CZ20024085A3

CZ20024085A3 - Způsob přípravy fyziologicky aktivního IL-18 polypeptidu

Info

Publication number: CZ20024085A3
Application number: CZ20024085A
Authority: CZ
Inventors: Kyung O. Johanson; Robert B. Kirkpatrick; Allan R. Shatzman; Yen Sen Ho; Patrick Mcdevitt
Original assignee: Smithkline Beecham Corporation
Priority date: 2000-06-15
Filing date: 2001-06-11
Publication date: 2003-05-14
Also published as: US7442526B2; PL208592B1; WO2001098455A2; HUP0501002A2; HK1055138A1; US20030143198A1; US7186528B2; CA2412730A1; DK1292697T3; AU2001280442B2; PT1292697E; EP1292697A2; EP1292697B1; WO2001098455A3; IL153422A; JP5121109B2; CA2412730C; US20060177422A1; NO330682B1; EP1292697A4

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobu přípravy fyziologicky aktivního polypeptidu, zejména způsobu přípravy aktivního lidského IL-18.

Dosavadní stav techniky

IL-18, rovněž známý jako interferon-gamma-indukující faktor, je v současnosti nově nalezený cytokin. Aktivní IL-18 obsahuje 157 aminokyselinových zbytků. Má silné biologické aktivity včetně indukce tvorby ínterferonu gamma T-buňkami a splenocyty, posílení zabijecí aktivity buněk NK a usnadnění diferenciace nativních T-buněk CD4⁺ na buňky Thl. Navíc lidský IL-18 usnadňuje tvorbu GM-CSF a snižuje tvorbu IL-10. Ukázalo se, že IL-18 má vyšší schopnosti indukovat interferon gamma, než má IL-12 a zdá se, že mají rozdílné receptory a využívají rozdílné cesty přenosu signálu.

IL-18, jeho kódující nukleotidová sekvence a jisté fyzikálně chemické vlastnosti čištěného proteinu jsou známy (Ushio S. a kol., J. Immunology, 156, 4274 až 4279 (1996), Dinarello C. A. a kol., J. Leukocyte Biology, 63., 658 až 664 (1998)).

Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kayaku Kenkyujoův (Hayashibara) US patent č. 5 912 324, který odpovídá EP 0 692 536 publikovanému 17. ledna 1996, popisuje myší protein, který indukuje tvorbu IFN-gamma imunokompetentními buňkami a tento protein je dále charakterizován jako protein s určitými fyzikálně chemickými vlastnostmi a definovanou částečnou aminokyselinovou

000·

sekvencí. Popisuje rovněž protein, který má aminokyselinovou sekvenci se 157 zbytky, její dva fagmenty, DNA (471 bp - párů baží), která protein kóduje, hybridomy, způsoby čištění proteinu a způsoby detekce proteinu.

Hayashibarův US patent č. 6 214 584, který odpovídá EP 0 712 931, publikovanému 22. května 1996, popisuje lidský protein ze 157 aminokyselinových zbytků a jeho homology,

DNA, která tento protein kóduje, transformanty, způsoby přípravy tohoto proteinu, monoklonální protilátky proti tomuto proteinu, hybridomy, způsoby čištění proteinu, způsoby detekce proteinu a způsoby léčení a/nebo prevence maligních tumorů, virových chorob, bakteriálních infekčních chorob a imunitních chorob.

Dokument Incyte Pharmaceuticals, lne., WO 97/24441, publikovaný 10. června 1997, popisuje protein se 193 aminokyselinovými zbytky, který odpovídá prekurzorů IL-18 a příslušnou kódující DNA.

V lidských buňkách mohou být polypeptidy, tvořené exprimací genů, zpracovávány intracelulárními enzymy, přičemž jsou částečně tráveny a získávají cukerné řetězce. Polypeptidy, které lze s úspěchem zahrnout do farmaceutických prostředků, mohou být takové polypeptidy, které se připraví podobně jako v lidských buňkách. Je známo, že většina cytokinů se obvykle tvoří jako prekursory bez biologické aktivity a ty jsou potom zpracovány intracelulárními enzymy tak, že jsou konvertovány na aktivní polypeptidy.

Polypeptid IL-18 obvykle existuje v lidských buňkách ve formě prekursoru o 139 aminokyselinových zbytcích bez jakékoli biologické aktivity. Prekursor IL-18 je rovněž označován jako Pro-IL-18. Jeden způsob produkce • · • ·

- ·3 • ·© · u>

• «· © aktivního IL-18 z jeho prekurzoru popisuje Hayashibaraův US patent č. 5 879 942, který odpovídá EP 0 819 757, publikovanému 21. ledna 1998. Patent popisuje enzym nebo protein, který konvertuje prekursor IL-18 na aktivní IL-18.

Jiný způsob produkce aktivního IL-18 z jeho prekurzoru popisuje Hayashibaraův US patent č. 5 891 663, který odpovídá EP 0 821 005, publikovanému 28. ledna 1998. Patent popisuje kontaktování prekursoru IL-18 s interleukin-l-beta-konvertujícím enzymem (ICE). Poznatky těchto patentů a odkazy jsou zde zahrnuty odkazem.

Úloha ICE jako mediátoru apoptózy a zánětu je široce studována v literatuře. Je rovněž známo, že ICE může zpracovávat jak interleukin-1, tak interleukin-18 na aktivní formy (Thornberry N. A. a kol., Nátuře, 356, 768 až 774 (1992), Ghayur T. a kol., Nátuře, 386, 619 až 623 (1997)).

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje způsoby aktivace in vitro prekursoru lidského IL-18 (rovněž známého jako Pro-IL-18) aktivujícím enzymem, které zahrnují kontaktování prekursoru lidského IL-18 s aktivujícím enzymem, jako je kaspasa 4 nebo kaspasa 5. Specifičtěji, tento vynález poskytuje způsob, ve kterém kaspasa 4 a kaspasa 5 působí na prekursor IL-18 tak, že štěpí specifické místo, aby se vytvořil aktivní polypeptid, který indukuje tvorbu IFN-gamma v imunokompetentních buňkách.

Tento vynález dále poskytuje způsoby aktivace in vivo prekursoru lidského IL-18, které zahrnují ko-expresi proteinu s aktivující proteasou. Specifičtěji, tento vynález poskytuje způsoby aktivace in vivo IL-18 za použití proteas, jako je kaspasa 4, rovněž známá jako ICE_RELII, kaspasa 5, rovněž známá jako ICE_RELIII a proteasa specifická vůči ubikvitinu, které působí na prekursor polypeptidu IL-18 tak, že ho konvertuje na aktivní polypeptid, který indukuje tvorbu IFN-gamma.

·« ·

• «

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje aminokyselinovou sekvenci lidského prekursoru IL-18 (SEQ ID NO:1).

Obr. 2 ukazuje sekvenci nukleových kyselin, kódující lidský IL-18 s celou délkou řetězce (SEQ ID N0:2).

Obr. 3 ukazuje aminokyselinovou sekvenci lidského aktivního IL-18 (SEQ ID N0:3).

Obr. 4 ukazuje aminokyselinovou sekvenci N-koncově zkrácené kaspasy 4 se 6-his smyčkou (SEQ ID N0:4).

Obr. 5 ukazuje sekvenci nukleových kyselin, kódující aminokyselinovou sekvenci N-koncově zkrácené kaspasy 4 se 6-his smyčkou (SEQ ID NO:5).

Obr. 6 ukazuje aminokyselinovou sekvenci N-koncově zkrácené kaspasy 5 se 6-his smyčkou (SEQ ID N0:4).

Obr. 7 ukazuje sekvenci nukleových kyselin, kódující aminokyselinovou sekvenci N-koncově zkrácené kaspasy 5 se 6-his smyčkou (SEQ ID NO:7).

Obr. 8 je schematický diagram bicístronické expesní kazety, obsažené v rámci pET28-Pro-IL-18/kaspasy 4 pro ko-expresi Pro-IL-18 a zkrácené kaspasy 4 v E. coli.

Obr. 9 ukazuje sekvenci expesní kazety • € • 4» ·

- Z5

9 9 9 ·

Pro-IL-18/kaspasy 4 v rámci pET28 (SEQ ID N0:8).

Obr. 10 ukazuje anotovanou sekvenci expesní kazety Pro-IL-18/kaspasy 4. Číslování odpovídá pozicím v rámci vektoru pET28a.

