CZ2003179A3

CZ2003179A3 - Léčivo pro imunoterapii maligních nádorů

Info

Publication number: CZ2003179A3
Application number: CZ2003179A
Authority: CZ
Inventors: Claudia Ulbrich; Klaus-Dieter Rockensüss; Armin Grossmann
Original assignee: Liponova Gmbh
Priority date: 2000-07-28
Filing date: 2001-07-21
Publication date: 2004-01-14
Also published as: ATE330626T1; NO20030420D0; NO20030420L; SK822003A3; AU2001279775A1; JP2004505058A; HUP0300772A2; HK1055562A1; CA2417374A1; EP1305041B1; DE50110274D1; US20070134275A1; DK1305041T3; HUP0300772A3; WO2002009745A1; PL358675A1; BG107482A; US20030129206A1; ES2267800T3; CY1105179T1

Description

Léčivo pro imunoterapii maligních nádorů

Oblast techniky

Předmětem předloženého vynálezu jsou kompozice, které jsou vhodné zejména pro imunoterapii maligních nádorů, a rovněž způsob jejich výroby a použití těchto kompozic pro výrobu léčiv.

Dosavadní stav techniky

Terapeutické ošetření nádorů se obvykle provádí radikálním chirurgickým zákrokem, chemoterapií, radioterapií nebo hormonální terapií. Tyto terapie mají početné nežádoucí vedlejší účinky a přinášejí s sebou pro pacienty značnou zátěž. Kromě toho se u některých forem nádorů těmito léčbami nedosahuje téměř žádných zlepšení, takže jejich využití s ohledem na vedlejší účinky se neukazuje smysluplné. K tomu patří zejména maligní nádory, maligní melanomy, ledvinné karcinomy, střevní karcinomy a pankreatické karcinomy. Proto je například u ledvinných karcinomů úmrtnost 85 %.

V posledních letech se ve zvýšené míře získávaly poznatky o komplexní interakci mezi nádory a imunitním systémem. Při tom se do středu zájmu dostaly strategie léčby nádorů, u kterých se stimuluje imunitní systém. Obecně je cílem takových terapií dosažení toho, aby imunitní systém rozpoznával specifické antigeny nádorových buněk, které se u zdravých buněk nevyskytují nebo se vyskytují v malých množstvích. Dosahuje se toho například aplikací jistého léčiva, jak se popisuje v Anticancer Research [(1997) č. 17,

str. 2879 - 2882 a 3117 - 3120]. Při tom se pacientovi odebírá nádorová tkáň a zpracuje se na autologní lyzát nádorových buněk, který se injektuje pacientovi. Provádělo se to v očekávání, že proti nádorovým antigenům v lyzátu vznikne imunita. Další strategie se popisuje ve zveřejněné patentové přihlášce WOA99/47687. Zde se zveřejňuje, že se pacientům injektují buňky prezentující autologní antigen, které na svém povrchu exprimují speciální nádorovou determinantu.

Cílem terapií nádorů není pouze zabraňování zvětšování nádorů a tvorbě metastáz, nýbrž rovněž podporování jejich regrese. Střední délka života pacienta se má zvyšovat a jeho zdraví a kvalita života se má zlepšovat. 0 úspěchu imunoterapií se dá v současnosti konstatovat, že dosavadní terapeutická ošetřování mohou bohužel docílit pouze ojedinělé nebo dílčí úspěchy. Základním problémem při tom je, že mnoho nádorových markérů existuje v jistých stádiích diferenciace a v jistých množstvích rovněž v zdravých buňkách. Proto se aktivace imunitního systému proti takovým nádorovým markérům často neuskutečňuje v žádoucím rozsahu nebo se žádoucí specifitou.

Úkolem předloženého vynálezu bylo vyvinout léčiva pro léčbu nádorů, která ve vysoké míře dosahují výše uvedených cílů. Léčby nádorů by měly být při použití léčiv podle předloženého vynálezu proveditelné rovněž relativně -rychle a j ednoduše.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká kompozice pro imunoterapií nádorů. Tato kompozice je připravitelná způsobem, při kterém se nádorový materiál vyhodnotí, rozmělní a přejede ba

vyčištěnoubuněčnóususpenzá., která se inkubuje s interferonem γ a tokoferolacetátem a zmrazí, čím vznikne lyzát nádorových buněk, a při kterém se izolují monocyty z buffycoat nebo z plné krve a potom se inkubací s cytokiny stimulují k diferenciaci na dendritické buňky a převedou do neadherentního stadia, načež se rozmrazí vypočtené množství předtím zmrazeného lyzátu nádorových buněk, přidá jako antigen, přidají se cytokiny, provede se inkubace a vzniklé zralé dendritické buňky se sesbírají.

