CZ20021853A3

CZ20021853A3 - Způsob testování účinku látky, polynukleotid, DNA, protilátka, souprava pro testování, pouľití polynukleotidu, pouľití polypeptidu, pouľití protilátky, RNA a terapeutické činidlo

Info

Publication number: CZ20021853A3
Application number: CZ20021853A
Authority: CZ
Inventors: Ryuta Koishi; Mitsuru Ono; Hidehiko Furukawa; Hiroyoshi Horikoshi; Toshihiko Fujiwara; Yosuke Ando
Original assignee: Sankyo Company, Limited
Priority date: 1999-12-09
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2002-11-13
Also published as: KR20020062652A; PL355666A1; CN1433482A; BR0016257A; RU2002115295A; US20030017488A1; EP1239050A4; WO2001042499A1; US20030207251A1; CA2390676A1; EP1239050A1; AU1887001A; US20030211533A1; MXPA02005758A; HUP0203408A2; ZA200204432B; AU768034B2; HUP0203408A3; IL149849A0; NO20022711D0

Description

Předložený vynález se týká nového způsobu testování terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemii, dále se týká sondy nukleové kyseliny, primeru a protilátky, které jsou při tomto způsobu testování použity.

Dosavadní stav techniky

Množství pacientů trpících hyperlipidemii se výrazně zvýšilo následkem nadbytečného příjmu tuku a cholesterolu, který doprovází v současnosti změnu v potravních návycích. Hyperlipidemie je porucha, při které se koncentrace sérových lipidů, tj. cholesterolu, neutrálního tuku (triglycerid, TG), fosfolipidů, volných mastných kyselin a podobných látek v séru zvyšuje a je vážným rizikovým faktorem arteriosklerózy. Dále se zvyšuje možnost, že tím budou způsobeny komplikace, jako je hypertenze, srdeční angína nebo infarkt myokardu, které jsou spojeny s ♦ arteriosklerózou koronárních cév a zvyšuje se riziko infarktu mozku.

Třebaže bylo popsáno mnoho sloučenin, které vykazují antihyperlipidemický »

účinek, mnoho z nich má v současné době, v případě, že jsou používány souvisle, různé neodstranitelné vedlejší účinky, protože se jedná o chemicky syntetizované sloučeniny.

Na druhé straně, sodná sůl pravastatinu, která je nyní komerčně dostupná, je jedno z nejsilnéjších antilipidemických činidel, pochází z mikrobiálních metabolitú, a působí jako represor HMG-CoA reduktázy, která je enzymem, který limituje rychlost v systému biosyntézy cholesterolu. Tedy, kdyby bylo možno identifikovat gen existující v živém organizmu, který kóduje protein, který má vztah k hyperlipidemii, bylo by možno vyvinout účinnější antilipidemické činidlo, které by buď nemělo žádný (nebo slabý) vedlejší účinek, a to tak, že by byla buď inhibována jeho funkce přímo, nebo by byla kontrolována jeho exprese. Avšak takový gen, který by měl těsný vztah ke vzniku hyperlipidemie, nebyl znám.

·· · ·

Na druhé straně, stejná sekvence jako má sonda nukleové kyseliny používaná v metodě uvedené v předloženém vynálezu je popsána v databázi Genbank jako nukleotidová sekvence, která kóduje “protein 3 příbuzný angiopoietinu”, a stejná nukleotidová sekvence je popsána jako sekvence, která kóduje zalpha5” v publikaci mezinárodního patentu č. WO 99/55 869. Avšak nebylo vůbec nic známo o vztahu mezi hyperlipidemií a geny, které mají tyto nukleotidové sekvence. Proto nebylo známo, že část nukleotidové sekvence kódující “protein 3 příbuzný angiopoietinu” nebo “zalpha5” je vhodná pro testování terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemií.

Cílem předloženého vynálezu je tedy poskytnout nový postup testování terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemií a sondy nukleové kyseliny, primeru nebo protilátky, které jsou v tomto testování použity.

Podstata vynálezu

Autoři předloženého vynálezu upřesnili polohu genu způsobujícího hyperlipidemií na chromozomu tím, že porovnali geny myši s vrozenou hypolipidemií s geny hyperlipidemické myši, aby vyhledali cílový gen pro působení terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemií. Potom dosáhli úspěchu při určení genu, který je u hyperlipidemické myši vysoce exprimován. Výsledkem porovnávání homologie bylo potvrzení, že cDNA pocházející z tohoto genu byla popsána jako nukleotidová sekvence, která kóduje v databázi Genebank “protein 3 příbuzný angiopoietinu”. Avšak autoři předloženého vynálezu zjistili, že koncentrace neutrálního tuku v krvi vzrůstá, když je gen s touto nukleotidovou sekvencí v hypolipidemické myši nucené exprimován a bylo potvrzeno, že gen má novou funkci, která dosud ještě nebyla popsána. Poté autoři předloženého vynálezu úspěšně vyvinuli nový způsob testování terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemií, který využívá pro detekční systém genové exprese, jako sondu nebo primer, nukleotidovou sekvenci nebo její část. Dále autoři předloženého vynálezu připravili protilátku specifickou proti polypeptidu, kódovanému nukleotidovou sekvencí, a vyvinuli způsob testování terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemií, který využívá experimentální systém, detekující pomocí protilátky množství produkce polypeptidu. Dále vytvořili živočišný model tím, že vnesli nukleotidovou sekvenci do laboratorního zvířete a podařilo se jim vyvinout nový způsob testování terapeutického nebo • · · ........

preventivního činidla proti hyperlipidemii za použití tohoto živočišného modelu. Tímto byl komplex předloženého vynálezu ukončen.

Zaprvé se předložený vynález týká způsobu testování účinku látky, zda se jedná • o terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii, který obsahuje následující kroky:

B

1) kultivování buněk v přítomnosti nebo nepřítomnosti testované látky;

2) detekování úrovně exprese mRNA, která má nukleotidovou sekvenci shodnou s kteroukoli z následujících sekvencí a) až e) (avšak t v sekvenci je čteno jako u) v kultivovaných buňkách, získaných výše v bodu 1):

a) nukleotidovou sekvenci uvedenou jako nukleotidy číslo 47 až 1411 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí;

b) nukleotidovou sekvenci uvedenou jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí;;

c) nukleotidovou sekvenci DNA vloženou do fágomidu, neseného v transformované Escherichia coli E. coli pBK/m55-1 SANK72199 (FERM BP-69-40);

d) nukleotidovou sekvenci DNA vloženou do fágomidu, neseného v transformované Escherichia coli E. coli pTrip/h55-1 SANK72299 (FERM BP-6941);

* e) nukleotidovou sekvenci která hybridizuje za striktních podmínek s polynukleotidem, obsahujícím protismyslnou sekvenci k nukleotidové sekvenci popsané v kterémkoli z výše uvedených bodů a) až d), a kóduje polypeptid, který má schopnost zvyšovat koncentraci neutrálního tuku v krvi; a

3) porovnání úrovně exprese mRNA mezi buňkami kultivovanými v přítomnosti látky a buňkami kultivovanými v nepřítomnosti látky, jako výsledek detekce ve výše uvedeném bodu 2).

Výše uvedené kultivované buňky s výhodou pocházejí z jater (kultura primárních hepatocytů nebo podobně), a je žádoucí, aby pocházely z primátů nebo hlodavců. Výhodnější je, když tyto buňky pocházejí z člověka, myši, krysy nebo křečka, ale předložený vynález není na tyto zdroje omezen.

V uvedené metodě je výhodné, když způsobem detekce množství exprimované mRNA je northernový přenos RNA, hybridizace tečková, RT-PCR, test protekce vůči • · • ♦ · · • * ribonukleáze, test „run-on“, analýza na DNA čipech, analýza na DNA mikroarrays nebo pomocí kvantitativní PCR metody, ale předložený vynález na ně není omezen.

