CZ200475A3 - General-purposes cell system for testing ingression of substances into cell nuclei - Google Patents
General-purposes cell system for testing ingression of substances into cell nuclei Download PDFInfo
- Publication number
- CZ200475A3 CZ200475A3 CZ200475A CZ200475A CZ200475A3 CZ 200475 A3 CZ200475 A3 CZ 200475A3 CZ 200475 A CZ200475 A CZ 200475A CZ 200475 A CZ200475 A CZ 200475A CZ 200475 A3 CZ200475 A3 CZ 200475A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nls
- egfp
- sequence
- testing
- cell
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 title abstract description 4
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 21
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 4
- 102100029462 Sodium-dependent lysophosphatidylcholine symporter 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710185583 Sodium-dependent lysophosphatidylcholine symporter 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 17
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 abstract description 14
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 abstract description 14
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 abstract 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 30
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 17
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 7
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 7
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 210000004492 nuclear pore Anatomy 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000011781 Karyopherins Human genes 0.000 description 2
- 108010062228 Karyopherins Proteins 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- 108010022579 ATP dependent 26S protease Proteins 0.000 description 1
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 1
- 101000997963 Aequorea victoria Green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032826 Homeodomain-interacting protein kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710110791 Homeodomain-interacting protein kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000003789 Nuclear pore complex proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000163 Nuclear pore complex proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010068086 Polyubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108091005971 Wild-type GFP Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 101150073130 ampR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 201000005264 laryngeal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000006674 lysosomal degradation Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000025308 nuclear transport Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- MVMXJBMAGBRAHD-UHFFFAOYSA-N picoperine Chemical compound C=1C=CC=NC=1CN(C=1C=CC=CC=1)CCN1CCCCC1 MVMXJBMAGBRAHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007363 regulatory process Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Univerzální buněčný systém pro testování vstupu látek do jaderUniversal cell system for testing the entry of substances into nuclei
Oblast techniky:Technical field:
Toto řešení náleží do oblasti molekulární genetiky a genové terapie, klonování rekombinantních DNA molekul, vytvoření geneticky modifikovaných, stabilně transformovaných buněčných linií. Vynález je úzce spojen s použitím DNA expresního vektoru nesoucí reportérový fúzní protein, který umožňuje monitorovat transport látek přes jadernou membránu.This solution belongs to the field of molecular genetics and gene therapy, cloning of recombinant DNA molecules, creation of genetically modified, stably transformed cell lines. The invention is closely related to the use of a DNA expression vector carrying a reporter fusion protein that allows the transport of substances across the nuclear membrane to be monitored.
Dosavadní stav techniky:BACKGROUND OF THE INVENTION:
GFP (Green fluorescent protein) je v molekulární biologii často užívaným markérem pro sledování pochodů v buňce, ke studiu genové exprese a lokalizace proteinů. Poprvé byl izolován z mořského živočicha, medúzy Aequorea victoria. Celý gen je tvořen 238 aminokyselinami. Je schopen tvořit fúzní proteiny jak na C-, tak i N- konci při současném zachování fluorescence.GFP (Green fluorescent protein) is a frequently used marker in molecular biology to monitor cell pathways, to study gene expression and protein localization. It was first isolated from a marine animal, the jellyfish Aequorea victoria. The entire gene consists of 238 amino acids. It is able to form fusion proteins at both the C- and N- termini while maintaining fluorescence.
GFP fluoreskuje díky chromoforu, který vzniká autokatalyticky cyklizací tří aminokyselin za přítomnosti molekulárního kyslíku. Nevyžaduje pro svou fluorescenci žádné další substráty nebo koíaktory (1). Proces intramolekulámí biosyntézy GFP chromoforu vyžaduje oxidaci O2 a vedlejším produktem této reakce je uvolnění molekul H2O2 ve stechiometrickém poměru 1:1 vztažené k počtu vzniklých molekul GFP s aktivním chromoforem (2) , viz Obr. 1. Generované kyslíkové radikály se stávají pro buňku toxickými s následnou indukcí apoptózy (3).GFP fluoresces due to the chromophore that is formed autocatalytically by cyclizing three amino acids in the presence of molecular oxygen. It does not require any other substrates or coactors for its fluorescence (1). The process of intramolecular biosynthesis of the GFP chromophore requires O 2 oxidation and a byproduct of this reaction is the release of H 2 O 2 molecules in a stoichiometric ratio of 1: 1 based on the number of GFP molecules produced with active chromophore (2). 1. Generated oxygen radicals become toxic to the cell with subsequent induction of apoptosis (3).