Pod výrazem „vyhodnocení nádorového materiálu se rozumí makroskopické posouzení tkáně, po kterém se identifikují zřetelné rozeznatelné podíly tukových, pojivových a funkčních ledvinných tkání, krevních cév a dalších nenádorových tkání a potom se odstraní a vyhodí.

Ve zvláštní formě provedení se při výrobě kompozice používá autologní nádorový materiál. Při výrobě kompozice se pro diferenciaci na nezralé dendritické buňky přidává přednostně IL-4 a GM-CSF a/nebo IFN-γ.

Kompozice podle předloženého vynálezu je vhodná zejména jako léčivo nebo pro výrobu léčiva pro imunoterapii. Léčiva, která obsahují buněčný lyzát podle předloženého vynálezu, se přednostně injektují itrakutánně nebo subkutánně.

Léčivy podle předloženého vynálezu se mohou léčit všechny možné druhy pevných nádorů. Léčiva, která obsahují kompozici podle předloženého vynálezu, se hodí zejména k léčení nádorů, při kterých jsou málo úspěšné jiné léčebné metody. Tyto zahrnují kromě jiných maligních pevných nádorů zejména maligní melanomy, ledvinné karcinomy, střevní • · · ·

karcinomy, pankreatické karcinomy, lymfomy, karcinomy bronchů a gynekologické nádory.

Při léčeni pacientů léčivy podle vynálezu v rámci terapie nádorů se zjistily neočekávaně výrazné pozitivní účinky pro pacienty. V překvapující míře se mohlo zabránit růstu nádorů a tvorbě metastáz, zatímco se podporovala regrese nádorů. Zdraví, kvalita života a předpokládaná délka života pacientů se zřetelně zvýšila. Pravděpodobně se mohlo těchto účinků dosáhnout kvůli tomu, že léčivo podle vynálezu se v podstatných aspektech odlišuje od známých léčiv. Zvláštním rozdílem od mnoha známých způsobů je to, že se pacientovi nádorové markéry neaplikují jednoduše, ale tyto se zavádějí v dendritických buňkách jako vehikulum přímo do imunitního systému pacienta. Překvapivě při tom postačuje zavádět do dendritických buněk in vitro surový buněčný lyzát z nádorových buněk, zatímco podle WOA99/47687 se buňky prezentující antigen smíchají nebo transfekují s vyčištěným antigenem. Způsob podle vynálezu je proto rovněž rychleji a jednodušeji proveditelný než známé způsoby. To má při výrobě takových léčebných látek zvláštní význam, aby se udržovalo nízké riziko kontaminace. Kromě toho buněčný lyzát má tu výhodu, že celý soubor antigenů je dostupný v jedné nádorové buňce.

Předložený vynález se týká rovněž způsobu přípravy léčiva, při kterém se připraví suspenze nádorových buněk, nádorové buňky se usmrtí a z krve se izolují monocyty, u kterých se indukuje diferenciace na dendritické buňky, a takto získané „nezralé dendritické buňky se inkubují s buněčným lyzátem usmrcených nádorových buněk, indukuje se zrání dendritických buněk a „zralé dendritické buňky se sesbí r.a j i .

··· ·

Monocyty se při tom přednostně izolují z buffycoat, ze separace kmenových buněk, z produktů leukafereze nebo z plné krve. Diferenciace monocytů na „nezralé dendritické buňky se indukuje přednostně prostřednictvím cytokinů, IL-4 a GM-CSF. Pro indukci zrání „nezralých dendritických buněk na „zralé dendritické buňky se hodí zejména prostaglandín E2 a TNF-a a/nebo IL-Ιβ a IL-6 přídavně k IL-4 a GM-CSF. Příprava suspenze nádorových buněk se provádí obecně izolací nádorového materiálu, který se popřípadě vyhodnotí, rozmělní a přejede ha vyčištěndtibuněčnou suspenzí. V jedné zvláštní formě provedení způsobu podle vynálezu se suspenze nádorových buněk připraví z autologního nádorového materiálu. V další přednostní formě provedení se v suspenzi nádorových buněk před usmrcením nádorových buněk indukuje exprese membránových proteinových komplexů. Indukce se provádí přednostně pomocí interferonu γ a tokoferolacetátu. Usmrcení nádorových buněk se provádí zejména zmrazováním. Sklízení zralých dendritických buněk se přednostně provádí za přítomnosti typických morfologických znaků (například tvorba závoje), zhodnotí mikroskopickou kontrolou a/nebo charakterizací povrchových antigenů za použití fluorescenčních protilátek. Předmětem předloženého vynálezu je rovněž použití popsané kompozice a její možné formy provedení pro výrobu léčiv pro léčbu nádorů.

