CZ2009399A3 - Zpusob prípravy esteru hyaluronanu - Google Patents
Zpusob prípravy esteru hyaluronanu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2009399A3 CZ2009399A3 CZ20090399A CZ2009399A CZ2009399A3 CZ 2009399 A3 CZ2009399 A3 CZ 2009399A3 CZ 20090399 A CZ20090399 A CZ 20090399A CZ 2009399 A CZ2009399 A CZ 2009399A CZ 2009399 A3 CZ2009399 A3 CZ 2009399A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- hyaluronan
- preparation
- water
- esters according
- stirred
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-3-[(2s,3r,5s,6r)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical class CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N 0.000 title 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims abstract description 82
- KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N hyaluronan Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H](C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N 0.000 claims abstract description 67
- 229940099552 hyaluronan Drugs 0.000 claims abstract description 59
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 32
- -1 hyaluronan ester Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 7
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 34
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 19
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 17
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 8
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 3
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012374 esterification agent Substances 0.000 abstract 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 29
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 27
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 25
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 22
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 21
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 19
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 13
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 13
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 12
- PAAZPARNPHGIKF-UHFFFAOYSA-N 1,2-dibromoethane Chemical compound BrCCBr PAAZPARNPHGIKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 11
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 10
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 description 10
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 10
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 10
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 description 10
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 10
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 9
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 8
- 238000000914 diffusion-ordered spectroscopy Methods 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 8
- 125000000094 2-phenylethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 7
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 7
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 7
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 7
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 6
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 5
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 5
- 238000001348 diffusion-ordered spectrum Methods 0.000 description 5
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical class CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N benzyl chloride Chemical compound ClCC1=CC=CC=C1 KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940073608 benzyl chloride Drugs 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 150000002366 halogen compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N benzyl bromide Chemical compound BrCC1=CC=CC=C1 AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001743 benzylic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SGRHVVLXEBNBDV-UHFFFAOYSA-N 1,6-dibromohexane Chemical compound BrCCCCCCBr SGRHVVLXEBNBDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WMPPDTMATNBGJN-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethylbromide Chemical compound BrCCC1=CC=CC=C1 WMPPDTMATNBGJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001284 acidic polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000004805 acidic polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 2
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 2
- HVTICUPFWKNHNG-UHFFFAOYSA-N iodoethane Chemical compound CCI HVTICUPFWKNHNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 11-dehydrocorticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABFPKTQEQNICFT-UHFFFAOYSA-M 2-chloro-1-methylpyridin-1-ium;iodide Chemical compound [I-].C[N+]1=CC=CC=C1Cl ABFPKTQEQNICFT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000005168 4-hydroxybenzoic acids Chemical class 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical group CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SKNCLPBMLUEXQG-UHFFFAOYSA-N C[N+](C)(C)CCOCC([O-])=O Chemical compound C[N+](C)(C)CCOCC([O-])=O SKNCLPBMLUEXQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N Cortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYUXSRADSPPKRZ-SKNVOMKLSA-N D-glucurono-6,3-lactone Chemical compound O=C[C@H](O)[C@H]1OC(=O)[C@@H](O)[C@H]1O UYUXSRADSPPKRZ-SKNVOMKLSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical class C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VJGNLOIQCWLBJR-UHFFFAOYSA-M benzyl(tributyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CC1=CC=CC=C1 VJGNLOIQCWLBJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001734 carboxylic acid salts Chemical group 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940105329 carboxymethylcellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004544 cortisone Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000000990 heteronuclear single quantum coherence spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 150000005165 hydroxybenzoic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- WHQSYGRFZMUQGQ-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;hydrate Chemical compound O.CN(C)C=O WHQSYGRFZMUQGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000003444 phase transfer catalyst Substances 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 150000003870 salicylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000005621 tetraalkylammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium bromide Chemical compound [Br-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DPKBAXPHAYBPRL-UHFFFAOYSA-M tetrabutylazanium;iodide Chemical compound [I-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DPKBAXPHAYBPRL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
Rešení se týká zpusobu prípravy esteru hyaluronanu, kde hyaluronan nesoucí skupinu COOH nebo COO.sup.-.n.Na.sup.+.n.se rozpustí ve vode, roztok se ochladí na laboratorní teplotu a pridá se s vodou mísitelné organické rozpouštedlo. Následne se pridá esterifikacní cinidlo R-X nebo X-Z-X, kde R a Z jsou alifatický, cykloalifatický, olefinický, arylalifatický ci heterocyklický zbytek s poctem uhlíku 1 až 18, volitelne s obsahem hydroxy skupiny a/nebo disulfidického mustku, a X je Cl, Br nebo l. Výsledná reakcní smes se míchá po dobu 1 hod až 6 dní, pricemž pH reakcní smesi se udržuje na hodnote 6 až 10, kde pH reakcní smesi muže být udržováno na hodnote 7 postupným pridáváním báze Na.sup.+.n.Y.sup.n-.n.(n=1, 2, 3), kde Y.sup.n-.n.je vybrán ze skupiny zahrnující OH.sup.-.n., HCO.sub.3.n..sup.-.n., CO.sub.3.n..sup.2-.n., PO.sub.4.n..sup.3-.n., HPO.sub.4.n..sup.2-.n., H.sub.2.n.PO.sub.4.n..sup.-.n., F.sup.-.n..
Description
Způsob přípravy esterů hyaluronanu
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu přípravy derivátů hyaluronanu, s využitím v biomedicíně, založeného na esterifikaci karboxylových skupin COOH nebo COO' Na+ hyaluronanu halogensloučeninami s alifatickým nebo arylalifatickým zbytkem ve vodně-organickém prostředí, s možným použitím anorganické báze.
Dosavadní stav techniky
Kyselina hyaluronová je polysacharid, který se skládá z disacharidických jednotek složených z D-glukuronové kyseliny a D-/V-acetylglukosaminu vázaných alternujícími β-1,4 a β-1,3 glykosidickými vazbami. Molekulová hmotnost in vivo bývá v rozsahu 3 kDa až 20 MDa, biopolymer v synoviální tekutině má molekulovou hmotnost 3 až 4 MDa.
Funkčními skupinami pro chemickou modifikaci hyaluronanu jsou karboxylová skupina, hydroxylová skupina (primární nebo sekundární) a W-acetylamidová skupina.
Existuje řada postupů jak chemicky polysacharidy modifikovat, řada z nich modifíkační reakci provádí právě na karboxylové skupině a využívá ktomu halogenované sloučeniny.
Příprava esterů hyaluronové kyseliny, kde všechny, nebo jen část karboxylových skupin kyseliny, jsou esterifikovány a část karboxylů je ve formě soli s kovy nebo farmakologicky akceptovatelnou organickou bází, je popsána v patentu della Valle et al. (EP0216453; 1986), v patentu della Valle et al. (US patent 4851521; 1986) a v patentu della Valle et al. (US4965353; 1989). Postup přípravy esterů hyaluronanu je založen na reakci tetrabutylamonné soli hyaluronanu s alkylhalogenidy, a to v prostředí čistého dimethylsulfoxidu.
Della Valle et al. popsal přípravu síťovaných esterů hyaluronanu (US patent 4957744; 1987). Postup je založen na reakci tetrabutylamonné soli hyaluronanu s dihalogenalkany, a to v prostředí čistého dimethylsulfoxidu.
