejich vzájemný vztah se označuje pojmy sesterské, tedy ty, pocházející od stejného rodiče a mající shodnou sekvenci nukleotidů a nesesterské, které pocházejí od různých rodičů a mají odlišnou sekvenci nukleotidů, zejména ve variabilních oblastech. Následně dochází ke vzájemné výměně úseků deoxyribonukleové kyseliny mezi nesesterskými chromatidami v procesu zvaném crossing over. Důsledkem toho procesuje vznik čtyř chromatid z každé dvojice homologních chromozomů a tyto chromatidy se liší svými variabilními sekvencemi. Po následujícím dvojím buněčném dělení pak každá spermie a každé vajíčko obsahuje jeden chromozom složený z jedné chromatidy lišící se ve variabilních sekvencích od chromatid

- 1 CZ 2024 - 62 A3 rodičovských chromozomů (obr. 1). Tímto mechanizmem se zvyšuje genetická variabilita v pohlavních buňkách.

V průběhu meiózy často dochází k chybám v rozdělení chromozomů mezi dceřiné buňky. V případě, že dojde ke ztrátě chromozomu, taková spermie nebo vajíčko nepřenese příslušný chromozom při oplození do embrya, jestliže ve spermii nebo vajíčku zůstanou dva chromozomy jsou místo jednoho chromozomu do embrya postiženou gametou přeneseny dva. U trisomie meiotického původu jsou tedy ve vzniklém embryu přítomny tři chromozomy, jeden ze spermie a dva z oocytu, nebo jeden z oocytu a dva ze spermie (obr. 2). Obdobným způsobem vznikají triploidie, kdy se do embrya přenáší celá nadbytečná sada chromozomů od otce nebo matky. Embrya triploidní označujeme jako polyploidní, s monosomií nebo trisomií označujeme jako aneuploidní. Dva chromozomy pocházející od téhož rodiče se ale v důsledku výše popsaného crossing-over liší ve variabilních sekvencích, heterozygotních markérech, zvyšuje se tedy vlastnost zvanáheterozygozita (Wang S et al. Bioessays. 2019 0ct;41(10):el800221).

Embrya s monosomií záhy zanikají, přítomnost trisomií vede k zániku embrya na začátku vývoje, ke spontánnímu potratu v těhotenství, případně k porodu dítěte se závažnou vrozenou vadou.

Triploidie (obr. 3, 4) je život plodu limitující genetická aberace vznikající přenosem nadbytečné haploidní sady chromozomů otcovského (diandrická triploidie) nebo mateřského původu (digynická triploidie). Triploidie postihuje přibližně 1 % až 2 % všech početí. Většina případů je potracena v raných vývojových stádiích, případně vede ke vzniku trofoblastické nemoci (Massalska et al. Clin Genet. 2021 Oct; 100(4):368-375).

Mitotické vady vznikají po oplození v časném embryu v důsledku nepravidelnosti buněčného dělení (Cavazza T et al. Cell. 2021 May 27;184(11):2860-2877.e22). Při mitotickém dělení již nedochází k výměně úseků mezi chromozomy, nezvyšuje se tedy heterozygozita (obr. 5). Pokud vada nevznikne v prvním buněčném dělení, nejsou zpravidla postiženy všechny buňky, vznikne tzv. mozaika. V průběhu dalšího vývoje mohou aneuploidní buňky zaniknout a být nahrazeny buňkami zdravými nebo se zdravými buňkami koexistovat a nebránit vývoji plodu, pokud jsou zastoupeny minoritně (Coticchio G et al. Hum Reprod Update. 2021 Aug 20;27(5):848-865).

Rozlišení meiotických a mitotických vad, včetně triploidií je důležité zejména pro diferenciální diagnostiku vad, kdy meiotické vady, včetně triploidií postihují všechny buňky embrya nebo plodu, zatímco mitotické vady se mohou vyskytnout v mozaice, tedy v některých buňkách jsou a v jiných ne, což je důležité při rozhodování, zda embryo transferovat u embryí vyšetřovaných preimplantačním genetickým testováním (Coticchio G et al. Hum Reprod Update. 2021 Aug 20;27(5):848-865), případně zda těhotenství ukončit či ne u vad plodu zjištěných prenatální diagnostikou (Lannoo L et al. Eur J Hum Genet. 2022 Dec;30(12): 1323-1330).

Preimplantační genetické testování embryí bylo zavedeno v roce 1990 (Handyside AH et al. Nature. 1990 Apr 19;344(6268):768-70.) a následně se stalo celosvětově používanou metodou (Giuliano R et al. Genes (Basel). 2023 Nov 17; 14( 11):2095.). Na celém světě se provádí kolem 50 000 preimplantačních genetických testování ročně (European IVF Monitoring Consortium (EIM) Hum Reprod Open. 2022 Jul 5;2022(3):hoac022.). Vyšetření se provádí před zavedením embrya do dělohy, tedy ještě před otěhotněním ženy.

