CZ2003449A3

CZ2003449A3 - Rostlinné a syntetické fenolické sloučeniny a rostlinné extrakty účinné v léčbě a prevenci chlamydiových infekcí

Info

Publication number: CZ2003449A3
Application number: CZ2003449A
Authority: CZ
Inventors: Heikki Vuorela; Pia Vuorela; Raimo Hiltunen; Maija Leinonen; Pekka Saikku
Original assignee: Control-Ox Oy
Priority date: 2000-08-17
Filing date: 2001-08-16
Publication date: 2003-06-18
Also published as: ES2330306T3; EE200300064A; CN1454093A; JP2004506656A; CN100500141C; NO20030728L; WO2002014464B1; CA2419716A1; EP1309333A2; AU8220101A; AU2001282201B2; HUP0300732A3; TWI282275B; WO2002014464A3; SG90259A1; KR100851357B1; HUP0300732A2; ATE441424T1; WO2002014464A2; NO20030728D0

Description

Vynález se týká účinných rostlinných fenolických sloučenin a odpovídajících syntetických sloučenin a jejich derivátů a rostlinných extraktů, stejně tak obsahujících, které jsou užitečné chlamydiových infekcí, a použití rostlinných fenolických sloučenin a odpovídajících syntetických sloučenin a jejich derivátů a rostlinných extraktů a přípravků je obsahujících v léčbě a prevenci chlamydiových infekcí. Rostlinné fenolické gloučeniny_ _ _a _ odpovídaj ící__syntetické sloučeniny a jejich deriváty a rostlinné extrakty mohou být použity pro přípravu farmaceutických preparátů, potravinových aditivních přípravků a funkčních potravin prospěšných pro zdraví.

Dosavadní stav techniky

Chlamydie jsou malé Gram negativní baktérie. V důsledku jejich jedinečného intracelulárního reprodukčního cyklu byly klasifikovány jako separátní řád Chlamydiales, zahrnující rod Chlamydia. Rod Chlamydia byl už úvodně rozdělen do dvou druhů, C. trachomatis a C. psittaci. Rozdělení bylo založeno na biochemických vlastnostech:

	C. trachomatis	C. psitacci
Akumulace glykogenu v inkluzích chlamydií (barvení jodem +)	+
Senzitivita na sulfa léky	+

C. trachomatis byla od počátku považována za heterogenní skupinu á C. psittaci za velmi heterogenní skupinu. Když byl objeven chlamydiový kmen (později nazvaný C. pneumoniae} • · · · ·· ···· • · · ·

	• 2	• · · · • · · • · ··	• · · · · • · · · · · • · · · · ·
způsobující respirační	infekce	bez	kontaktu	s ptáky, byl
nesporně	považován za	patřící	do	skupiny	C. psittaci,
protože	splnil výše	zmíněná	biochemická	kritéria. C.

trachomatis a C. psittaci se liší s ohledem na svoji povrchovou strukturu. Hlavní složka povrchové struktury C. trachomatis je hlavní vnější membránový protein (MQMP), který se liší na čtyřech různých místech a zakládá rozdělení C. trachomatis na v současnosti téměř 20 různých imunotypů. U C. pneumoniae je MOMP velmi konzervativní a je nalézán pouze jeden imunotyp. Cílové buňky v tkáni jsou navíc odlišné: epitel pohlavních orgánů a spojivky v případě C. trachomatis a epitel respiračního traktu v případě C. pneumoniae. První baktérie^__. s. výj imkou vzácného kmene lymfoqranuloma venereum (LGV), není se schopna množit ve fagocytech a makrofázích, které tvoří specificky cílové buňky druhé baktérie. Při penetraci do buněk používá C. pneumoniae heparinový receptor, který není používán pohlavními chlamydiemi s výjimkou LGV. Odlišné jsou dále způsoby přenosu a výsledný klinický obraz: C. pneumoniae je přenášena respiračním traktem a může přecházet do monocytů v cirkulačním systému, zatímco C. trachomatis je přenášena hlavně sexuálními kontakty. Odlišná je navíc léčba: C. trachomatis je obvykle léčena jednou dávkou, zatímco pro C. pneumoniae je doporučována dokonce třítýdenní antibiotická léčba.

Níže je uveden seznam onemocnění způsobených nebo sdružených s chlamydiovými druhy:

C. trachomatis:

- konjunktivitis

- cervicitis

- uretritis

- zánětlivá onemocnění pánve (PID)

- infekce novorozenců, například dětská pneumonitis • · · ·

• ·

- peritonitis

- perihepatitis

- reaktivní artritis

C. pneumoniae:

infekce horních cest dýchacích

- bronchitis

- pneumonie

- chronická obstrukční choroba bronchopulmonální (COPD)

- astma

- vaskulitis

- ateroskleróza s jejími komplikacemi _-__ence_falitis__________________________________________________

- určité typy roztroušené sklerózy

- část pacientů s Alzheimerovou chorobou pozdního typu

Již v roce 1989 bylo prokázáno, že chlamydiový kmen způsobující respirační infekce bez kontaktu s ptáky se lišil geneticky od C. trachomatis i od popsaných C. psittaci tak jasně, že byl separován do svých vlastních druhů C. pneumoniae. Homologie nukleové kyseliny s C. trachomatis je pod 10%. C. trachomatis má extragenomické plazmidy nenacházené v lidských kmenech C. pneumoniae. Genomy obou druhů byly sekvenovány a počet genů je významně vyšší (okolo 200) u C. pneumoniae než u C. trachomatis. V nedávné reklasifikaci chlamydií byla již tato baktérie převedena do zcela odlišného rodu Clamydophila. Je tedy dobrý důvod věřit., že vše, co je známo o C. trachomatis nemůže být aplikováno na C. pneumoniae.

Nejběžnější chlamydiové kmeny u člověka jsou C. pneumoniae a C. trachomatis, který způsobuje běžná důležitá onemocnění. C. psittaci je velmi rozšířena v živočišné říší, ale pouze občas také způsobuje infekce u člověka. C. pecorum je navíc známa, • ···· ·· ···· ·· ···· •Φ · · · ··· · φ · · · · ··· • Φ · · · ···· · φ · ···· · · · · ··· · φφ ·· ·· ·· *

že způsobuje infekce u přežvýkavců. Probíhá klasifikace nových rodů a druhů do řádu Chlamydiales.

C. pneumoniae je nejběžnější chlamydií způsobující infekci člověka a téměř každý je infikován 2 až 3 krát během života touto baktérii. C. pneumoniae může snadno invadovat do plicni tkáně a množit se v makrofázich a endotelu krevních cév. Klinický obraz respirační infekcí způsobený C. pneumoniae se velmi liší od obvykle mírných infekcí horních cest dýchacích u dětí až k vážným pneumoniím u dospělých. 5-10%.všech pneumonií je způsobeno C. pneumoniae. C. pneumoniae se šíří jako infekce dýchacích cest ze člověka na člověka. Někteří jedinci jsou samozřejmě účinní přenašeči, protože infekce se .stává, .častější, pouze ve školním věku. V severních zemích se vyskytují infekce způsobené C. pneumoniae ve formě dvou až tříletých epidemií se zhruba šestiletými intervaly.

Chlamydiové infekce mají plíživý a latentní charakter a jejich chronické pozdní komplikace jsou samozřejmě nejvýznamnější. Epidemiologické studie ukazují důležitou asociaci mezi chronickými infekcemi C. pneumoniae a aterosklerózou: mnoho studií také odhalilo spojení mezi chlamydiovými infekcemi a incidencí akutního infarktu myokardu (AMI). Chronická infekce C. pneumoniae dále zřejmě hraje roli v záchvatech astmatu, stejně tak jako chronické obstrukční choroby bronchopulmonální.

Arterioskleróza je chronický zánětlivý stav a částice C. pneumoniae mohou být prokázány v pěnových buňkách a buňkách hladkého svalstva u více než poloviny aterosklerotických plátů. U pacientů s akutním infarktem myokardu se často vyskytuje imunitní odpověď na chlamydiový lipopolysacharid (LPS), což ukazuje na exacerbaci infekce. Bylo také možné detekovat v poškozených srdečních chlopních a chlamydie se • · ·« · ·· ·*·· • · ··· · · · .

« · ··· · · · • · ··· ···· · • · · · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· obzvláště hojně vyskytují v anurysmatech břišní aorty. Bylo navíc objeveno, že C. pneumoniae hraje roli v mozkových infarktech a transientních mozkových ischemických atakách. Dosud není s konečnou platností jasné, jakou roli hrají chlamydie nacházené v poškozených místech v rozvoji samotného poškození, ale jedním faktorem v pomalém rozvoji těchto onemocnění se zdá být chronická chlamydiová infekce. U zvířecích modelů však bylo prokázáno, že C. pneumoniae iniciuje a akceleruje rozvoj aterosklerózy. Epidemiologické a klinické studie prokázaly, že existuje jasné spojení mezi chronickou infekcí C. pneumoniae a aterosklerózou a akutním infarktem myokardu. V posledních studiích bylo uzavíráno, že . - infekce _pzneum.oniae._j_e._ ri_zikových __faktorem_ _s_rdečních _příhod. Infekce C. pneumoniae je často spojena s kouřením cigaret, která samozřejmě predisponuje k chronické chlamydiové infekci.