Jiný způsob zesíťováni / auto-zesíťování kyselých polysacharidů je popsán u della Valle et al. (US patent 5676964; 1995) a je založen na tvorbě esteru mezi karboxylovou skupinou polysacharidů a hydroxy- skupinou téže nebo jiné molekuly • · polysacharidů. Karboxylové skupina tetrabutylamonné soli polysacharidů je aktivována 2-chloro-1-methylpyridinium jodidem. Reakce probíhá s přídavkem terciárního aminu (triethylaminu), a to v prostředí čistého dimethylsulfoxidu. Postup je aplikován na kyselinu hyaluronovou, kyselinu alginovou, karboxymethylcelulózu a ka rboxymethylch itin.
Della Valle et al. (US patent 5336767; 1992) popisuje estery hyaluronové kyseliny, částečně nebo plně esterifikované na karboxylové skupině alifatickými nebo jednoduchými cykloalifatickými zbytky bez farmakologické aktivity, dále alkoholy s farmakologickou aktivitou (steroidními alkoholy s protizánětlivým účinkem, na které je patent cílen - např. kortison), a jejich kombinacemi. Použitý způsob esterifikace je aplikovatelný obecně na kyselé polysacharidy s karboxylovou skupinou. Kvarterní amoniová sůl kyselého polysacharidů reaguje s esterifikačním činidlem (alkylhalogenidem) v aprotickém organickém rozpouštědle. Variací je rovněž reakce sodné nebo draselné soli kyseliny hyaluronové, suspendované v aprotickém rozpouštědle, salkylačním činidlem v přítomnosti katalytického množství kvarterní amoniové soli (tetrabutylamonium jodid).
Další patent téhož autora (US patent 5202431; 1991) je cílen na estery hyaluronové kyseliny, částečně esterifikované na karboxylové skupině alifatickým, arylalifatickým, cykloalifatickým nebo heterocyklickým zbytkem, které mají část karboxylů ve formě soli s terapeuticky aktivním aminem (např. antibiotika, peptidy, alkaloidy, vitaminy). Sodná sůl esteru kyseliny hyaluronové je převedena na kyselou formu pomoci katexu v H+ cyklu, smíchána s bází terapeuticky aktivního aminu (získá se převedením soli terapeuticky aktivního aminu na bázi pomocí anexu v OH' cyklu), kde vzniklá sůl je zamražena a lyofilizována.
Angele et al. (US patent 6737072; 1999) připravili pórovitou kompozitní matrici pro tkáňové inženýrství složenou z esteru kyseliny hyaluronové (ethyl nebo benzyl ester) a hydrolyzovaného kolagenu (želatiny). Jako rozpouštědlo použili HFP (hexafluorisopropanol).
Bellini et al. (US patent 6632802 / US patent 2002026039; 2001 / 2001) popisuje přípravu biokompatibilních vláken pro chirurgii z esterů kyseliny hyaluronové, kde jedna část karboxylových skupin hyaluronanu je esterifikována arylalifatickým zbytkem (benzyl-; stupeň substituce 75 %) a druhá část karboxylů hyaluronanu je esterifikována dlouhými alkyly C10-C22 (25 %): dokosyl- (C22), eikosyl- (C20), oktadecyl-, hexadecyl-, dodecyl- a decyl-. Nejprve je tetrabutylamonná sůl hyaluronanu esterifikována benzylbromidem a poté probíhá esterifikace příslušným alkylhalogenidem, a to v prostředí čistého dimethylsulfoxidu.
Abatangelo et al. (US patent 6596274; 1996) vyvinuli biologický materiál pro náhrady pojivových tkání, který obsahuje kmenové buňky kostní dřené částečně nebo kompletně diferencované v buňky pojivových tkání ze skupiny: fibroblasty, osteoblasty, myoblasty, adipocyty, chondrocyty a endotheliální buňky; extracelulární matrix spolu s buňkami nebo pouze tuto matrix. Dále tento materiál obsahuje matrici z esteru kyseliny hyaluronové (benzylester se stupněm esterifikace 75 % nebo 100 %), kde příprava esteru vychází z patentu della Valle et al. (US patent 4851521; 1986).
Dorigatti et al. (US patent 5879359; 1997) popisuje biodegradabilní „vodící kanálky“ (guide channels) pro regeneraci nervové tkáně, které se skládají z propletených vláken zapuštěných v matrici. Vlákna i matrice se skládá z esteru kyseliny hyaluronové, jehož příprava vychází z patentu della Valle et al. (EP0216453; 1986) a patentu della Valle et al. (US patent 4851521; 1986).
Dorigatti et al. (US patent 5658582; 1994) poskytl mnohavrstvý netkaný materiál, jehož svrchní vrstva přichází do kontaktu s kůží a obsahuje ester kyseliny hyaluronové, jehož příprava vychází z patentu della Valle et al. (US patent 4851521; 1986). Tento materiál má využití jako neadhezivní krytí a v chirurgii.
V patentu Mariotti et al. (WO02/098923; 2002) jde o přípravu derivátů hyaluronanu s esterifikovanými nebo karbamoylovanými hydroxy skupinami a esterifikovanými karboxy skupinami, použitelných jako chirální stacionární fáze pro separaci enantiomerů. Esterifikace karboxylové skupiny hyaluronanu probíhá reakcí tetrabutylamonné soli hyaluronanu s alkylhalogenidem, a to v prostředí čistého N,N-dimethylformamidu.
Pomocí halogenovaných sloučenin lze modifikovat i nízkomolekulární látky. Patentově chráněný je postup esterifikace hydroxybenzoových kyselin (salicylové a p-hydroxybenzoové kyseliny), založený na reakci s halogensloučeninou v homogenní kapalné fázi v přítomnosti nekvaternizovatelného (stericky bráněného) terciárního
-4toto to toto ·· ·· *· • · ··« · tov * • toto · to to to to · ·· to • ·*·« to to toto · « to ···· • · to to to to to toto to · · « · · ·· ·· · · aminu (např. Λ/,/V-diisopropylethylamin), který slouží zároveň jako rozpouštědlo (Desmurs et al., 1991, EP0467727).
Esterifikace solí mono- nebo polykarboxylových kyselin reakcí s halogensloučeninami ve vodě s použitím katalyzátoru fázového přenosu (např. tetrabutylamonium bromid nebo tributylbenzylamonium chlorid) je chráněna patentem (Crochemore, 1992, EP0534817).
Všechny dosud patentované postupy esterifikace karboxylu hyaluronanu vyžadují přípravu soli hyaluronanu s organickou bází, což je krok navíc. V námi navrhovaném postupu se vychází z hyaluronanu (sodné soli) a reakce probíhá ve vodně-organickém prostředí na rozdíl od jiných postupů, které jsou prováděny v organickém rozpouštědle bez přídavku vody. Zároveň je v navrhovaném postupu používána anorganická báze. Vedlejšími produkty v našem postupu jsou anorganické soli (NaCI, NaBr), v jiných postupech je to sůl organické báze, tudíž je náš postup mnohem výhodnější, protože čištění produktu od těchto vedlejších látek je snazší. Navíc anorganické soli jsou jako stopové nečistoty v produktu mnohem méně škodlivé než organické soli. Náš předkládaný postup je mnohem výhodnější i proto, že jako reakční prostředí používá vodu (resp. směs vody a organického rozpouštědla mísitelného s vodou), která snižuje nutnost použití organických rozpouštědel až o 50 %, a proto je tedy navrhovaný postup také mnohem ekologičtější.
Rozdíly mezi námi navrhovaným postupem a patentovanými postupy esterifikace karboxylu hyaluronanu shrnuje Tab. 1.