Při preimplantačním genetickém testování postup vychází z bioptovaného vzorku odebraného nej častěji z trofektodermu embrya ve stadiu blastocysty, případně z blastomer embrya ve stadiu rýhování (Greco E et al. Int J Mol Sci. 2020 Jun 19;21( 12):4381). Tento vzorek obsahuje asi 5 až 10 buněk trofektodermu. Z nich je extrahována deoxyribonukleová kyselina, taje amplifíkována a použita k vlastnímu molekulárně genetickému vyšetření.

Prenatální testování vrozených vad s pomocí molekulárně genetického vyšetření bylo zavedeno v roce 1997 (Pós O et al. FlOOORes. 2019 May 31;8:F1000) a používá se celosvětově. Vyšetření

-2CZ 2024 - 62 A3 se provádí v průběhu těhotenství, čas odběru materiálu se volí podle použitého zdroje buněk nebo nebuněčné deoxyribonukleové kyseliny.

Při prenatálním genetickém testování postup vychází ze vzorku buněk pocházejících z plodu, plodových obalů nebo z placenty. Tyto buňky mohou být získány nejčastěji z plodové vody, choriových klků, pupečníkové krve, případně krve matky (Chang L et al. Life Sci Alliance. 2023 Feb 21 ;6(5):e202201761). Získané buňky jsou separovány, je z nich izolována deoxyribonukleová kyselina, taje použita k vlastnímu molekulárně genetickému vyšetření. Další možností je získání nebuněčné deoxyribonukleové kyseliny plodu z krve matky (Ju J et al. Methods Mol Biol. 2023;2590:287-294.).

Vlastní molekulárně genetické vyšetření je provedeno metodami sekvenování nové generace, metodou SNP arrayí, nebo jiným vhodným způsobem.

K určení meiotického nebo mitotického původu zjištěné genetické chyby bylo dosud třeba použít referenční vzorek od alespoň jednoho rodiče (Rana B et al. Am J Hum Genet. 2023 Apr 6; 110(4):565-574), případně u preimplantačního genetického testování provést u téhož embrya dva invazivní výkony, biopsii pólocytů a následně biopsii trofektodermu (Handyside AH et al. Prenat Diagn. 2021 Apr;41(5):525-535).

Podstata vynálezu

V následujícím popisu budou vysvětleny hlavní znaky metody podle tohoto vynálezu; nicméně to neznamená, že vynález musí obsahovat všechny znaky a aspekty popsané v tomto textu. Rozsah ochrany bude definován patentovými nároky připojenými k tomuto popisu.

Odborník plně pochopí tento vynález z následujícího popisu spolu s příkladem, kde budou podrobněji vysvětleny některé specifické znaky a aspekty, a doprovodnými obrázky. V popisu použité technické a vědecké výrazy mají stejný význam, jaký je běžně známý odborníkům v oblasti lékařství, molekulární biologie, genetiky, bioinformatiky, preimplantační a prenatální diagnostiky, reprodukční medicíny a klinické embryologic, pokud zde není definováno jinak.

Definice

Genomová deoxyribonukleová kyselina je deoxyribonukleová kyselina, v níž je uložen genetická informace konkrétního organismu. Zahrnuje úseky deoxyribonukleové kyseliny reprezentující jednotlivé geny i úseky nekódující proteiny.

Homologní chromozomy jsou chromozomy, které mají na stejných lokusech, tedy ve stejné poloze, stejné alely. Jeden chromozom pochází od matky a jeden od otce daného jedince.

Chromatida je vlákno deoxyribonukleové kyseliny. Před replikací deoxyribonukleové kyseliny se chromozom skládá z jedné chromatidy, po replikaci ze dvou identických chromatid.

Crossing-over je biologický jev, který nastává v průběhu vývoje spermií i vajíček a při němž dochází ke vzájemné výměně úseků deoxyribonukleové kyseliny mezi nesesterskými (jedna pochází od otce, druhá od matky) chromatidami.

Indel je typ mutace, způsobený chyběním (delece) nebo vložením (inserce) úseku, popř. kombinací delece a inserce deoxyribonukleové kyseliny v genomové deoxyribonukleové kyselině.

DNA polymorfismy neboli variabilní oblasti deoxyribonukleové kyseliny jsou části řetězce obsahující individuální odchylky v sekvenci nukleotidů, polymorfismy, mutace, jednonukleotidové markéry, indely, popř. další varianty.

- 3 CZ 2024 - 62 A3

Meiotický původ chromozómové vady znamená, že vada vznikla před oplozením při vývoji spermií nebo vajíček.

Mitotický původ chromozómové vady znamená, že vada vznikla po oplození v průběhu vývoje embrya.

Sekvenace genomu znamená stanovení pořadí nukleotidů v genomové deoxyribonukleové kyselině.

SNP array (Single Nucleotide Polymorphism Array) je molekulárně genetická metoda založená na hybridizaci vzorku s úseky deoxyribonukleové kyseliny vázanými na podklad (mikročip).

NGS/MPS čili sekvenování nové generace neboli masivní paralelní sekvenace je metoda umožňující současné automatizované stanovení pořadí nukleotidů v deoxyribonukleové kyselině mnoha vzorků.

Heterozygozitaje míra genetické variability, rozdílů v pořadí nukleotidů, její inverzní hodnotou je homozygozita, která je mírou shod v pořadí nukleotidů.