Bylo pozorováno, že léčba antibiotiky snižuje riziko srdečních záchvatů, a že léčbou antibiotiky bylo možné ovlivnit společný zánětlivý markér CRP a hladiny fibrinogenu v séru. Ve většině industrializovaných zemí se snižuje morbidita srdečních onemocnění při zahájení používání antibiotik velmi účinných proti chlamydiím jako běžné léčby dalších infekcí.

C. trachomatis je nejdůležitější příčinou pohlavních infekcí u žen. Navíc část infekcí močového ústrojí žen ve fertilním věku, které jsou bakteriologicky negativní, je způsobena C. trachomatis. C. trachomatis je běžnou komplikací chronické endometriózy a PID je nejběžnější komplikací infekcí C. trachomatis u žen. Infekce C. trachomatis může být téměř bez symptomů a dokonce jsou známy případy extrauterinního těhotenství, stejně tak jako infertility jako komplikací tvorby obstrukčního jizvení způsobeného plíživou, klinicky němou infekcí. Okolo poloviny dětí narozených nosičům chlamydií je infikováno při narození a u zhruba poloviny

infikovaných novorozenců se vyvine inkluzní konjunktivitis s pneumonií způsobenou C. pneumoniae jako komplikací. C. trachomatis také způsobuje pohlavní infekce u mužů.

Chlamydie jsou citlivé na tetracykliny a erytromycin; rifampicin a některé nové fluorochinolony jsou účinné také. C. trachomatis je také, na rozdíl od například C. pneumoniae citlivé na sulfa léky. Navzdory odpovědi na léčbu jsou chlamydiové infekce často rekurentní a existuje riziko, že se stanou chronickými. Clamydie se množí pouze uvnitř buňky, a proto jsou dnes nová makrolidová antibiotika a azalídy koncentrující se v buňkách alternativou k tetracyklinu a _erytromyciniL______j aico_____primárnímu _ _ _léku.______ U____kompli kovaných chlymidiových infekcí musí být v léčbě pravděpodobně pokračováno po dlouhou dobu a například u Reiterovy nemoci zůsobené chlamydiemi je doporučována tříměsíční léčba.

Dosud neexistují žádné vakcíny pro prevenci chlamydiových infekci. Charakter imunitní odpovědi je nedostatečně známý a s tím je spojena i tendence k hypersenzitivitě.

V patentu EP 0377722 jsou popsány způsob hodnocení rizika srdečního infarktu, způsob diagnózy onemocnění srdce a krevních cév, stejně tak jako použití léků účinných proti chlamydiím. V této publikaci jsou popsány tetracykliny, erytromycin, rifampicilin a fluorochinolony jako vhodné léky pro léčbu nebo prevenci chronického srdečního onemocnění způsobeného chlamydiemi.

WO 98/50074 popisuje obzvláště pro léčbu infekce způsobené C. pneumoniae kombinaci antichlamydiových látek, kde aktivní složky jsou každá účinná v určitém stádiu buněčného cyklu chlamydií.

• «·· ·* «·*· ·· ····

V patentu US 5830874 jsou popsány způsob diagnózy arteriálního chlamydiového granulomu způsobeného C. pneumoniae_r stejně tak jako terapeutické přípravky pro léčbu arteriální chlamydiové granulomatózy. Jako vhodné terapeuticky účinné sloučeniny jsou jako účinné léky proti chlamydiím zmíněny tetracykliny, erytromyciny, klaritromyciny, azitromycin a chinolony, atd.

Patent JP 10139686 popisuje pro léčbu aterosklerózy způsobené C. pneumoniae použití 2-(3,4-dimetoxycinamoyl) -aminobenzoové kyseliny jako terapeuticky účinné sloučeniny v denní dávce 100 - 1000 mg.

..Podle informací uvedených výše. existuje_.zjevná_jpotřeba.nových sloučenin a přípravků, které by mohly být použity v léčbě a prevenci chlamydiových infekcí.

Šikimáty, neboli sloučeniny vytvořené z šikimové kyseliny biosyntetickou dráhou, sloučeniny vytvořené acetátmevalonátovou biosyntetickou dráhou a sloučeniny vytvořené kombinacemi obou drah patří do skupiny rostlinných fenolických látek. K řečeným sloučeninám patří jednoduché aromáty, fenoly, kumariny, lignany, ligniny, stejně tak jako flavonidy a jejich deriváty. Jednoduché aromáty zahrnují hlavně fenylpropanové deriváty a fenylmetanové deriváty. V přirozených flavonoidech, které jsou strukturálními fenolickými sloučeninami, tvoří široce rozšířenou skupinu rostlinných pigmentů. Flavonoidy se vyskytují v celé rostlinné říši, v bryofytech, mechách a dalších nižších rostlinách. Většina z nich je nacházena u vyšších rostlin a cévnatých rostlin a vyskytují se ve vším ovoci, zelenině a mezi jiným i v čaji, stejně tak jako ve víně, obzvláště v červeném víně. Flavonoidy se vyskytují v přírodě hlavně v glykosidické formě, ale mohou to být také volné fenoly a sulfáty v takzvané aglykonové formě, nebo jako navázané k polysacharidům a proteinům. Ve většině případů jsou

99·· ·· *··«

9 9♦» * • 9 · • · 9

9* 9 flavonoidy sloučeniny.

svojí chemickou strukturou polyfenolické

Z rostlin bylo identifikováno přes 8000 flavonoidů, které mají nesčetné funkce. Tyto látky v důsledku své hořké chuti chrání rostliny proti škodlivému hmyzu ' a v důsledku svých antibiotických vlastností chrání rostliny před viry a baktériemi. Podle současného názoru nejsou flavonoidy nutričně důležitými sloučeninami, ale zdá se, že mají prospěšné účinky na zdraví. Účinek je očividně nezávislý na vitaminech a minerálech obsažených v rostlině. Těžko může někdo . vyloučit požívání flavonoidů, ale jejich možnosti účinkovat závisí nějak na absorpčních vlastnostech a biodostupnosti a navíc na interakci současně získaných flavonoidů.

Antioxidační účinek přirozených fenolických sloučenin byl již znám docela dlouhou dobu a antioxidační účinek, stejně tak jako se bylo zabýváno v několika studiích vychytáváním volných radikálů. Podle současných vědeckých informací je schopnost flavonoidů zabraňovat oxidaci LDL cholesterolu považována za jednu z nejvýznamnějších vlastností. Oxidace LDL cholesterolu v subendotelu krevních cév je iniciálním faktorem v aterogenezi. Mnoho studií naznačuje, že nedostatečný příjem flavonoidů z výživy může být důležitým faktorem v morbiditě způsobené onemocněními srdce a krevních cév. V lidských studiích týkajících se flavonoidů bylo pozorováno pouze několik nejvýznamnějších flavonoidů, z kterých u quercetinu bylo pozorováno, že zabraňuje oxidaci LDL cholesterolu a tedy snižuje riziko koronárních onemocnění, protože oxidovaný LDL cholesterol je jasně ve vztahu ke stádiím aterosklerózy.

Denní příjem flavonoidů z výživy . se liší například podle holandského výzkumu mezi 0-30 mg. Ve finských studiích vykazovaly flavonoidy mírně ochranný účinek před morbiditou způsobenou onemocněními srdce a krevních cév, ale rozdíly ·+»« • r ·« *·♦♦ • · * ♦ · « • * * > · · · j • · · · · · * <

·· ·♦ ·* «« flavanoly, způsobenými v příjmu flavonoidů byly na druhou stranu spíše malé, celková množství byla zhruba 2-6 mg/den. Ve studii provedené v Holandsku byl pozorován inverzní vztah mezi flavonoly a které je možno získat z potravy a úmrtími onemocněními srdce a krevních cév. Také byl pozorován inverzní vztah mezi příjmem flavonolů a flavonů a rizikem srdečního infarktu. Flavonoidy jsou dále známy tím, že mají účinek na zánět a imunitní odpovědi, stejně tak jako na mnoho dalších funkcí buňky. Některé flavonoidy a mnoho dalších fenolických přirozených sloučenin může zabránit nebo zvýšit příjem kalcia do buňky, což je také demonstrováno v Tabulce 1 uvedené dále.