Tab. 1. Srovnání navrhovaného postupu s patentovanými postupy esterifikace karboxylu hyaluronanu.
| Vlastnost postupu | Postup podle vynálezu | Patentované postupy |
| Forma hyaluronanu | Hyaluronan (sodná sůl) | Tetraalkylamonná sůl HA, pyridiniová sůl HA |
| Rozpouštědlo | Směs vody a organického rozpouštědla | Cistě organické prostředí |
| Použití anorganické báze | ANO | NE |
| Reakční systém | Homogenní i heterogenní | Homogenní |
| Vedlejší produkty | NaCi, NaBr (anorganická sůl) | Sůl organické báze |
| Ekologie | Vodně-organické prostředí snížení použití organických rozpouštědel až o 50 % | Vysoká zátěž |
-5 • · ♦ ·· ·♦ ·· ·· * · · · · φ · · ··
Φ · · Φ Φ ΦΦΦ 9ΦΦ ·
ΦΦ·· · · Φ· « φ · ··«· • Φ ··»·· ···· · ·· ΦΦ ♦···
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je esterifikace karboxylové skupiny COOH nebo COO Na+ hyaluronanu, pomocí halogenované sloučeniny, tj. esterifikačního činidla R-X nebo X-Z-X, kde R a Z jsou alifatický, cykloalifatický, olefinický, arylalifatický či heterocyklický zbytek s počtem uhlíků 1 až 18, volitelně s obsahem hydroxy skupiny a/nebo disulfidického můstku, a X je Cl, Br nebo I, v prostředí voda-organické rozpouštědlo, kde výsledná reakční směs se míchá po dobu 1 hod až 6 dní, přičemž pH reakční směsi se udržuje na hodnotě 7.
Hyaluronan sodný je normálně v DMSO (dimethylsulfoxid) nerozpustný a v DMSO obsahujícím 10 % vody tvoří suspenzi. Na základě vlastního výzkumu jsme zjistili, že pokud je hyaluronan nejprve rozpuštěn ve vodě ve vysoké koncentraci (zpravidla 10 %, v závislosti na molekulové hmotnosti polysacharidů a tím i viskozítě vzniklého roztoku), a poté je k vodnému roztoku postupně přidáváno organické rozpouštědlo (DMSO), je takto ihned získán homogenní roztok polymeru (i v 90% DMSO s vodou).
Zjistili jsme, že pomocí halogenalkanů lze hyaluronan, který obsahuje karboxylovou skupinu, resp. její sodnou sůl, vhodně chemicky modifikovat. Základní reakce je znázorněna níže:
hyaluronan—COOH + Na+Yn’-----hyaluronan—COO'Na+ + H*Yn' hyaluronan—COONa+ + R—X -----► hyaluronan—C—OR + Na+X
O kde X = Cl, Br, I; Yn' = OH; HCO3; CO32; PO43; HPO42’, H2PO4; F'; n=1
Esterifikace probíhá reakcí karboxylové funkční skupiny hyaluronanu s halogensloučeninou.
Zbytek R je alifatického, cykloalifatického, olefinického, arylalifatického či heterocyklického charakteru s počtem uhlíků C1-C18, který může nést hydroxylovou skupinu nebo obsahovat disulfidický můstek.
Organické rozpouštědlo mísitelné s vodou může být dimethylsulfoxid, /V,A/-dimethylformamid, Λ/,/V-dimethylacetamid nebo A/-methylpyrrolidon.
(I) (II) ,2, 3.
-6• · ··«« ·· • · · · · ·· ·· · · ··
Dále jsme zjistili, že jako esterifikační činidlo lze použít i sloučeninu mající dva reaktivní halogeny, kde reakce je následující:
hyaluronan COONa + X Z X hyaluronan C O Z X 4- NaX* (|||)
O
Zbytek Z je alifatického, cykloalifatického, olefinického, arylalifatického či heterocyklického charakteru s počtem uhlíků C1-C18, který může nést hydroxylovou skupinu nebo obsahovat disulfidický můstek.
Reakce se opět provádí ve směsi vody a vhodného organického rozpouštědla mísitelného s vodou (např. dimethylsulfoxid, A/,/V-dimethylformamid).
Vyznačený postup esterifikace hyaluronanu je následující: připraví se výchozí reakční směs, přičemž hyaluronan nesoucí COOH skupinu nebo její sodnou sůl COO’Na+ se nejprve rozpustí při teplotě 5 až 80 °C ve vodě a připraví se roztok o koncentraci 0,01 až 10 %hmotn., s výhodou co nejkoncentrovanější, s výhodou 1 až 10%hmotn., při laboratorní teplotě (tj. 20 až 25 °C). Posléze se k tomuto roztoku přidává s vodou mísitelné organické rozpouštědlo tak, aby vznikla heterogenní nebo s výhodou homogenní směs, kde výsledná koncentrace organického rozpouštědla je v rozmezí 10 až 95 %hmotn., s výhodou 90 %. K tomuto roztoku se přidá 0,2 až 3 molární ekvivalenty esterifikačního činidla R-X nebo X-Z-X, vzhledem k disacharidické jednotce hyaluronanu, a míchá se při teplotě 5 až 80 °C, s výhodou při 45 °C, po dobu 1 h až 6 dní, s výhodou 72 hod. Do reakční směsi lze přidávat i alkálii ΝθΎ' (n=1, 2, 3), kde Yn‘ je vybrán ze skupiny zahrnující OH', HCO3*, CO32·, PO4 3‘, ΗΡΟΛ, H2PO4·, F tak, aby došlo k neutralizaci COOH skupiny, případně kyselin vznikajících hydrolýzou činidla R-X nebo X-Z-X.
Pokud je reakce prováděna v heterogenním systému, je hyaluronan suspendován ve směsi vody s vhodným organickým rozpouštědlem (např. dimethylsulfoxid, A/,/V-dirnethylformamid).
Ve vodě, obzvláště pak za přítomnosti alkálie, může probíhat i vedlejší reakce, hydrolýza esterifikačního činidla R-X, resp. X-Z-X - viz reakce (IVa), (IVb), (IVc). Tato hydrolýza vede jednak ke vzniku kyseliny HX, která následně utváří zpět volnou karboxylovou kyselinu (hyaluronan-COOH, viz reakce (V)), a jednak ke vzniku alkoholu (R-OH, X-Z-OH, HO-Z-OH). Kyselinu HX, pokud je to nutné, lze snadno
| • · * · | |||||
| odstranit dalším dialýzou. | přídavkem alkálie (neutralizací) za | vzniku | soli, | která se odstraní | |
| R x + | h2o | - R OH | + | HX | (IVa) |
| x z x + | h2o | - X Z OH | + | HX | (IVb) |
| X Z OH + | h2o | HO Z OH | + | HX | (IVc) |
| hyaluronarr-COO Na | + HX | *- hyaluronarrCOOH + | NaX | (V) |
Alkoholy je rovněž nezbytné oddělit od žádaného produktu, což je možné srážením a dialýzou.
Vzniklý ester hyaluronanu (žádaný produkt) je možné izolovat srážením nebo dialýzou s následnou lyofilizací. V případě srážení je vhodným rozpouštědlem ke srážení například 2-propanol, aceton nebotetrahydrofuran.
Vznik esteru je prokázán v IR spektru vibrací karbonylové skupiny v(C=O) -1740 cm’1 a obsažený alkylový zbytek vibracemi v(CH2)as 2926 cm'1 a v(CH2)s 2853 cm'1.
V 13C NMR spektru se vznik esteru projeví signálem nové karbonylové skupiny, která má chemický posun -171 ppm.