Heterozygotním markérem se rozumí jakákoliv varianta v deoxyribonukleové kyseliny v lidském genomu popsaná v referenčním genomu hg38/GRCh38 (Genome Reference Consortium) anebo v budoucích verzích lidského referenčního genomu. Jedná se tedy o všechny polymorfismy, mutace, jednonukleotidové markéry, indely, popř. další varianty, popsané v databázi k současnému datu, ale i popsané v rámci budoucího výzkumu a poznání. Jako nejvhodnější se jeví používání jednonukleotidových markérů nebo též SNP markérů nebo SNP polymorfismů (z angl.SNP = Single Nucleotide Polymorphism), jelikož se vyskytují v lidském genomu ve velkém počtu zahrnujících desítky až stovky milionů polymorfismů a jsou lehce detekovatelné např. technologií SNP arrayí nebo NGS. Nicméně pro fungování vynálezu lze využít jakékoliv variabilní oblasti nacházející s ve vyšetřovaném genomu.

Podrobný popis

Předkládaný vynález se týká způsobu stanovení meiotického nebo mitotického původu chromozómové vady ze vzorku genomové deoxyribonukleové kyseliny izolované z buněk embrya nebo plodu, získaných biopsií nebo izolací z amniové tekutiny nebo z mateřské krve nebo nebuněčné deoxyribonukleové kyseliny získané z kultivačního media při preimplantačním nebo z mateřské krve při prenatálním testování, jak je definováno v nároku 1. Představuje velmi spolehlivou metodu odlišení mitotických a meiotických chyb u časných embryí a plodů těhotných žen, která je použitelná při preimplantačním a prenatálním testování geneticky podmíněných vrozených vad. Ve srovnání s dosud používanými metodami (např. Rana B et al. Am J Hum Genet. 2023 Apr 6; 110(4):565-574) není třeba získání dodatečného vzorku otce nebo matky, což umožňuje kromě zlevnění procesu také stanovení diagnózy v případech, kdy referenční vzorek není dostupný nebo by jeho získání způsobilo nepřijatelné prodlení.

Způsob podle předkládaného vynálezu může být aplikován na trisomii kteréhokoliv chromozomu, kromě chromozomu Y i natrisomie více chromozomů současně přítomné. Vynález lze aplikovat i na triploidie, což jsou z technického pohledu meiotické trisomie všech autozomů, popř. i chromozomu X (u konstelace 69, XXX).

Postup spočívá ve vyhodnocení DNA polymorfismů, tedy variabilních sekvencí ve dvoušroubovici DNA (polymorfismy, jednonukleotidové SNP markéry, indely a jiné) získaných genetickým vyšetřením vzorku z preimplantačního genetického testování nebo prenatálního genetického testování. Algoritmus lze aplikovat na konkrétní vzorek bez pomocných vzorků příbuzných (např.

-4CZ 2024 - 62 A3 matka a/nebo otec), které se standardně v dosud používaných metodách pro rozlišení meiotických a mitotických chyb používají.

Tento způsob zahrnuje tyto hlavní kroky (obr. 6):

1. Určení počtu DNA polymorfismů u diploidního vzorku, z kterých bude stanovena míra heterozygozity, která bude následně sloužit jako referenční hodnota. Toto stanovení počtu polymorfismů a míra heterozygozity pro referenční hodnoty se provádí na začátku aplikace metody a platí pro vzorky vyšetřované v téže populaci dlouhodobě.

2. Získání testovaného materiálu biopsií embrya nebo placenty nebo izolací volných buněk z amniové tekutiny nebo z pupečníkové krve nebo volné embryonální nebo plodové deoxyribonukleové kyseliny z plodové nebo mateřské krve nebo z kultivačního media.

2. Izolaci deoxyribonukleové kyseliny ze vzorku získaného podle bodu 2.

3. V případě malého vzorku, např. z biopsie embrya, amplifikaci izolované deoxyribonukleové kyseliny.

4. Analýzu deoxyribonukleové kyseliny získané ze vzorku podle bodů 2 nebo 3 pomocí sekvenování nové generace, aplikace SNP arrayí nebo použití jakékoliv jiné metody, která analýzu variabilních oblastí v DNA umožní.

5. Bioinformatické zpracování dat získaných analýzou deoxyribonukleové kyseliny podle bodu 4, jehož výsledkem je stanovení nárůstu počtu DNA polymorfismů (dále jen „nárůst heterozygozity“ nebo „pokles homozygozity“) u vzorku na úsecích jednotlivých chromozomů srovnáním s referenční hodnotou určenou podle bodu 1.

6. Vyhodnocení přítomnosti aneuploidií, chromozómových vad, případně dalších genetických vad a stanovení meiotického nebo mitotického původu zjištěné chromozómové vady na základě míry heterozygozity z dat získaných podle bodu 5.

Referenční hodnota

Jako referenční hodnota může sloužit počet heterozygotních DNA polymorfismů ve vzorku blízkého příbuzného nebo určení průměrného počtu heterozygotních DNA polymorfismů (dále jen „heterozygozita“) ve vyšetřované populaci.