Zadruhé se předložený vynález týká sondy nukleové kyseliny, kterou je možno použít ve výše uvedené metodě, tj. polynukleotidu, který má nukleotidovou sekvenci hybridizující za striktních podmínek s mRNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, popsanou ve kterémkoli z výše uvedených bodů a) až d) (avšak t v sekvenci je čteno jako u) [vyjma těch, které obsahují nukleotidové sekvence, popsané výše v bodech a) až d)]. Dále mohou být také ve výše uvedené metodě s výhodou použity jako sondy nukleové kyseliny: DNA obsahující alespoň 15 nukleotidů z nukleotidové sekvence uvedené jako nukleotidy číslo 47 až 1411 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí, kde jeden nebo více nukleotidů je na jednom nebo obou jejích koncích odstraněno, nebo DNA obsahující alespoň 15 nukleotidů z nukleotidové sekvence uvedené jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí, kde jeden nebo více nukleotidů je na jednom nebo obou koncích odstraněno.

Zatřetí se předložený vynález týká způsobu testování účinku látky, zda se jedná o terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii, který obsahuje následující kroky:

1) kultivování buněk v přítomnosti nebo nepřítomnosti testované látky;

2) detekování úrovně produkce polypeptidu, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci shodnou s kteroukoli z následujících sekvencí a) až e) nebo s její částí v supernatantu kultivovaných buněk, získaných výše v bodu 1), za pomoci protilátky, která tento polypeptid specificky rozeznává; a

3) porovnání úrovně produkce polypeptidu mezi buňkami kultivovanými v nepřítomnosti látky a buňkami kultivovanými v přítomnosti látky, jako výsledek detekce ve výše uvedeném bodu 2); a protilátky použité ve výše uvedeném bodu 2).

Je výhodné když protilátka, která specificky rozeznává polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence kódované kteroukoli z nukleotidových sekvencí, uvedených výše v bodech a) až e) nebo jejich částí, je protilátka která specificky rozpoznává aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako aminokyseliny číslo 17 až 455 v SEQ ID No. 2 v seznamu sekvencí, nebo její část, polypeptid, který obsahuje sekvenci aminokyselin 19 až 455 z téže sekvence jako výše, nebo její část, polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako aminokyseliny číslo 17 až 460 v • · ··· ·

SEQ ID No. 4 v seznamu sekvencí, nebo její část, a dále jsou výhodné ty protilátky, které specificky rozpoznávají aminokyselinovou sekvenci uvedenou v aminokyselinové sekvenci jako aminokyseliny číslo 1 až 13 v SEQ ID No. 9 v seznamu sekvencí nebo aminokyseliny číslo 1 až 14 v SEQ ID No. 10.

Dále jsou jako způsoby detekce protilátky ve výše uvedeném postupu 2) výhodné westernový přenos proteinů, hybridizace tečková, enzymový imunologický test na pevné fázi (metoda ELISA) nebo radioizotopový imunologický test (metoda RIA), ale předložený vynález na ně není omezen.

Ze čtvrtého hlediska se předložený vynález týká soupravy pro testování terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemii, které obsahuje výše uvedenou protilátku.

Z pátého hlediska se předložený vynález týká způsobu testování účinku látky při zjišťování, zda se jedná o terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii, který obsahuje následující kroky:

1) podání testované látky živočichovi, jinému než je člověk, který byl získán genovou manipulací, při které byl do něho vnesen cizí gen obsahující nukleotidovou sekvenci, ukázanou v kterémkoli z výše uvedených bodů a) až

e), přičemž tento gen byl vnesen tak, že může být vysoce exprimován;

2) měření koncentrace neutrálního tuku v krvi živočicha z bodu 1).

V tomto způsobu je výhodné, když živočichem, jiným než člověk, je myš, ale předložený vynález na ni není omezen. Dále, výhodným způsobem vnesení cizího genu do živočicha, jiného než je člověk, je metoda infikování živočicha adenovirem, který obsahuje adenovirový vektor do kterého je vnesen gen, ale předložený vynález není omezen na tento postup.

Z šestého hlediska se předložený vynález týká DNA nebo RNA, která obsahuje protismyslnou sekvenci k nukleotidové sekvenci, která se skládá z 15 až 30 po sobě následujících nukleotidů z nukleotidové sekvence uvedené jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí nebo antilipidemické činidlo obsahující jako svou aktivní složku DNA nebo RNA.

Předložený vynález totiž poskytuje způsob testování účinku látky, zda se jedná o terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii, při kterém jako ukazatel slouží exprese genu, který se účastní regulování koncentrace neutrálního tuku v krvi savců a má nukleotidovou sekvenci, která je uvedena v SEQ ID No. 1 nebo SEQ ID No.

.·· ·

......

*· ·· · :

• · *. * z · ·

......

v seznamu sekvencí; sonda nukleové kyseliny, primer a protilátka, používané při tomto způsobu stanovení; a molekula protismyslné nukleotidové kyseliny DNA, která má nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí.

V předloženém vynálezu výraz „hybridizuje za striktních podmínek“ znamená, že je hybridizace probíhá při 68 °C v komerčně dostupném hybridizačním roztoku ExpressHyb Hybridization Solution (vyráběn v Clontech) nebo hybridizace probíhá za podmínek ekvivalentních s těmito.

Přesněji řečeno, metoda předloženého vynálezu obsahuje: měření exprese genu, který má nukleotidovou sekvenci uvedenou u nukleotidů číslo 47 až 1411 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí nebo nukleotidovou sekvenci uvedenou u nukleotidů číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí nebo genu kódujícího polypeptid, který má totožnou aktivitu jako polypeptid tímto genem kódovaný, pomocí detekce specifické nukleové kyseliny (mRNA) nebo polypeptidu, a výběrem látky redukující rozsah exprese genu, která je pak kandidátem na terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii.

Dále bude k předloženému vynálezu podán výklad.

A) Detekce nukleové kyseliny

1) Sonda

Sonda používaná v metodě, která využívá hybridizaci nukleové kyseliny jako jeden ze způsobů provádění detekce nukleové kyseliny, je DNA nebo RNA, přičemž její nukleotidová sekvence je taková, že hybridizuje za striktních podmínek s polynukleotidem, který má jakoukoli z následujících sekvencí a) až e) (t v sekvenci je čteno jako u):

a) nukleotidová sekvence uvedená u nukleotidů číslo 47 až 1411 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí;

b) nukleotidová sekvence uvedená u nukleotidů číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí;

c) nukleotidová sekvence DNA fragmentu vloženého do fágomidu, který je nesen transformovanou Escherichia coli E.coli pBK/m55-1 SANK72199 (FERM BP6940) ;

d) nukleotidová sekvence DNA fragmentu vloženého do fágomidu, který je nesen transformovanou Escherichia coli E.coli pTrip/h55-1 SANK72299 (FERM BP6941) ;

• · • ·

e) nukleotidová sekvence hybridizující za striktních podmínek s polynukleotidem, který má protismyslnou sekvenci k nukleotidová sekvenci popsané v jakémkoli zvýše uvedených bodů a) až d), a má schopnost zvyšovat koncentraci neutrálního tuku v krvi.