Pokud je karboxylová skupina esterifikována arylalifatickým zbytkem, jsou přítomny v 13C NMR spektru signály fenylu -130-140 ppm.
V 1H NMR spektru se vznik alkyl esteru projeví signálem -4,2 ppm CH2 skupiny v těsném sousedství esterové skupiny a dále signály dalších methylenových skupin (např. pro hexyl: 1.70, 1.55, 1.38 ppm). Z poměru integrálu signálu methylenových skupin k integrálu signálu methylu z A/-acetylglukosaminu hyaluronanu lze stanovit stupeň substituce (DS) polymeru alkylovým řetězcem.
Pokud je karboxylová skupina esterifikována arylalifatickým zbytkem, jsou přítomny v 1H NMR spektru signály fenylu -7,3-7,5 ppm. Z poměru integrálu signálu fenylové skupiny k integrálu signálu methylu z N-acetylglukosaminu hyaluronanu lze stanovit stupeň substituce (DS) polymeru arylalkylovým řetězcem.
V» ·Φ ···· * · · ♦ · · ·· · · * · ♦ · ··· ·φ φ * »«· · φ φφ φφφ ····
-8- · *··»···· ···· φ φ· ·· φφ ··
Pokud je karboxylová skupina esterifikována aromatickým zbytkem, který absorbuje v UV-VIS oblasti, je možné prokázání substituce polymeru pomocí GPC analýzy s UV-VIS detekcí a stanovení procentuálního zastoupení jeho substituované a nesubstituované formy (resp. čistoty, zastoupení nízkomolekulárních UVabsorbujících činidel).
Vynález se dále týká esteru hyaluronanu připraveného způsobem podle vynálezu, které odpovídají obecnému vzorci A, B nebo C:
| hyaluronan | c -0 | R | |
| 0 | A | ||
| hyaluronan | C 0 | Z X | |
| o | B | ||
| hyaluronan | C 0 | Z 0 -C-hyaluronan | |
| ó | I 0 | C | |
| Kde R, | Z a X mají význam uvedený výše. |
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 1 v D2O, kde 1 = signál fenylu, 2 = signály methylenové skupiny, 3 = signál vody.
Obr. 2 znázorňuje GPC analýzu derivátu z příkladu 1, kde 1 je detektor rozptylu světla; 2 je refraktometrický detektor; 3 je UV detekce při 257 nm.
Obr. 3 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 2 v DzO, kde 1 = signál fenylu, 2 = signály methylenové skupiny, 3 = signál vody.
Obr. 4 znázorňuje GPC analýzu derivátu z příkladu 2, kde 1 je detektor rozptylu světla; 2 je refraktometrický detektor; 3 je UV detekce při 257 nm.
Obr. 5 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 3 v D2O, kde 1 = signál fenylu, 2 = signál methylenové skupiny, 3 = signál vody).
Obr. 6 znázorňuje GPC analýzu derivátu z příkladu 3, kde 1 je detektor rozptylu světla; 2 je refraktometrický detektor; 3 je UV detekce při 257 nm.
··
Obr. 7 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 4 v D2O, kde 1 = signál fenylu, 2 = signál methylenové skupiny v sousedství fenylu, 3 = signál vody).
Obr. 8 znázorňuje GPC analýzu derivátu z příkladu 4, kde 1 je detektor rozptylu světla; 2 je refraktometrický detektor; 3 je UV detekce při 257 nm.
Obr. 9 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 5 v D2O, kde 1 = signál methylu z -CH2- CH3, 2 = signál methylenu z -CH2- CH3, 3 = signál vody, 4 = signál NMR standardu).
Obr. 10 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 6 v D2O, kde 1a = signál středových methylenových skupin hexylu; 1b, 1c = signály methylenových skupin hexylu, 1d = signál methylenové skupiny vedle esterové vazby, 2 = signál vody, 3 = signál NMR standardu.
Obr. 11 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 7 v D2O, kde 1 = signál methylenu, 2 = signál DMSO, 3 = signál vody, 4 = signál NMR standardu.
Obr. 12 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 8 v D2O, kde 1 = signál methylenu, 2 = signál DMF, 3 = signál vody, 4 = signál NMR standardu.
Obr. 13 znázorňuje naměřené H-H COSY NMR spektrum derivátu z příkladu 8 v D2O, kde 1 = interakce methylenů -CH2-CH2-Br skupiny, 2 = interakce methylenů -CH2-CH2-OH skupiny, 3 = interakce vodíku v poloze 5 glukuronové části polymeru.
Obr. 14 znázorňuje naměřené HSQC NMR spektrum derivátu z příkladu 8 v D2O, kde 1 = interakce vodíku s uhlíkem nesoucím Br v -CH2-CH2-Br skupině.
Příklady provedeni vynálezu
Použitá zařízení
IR
FTIR 8400S spektrofotometer Shimadzu s hydraulickým lisem SSP-10A
NMR
300 MHz NMR spektrometr Bruker AVANCE ···
-10500 MHz NMR spektrometr Bruker AVANCE III
600 MHz NMR spektrometr Bruker AVANCE
GPC
HPLC (Agilent), rozptyl světla DAWN EOS (Wyatt), refraktometrický detektor Optilab rEX (Wyatt); separace: 2 za sebou zapojené kolony PL aquagel OH 30 (bez termostatu); mobilní fáze: 0.1 M NaH2PO4 . 2H2O + 0.05 % NaN3, pH=7,5; průtok mobilní fáze: 0,8 ml / min; dávkovaný objem vzorku: 100 μΙ.
Odstředivka
Centrifuga chlazená Jouan BR4i
Lyofilizátor
Lyofilizátor PowerDry PL3000
Dialýza
Dialyzační střeva Pierce, SnakeSkin Pleated Dialysis Tubing, 3500 MWCO, 22 mm x 35 feet dry diameter
Molekulová hmotnost výchozího hyaluronanu (zdroj: CPN s.r.o., Dolní Dobrouč, ČR) byla stanovena metodou SEC-MALLS.
Příklad 1
Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované benzylchloridem
Hyaluronan sodný (Mr = 24,09 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozpustí při teplotě 23 °C v 10 ml vody a přidá se 40 ml DMSO (směs se zahřívá uvolněným směšovacím teplem). Směs je ochlazena na 23 °C a za míchání se přidá benzylchlorid (0,4315 ml; 3,75 mmol). Směs se míchá 4 dny při 45 °C. Posléze je směs ochlazena na 23 °C a produkt vysrážen přídavkem 2-propanolu (100 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 4 x 20 ml 2-propanolu. Produkt je sušen 50 min při 40 °C. Po usušení je derivát rozpuštěn v 10 ml vody, přidá se 10 ml roztoku 0,4 M NaHCO3 ochlazeného na 4 °C a směs je míchána 5 min. Následuje dialýza proti vodě. Roztok po dialýze je odstředěn (4000 RPM /10 min) a supernatant je zamražen a lyofilizován.
• φ • · φ · φ φ · · · · · * . Λ · ···· ·· · φ · ♦ · · ···
-11- · ·····*·· ♦ ··· 4 ·· «φ φφ ΦΦ
FT-IR v (KBr) cm·1: 3419, 2921, 2896, 1733, 1652, 1616, 1558, 1411, 1377, 1321, 1236, 1207, 1153, 1080, 1045.
13C NMR (300 MHz, D2O) δ: 177.81, 176.60, 171.30 (-C(=O)-O-); 137.84, 131.97 (fenyl); 106.04, 103.44, 85.49, 82.85, 78.25, 76.48, 75.35, 71.34, 63.43, 57.18, 25.37.