Pokud je použit postup s určením heterozygozity ve vyšetřované populaci, pak pomocí analýzy souboru vzorků jedinců z dané populace lze určit průměrnou heterozygozita pro diploidní sestavu, tedy dvojici všech chromozomů člověka. Průměrnou hodnotu lze určit např. pomocí SNP arraye spočítáním všech zjištěných heterozygotních markérů. Pro určení populační četnosti heterozygotních variant lze použít i metodu NGS, kdy lze sekvenací celého genomu nebo jeho části určit počet heterozygotních variant a průměrnou heterozygozitu na chromozom nebo jeho část.

Pro použití v metodě, která je předmětem vynálezu, je nutné vyčíslit průměrnou hodnotu heterozygotních variant v úsecích jednotlivých chromozomů a tu srovnávat s heterozygozitou odpovídajících chromozomů v testovaném vzorku, protože při vývoji pohlavních buněk dochází k výměně úseků mezi chromozomy otcovského a mateřského původu při ději zvaném crossingover, tedy nedědí se původní chromozomy, ale chromozomy kombinované z úseků otcovského a mateřského původu.

- 5 CZ 2024 - 62 A3

Bioinformatická analýza

Bioinformatická analýza využívá systém počítačového zpracování, který slouží ke stanovení hodnoty heterozygozity u vzorku z informací získaných sekvenováním deoxyribonukleové kyseliny u testovaného vzorku, detekcí pomocí SNP arrayí, NGS nebo jiným vhodným způsobem. Systém počítačového zpracování je založen na instrukcích uložených na počítačově čitelném mediu a je konstruován tak, aby umožnil odlišit míru heterozygozity ve vzorku podle jednotlivých chromozomů a umožnil s použitím referenčních dat rozlišit meiotický nebo mitotický původ přítomných trisomií jednotlivých chromozomů ve vzorku.

Detekce meiotické aneuploidie a rozlišení od mitotické aneuploidie

Metoda využívá poznatku, že při meiotické trisomii se vyskytují u embrya, plodu, choriových klků apod. úseky genomu s vyšší heterozygozitou, tj. frekvencí heterozygotních DNA polymorfismů vyšší o přibližně 50%. Mezi heterozygotní DNA polymorfismy lze zařadit všechny DNA polymorfismy vykazující frekvenci alternativní alely (allelic balance) v rozmezí 0,1-0,9 (popř. i šířeji), jelikož v případě trisomie nemá daný chromozom v trisomii sestavu markérů s teoretickou alternativní alelickou četností 0,5, ale díky třem přítomným chromozomům vykazuje alternativní alelickou četnost 0,33 popř. 0,66. Interní validací na základě vyšetření 50 meiotických trisomií bylo zjištěno, že u meiototické trisomie došlo k nárůstu počtu heterozygotních SNP markérů o 45,6 % (st.dev ± 11,8 %) oproti normalizovanému počtu heterozygotních SNP markérů u diploidního vzorku ve specifických úsecích chromozomů Vyšší heterozygozita a nižší homozygozita je podmíněna u meiotické trisomie tím, že homologní chromozomy pocházející od jednoho rodiče se v důsledku proběhlé výměny úseků nesesterských chromatid navzájem přítomností heterozygotních markérů liší.

Při meiotické trisomii získává embryo dva takto, pokud jde o DNA polymorfismy, částečně odlišné chromozomy od jednoho rodiče a jeden zcela odlišný od druhého rodiče.

Při mitotické trisomii dochází v důsledku nerovnoměrné distribuce chromozomů do dceřiných buněk ke zdvojení přítomnosti jednoho chromozomu od jednoho rodiče, třetí chromozom pochází od druhého rodiče. Dva chromozomy jsou tedy co do přítomnosti DNA polymorfismů shodné a třetí odlišný.

Matematicky lze výsledek popsat jako:

x - počet DNA polymorfismů (heterozygozita) v daném úseku chromozomu u testovaného vzorku, X - průměrný počet DNA polymorfismů (heterozygozita) v referenci v daném úseku chromozomu, pokud má být výsledek spolehlivý, hodnota X je nejméně 70,

N - nárůst počtu DNA polymorfismů (heterozygozita) v procentech

N= 100 . (x-X)/X

Obdobně lze matematicky popsat i snížení homozygozity jako:

x - počet DNA polymorfismů v homozygotním stavu v daném úseku chromozomu u testovaného vzorku,

X - průměrný počet DNA polymorfismů v homozygotním stavu v referenci v daném úseku chromozomu, pokud má být výsledek spolehlivý, hodnota X je nejméně 70, N - pokles počtu DNA polymorfismů v homozygotním stavu v procentech

N= 100 . (x-X)/X

Analýza nárůstu heterozygozity u jednotlivých chromozomů a jejich částí

Nárůst heterozygozity (nárůst počtu DNA polymorfismů) nebo pokles homozygozity nemusí být detekován po celém testovaném chromozomu. Při segregaci chromozomů během meiózy dochází k promíchání sesterských a nesesterských chromatid díky crossing-overům. V případě meiotické