Může být použita jakákoli sonda, která hybridizuje za striktních podmínek s polynukleotidem, který má nukleotidovou sekvenci popsanou v jakémkoli z výše uvedených bodů a) až e), a umožňující detekování polyribonukleotidu, např. polynukleotid, který má protismyslnou sekvenci k nukleotidové sekvenci popsané v jakémkoli zvýše uvedených bodů a) až e), polynukleotid, který má částečnou sekvenci obsahující alespoň 15 po sobě následujících nukleotidů z protismyslné sekvence, modifikovaná sekvence protismyslných nukleotidů a podobně. Výše uvedený polynukleotid, který má protismyslnou sekvenci k nukleotidové sekvenci popsané výše v bodu a), může být získán jako značená sonda přímým značením podle známého postupu, jako cDNA klonovaná z cDNA knihovny pocházející z myších jater na základě nukleotidové sekvenční informace uvedené v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí pomocí známého postupu, jako je metoda plakové hybridizace, metoda hybridizace kolonií nebo PCR metoda, nebo značením během replikační nebo transkripční reakce polymerázovou reakcí za použití klonu cDNA jako matrice. Polynukleotid, který má protismyslnou sekvenci k nukleotidové sekvenci popsané výše v bodu b), může být získán jako značená sonda z cDNA klonu pomocí stejného postupu na základě nukleotidové sekvenční informace uvedené v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí z cDNA knihovny pocházející z lidských jater. Na druhé straně polynukleotid, který má protismyslnou sekvenci k nukleotidové sekvenci popsané výše v bodech c) nebo d), může být získán z rekombinantních fágomidů nesených transformovanými Escherichia coli E.coli pBK/m55-1 SANK 72 199 nebo E.coli pTrip/h55-1 SANK 72 299, které byly pro mezinárodní použití uloženy 19. listopadu 1999 v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo (Národní ústav pro pokročilou průmyslovou vědu a technologii, Depozitář mezinárodních patentů) v 1-1-3, Higashi-cho, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, a byla jim přidělena přístupová čísla FERM BP-6940 respektive FERM BP6941.

Dále polynukleotid, který má protismyslnou sekvenci k nukleotidové sekvenci popsané ve výše uvedeném bodu e), může být získán z klonu cDNA izolovaného klonováním pomocí metody plakové hybridizace nebo metody hybridizace kolonií

z cDNA knihovny pocházející z libovolného savčího zdroje (s výhodou játra), pomocí polynukleotidu, který má protismyslnou sekvenci k nukleotidovým sekvencím popsaným v bodech a) až b), a získaným jak bylo výše uvedeno ve formě sondy.

Polynukleotid, který obsahuje alespoň částečnou sekvenci 15 po sobě následujících nukleotidů protismyslné sekvence k nukleotidovým sekvencím popsaným výše v bodech a) až e), může být získán chemickou syntézou, pokud se takový polynukleotid skládá z několika tuctů nukleotidů. Jinak může být získán pomocí klonování, pomocí PCR reakce nebo podobně, jakákoli z částečných sekvencí v cDNA klonu, který má nukleotidovou sekvenci uvedenou výše v jakémkoli z bodů a) až e), získané jak bylo uvedeno výše, a potom připravena ve formě sondy, která má protismyslnou sekvenci, pomocí stejné metody jako výše.

Například polynukleotid, který má částečnou sekvenci sestávající ze souvislého úseku několika tuctů nukleotidů z protismyslné sekvence k nukleotidové sekvenci uvedené v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí, přičemž několik nukleotidů je přidáno, deletováno a/nebo přidáno, může být také použit v metodě předloženého vynálezu, pokud za striktních podmínek hybrídizuje s polynukleotidem popsaným v jakémkoli zvýše uvedených bodů a) až e). Takový polynukleotid může být připraven pomocí metody chemické syntézy nebo pomocí metody vnášející variace, za použití enzymatických reakcí, které jsou dobře známé v oblasti technického zázemí předloženého vynálezu, jako je polymerázová řetězová reakce (zde označovaná jako „PCR“).

Dále sonda použitá v metodě předloženého vynálezu není omezena na to, že se obsahuje jednu nukleotidovou sekvenci. To znamená, že v metodě předloženého vynálezu, může být například použita jako sonda směs dvou nebo více druhů nukleotidových sekvencí splňujících výše uvedené požadavky, nebo může být provedena mnohočetná detekce pomocí samostatného použití dvou nebo více druhů těchto nukleotidových sekvencí.

2) Primer pro RT-PCR

Jiným způsobem realizace detekce nukleových kyselin v předloženém vynálezu je metoda amplifikace DNA fragmentu specificky pomocí PCR po provedení reakce reverzní transkripce, kde je jako matrice použita mRNA, tedy tzv. RT-PCR. V této metodě, aby došlo k specifické amplifikaci cílové nukleotidové sekvence, jsou použity protismyslný primer, který je komplementární k specifické částečné sekvenci zamýšlené mRNA a pozitivní primer, který je komplementární k specifické částečné sekvenci cDNA, vytvořené pomocí reverzní transkriptázy a protismyslného primeru.

Protismyslný primer, který je používán jak v reakci s reverzní transkriptázou, tak v PCR reakci, se v podstatě skládá ze souvislé sekvence alespoň 18 nukleotidů, s výhodou alespoň 23 nukleotidů protismyslné sekvence k výše zmíněné nukleotidové sekvenci, uvedené v jakémkoli výše zmíněném bodu a) až e).

Na druhé straně sekvence pozitivního primeru, použitého v PCR, sestává z libovolných částečných sekvencí alespoň 18 nukleotidů, s výhodou alespoň 21 nukleotidů, nacházejících se proti směru přepisu od sekvence na nejvzdálenějším 5'konci sekvence, odpovídající komplementárnímu řetězci výše zmíněného protismyslného primeru ve výše zmíněných nukleotidových sekvencích, uvedených v jakémkoli z výše uvedených bodů a) až e). Avšak pokud jsou v pozitivním primeru respektive v protismyslném primeru komplementární sekvence, existuje možnost že bude amplifikována nespecifická sekvence, což je výsledkem skutečnosti, že primery vzájemně tepelně hybridizují, čímž ztěžují detekování specifického genu. Proto je výhodné navrhnout primery tak, abychom se takového spojení vyvarovali.

K těmto protismyslným a pozitivním primerům mohou být na jejich 5'-konec přidány nukleotidové sekvence, které nemají vztah k výše zmíněným nukleotidovým sekvencím, uvedeným v jakémkoli z bodů a) až e). Avšak linker je s výhodou takový, že nehybridizuje nespecificky s nukleovou kyselinou v reakční směsi v průběhu reakce, a tedy nemůže ztěžovat detekování specifického genu.

3) Buňky nebo živočichové pro detekování genové exprese

Kultivované buňky použité v této metodě předloženého vynálezu by měly být právě takové savčí buňky, ve kterých je exprimován gen, který obsahuje výše zmíněné nukleotidové sekvence, uvedené v jakémkoli z výše uvedených bodů a) až e). Výhodné jsou kultivované buňky pocházející z jater savců (s výhodou primární kultury hepatocytů), ale mohou být také použity uměle transformované buňky, například buňky, do kterých je spolu s promotorovou oblastí (např. buňky CHO) vnesen gen obsahující výše zmíněnou nukleotidovou sekvenci, uvedenou v jakémkoli zvýše uvedených bodů

a) až e). Jako savčí zdroje jsou výhodné člověk, myš, krysa nebo křeček, výhodnější jsou člověk a myš. Kromě toho jsou ještě výhodnější primární kultury hepatocytů pocházející z KK myši (dostupné od Nihon Kurea), což je hyperlipidemická myš, vynález však není na tento myší kmen omezen. Kromě toho, pokud je to považováno • ·· · : .........

za výhodnější než používání buněčných kultur, je také možno použít metodu, ve které je testovaná látka podána savci a potom je měřena v buňkách orgánů nebo tkání, které jsou ze živočicha extrahovány, exprese genu obsahujícího nukleotidové sekvence, uvedené v jakémkoli z výše uvedených bodů a) až e). Orgány nebo tkáně, ve kterých by měla být exprese genu detekována, mohou být ty, ve kterých může být exprimován gen, který obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v jakémkoli z bodů a) až e), a jedná se nejčastěji o játra. Živočichem výhodným v tomto provedení může být člověk, myš, krysa nebo křeček, výhodnější jsou člověk a myš. Například z myší je výhodná výše uvedená myš KK, ale předložený vynález není na ní omezen.