Obr. 11 ukazuje indukci Pro-IL-18/kaspasy 4.

Obr. 12 je schematický diagram bicistronické expesní kazety, obsažené v rámci pET28-Pro-IL-18/zkrácené kaspasy 5 pro ko-expresi Pro-IL-18 a kaspasy 5 v E. coli.

Obr. 13 ukazuje sekvenci expesní kazety Pro-IL-18/kaspasy 5 v rámci pET28 (SEQ ID NO:9).

Obr. 14 ukazuje anotovanou sekvenci expesní kazety Pro-IL-18/zkrácené kaspasy 5 s vyznačením znaků regulatorní sekvence a translace Pro-IL-18 a zkrácené kaspasy 5. Číslování odpovídá pozicím v rámci vektoru pET28a.

Obr. 15 ukazuje indukci Pro-IL-18/kaspasy 5.

Obr. 16 ukazuje aminokyselinovou sekvenci Ub-IL-18 (SEQ ID NO:10).

Obr. 17 ukazuje sekvenci nukleových kyselin, kódující aminokyselinovou sekvenci Ub-IL-18 (SEQ ID NO:il).

Obr. 18 ukazuje sekvenci nukleových kyselin expesní kazety Ub-IL-18/Ubp-l v rámci vektoru pET28 (SEQ ID NO:12).

Obr. 19 ukazuje anotovanou sekvenci Ub-IL-18/Ubp-l v rámci vektoru pET28. Číslování odpovídá pozicím v rámci pET28.

v

Obr. 20 ukazuje expresi a zpracování Ub-IL-18 pomocí

Ubp-1.

• 4 «444 • 1 ♦

Λ 4 *4 4

4 4 4

Obr. 21 ukazuje zkoušku aktivity za použití buněk KG-l (lidské myelomonocytární buněčné linie) pro monitorování tvorby IFN-gamma (IL-18 exprimovaná různými způsoby, jak je označeno).

Obr. 22 ukazuje zkoušku aktivity za použití čištěných lidských PBMCs, aby se monitorovala tvorba IFN-gamma (IL-18 exprimovaná různými způsoby, jak je označeno).

Podrobný popis vynálezu

Kaspasa 4 a 5 jsou členy rodiny cysteinových proteas, která zahrnuje interleukin-l-beta-konvertující enzym (ICE) a tyto proteasy výhodně štěpí substráty, obsahující motiv proteasové aktivace, zahrnující aminokyselinovou sekvenci XEYD, ve které je X zvoleno ze skupiny aminokyselin, sestávající z W, L, F, Y, I, V, D nebo E, E je glutamová kyselina, Y je zvoleno ze skupiny aminokyselin, sestávající z Η, I, A, T, S, P nebo E a D je asparagová kyselina (Munday N. A. a kol., J. Biol. Chemistry, 270, 15870 až 15876 (1995), Talanian R. V. a kol., J. Biol. Chemistry, 272, 9677 až 9682 (1997), Thornberry N. A. a kol., J. Biol. Chemistry, 272, 17907 až 17911 (1997)). Předpokládá se, že rozpoznání substrátu kaspasou 5 je v zásadě stejné jako u ICE a kaspasy 4 a liší se od ostatních členů kaspas ( Talanian R. V. a kol., J. Biol. Chemistry, 272, 9677 až 9682 (1997), Thornberry N. A. a kol., J. Biol. Chemistry, 272, 17907 až 17911 (1997)). Kaspasa 4 je popsána v EP-B-0 754 234.

Kaspasa 5 je popsána v US patentech 5 552 536 a 5 760 180.

Proteasy specifické, na ubikvitin jsou rodinou enzymů, nezávislých na ATP, které mohou přesně štěpit vývojově • ·· · )* • · • 9

• ' ♦ · · · • « · · · 9 · · · ···· • · · * ·· ·♦ zachovaný ubikvitinový peptid se 76 aminokyselinami od N-konce proteinů, ke kterým je fúzován. Tyto proteasy specificky štěpí peptidovou vazbu mezi aminokyselinovým zbytkem na karboxylovém konci ubikvitinového proteinu a alfa-aminoskupinou jakéhokoli neubikvitinového proteinu, se kterým je ubikvitin spojen. Proteasy specifické vůči ubikvitinu ze Saccharomycetěs cerevisiae, Ubp-1, Ubp-2 a Ubp-3 jsou například známy a mohou být rekombinantně exprimovány, aby katalyžovaly jak in vivo, tak in vitro reakce deubikvitinace, které jsou zacíleny na ubikvitinové fuzní proteiny (Baker R. T. a kol., J. Biol. Chem., 267, 23364 až 23375 (1992), Baker R. T. a kol., J. Biol. Chem., 269,

25381 až 25386 (1994). Specifita proteas specifických vůči ubikvitinu ze Saccharomycetes cerevisiae umožňuje přesné odstranění ubikvitinu z jakéhokoli peptidu s výjimkou těch peptidů, které začínají prolinem. Proteasy specifické vůči ubikvitinu z jiných druhů, jako je myší Unp a její lidský homolog Unph jsou schopny účinného štěpení dokonce i před prolinem (Gilchrist C. A. a kol., J. Biol. Chem., 272,

32280 až 32285 (1997)). Takto lze prakticky připravit jakýkoli požadovaný N-konec prostřednictvím odstranění přesně fúzovaného ubikvitinového peptidu, pokud se kombinuje in vitro nebo je koexprimován s proteasou specifickou vůči ubikvitinu. Proteasy specifické vůči ubikvitinu jsou popsány v US patentech 5 212 058, 5 683 904, 5 391 490 a 5 494 818.

Jakoukoli přírodní nebo uměle produkovanou kaspasu 4, kaspasu 5 nebo ubikvitinovou proteasu lze použít v tomto vynálezu, pokud tvoří aktivní polypeptidy, které indukují tvorbu IFN-gamma v imunokompetentních buňkách, bez ohledu na její strukturu, zdroj nebo původ.

V lidských buňkách mohou být polypeptidy, tvořené expresí genů, zpracovány intracelulárními enzymy. Intracelulární enzymy štěpí prekursory proteinů, jako je ·>

• ·

·· ···«

Pro-IL-18, na jejich, aktivní formy. Aby mohly být polypeptidy s úspěchem začleněny do farmaceutických prostředků, měly by se zpracovat podobně, jako se zpracovávají v lidských buňkách. Polypeptidy obvykle existují v lidských buňkách ve formě prekursoru a nemají žádnou biologickou aktivitu. Je známo, že mnoho cytokinů, včetně polypeptidu IL-18, je obvykle tvořeno jako prekursory bez jakékoli biologické aktivity a potom jsou zpracovány intracelulárními enzymy tak, že jsou konvertovány na aktivní polypeptidy.

Prekursor IL-18, jak se označuje v tomto patentu, například v buňkách, které vrozeně tvoří daný polypeptid, v savčích hostitelských buňkách a v bakteriálním systému, jako je E. coli, transformovaném zavedením DNA, například DNA s nukleotidovou sekvencí v SEQ ID NO:2, která obsahuje region, který kóduje polypeptid. Za použití takových savčích a bakteriálních hostitelských buněk může být prekursor IL-18 koexprimován s proteasami, aby se vytvořil aktivní IL-18.

Štěpení in vitro

Tento vynález poskytuje způsoby aktivace in vitro prekursoru polypeptidu, jako je prekursor IL-18 zahrnující kontaktování prekursoru polypeptidu s aktivujícím enzymem.

Ve výhodném ztělesnění tento vynález poskytuje způsob aktivace in vitro prekursoru lidského IL-18, který zahrnuje kontaktování prekursoru lidského IL-18 s kaspasou 4 nebo kaspasou 5.

Ve výhodném ztělesnění se prekursor IL-18 aktivuje in vitro štěpením s aktivujícím enzymem, který rozpozná specifický motiv proteasové aktivace, zahrnující aminokyselinovou sekvenci XEYD, ve které je X zvoleno ze skupiny aminokyselin, sestávající z W, L, F, Υ, I, V, D nebo E a Y je zvoleno ze skupiny aminokyselin, sestávající z Η, I, A, T, S, P nebo E.