-6CZ 2024 - 62 A3 trisomie to pak vede ke zdědění dvou úseků sesterských chromatid, ale také ke zdědění dvou úseků nesesterských chromatid, kdy pak dochází k nárůstu heterozygozity a poklesu homozygozity. Podstatou patentuje rovněž zjištění, že nárůst heterozygozity nebo pokles homozygozity je nutné sledovat po částech testovaného chromozomu. Optimální velikost části chromozomu není definována, odráží však počet DNA polymorfismů detekovaných v analyzovaném úseku chromozomu za popužití dané technologie. Interní validací meiotických trisomií jsme zjistili, že 71,3 % (st.dev ± 5,9 %) chromozomu skládá ze zděděných nesesterských chromatid, a v těchto úsecích lze sledovat nárůst heterozygozity nebo pokles homozygozity. To je zapříčiněno tím, že homologní pár se sesterskými a nesesterskými chromatidami tvoří tetrádu a crossing-over je možný navzájem mezi všemi nesesterskými chromatidami, což zvyšuje výslednou variabilitu.

Detekce triploidie

Vzhledem ke skutečnosti, že triploidie jsou způsobeny přítomností nadbytečné sady chromozomů a vznikají chybou meiotického dělení (Massalska et al. Clin Genet. 2021 Oct; 100(4):368-375), lze počet polymorfismů použít pro detekci triploidie. Při triploidi je nárůst heterozygozity (pokles homozygozity) detekován na všech chromozomech, jelikož triploidie se projevuje trisomií všech chromozomů, pokud nedojde kjiné chromozómové chybě ovlivňující počet kopií daného chromozomu. U triploidie lze dle interní validace očekávat nárůst heterozygozity o 45,6% u 71,3% genomu. Obdobně lze výpočet vyjádřit i poklesem homozygozity polymorfních markérů a lze tedy pro detekci využít oba přístupy.

Minimální počet markérů pro spolehlivou predikci

Minimální počet markérů pro danou oblast chromozomu pro kalkulaci nárůstu heterozygozity nebo poklesu homozygozity byl stanoven testováním u diploidních vzorků na přibližně 70 polymorfismů/markerů. Při použití méně markérů může metoda vykazovat chyby v důsledku variability v počtu heterozygotních DNA polymorfismů u diploidního vzorku. Metodu lze použít i s využitím menšího počtu markérů, pokud došlo k validací spolehlivosti vyšetření. Počet DNA polymorfismů a heterozygozita u jednotlivých chromozómových úseků se může lišit v závislosti na etnicitě daného vzorku, pro různá etnika je nutné normalizovat a stanovit průměrnou hodnotu.

Příklady uskutečnění

Postup podle vynálezu byl aplikován na preimplantační genetické vyšetření lidských embryí. Embrya byla získána oplozením vajíček žen s poruchou plodnosti oplozením spermiemi jejich partnerů. Tato embrya byla po oplození kultivována 5 dní v komerčním kultivačním mediu v atmosféře obsahující 5% kyslíku a 5% oxidu uhličitého. Embrya, která dosáhla stadia blastocysty byla bioptována, to znamená že bylo z jejich trofoblastu odebráno 5-10 buněk, které byly následně opláchnuty pufirem a přeneseny do PCR mikrozkumavky s 0,8 pl pufru. Mikrozkumavky se vzorky byly do dalšího zpracování uchovány při teplotě -20°C.

Odebraný bioptát trofobastu byl podroben celogenomové amplifikaci. Pro amplifikaci všech vzorků trofektodermu byla použita technologie s co nejvyšším pokrytím genomu REPLI-g Advanced DNA Single Cell Kit (Qiagen).

Pro detekci SNP markérů byla amplifikovaná DNA z jednotlivých vzorků trofektodermu hybridizovánana SNP array Infinium Global Screening Array-24 v3.0 BeadChip (Illumina), která dokáže určit genotypy u 700 000 SNP markérů.

Proces přípravy sondy a hybridizaci na čipy zahrnoval dodatečnou amplifikaci, fragmentaci DNA, vysrážení isopropanolem, resuspendaci v hybridizačním pufru a 16-24 hodinovou hybridizaci na jednotlivých pozicích čipů. Následující den bylo provedeno fluorescenční značení jednotlivých

-7CZ 2024 - 62 A3

SNP markérů a následně detekce fluorescenčního signálu pomocí vysokorozlišovacího skeneru i Scan systém (Illumina).

Po skenování byly pomocí softwaru skeneru vygenerovány idat soubory, které sloužily jako vstupní formát do softwaru Genome Studio, licence-free nástroje distribuovaného firmou Illumina (GenomeStudio Software Downloads (illumina.com). Pomocí softwaru Genome Studio byly určeny a vyexportovány genotypy pro všech 700.000 SNP markérů.

Genotypy jednotlivých SNP markérů byly využity pro detekci triplopidií, meiotických trisomií a rozlišení od ostatních typů chromozómových abnormalit (mozaiky, mitotické trisomie). Mezi heterozygotní markéry byly zařazeny všechny SNP markéry vykazující intenzitu fluorescence Ballely v rozmezí 0,1 -0,9, jelikož v případě trisomie má daný chromozom v trisomii sestavu markérů AAB nebo ABB (tedy frekvenci B-alely 0,33 a 0,66).

Počty heterozygotních SNP markérů byly porovnány s normalizovaným počtem heterozygotních SNP markérů napříč jednotlivými chromozomy a jejich částmi, rozdělenými po 5 Mb (megabázích).