Kultivované buňky použité v rámci této metody předloženého vynálezu mohou být za jakýchkoli podmínek, za kterých může být gen obsahující nukleotidovou sekvenci, uvedenou v jakémkoli z bodů a) až e), exprimován v případě, že není přidána testovaná látka. Například jsou pro buněčné kultury známy zavedené kultivační podmínky, a buňky mohou být kultivovány za takových podmínek, kdy mohou exprimovat gen obsahující výše uvedenou nukleotidovou sekvenci, uvedenou v jakémkoli z bodů a) až e).

4) Přidání testované látky

Testovaná látka je přidána do kultivačního média v průběhu kultivace výše uvedených buněk a tyto buňky jsou po určitou dobu kultivovány. Příklady testovaných látek mohou zahrnovat: sloučeninu, mikrobiální metabolit, extrakt z rostlinné nebo živočišné tkáně, jejich deriváty nebo směsi a podobně. Dávka a koncentrace testované látky mohou být vhodným způsobem určovány. Jinak je například možno připravit ředící série a ty jsou pak použity jako dva nebo více typů dávek. Období kultivace v přítomnosti testované látky může být také vhodným způsobem určováno, a s výhodou trvá 30 minut až 24 hodin. Když je testovaná látka podávána savci, mohou být použity vhodné dávkové formy jako je orální podávání, intravenózní injekce, intraperitoneální injekce, transdermální a podkožní injekce, v závislosti na fyzikálních vlastnostech testované látky nebo podobně.

5) Příprava vzorku

Je výhodné extrahovat RNA z buněk kultivovaných výše uvedeným způsobem tak, že jsou buňky rozpuštěny přímo v rozpouštědle pro extrakci RNA (například takových, která obsahují složku se schopností inaktivovat ribonukleázu, jako je fenol), bezprostředně po ukončení kultivace. Jinak je možno buňky získat opatrným • · · ♦ · · ©· · seškrabáním stěrkou tak, že buňky nejsou rozbity, nebo metodou jemného oddělení buněk od materiálu kultivační nádoby za pomoci proteáz jako je trypsin a podobně. Potom jsou rychle přeneseny do procesu extrakce RNA.

Jako metody extrakce RNA mohou být použity ultracentrifugační metoda používající thiokyanát guanidinu a chlorid česný, postup používající thiokyanát guanidinu a horký fenol, metoda používající guanidin s kyselinou chlorovodíkovou, metoda používající kyselý thiokyanát guanidinu, fenol a chloroform (Chomczynski, P. a Sacchi, N. (1987), Anal. Biochem., 162, 156-159) nebo podobné. Výhodná je metoda používající kyselý thiokyanát guanidinu, fenol a chloroform.

Metoda dalšího čištění mRNA ze získané RNA bude vysvětlena dále. Od té doby co je známo, že mnohé mRNA existující v cytoplazmě eukaryotů mají na 3'-konci sekvenci poly(A), mRNA může být čištěna s využitím této vlastnosti, a to absorbováním mRNA na sondu oligo(dT) značenou biotinem, vychytáním mRNA pomocí vazby biotin/avidin na paramagnetická zrnka, na kterých je fixován streptavidin, a po promývací operaci je provedena eluce mRNA. Kromě toho může být také použita purifikační metoda, která obsahuje nachytání mRNA na sloupec oligo(dT) celulózy a poté její eluci. Dále může být také mRNA frakcionována pomocí centrifugace v hustotním gradientu sacharózy nebo podobně. Avšak pro metodu předloženého vynálezu nejsou tyto mRNA purifikující postupy nepostradatelné, a v následujícím postupu může být také použita celková RNA, pokud může být detekována exprese genu obsahujícího nukleotidovou sekvenci, uvedenou v jakémkoli zvýše uvedených bodů a) až e).

6) Imobilizace vzorku

Když je detekce prováděna pomocí hybridizace nukleové kyseliny, aby byl specificky detekován gen ve vzorku RNA, který byl získán výše uvedeným postupem, vzorek RNA je podroben elektroforéze na agaróze, poté je pro hybridizační pokus přenesena na membránu (dále označováno jako „membrána“) (northernový přenos) nebo imobilizována na membráně pomocí metody tzv. tečkové hybridizace, kdy je vzorek ponechán přímo vsáknout do membrány. Jako membrána může být použita nitrocelulózová membrána (například High bond-C pure (vyrábí Amersham Pharmacia) nebo podobné), kladně nabitá nylonová membrána (například High bond-N+ (vyrábí Amersham Pharmacia) nebo podobné) nebo hydrofilní nylonové membrány (například High bond-N/NX (vyrábí Amersham Pharmacia) nebo podobné).

* * ·

Metodou agarózové elektroforézy pro northernový přenos může být metoda používající agarózový gel sformamidem, metoda používající působení glyoxalu a dimethylsulfoxidu na vzorek, aby došlo kjeho denaturaci, a poté vzorek migruje v agarózovém gelu v roztoku pufru s kyselinou fosforečnou, metoda elektroforézy vagarózovém gelu smethylrtutí (Maniatis, T. a kol., (1982) v “Molecular Cloning A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, NY.) nebo podobně, ale předložený vynález není na tyto metody omezen.

Jako metoda pro přenesení RNA z gelu po elektroforéze na membránu může být použita kapilární přenosová metoda (Maniatis, T. a kol., (1982) v “Molecular Cloning A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, NY.), vakuová metoda, elektroforetická metoda (Maniatis, T. a kol., (1982) v “Molecular Cloning A Laboratory Manual”, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, NY.) nebo podobné. Vybavení pro metodu tečkové hybridizace je také komerčně dostupné (například Biodot (vyrábí BioRad) nebo podobné).

Po přenosu na membránu je přenesená RNA k membráně fixována (tato operace závisí na materiálu membrány a fixační operace není pro některé produkty nezbytná).

7) Značení sondy

Dále jsou popsány metoda značení sondy pro detekování specifické mRNA ve vzorku RNA, imobilizovaném výše uvedeným způsobem, a vlastní detekční metoda při provádění detekce pomocí hybridizace nukleové kyseliny:

i) Značení pomocí radioaktivních izotopů

Značená DNA sonda je připravena za použití DNA fragmentu nebo vektoru, který tento fragment nese nebo podobně, buď jako látky nebo matrice, pomocí posunu jednořetězcového zlomu (např. pomocí soupravy pro posun jednořetězcového zlomu (vyrábí Amersham Pharmacia) nebo podobné), metodou náhodných primerů (například za použití soupravy Multi-prime DNA labelling systém (vyrábí Amersham Pharmacia) nebo podobné), pomocí metody značící konce (například pomocí soupravy Megalabel (TAKARA SHUZO CO., LTD.), pomocí soupravy značící 3'-konce (vyrábí Amersham Pharmacia), nebo podobné). Značená RNA sonda je připravena in vitro transferovou metodou pomocí promotoru SP6 nebo promotoru T7, které jsou umístěny ve vektoru do kterého je klonována DNA, která bude sondou. Sondy mohou být detekovány pomocí autoradiografie za použití rentgenového filmu nebo zobrazovací plochy, a také může •9 ·*·<

« · • · · · • · * • · · • · · • · · · · · být pomocí denzitometrie provedena kvantifikace (například je použit zobrazovací denzitometr GS-700 (vyrábí Bio-Rad)) v případě rentgenového filmu, respektive systému BAS2000II (vyrábí Fuji film) v případě zobrazovací plochy.