V současné době je známo několik typů mutant GFP, které se dělí do skupin podle typu jejich chromoforu, který je zodpovědný za fluorescenci. EGFP (enhanced GFP) je mutantní variantou divokého typu (wild-type) GFP, ve které došlo k substituci dvou aminokyselin, a to k záměně Phe za Leu v poloze 64 a Ser za Thr v poloze 65. EGFP má na rozdíl od divokého typu jiné spektrální vlastnosti, jasnější fluorescenci a výrazně se liší ve schopnosti fluorescence při 37°C. Zatímco divoký typ fluoreskuje při pokojové a teplotáchSeveral types of GFP mutants are currently known to be grouped according to the type of their chromophore that is responsible for fluorescence. EGFP (enhanced GFP) is a mutant wild-type variant of GFP in which two amino acids have been substituted, namely a Phe to Leu substitution at position 64 and a Ser to Thr at position 65. EGFP, unlike the wild type other spectral properties, clearer fluorescence, and differ significantly in fluorescence at 37 ° C. While the wild type fluoresces at room and temperature
*-4—* nižších, EGFP má schopnost fluoreskovat při 37^C. Jinak jsou si mutanty strukturálně velice podobné (4).* -4 - * lower, EGFP has the ability to fluoresce at 37 ° C. Otherwise, the mutants are structurally very similar (4).
Použití GFP nebo EGFP je předmětem mnoha řešení patentů. Příkladem může být patent US2002009712. Příkladem využití GFP fúzního proteinu, např. s Gas proteinem je patentThe use of GFP or EGFP is the subject of many patent solutions. An example is US2002009712. An example of use of a GFP fusion protein, e.g., with a Gas protein, is patent
Z5Í^zVo03008435.Z5i ^ zVo03008435.
Nukleární lokalizační signál (NLS) je jedním z řady lokalizačních signálů, který řídí jaderný transport látek. Kromě mitózy, kdy je jaderná membrána rozpadlá, je transport látek řízen komplexem jaderných pórů NPC (nuclear póre complex), které jsou tvořeny asi sto různými proteiny, tzv. nukleoporiny. Ty jsou uspořádány do kruhu tak, že tvoří podobu basketbalového koše, kterým se NLS protein spolu s přenášeným substrátem přenese z cytoplazmy do jádra.Nuclear localization signal (NLS) is one of a number of localization signals that direct nuclear transport of substances. In addition to mitosis, when the nuclear membrane is disintegrated, the transport of substances is controlled by a nuclear pore complex (NPC) consisting of about a hundred different proteins, called nucleoporins. These are arranged in a circle to form a basketball basket by which the NLS protein, along with the transferred substrate, is transferred from the cytoplasm to the nucleus.
Proteiny do velikosti přibližně 40 kDa mohou do jádra procházet prostou difúzí. Proteiny o velikosti větší než 40 kDa vstupují do jádra^ zprostředkovaně, vyžadují energii a NLS.Proteins of up to about 40 kDa can be diffused into the nucleus. Proteins larger than 40 kDa enter the nucleus mediately, requiring energy and NLS.
Navzdory tomu oligonukleotidy o velikosti 10^25 bps (což odpovídá průměrně 6 kDa) mají limitující schopnost penetrace. Oligonukleotidy mají hydrofilní charakter a nepříliš snadno prostupují buněčnými membránami.Despite this, oligonucleotides of 10 ^ 25 bps (corresponding to an average of 6 kDa) have a limiting penetration capability. Oligonucleotides have a hydrophilic character and do not readily penetrate cell membranes.
Mechanismus přenosu přes jadernou membránu je následující: NLS obsahuje vazebné místo pro ímportin a. V první fázi transportu se NLS váže k heterodimeru α,β importinu prostřednictvím zmiňovaného vazebného místa. ímportin β je zodpovědný za dopravu NLS spolu s importovaným substrátem k cytoplazmatickým fílamentům NPC. Ihned proběhne translokace systému na jadernou stranu NPC. Translokace je energeticky náročný proces, vyžaduje hydrolýzu GTP. Transnukleární proces je ukončen uvolněním importovaného substrátu v jádře a uvolněním heterodimeru importinu, který se v disociovaném stavu vrací zpět do cytoplazmy (5).The mechanism of nuclear membrane transfer is as follows: NLS contains a binding site for portportin a. In the first phase of transport, the NLS binds to the α, β importin heterodimer via said binding site. portportin β is responsible for transporting the NLS along with the imported substrate to the cytoplasmic NPCs. The system will immediately be translocated to the nuclear side of the NPC. Translocation is an energy-intensive process, requiring GTP hydrolysis. The transnuclear process is terminated by releasing the imported substrate in the nucleus and releasing the importin heterodimer, which in the dissociated state returns to the cytoplasm (5).
NLS se v molekulární biologii využívá ke studiu zprostředkovaného transportu nebo pasivní difúze látek, proteinů přes jaderný obal v eukaryotických buňkách. Využívá se fúzních proteinů NLS s např. GFP nebo EGFP, čímž se také zabývá patent WO9849325.NLS is used in molecular biology to study the mediated transport or passive diffusion of substances, proteins through the nuclear envelope in eukaryotic cells. NLS fusion proteins with, e.g., GFP or EGFP are utilized, which is also discussed in WO9849325.