Graf porovnání byl vykreslen pomocí statistického a grafického balíčku ggplot2 v programovacím jazyku R.

Interní validací na základě vyšetření 50 meiotických trisomií bylo zjištěno, že u meiotické trisomie došlo k nárůstu počtu heterozygotních SNP markérů o 45,6 % (standard deviation ± 11,8 %) oproti normalizovanému počtu heterozygotních SNP markérů u normálního (diploidního vzorku) ve specifických úsecích chromozomů.

Pro spolehlivou detekci meiotických trisomií byl nárůst heterozygozity vztažen na několik 5 Mb úseků po sobě navazujících. Interně bylo validováno, že nárůst u tří po sobě následujících 5 Mb úsecích chromozomu indikuje meiotickou trisomii i u menších chromozomů (např. chromozomů 21, 22). Výsledky jsou zobrazeny na grafech (obr. 7 až 15).

Objasnění obrázků

Obrázek 1. Na obrázku je znázorněn průběh a výsledek meiotického dělení při vývoji pohlavních buněk. Na počátku jsou přítomny páry homologních chromozomů (1), každý pochází od jednoho z rodičů jedince, u něhož se pohlavní buňky vyvíjejí. Následně dojde k překřížení a spojení jednotlivých chromatid pocházejících od různých rodičů (nesesterské chromatidy) a vzájemné výměně úseků chromatid, tento jev se nazývá crossing over (2). Výsledkem po rozdělení chromatid jsou čtyři chromatidy lišící se v počtu variabilních oblastí (3).

Obrázek 2. Na obrázku je znázorněn vznik meiotické trisomie. Do pohlavní buňky přecházejí dvě chromatidy (4, 5) místo jedné. Tyto chromatidy se liší ve svých nesesterských úsecích a v těchto úsecích dochází k vytvoření heterozygotní sestavy DNA polymorfismů, dojde tedy ke zvýšení heterozygozity po oplození. Při oplození se k těmto dvěma chromatidám připojuje další chromatida z pohlavní buňky druhého rodiče (6). Oplozené vajíčko pak obsahuje trojici chromatid místo dvojice. Z těchto chromatid vzniknou po replikaci deoxyribonukleové kyseliny tři chromozomy (7, 8, 9).

Obrázek 3. Na obrázku je znázorněn stav genomu u triploidie matemálního původu (pochází z oocytu). Diploidní oocyt může být oplozen spermií obsahující chromozom X (10), potom zygota obsahuje dva chromozomy X mateřského původu (11) a jeden otcovského původu (12). Pokud je diploidní oocyt oplozen spermií nesoucí chromozom Y (13), bude zygota obsahovat dva chromozomy X mateřského původu (14) a jeden chromozom Y (15).

-8CZ 2024 - 62 A3

Obrázek 4. Na obrázku je znázorněn stav genomu u triploidie patemálního původu (pochází ze spermie). Oocyt může být oplozen diploidní spermií obsahující chromozomy X (16), potom zygota obsahuje jeden chromozom X mateřského původu (17) a dva otcovského původu (18). Pokud je oocyt oplozen diploidní spermií nesoucí chromozom Y (19), bude zygota obsahovat jeden chromozom X mateřského původu (20) a dva chromozomy Y (21).

Obrázek 5. Na obrázku je znázorněn vznik mitotické trisomie. Do pohlavní buňky přechází jedna chromatidy od jednoho rodiče (22) a druhá od druhého (23), tedy normální počet. Pn nepravidelném dělení po oplození přechází do buňky dva identické chromozomy od jednoho rodiče (24, 25) a jeden od druhého (26). Vzhledem k tomu, že dva chromozomy jsou identické, nedojde ke zvýšení heterozygozity.

Obrázek 6. Na obrázku je schéma postupu diagnostiky podle vynálezu. Amplifikace deoxyribonukleové kyseliny je nezbytné u malých vzorků. Závěrečné hodnocení může být automatizované nebo na základě vyhodnocení grafů heterozygozity odborníkem.

Obrázek 7. Graf znázorňuje míru heterozygozity v jednotlivých chromozomech z příkladu. Zvýšená hodnota heterozygozityu chromozomu 16 (27) prokazuje meiotický původ trisomie chromozomu 16.

Obrázek 8. Graf znázorňuje zastoupení heterozygotních markérů v jednotlivých chromozomech z příkladu. Zvýšené hodnota heterozygozity u chromozomu 9 (28) a chromozomu 19 (29) prokazuje meiotický původ trisomie chromozomů 9 a 19.

Obrázek 9. Graf znázorňuje zastoupení heterozygotních markérů v jednotlivých chromozomech z příkladu. Zvýšené hodnota heterozygozity u chromozomu 8 (30) a chromozomu 16 (31) prokazuje meiotický původ trisomie chromozomů 8 a 16.

Obrázek 10. Graf znázorňuje zastoupení heterozygotních markérů v jednotlivých chromozomech z příkladu. Zvýšené hodnota heterozygozity u chromozomu 9 (32) prokazuje meiotický původ trisomie chromozomu 9.