Léky blokující kalciové kanály mají důležitou roli v léčbě onemocnění srdce a krevních cév, jako jsou například bolest na hrudi způsobená srdeční anoxií, infarktem myokardu, aterosklerózou a hypertenzí. Tyto léky účinkují na kalciové kanály bráněním toku kalcia do buňky a tím zvětšují koronární tepnu, stejně tak jako snižují periferní rezistenci krevních snížena srdeční zátěž. Použití kalciových velkém měřítku vedlo například k rozvoji programů za účelem nalezení sloučenin cév, kde je blokátorů ve vyhledávacích izolovaných z přírody majících blokující účinek na kalciové kanály. Jako vyhledávací médium bylo v těchto studiích použito například kontinuální buněčné linie pocházející z nádoru zadního laloku hypofýzy potkana (GH4C1), stejně tak jako. byla použita technika políčkové svorky, při které mohou být současně vyšetřeny separátní kalciové kanály jedné buňky. Jako výsledek studií byly nalezeny přirozeně se vyskytující sloučeniny a extrakty, které mají na kalciové kanály blokující nebo aktivační účinky. Tyto sloučeniny byly nalezeny mezi rostlinnými jednoduchými fenoly, kumariny, flavonoidy a extrakty bohatými na řečené sloučeniny. Některé z těchto látek jsou svým blokujícím účinkem srovnatelné s verapamilem a • · · *· · některé ze’ sloučenin mají tendenci zvyšovat tok kalcia do buňky.

Popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká účinných sloučenin a odpovídajících syntetických sloučenin a jejich derivátů a rostlinných extraktů a přípravků je obsahujících, užitečných v léčbě a prevenci chlamydiových infekcí, stejně tak jako použití rostlinných fenolických sloučenin a odpovídajících syntetických sloučenin a jejich derivátů a rostlinných extraktů a přípravlů je obsahujících pro léčbu a prevenci chlamydiových infekcí.

Charakteristické rysy rostlinných fenolických sloučenin a odpovídajících syntetických sloučenin a jejich derivátů a rostlinných extraktů podle vynálezu, přípravků podle vynálezu je obsahující, stejně tak jako jejich použití v léčbě a prevenci chlamydiových infekcí, jsou prezentovány v patentových nárocích, stejně tak jako jejich použití při výrobě léků nebo potravin prospěšných zdraví, užitečných v léčbě a prevenci chlamydiových infekcí.

Překvapivě bylo zjištěno, že určité rostlinné fenolické sloučeniny, odpovídající syntetické sloučeniny a jejich deriváty a rostlinné extrakty a frakce a parciální frakce obsahující řečené rostlinné sloučeniny mají antibiotikům podobný, silný efekt proti chlamydiím. Podle vynálezu jsou rostlinné fenolické sloučeniny fenolické sloučeniny vytvořené z šikimové kyseliny biosyntetickou dráhou, fenolické sloučeniny vytvořené acetát-mevalonátovou dráhou a fenolické sloučeniny vytvořené jako výsledek kombinací obou drah. Tyto sloučeniny, jako jsou například jednoduché aromáty, fenoly, kumariny, lignany, ligniny a flavonoidy jsou získané z produktů rostlinné říše, jako jsou například ovoce a

zelenina, obzvláště citrusové ovoce, zelenina, bobulové ovoce, *

cibule, čaj, červené víno, atd.

Rostlinné fenolické sloučeniny, odpovídající syntetické sloučeniny a jejich deriváty a extrakty a frakce a parciální frakce je obsahující mohou být použity jako takové, nebo jako jejich směsi, volitelně v kombinaci se sloučeninami síry obsaženými v česneku, jako jsou například alicin nebo deriváty alicinu.

Přednostní rostlinné přirozené fenolické sloučeniny jsou flavonoidy, stejně tak jako deriváty fenylmetanu a fenyíprojpanu., _ -fenolické- - -kyseliny, - 'triterpeny>-----kumariny a katheciny, a extrakty a parciální frakce je obsahující, stejně tak jako frakce obsahující jednoduché fenoly, flavonoidy, jejich deriváty, polyfenoly, diterpenové fenoly a diterpenové chinony,. stejně tak jako frakce, z kterých byly tanin a diterpenové frakce odstraněny. Preferované jsou také odpovídající syntetické sloučeniny a jejich deriváty a farmaceuticky přijatelné soli, estery a deriváty výše uvedených sloučenin.

Přednostní sloučeniny a jejich sloučeniny jsou sloučeniny s antichlamydiovým účinkem (inhibice tvorby inkluzí) stejným nebo větším než 30%, a obzvláště preferovány jsou sloučeniny s antichlamydiovým účinkem stejným nebo větším než 90%, jak je definováno v Příkladech provedení vynálezu. V následujícím jsou prezentovány skupiny přednostních sloučenin a extraktů:

- Flavony, jako jsou například apigenin, luteolin, flavon

- Flavonoly, jako jsou například quercetin, rhamnetin, morin

- Flavonony, jako je například naringin

- Izoflavony, jako je například genístein • ···· ·· ···· ·· ···· • · ··· · · · · • · ··· ··· • · · · · ···· · • · · · · · ···· ···· ·· ·· · · · ·

- Sloučeniny odvozené od fenylmetanu, jako jsou například metylgalát, propylgalát, oktylgalát, dodecylgalát, izopropylgalát

- Sloučeniny odvozené od propylpropanu, jako jsou například o Kumariny jako umbeliferon, skopoletin, metoxypsoralen, xantotocin a kumarin o Flavan-3-oly jako (-)-epigalokateciny, (-)epikatechin, (H-)-katechin a (-)- epikatechin galát

- Syntetické sloučeniny, jako jsou například flavonoidy a kumariny jako kumarin 106, 2'-metoxy-a-naftoflavon, 6,2'dimetoxyflavon, 6-metylkumarin, alfa-naftoflavon,

---------rotanon, 7-dietyl-amíno-3-thenoylkumarin

- Přirozené rostlinné extrakty, jako jsou například extrakty z Mentha longifolia, Mentha arvencsis_r Galeopsis speciosa, Salvia officinalis, Thymus vulgaris, Rumex acetocella, Rosa rugosa, Veronica longifolia, Symphytum asperum, Artemisia vulgaris, Convallaria majalis, Quercus robur, Daucus carota, Fragaria iinumae, Brassica oleracea, Brassica napus, Medicago sativa, Citrus sinensis, Phloem flour, Vaccinum myrtillus

Rostlinné fenolické sloučeniny, extrakty a parciální frakce je obsahující, mohou být pohodlně získány z přirozených rostlin nebo jejich částí za použití konvenčních technik extrakce a izolace látek. Stonky, kořeny nebo listy jsou vhodně hydrodestilované a macerované, nebo pouze hydrodestilované, za účelem získání požadovaného extraktu, které mohou být dále purifikovány za použití jakékoli purifikační techniky známé osobě znalé oboru. Odpovídající syntetické sloučeniny nebo jejich deriváty jsou obvykle komerčně dostupné látky, nebo mohou být vyrobeny za použití jakýchkoli známých syntetických metod.

···· ·· ···· ·· ····

V následující Tabulce 1 jsou prezentovány některé přednostní rostlinné fenolické sloučeniny podle předkládaného vynálezu, účinek sloučenin na tok kalcia do buňky, antioxidační účinek, stejně tak jako chemická struktura sloučenin.

Chemické struktury sloučenin prezentovaných v Tabulce 1 jsou uvedeny v následujících schématech A, B, C, D a E. Ve schématu A jsou uvedeny flavony, flavonoly, ve Schématu B flavanony, Ve Schématu C izoflavony, ve Schématu.D deriváty fenylmetanu, ve Schématu D deriváty fenylpropanu. Substituenty Ri_₇ se týkají odpovídajících funkčních skupin uvedených v Tabulce 1.

···· ·· ···· ·· ···· • · · · · · · • · · · · · · · · · • · ·*·· ···· ···· ·· ·· ·· · ·

IC50 (mol/1) proti DPPH

O r· co <n « o 3 xd >

0 1 O H X O CM rd

CM in co ^,N U φ 2 c H X φ 0 £

O 10 n MM ' φ O 3 xd >

g

0 1 O w X o rd

g

) Flavonol (Struktura A) í |

0 1 O rd X Γ- o H

n 1 O rd X rd CM rd

0 t O H X rd CO id

n 1 O rd X Ok CO CM

0 1 O rd X Ok CM rd

0 O rd X CM O rd

| Flavanony (Struktura B) · |

>N? Φ O C rd X. X Φ F> 0 ID •H > m

Jk o rd X O CO

1 Izoflavony (Struktura C) · j |

>N? Φ O fi rd s * 0 Ol \rl > <·>

«7 0 o fi»d _ X Φ o 0 r* xd > co

ě

g

| Fenylmetany (Struktura D) i |

Ok id CO n >N · qj O ^β X 3 £

n I O »d X 10 id CM

η 1 O id X 10 CM * <0

£

<9 M £ «Ρ CA & i rd Pm

CM O CM

CM 10 co CM

co w 00 CM

CM CM CM CM

ip CM CO

in Γ- ΟΟ ιο

*P 00 Μ»

tn o rd 10

CM CM O CO

CO 10 rd CO

<0 10 rd CO

CM CM O <0

00 *P

10 o id 10

CO CM Γ* CM

10 O Ok 10

CM 10 CM

CM O r· CM

10 H *p

CM CO

rd CM CM »d

rd O id

CM 00 Ok rd

O

Γ- O

Ok rd

O CO

rd 10

co o

CO id

co co

Ok 10

00 o

<0 CM

01 w

10 o

O 10

10 10

10 Γ»