ii) Enzymatické značení

Fragment DNA nebo RNA je přímo označen pomocí enzymu. Příklady enzymů používaných pro značení zahrnují: alkalickou fosfatázu (je použit systém AlkPhos Direct pro chemiluminiscenci (vyrábí Amersham Pharmacia) nebo podobný) a křenovou peroxidázu (je použit ECL systém přímého značení a detekce nukleové kyseliny (vyrábí Amersham Pharmacia) nebo podobný). Detekce sondy je provedena ponořením membrány do pufrovaného enzymového reakčního roztoku obsahujícího substrát, který je schopen detekovat katalytickou reakci enzymu, který byl použit pro značení, například substrát produkující barevnou látku nebo substrát emitující světlo jako výsledek katalytické reakce. Když je použit barvící substrát, detekce může být provedena vizuálně. Když je použit emitující substrát, je detekován fotograficky pomocí okamžitých fotografických přístrojů nebo autoradiograficky pomocí rentgenového filmu nebo pomocí zobrazovací plochy podobným způsobem jako v případě značení radioaktivními izotopy. Kromě toho když je použit emitující substrát, je možno provést kvantifikaci pomocí denzitometrie nebo pomocí systému BAS2000II.

iii) Značení jinými molekulami

Fluoresceinové značení: DNA fragment je označen metodou posunu jednořetězcového zlomu, metodou náhodných primerů nebo metodou značení na 3'konci (značící systém ECL3’-oligo labeling systém dostupný od Amersham Pharmacia). RNA je značena pomocí in vitro transkripční reakce, využívající promotory SP6 a T7;

Biotinové značení: 5'-konec DNA je značen (pomocí soupravy pro značení oligonukleotidu biotinem, která je dostupná od Amersham Pharmacia), nebo je DNA fragment značen pomocí metody posunu jednořetězcového zlomu, metodou náhodných primerů nebo podobně;

Digoxigeninem modifikované dUTP značení: DNA fragment je značen pomocí metody posunu jednořetězcového zlomu, metodou náhodných primerů nebo podobně;

Detekce těchto značených molekul zahrnuje uskutečnění specifické vazby určité molekuly k molekule, která byla značena vazbou radioaktivního izotopu nebo enzymu na sondu. V případě fluoresceinu nebo digoxigeninu jsou specifickými vazebnými molekulami protilátka proti fluoresceinu nebo protilátka proti digoxigeninu. V případě • fc · ·

biotinu je to avidin nebo streptavidin. Po jejich navázání na sondu může být provedena detekce pomocí radioaktivního izotopu nebo enzymu stejnou metodou, jaká je popsána výše v bodech i) nebo ii).

8) Hybridizace

Hybridizace může být provedena metodami dobře známými v oblasti technického zázemí předloženého vynálezu. Vztah mezi složením hybridizačního roztoku nebo promývacího roztoku a hybridizační teplotou nebo promývací teplotou v předloženém vynálezu může být definován tak, jak je popsán v odkazu (baiojikken ilustrovaný 4, str. 148, Shujunsha), ale výhodné jsou následující podmínky:

Hybridizační roztok: Hybridizační roztok ExpressHyb (vyráběný Clontech);

Konečná koncentrace sondy (v případě sondy značené radioaktivním izotopem): 1 až 2 x 10⁶ cpm/ml (s výhodou 2x10® cpm/ml);

Hybridizační teplota a doba: 68 °C, 1 až 24 hodin.

Podmínky promývání membrány:

i) Třepání je prováděno v 0,1 až 5 x SSC (nejvýhodněji 2 x SSC), 0,05 až 0,1% (nejvýhodněji 0,05%) dodecylsulfátu sodném (dále je zde označován jako „SDS“), při teplotě místnosti až při teplotě 42 °C (nejvýhodněji při teplotě místnosti) po dobu 20 až 60 minut (nejvýhodněji po dobu 20 minut), dvakrát až šestkrát (nejvhodněji třikrát), s výměnou promývacího roztoku.

ii) Po operaci i) je prováděno 2x až 6x třepání v 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, při teplotě 50 až 65 °C, po dobu 20 až 60 minut, dvakrát až šestkrát, s výměnou promývacího roztoku. Jinou možností je provádět třepání v 0,2 až 0,5 x SSC, 0,1% SDS, při teplotě 62 až 65 °C, po dobu 20 až 60 minut, dvakrát až šestkrát, s výměnou promývacího roztoku. Nejvýhodněji je provádět 3x třepání v 0,1 x SSC a 0,1% SDS, při teplotě 50 °C, po dobu 20 minut, s výměnou promývacího roztoku.

Po promývání, jak bylo popsáno výše v bodu 7), jsou prováděny detekce a kvantifikace v závislosti na metodě značení sondy. Kromě je v každém vzorku současně měřeno exprimované množství toho genu, u kterého je známo že jeho exprimované množství na buňku je stabilní (například jsou komerčně dostupné sondy pro detekci genové exprese silně zásaditého proteinu s molekulovou hmotností 23 kD, α-tubulinu, glyceraldehyd 3-dehydrogenázy, hypoxanthinguaninfosforibosyltransferázy, fosfolipázy A2, ribozomálního proteinu S9 a ubichitinu nebo podobných), aby byl korigován rozptyl vyplývající z rozdílů v množství RNA mezi jednotlivými vzorky nebo «* »* podobně, a potom je porovnána relativní hodnota exprimovaného množství genu, který má být detekován, na základě exprimovaného množství tohoto stabilně exprimovaného genu, mezi těmi buněčnými populacemi, kterým byla do kultivačního média přidána testovaná látka a buněčnými populacemi, kterým do kultivačního média přidána nebyla. Tímto způsobem může být provedeno přesnější vyhodnocení.

Z výše uvedených výsledků vyplývá, že testovaná látka, která snižuje exprimované množství genu, který má nukleotidovou sekvenci uvedenou v jakémkoli zvýše uvedených bodů a) až e), může sloužit jako terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii.

9) RT-PCR reakce

Podmínky každé reakce v takovém provedení vynálezu, kde je nukleová kyselina detekována pomocí RT-PCR, budou ukázány dále. Obvykle nemusí být ze vzorku pro detekci pomocí RT-PCR purifikována póly (A)⁺RNA.

i) Reverzní transkriptázová reakce

Příklad složení reakční směsi (celkový objem 20 pl):

Celková RNA: odpovídající množství;

Chlorid hořečnatý: 2,5 až 5 mM (s výhodou 5 mM);

Roztok 1 x RNA PCR pufru (10 mM Tris-kyselina chlorovodíková (pH 8,3 až 9,0 (s výhodou 8,3)), 50 mM chlorid draselný);

dNTP: 0,5 až 1 mM (s výhodou 1 mM);

Protismyslný primer: 1 μΜ (také může být jako náhrada za protismyslný primer přidáno 2,5 μΜ komerčního náhodného primeru nebo oligo (dT) primeru (15 až 20 nukleotidů));

Reverzní transkriptáza: 0,25 až 1 jednotka/μΙ (s výhodou 0,25 jednotky/μΙ); doplněno do 20 μΙ sterilní vodou.

Tepelné podmínky reakce:

po udržování při teplotě 30 °C po dobu 10 minut (pouze při použití náhodných primeru), drženo při teplotě 42 až 60 °C (s výhodou 42 °C) po dobu 15 až 30 minut (s výhodou po dobu 30 minut) a poté zahřát na teplotu 99 °C po dobu 5 minut, aby došlo k inaktivaci enzymu, poté ochlazeno na teplotu 4 až 5 °C (s výhodou 5 °C) po dobu 5 minut.

ii) PCR

Příklad složení reakční směsi:

• to· ·

Chlorid hořečnatý: 2 až 2,5 mM (s výhodou 2,5 mM);

Roztok 1 x PCR pufru (10 mM Tris-kyselina chlorovodíková (pH 8,3 až 9,0 při teplotě 25 °C (s výhodou 8,3)), 50 mM chlorid draselný);

dNTP: 0,2 až 0,25 mM (s výhodou 0,25 mM);

Protismyslný primer a pozitivní primer: 0,2 až 0,5 μΜ (s výhodou 0,2 μΜ);

Taq polymeráza: 1 až 2,5 jednotky (s výhodou 2,5 jednotky);

Celkový objem je doplněn do 80 pl sterilní vodou a celý objem je přidán k celému objemu reakční směsi, ve které byla ukončena reakce reverzní transkripce, a je započata PCR.