Obrázek 11. Graf znázorňuje zastoupení heterozygotních markérů v jednotlivých chromozomech z příkladu. Zvýšené hodnota heterozygozity u chromozomu 13 (33) a chromozomu 16 (34) prokazuje meiotický původ trisomie chromozomů 13 a 16.

Obrázek 12. Graf znázorňuje zastoupení heterozygotních markérů v jednotlivých chromozomech z příkladu. Zvýšené hodnota heterozygozity u chromozomu 16 (35) prokazuje meiotický původ trisomie chromozom 16.

Obrázek 13. Graf znázorňuje zastoupení heterozygotních markérů v jednotlivých chromozomech z příkladu. Zvýšené hodnota heterozygozity u chromozomu 18 (36) prokazuje meiotický původ trisomie chromozomu 18.

Obrázek 14. Graf znázorňuje zastoupení heterozygotních markérů v jednotlivých chromozomech z příkladu. Zvýšené hodnota heterozygozity u chromozomu 19 (37) prokazuje meiotický původ trisomie chromozomu 19.

Obrázek 15. Graf znázorňuje zastoupení heterozygotních markérů v jednotlivých chromozomech z příkladu. Zvýšené hodnota heterozygozity všech chromozomů prokazuje triploidii.

-9CZ 2024 - 62 A3

Citovaná nepatentová literatura

Cavazza T, Takeda Y, Politi AZ, Aushev M, Aldag P, Baker C, Choudhary M, Bucevičius J, Lukinavičius G, Elder K, Blayney M, Lucas-Hahn A, Niemann H, Herbert M, Schuh M. Parental genome unification is highly error-prone in mammalian embryos. Cell. 2021 May 27;184(11):2860-2877.e22. doi: 10.1016/j.cell.2021.04.013. Epub 2021 May 7. PMID: 33964210; PMCID: PMC8162515.

Coticchio G, Barrie A, Lagalla C, Borini A, Fishel S, Griffin D, Campbell A. Plasticity of the human preimplantation embryo: developmental dogmas, variations on themes and self-correction. Hum Reprod Update. 2021 Aug 20;27(5):848-865. doi: 10.1093/humupd/dmab016. PMID: 34131722.

European IVF Monitoring Consortium (EIM), for the European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE); Wyns C, De Geyter C, Calhaz-Jorge C, Kupka MS, Motrenko T, Smeenk J, Bergh C, Tandler-Schneider A, Rugescu IA, Goossens V. ART in Europe, 2018: results generated from European registries by ESHRE. Hum Reprod Open. 2022 Jul 5;2022(3):hoac022. doi: 10.1093/hropen/hoac022. PMID: 35795850; PMCID: PMC9252765.

Genome Reference Consortium:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCF_000001405.26/.

Giuliano R, Maione A, Vallefiioco A, Sorrentino U, Zuccarello D. Preimplantation Genetic Testing for Genetic Diseases: Limits and Review of Current Literature. Genes (Basel). 2023 Nov 17;14(11):2095. doi: 10.3390/genesl4112095. PMID: 38003038; PMCID: PMC10671162.

Greco E, Litwicka K, Minasi MG, Cursio E, Greco PF, Barillari P. Preimplantation Genetic Testing: Where We Are Today. Int J Mol Sci. 2020 Jun 19;21(12):4381. doi: 10.3390/ijms21124381. PMID: 32575575; PMCID: PMC7352684.

Handyside AH, Kontogianni EH, Hardy K, Winston RM. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature. 1990 Apr 19;344(6268):768-70. doi: 10.1038/344768a0. PMID: 2330030.

Handyside AH, McCollin A, Summers MC, Ottolini CS. Copy number analysis of meiotic and postzygotic mitotic aneuploidies in trophectoderm cells biopsied at the blastocyst stage and arrested embryos. Prenat Diagn. 2021 Apr;41(5):525-535. doi: 10.1002/pd.5816. Epub 2020 Sep 9. PMID: 32833230.

Chang L, Jiao H, Chen J, Wu G, Liu P, Li R, Guo J, Long W, Tang X, Lu B, Xu H, Wu H. Singlecell whole-genome sequencing, haplotype analysis in prenatal diagnosis of monogenic diseases. Life Sci Alliance. 2023 Feb 21;6(5):e202201761. doi: 10.26508/lsa.20220176L PMID: 36810160; PMCID: PMC9947115.

Ioannou D, Fortun J, Tempest HG. Meiotic nondisjunction and sperm aneuploidy in humans. Reproduction. 2019 Jan;157(l):R15-R31. doi: 10.1530/REP-18-0318. PMID: 30390610.

Ju J, Su F, Chen C, Sun J, Gao Y. Haplotype-Assisted Noninvasive Prenatal Diagnosis of Genetic Diseases by Massively Parallel Sequencing of Maternal Plasma Cell-Free DNA. Methods Mol Biol. 2023;2590:287-294. doi: 10.1007/978-1-0716-2819-5 17. PMID: 36335505.