CM id

Γ* id

Ok 1O

Ok 10

Ok id

CO id

O Ί»

*“»· dP rt ₊ 3 Λ ro r 3§ ‘0 -n xd >M ““A

<0 σ> CM 1

co rd 10

Ok CO rd 1

Ok co <0 1

CM id CM

10 Tp rd 1

CO 10 rd 1

1O ^P rd

rd to +

<0 10 10 +

*4» CM to +

o 00 +

rd O CM +

o ω co

co 10 10

10 10 +

CM 10 CM 1

10 10 1

10 +

Ok CO co 1

CM CD 0? 1

CO CO 10 1

Ol K O rd 1

«

a

g

a

1

•

1

£

§

g

§

a

g

1

I

1

•

«

a

3 rd O

« rl O

a

g

1

«

a

§

a

g

3 rd 8

a o

g

«Π X 8

a

g

a

g

a

g

a

g

« §

£

§

a o

a

g

3 rd 8

3 rl CD O

g

í

g

a o

g

a

g

a

g

n a o o

£

a

g

rt 1

41 i

g

o Γ

g

3 i—1 8

3 řd 8

a

g

a a o

£

§

a o

n X 8

a

a o

g

8.

g

a o

g

a o

g

a

a o

g

Sloučenina (20 ug/ml)

^rtfi ♦d c & •d 2

c d rd 0 JS 3

1 4 G •d •P Φ 0 (9 O .

4 - § Si Em

*fi •d X Φ •P •d >

ó 1 n a CM TJ 1 rl c u •rl 0 x 6 w e ρ i3 z? ? > n

1 Γ- 1 4 fi Ό •d *d η n 0 0 41 44 ť ? 3 rd Fi Ok

I Γ* co i 4 fi Ό •d -d H « 0 0 33 3 rd P Ok

Λ e •rl 0 Φ P Φ δ

*e •rl +1 <9

4 fi •d P Φ •s 0 N H

« 3 •rl M S

*3 •rl U 5 Φ δ

4 fi ♦d P £

i 3 •rl 3 3» 3 •rl M nl a

4 fi •d •d M (9 X

4 fi •d Φ N •d (9 Q

4 fi •d Φ P n •d fi $

4 fi •d N •d <9 Q

*3 ♦d •P Λ •d 3 Φ O

•d rt >rt 3 > •rl O rl 0 φ N W 3 > Φ a Λ

ϋ ‘(9 > 0 rd (9 3k i9 fi •d rd Φ W ><

(9 fi •d rd Φ 01 š

• 9··· 99 9··9 ·· ····

999 999 9 • · 999 9999 9 • 9 «999 9999

9999 99 ·· 99 99

	0 ( Ο Η X σ> ο ιη	1 1 Ο Η Μ Γ0 π Η	0 1 Ο Η X Ο Η	0 1 O H X M· tn H	\| Fenylpropany (Struktura E) , \|	0 1 O H X r-1 04	O 1 O rl X <n *ř
	Η 00 Η	ΟΙ <Μ Η 01	(0 ΟΙ οο ΟΙ	OD tn <n	04 O 00 H	04 •0· a W
	*3· Ό	Η	οο γ*	00 s u>	xř 01	tH . Ol
	ΟΙ r·1 ΟΙ	0) Π 1	01 ΟΙ σ> ι	xř O *3· 1	H r* o> +	rt 04 a +
		1		1	1	1
		1	1	1	1	1
		1	1	1	1	1
	§	g	g	g	-	1
	g	a ο	g	g	1	1
	§	§	g	g	1	1
	η X 8	υ C4 <Μ «? a a υ ο	υ t* <Ν J? ga o	rl rl <» O <* X S θ o	g	Cl X 8
7,« > §1 α •Η Μ &	+> 'tf γΗ m •Η £ £	0 •Ρ Μί Η d 0» Η >1 & έ<	0 P 'd r—1 8» r4 i? g	0 P 'd H d 0» rH δ* •8 0 o	Kyselina * kafeinová*	rt >rt C £ •rl 0 f-t H Φ 9 m m >1 a « Ή

ο ο

φ £

>Φ φ

Ν

Ο

C

Η

4J

Φ (X ο

44	II
υ
Μ	4-1
Φ	φ
s	Od
	Ο
ω
•a	*» φ
·<	Ν Ό
0	£
44	φ
Φ	X

Φ	Ο
υ
	II
> >ω
	φ X
__φ—	___CS--	___
	ο
Φ
«—1
&Μ	φ
υ	Ν Ό
• κ	44 Φ r-i
C0	σ	φ
ο	ο	Ν
κ ο	II	Ό 44
S		ι—1
	φ	σ
	Γ—1	φ
φ	ο	Ν
£	ο	Ό
σ •Η ω	*·. φ	£ Φ X
&	Ν	$4
	Ό	Ο

ο υ

φ

X

4->

Ο

Od β

•Η

C

Φ >υ ο

ι—I Φ 'φ

I-( φ

4-1

Φ >

Φ

Ό

Ο α

>1 r—I Ο £ cn β Ή C φ >υ φ ο ’—ι φ

Φ

X 'Φ >

'Φ >

Ο ι—I Φ 44 Φ ι—I Ο S

Φ

Η σ

II φ

γ-Η ο

β •Η

Λ

Φ φ

X ο

'>

β β

φ

Φ υ

Φ

Μ

ΝΟ

Ο

Φ

X

Od

Ο

Φ χ

L

Φ

Ο

Φ φ

χ od φ

ι-1

Ο

Ο ο

β φ

>υ β

φ

φ.

β

Q • ·· · • * ··· · · · • · ··· ···· · • · · · · · «·«· ··· · ·· ·· ·· ·«

Antichlamydiový efekt rostlinných fenolických sloučenin quercetinu, morinu, rhamnetinu a oktyl galátu na C. pneumoniae a C. trachomatis byl studován v Příkladech provedení vynálezu 1-4. Všechny tyto. sloučeniny inhibovaly růst C. pneumoniae v koncentraci 5-50 uM a bylo prokázáno, že quercetin, morin a rhamnetin byly velmi účinné na C. trachomatis při použití předléčených hostitelských buněk. Přednostní sloučeniny pro léčbu a prevenci infekce C. pneumoniae jsou tedy například fenolické sloučeniny quercetin, morin, rhamnetin a oktyl galát izolované z přirozených materiálů, a pro léčbu a prevenci infekce C. trachomatis na druhou stranu quercetin, morin a rhamnetin a extrakty a parciální frakce je obsahující.

Antichlamydiový efekt také dalších rostlinných fenolických sloučenin, určitých syntetických flavonoidů a kumarinů a směsí rostlinných fenolických sloučenin s česnekem při použití koncentrace 50 uM byl studován v Příkladě provedení vynálezu 5 ukazující významný inhibiční efekt. Podobně byl studován antichlamydiový účinek alicinu obsaženého v česneku na C. pneumoniae s podobnými výsledky.

Antichlamydiový účinek přirozených rostlinných extraktů a dietních rostlinných provedení vynálezu 6 účinek.

extraktů byl studován v Příkladu a byl prokázán vynikající inhibiční

Přednostní sloučeniny a extrakty a frakce jsou takové s antichlamydiovým účinkem (inhibice tvorby inkluzí) stejným nebo více než 30%, a obzvláště přednostní sloučeniny jsou takové s antichlamydiovým účinkem stejným nebo více než 90%, jak je definováno v Příkladech provedení vynálezu.

Sloučenina podle předkládaného vynálezu, typicky účinná proti chlamydiím, je navíc antioxidační látkou a má účinek na příjem Ca²⁺ do buňky.

Oktyl galát je také sloučeninou běžně používanou jako potravinové aditivum.

Jako aktivní složky mohou být rostlinné fenolické sloučeniny, odpovídající syntetické sloučeniny a jejich deriváty a rostlinné extrakty, frakce a jejich směsi dávkovány tak, že denní dávka počítaná jako aglykon je od 25 ug do 3000 mg. Rostlinné fenolické sloučeniny a odpovídající syntetické sloučeniny a jejich ..deriváty a rostlinné _ extrakty a jejich frakce a směsi podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny jako farmaceutické přípravky ve formě kapslí, tablet, mastí, tekutých přípravků nebo jiných odpovídajících forem známých osobě znalé oboru. Přípravky obsahují aktivní složku, takže denní dávka počítaná jako aglykon je od 25 ug do 3000 mg, jako jednotkové dávky přednostně od 25 ug do 500 mg.