Ubiquitin je součástí proteolytického degradačního systému, který má význam v mnoha regulačních procesech buňky, jako jsou např. regulace buněčného cyklu, diferenciace, apoptóza. Nezanedbatelný význam má také. v regulaci transkripce a v onkogenezi.Ubiquitin is part of a proteolytic degradation system that is important in many cell regulatory processes, such as cell cycle regulation, differentiation, apoptosis. It also has considerable significance. in transcription regulation and oncogenesis.
« 3 «3
Ubiquitinylace je jedním z hlavních nelysozomálních procesů odbourávání proteinů s kťátkým i dlouhým poločasem rozpadu v savčích buňkách. Specificky rozpoznává chybné, abnormální, nadbytečné nebo buňce cizí proteiny. Nejprve se substrát váže kovalentně k řetězci polyubiquitinu, následně 26S proteazom pomocí specifického signálu rozpoznává takto navázaný substrát a degraduje jej (6).Ubiquitinylation is one of the major non-lysosomal degradation processes of both short and long half-life proteins in mammalian cells. Specifically, it recognizes erroneous, abnormal, redundant or cellular proteins. First, the substrate binds covalently to the polyubiquitin chain, then the 26S proteasome recognizes the substrate thus bound by a specific signal and degrades it (6).
Ubiquitin je v praxi také využíván ke studiu aktivity proteazomu. K vyhodnocení aktivity na základě akumulace reportérového proteinu v živých buňkách slouží vektor kódující fúzní protein ubiquitin-GFP, čímž se zabývá patent/WÓ018lT277Ubiquitin is also used in practice to study proteasome activity. The vector encoding ubiquitin-GFP fusion protein is used to evaluate activity based on reporter protein accumulation in living cells, as described in patent / WO018112277
Kromě ubiquitinu je známá PĚST sekvence (sekvence bohatá na prolin (P), glutámovou kyselinu (E), serin (S) a threonin (T)), která se podílí také na degradaci proteinů. Tato sekvence byla použita při zkonstruování vektoru obsahující fúzní protein s EGFP proto, aby ( se zvýšil obrat EGFP, jehož zvýšená exprese se stává pro buňku toxickou. Příkladem je patent kde je výše zmíněné předmětem řešení.In addition to ubiquitin, the FIST sequence (a sequence rich in proline (P), glutamic acid (E), serine (S) and threonine (T)) is also known to be involved in protein degradation. This sequence was used in the construction of a vector containing an EGFP fusion protein to ( increase EGFP turnover, whose overexpression becomes toxic to the cell. An example is the patent where the aforementioned subject matter is addressed.
Podstata vynálezu:SUMMARY OF THE INVENTION:
Tento buněčný systém pro testování vstupu látek do jader je založen na konstrukci expresního vektoru kódující sekvenci pro fúzní protein ubiquitinu, EGFP a amplifikováného jaderného lokalizačního signálu (Ubi_EGFP_NLS). Dále, námi předkládané řešení je založeno na využití výše zmíněného expresního vektoru pro vytvoření stabilně transfekované buněčné linie produkující fúzní protein Ubi_EGFP_NLS.This cellular system for testing the entry of substances into nuclei is based on the construction of an expression vector encoding a sequence for the ubiquitin fusion protein, EGFP, and an amplified nuclear localization signal (Ubi_EGFP_NLS). Furthermore, the present invention is based on the use of the aforementioned expression vector to generate a stably transfected cell line producing the Ubi_EGFP_NLS fusion protein.
EGFP je zde pro svou schopnost fluorescence využíván jako reportéra vý gen. EGFP si zachovává svou funkčnost i po spojení s cílovým proteinem jak na C-, tak i na N-konci. Tohoto faktu bylo využito při konstrukci fúzního proteinu s amplifiko vanou NLS sekvencí na C-konci EGFP. V tomto případě jaderný lokalizační signál (odvozen od SV40 T-large antigenu izolovaného z opičího viru) zabezpečí transport EGFP do jádra a zajistí tak zelenou jadernou fluorescenci za daných podmínek.EGFP is used here as a reporter for its fluorescence ability. EGFP retains its functionality even after coupling to the target protein at both the C- and N-terminus. This was used to construct a fusion protein with an amplified NLS sequence at the C-terminus of EGFP. In this case, the nuclear localization signal (derived from the SV40 T-large antigen isolated from the simian virus) will ensure the transport of EGFP to the nucleus, thereby ensuring green nuclear fluorescence under the conditions.