1H NMR (300 MHz, D2O) δ: 7.5 (m, 5H, fenyl); 5.40, 5.36, 5.28, 5.24 (d, 2H, CH2).
DOSY NMR: viz Obr. 1.
GPC-UV detekce: viz Obr. 2.
DS: 10 % (stupeň substituce stanovený na základě kombinace 1H NMR a GPC-UV analýzy)
Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázání aromatického zbytku na hyaluronan (Obr. 1.). Signály aromatiky se nacházejí ve stejné oblasti difúzního koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že aromatický zbytek musí být vázán na polymer. Signál -CH2- skupiny v sousedství fenylu je rovněž součástí polymeru.
Na základě poměru integrálů signálů fenylu a methylu z Nacetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) benzylu 11,6 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.
Na základě poměru integrálů signálů methylenové skupiny a methylu z Nacetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) benzylu 11,5 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.
Na základě GPC analýzy došlo k rozdělení substituované HA benzylovým zbytkem od nízkomolekulámího nevázaného benzylového zbytku (Obr. 2., 3. křivka). Z UV detekce při 257 nm, při které absorbuje aromatika benzylu je patrné, že absorbuje i polymerní frakce, kterou je kyselina hylauronová a tudíž musí být substituována aromatickým zbytkem.
Z poměru ploch pod píky UV křivky byl stanoven poměr vázaného a nevázaného benzylu (81,9 % navázaného) a v kombinaci se stanovením celkového obsahu aromatiky z 1H NMR byl zjištěn DS=10 % benzylovým zbytkem.
* * »* .·· ·· · · « * 4 · * · · φ * * • * · · ♦ ·«* · ♦ · · **·· · · · · · ♦ · · ··· _ 19 _ · *······· 1 ·«*« · ·« · ·· ·♦
Příklad 2
Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované benzylchloridem v přítomnosti báze
Hyaluronan sodný (Mr = 24,09 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozpustí při teplotě 23 °C v 5 ml vody a přidá se 45 ml DMSO. Směs je ochlazena na 23 °C a za mícháni se přidá benzylchlorid (0,4315 ml; 3,75 mmol). Směs se míchá 4 dny při 45 °C. Během reakce je postupně přidáván 1 M NaHCO3 tak, aby bylo pH=7 (celkem přidáno 2 ml 1 M NaHCO3). Posléze je směs ochlazena na 23 °C a produkt vysrážen přídavkem 2-propanolu (150 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána, přidá se 2-propanol (40 ml) a sraženina je znovu 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 4 x 20 ml 2-propanolu. Produkt je sušen 1,5 h při 40 °C. Po usušení je derivát rozpuštěn v 50 ml DMSO, přidá se 40 ml vody ochlazené na 4°C a směs je míchána 10 min. Přidá se 10 ml roztoku 0,4 M NaHCO3 ochlazeného na 4°C a směs je míchána 15 min. Následuje dialýza proti vodě. Roztok po dialýze je odstředěn (3000 RPM /10 min) a supernatant je zamražen a lyofilizován.
FT-IR v (KBr) cm’1: 3415, 2921, 2893, 1745, 1646, 1614, 1556, 1498, 1407, 1377, 1315, 1215, 1153, 1080, 1045.
13C NMR (500 MHz, D2O) δ: 177.86, 176.67, 171.34 (-C(=O)-O-); 137.89, 132.00, 131.93 (fenyl); 106.10, 103.38, 85.53, 82.88, 78.29, 76.52, 75.38, 75.00, 71.22, 71.00, 63.44, 57.22, 25.41.
1H NMR (500 MHz, D2O) δ: 7.52, 7.51, 7.49, 7.47, 7.40, 7,38 (m, 5H, fenyl); 5.44, 5.41,5.40, 5.38, 5.31, 5.28, 5.26, 5.24 (m, 2H, CH2).
DOSY NMR: viz Obr. 3.
GPC-UV detekce: viz Obr. 4.
DS: 24 % (stupeň substituce stanovený na základě kombinace 1H NMR a GPC-UV analýzy)
Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázání aromatického zbytku na hyaluronan (Obr. 3.). Signály aromatiky se nacházejí ve stejné oblasti difůzního koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že aromatický zbytek musí být vázán na polymer. Signál -CH2- skupiny v sousedství fenylu je rovněž součástí polymeru.
-13* ♦ ··
Na základě poměru integrálů signálů fenylu a methylu z Nacetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) benzylu 34,0 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.
Na základě poměru integrálů signálů methylenové skupiny a methylu z Nacetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) benzylu 29,5 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.
Na základě GPC analýzy došlo k rozdělení substituované HA benzylovým zbytkem od nízkomolekulámího nevázaného benzylového zbytku (Obr. 4., 3. křivka). Z UV detekce při 257 nm, při které absorbuje aromatika benzylu je patrné, že absorbuje i polymemí frakce, kterou je kyselina hylauronová a tudíž musí být substituována aromatickým zbytkem.
Z poměru ploch pod píky UV křivky byl stanoven poměr vázaného a nevázaného benzylu (70,5 % navázaného) a v kombinaci se stanovením celkového obsahu aromatiky z 1H NMR byl zjištěn DS=24 % benzylovým zbytkem.
Příklad 3
Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované benzylbromidem
Hyaluronan sodný (Mr - 24,09 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozmíchá při teplotě 23 °C ve 2 ml DMSO a do vzniklé suspenze se přidá 0,2 ml vody. Za stálého míchání se přidá benzylbromid (0,2973 ml; 2,50 mmol). Směs se míchá 43 h při 45 °C. Posléze je směs ochlazena na 23 °C, naředěna 7,5 ml DMSO a produkt je vysrážen přídavkem 2-propanolu (20 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 4 x 20 ml 2-propanolu. Produkt je sušen 35 min při 40 °C. Po usušení je derivát rozpuštěn v 10 ml DMSO, přidá se 10 ml vody ochlazené na 4°C a 10 ml 0,2 M NaHCO3 ochlazeného na 4°C a směs je míchána 5 min. Následuje dialýza proti vodě. Roztok po dialýze je odstředěn (4000 RPM / 10 min) a supernatant je zamražen a lyofilizován.
FT-IRv(KBr) cm'1: 3429, 2894, 1735, 1647, 1612, 1560, 1411,1377, 1319, 1234, 1207,1153,1080,1047.
13C NMR (500 MHz, D2O) δ: 177.85, 177.56, 176.33, 171.32 (-C(=O)-O-); 137.87, 132.15, 131.99, 131.91 (fenyl); 106.06, 103.48, 85.95, 85.45, 82.86, 78.28, 76.56, 75.35, 71.34, 63.45, 57.20, 25.39, 24.90.
• · · ·* φφ ** ·* ν Φ Φ φφφ · · · · • · · « φφφ* · · · · • ···* φ · φ · · · · Φ··
- 14 - · ··»,»·· 1Η NMR (500 MHz, D2O) δ: 7.55, 7.53, 7.52 (m, 5Η, fenyl); 5.43, 5.40, 5.31, 5.28 (d, 2Η, CH2).
DOSY NMR: viz Obr. 5.
GPC-UV detekce: viz Obr. 6.
DS: 12 % (stupeň substituce stanovený na základě kombinace 1H NMR a GPC-UV analýzy)
Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázáni aromatického zbytku na hyaluronan (Obr. 5.). Signály aromatiky se nacházejí ve stejné oblasti difúzniho koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že aromatický zbytek musí být vázán na polymer. Signál -CH2- skupiny v sousedství fenylu je rovněž součástí polymeru.