Rostlinné fenolické sloučeniny a odpovídající syntetické sloučeniny a jejich deriváty a rostlinné extrakty, frakce a jejich směsi mohou být také přidány jako takové k potravinám nebo mohou být připraveny jako přípravky vhodné pro potraviny, jako jsou například bylinné přípravky, koření, granule a podobně, které mohou být použity jako takové po přidání do denně přijímaných výživných nebo funkčních potravin prospěšných pro zdraví také nazývaných produkty prospěšné zdraví, jako jsou například potraviny k okamžitému použití, kaše, salátové dresinky, nápoje, mléčné produkty, jedlé tuky, zmrzlé produkty , lyofilizované potraviny, specializované potraviny, bramborové lupínky, omáčky k namáčení, atd., ve spojení s produkcí. Rostlinné fenolické sloučeniny a odpovídající syntetické sloučeniny a jejich deriváty mohou • ···· 99 9999 99 9999

9 9 9 9 9 9 9 · ·· · · · · · · · » • · · ··· · 9 · 9

999 9 99 99 99 99 existovat v přípravcích podle předkládaného buďto v aglykonové formě nebo v glykosidické formě.

Rostlinné fenolické sloučeniny a odpovídající syntetické sloučeniny a jejich deriváty a rostlinné extrakty a frakce jejich směsi podle předkládaného vynálezu jsou jako sloučeniny bezpečné. Přípravky a preparáty podle vynálezu mohou být použity jako léčebná kůra pro akutní chlamydiovou infekci i kontinuální dávkování přípravků a preparátů a pravidelně s denním příjmem potravy za účelem prevence chlamydiové isčhemická choroba srdeční úmrtí, například v důsledku léčba - onemocnění- - srdce - a infekce. Protože chronická způsobuje významné množství .akutního . infarktu, myokardu^ - a odpovídáj icích a rostlinných krevních cév způsobuje vysoké náklady pro národní ekonomie, je možné pomocí rostlinných fenolických sloučenin a odpovídajících syntetických sloučenin a syntetických sloučenin a jejich derivátů extraktů a frakcí a jejich směsí podle předkládaného vynálezu, a pomocí nových přípravků je obsahujících, významně zabránit nebo zpomalit vzplanutím onemocnění srdce a krevních cév obzvláště v rizikových skupinách. Přípravky a preparáty podle vynálezu mohou být také použity v léčbě a prevenci pozdních komplikací, jako jsou například infertilita, raimoděložní těhotenství a rakovina děložního čípku, a také v léčbě a prevenci dalších infekcí a komplikací se vztahem k chlamydiím,

Vynález je demonstrován detailněji v následujících Příkladech provedení vynálezu, ale není těmito Příklady nijak omezen. V Příkladech provedení vynálezu je popsán přímý antichlamydiový účinek sloučenin a rostlinných extraktů podle vynálezu na C. pneumoniae a C. trachomatis, stejně tak jako toxicita sloučenin a extraktů na použité hostitelské buňky (buňky HL, lidská plicní tkáň, standardní diploidní buněčná linie).

···· • φ ···· φφ φφφφ • · · * * φ • φ · φ · · • · · · · · · · • φ · φ · φ · • ·· φφ φφ

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Přímý antichlamydiový účinek rostlinných fenolických sloučenin (jako inhibice tvorby inkluzí) na kmen C. pneumoniae ΚΊ (klinický izolát).

Výsledky/koncentrace 50 uM:

Koncentrace	Inhibice	%	DMSO	Inhibice %	DMSO
sloučenin 50 uM	kontroly			kontroly (předléčené)*
Qurcetin	90	90
Morin	99	96
Rhamnetin	99	59
Oktyl galát	100	100
DMSO	0	0

) ★ Hostitelské buňky byly inkubovány jeden den se sloučeninou, která byla studována, před infikací. Do 24 jamkových destiček obsahujících hostitelské buňky byla přidána sloučenina, která byla studována, v 1 ml udržovacího média ve stejné koncentraci jako v samotném testovacím postupu. Záměrem toho bylo studovat možný efekt sloučeniny na vlastní hostitelské buňky, který mohl být faktorem inhibujícím infekci. V testovacím postupu bylo pokračováno způsobem popsaným v metodě stanovení.

·· «·· · «· «··· • * * · · • » · · · ♦ · • ·· · · · · · *· ·· ·· ··

Výsledky/koncentrace 0,5 uM:

Koncentrace	Inhibice	%	DMSO	Inhibice	o. O	DMSO
sloučenin 0,5 uM	kontroly			kontroly (předléčené)*
Qurcetin	68	77
Morin	80	62
Rhamnetin	73	50
Oktyl galát	82	62
DMSO	0	0

* Hostitelské buňky byly inkubovány jeden den se sloučeninou, která byla studována, před infikací. Do 24 jamkových destiček obsahujících hostitelské buňky byla přidána sloučenina, která byla studována, v 1 ml udržovacího média ve stejné koncentraci jako v samotném testovacím postupu. Záměrem toho bylo studovat možný efekt sloučeniny na vlastní hostitelské buňky, který mohl být faktorem inhibujícím infekci. V testovacím postupu bylo pokračováno způsobem popsaným v metodě stanovení.

Příklad 2

Inhibice infekčnosti C. pneumoniae

Výsledky/koncentrace 50 uM:

Koncentrace	Inhibice	o O	DMSO	Inhibice %	DMSO
sloučenin 50 uM	kontroly			kontroly (předléčené)*
Qurcetin	76	0
Morin	94	76
Rhamnetin	100	67
Oktyl galát	100	100
DMSO	0	0

* Hostitelské buňky byly inkubovány jeden den se sloučeninou, která byla studována, před infikací. Do 24 jamkových destiček • »··· ♦ ·*♦ 1#·· it · · 9 9 · · 9

9 9 9 9 9 9 9 9 · • 9 9 9 · · 9 · 9 · • •«9 99 99 99 «· obsahujících hostitelské buňky byla přidána sloučenina, která byla studována, v 1 ml udržovacího média ve stejné koncentraci jako v samotném testovacím postupu. Záměrem toho bylo studovat možný efekt sloučeniny na vlastní hostitelské buňky, který mohl být faktorem inhibujícím infekci. V testovacím postupu bylo pokračováno způsobem popsaným v metodě stanovení.

Výsledky/koncentrace 0,5 uM:

Koncentrace	Inhibice	%	DMSO	Inhibice	q, o	DMSO
sloučenin 0,5 uM	kontroly			kontroly (předléčené) *
Qurcetin	58	0
Morin .....	81 -	53
Rhamnetin	100 '	75
Oktyl galát	59	42
DMSO	0	0

Příklad 3

Přímý antichlamydiový účinek na C. trachomatis

C. trachomatis, kultivace v buňkách McCoy. Testovací postup jinak stejný jako s C. pneumoniae.

444· ·* 4·*·

4 4 * 4 « · * * « • · * ♦ · 4 •4 · · · · • · 44 ·« »4 444*

4 ·

4 · • 4 * · 4 · ·· 4«

Výsledky/koncentrace 50 uM:

Koncentrace sloučenin 50 uM	Inhibice kontroly	o, Ό	DMSO	Inhibice % kontroly (předléčené)*	DMSO
Qurcetin	0	100
Morin	0	100
Rhamnetin	0	100
Oktyl galát	14	88

* Hostitelské buňky byly inkubovány jeden den se sloučeninou, která byla studována, před infikací. Do 24 jamkových destiček obsahujících hostitelské buňky byla přidána sloučenina, která byla studována,- v 1 ml-udržovacího média ve stejné koncentraci jako v samotném testovacím postupu. Záměrem toho bylo studovat možný efekt sloučeniny na vlastní hostitelské buňky, který mohl být faktorem inhibujícím infekci. V testovacím postupu bylo pokračováno způsobem popsaným v metodě stanovení.

Výsledky/koncentrace 0,5 uM:

Koncentrace	Inhibice	%	DMSO	Inhibice %	DMSO
sloučenin 0,5 uM	kontroly			kontroly (předléčené)*
Qurcetin	0	20
Morin	0	100
Rhamnetin	0	17
OG	0	0

* Hostitelské buňky byly inkubovány jeden den se sloučeninou, která byla studována, před infekcí. Do 24 jamkových destiček obsahujících hostitelské buňky byla přidána sloučenina, která byla studována, v 1 ml udržovacího média ve stejné koncentraci jako v samotném testovacím postupu. Záměrem toho bylo studovat možný efekt sloučeniny na vlastní hostitelské buňky, který ·· ···· ·· ···· • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · · 4 • · · · · · · · · • · · ·· ·· ·· mohl být faktorem inhibujícím infekci. V testovacím postupu bylo pokračováno způsobem popsaným v metodě stanovení.

Příklad 4

Stanovení toxicity některých ze studovaných vzorků na hostitelské buňky.

Stanovení bylo provedeno jako v předchozích testech, ale bez jakékoli infekce. Životnost byla provedena barvením Trypanovou modří.