Jak bylo zmíněno v části Dosavadní stav techniky, jsou patentované vektory kódující fúzní protein GFP, příp. EGFP sNLS. Námi předkládaný návrh se odlišuje od výše citovaného patentu zejména tím, že ve vektorovém konstruktu je také začleněna sekvence ubiquitinu, jehož funkcí je zajistit zvýšenou degradaci EGFP a tím zabránit možnému toxickému působení na živé buňky a také uspořádáním amplifikované NLS sekvence.As mentioned in the Prior Art section, patented vectors encoding the GFP fusion protein, respectively, are disclosed. EGFP sNLS. Our proposal differs from the above-cited patent in particular in that the ubiquitin sequence is also included in the vector construct, the function of which is to ensure increased degradation of EGFP and thereby prevent possible toxic effects on living cells, as well as the arrangement of the amplified NLS sequence.
Exprese EGFP je řízena silným eukaryontním CMV promotorem, který je zakódován ve vektoru pUF2. Při vysoké expresi EGFP se tento protein může stát pro buňku toxickým a ta na to reaguje spuštěním apoptické kaskády. Zvýšené množství EGFP proteinu je možné regulovat specifickým proteinem ubiquitinem, který se účastní proteolytických pochodů v buňce.EGFP expression is driven by a strong eukaryotic CMV promoter, which is encoded in the pUF2 vector. With high EGFP expression, this protein can become toxic to the cell and it responds by triggering an apoptotic cascade. The increased amount of EGFP protein can be regulated by the specific ubiquitin protein involved in proteolytic processes in the cell.
Fúzní protein ubiquitinu s EGFP zajistí degradaci fúzního proteinu a tedy i jeho rychlejší obrat, čímž se snižuje toxický vliv kyslíkových radikálů vznikajících při tvorbě EGFP aktivního chromoforu. V námi navrhovaném řešení je ubiquitin připojen k EGFP na jeho N-konci. Jedinečností tohoto návrhu je to, že oproti jiným patentům námi předkládaná sekvence kóduje „in frame“ nejen ubiquitin a EGFP, ale je také spojen s amplifíkovanou NLS sekvencí.The ubiquitin fusion protein with EGFP ensures degradation of the fusion protein and hence its faster turnover, thereby reducing the toxic effect of the oxygen radicals resulting from the formation of the EGFP active chromophore. In our proposed solution, ubiquitin is attached to EGFP at its N-terminus. The uniqueness of this design is that, unlike other patents, the sequence we present encodes not only ubiquitin and EGFP in-frame, but is also associated with an amplified NLS sequence.
Fúzní protein ubiquitinu, EGFP a amplifované NLS sekvence zajistí na jedné straně lokalizaci EGFP v jádře a následně jeho zelenou fluorescenci, na druhé straně se zvýší celkový obrat EGFP a tím se sníží jeho možné toxické působení na buněčnou kulturu.The ubiquitin fusion protein, EGFP, and amplified NLS sequences, on the one hand, localize the EGFP in the nucleus and subsequently its green fluorescence, on the other hand, increase the overall turnover of EGFP and thereby reduce its possible toxic effect on cell culture.
Jak již bylo zmíňeno, vektor kódující Ubi_EGFP_NLS je použit pro přípravu stabilní linie exprimující EGFP do jádra při současném zvýšeném obratu EGFP. Takto připravený buněčný testovací systém je vhodný pro testování a monitorování vstupu, transportu fluorescenčně značených látek různé chemické povahy do jader eukaryotických buněk.As mentioned, the vector encoding Ubi_EGFP_NLS is used to prepare a stable EGFP-expressing line into the nucleus while increasing EGFP turnover. The cell assay system thus prepared is suitable for testing and monitoring the entry, transport of fluorescently labeled substances of different chemical nature into the nuclei of eukaryotic cells.
Tento systém je vhodný pro testování vstupu nemodifikovaných i modifikovaných fluorescenčně značených oligonukleotidů do buněčných jader jako potenciálních genových terapeutik.This system is suitable for testing the entry of unmodified and modified fluorescently labeled oligonucleotides into cell nuclei as potential gene therapeutics.
Vektorové konstrukty kódující EJbi_EGFP_NLS nejsou zatím předmětem žádného řešení patentů.Vector constructs encoding EJbi_EGFP_NLS have not been the subject of any patent solution yet.
Příklad provedení vynálezu:Example of the invention:
Základní kostru vektoru pUF2_Ubi_EGFP_NLS tvoří plazmid pUF2. Je tvořen 6252 bps, nese geny pro neomycinovou a ampicilinoyou rezistenci, CMV promotor. Do tohoto plazmidu je restriktázami Xbal a Notl vklonován „in frame“ gen kódující fúzní protein pro Ubi _EGFP_NLS.The backbone of the vector pUF2_Ubi_EGFP_NLS is the plasmid pUF2. It consists of 6252 bps, carries genes for neomycin and ampicillin resistance, the CMV promoter. An in-frame gene encoding the Ubi _EGFP_NLS fusion protein is cloned into this plasmid by XbaI and NotI.