Na základě poměru integrálů signálů fenylu a methylu z W-acetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) benzylu 15,0 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.
Na základě poměru integrálů signálů methylenové skupiny a methylu z N-acetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) benzylu 11,0 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.
Na základě GPC analýzy došlo k rozdělení substituované HA benzylovým zbytkem od nízkomolekulárního nevázaného benzylového zbytku (Obr. 6., 3. křivka). Z UV detekce při 257 nm, při které absorbuje aromatika benzylu je patrné, že absorbuje i polymerní frakce, kterou je kyselina hylauronová a tudíž musí být substituována aromatickým zbytkem.
Z poměru ploch pod píky UV křivky byl stanoven poměr vázaného a nevázaného benzylu (76,4 % navázaného) a v kombinaci se stanovením celkového obsahu aromatiky z 1H NMR byl zjištěn DS=12 % benzylovým zbytkem.
Příklad 4
Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované 2-fenylethylbromidem
Hyaluronan sodný (Mr = 24,09 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozmíchá při teplotě 23 °C ve 2 ml DMSO a do vzniklé suspenze se přidá 0,2 ml vody. Za stálého míchání se přidá 2-fenylethylbromid (0,3414 ml; 2,50 mmol). Směs se míchá 6 dní při τ w « * vv v v « · · · ♦ ··· ·· · · • «··* «· * · ·«·· ··· _ 4Κ _ · ·······* 1 *··· · ·* «· ·· ·· °C. Posléze je směs ochlazena na 23 °C, naředěna 7,5 ml DMSO a produkt je vysrážen přídavkem 2-propanolu (30 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 4 x 20 ml 2-propanolu. Produkt je sušen 40 min při 40 °C. Po usušení je derivát rozpuštěn v 10 ml DMSO, přidá se 10 ml vody ochlazené na 4 °C a 10 ml 0,4 M NaHCO3 ochlazeného na 4 °C a směs se míchá 5 min. Následuje dialýza proti vodě. Roztok po dialýze je odstředěn (4000 RPM / 10 min) a supernatant je zamražen a lyofilizován.
FT-IR v (KBr) cm'1: 3409, 2918, 2894, 1743, 1647, 1620, 1560, 1498, 1409, 1375, 1315, 1228, 1205, 1153, 1076, 1037.
13C NMR (500 MHz, D2O) δ: 177.81, 177.48, 176.42, 171.41 (-C(=O)-O-); 141.12, 132.10, 131.73, 129.86 (fenyl); 106.03, 103.47, 85.95, 85.47, 82.84, 82.44, 78.26, 76.50, 75.34, 74.98, 71.32, 70.00, 63.43, 57.18, 36.83 (CH2), 25.37, 25.25.
1H NMR (500 MHz, D2O) δ: 7.45, 7.43, 7.40, 7.39, 7.36 (m, 5H, fenyl); 4.53 (t, 2H, CH2); 3.07 (t, 2H, CH2).
DOSY NMR: viz Obr. 7.
GPC-UV detekce: viz Obr. 8.
DS: 23 % (stupeň substituce stanovený na základě kombinace 1H NMR a GPC-UV analýzy)
Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázání aromatického zbytku na hyaluronan (Obr. 7.). Signály aromatiky se nacházejí ve stejné oblasti difúzního koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že aromatický zbytek musí být vázán na polymer. Signál -CH2- skupiny v sousedství fenylu je rovněž součástí polymeru.
Na základě poměru integrálů signálů fenylu a methylu z /V-acetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) 2-fenylethylu 23,8 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.
Na základě poměru integrálů signálů CH2 skupiny v sousedství fenylu a methylu z N-acetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) 2-fenylethylu 21,0 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.
Na základě GPC analýzy došlo k rozdělení substituované HA 2-fenylethylovým zbytkem od nízkomolekulárního nevázaného 2-fenylethylového zbytku ♦ · · ·« φ* ♦··♦ • · · φφφ Φ♦ Φ · • · · k φ ··« * · ·♦ • ···♦ « Φ φφ φ φ · ···· ·φφφβφ·Φφ * 10- «««* ν ·· «· φ« ·· (Obr. 8., 3. křivka). Z UV detekce při 257 nm, při které absorbuje aromatika 2-fenylethylu je patmé, že absorbuje i polymerní frakce, kterou je kyselina hylauronová, a tudíž musí být substituována aromatickým zbytkem.
Z poměru ploch pod píky UV křivky byl stanoven poměr vázaného a nevázaného 2-fenylethylu (95,9 % navázaného) a v kombinaci se stanovením celkového obsahu aromatiky z 1H NMR byl zjištěn DS=23 % 2-fenylethylovým zbytkem.
Přiklad 5
Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované ethyljodidem
Hyaluronan sodný (Mr = 24,09 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozmíchá při teplotě 23 °C ve 2 ml DMSO a do vzniklé suspenze se přidá 0,2 ml vody. Za stálého míchání se přidá ethyljodid (0,0800 ml; 1,00 mmol). Směs se míchá 7 dni při 45 °C. Posléze je směs ochlazena na 23 °C, naředěna 8 ml DMSO a produkt je vysrážen přídavkem 2-propanolu (40 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 4 x 20 ml 2-propanolu. Produkt je sušen 1 h při 40 °C. Po usušeni je derivát rozpuštěn ve 20 ml 0,2 M NaHCO3 během 25 min. Následuje dialýza proti vodě. Roztok po dialýze je odstředěn (3000 RPM /10 min) a supernatant je zamražen a lyofilizován.
FT-IR v (KBr) cm'1·. 3413, 2894, 1735, 1647, 1616, 1560, 1407, 1377, 1315, 1226, 1205, 1151, 1078, 1047.
13C NMR (300 MHz, D2O) δ: 177.87, 176.73, 171.71 (-C(=O)-O-); 106.11, 103.49, 85.55, 82.91, 82.38, 78.31, 76.56, 75.41, 75.05, 71.38, 66.08 (CH2), 63.48, 57.23, 25.42, 16.17 (CHg).
1H NMR (300 MHz, D2O) δ: 4.30, 4.29 (m, 2H, CH2); 1.31,1.30, 1.28 (t, 3H, CHg).
DOSY NMR: viz Obr. 9.
DS: 24 % (stupeň substituce stanovený na základě 1H NMR)
Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázání ethylového zbytku na hyaluronan (Obr. 9.). Signály methylové a methylenové skupiny ethylu se nacházejí ve stejné oblasti difúzniho koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že ethylový zbytek musí být vázán na polymer.
• ·♦ ·· 44·· • 4 4 4 4 4 4 · • · · *4 444 · ♦ 4 4 • ·♦·· 44 ·· 444 ··♦·
-Ύ 4444.4444
- Ί/ “ ·♦»· 4 4» .4 4444
Na základě poměru integrálů signálů methylu z ethylové skupiny a methylu z N-acetylglukosaminu HA byl stanoven obsah ethylu 22,3 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.
Na základě poměru integrálů signálů CH2 skupiny ethylu a methylu z Nacetylglu kosa minu HA byl stanoven obsah ethylu 25,5 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.