Vzorky:

Q = quercetin

M = morin

R = rhamnetin

OG = oktyl galát

HL-C = Buňky HL v samotném nutričním médiu

HL-CD = Buňky HL po přidání DMSO

Test toxicity HL-C

Q50	Q5	Q0,5	Q0,05	Q0,005	HL-C	HL-CD	UM
10,5	9,2	7,0	11,7	' 7,4	19,7	9,6	%

M50	M5	M0,5	M0,05	M0,005	HL-C	HL-CD	uM
11,2	8,3	8,4	9,0	8,3	19,0	9,0	%

R50	R5	R0,5	R0,05	R0,005			uM
15,7	9,6	10,0	9,5	10,9			O. Ό

OG50	OG5	OGO, 5	OGO,05	OGO,005	HL-C	HL-CD	uM
16,4	8,8	7,9	7,4	8,0	5,7	7,8	O. Q

• ·

Test toxicity HL-C (předléčených)

Q50	Q5	Q0,5	Q0,05	Q0,005		HL-CD	uM
10,5	8,1	3,3	7,2	7,9		30,1	%

M50	M5	M0,5	M0,05	M0,005		HL-CD	UM
9,7	12,7	6,4	8,1	14,4			O. Ό

R50	R5	R0,5	R0,05	R0,005	HL-C	HL-CD	uM
16,9	8,0	10,6	7,6	6, 6	10,8	10,7	%

OG50	OG5	OGO, 5	OGO,05	OGO,005	HL-C		uM
14,8	8,5	5,0	7,1	7,0	7,9		%

Přiklad 5

Přímý antichlamydiový efekt rostlinných fenolických sloučenin, určitých syntetických sloučenin a směsí na C. pneumoniae

Použitá koncentrace byla 50 uM.

Sloučenina	% Inhibice
1. Přirozené flavonoidy
Apigenin	100
Luteolin	100
Flavon	90
Vitexin	3
Vitexin-2''-O-rhamnosid	11
Luteolin-7-glukosid	23
Luteolin-3', 7-glukosid	45
Quercetin	90
Rhamnetin	100
Isorhamnetin	70
Morin	100

• · 4 ·

4 4 4

Quercitin	50
Rutin	46
Naringenin	16
Naringin	66
Daidzein	51
Genistein	60
Daidzin	0
Genistin	37
Procyanidin B1	30
Procyanidin B2	o.
2. Přirozené fenolické kyseliny
Kyselina benzoová	44
Kyselina galová	27 '
Kyselina syringová	32
Kyselina kaefeinová	78
Kyselina ferulová	14
Metylgalát	100
Propylgalát	100
Oktylgalát	100
Dodecylgalát	100
3. Přirozené triterpeny
Resveratrol	54
Přirozené kumariny a Katheciny
Scopletin	96
Metoxypsoralen	100
Umbeliferon	75
Xantotoxin	94
Kumarin	28
(-)-Epikatechingalát	⁸⁵
(-)-Epigalokatechin	58
(-)-Epikatechin	75
(+)-Katechin	76
5. Syntetické flavonoidy a kumariny

3-(α-acetonylbenzyl)-4- hydroxykumarin	0
Kumarin 102	63
Kumarin 106	100
2'-metoxy-a-naftoflavon	100
6,2'-dimetoxyflavon	73
6-metylkumarin	71
Alfa-naftoflavon	92
Rotenon	100
7-dietylamino-3-thenoylkumarin	100
3-(2-benzoxazoyl)umbeliferon	28
Kumarin 30	50
3-benzoylbenzo(F)kumarin	62
6,8-dibromokumarin-3- karboxylová kyselina	0
4-metyl-3-fenylkumarin	0
6. Směsi
Oktylgalát	100
Oktylgalát 1/10	53
Oktylgalát 1/100	17
Česnek	26
Česnek 1/10	25
Česnek 1/100	19
Oktylgalát 50% + Česnek 50%	100
Oktylgalát 50% + Česnek 50% 1/10	47
Oktylgalát 50% + Česnek 50% 1/100	34
Oktylgalát 50% + Česnek 50% 1/1000	6

• « · ·

Příklad 6

Účinek rostlinných extraktů na C. pneuiaoniae

Bylo provedeno iniciální vyhledávání 101 extraktů připravených z 61 přirozených a dietních rostlinných materiálů proti C. pneuiaoniae·. Použitá koncentrace byla 40 ug/jamku.

V následujícím jsou prezentovány výsledky nejaktivnějších přirozených rostlinných extraktů pneuiaoniae vypočítané ze 4 různých hodnocení.

vybraných proti C.

Rostlina	Třída	% inhibice	životnost
N48. Mentha longifolia	Labiateae	100	OK
N53. Mentha arvensis	Labiateae	100	OK
N44. Galeopsis speciosa	Labiateae	100	OK
N57. Salvia officinalis	Labiateae	100	OK
N57. Salvia officinalis	Labiateae	100	OK
N58. Thymus vulgaris	Labiateae	100	OK
N34. Rumex acetcella	Polygonaceae	100	Menší
N30. Rosa rugosa	Rosaceae	100	OK
N28. Veronica longifolia	Scrophulariaceae	100	Menší
N8. Symphytum asperum	Boraginaceae	100	Menší
N22. Artemisia vulgaris	Asteraceae	100	OK
N37. Convallaria majalis	Covallariaceae	100	-
Quercus robur	Fagaceae	100	—

V následujícím jsou prezentovány výsledky vybraných nej aktivnějších dietních rostlinných extraktů, které vykázaly 100% inhibici proti C. pneuiaoniae vypočítanou ze 4 různých hodnocení.

Rostlina	Třída	% inhibice	životnost
D8. Daucus carota	Umbelliferae	100	-
D14. Fragaria iinumae	Rosaceae	100	Menší
Dl6. Brassíca oleracea	Cruciferae	100	OK
D17. Brassíca napus	Cruciferae	100	OK
D21. Medicago sativa	Leguminosáe	100	OK
D23. Citrus sinensis	Rutacea	100	Menší
D25. Phloem flour	Polygonacea	100	OK
D30. Vaccinum myrtillus	Ericaceae	100	OK
D31. Vaccinum myrtillus	Ericaceae	100	OK

Nebyly zaznamenány významné rozdíly v aktivitě mezi organicky a normálně pěstovanými rostlinami.

V této studii byly považovány za aktivní extrakty rostlin, které vykázaly 100% inhibici inkluzí C. pneumoniae (n = 4). Pět rostlin, které patří do třídy Labiateae bylo zjištěny jako obzvláště aktivní. Navzdory způsobu extrakce hydrodestilované i macerované, nebo pouze hydrodestilované extrakty Salvia officinalis byly aktivní proti C. pneumoniae.

V následujícím je poskytnut popis použitých mikrobiologických metod.

1. Kultivace a pasáž HL buněk

Pasáž kultur HL buněk jsou připraveny s intervalem 3 dnů. Hostitelské buňky jsou inokulovány den před infikací. Buňky jsou promyty pomocí PBS 1x10 ml a sbírány trypsinizací (l10, 1,5-2,0 ml/lahev; cca 5 minut v laminárním průtokovém boxu nebo 2 minuty v CO₂ při teplotě +37°C) . Buněčná suspenze je naředěna na koncentraci cca 350000 buněk/ml nutričního média (RN) . Kultivace při teplotě +37°C, CO₂ (5,0%) a RN médium se • ♦ ···· ·· · · · • · · · · • · * ♦ · « • · · · · · · ·· ·· ·· ·· měnilo 1-2 krát za týden. Buňky HL mohou být zamraženy v tekutém dusíku (1 ml 7,5% FCS (RN) + 1 ml DMSO).

2. Purifikace chlamydií

EB (Základní tělísko) = neefektivní extracelulární forma chlamydií. Předcházející den je odebráno k rozmražení nezbytné množství suspenze HL buněk infikovaných chlamydiemi. Buňky jsou dobře suspendovány a udržovány v ultrazvukové lázni po dobu 2' minut společně (20 sekund sonikace (amplituda je 24-25) a 10 sekund chlazení x 6) . Buňky byly rozbity a chlamydie zůstaly nepoškozeny.

v

Suspenze je centrifugo vána po dobu 10 minut při 1600 otáčkách za minutu (550 x g), kde chlamydie jsou v supernatantu (zbytky HL buněk jsou odstraněny). Supernatant je aspirací odstraněn a je přidáno 5 ml PBS, suspendováno a sonikováno po dobu 1 minuty (10 sekund sonikace - 5 sekund chlazení x 6).

Chlamydie mohou být uskladněny zamražením při teplotě -70°C.

3. Testovací postup na chlamydie

Kultivované HL buňky jsou infikovány C. pneumoniae EB. EB, které invadovaly do buňky jsou změněny na metabolicky aktivní retikulární tělíska (RB), které se dělí binárním štěpením na endozomovou' vakuolu nebo inkluzi. Po určitém čase (zhruba 72 hodin) jsou RB C. pneumoniae kondenzovány zpět na EB, po čemž jsou inkluze rozbity, hostitelské buňky jsou rozbity a EB jsou uvolněny. V této metodě je záměrem verifikovat inkluze před rozbitím hostitelských buněk.