Sekvence ubiquitinu byla namnožena pomocí PCR. Templátovou DNA byla lidská cDNA. Za použití DNA/RNA syntetizéru (ABI 394; Applied Biosystems, Foster City, USA) byly nasyntetizovány primery:The ubiquitin sequence was amplified by PCR. The template DNA was human cDNA. Using a DNA / RNA synthesizer (ABI 394; Applied Biosystems, Foster City, USA), primers were synthesized:
Ubi_sense: 5‘-CGG GAT CCC CGC GCC ATC ATG GAG ATC TTC GTG AAG ACC-3‘ Ubi_antisense: 5‘- GGA ATT CGG TAC CGC GCA GAC GCA GCA CCA GGT GCA AGG-3‘Ubi_sense: 5‘-CGG GAT CCC CGC GCC ATC ATG GAG ATC TTC GTG AAG ACC-3 bi Ubi_antisense: 5‘-GGA ATT CGG TAC CGC GCA
Primer Ubi_sense je navržen tak, že kóduje restrikční místo pro BamHI a Bglll, primer obsahuje také ATG kodon s Kozákovou sekvencí. Primer Ubi_antisense kóduje restrikční místo pro KpnI a EcoRI.The Ubi_sense primer is designed to encode a BamHI and BglII restriction site, the primer also contains an ATG codon with a Kozak sequence. Primer Ubi_antisense encodes a restriction site for KpnI and EcoRI.
Namnožená DNA byla štěpena enzymy KpnI a BamHI a vligována T4 DNA ligázou do vektoru pUC131 štěpeného týmiž restrikčními enzymy, viz Obr. 2. Takto připravený rekombinantní plazmid pUC131_Ubi byl namnožen v bakteriální kultuře E. coli, poté byla izolována plazmidová DNA (QIAGEN kit). Insert byl ověřen restrikcí a sekvenací.The amplified DNA was digested with KpnI and BamHI and ligated with T4 DNA ligase into the pUC131 vector digested with the same restriction enzymes. 2. The recombinant plasmid pUC131_Ubi thus prepared was expanded in E. coli bacterial culture, and plasmid DNA (QIAGEN kit) was then isolated. The insert was verified by restriction and sequencing.
Sekvence ubiquitinu o velikosti 242 bps byla dále překlonována restriktázami BamHI a Ncol do vektoru pEGFP (Clontech) štěpeného stejnými enzymy, viz Obr. 3.The ubiquitin sequence of 242 bps was further cloned with BamHI and NcoI into the pEGFP vector (Clontech) digested with the same enzymes, see FIG. 3.
Velikost plazmidu pEGFP je 3355 bps. Úsek od 289 do 1008 bps kóduje gen pro EGFP. EGFP z vektoru pEGFP je modifikovanou variantou wild-typu GFP a vyznačuje se jasnější fluorescencí s excitačním maximem 488 nm a emisním maximem 507 nm.The size of the plasmid pEGFP is 3355 bps. The region from 289 to 1008 bps encodes the EGFP gene. EGFP from the pEGFP vector is a modified wild-type GFP variant and is characterized by brighter fluorescence with an excitation peak of 488 nm and an emission peak of 507 nm.
Do vzniklého rekombinantního vektoru pUbi_EGFP byla vklonována amplifíkovaná NLS sekvence, viz Obr. 4. Tato sekvence o velikosti 84 bps je složena ze 4 dílčích oligonukleotidů označených NLS 1-4, přičemž oligonukleotidy NLS1 a NLS2 tvoří řetězec ve směru 5'-3', oligonukleotidy NLS3 a NLS4 tvoří k tomu řetězec komplementární ve směru 3'-5'.The amplified NLS sequence was cloned into the resulting recombinant vector pUbi_EGFP, see FIG. This 84 bps sequence consists of 4 sub-oligonucleotides designated NLS 1-4, wherein the NLS1 and NLS2 oligonucleotides form a 5'-3 'strand, while the NLS3 and NLS4 oligonucleotides form a 3'-5 complementary strand. '.