Popsaná kompozice a její možné formy provedení se podle vynálezu používají rovněž pro výrobu léčiv pro vakcinaci nádorů.

Příklady provedení vynálezu

Příprava kompozice pro léčbu nádorů

a) Příprava lyzátu nádorových buněk • ·

Pro přípravu nádorové tkáně se pečlivě sesbírají a vyhodí makroskopicky zřetelně rozeznatelné podíly nenádorových tkání, například tukových, pojivových a funkčních ledvinných tkání, a rovněž krevních cév a nekrotických tkání. Připravená tkáň se co nej jemněji rozmělní (kousky o průměru přibližně 2 až 3 mm) a/nebo enukleuje a potom se s okolním médiem přenese na sterilní síto (50 až 100 mesh). Skleněnou tyčinkou se všechny kousky tkáně nacházející se na sítu propasírují za pomalého míchání bez tlaku. Protlačené buňky se s médiem (RPMI 1640) přenesou do sterilní kádinky a zbytky tkáně na sítu se po přidání 15 ml média RPMI (RPMI 1640 s 25 mmol HEPES) znovu pasírují skleněnou tyčinkou.

Buněčná suspenze se navrství na 45% perkolační polštářek. Tento stupeň slouží k odstranění popřípadě přítomných erytrocytů a k obohacení jednojaderných buněk na perkolačním polštářku. Naplněné zkumavky se centrifugují a mezifáze s jednojadernými buňkami se odsaje, přenese do zkumavky, odstředí a promyje roztokem NaCl a glukózy. Celkový počet živých buněk se stanoví mikroskopicky pomocí Neubauerovy sčítací komůrky po barvení buněk trypanovou modří. Kromě toho se provádí typizace buněk pomocí Testsimplets® (Boehringer, Mannheim), které jsou vhodné pro převedení karcinomových buněk na odlišitelné od jiných buněk v procesu rychlého barvení. Po resuspendování buněk v roztoku chloridu sodného a glukózy se přidá vitamin E (700 μg/připravovanou dávku) a interferon γ (1 500 IU/ připravovanou dávku). Směs se inkubuje dvě hodiny při 37 °C ve vodní lázni, odstředí a dvakrát promyje roztokem chloridu sodného a glukózy. Vytvoří se alikvoty směsi v kryoskopických zkumavkách a zmrazováním při -85 °C ± 5 °C převedou na lyzát • 9 ·· • 9 · • 9 999

9 9 9 nádorových buněk. Kontrola kvality zahrnuje zkoušky podle specifikace na počet buněk, sterilitu a devitalizaci.

B) Příprava dendritických buněk a kompozice pro léčbu nádorů

Použitá média:

Medium A: medium RPMI + 1 % autologní plazma

Médium B: médium A + GM-CSF (800 U/ml) + IL-4 (1000 U/ml) Médium C: médium B + TNF-a (1000 U/ml) + prostaglandin E₂ (1 pg/ml)

Buffycoat z poskytnuté darované krve, z leukafereze nebo plné krve ze sáčku s krví se přenesou do centrifugačních zkumavek a centrifuguji. Mezifáze obsahuje jednojaderné buňky (= buffycoat) a oddělí se od erytrocytů (dolní část) a plazmy (horní část). Plazma a jednojaderné buňky se navrství na Lymphoprep® (Nycomed) a centrifugují. Potom se plazma a jednojaderné buňky odpipetují a znovu centrifugují. Plazma se odebere a použije pro přípravu médií. Zbylá plazma se uloží při +2 °C až +8 °C pro přípravu popřípadě přídavného média A. Buněčný sediment se promyje dvakrát roztokem NaCl (0,9%) a centrifuguje. Před druhým stupněm promývání se spočítají vitální buňky po barvení trypanovou modří. Centrifugační zbytek se extrahuje v médiu A s koncentrací buněk 4 x 10⁶/ml. Buněčná suspenze se nanese na Petriho misky a inkubuje dvě hodiny při 37 °C ± 1 °C/5 % CO2. Provede se mikroskopická kontrola na adherentní buňky (monocyty) a potom se opatrně odsaje médium A, aby se odstranily neadherentní buňky.