Tepelné podmínky reakce: napřed zahřívání na teplotu 94 °C po dobu 2 minut, zahřívání na teplotu 90 až 95 °C (s výhodou 94 °C) po dobu 30 sekund a potom 28 až 50 cyklů (s výhodou 28 cyklů) teplotního cyklu obsahujícího zahřívání na teplotu 40 až 60 °C (s výhodou na teplotu v oblasti od disociační teploty (Tm) vypočtené z charakteristik primeru do teploty o 20 °C nižší) po dobu 30 sekund a udržování při teplotě 70 až 75 °C (s výhodou 72 °C) po dobu 1,5 minuty, a poté ochlazení na 4 °C.

Po PCR je u reakční směsí provedena elektroforéza a je zjišťováno, zda je amplifikována zóna zamýšlené velikosti. Aby byla provedena kvantitativní detekce, PCR je provedena za stejných podmínek při použití klonu cDNA, předem stupňovitě naředěného, jako standardní matrice DNA, a předem je definován počet teplotních cyklů, který umožňuje kvantitativní detekci, nebo je každých 5 cyklů odebrána část reakční směsi a s tímto vzorkem je provedena elektroforéza. Dále například když je v PCR reakci použit radioaktivním izotopem značený dCTP, kvantifikace je možná měřením radioaktivity inkorporované do zóny.

Výsledky detekce jsou porovnány mezi vzorkem pocházejícím z buněk kultivovaných v přítomnosti testované látky a vzorkem pocházejícím z buněk kultivovaných v nepřítomnosti testované látky. Testovaná látka, v jejíž přítomnosti je redukováno exprimované množství genu, který obsahuje nukleotidovou sekvenci, uvedenou v jakémkoli zvýše uvedených bodů a) až e), pak může sloužit jako terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii.

10) Jiné metody

Jiné metody pro měření exprimovaného množství genu, který obsahuje nukleotidovou sekvenci, uvedenou v jakémkoli zvýše uvedených bodů a) až e), jsou zmíněny dále.

• <«··

i) Test ochrany proti ribonukleáze (RNáze):

Když značená sonda hybridizuje pouze s mRNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, uvedenou v jakémkoli z výše uvedených bodů a) až e) (avšak t v sekvenci je čteno jako u), a vytváří dvouřetězcový polynukleotid, a poté je ke vzorku přidána ribonukleáza a vzorek inkubován, mRNA kníž je hybridizována sonda nebude ribonukleázou rozštěpena, protože je vytvořena dvojitá šroubovice a štěpena bude ostatní RNA. Takto zůstává pouze dvouřetězcový polynukleotid (pokud je sonda kratší než mRNA, která má být detekována, zůstane dvouřetězcový polynukleotid odpovídající svojí délkou řetězci sondy). Exprimované množství cílového genu je měřeno tak, že je kvantifikován dvouřetězcový polynukleotid. Specificky je to provedeno podle metody popsané níže.

Je výhodné ribonukleázou štěpit nadbytek značené sondy, aby byla od dvouřetězcového polynukleotidu s jistotou oddělena značená sonda, která zbyla aniž vytvořila dvojšroubovici, a tím byla usnadněna kvantifikace. Avšak pokud je použita ribonukleáza, která může také štěpit jednořetězcovou DNA, jako značená sonda může být použita buď DNA nebo RNA. Metoda přípravy značené sondy je podobná metodě popsané výše v bodech 1) až 7). Délka sondy použité v této metodě je s výhodou 50 až 500 nukleotidů. Kromě toho sonda, ve které existují vzájemně komplementární řetězce, jako je sonda vytvořená přímým značením dvojřetězcové DNA a poté tepelnou denaturací, není pro metodu vhodná.

RNA sonda je například připravena následujícím postupem. Matrice DNA je prvně vložena do plazmidového vektoru (například pGEM-T (Promega) nebo podobného), který obsahuje bakteriofágové promotory (T7, SP6, T3 promotor nebo podobné). Potom je rekombinantní plazmidový vektor štěpen restrikčním enzymem v místě právě ve směru přepisu za inzertem tak, že pouze část může být rozštěpena. Je provedena in vitro transkripční reakce za použití takto získaného přímého řetězce DNA jako matrice, v přítomnosti ribonukleotidu značeného radioaktivním izotopem. Enzymy jako T7, SP6, T3 polymeráza nebo podobné jsou použity pro tuto reakci v závislosti na druhu promotoru ve vektoru. Operace popsaná výše může být provedena například pomocí souprav Riboprobe system-T7, Riboprobe system-SP6 nebo Riboprobe system-T3 (všechny jsou vyráběny firmou Promega).

Kroky do přípravy RNA vzorku jsou stejné jako výše v bodech 3) až 5). Test ochrany proti ribonukleáze je proveden za použití množství ekvivalentního k vzorkům • · ·· ··*· ·· ·· » ·« · • · *· *

• ·€· až 20 pg izolované celkové RNA a nadbytečného množství odpovídajícího 5 x 10⁵cpm značené sondy. Tato operace může být provedena pomocí komerční soupravy (HybSpeed RPA Kit, vyrábí Anbion). Poté co je výsledný vzorek štěpený ribonukleázou podroben elektroforéze na 4 až 12% polyakrylamidovém gelu, který obsahuje 8 M močovinu, gel je vysušen a je provedena autoradiografie na rentgenovém filmu. Při výše uvedené operaci může být detekována zóna dvouřetězcového polynukleotidu, který není rozštěpen ribonukleázou, a kvantifikována metodou popsanou výše v bodu i) v 7). Kromě toho, pokud je současně měřeno exprimované množství β-aktinového genu, aby byl korigován rozptyl vyplývající z rozdílů v množství RNA mezi jednotlivými vzorky a podobně, může být provedeno přesnější zhodnocení, jako v případě analýzy northernového přenosu.

Tedy jsou porovnány výsledky detekce mezi vzorkem pocházejícím z buněk kultivovaných v přítomnosti testované látky a vzorkem pocházejícím z buněk kultivovaných v nepřítomnosti testované látky, a testovaná látka, v jejíž přítomnosti je redukováno exprimované množství genu, který obsahuje nukleotidovou sekvenci, uvedenou v jakémkoli z výše uvedených bodů a) až e), může sloužit jako terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii.

ii) Test typu „run-on“ (viz Run-on assay, Greenberg, Μ. E. a Ziff, E. B. (1984) Nátuře 311, 433-438 a Groudine, M. a kol., (1981) Mol. Cell Biol. 1,281-288):

Tato metoda je metodou izolace jádra z buňky a měření transkripční aktivity cílového genu. Ačkoli to není metoda detekce mRNA v buňce, která je popsána výše, je v předloženém vynálezu zahrnuta jako „metoda detekce rozsahu exprese genu“. Pokud je provedena transkripční reakce ve zkumavce za použití izolovaného buněčného jádra, prodlužování řetězce bude pokračovat pouze tam, kde transkripce započala již před izolací jádra a vytvořila mRNA. Transkripční aktivita cílového genu v době izolace může být měřena přidáním ribonukleotidu značeného radioaktivním izotopem během reakce, aby došlo k označení prodlužující se mRNA, a poté detekcí mRNA hybridizující s neznačenou sondou obsaženou v reakční směsi. Aby byla zjištěna doba kdy se účinek testované látky projevuje nejvýrazněji, může být měněna doba od přidání testované látky k buněčné kultuře do izolace jádra. Jádro je například izolováno 30 minut, 1 hodinu, 2 hodiny, 4 hodiny, 8 hodin a 24 hodin po přidání testované látky je a je s ním proveden test. Tato specifická operační metoda je přibližně stejná jako ta, která je popsána ve výše uvedeném odkazu, z tou výjimkou, že neznačená sonda je • ·