Za použití DNA/RNA syntetizéru (ABI 394) byly nasyntetizovány na 5’konci fosforylované oligonukleotidy NLS 1-4 o následující sekvenci:Using a DNA / RNA synthesizer (ABI 394), 5'-end phosphorylated NLS 1-4 oligonucleotides with the following sequence were synthesized:
NLS 1: 5‘-GTA CAT AGA TCC AAA AAA GAA GAG AAA GGT AGA TCC AAA AAA GAA GAG AAA GGT AGA-3 ‘NLS 1: 5‘-GTA CAT AGA TCC AAA AAA GAA GAA AAA GGT AGA TCC AAA AAAAA GA AAA GGT AGA-3
NLS 2: 5‘-TCC AAA AAA GAA GAG AAA GGT ATA AGC-3‘NLS 2: 5‘-TCC A AAA A GAA GAG A AAA GGT ATA AGC-3 AT
NLS 3: 5‘-TTT TGG ATC TAC CTT TCT CTT CTT TTT TGG ATC TAT-3‘NLS 3: 5‘-TTT TGG ATC TAC TCT CTT CTT TTT TTT TGG ATC TAT-3
NLS 4: 5‘-GGC CGC TTA TAC CTT TCT CTT CTT TTT TGG ATC TAC CTT TCT CTT CTT -3‘NLS 4: 5‘-GGC CGC TTA TAC CTT TCT CTT TCT TTT TGG ATC TAC CTT TCT CTT CTT -3 ‘
Tyto sekvence jsou navrženy tak, že po příslušné hybridizaci vzájemně komplementárních úseků (NLS 1 a 3; NLS 2 a 4) vytvářejí na obou koncích konce kohezivní pro restrikční enzymy BsrGI (5 ‘ -konec) a Nati (3 ’ -konec).These sequences are designed such that, after appropriate hybridization of mutually complementary regions (NLS 1 and 3; NLS 2 and 4), they form ends at both ends cohesive for the restriction enzymes BsrGI (5 'end) and Nati (3' end).
- 6 ~- 6 ~
NLS 1 a 2 po spojení enzymem T4 DNA ligázou tvoří řetězec 5‘-3‘, kdežto oligonukleotidy NLS 3 a 4 tvoří k tomu řetězec komplementární ve směru 3‘-5‘.NLS 1 and 2, when coupled with T4 DNA ligase, form a 5‘-3 řetězec strand, while the NLS 3 and 4 oligonucleotides form a complementary 3 ve-5 směru strand.
Tato navržená amplifikovaná NLS sekvence kóduje tři po sobě jdoucí opakování motivu GAT CCA AAA AAG AAG AGA AAG GTA. Sekvence kóduje také stop kodon TAG.This designed amplified NLS sequence encodes three consecutive repeats of the GAT CCA motif AAA AAG AAG AGA AAG GTA. The sequence also encodes the stop codon TAG.
Protokol skládání umělého genu:Artificial gene folding protocol:
1. Ve zkumavce A smíchat 200 pmolů oligonukleotidů NLS1 a NLS3.1. In tube A, mix 200 pmoles of NLS1 and NLS3 oligonucleotides.
2. Ve zkumavce B smíchat 200 pmolů oligonukleotidů NLS2 a NLS4.2. Mix 200 pmoles of NLS2 and NLS4 oligonucleotides in tube B.
3. Inkubovat 2 min při 80 °C.3. Incubate at 80 ° C for 2 min.
4. Poté inkubovat 30 min při pokojové teplotě.4. Incubate for 30 min at room temperature.
5. Smíchat obsah zkumavky A s obsahem zkumavky B a inkubovat 5 min při 40 °C.5. Mix tube A contents with tube B and incubate for 5 min at 40 ° C.
6. Poté inkubovat 20 min při pokojové teplotě.6. Incubate for 20 min at room temperature.
7. Ligace hybridizovaných oligonukleotidů T4 DNA ligázou (New England Biolabs) 1 hod. při 16°C.7. Ligation of hybridized oligonucleotides with T4 DNA ligase (New England Biolabs) for 1 hour at 16 ° C.
Produkt byl izolován pomocí gelové elektroforézy.The product was isolated by gel electrophoresis.
Vlastní klonování pak zahrnuje štěpení pUbi_EGFP restriktázami BsrGI a Notl a do takto připraveného plazmidu byla vklonována sekvence NLS s navrženými lepivými konci pro oba zmiňované enzymy. Vzniklý plazmid pUbi_EGFP_NLS o velikosti 3645 bps byl transformován do E. coli, namnožen pod selekčním tlakem ampicilinového antibiotika. Jednotlivé klony byly izolovány a plazmidy s inserty ověřeny restrikcí.The actual cloning then involves the cleavage of pUbi_EGFP by BsrGI and NotI and the NLS sequence with the designed sticky ends for the two enzymes was cloned into the plasmid thus prepared. The resulting 3645 bps plasmid pUbi_EGFP_NLS was transformed into E. coli, amplified under the selection pressure of an ampicillin antibiotic. Individual clones were isolated and plasmids with inserts verified by restriction.
Z pUbi_EGFP_NLS byla vyštěpena enzymy Xbal a Notl kazeta kódující fúzní protein Ubi_EGFP_NLS o délce 1043 bps a vložena do cílového vektoru pUF2 naštěpeného týmiž enzymy, viz Obr. 5. Insert byl po namnožení v E. coli opět izolován a ověřen restrikcí.The XbaI and NotI cassettes encoding the 1043 bps Ubi_EGFP_NLS fusion protein were excised from pUbi_EGFP_NLS and inserted into the target vector pUF2 digested with the same enzymes as shown in FIG. 5. After insertion in E. coli, the insert was again isolated and verified by restriction.