Přiklad 6
Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované 1,6-dibromhexanem
Hyaluronan sodný (Mr = 72,81 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozpustí při teplotě 23 °C v 5 ml vody a přidá se 45 ml DMSO. Za stálého míchání se přidá 1,6-dibromhexan (0,0769 ml; 0,50 mmol). Směs se míchá 49,5 h při 60 °C. Posléze je směs ochlazena na 23 °C a produkt je vysrážen přídavkem 2-propanolu (150 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 2 x 20 ml a 2 x 30 ml 2-propanolu. Produkt je sušen 1,5 h při 40 °C. Po usušení je derivát rozpuštěn ve směsi 40 ml vody a 10 ml roztoku 0,4 M NaHCOa mícháním během 1 h. Následuje dialýza proti vodě. Roztok po dialýze je odstředěn (3000 RPM /10 min) a supernatant je zamražen a lyofilizován.
FT-IR v (KBr) cm’1: 3411, 2925, 1739, 1643, 1614, 1558, 1407, 1377, 1315, 1230, 1205, 1151, 1076, 1045.
1H NMR (500 MHz, D2O) δ: 4.30 (m, 2H, 2x CH2); 1.72, 1.57 (m, 2H, 2x CH2); 1.40 (m, 2H, 2x CH2).
DOSY NMR: viz Obr. 10.
Obsah hexylu: 15 % (stanoveno na základě 1H NMR).
Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázání hexylového zbytku na hyaluronan (Obr. 10.). Signály methylenových skupin hexylu se nacházejí ve stejné oblasti difúzniho koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že hexylový zbytek musí být vázán na polymer.
Na základě poměru integrálů signálů středových CH2 skupin hexylu a methylu z W-acetylglukosaminu HA byl stanoven obsah hexylu 15 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.
*«
-18Přiklad 7
Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované 1,2-dibromethanem
Hyaluronan sodný (Mr = 18,8 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozpustí při teplotě 23 °C ve 2,5 ml vody a přidá se 2,5 ml DMSO. Za stálého míchání se přidá 1,2dibromethan (0,3232 ml; 3,75 mmol). Směs se míchá 68 h při 60 ’C. Posléze je směs ochlazena na 23 °C, přidá se 1 ml DMSO a produkt je vysrážen přídavkem acetonu (24 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 3 x 10 ml acetonu. Produkt je sušen v exsikátoru 24 h při 23 °C.
FT-IR v (KBr) cm’1: 3402, 3001, 2916, 2538, 1743, 1654, 1556, 1434, 1407, 1375, 1315,1259, 1218, 1153, 1078, 1047.
1H NMR (500 MHz, D2O) δ: 4,3 (m, 2H, 2x CH2).
DOSY NMR: viz Obr. 11.
DS: 13 % (stupeň substituce stanovený na základě 1H NMR)
Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázáni zbytku 1,2dibromethanu na hyaluronan (Obr. 11.). Signál methylenových skupin se nachází ve stejné oblasti difúzního koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že zbytek 1,2-dibromethanu musí být vázán na polymer.
Na základě poměru integrálů signálu methylenu a methylu z N-acetylglukosaminu HA byl stanoven obsah zbytku 1,2-dibromethanu 13 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.
Příklad 8
Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované 1,2-dibromethanem ve směsi vodaDMF (A/,A/-dimethylformamid)
Hyaluronan sodný (Mr = 18,8 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozpustí při teplotě 23 °C ve 2,5 ml vody a přidá se 2,5 ml DMF. Za stálého míchání se přidá 1,2dibromethan (0,3232 ml; 3,75 mmol). Směs se míchá 72 h při 60 °C. Posléze je směs ochlazena na 23 °C a produkt je vysrážen přídavkem acetonu (20 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 3 x 10 ml acetonu Produkt je sušen v exsikátoru 24 h při 23 °C.
- 19 • · «·«
FT-IR v (KBr) cm'1: 3411, 2921, 2894, 1747, 1658, 1556, 1377, 1313, 1257, 1217, 1153, 1078, 1045.
1H NMR (600 MHz, D2O) δ: 4,3 (m, 2H, 2x CH2).
DOSY NMR: viz Obr. 12.
DS: 42 % (stupeň substituce stanovený na základě 1H NMR)
H-H COSY: viz Obr. 13
HSQC: viz Obr. 14
Obsah -CH2-CH2-OH skupin: 26 %
Obsah -ΟΗ2-ΟΗ2-Βγ skupin: 16 %
Elementární analýza Br: 11 % (molárně na disacharidickou jednotku HA)
Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázání zbytku 1,2dibromethanu na hyaluronan (Obr. 12.). Signál methylenových skupin se nachází ve stejné oblasti difúzního koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že zbytek 1,2-dibromethanu musí být vázán na polymer.
Naměřené H-H COSY spektrum derivátu ukázalo interakce dvou nově vzniklých signálů 4,3 a 4,4 ppm se sousedními vodíky (3,87 ppm), které přísluší CH2-CH2-OH skupině. Dále pak interakce dvou nové vzniklých signálů 4,55 a 4,65 ppm se sousedními vodíky (3,71 ppm), které přísluší -CH2-CH2-Br skupině. Nakonec je to také přítomnost nového signálu v oblasti —4,1 ppm, který přísluší posunutému signálu skeletárního vodíku v poloze 5 glukuronové kyseliny, a k němu příslušnou interakci (3,9 ppm). Signál při 4,1 ppm vyjadřuje celkovou substituci jak -CH2-CH2OH skupinou tak i -CH2-CH2-Br skupinou, která měla hodnotu 42 %.
Na základě rozdílu integrálů signálu vodíku v poloze 5 glukuronové kyseliny (4,1 ppm) a signálu vodíku -CH2-CH2-OH (4,3 ppm) skupiny byl stanoven obsah CH2-CH2-Br skupin 16 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.
Naměřené HSQC spektrum derivátu ukázalo interakci signálu 3,71 ppm s příslušným uhlíkem s posunem 28 ppm. Z hodnoty ulikového posunu se jedná o uhlík nesoucí Br.
Naměřená NMR spektra H-H COSY a HSQC a výsledek elementární analýzy obsahu Br potvrzují strukturu B nároku 14.
!
• · · · *
·· toto • · to · to • ··· to · * to* · · ♦ ·
Příklad 9
Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované 1,2-dibromethanem
Hyaluronan sodný (Mr = 18,8 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozpustí při teplotě 23 °C ve 2,5 ml vody a přidá se 2,5 ml DMSO. Za stálého míchání se přidá 1,2dibromethan (0,3232 ml; 3,75 mmol). Směs se míchá 76 h při 60 °C. Během reakce je udržováno pH reakční směsi na hodnotě 7 pomocí 1 M NaHCO3. Posléze je směs ochlazena na 23 °C, přidá se 1 ml DMSO a 1 ml vody a produkt je vysrážen přídavkem acetonu (28 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 3 x 10 ml acetonu. Produkt je sušen v exsikátoru 24 h při 23 °C. Po usušení je derivát rozpuštěn ve směsi 60 ml vody a 40 ml roztoku 0,1 M NaHCO3 mícháním během 2 h. Následuje dialýza proti 0,1% hm. roztoku NaCi a poté dialýza proti vodě. Roztok po dialýze je odstředěn (3000 RPM / 10 min) a supernatant je zamražen a lyofilizován.
FT-IR v (KBr) cm'1: 3394, 2921, 2893, 1743, 1653, 1616, 1560, 1407, 1377, 1317, 1234, 1207, 1151, 1078, 1045.
1H NMR (500 MHz, D2O) δ: 4,3 (m, 2H, 2x CH2).
DS: 17 % (stupeň substituce stanovený na základě 1H NMR)
Mr: 140,7 kDa
Na základě poměru integrálů signálu methylenu a methylu z W-acetylglukosaminu HA byl stanoven obsah zbytku 1,2-dibromethanu 17 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.