V dalším výhodném ztělesnění se prekursor IL-18 aktivuje in vitro štěpením peptidové vazby mezi asparagovou kyselinou 36 a tyrosinem 37 v SEQ ID NO:1 pomocí kaspasy 4 nebo kaspasy 5, aby se tvořil aktivní polypeptid, který indukuje tvorbu IFN-gamma v imunokompetentních buňkách.

Obecně lze kaspasu 4 nebo kaspasu 5 získat z buněk, které je vrozeně tvoří a z transformantů, získaných použitím způsobu rekombinantní DNA. Příklady takových buněk jsou ty buňky, které se získají ze savčích a lidských buněk, jako jsou epiteliální buňky, endoteliální buňky, intersticiální buňky, chrupavkové buňky, monocyty, granulocyty, lymfocyty a jejich založené buněčné linie. Příklady transformantů zahrnují transformované mikroorganismy a zvířecí buňky, získané zavedením DNA kódující kaspasu 5 do mikroorganismů a zvířecích buněk. Kaspasa 4 nebo kaspasa 5 se připraví kultivací těchto transformantů v obvyklém kultivačním mediu, i které se používá v této oblasti, buď jejich ošetřením ultrazvukem ve formě intaktních kultur nebo po jejich * separaci z kultury anebo louhováním transformantů v hypotonických rozpouštědlech, po čemž se odpad zbylých buněk nebo směsi, obsahující supernatanty kultury a buněčný odpad, vystaví působení následujících obvyklých způsobů, v této oblasti používaných pro čištění enzymů: vysolení, dialýze, filtraci, zahuštění, sepační sedimentaci, iontové výměnné chromatografií, gelové filtrační chromatografií, adsorpční chromatografií, isoelektrické chromatografií, hydrofobní chromatografií, chromatografií na reversní fázi, afinitní chromatografií, gelové elektroforéze a elektrofokusingu. Lze použít dva nebo více těchto způsobů čištění v kombinaci. DNA kódující kaspasu 4 (obr. 5) (SEQ ID NO:5) a kaspasu 5 (obr.

»···

7) (SEQ ID NO:7) a transformanty, které produkují kaspasu 4 a kaspasu 5 jsou známé v oboru. Například mohou být tyto enzymy produkovány v aktivní formě v E. coli expresí peptidů, zkrácených na N-konci, kterým chybí pro region, jak popisuje Munday N. A. a kol., J. Biol. Chem., 26., 15870 až 15876 (1996).

Buňky, které tvoří prekursorový polypeptid, jako je Pro-IL-18, vrozeně nebo ty buňky, které byly transformovány, aby produkovaly prekursor, se kultivují v nutričním kultivačním mediu. Výhodná kultivační media zahrnují kultivační media dobře známá v oboru, jako je medium Luria-Bertaniovo nebo jiné bohaté kultivační medium pro kultivaci E. coli, zahrnující trypton a kvasnicový extrakt.

Kaspasa 4 nebo kaspasa 5, zísakaná za použizí způsobu, popsaného výše, může současně existovat ve výsledných kulturách nebo se může přidat do vznikajících směsí nebo buněčné debris po rozbití proliferujících buněk, separovaných nebo neseparovaných od kultur. Požadované množství kaspasy 4 nebo kaspasy 5 je menší, než je ekvimolární s množstvím prekursoru. Kaspasa 4 nebo kaspasa 5 se uvede do kontaktu s prekursorem při teplotě a pH, které umožňují, aby kaspasa 4 nebo kaspasa 5 působila na prekursor, obvykle může kaspasa 4 nebo kaspasa 5 reagovat s prekursorem, až se vytvoří, požadované množství aktivního polypeptidu z prekursoru při teplotách asi 4 až 40 °C a hodnotách pH asi 6 až 9. Výhodná teplota je asi 25 °C a výhodné pH je asi 7,2. Takto lze získat reakční směsi, které obsahují aktivní polypeptid.

Aktivitu kaspasy 4 nebo kaspasy 5 lze zkoušet a vyjadřovat pomocí jednotek aktivity podle gg zreagovaného polypeptidu, vytvořeného na gg kaspasy 4 nebo kaspasy 5 za minutu.

·« »··♦ ···· ♦ · · * · * · ·· ·· · · · * • » · · · · * · * · . · 1 1 · · * · · · · ·

4«· «L Ια · * ·· ·«·· »* ··

Koexprese in vivo

Tento vynález dále poskytuje způsoby aktivace prekursoru polypeptidu, jako je prekursor IL-18, in vivo, které zahrnují koexpresi proteinu s aktivující proteasou. Specifičtěji tento vynález poskytuje způsoby aktivace IL-18, které zahrnují bicistronickou koexpresi polypeptidů, jako je IL-18 s proteasou, jako je kaspasa 4, rovněž známá jako ICE_relII, kaspasa 5, rovněž známá jako ICE_RELIII a ubikvitin.

Ve výhodném ztělesnění je lidská kaspasa 4, rovněž známá jako ICE_RELII koexprimována bicistronicky s lidským Pro-IL-18, aby se in vivo přeměnil Pro-IL-18 na aktivní IL-18.

V dalším výhodném ztělesnění je zkrácená lidská kaspasa 4 (SEQ ID NO:4) koexprimována bicistronicky s lidským Pro-IL-18, aby se in vivo přeměnil Pro-IL-18 (SEQ ID NO:1) na aktivní IL-18 (SEQ ID NO:3).

V dalším výhodném ztělesnění je lidská kaspasa 5, rovněž známá jako ICE_RELIII koexprimována bicistronicky s lidským Pro-IL-18, aby se in vivo přeměnil Pro-IL-18 na aktivní IL-18 (SEQ ID N0:3).

V dalším výhodném ztělesnění je ubikvitinová proteasa 1 (Ubp-1) koexprimována bicistronicky s Ubikvitin-IL-18 (Ubp-IL-18), aby se in vivo přeměnil Ub-IL-18 na aktivní IL-18.

V dalším výhodném ztělesnění je ubikvitinová proteasa 1 (Ubp-1) koexprimována bicistronicky s Ubikvitin-IL-18 (Ubp-IL-18), aby se in vivo přeměnil Ub-IL-18 (SEQ ID NO:9)

-.:.12.

·· ·· ·· *·*«

na aktivní IL-18 (SEQ ID N0:3).

V nejvýhodnějším ztělesnění je zkrácená lidská kaspasa 5 (SEQ ID NO:5) koexprimována bicistronicky s lidským Pro-IL-18, aby se in vivo přeměnil Pro-IL-18 (SEQ ID NO:1) na aktivní IL-18 (SEQ ID NO:3).

DNA, kódující kaspasu 4 nebo kaspasu 5 a DNA, kódující prekursor polypeptidu se obě zavádějí do vhodné bakteriální nebo savčí hostitelské buňky, aby jí transformovaly. V tomto případě působí kaspasa 4 nebo kaspasa 5, vytvořená expresí DNA, na prekursor polypeptidu, který se vytváří expresí DNA ve stejném transformantu, aby se vytvořil aktivní polypeptid (obr. 11 a 15). Výhodnými hostitelskými buňkami jsou epidermální, intersticiální, neuroblastové a hematopoetické buněčné linie, odvozené z lidských, opičích, myších a křeččích buněk a používané obvykle jako hostitelské buňky, jako jsou 3T3 buňky, včetně buněk 3T3-Swiss albino (ATCC CCL 92), buněk C1271 (ATCC CRL 1616), buňky CHO, včetně buněk CHO-K1 (ATCC CCL 61),, buněk CV-1 (ATCC CCL 70), buněk COS, včetně buněk COS-1 (ATCC CCL 1950), buněk HeLa (ATCC CCL 2), buněk MOP, včetně buněk MOP-8 (ATCC CRL 1709) a jejich mutantů. Velmi výhodnými hostitelskými buňkami jsou E. coli. Nejvýhodnějším způsobem zavedení DNA, kódující kaspasu 4 nebo 5 a DNA, kódující prekursor polypeptidu do E. coli je chemická transformace s chloridem rubidia, která je dobře známá v oboru. Způsoby zavedení DNA, kódující kaspasu 4 nebo kaspasu 5 a DNA, kódující prekursor polypeptidu do savčích hostitelských buněk zahrnují běžný DEAE-dextranový způsob, způsob kyseliny fosforečné a vápníku, elektroporaci, lipofekci, mikroinjekci a způsoby virové infekce, které využívají retrovirus, adenovirus, herpesvirus a virus vakcinie. V tomto případě lze použít vektory, jako je pCD, pcDL-SRalfa, pKY4, pCDM8, pCEV4, pME18S a pSV2-gpt, včetně vhodných promotorů, enhancerů, výchozích bodů replikace, »· ···· • ·· 13»

míst terminace, spojovacích sekvencí, polyadenylačních sekvencí a/nebo markérů pro selekci ve standardních způsobech, které jsou popsány Ausubelem F. M. a kol.,