Jako hostitelská buňka C. pneumoniae za podmínek in vitro jsou použity HL buňky. Jako hostitelská buňka · C. trachomatis za podmínek in vitro jsou často používány buňky McCoy.

• **· •· 9 9··

Infekce buněk HL a McCoy

Den před infikací jsou hostitelské buňky inokulovány na 24jamkovou destičku: buňky jsou sbírány trypsinizací, jsou suspendovány v cca 5 ml nutriční tekutiny a počítány v Burkerově komůrce. Do každé jamky je pro kultivaci použita koncentrace 250000-400000 buněk/jamku. Před přidáním buněk do jamky je, pokud je to nezbytné, použito kruhovité krycí sklíčko (průměr 13 mm) pro obarvení. Je přidána nutriční tekutina tak, že objem je 1 ml/jamku. Následující den jsou buňky infikovány zvolenou baktérií.

aspirací a cykloheximid obsahuj ící sloučeninu

Roztok, který má být použit, a který obsahuje částice chlamydií je důkladně promíchán. Stará nutriční tekutina je odstraněna aspirací. Infikací je inokulum, které bylo uskladněno při teplotě -70°C naředěno na koncentraci IFU cca 10³, takže objem roztoku je alespoň 200 ul/jamku na 24-jamkovou destičku. Buňky jsou infikovány centrifugací při 1600 otáčkách za minutu (550 x g)/l hodinu. Nutriční médium odstraněno vyměněno za udržovací médium a také obsahující studovanou (koncentrace DMSO 0,2%), 1 ml/jamku. Buňky jsou inkubovány v 5% CO₂ atmosféře při teplotě +35°C. Buňky infikované C. pneumoniae jsou inkubovány 3 dny. Po 2-3 dnech je udržovací médium odstraněno a buňky promyty pomocí lxl PBS. Do jamek je přidáno 200 ul SPG pro další infikací, odebráno pomocí pipetových špiček a přeneseno do zkumavek. Toto je použito pro infekci nových buněk stejným způsobem, jako je uvedeno výše pro testování inhibice infekčnosti (chlamidiosidický účinek).

Barvení chlamydií

Nutriční médium, které je uvedeno výše, a kde krycí sklíčko je ponecháno pro obarvení, je aspirací odstraněno. Infikované buňky jsou fixovány na krycím sklíčku metanolem 10 minut. Krycí sklíčko je odstraněno z jamky a přeneseno na vhodnou

mnoklonální protilátku konjugovanou s fluorosceinem na Parafilmu ve vlhké komoře se stranou obsahující buňky umístěnou dole. Krycí sklíčko je inkubováno po dobu 30 minut při teplotě +37°C a promyto dvakrát pomocí PBS a jedenkrát vodou. Nakonec je vysušeno. Krycí sklíčko je umístěno stranou obsahující buňky dolů na základní sklíčko obsahující fixační látku (například připevňovací médium). Při prohlížení fluorescenčním mikroskopem vykazují vzorky kultury infikované chlamydiemi charakteristickou jablečně zelenou fluorescenci inkluzí proti červenému přebarvenému pozadí.

Chemikálie.a činidla

RN = FCS nutriční médium: 100 ml RPMI 1640 (Sigma), ke kterému byl přidán 3,5% L-glutamin a 10 mg streptomycinu (finální koncentrace 20 ug/ml), 7,5 ml FCS. Hotové roztoky jsou uloženy při teplotě +8°C.

Udržovací médium: 100 ml FCS nutričního média s přidáním 50 ug cyklohexamidu ve finální koncentraci 0,5 ug/ml. Hotové roztoky jsou uloženy při teplotě +8°C.

PBS (Dulbecco fosfátový pufr, Gibco), pH 7,4

SPG = Sacharóza 0,2 M (37,5 g), KH₂PO₄ 3,8 mM (0,26 g), Na₂HPO₄x 2H₂O 6,7 mM (0,61 g), kyselina glutamová (C₅H₉NO₄) 5 mM (0,36 g) jsou smíchány v 500 ml miliporové vody. Po sterilizaci uskladněno při teplotě -20°C.

FCS, fetální telecí sérum (Gibco, Skotsko) je inaktivováno při teplotě 56°C, 30 minut, zfiltrováno a uskladněno při teplotě 70°C.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický přípravek pro léčbu a/nebo prevenci chlamydiových infekcí, charakterizovaný tím, že přípravek obsahuje rostlinnou fenolickou sloučeninu, nebo extrakt, nebo frakci, nebo parciální frakci ji obsahující, nebo odpovídající syntetickou sloučeninu nebo její syntetický derivát, nebo směs řečených sloučenin, volitelně ve směsi se sirnou sloučeninou původem z česneku.
2. Přípravek podle patentového nároku 1, charakterizovaný tím, že antichlamydiový efekt rostlinné fenolické sloučeniny, nebo extraktu, nebo frakce, nebo parciální frakce ji obsahující, nebo odpovídající syntetické sloučeniny nebo jejího syntetického derivátu je stejný nebo větší než 30% a přednostně je antichlamydiový účinek stejný nebo větší než 90% inhibice tvorby inkluzí, jak je definováno v Příkladech provedení vynálezu.
3. Přípravek podle patentového nároku nebo

2, charakterizovaný tím, že rostlinná fenolická sloučenina je vytvořená fenolická fenolické sloučenina biosyntetickou dráhou, kyseliny vytvořená fenolická z šikimové sloučenina biochemickou acetát-mevalonátovou dráhou, nebo sloučenina vytvořená jako výsledek kombinace obou drah, nebo extrakt, nebo frakce, nebo parciální frakce ji obsahující, nebo frakce obsahující jednoduché fenoly, flavonoidy, jejich deriváty, polyfenoly, diterpenové fenoly a diterpenové chinony, nebo frakce, z které byly odstraněny tanin a diterpenové frakce.
4. Přípravek podle jakéhokoli z patentových nároků 1-3, charakterizovaný tím, že rostlinná fenolická sloučenina je flavon, flavonol, flavonon, izoflavanoid, fenylmetanová • · ·©· • · * · ♦ ·

33 ” “ ·’ sloučenina nebo fenylpropanová sloučenina, a odpovídající syntetická sloučenina nebo její derivát je syntetický flavonoid nebo syntetický kumarin.
5. Přípravek podle jakéhokoli z patentových nároků 1-4, charakterizovaný tím, že extrakt, nebo frakce, nebo parciální frakce je přirozený rostlinný extrakt, nebo dietní rostlinný extrakt.
6. Přípravek podle jakéhokoli z patentových nároků 1-5, charakterizovaný tím, že extrakt, nebo frakce, nebo parciální frakce je extrakt z: Mentha longifolia, Mentha arvencsis, Galeopsis speciosa.,. Salvia officinalis, Thymus vulgaris , Rumex acetocella, Rosa rugosa, Veronica longifolia, Symphytum asperum, Artemisia vulgaris, Convallaria majalis, Quercus robur, Daucus carota, Fragaria iinumae, Brassica oleracea, Brassica napus, Medicago satíva, Citrus sinensis, Phloem flour, nebo Vaccinum myrtillus.
7. Přípravek podle jakéhokoli z patentových nároků 1-6, charakterizovaný tím, že přípravek obsahuje rostlinnou fenolickou sloučeninu flavonu, quercetinu, luteolinu, genisteinu, vybranou z apigeninu, rhamnetinu, morinu, metylgalátu, propylgalátu, oktylgálátu, dodecylgalátu, izopropylgalátu, umbeliferonu, skopoletinu, metoxypsoralenu, xantotocinu, kumarinu, (-)-epigalokatecinu, (-)-epikatechinu, (+)-katechinu, (-)- epikatechin galátu, nebo odpovídající syntetické sloučeniny vybrané z kumarinu 106, 2'-metoxy-anaftoflavonu, 6,2'-dimetoxyflavonu, 6-metylkumarinu, alfanaftoflavonu, rotanonu a 7-dietyl-amino-3-thenoylkumarinu.
8. Přípravek podle jakéhokoli z patentových nároků 1-7, charakterizovaný tím, že přípravek obsahuje quercetin, morin, rhamnetin, oktyl galát, je-li příčinou infekce C. pneumoniae a »«·· »· 9 · ·· ···· quercetin, morin, rhamnetin, je-li příčinou infekce C. trachoiaa tis.
9. Přípravek podle jakéhokoli z patentových nároků 1-8, charakterizovaný tím, že přípravek obsahuje 25 ug až 3000 mg aglykonové formy rostlinné fenolické sloučeniny, nebo extraktu, nebo frakce, nebo parciální frakce ji obsahující, nebo odpovídající syntetické sloučeniny, nebo jejího syntetického derivátu v aglykonové nebo glykosidické formě.
10. Přípravek podporující zdraví, charakterizovaný tím, že přípravek obsahuje rostlinnou fenolickou sloučeninu, nebo extrakt, nebo frakci, nebo parciální frakci ji obsahující, nebo odpovídající syntetickou sloučeninu, nebo její syntetický derivát, nebo směs řečených sloučenin, volitelně jako směs se sirnou sloučeninou původem z česneku.
11. Přípravek podporující zdraví podle patentového nároku 10, charakterizovaný tím, fenolické sloučeniny, že antichlamydiový efekt rostlinné nebo extraktu, nebo frakce, nebo parciální frakce ji obsahující, nebo odpovídající syntetické sloučeniny nebo jejího syntetického derivátu je stejný nebo větší než 30% a přednostně je antichlamydiový účinek stejný nebo větší než 90% inhibice tvorby inkluzí, jak je definováno v Příkladech provedení vynálezu.
12. Přípravek podporující zdraví podle patentového nároku 10 nebo 11, charakterizovaný tím, že rostlinná fenolická sloučenina je fenolická sloučenina vytvořená z šikimové kyseliny biosyntetickou dráhou, fenolická sloučenina vytvořená biochemickou acetát-mevalonátovou dráhou, nebo fenolická sloučenina vytvořená jako výsledek kombinace obou drah, nebo extrakt, nebo frakce, nebo parciální frakce ji obsahující, nebo frakce obsahující jednoduché fenoly, flavonoidy, jejich • ·*· • ·Φ·