Na Petriho misky se přidá médium B a provádí se inkubace pří 37 °C ± 1 °C/5 % CO2. V den 1 se odsaje médium B a přidá se čerstvé médium. V den 2 se médium B částečně odsaje (3 ml) a přidá se čerstvé médium B (3 ml). V den 5 se provede

9 9 • · · 9 9 • 9 9 9 9 • · · 9 9 9 9 ·· ·· 999 99 mikroskopická kontrola, zda se adherentní buňky převedly do neadherentního stadia. Buňky jedné dávky se spojí a po zbarvení trypanovou modří se spočítají vitální buňky. Buňky se odstředí a vyjmou ve vypočteném množství (5 x 10⁵/jamku/3 ml) do média C, přičemž objem odpovídá desetině konečného objemu, smíchají s vypočteným množstvím lyzátu nádorových buněk (5 x 10⁴/jamku/3 ml), homogenizují a inkubují jednu hodinu při 37 °C ± 1 °C/5 % C0₂, potom se doplní médiem C na konečný objem. Buněčná suspenze se nanese na 6-jamkové plotny a dále inkubuje při 37 °C ± 1 °C/5 % C0₂. V den 6 a 7' se provádí mikroskopická kontrola: Proces zrání dendritických buněk se projevuje „tvorbou závoje. V den 8 se provádí při výrazné „tvorbě závoje při mikroskopické kontrole „sklízení zralých dendritických buněk. Zralé dendritické buňky se odstředí a dvakrát promyjí. Centrifugační zbytek se vyjme do 0,9% roztoku NaCl, vitální buňky se po zbarvení trypanovou modří spočítají a 0,9% roztokem NaCl se nastaví na požadovaný počet buněk.

···«

Claims

···

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kompozice připravitelná způsobem, při kterém se nádorový materiál vyhodnotí, rozmělní a převede na vyčištěnou buněčnou suspenzi, která se inkubuje s interferonem γ a tokoferolacetátem a zmrazí, čím vznikne lyzát nádorových buněk, a pří kterém se izolují monocyty z buffycoat nebo z plné krve a potom se inkubací s cytokiny stimulují k diferenciaci na dendritické buňky a převedou do neadherentního stadia, načež se rozmrazí vypočtené množství předtím zmrazeného lyzátu nádorových buněk, přidá jako antigen, přidají se cytokiny, provede se inkubace a vzniklé zralé dendritické buňky se sesbírají.
2. Kompozice podle nároku 1,vyznačující se tím, že při její přípravě se používá autologní nádorový materiál.
3. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že při její přípravě se pro diferenciaci na „nezralé dendritické buňky přidává IL-4 a GM-CSF.
4. Léčivo, vyznačující se tím, že obsahuje kompozici podle alespoň jednoho z nároků 1 až 3.
5. Způsob výroby léčiva, vyznačující se tím, že se připraví suspenze nádorových buněk, nádorové buňky se usmrtí a z krve se izolují monocyty, u kterých se indukuje diferenciace na dendritické buňky, a takto získané „nezralé dendritické buňky se inkubují s buněčným lyzátem usmrcených nádorových buněk, indukuje se ·· ···· • · · · · zrání dendritických buněk a „zralé dendritické buňky se sesbíráj i.
6. Způsob podle nároku 5,vyznačující se tím, že monocyty se izoluji z buffycoat, plné krve., leukafereze nebo ze separace kmenových buněk.
7. Způsob podle nároku 5 a/nebo 6, vyznačuj ící se t í m , že diferenciace monocytů na „nezralé dendritické buňky se indukuje prostřednictvím cytokinů, IL-4 a GM-CSF s interferonem γ nebo bez něho.
8. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 5 až 7, vyznačující se tím, že zrání „nezralých dendritických buněk na „zralé dendritické buňky se indukuje prostaglandínem E₂ a TNF-α a/nebo IL-Ιβ a IL-6 přídavně k IL-4 a GM-CSF.
9. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 5 až 8, vyznačující se tím, že se připraví suspenze nádorových buněk izolací nádorového materiálu, který se popřípadě vyhodnotí, rozmělní a převede na vyčištěnou buněčnou suspenzi.
10. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 5 až 9, vyznačující se tím, že se připraví suspenze nádorových buněk izolací autologního nádorového materiálu, který se popřípadě vyhodnotí, rozmělní a převede na vyčištěnou buněčnou suspenzi.
11. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 5 až 10, vyznačující se tím, že v suspenzi nádorových buněk se před usmrcením nádorových buněk indukuje exprese .membránových proteinových komplexů.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že exprese membránových proteinových komplexů se indukuje ínterferonem γ a tokoferolacetátem.
13. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že nádorové buňky se usmrcují zmrazováním.
14. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že „zralé dendritické buňky se sklízejí za přítomnosti typických morfologických znaků (například tvorba závoje), zhodnotí mikroskopickou kontrolou a/nebo charakterizací povrchových antigenů za použití fluorescenčních protilátek.
15. Použití kompozice podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčbu nádorů.
16. Použití kompozice podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro vakcinaci nádorů.