Current Protocols in Molecular Biology, New York, Greene Publishing Assoc. a Wiley Interscience (1994). Klony, u nichž se pomocí imunologické detekce zjistilo, že produkují aktivovaný polypeptid, se selektují zvolením vhodného klonu z transformantů po kultivaci v nutričním kultivačním mediu. Kultury obsahující aktivní polypeptid lze získat kultivací klonovaných transformantů s běžnou nutriční kulturou, která se používá v této oblasti. Jak buňky, které vrozeně vytvářejí prekursor polypeptidu tak další buňky, které byly transformovány, aby vytvářely tento polypeptid, mohou vytvářet prekursor spolu s aktivujícími enzymy, které aktivují polypeptid, jako je kaspasa 4, kaspasa 5 a ubikvitin. Způsoby rekombinantní DNA, využívající savčí hostitelské buňky, jsou popsány podrobně Glutzmanem, Cell, 23, 175 (1981) a Mullinganem, PNAS, 72, 2072 (1981). Způsoby rekombinantní DNA, využívající bakteriální hostitelské buňky, jsou popsány v Protein Expression: A Practical Approach, Higgins S. J. a Hames B. D. (vyd.), New York, Oxford University Press (1999).

Zatímco reakční směsi a kultury, obsahující aktivní IL-18 polypeptid lze použít intaktní jako induktory IFN-gamma, ve výhodném ztělesnění se buňky v kulturách poškozují ultrazvukem, buněčnými lyžujícími enzymy a/nebo surfaktanty, po čemž následuje separace polypeptidu ze vzniklých buněk a buněčné debris pomocí filtrace, centrifugace atd., po čemž následují standardní průmyslové procesy, které jsou popsány v Protein Purification: Principles and Practice, Cantor C. R. (vyd.), New York, Spinger-Verlag (1993). Polypeptid, zbavený buněk a buněčné debris, lze čistit běžnými způsoby čištění, které se používají k čištění biologicky aktivních látek v této ····

-.:.14 ··

99

9 9 · • · * • · · · oblasti, například vysolením, dialýzou, filtrací, zahuštěním, separační sedimentací, iontově výměnnou chromatografií, gelovou filtrační chromatografií, adsorpční chromatografií, isoelektrickou chromatografií, hydrofobní chromatografií, chromatografií na reversní fázi, afínitní chromatografií, gelovou elektroforézou a elektrofokusing. Je-li to zapotřebí, lze použít dva nebo více těchto způsobů čištění v kombinaci. Výsledný čištěný polypeptid lze zahustit a lyofilizovat na kapalný nebo pevný produkt s ohledem na jeho konečné použití.

Bicistronické expresní kazety podle tohoto vynálezu jsou univerzálními vektory, které lze použít pro získání prakticky jakéhokoli peptidu, který obsahuje vhodná místa pro rozpoznání štěpení kaspasou 4/ kaspasou 5 nebo ubikvitinem, jak bylo dříve popsáno (Tobiáš J. W. a kol., Journal of Biological Chemistry, 266(18), 12021 až 12028 (1991), Talanian R. V. a kol., Journal of Biological Chemistry, 272(15) , 9677 až 9682 (1997) ). Bicistronická exprese poskytuje výhody oproti koexpresním strategiím, protože oba geny se vážou ke stejné transkripční jednotce, což zajišťuje stálou expresi obou genů v průběhu doby. To je v protikladu k duálním plasmidovým systémům, kde jeden plasmid může v průběhu doby zaniknout, nebo k jednoduchým plasmidovým systémům duálních promotorů, kde se exprese může lišit u každého promotoru od jednoho pokusu k druhému. Zejména jsou bicistronické expresní systémy, které jsou zde popsány, ideálně vhodné pro in vivo aktivaci enzymů, cytokinů, růstových faktorů a dalších proteolyticky aktivovatelných proteinů, což umožňuje širokou škálu tvorby takových proteinů buňkami v jednom kroku a eliminuje nutnost odděleného kroku aktivace in vitro.

Aktivující proteasy, kaspasa 4 (Alal05 až Asn377) nebo kaspasa 5 (Ilel46 až Asn418) se subklonují jako N-koncové ··' ····

6-His fuze, které následují ihned po sekvenci Pro^iL-lS, aby se dosáhlo transkripční fuze obou genů. T7 koncová sekvence • je umístěna od konce sekvence kaspasy 4 pro translační zakončení bicistronické transkripční jednotky. Malý < intergenní region včetně defektní Shine-Dalgarnovy sekvence se rovněž přidá, aby se umožnila pouze minimální iniciace <w translace od sekvence kaspasy 4 (obr. 10 a 14). další regulatorní regiony zahrnují 25 párů baží lac operátorové sekvence umístěné ihned od konce promotorového regionu se 17 bázemi, který je vázán lac represorem, kódovaným kopií lac-I genu umístěné na plasmidu, což snižuje bazální transkripci v nepřítomnosti T7 RNA polymerasy. Vzniklé plasmidy, označované jako ProIL18/kasp4 a ProIL18/kasp5 se potom odděleně transfektují do kmenu E. coliBL21 (DE3), který obsahuje induktabilní chromozomální kopii genu T7 polymerasy.

Transkripce bicistronické kazety je podřízena promotoru T7, který je kontrolován fágovým T7 RNA polymerasovým proteinem, kódovaným lysogenickou kopií T7 RNA polymerasového genu. Tato chromosomální kopie T7 polymerasy * je sama pod kontrolou lacUV5 promotoru, indukovatelného přidáním isopropyl-l-thio-b-D-galaktopyranosidu. Indukce vede ke koordinaci transkripce a translace Pro-IL-18 a , His-kaspasy-4 nebo His-kaspasy-5. Kaspasa 4 nebo kaspasa 5, která je po translaci ve stavu vzniku, se samozpracovává na „ aktivní formu, která iniciuje proteolytickou aktivaci

Pro-IL-18. Jak prekursor IL-18 po translaci, tak i posttranslačně aktivovaný IL-18 je převážně rozpustný uvnitř E. coli. Konečný aktivní IL-18, obsahující N-koncový tyrosin se čistí po indukci přímo z lyzátů bakteriálních buněk běžnými chromátografickými zůsoby. Štěpení na zralý IL-18 kaspasou 4 je úplné za 4 hodiny při 37 °C nebo za 18 hodin při 29 °C (obr. 11) a štěpení na zralý IL-18 kaspasou 5 je úplné za 18 hodiny při 29 °C (obr. 15).

-•••16*··V nejvýhodnějším ztělesnění používá tento vynález zkrácenou kaspasu 4, jak ji ukazuje obr. 4 (SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:5) nebo zkrácenou kaspasu 5, jak ji ukazuje obr. 5 (SEQ ID NO:6 a SEQ ID NO:7). Zkrácení kaspasy 4 a kaspasy 5 je popsáno Mundayem N. A. a kol., J. Biol. Chemistry, 270, 15870 až 15876 (1995).

Tento vynález dále poskytuje způsob tvorby aktivního polypeptidu koexpresí proteasy specifické vůči ubikvitinu s fuzním N-koncovým ubikvitin IL-18 (prekursor), který se přemění na aktivní IL-18 aktivitou C-koncové hydrolasy ubikvitinu. Protein ubikvitin se 76 aminokyselinami obsahující původní N-koncový tyrosin se fuzuje s původním N-koncem lidského IL-18 a koexprimuje s proteasou specifickou vůči ubikvitinu v E. coli například tak, jak ukazují sekvence SEQ ID NO:10 a SEQ ID NO:11. Ubikvitin je vysoce zachovaný protein se 76 aminokyselinovými zbytky, který se nachází v eukaryotických buňkách, které značí proteiny k degradaci (Baker R. T., Current Opinion in Biotechnology, 7(5), 541 až 546 (1996)). Ubikvitin se specificky štěpí od proteinů působením proteas specifických vůči ubikvitinu, které jsou endogenně exprimovány v eukaryotických buňkách, ale které nejsou přítomny u bakterií. Koexprese proteinů fúzovaných s ubikvitinem s proteasou specifickou vůči ubikvitinu v E. coli rovněž vede k účinnému odstranění ubikvitinu (Baker R. T. a kol.,

Journal of Biological Chemistry, 267(32), 23364 až 23375 (1992)) (obr. 20). Navíc je většina z těchto deubikvitinujících enzymů schopna štěpení před prakticky každou aminokyselinou s výjimkou prolinu. Tak je možné štěpení ubikvitinu z původního IL-18 bez ohledu na přítomnost velkého aromatického tyrosinového zbytku v poloze PÍ' .