• · · • · · · připravena podobným způsobem, jak je popsáno výše v bodu 1). Tedy jsou porovnány výsledky detekce mezi vzorkem pocházejícím z buněk kultivovaných v přítomnosti testované látky a vzorkem pocházejícím z buněk kultivovaných v nepřítomnosti testované látky, a testovaná látka, která redukuje transkripční aktivitu genu, který obsahuje nukleotidovou sekvenci, uvedenou v jakémkoli z výše uvedených bodů a) až e), může sloužit jako terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii.

iii) Analýza DNA na čipech, analýza DNA na mikroarrays [1] Příprava vzorku pro získání sondy

Zaprvé jsou extrahovány a purifikovány mRNA ze vzorku pocházejícího z buněk, kultivovaných v přítomnosti testované látky, a ze vzorku pocházejícího z buněk, kultivovaných v nepřítomnosti testované látky. Postup až do přípravy RNA vzorku je stejný, jak byl popsán výše v bodech 3) až 5).

[2] Značení sondy

Třebaže je možno jako výchozí materiál pro přípravu sondy pro čipovou DNA analýzu nebo analýzu DNA na mikroarrays také použít celkovou RNA, která není purifikována, je výhodnější použít poly(A)⁺ RNA purifikovanou pomocí metody popsané výše v bodu 5).

Způsob značení sondy a detekční metoda pro stanovení pomocí hybridizace nukleové kyseliny bude vysvětlena níže.

Sonda pro analýzu pomocí DNA čipu vyrobeného firmou Affimetrix: cRNA sonda značená biotinem je použita podle protokolu, který je dodáván s DNA čipem vyrobeným firmou Affimetrix.

Sonda pro analýzu pomocí DNA microarray: cDNA je fluorescenčně značena přidáním d-UTP značeného fluorochromem (například Cy3, Cy5 nebo podobně) nebo podobně, kdy je cDNA připravena z poly(A)⁺ RNA pomocí reverzní transkripční reakce. Pokud jsou vzorek pocházející z buněk kultivovaných v přítomnosti testované látky a vzorek pocházející z buněk kultivovaných v nepřítomnosti testované látky značeny rozdílnými barvivý, potom mohou být smíchány a použity v následujícím procesu hybridizace.

Sonda pro analýzu za použití membránového filtru:

Když je cDNA připravována z poly(A)⁺ RNA pomocí reakce reverzní transkripce, sonda je značena přidáním d-CTP značeného radioaktivním izotopem (například ³²P, ³³P) nebo podobným.

[3] Imobilizovaný vzorek

Imobilizované vzorky pro umožnění hybridizace se značenou sondou získanou výše uvedeným postupem [2] jsou připraveny následujícím způsobem.

Genový čip, na kterém je imobilizován protismyslný oligonukleotid (vyrobeno v Affimetrix) syntetizovaný na základě EST sekvence (místo s adresou expresní) nebo mRNA sekvence z databáze (Lipshutz, R. J. a kol., (1999) Nátuře genet. 21, dodatek, 20-24).

Výše uvedené EST sekvence nebo mRNA sekvence jsou nejvýhodnější takové, které pocházejí z téhož živočicha, který je použit pro přípravu sondy, nejsou však na ně omezeny. Například mohou být také použity ty sekvence, které pocházejí z živočicha, který je mu blízce příbuzný. Avšak měl by být imobilizován gen, který obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou výše v jakémkoli bodu a) až e), gen který je v současné době uveden v databázi Genbank jako nukleotidová sekvence kódující “protein 3 příbuzný angiopoietinu” nebo sekvence obsahující částečnou sekvenci jakéhokoli z nich.

DNA mikroarray nebo membránový filtr, na němž je imobilizována cDNA nebo produkt RT-PCR, vytvořené v mRNA získané z buněk izolovaných z vnitřních orgánů (s výhodou jater) živočicha, který je shodný nebo blízce příbuzný živočichovi, použitému pro přípravu sondy:

cDNA nebo produkt RT-PCR jsou klonovány tak, že byla provedena reverzní transkriptázové reakce nebo PCR za použití primerů vytvořených na základě sekvenční informace z EST databáze živočicha, který je použit jako materiál pro získání mRNA. Jako materiál pro přípravu vzorku mohou být použity buňky (s výhodou jaterního původu) exprimující gen, který obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou výše v jakémkoli bodu a) až e), nebo gen, který je v současné době uveden v databázi Genbank jako nukleotidová sekvence kódující “protein 3 příbuzný angiopoietinu”. Mezi cDNA nebo RT-PCR produkty patří ty, které byly připraveny po předchozí selekci těch mRNA, které jsou exprimovány v rozdílných množstvích, pomocí subtrakční metody (Diatchenko, L. a kol., (1996) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 93, 6025-6030), pomocí metody „differential displaying“ (Kato, K. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 3685-3690) nebo podobných. Dále mohou být jako DNA mikroarray či filtr použit komerčně dostupný výrobek, který obsahuje gen, jež má být detekován, totiž gen uvedený v databázi Genbank jako nukleotidová sekvence kódující “protein 3 příbuzný

angiopoietinu”. Jinak může být DNA mikroarray nebo filtr, na němž je imobilizován gen obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou výše v jakémkoli bodu a) až e), také vytvořen pomocí nanášecího zařízení (například TAKARA SHUZO CO., LTD., GMS417 arrayer nebo podobný).

Sondy připravené v bodu [2] jsou ponechány hybridizovat s tímto imobilizovaným vzorkem odděleně za stejných podmínek, nebo současně jako směs (Brown, P.O. a kol., (1999) Nátuře genet. 21, dodatek, 33-37).

[4] Analýza

V případě analýzy pomocí DNA čipu vyrobeného v Affimetrix:

Hybridizace a analýza jsou provedeny podle protokolu připojeného k DNA čipu vyrobenému v Affimetrix.

V případě analýzy pomocí DNA mikroarray:

Například v případě že je použit komerční DNA mikroarray od TAKARA SHUZO CO., LTD., jsou hybridizace a promývání provedeny podle protokolu společnosti a fluorescenční signál je detekován pomocí zařízení pro detekci fluorescence (například GMS418 array skener (TAKARA SHUZO CO., LTD.) nebo podobný) a poté následuje analýza.

V případě analýzy za použití filtru:

Hybridizace může být provedena metodami dobře známými v oblasti technického zázemí předloženého vynálezu. Například jsou provedeny hybridizace a promývání, poté následuje analýza pomocí analyzujícího zařízení (například Atlasimage (vyrábí Clontech)).

Ve všech výše popsaných příkladech, sonda ve vzorku, který pochází z buněk kultivovaných v přítomnosti testované látky a sonda ve vzorku, který pochází z buněk kultivovaných v nepřítomnosti testované látky, jsou ponechány hybridizovat s imobilizovaným vzorkem ze stejné série. Kromě toho, že je použita jiná sonda, musejí zůstat podmínky hybridizace stejné. Jak je ukázáno výše v bodu [2], když je každá ze sond značena odlišným fluorochromem, pak může být k jednomu imobilizovanému vzorku hybridizována směs obou sond (Brown, P. O. a kol., (1999) Nátuře genet. 21, dodatek, 33-37).