Φ 4 » · · < ♦ · ·· deriváty, polyfenoly, chinony, nebo frakce, diterpenové frakce.

diterpenové fenoly a diterpenové z které byly odstraněny tanin a
13. Přípravek podporující zdraví podle jakéhokoli z patentových nároků 10-12, charakterizovaný tím, že rostlinná fenolická sloučenina je flavon, flavonol, flavonon, izoflavanoid, fenylmetanová sloučenina nebo fenylpropanová sloučenina, a odpovídající syntetická sloučenina nebo její derivát je syntetický flavonoid nebo syntetický kumarin.
14. Přípravek podporující zdraví podle jakéhokoli z patentových, nároků 10-13, charakterizovaný tím, že extrakt, nebo frakce, nebo parciální frakce je přirozený rostlinný extrakt, nebo dietní rostlinný extrakt.
15. Přípravek podporující zdraví podle jakéhokoli z patentových nároků 10-14, charakterizovaný tím, že extrakt, nebo frakce, nebo parciální frakce je extrakt z: Mentha longifolia, Mentha arvencsis, Galeopsis speciosa, Salvia officinalis, Thymus vulgaris, Rumex acetocella, Rosa rugosa, Veronica longifolia, Symphytum asperum, Artemisia vulgaris, Convallaria majalis, Quercus robur, Daucus carota, Fragaria iinumae, Brassica oleracea, Brassica napus, Medicago sativa, Citrus sinensis, Phloem flour, nebo Vaccinum myrtillus.
16. Přípravek podporující zdraví podle jakéhokoli z patentových nároků 10-15, charakterizovaný tím, že přípravek obsahuje rostlinnou fenolickou sloučeninu vybranou z apigeninu, luteolinu, flavonu, quercetinu, rhamnetinu, morinu, genisteinu, metylgalátu, propylgalátu, oktylgalátu, dodecylgalátu, izopropylgalátu, umbeliferonu, skopoletinu, metoxypsoralenu, xantotocinu, kumarinu, (-)-epigalokatecinu, (-)-epikatechinu, (+)-katechinu, (-)- epikatechin galátu, nebo « ·

9« 9 9 9 • 9 odpovídající syntetické sloučeniny vybrané z kumarinu 10 6, 2'metoxy-a-naftoflavonu, 6,2'-dimetoxyflavonu, 6-metylkumarinu, alfa-naftoflavonu, rotanonu a 7-dietyl-amino-3thenoylkumarinu.
17. Přípravek podle jakéhokoli z patentových nároků 10-16, charakterizovaný tím, že přípravek obsahuje quercetin, morin, rhamnetin, oktyl galát, je-li příčinou infekce C. pneumoniae a quercetin, morin, rhamnetin, je-li příčinou infekce C. trachomatis.
18. Použití přípravku podporujícího zdraví podle jakéhokoli z patentových nároků 10-17 v přípravě potravin, nebo k přidání do denní potravy.
19. Použití rostlinné fenolické sloučeniny, nebo extraktu, nebo frakce, nebo parciální frakce ji obsahující, nebo odpovídající syntetické sloučeniny, nebo jejího syntetického derivátu, nebo směsi řečených sloučenin, volitelně jako směs se sirnou sloučeninou původem z česneku ve výrobě léku pro léčbu a/nebo prevenci chlamydiových infekcí.
20. Použití podle patentového nároku 19, charakterizované tím, že antichlamydiový efekt rostlinné fenolické sloučeniny, nebo extraktu, nebo frakce, nebo parciální frakce ji obsahující, nebo odpovídající syntetické sloučeniny nebo jejího syntetického derivátu je stejný nebo větší než 30% a přednostně je antichlamydiový účinek stejný nebo větší než 90% inhibice tvorby inkluzí, jak je definováno v Příkladech provedení vynálezu.
21. Použití podle charakterizované tím, fenolická sloučenina patentového že rostlinná vytvořená nároku 19 nebo 20, fenolická sloučenina je z šikimové kyseliny • ·*· • * · · * · •4 »··· biosyntetickou dráhou, fenolická sloučenina vytvořená biochemickou acetát-mevalonátovou dráhou, nebo fenolická sloučenina vytvořená jako výsledek kombinace obou drah, nebo extrakt, nebo frakce, nebo parciální frakce ji obsahující, nebo frakce obsahující jednoduché fenoly, flavonoidy, jejich deriváty, polyfenoly, diterpenové fenoly a diterpenové chinony, nebo frakce, z které byly odstraněny tanin a diterpenové frakce.
22. Použití podle jakéhokoli z patentových nároků 19-21, charakterizované tím, že rostlinná fenolická sloučenina je flavon, flavonol, flavonon, izoflavanoid, fenylmetanová sloučenina nebo fenylpropanová sloučenina, a odpovídající syntetická sloučenina nebo její derivát je syntetický flavonoid nebo syntetický kumarin.
23. Použití podle jakéhokoli z patentových nároků 19-22, charakterizované tím, že extrakt, nebo frakce, nebo parciální frakce je přirozený rostlinný extrakt, nebo dietní rostlinný extrakt.
24. Použití podle jakéhokoli z patentových nároků 19-23, charakterizované tím, že extrakt, nebo frakce, nebo parciální frakce je extrakt z.: Mentha longifolia, Mentha arvencsis, Galeopsis speciosa, Salvia officinalis, Thymus vulgaris, Rumex acetocella, Rosa rugosa, Veronica longifolia, Symphytum asperum, Artemísia vulgaris, Convallaria majalis, Quercus robur, Daucus carota, Fragaria iinumae, Brassica oleracea, Brassica napus, Medicago sativa, Citrus sinensis, Phloem flour, nebo Vaccinum myrtillus.
25. Použití podle jakéhokoli z patentových nároků 19-24, charakterizované tím, že přípravek obsahuje rostlinnou fenolickou sloučeninu vybranou z apigeninu, luteolinu,

4444

44 ·»»·

44 «4··

38 · * · · 4 4 4 • · 444 444 ·· 44» 4444 4 * * 4*44 4444 ··» · 44 4» 44 44 flavonu, quercetinu, rhamnetinu, morinu, genisteinu,

metylgalátu, propylgalátu, oktylgalátu, dodecylgalátu, izopropylgalátu, umbeliferonu, skopoletinu, metoxypsoralenu, xantotocinu, kumarinu, (-)-epigalokatecinu, (-)-epikatechinu, (+)-katechinu, (-)- epikatechin galátu, nebo odpovídající syntetické sloučeniny vybrané z kumarinu 106, 2'-metoxy-anaftoflavonu, 6,2'-dimetoxyflavonu, 6-metylkumarinu, alfanaftoflavonu, rotanonu a 7-dietyl-amino-3-thenoylkumarinu.
26. Použití podle jakéhokoli z patentových nároků 19-25, charakterizované tím, že přípravek obsahuje quercetin, morin, rhamnetin, oktyl galát, je-li příčinou infekce C. pneumoniae a quercetin, morin, rhamnetin, je-li příčinou infekce C. trachoma tis.
27. Použití podle jakéhokoli z patentových nároků 19-26, charakterizované tím, že 25 ug až 3000 mg aglykonové formy rostlinné fenolické sloučeniny, nebo extraktu, nebo frakce, nebo parciální frakce ji obsahující, nebo odpovídající syntetické sloučeniny, nebo jejího syntetického derivátu je použito v aglykonové nebo glykosidické formě.