-••*17'

Koexprese ubikvitin-IL-18 (Ub-IL-18) a ubikvitinové proteasy 1 (Ubp-1) (Tobiáš J. W. a kol., Journal of Biological Chemistry, 266(18), 12021 až 12028 (1991)) se uskutečňuje prostřednictvím bicistronické exprese obou genů za kontroly induktabilního T7 promotoru. Konečný IL-18 se exprimuje jako N-koncový fuzní protein s vývojově zachovaným 76-ti aminokyselinovým peptidem ubikvitinem. Ub-IL-18 cDNA se subklonuje za kontroly T7 RNA polymerasového promotoru v rámci vektoru pET28a. Následně se cDNA, kódující proteasu specifickou vůči ubikvitinu, která má plnou délku řetězce, subklonuje od konce před T7 terminátorovou sekvencí (obr. 19). Jak cDNA Ub-IL-18, tak cDNA proteasy specifické vůči ubikvitinu se transkribují do jednoduchého mRNA transkriptu, ze kterého dojde k translaci odděleně proteinů Ub-IL-18 a proteasy, specifické vůči ubikvitinu.

Jak je popsáno výše, aktivní lidský polypeptid IL-18, získaný uvedenými způsoby, vykazuje aktivitu indukující produkci IFN-gamma jako užitečné biologicky aktivní látky, stimuluje produkci IFNg u buněk KG-1 (lidské myelomonocytární buněčné linie) (obr. 21) a čištěných lidských PBMCs (obr. 22).

Všechny publikace a patenty jsou zde zahrnuty odkazem. Následující příklady dále vysvětlují tento vynález, ale neomezují jeho rozsah.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava prekursoru IL-18 (pro-IL-18)

Lidský prekursor IL-18 se exprimuje jako N-koncový _···ί₈···_ fuzní protein se smyčkou s šesti histidiny v E. coli. Expresní plasmid, PřoEx-hIL18 je odvozen od vektoru pPROEX-1 (Life Technologies), obsahujícího Trc promotor a Iaclq pro induktabilní expresi s isopropyl-l-thio-beta-Dgalaktopyranosid (IPTG). Aby se vytvořil rekombinantní expresní vektor, fragment DNA obsahující úplný gen prekursoru kaspasy 5 se amplifikuje pomocí PCR z klonu cDNA, zakončeného 5' Nde a 3' Bam HI restrikčními endonukleasovými místy. Ampl-if ikovaný produkt se subklonuje mezi tyto dvě restrikční místa na pPROEX, čímž vznikne v rámci N-konce fuze s šestihistidinovou kódující sekvencí přítomnou ve vektoru.

Výsledný plasmid se exprimuje v DH10B hostitelských buňkách po indukci lmM IPTG po dobu 5 hodin při teplotě 37 °C. Rekombinantní protein se zachytí z buněčných pelet, které se získají po centrifugací indukovaných kultur.

Příklad 2

Čištění pro-IL-18

1,5 kg buněk E. coli, které exprimují pro-IL-18, jak je popsáno v příkladu 1, se suspenduje v 3,6 1 lýzového pufru C (50 mM Tris HC1, 10 mM BME, 0,5 M NaCl, 5% glycerol, 1 μg na ml pepstatinu A, 1 μg na ml leupepsinu,

0,4 mM AEBSF), lyžuje dvěma průchody přes Microfluidics při 82,74 MPa, centrifuguje při 28000 xg a shromáždí se 3,7 1 supernatantu. Do supernatantu se přidá 600 ml NiNTA agarosy, předem vyvážené pufrem, obsahujícím 5 mM imidazolu (pufr D) a suspenze se inkubuje po dobu 1 hodiny, aby se zachytil pro-IL-18. Suspenze se centrifuguje při nízkých otáčkách (50 otáček za sekundu), supernatant se slije a suspenze se natáhne do sloupce. Sloupec se promyje pufrem D a pro-IL-18 se eluuje 300mM imidazolem v pufru C. Eluát se dialyzuje *Í9***pufrem E (25 mM HEPES, 10 mM BME, pH 8,0) a natáhne do sloupce DEAE ToyoPearl 650M, předem vyváženého stejným pufrem. Sloupec se eluuje lieárním gradientem 0 až 0,5M chloridem sodným v pufru E. Eluát obsahuje 650 mg pro-IL-18 s více než 90% čistotou.

Příklad 3

Příprava kaspasy 4

Lidská kaspasa 4 je rovněž exprimována jako fuzní protein s šestihistidinovou smyčkou na N-konci v E. coli. Expresní plasmid, pET16b-kaspasa-4, se odvodí od vektoru pET16b (Novagen), který obsahuje fágový T7 promotor. Rekombinantní vektor se konstruuje PCR amplifikací aktivní domény kaspasy 4 (aminokyseliny Ilel46 až Asn418) zahrnutím kódující sekvence pro šest histidinů na N-konci a zakončením Nco I a Xho I restrikčními endonukleasovými místy. Výsledný produkt PCR se potom subklonuje mezi tato dvě restrikční místa, aby se vytvořil fuzní vektor kaspasy 4 se šesti histidiny na N-konci.

Výsledný plasmid se tranformuje do lysogenního kmenu E. coli BL21 DE3, obsahujícího chromozomální kopii T7 RNA polymerasy za kontroly promotoru lacUV5, což umožňuje induktabilní expresi kaspasy 4 po indukci lmM IPTG. Aktivní protein se čistí z buněčných pelet izolovaných po indukci při teplotě 37 °C po dobu 3 h.

Příklad 4

Čištění kaspasy 4

Když jsou lyžovány buňky E. coli exprimující lidskou kaspasu 4 se šestihistidinovou smyčkou na N-konci, popsanou • ·

4

4444 444

44 4444 v příkladu 2, lze detekovat aktivitu kaspasy 4 v lyzátovém supernatantu. Potom, co se protein zachytí ze supernatantu na NiNTA agarosových kuličkách, získá se znovu jak plO, tak p20. To ukazuje, že proteasová doména kaspasy 4 je aktivována v buněčné kultuře prostřednictvím samoštěpení na spojení plO a p20 a zůstává jako rozpustný nekovalentní heterodimer. Se znalostí této informace lze heterodimer pl0/p20 se smyčkou se šesti histidiny čistit. Vlastní proces se uskutečňuje při teplotě 4 °C, aby se zabránilo jakémukoli dalšímu poškození molekuly.

Asi 400 g vlhkých buněčných pelet E. coli se suspenduje v 1,6 1 lýzového pufru obsahujícího 25 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 500 mM NaCl, 10 mM beta-merkaptoethanolu (BME) při pH 7,4 a 10% glycerol (pufr A) a lýzuje dvěma průchody přes Microfluidics při 82,74 MPa. Lyzát se centrifuguje při 30000 xg po dobu jedné hodiny a dostane se 1,7 1 lyzátového supernatantu. Do lyzátového supernatantu se přidá 150 ml NiNTA agarosy, která byla předem vyvážena lyzátovým pufrem obsahujícím 5mM imidazol, pH suspenze se upraví na hodnotu 8,0 pomocí 2N hydroxidu sodného a kaspasa 4 se absorbuje várkovým způsobem po dobu 1 h. NiNTA agarosa se vloží do sloupce, promyje 5mM a 25mM imidazolem v pufru A sekvenčně, aby se odstranily nečistoty a kaspasa 4 se eluuje 300mM imidazolem v pufru A. Protein se dialyzuje proti pufru B (25 mM HEPES, 0,1 % CHAPS, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 10 mM BME, pH 8,0) a natáhne do sloupce DEAE ToyoPearl 650M, předem vyváženého stejným pufrem. Kaspasa 4 se eluuje ze sloupce lOOmM chloridu sodného ve stejném pufru. Frakce vykazující nejvyšší specifickou aktivitu kaspasy 4 za použití fluorescenčního peptidového substrátu LEED-AMC se shromáždí.