Nárůst molekulové hmotnosti derivátu na hodnotu 140,7 kDa z výchozí hodnoty molekulové hmotnosti hyaluronanu 18,8 kDa potvrzuje síťování derivátu a tím strukturu C v nároku 14.
Claims (14)
1. Způsob přípravy esterů hyaluronanu, vyznačující se tím, že hyaluronan nesoucí skupinu COOH nebo COO’Na+, se rozpustí ve vodě, roztok se ochladí na laboratorní teplotu, přidá se s vodou mísitelné organické rozpouštědlo, a pak se přidá esterifikační činidlo R-X nebo X-Z-X, kde R a Z jsou alifatický, cykloalifatický, olefinický, arylalifatický či heterocyklický zbytek s počtem uhlíků 1 až 18, volitelně s obsahem hydroxy skupiny a/nebo disulfidického můstku, a X je Cl, Br nebo I, a výsledná reakční směs se míchá po dobu 1 hod až 6 dní, přičemž pH reakční směsi se udržuje na hodnotě 6 až 10.
2. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle nároku 1, vyznačující se tím, že se hyaluronan rozpustí ve vodě při teplotě 5 až 80 °C.
3. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že koncentrace roztoku hyaluronanu je v rozmezí 0,01 až 10 %hmotn.
4. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle nároku 3, vyznačující se tím, že koncentrace roztoku hyaluronanu je v rozmezí 1 až 10 %hmotn.
5. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že výsledná koncentrace organického rozpouštědla v roztoku hyaluronanu je v rozmezí 10 až 95 % hmotn.
6. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle nároku 5, vyznačující se tím, že koncentrace organického rozpouštědla v roztoku hyaluronanu je 90 % hmotn.
7. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že po přidání esterifikačního činidla se směs míchá při teplotě 5 až 80 °C.
8. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle nároku 5, vyznačující se tím, že se směs míchá při teplotě 45 °C.
9. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle nároku 7 nebo 8, vyznačující se tím, že po přidání esterifikačního činidla se směs míchá po dobu 72 hodin.
·· 4 «V «· 44*« **· * 4 4 4 · 44 • 44 * 44» 4 4 44 • ·*·· φ 44 ·»· ·444 » V ♦ > φ · · 44 ··» · Φ φΦ φφΦ«
10. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že molární ekvivalent přidaného esterifikačniho činidla je 0,2 až 3 vůči disacharidické jednotce hyaluronanu.
11. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že pH reakční směsi je udržováno na hodnotě 7 postupným přidáváním báze Na+Yn' (n=1, 2, 3), kde Yn' je vybrán ze skupiny zahrnující OH‘, HCO3’, CO32', PO?', HPO?', H2PO4·, F.
12. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronové nebo její sodná sůl má hmotnostně střední molekulovou hmotnost v rozsahu 4.103 až 5.106 g.mol·1.
13. Způsob podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že s vodou mísitelné organické rozpouštědlo je vybráno ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, /V.N-dimethylformamid, Λ/,/V-dimethylacetamid a N-methylpyrrolidon.
14. Ester hyaluronanu připravený způsobem podle kteréhokoli z předchozích nároků, odpovídající obecnému vzorci A, B nebo C hyaluronan C O R hyaluronan C O Z X Ó hyaluronan C O Z O C hyaluronan O O přičemž R, Z a X mají význam uvedený výše.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20090399A CZ2009399A3 (cs) | 2009-06-24 | 2009-06-24 | Zpusob prípravy esteru hyaluronanu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20090399A CZ2009399A3 (cs) | 2009-06-24 | 2009-06-24 | Zpusob prípravy esteru hyaluronanu |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2009399A3 true CZ2009399A3 (cs) | 2011-01-05 |
Family
ID=43410308
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20090399A CZ2009399A3 (cs) | 2009-06-24 | 2009-06-24 | Zpusob prípravy esteru hyaluronanu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2009399A3 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11425907B2 (en) | 2018-08-23 | 2022-08-30 | Contipro A.S. | Composition comprising an iodide and a derivative of hyaluronic acid with an oxidative effect, method of preparation thereof and use thereof |
-
2009
- 2009-06-24 CZ CZ20090399A patent/CZ2009399A3/cs unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11425907B2 (en) | 2018-08-23 | 2022-08-30 | Contipro A.S. | Composition comprising an iodide and a derivative of hyaluronic acid with an oxidative effect, method of preparation thereof and use thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2559447C2 (ru) | Способ получения окисленного производного гиалуроновой кислоты и способ его модификации | |
| JP5945504B2 (ja) | ヒアルロン酸の酸化誘導体，その調製方法及びその修飾方法 | |
| CZ301555B6 (cs) | Zpusob prípravy DTPA sítovaných derivátu kyseliny hyaluronové a jejich modifikace | |
| JP5372773B2 (ja) | 酸性多糖類の誘導体 | |
| Dong et al. | Amphiphilic hydroxyalkyl cellulose derivatives for amorphous solid dispersion prepared by olefin cross-metathesis | |
| EP1992364A1 (en) | Carboxylated polysaccharides phosphated or bisphosphonated derivatives, optionally cross-linked, and their preparation and biomedical uses | |
| JP2012520902A (ja) | （ｏ‐アシル‐ｏ’‐アルキルカーボネート‐置換ピリジン）錯体によるヒアルロン酸の修飾方法 | |
| US20220298265A1 (en) | Amphiphilic polysaccharides, polysaccharide-based hydrogels, and methods of manufacture | |
| Würfel et al. | Chemical Modification of Pectin and Polygalacturonic Acid: A Critical Review. | |
| Münster et al. | Mechanism of sulfonation-induced chain scission of selectively oxidized polysaccharides | |
| Tanaka et al. | Synthesis and gel formation of hyperbranched supramolecular polymer by vine-twining polymerization using branched primer–guest conjugate | |
| EP1261646B1 (en) | Gels of hyaluronic acid cross-linked with bi-functional l-aminoacids or l-aminoesters or mixtures thereof | |
| Buffa et al. | α, β-Unsaturated aldehyde of hyaluronan—Synthesis, analysis and applications | |
| Chen et al. | Synthesis and characterization of water-soluble chitosan grafted with hydrophilic aliphatic polyester | |
| ITPD950089A1 (it) | Acido ialuronico e suoi derivati esterei per la preparazione di matri- ci per il rilascio controllato di farmaci | |
| CA3163068A1 (en) | Thiol-modified polymer compound, and preparation method therefor and application thereof | |
| JP2023502470A (ja) | スルフヒドリル変性ヒアルロン酸及びその調製方法並びに用途 | |
| CZ2009399A3 (cs) | Zpusob prípravy esteru hyaluronanu | |
| US11203649B2 (en) | Functionalized hyaluronic acid or a derivative thereof in the treatment of inflammatory states | |
| JP2009516765A (ja) | 新規ヒアルロン酸誘導体、その製造方法及びその使用 | |
| JP6982321B2 (ja) | 多糖類の不飽和誘導体，その調製方法及びその使用 | |
| US6482941B1 (en) | Carboxylated polysaccharides 6-substituted | |
| JP2018519391A (ja) | 硫酸化多糖類の誘導体，ならびにその調製，修飾及び使用方法 | |
| Marchetti et al. | Synthesis of 6-deoxy-6-chloro and 6-deoxy-6-bromo derivatives of scleroglucan as intermediates for conjugation with methotrexate and other carboxylate containing compounds | |
| CN103298837B (zh) | 获得在n-乙酰基-半乳糖胺残基的4-或6-位硫酸化的软骨素的方法 |