Tato kazeta Ubi_EGFP_NLS může být vklonováná do jakéhokoli vektoru vhodnými restrikčními enzymy. Příkladem může být klonování kazety vyštěpené z vektoru pUbi_EGFP_NLS enzymy Sáli, Notl do plazmidu pLNCX2 štěpeného Xhol, Notl, přičemž SaU a Xhol mají navzájem kompatibilní kohezivní konce.This Ubi_EGFP_NLS cassette can be inserted into any vector by suitable restriction enzymes. An example would be cloning of the cassette cleaved from the vector pUbi_EGFP_NLS by SalI, NotI enzymes into XhoI digested plasmid pLNCX2, NotI, with SaU and XhoI having mutually compatible cohesive ends.
Vektor pUF2_Ubi_EGFP_NLS byl testován v eukaryotické buněčné linii Hep2 (human larynx carcinoma cells). Buňky byly kultivovány v DMEM lx high glucose ( L-glutamin 584 mg/1, pyruvát sodný 110 mg/1) médiu (PAA Laboratories) obsahující 10% FCS (PAA Laboratories), 50 pg/ml gentamycinu (PAA Laboratories). Buňky byly kultivovány v inkubátoru při 37 °C, 5% CO2.The vector pUF2_Ubi_EGFP_NLS was tested in the human larynx carcinoma cells (Hep2) eukaryotic cell line. Cells were cultured in DMEM 1x high glucose (L-glutamine 584 mg / l, sodium pyruvate 110 mg / l) medium (PAA Laboratories) containing 10% FCS (PAA Laboratories), 50 µg / ml gentamycin (PAA Laboratories). Cells were cultured in an incubator at 37 ° C, 5% CO 2.
6^6 ^
Den před transfekcí byly buňky rozesety v hustotě 4x104 na 24 jamkovou destičku. 0,4 pg plazmidu pUF2_Ubi_EGFP_NLS bylo transfekováno pomocí Effectene Transfection Reagent (QIAGEN). 24 hodin po transfekci byly pozitivně transfekované buňky detekovány fluorescenční mikroskopií (Nikon Eclipse TE300) s použitím B-2A filtr bloku (Nikon, ex 450-490 nm, DM 505 nm, BA 520 nm). 24 hodin po transfekci byla buněčná linie podrobena selekčnímu tlaku antibiotika G418 (PAA Laboratories) o koncentraci 400 pg/ml média po dobu 20 dnů. Klony exprimující EGFP byly dále izolovány pomocí klonovacích disků (Sigma).The day before transfection, cells were plated at a density of 4x10 4 per 24-well plate. 0.4 µg of plasmid pUF2_Ubi_EGFP_NLS was transfected with Effectene Transfection Reagent (QIAGEN). 24 hours after transfection, positively transfected cells were detected by fluorescence microscopy (Nikon Eclipse TE300) using a B-2A filter block (Nikon, ex 450-490 nm, DM 505 nm, BA 520 nm). 24 hours after transfection, the cell line was subjected to selection pressure of antibiotic G418 (PAA Laboratories) at a concentration of 400 pg / ml medium for 20 days. Clones expressing EGFP were further isolated using cloning disks (Sigma).
Přehled obrazové dokumentace:Picture documentation:
Obr. 1: Reakční mechanismus vzniku aktivního chromoforu GFP/EGFP, převzato z: Tsien R.Y.: The green fluorescent protein, Annu. Rev. Biochem., 67, 509-44, 1998Giant. 1: Reaction mechanism of active chromophore GFP / EGFP, taken from: Tsien R.Y .: The green fluorescent protein, Annu. Roar. Biochem., 67, 509-44 (1998)
Obr. 2: Klonovací schéma pUC131_UbiGiant. 2: Cloning scheme of pUC131_Ubi
Obr. 3: Klonovací schéma pUbi_EGFPGiant. 3: Cloning scheme pUbi_EGFP
Obr. 4: Klonovací schéma pUbi_EGFP_NLSGiant. 4: Cloning scheme pUbi_EGFP_NLS
Obr. 5: Klonovací schéma pUF2_ Ubi_EGFP_NLSGiant. 5: Cloning scheme of pUF2_Ubi_EGFP_NLS
”8 ~~8 ~~
Průmyslová využitelnost:Industrial Applicability:
Tento buněčný testovací systém lze využít pro testování a monitorování vstupu, transportu fluorescenčně značených látek různé chemické povahy do jader eukaryotických buněk.This cellular assay system can be used to test and monitor the entry, transport of fluorescently labeled substances of different chemical nature into nuclei of eukaryotic cells.
Tento systém je vhodný pro testování vstupu nemodifikovaných i modifikovaných fluorescenčně značených oligonukleotidů do buněčných jader jako potenciálních genových terapeutik.This system is suitable for testing the entry of unmodified and modified fluorescently labeled oligonucleotides into cell nuclei as potential gene therapeutics.