Příklad 5

• * 9	• 9 •	• · 9	9 9 9 • 9 9
• ♦	9
9
• . • 999	9 9*·	• · 99	• 99··	9 · 9 · 99 99

- 21 Aktivace a příprava polypeptidu in vitro

Pro-IL-18 čištěný, jak je popsáno v příkladu 2, se inkubuje s kaspasou 4 v poměru hmotností 1:500 po dobu 3 h při teplotě místnosti. Štěpná reakce prodomény se uskuteční z více než 90 % podle analýzy SDS-PAGE. Do reakční směsi se přidá 140 ml NiNTA agarosy v pufru D, inkubuje po dobu lha vylije na nálevku se skleněným sintrem, aby se získal zpět nenavázaný materiál obsahující převážně zralý IL-18. Malá množství zbylého pro-IL-18, prodomény, kaspasy 4 a jiné nečistoty se vážou na NiNTA agarosu. Nenavázaný roztok se adjustuje do 25mM DTT, inkubuje po dobu 1 h, aby se dokončila redukční reakce, pH roztoku se upraví na hodnotu 6,0 přidáním 2M kyseliny fosforečné a zahustí na objem 86 ml za použití membrány YM10. Zahuštěný vzorek se natáhne na sloupec Superdex 75 předem vyvážený lOmM fosforečnanem sodným o pH 6,0 obsahujícím 0,lM chlorid sodný. Spojené frakce obsahují 560 mg zralého IL-18.

Příklad 6

Aktivace a příprava polypeptidu in vivo

Aktivace IL-18 lze rovněž dosáhnout in vivo pomocí současné exprese lidského prekursoru IL-18 a kaspasy 4. Pro-IL-18 je koexprimován bicistronicky v E. coli z jednoduchého transkriptu s lidskou kaspasou 4 v rámci expresního plasmidu pET28-pro-IL-18/kasp4 (obr. 5 a 6). Lidský gen pro-IL-18 se subklonuje do pET28a (Novagen) za kontroly T7 promotoru včetně účinné Shine-Dalgarnovy sekvence pro optimální iniciaci translace od pro-IL-18 sekvence (obr. 18). Gen kaspasy 4 (Ilel46 až Asn418) se subklonuje okamžitě za sekvenci pro-IL-18 včetně účinné Shine-Dalgarnovy sekvence, což zajišťuje minimální iniciaci translace ze sekvence kaspasy 4. T7 terminační sekvence se

- 22:

začlení pro ukončení translace za bicistronickou transkripční jednotku. Výsledný konstrukt se potom podrobí transfekcí do BL21(DE3) hostitele, obsahujícího induktabilní chromozomální kopii T7 polymerasového genu. Indukce tohoto konstruktu v tomto hostiteli pomocí lmM IPTG má za následek koordinaci transkripce a translace pro-IL-18 a pro-kaspasy 4. Translací nově vznikající pro-kaspasa 4 je sama přeměňována na aktivní enzym, který iniciuje proteolytickou aktivaci pro-IL-18. Obr. 8 ukazuje dobu aktivace během 18 hodin při teplotě 29 °C po indukci lmM IPTG (0 až 18 h)..

Příklad 7

Aktivace kaspasy 4 in vivo

Aktivaci kaspasy 4 in vivo popsal Munday N. A. a kol., J. Biol. Chemistry, 270, 15870 až 15876 (1995). Exprese zkrácené formy kaspasy 4, která začíná na Ala59, které chybí proregion v E. coli vede samoaktivaci štěpením mezi podjednotkami P10 a P20, které se soustřeďují do aktivního enzymového heterodimeru. Prodleva v aktivaci kaspasy 4 se odrazí v translaci prodlevy ve štěpení a aktivaci pro-IL-18 na zralý IL-18 (obr. 9). To umožňuje nahromadění stabilnějšího pro-IL-18 před štěpením na zralý IL-18, který je méně stabilní v buňkách.

Příklad 8

Čištění lidského IL-18 koexprimovaného s kaspasou 4 g buněk E. coli exprimujících IL-18, jak je popsáno v příkladu 6, se suspenduje ve 130 ml O,1M HEPES, pH 7,5, obsahujícího lmM EDTA a lOmM DTT (vlastní proces se uskuteční při teplotě 4 °C a v přítomnost lOmM DTT s výjimkou posledního kroku, aby se zachoval volný SH) a • · · ·

lýzuje při 103,425 MPa dvěma průchody přes Microfluidics. 230 ml lyzátu se centrifuguje při 34000 xg po dobu 30min. 200 ml supernatantu se zředí na 1 1 25mM HEPESem, pH 7,0 a nechá protéci dvěma sloupci seřazenými za sebou, ToyoPearl SP 650M a ToyoPearl DEAE 650M. Většina nečistot vzniklých z buněk E. coli se naváže na sloupce. Materiál, který protekl sloupci, se upraví na hodnotu pH 9,5 pomocí 25mM bistrispropan HCl, zředí na 2 1 a natahne na sloupec Source 15Q předem vyvážený 25mM bistrispropan HCl, pH 9,5. Sloupec se eluuje lineárním gradientem 0 až 0,5M chloridem sodným ve stejném pufru.

Frakce obsahující IL-18 se identifikují za použití Vydac C4 RP-HPLC a shromáždí se 250 ml. Eluát se zahustí na objem 50 ml za použití membrány YM10 a natáhne na sloupec Supredex 75 předem vyvážený lOmM NaPO₄ pH 6,0 obsahujícím lmM EDTA a 0,15M chlorid sodný (žádný DTT pro použití in vivo).

Příklad 9

Příprava zkrácené kaspasy 5

Lidská zkrácená kaspasa 5 je rovněž exprimována jako fuzní protein s šestihistidinovou smyčkou na N-konci v E. coli. Expresní plasmid, pET16b-zkrácená kaspasa 5, se odvodí od vektoru pET16b (Novagen), který obsahuje fágový T7 promotor. Rekombinantní vektor se konstruuje PCR amplifikací aktivní domény zkrácené kaspasy 5 (aminokyseliny Ilel46 až Asn418) zahrnutím kódující sekvence pro šest histidinů na N-konci a zakončením Nco I a Xho I restrikčními endonukleasovými místy. Výsledný produkt PCR se potom subklonuje mezi tato dvě restrikční místa, aby se vytvořil fuzní vektor zkrácené kaspasy 5 se šesti histidiny na N-konci.

Výsledný plasmid se transformuje do lysogenního kmenu E. coli BL21 DE3, obsahujícího chromozomální kopii T7 RNA

4· »·· ·

·« * * · • * » • · • 6 • · • · » · e · ·

«9 #» polymerasy za kontroly promotoru lacUV5, což umožňuje induktabilní expresi zkrácené kaspasy 5 po indukci lmM IPTG. Aktivní protein se čistí z buněčných pelet izolovaných po indukci při teplotě 37 °C po dobu 3 h.

Příklad 10

Čištění zkrácené kaspasy 5

Když jsou lyžovány buňky E. coli exprimující lidskou zkrácenou kaspasu 5 se šestihistidinovou smyčkou na N-konci, popsanou v příkladu 9, lze detekovat aktivitu zkrácené kaspasy 5 v lyzátovém supernatantu. Potom, co se protein zachytí ze supernatantu na NiNTA agarosových kuličkách, získá se znovu jak plO, tak p20. To ukazuje, že proteasová doména zkrácené kaspasy 5 je aktivována v buněčné kultuře prostřednictvím samoštěpení na spojení plO a p20 a zůstává jako rozpustný nekovalentní heterodimer. Se znalostí této informace lze heterodimer pl0/p20 se smyčkou se šesti histidiny čistit. Vlastní proces se uskutečňuje při teplotě 4 °C, aby se zabránilo jakémukoli dalšímu'poškození molekuly. .