Lannoo L, van Straaten K, Breckpot J, Brison N, De Catte L, Dimitriadou E, Legius E, Peeters H, Parijs I, Tsuiko O, Vancoillie L, Vermeesch JR, Van Buggenhout G, Van Den Bogaert K, Van Calsteren K, Devriendt K. Rare autosomal trisomies detected by non-invasive prenatal testing: an

- 10 CZ 2024 - 62 A3 overview of current knowledge. Eur J Hum Genet. 2022 Dec;30(12): 1323-1330. doi: 10.1038/s41431-022-01147-1. Epub 2022 Jul 27. PMID: 35896702; PMCID: PMC9712527.

MacLennan M, Crichton JH, Playfoot CJ, Adams JR. Oocyte development, meiosis and aneuploidy. Semin Cell Dev Biol. 2015 Sep;45:68-76. doi: 10.1016/j.semcdb.2015.10.005. Epub 2015 Oct 8. PMID: 26454098; PMCID: PMC4828587.

Massalska D, Bijok J, Kucihska-Chahwan A, Zimowski JG, Ozdarska K, Panek G, Roszkowski T. Triploid pregnancy-Clinical implications. Clin Genet. 2021 Oct;100(4):368-375. doi: 10.11 11/cge.14003. Epub 2021 Jun 1. PMID: 34031868.

Pós O, Budíš J, Szemes T. Recent trends in prenatal genetic screening and testing. FlOOORes. 2019 May 31;8:F1000 Faculty Rev-764, doi: 10.12688/flOOOresearch. 16837.1. PMID: 31214330; PMCID: PMC6545823.

Rana B, Lambrese K, Mendola R, Xu J, Garrisi J, Miller K, Marin D, Treff NR. Identifying parental and cell-division origins of aneuploidy in the human blastocyst. Am J Hum Genet. 2023 Apr 6;110(4):565-574. doi: 10.1016/j.ajhg.2023.03.003. Epub 2023 Mar 27. PMID: 36977411; PMCID: PMC10119141.

Wang S, Liu Y, Shang Y, Zhai B, Yang X, Kleckner N, Zhang L. Crossover Interference, Crossover Maturation, and Human Aneuploidy. Bioessays. 2019 0ct;41(10):el800221. doi: 10.1002/bies.201800221. Epub 2019 Aug 19. PMID: 31424607; PMCID: PMC6756933.

Příbuzné patenty:

CA2786357C - Simultaneous determination of aneuploidy and fetal fraction

EPl981995 - Non-invasive fetal genetic screening by digital analysis

EP3658689B1 - A method for non-invasive prenatal detection of fetal chromosome aneuploidy from maternal blood based on bayesian network

EP3760732 - Methods for non-invasive prenatal ploidy calling

US10424394B2 - Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations

US10577655B2 - Cell free DNA diagnostic testing standards

US20190211391A1 - Methods for non-invasive prenatal ploidy calling

US20200251180A1 - Resolving genome fractions using polymorphism counts

US20200350034A1 - Method for non-invasive prenatal testing using parental mosaicism data

US20220403461A1 - Methods and compositions for determining ploidy

US20230042405Al - Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments

US20230360723A1 - Methods for non-invasive prenatal ploidy calling

WO2013052557 - Methods for preimplantation genetic diagnosis by sequencing related applications

WO2014127749 - Application of single cell genome sequencing in preimplantation genetic diagnosis

Claims (5)

1. Metoda rozlišení meiotických a mitotických chyb při preimplantačním a prenatálním vyšetření umožňující stanovení původu trisomií a zjištění triploidií v embryonálních nebo fetálních buňkách nebo ve volné DNA určením míry heterozygozity nebo homozygozity, vyznačující se tím, že: a) testovaný materiál je získán biopsií embrya nebo placenty nebo izolací volných buněk z amniové tekutiny nebo z pupečníkové krve nebo volné embryonální nebo plodové deoxyribonukleové kyseliny z plodové nebo mateřské krve nebo z kultivačního media, v němž byly kultivovány testované buňky, b) následuje izolace deoxyribonukleové kyseliny

c) při množství deoxyribonukleové kyseliny ve vzorku nedostačujícím pro analýzu podle bodu d je provedena amplifikace deoxyribonukleové kyseliny

d) následuje analýza deoxyribonukleové kyseliny sekvenací nové generace, aplikací SNP arrayí nebo jiným vhodným způsobem

e) je provedeno zpracování získaných dat spočívající ve stanovení heterozygozity nebo homozygozity v chromozomech nebo v jednotlivých úsecích chromozomů

f) je vyhodnocena přítomnosti aneuploidií, chromozómových vad, případně dalších genetických vad a míra heterozygozity nebo homozygozity

g) je určen meiotický nebo mitotický původ zjištěných trisomií, odlišena plná aneuploidie od aneuploidie v mozaice a zjištěna případná přítomnost triploidie.

2. Způsob podle nároku 1 může být aplikován na jakýkoliv chromozom nebo na více chromozomů kromě chromozomu Y pro zjištění trisomie.

3. Způsob podle nároku 1 může být aplikován na celou sadu chromozomů pro zjištění triploidie.

4. Způsob podle nároku 1 nevyžaduje použití srovnávacího vzorku jednoho nebo obou rodičů.

5. Způsob podle nároku 1 může být aplikován na jakoukoliv metodu preimplantačního nebo prenatálního genetického testování založenou na analýze DNA.