Reference:Reference:
(1) Dopf J., Horiagon T.M.: Deletion mapping of the Aequorea victoria green fluorescent protein, Gene, 173, 39-44, 1996 (2) Tsien R.Y.: The green fluorescent protein, Annu. Rev. Biochem., 67, 509-44,1998 (3) Hsiao-Sheng L., Ming-Shiou J. et al.: Is green fluorescent protein toxic to the living cells?, Biochem. and Biophys. Res. Communications, 260, 712-717, 1999 (4) Zimmer M.: Green fluorescent protein (GFP): Applications, structure, and related photophysical behavior, Chem. Rev., 102, 759-781, 2002 (5) Escriou V., Carriere M. et al.: NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus, Advanced Drug Delivery Reviews, 55, 295-306, 2003 (6) Attaix D., Combaret L. et al.: Reguiation of proteolysis, Current Op. In clin.nutrition and metabolic care, 4, 45-49, 2001(1) Dopf J., Horiagon T.M .: Deletion mapping of Aequorea victoria green fluorescent protein, Gene, 173, 39-44, 1996. (2) Tsien R.Y .: The green fluorescent protein, Annu. Roar. Biochem., 67, 509-44, 1998 (3) Hsiao-Sheng L., Ming-Shiou J. et al., Green fluorescent protein toxic to the living cells? and Biophys. Res. Communications, 260, 712-717, 1999 (4) Zimmer M .: Green Fluorescent Protein (GFP): Applications, Structure, and Related Photophysical Behavior, Chem. Rev., 102, 759-781, 2002 (5) Escriou V., Carriere M. et al .: NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus, Advanced Drug Delivery Reviews, 55, 295-306, 2003 (6) Attaix D., Combaret L. et al .: Reguiation of Proteolysis, Current Op. In clinic nutrition and metabolic care, 4, 45-49, 2001
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ200475A CZ295047B6 (en) | 2004-01-15 | 2004-01-15 | General-purposes cell system for testing ingression of substances into cell nuclei |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ200475A CZ295047B6 (en) | 2004-01-15 | 2004-01-15 | General-purposes cell system for testing ingression of substances into cell nuclei |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ200475A3 true CZ200475A3 (en) | 2005-05-18 |
| CZ295047B6 CZ295047B6 (en) | 2005-05-18 |
Family
ID=34529463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ200475A CZ295047B6 (en) | 2004-01-15 | 2004-01-15 | General-purposes cell system for testing ingression of substances into cell nuclei |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ295047B6 (en) |
-
2004
- 2004-01-15 CZ CZ200475A patent/CZ295047B6/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ295047B6 (en) | 2005-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20250115905A1 (en) | Methods of Rescuing Stop Codons via Genetic Reassignment with ACE-tRNA | |
| KR102699584B1 (en) | Control of gene expression by aptamer-mediated regulation of alternative splicing | |
| US9388425B2 (en) | Tunable genetic switch for regulating gene expression | |
| JP2024099582A (en) | Compositions and methods for transgene expression from the albumin locus | |
| BR112020005323A2 (en) | polynucleotides, compositions and methods for genome editing | |
| JP2025028917A (en) | Nucleic Acid Constructs and Methods of Use | |
| US12049650B2 (en) | Destabilising domains for conditionally stabilising a protein | |
| KR20200093635A (en) | Gene editing using modified closed terminal DNA (CEDNA) | |
| KR20160122125A (en) | Viral vector production system | |
| JP2009232862A (en) | New property-effecting and/or new property-exhibiting composition for therapeutic and diagnostic use | |
| JP2008200041A (en) | Modular transfection system | |
| KR20210151785A (en) | Non-viral DNA vectors and their use for expression of FVIII therapeutics | |
| US20240200104A1 (en) | Ltr transposon compositions and methods | |
| KR20220097414A (en) | CRISPR and AAV Strategies for X-Linked Combustion Retinal Delaminization Therapy | |
| KR20230003478A (en) | Non-viral DNA vectors and their use for expressing Gaucher therapeutics | |
| EP1470224B1 (en) | Molecular libraries | |
| Cohen et al. | Functional expression of rat GLUT 1 glucose transporter in Dictyostelium discoideum | |
| CZ200475A3 (en) | General-purposes cell system for testing ingression of substances into cell nuclei | |
| CN114729021B (en) | Amino acid sequence capable of destroying cells, related nucleotide sequence and related application | |
| CN118632622A (en) | Mutant myocilin disease model and its use | |
| CN105968211B (en) | A kind of recombinant antiviral protein and its preparation method and application | |
| RU2833486C1 (en) | Crispr and aav strategies for therapy of x-linked juvenile retinoschisis | |
| RU2811724C2 (en) | GENE EDITING USING MODIFIED CLOSED-END DNA (ceDNA) | |
| JP2023150865A (en) | Novel polypeptide and use thereof | |
| WO2025054555A1 (en) | Transgenic mitochondrial delivery system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20130115 |