Asi 400 g vlhkých buněčných pelet E. coli se suspenduje v 1,6 1 lýzového pufru obsahujícího 25 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 500 mM NaCl, 10 mM beta-merkaptoethanolu (BME) při pH 7,4 a 10% glycerol (pufr A) a lýzuje dvěma průchody přes Microfluidics při 82,74 MPa. Lyzát se centrifuguje při 30000 xg po dobu jedné hodiny a dostane se 1,7 1 lyzátového supernatantu. Do lyzátového supernatantu se přidá 150 ml NiNTA agarosy, která byla předem vyvážena lyzátovým pufrem obsahujícím 5mM imidazol, pH suspenze se upraví na hodnotu 8,0 pomocí 2N hydroxidu sodného a kaspasa 5 se absorbuje várkovým způsobem po dobu 1 h. NiNTA agarosa se vloží do sloupce, promyje 5mM a 25mM imidazolem v pufru A sekvenčně,

·· * • í * ·	«'· · · * Λ 9 ·	• · 9 99· « · ·
25 ·
• «· · ·	• • · ·	• 99 99 9999	• · · ·

aby se odstranily nečistoty a kaspasa 5 se eluuje 300mM imidazolem v pufru A. Protein se dialyzuje proti pufru B ( 25 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 10 mM BME, pH 8,0) a natáhne do sloupce DEAE ToyoPearl 650M, předem vyváženého stejným pufrem. Zkrácená kaspasa 5 se eluuje ze sloupce 100 mM chloridu sodného ve stejném pufru. Frakce vykazující nejvyšší specifickou aktivitu zkrácené kaspasy 5 za použití fluorescenčního peptidového substrátu LEED-AMC se shromáždí.

Příklad 11

Aktivace a příprava polypeptidu in vitro

Pro-IL-18 připravený a čištěný, jak je popsáno v příkladech 1 a 2, se inkubuje se zkrácenou kaspasou 5 v poměru hmotností 1:500 po dobu 3 h při teplotě místnosti. Štěpná reakce prodomény se uskuteční z více než 90 % podle analýzy SDS-PAGE. Do reakční směsi se přidá 140 ml NiNTA agarosy v pufru D, inkubuje po dobu lha vylije na nálevku se skleněným sintrem, aby se získal zpět nenavázaný materiál obsahující převážně zralý IL-18. Malá množství zbylého pro-IL-18, prodomény, zkrácené kaspasy 5 a jiné nečistoty se vážou na NiNTA agarosu. Nenavázaný roztok se adjustujedo 25mM DTT, inkubuje po dobu 1 h, aby se dokončila redukční reakce, pH roztoku se upraví na hodnotu 6,0 přidáním 2M kyseliny fosforečné a zahustí na objem 86 ml za použití membrány YM10. Zahuštěný vzorek se natáhne na sloupec Superdex 75 předem vyvážený 10mM fosforečnanem sodným o pH 6,0 obsahujícím Ο,ΙΜ chlorid sodný. Spojené frakce obsahují 560 mg zralého IL-18.

Příklad 12

Aktivace a příprava polypeptidu in vivo

9 26.

»

9 9 9 9 9

• *9	9 · · *	• '9 9
.·
9	9 9 9	• 9 · 9
9 9 9 9 9	9 Λ 9 9 9 9	99 99

Aktivace IL-18 lze rovněž dosáhnout ín vivo pomocí současné exprese lidského prekursoru IL-18 a zkrácené kaspasy 5. Pro-IL-18 je koexprimován bicistronicky v E. coli z jednoduchého transkriptu s lidskou zkrácenou kaspasou v rámci expresního plasmidu pET28-pro-IL-18/kasp5 (obr.9). Lidský gen pro-IL-18 se subklonuje do pET28a (Novagen) za kontroly T7 promotoru včetně účinné Shine-Dalgarnovy sekvence pro optimální iniciaci translace od pro-IL-18 sekvence (obr. 10). Gen zkrácené kaspasy 5 (Ilel46 až Asn418) se subklonuje okamžitě za sekvenci pro-IL-18 včetně účinné Shine-Dalgarnovy sekvence, což zajišťuje minimální iniciaci translace ze sekvence zkrácené kaspasy 5. T7 terminační sekvence se začlení pro ukončení translace za bicistronickou transkripční jednotku. Výsledný konstrukt se potom podrobí transfekci do BL21(DE3) hostitele, obsahujícího induktabilní chromozomální kopii T7 polymerasového genu. Indukce tohoto konstruktu v tomto hostiteli pomocí lmM IPTG má za následek koordinaci transkripce a translace pro-IL-18 a pro-kaspasy 5. Translací nově vznikající pro-kaspasa 5 je samovolně přeměňována na aktivní enzym, který iniciuje proteolytickou aktivaci pro-IL-18.

Příklad 13

Čištění lidského IL-18 koexprimovaného se zkrácenou kaspasou 5 g buněk E. coli exprimujících IL-18, jak je popsáno v příkladu 12, se suspenduje ve 130 ml O,1M HEPES, pH 7,5, obsahujícího lmM EDTA a lOmM DTT (vlastní proces se uskuteční při teplotě 4 °C a v přítomnosti lOmM DTT s výjimkou posledního kroku, aby se zachoval volný SH) a lýzuje při 103,425 MPa dvěma průchody přes Microfluidics. 230 • · ···· • 4 « · W » » v • · · · · <««· «4·« ··· ·· ···« «9 «· ml lyzátu se centrifuguje při 34000 xg po dobu 30min. 200 ml supernatantu se zředí na 1 1 25mM HEPESem, pH 7,0 a nechá protéci dvěma sloupci seřazenými za sebou, ToyoPearl SP 650M a ToyoPearl DEAE 650M. Většina nečistot vzniklých z buněk E. coli se naváže na sloupce. Materiál, který protekl sloupci, se upraví na hodnotu pH 9,5 pomocí 25mM bistrispropan, zředí na 2 1 a natahne na sloupec Source 15Q předem vyvážený 25mM bistrispropan HCl, pH 9,5. Sloupec se eluuje lineárním gradientem 0 až 0,5M chloridem sodným ve stejném pufru. Frakce obsahující IL-18 se identifikují za použití Vydac C4 RP-HPLC a shromáždí se 250 ml. Eluát se zahustí na objem 50 ml za použití membrány YM10 a natáhne na sloupec Supredex 75 předem vyvážený lOmM NaPO₄ pH 6,0 obsahujícím lmM EDTA a 0,15M chlorid sodný (žádný DTT pro použití in vivo).

Příklad 14

Příprava ubikvitin/pro-IL-18/Ubpl

Sekvence kódující ubikvitin se 76 aminokyselinami se fuzuje v rámci s počátkem zralého lidského IL-18 přes tupou koncovou ligaci tak, že první tyrosinový kodón zralého 11-18 následuje okamžitě po kodónu glycinu 76 ubikvitinu. Fuzní gen se potom subklonuje do pET vektoru za kontroly T7 promotoru včetně účinné Shine-Dalgarnovy sekvence pro optimální iniciaci translace od sekvence genu ubikvitin-IL-18. Gen Ubp-1 s plnou délkou se subklonuje okamžitě za IL-18 včetně účinné Shine-Dalgarnovy sekvence pro minimální translaci Ubp-1. Obr. 11 ukazuje sekvenci UbIL-18/Ubp-l expresní kazety v rámci pET28. Obr. 13 ukazuje anotovanou sekvenci UbIL-18/Ubp-l expresní kazety v rámci pET28. Číslování odpovídá pozicím v rámci pET28.

Příklad 15 •· ···· • 9

2*8 :

• <· ♦ · • · · • ·· · ·

9 9 · « • · « · » 99 99 99

Aktivace a příprava IL-18 in vivo

Konstrukt z příkladu 14 se potom podrobí transfekci do BL21(DE3) hostitele. Indukce tohoto konstruktu v tomto hostiteli pomocí lmM IPTG má.za následek koordinaci transkripce a translace ubikvitin-IL-18 a Ubp-1. Enzymatické působení Ubp-1 vede k účinnému zpracování Ub-IL-18 na zralý aktivní IL-18, který lze potom přímo čistit z lyzátů E. coli běžnými způsoby. Obr. 16 ilustruje dobu exprese a zpracování při teplotách 30 °C a 37 °C po indukci lmM IPTG. Šipka nahoře ukazuje část nezpracovaného Ub-IL-18 v linii 1. Šipka dole ukazuje zpracovanou část IL-18 v linii

3. (Detekce Western blot za použití antisera proti IL-18).

Příklad 16

Čištění lidského IL-18 koexprimovaného s ubikvitinem g buněk E. coli exprimujících IL-18, jak je popsáno v příkladu 15, se suspenduje ve 130 ml O,1M HEPES, pH 7,5, obsahujícího lmM EDTA a lOmM DTT (vlastni proces se uskuteční při teplotě 4 °C a v přítomnost 10mM DTT s výjimkou posledního kroku, aby se zachoval volný SH) a lýzuje při 103,425 MPa dvěma průchody přes Microfluidics. 230 ml lyzátu se centrifuguje při 34000 xg po dobu 30min. 200 ml supernatantu se zředí na 1 1 25mM HEPESem, pH 7,0 a nechá protéci dvěma sloupci seřazenými za sebou, ToyoPearl SP 650M a ToyoPearl DEAE 650M. Většina nečistot vzniklých z buněk E. coli se naváže na sloupce. Materiál, který protekl sloupci, se upraví na hodnotu pH 9,5 pomocí 25mM bistrispropan, zředí na 2 1 a natahne na sloupec Source 15Q předem vyvážený 25mM bistrispropan HC1, pH 9,5. Sloupec se eluuje lineárním gradientem 0 až 0,5M chloridem sodným ve stejném pufru.

Frakce obsahující IL-18 se identifikují za použití Vydac C4 RP-HPLC a shromáždí se 250 ml. Eluát se zahustí na objem 50 ·· ···· • *» ♦ © * ·♦ • · · · · · · · · — · — « · · · * • · ' · · · # , · ©·«· ··· ·· ♦·*· ·· ml za použití membrány YM10 a natáhne na sloupec Supredex 75 předem vyvážený ÍOmM NaPO₄ pH 6,0 obsahujícím lmM EDTA a 0,15M chlorid sodný (žádný DTT pro použití in vivo).

Zatímco je zde popsáno, co se v současné době považuje za výhodná ztělesnění tohoto vynálezu, je zřejmé, že lze uskutečnit řadu modifikací a patentové nároky zahrnují všechny takové modifikace, které spadají do rozsahu tohoto vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob produkce aktivního polypeptidu z prekursoru polypeptidu, který má proteasový aktivační motiv, vyznačující se tím, že zahrnuje aminokyselinovou sekvenci XEYD, ve které je X zvoleno ze skupiny aminokyselin, sestávající z W, L, F, Y, I, V, D nebo E a Y je zvoleno ze skupiny aminokyselin, sestávající zH, I, A, T, S, P nebo E, zahrnující:

(i) kontaktování kaspasy 4 s prekursorem polypeptidu a (ii) čištění aktivního polypeptidu.
2. Způsob produkce aktivního polypeptidu z prekursoru polypeptidu, který má proteasový aktivační motiv, vyznačující se tím, že zahrnuje aminokyselinovou sekvenci XEYD, ve které je X zvoleno ze skupiny aminokyselin, sestávající z W, L, F, Y, I, V, D nebo E a Y je zvoleno ze skupiny aminokyselin, sestávající z Η, I, A, T, S, P nebo E, zahrnující:

(i) kontaktování kaspasy 5 s prekursorem polypeptidu a (ii) čištění aktivního polypeptidu.
3. Způsob produkce aktivního polypeptidu IL-18 z prekursoru polypeptidu IL-18, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(i) kontaktování kaspasy 4 s prekursorem polypeptidu IL-18 a (ii) čištění aktivního polypeptidu.

• * 4 • · · ·

- ?ι :• · «··· ··· «4 · · « · ♦ · • · ·
4. Způsob produkce aktivního polypeptidu IL-18 z prekursoru polypeptidu IL-18, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(i) kontaktování kaspasy 5 s prekursorem polypeptidu IL-18 a (ii) čištění aktivního polypeptidu.
5. Způsob podle nároku 3,vyznačuj ící se tím, že prekursor polypeptidu IL-18 je lidský polypeptid IL-18.
6. Způsob podle nároku 4,vyznačuj ící se tím, že prekursor polypeptidu IL-18 je lidský polypeptid IL-18.
7. Způsob produkce aktivního lidského polypeptidu IL-18, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(i) kontaktování kaspasy 4 s lidským prekursorem polypeptidu IL-18, aby se daný prekursor polypeptidu přeměnil na aktivní lidský polypeptid IL-18, uvedený prekursor polypeptidu IL-18 zahrnuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její část, která má zachovány zbytky asparagové kyseliny 36 a tyrosinu 37 v aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1 jako N-koncovou sekvenci a (ii) čištění aktivního lidského polypeptidu IL-18.
8. Způsob produkce aktivního lidského polypeptidu IL-18, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(i) kontaktování kaspasy 5 s lidským prekursorem • · » • · · a ·· ·· polypeptidu IL-18, aby se daný prekursor polypeptidu přeměnil na aktivní lidský polypeptid IL-18, uvedený prekursor polypeptidu IL-18 zahrnuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její část, která má zachovány zbytky asparagové kyseliny 36 a tyrosinu 37 v aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:l jako N-koncovou sekvenci a (ii) čištění aktivního lidského polypeptidu IL-18.
9. Způsob produkce aktivního lidského polypeptidu IL-18 podle nároku 7, vyznačující se tím, že aktivní lidský polypeptid IL-18 je polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:3.
10. Způsob produkce aktivního lidského polypeptidu IL-18 podle nároku 8, vyznačující se tím, že aktivní lidský polypeptid IL-18 je polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:3.
11. Způsob produkce aktivního polypeptidu z prekursoru polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(i) bicistronickou koexpresi kaspasy 4 s prekursorem polypeptidu a (ii) čištění aktivního polypeptidu.
12. Způsob produkce aktivního polypeptidu z prekursoru polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(i) bicistronickou koexpresi kaspasy 5 s prekursorem polypeptidu a ···· • · « · · · · · · ···· ··· ··- ···· ·· ·· (ii) čištění aktivního polypeptidu.
13. Způsob produkce aktivního polypeptidu IL-18 z prekursoru polypeptidu IL-18, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(i) bicistronickou koexpresi ubikvitinasy s fuzním ubikvitin/IL-18 a (ii) čištění aktivního polypeptidu IL-18.
14. Způsob produkce aktivního polypeptidu IL-18 z prekursoru polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(i) bicistronickou koexpresi kaspasy 4 s prekursorem polypeptidu IL-18 a (ii) čištění aktivního polypeptidu IL-18.
15. Způsob produkce aktivního polypeptidu IL-18 z prekursoru polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(i) bicistronickou koexpresi kaspasy 5 s prekursorem polypeptidu IL-18 a (ii) čištění aktivního polypeptidu IL-18.
16. Způsob podle nároku 13,vyznačující se tím, že prekursor polypeptidu IL-18 je lidský prekursor polypeptidu IL-18.
17. Způsob podle nároku 14,vyznačující se t í m, že prekursor polypeptidu IL-18 je lidský prekursor polypeptidu IL-18.
18. Způsob podle nároku 15,vyznačující se tím, že prekursor polypeptidu IL-18 je lidský prekursor polypeptidu IL-18.
19. Způsob podle nároku 16,vyznačující se tím, že aktivní lidský polypeptid IL-18 je polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:3.
20. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že aktivní lidský polypeptid IL-18 je polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:3.
21. Způsob podle nároku 18,vyznačující se tím, že aktivní lidský polypeptid IL-18 je polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:3.
22. Způsob produkce aktivního lidského polypeptidu IL-18 z prekursoru lidského polypeptidu IL-18, vyznačující setím, že zahrnuje:

(i) bicistronickou koexpresi ubikvitinasy s ubikvitin/IL-18, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:10 a (ii) čištění aktivního lidského polypeptidu IL-18.
23. Způsob produkce aktivního lidského polypeptidu IL-18 z prekursoru lidského polypeptidu IL-18, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(i) bicistronickou koexpresi kaspasy 4, která má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:4, s prekursorem lidského polypeptidu IL-18 a (ii) čištění aktivního polypeptidu IL-18.
24. Způsob produkce aktivního lidského polypeptidu IL-18 z prekursoru lidského polypeptidu IL-18, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(i) bicistronickou koexpresi kaspasy 5, která má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:6, s prekursorem lidského polypeptidu IL-18 a (ii) čištění aktivního polypeptidu IL-18.