Výsledkem analýzy je změření množství sond, které hybridizuje s cílovým genem na i mobilizovaném vzorku, tj. genu obsahujícímu nukleotidovou sekvenci uvedenou výše v jakémkoli z bodů a) až e), nebo genu obsahujícímu nukleotidovou sekvenci • ·

kódující “protein 3 příbuzný angiopoietinu” mezi sondou ve vzorku pocházejícím z buněk kultivovaných v přítomnosti testované látky a sondou ve vzorku pocházejícím z buněk kultivovaných v nepřítomnosti testované látky. Závěrem je, pokud jde o množství sond hybridizujících k cílovému genu, že když množství sondy ve vzorku pocházejícím z buněk kultivovaných v přítomnosti testované látky je menší než množství sondy ve vzorku pocházejícím z buněk kultivovaných v nepřítomnosti testované látky, pak látka potlačuje expresi genu obsahujícího nukleotidovou sekvenci uvedenou výše v jakémkoli z bodů a) až e), a tedy může být terapeutickým nebo preventivním činidlem.

iv) Další

Následující metody mohou být uvedeny jako metody detekování testované látky, která snižuje úroveň exprese genu obsahujícího nukleotidovou sekvenci uvedenou výše v jakémkoli z bodů a) až e), ve srovnání s úrovní exprese genu ve vzorku pocházejícím z buněk kultivovaných v nepřítomnosti testované látky.

Zde totiž může být použita technika známá jako „Taqman“, kde PCR a hybridizace se sondami (dále zde označováno jako „sondáž“) jsou spojeny do jedné reakce (Holland, P. M. a kol., (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 7276-7280) nebo technika, kde PCR a sondáž jsou spojeny do jedné reakce (Higuchi a kol., Biotechnology, 10, 413-417 (1992)). V druhé metodě je do PCR reakční směsi přidán ethidiumbromid, který je detekčním činidlem pro nukleovou kyselinu, které emituje fluorescenci, když je excitován paprsky UV. Protože se fluorescence ethidiumbromidu zvyšuje v přítomnosti dvojřetězcové DNA, detekované zvýšení hodnoty fluorescence, když je ozařováno excitačním světlem, může být korelováno s hromaděním dvojřetězcového produktu.

Kromě toho jako další metodu, kde amplifikace pomocí PCR reakce a sondáž jsou spojeny, je možno použít metodu popsanou v publikaci evropské patentové přihlášky č. 0 601 889. Kromě toho je také možno kvantifikovat množství mRNA pomocí systému Light cycler (vyrábí Roche diagnostics, viz zveřejněná publikace japonské patentové přihlášky (KOKAI) No. 2000-312600).

B) Detekce polypeptidů

Jako jiné provedení metody předloženého vynálezu existuje metoda detekce polypeptidů kódovaného genem, který má být ve výše zmíněném provedení detekce genové exprese detekován. V tomto provedení je polypeptid ve vzorku imobilizován na • · dně jamky v96jamkové destičce, membráně nebo podobně, a poté je provedena detekce za použití protilátky, která specificky rozpoznává cílový polypeptid. Mezi těmito metodami je metoda používající 96jamkovou destičku obecně nazývána imunologický enzymový test na pevném podkladu (metoda ELISA) nebo metoda nazývaná radioizotopový imunologický test (metoda Ria). Jako metoda pro imobilizaci na membráně jsou zmiňovány metoda přenášení polypeptidů na membránu po polyakrylamidové gelové elektroforéze vzorku (westernový přenos) nebo tzv. metoda tečkové hybridizace, kde jsou vzorek nebo jeho ředidlo přímo vsakovány do membrány. 1) Příprava vzorku

Podmínky pro druh kultivovaných buněk, použitých ve výše uvedeném provedení pro detekci polypeptidů jsou stejné jako podmínky v případě výše uvedeného provedení předloženého vynálezu pro detekci genové exprese. Kromě toho zde může být použita metoda, kde je testovaná látka podána savci a sérum z tohoto živočicha získané, je použito jako vzorek. Výhodným savcem v tomto případě je člověk, myš, krysa nebo křeček, a ještě výhodnější je člověk nebo myš. Například ačkoli v případě používání myší je s výhodou používána myš KK, která je hyperlipidemická myš, předložený vynález není na ni omezen. Stejně jako podmínky pro kultivování buněk, i způsoby podávání testované látky jsou také stejné jako v případě provádění detekce genové exprese. Testovanou látkou, jejíž aktivita ve smyslu terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemii má být testována, může být sloučenina, mikrobiální metabolit, extrakt z rostlinné nebo živočišné tkáně, jejich deriváty nebo jejich směsi.

Jako materiál pro přípravu vzorku pro toto provedení může být použit supernatant nebo cytoplazmatická frakce buněk kultivovaných v přítomnosti nebo v nepřítomnosti testované látky; výhodné je použít supernatant buněčné kultury. Supernatant buněčné kultury je odebrán po ukončení kultivace, je podroben sterilizaci pomocí filtrování a potom je použit pro přípravu vzorku pro ELISA/RIA nebo westernový přenos.

Jako vzorek pro ELISA/RIA může být použit například odebraný supernatant buněčné kultury jako takový, nebo vhodně naředěný roztokem pufru.

Způsob přípravy vzorku pro westernový přenos (pro elektroforézu) je následující. Zaprvé je protein vysrážen například tak, že na supernatant buněčné kultury je působeno kyselinou trichloroctovou a sraženina je získána oddělením pomocí centrifugace. Sraženina je promyta acetonem vychlazeným v ledu, vysušena na vzduchu a pro SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforézu (vyrábí Bio-Rad a podobně) je rozpuštěna v roztoku vzorkového pufru, obsahujícího 2-merkaptoethanol.

V případě metody tečkové hybridizace je odebraný supernatant buněčné kultury samotný nebo vhodně naředěný roztokem pufru, přímo absorbován na membránu, například za použití zařízení pro přenos na membránu.

2) Imobilizace vzorku

Vzorek získaný jak bylo uvedeno výše je imobilizován proto, aby v něm byl specificky detekován polypeptid. Jako membrána použitá pro westernový přenos a metodu tečkové hybridizace mohou být použity nitrocelulózové membrány (například vyráběné Bio-Rad nebo podobné), nylonové membrány (například High bond-ECL (Amersham Pharmacia) nebo podobné), bavlněné membrány (například Blot absorbent filter (vyráběné Bio-Rad) nebo podobné), nebo polyvinyldifluoridové (PVDF) membrány (například vyráběné Bio-Rad nebo podobné).

Jako tak zvaná metoda přenosu na membránu, která je metodou přenosu polypeptidu z gelu na membránu po proběhlé elektroforéze, může být použita metoda vlhkého přenosu na membránu (Current Protocols in Immunology, svazek 2, vyd. J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, a W. Strober), metoda polosuchého přenosu na membránu (viz výše uvedené Current Protocols in Immunology, svazek 2) a podobné. Vybavení pro metodu tečkové hybridizace je také komerčně dostupné (například souprava Biotechnology dot (vyráběná Bio-Rad) nebo podobné).

Aby byla provedena detekce a kvantifikace pomocí metody ELISA/metody RIA, jsou vzorek nebo jeho ředidlo (například zředěný fyziologickým roztokem pufrovaným kyselinou fosforečnou (dále zde označován jako „PBS“), který obsahuje 0,05 % azidu sodného) naneseny do 96jamkové destičky (například typu Immunoplate maxi soap (vyráběné NUNC) nebo podobné), a ponechán stát přes noc při teplotě od 4 °C do teploty místnosti nebo při teplotě 37 °C po dobu 1 až 3 hodin, aby došlo k imobilizaci polypeptidu na dně jamky.

3) Protilátka

Protilátka použitá v tomto provedení je taková, která specificky rozpoznává polypeptid produkovaný tehdy, když je v živočišné buňce exprimován gen obsahující nukleotidovou sekvenci popsanou výše v jakémkoli z bodů a) až e), s výhodou polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou u aminokyselin číslo 17 až

...........

455 (s výhodou 19 až 455) v SEQ ID No. 2 v seznamu sekvencí nebo jejich část, nebo polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou u aminokyselin číslo 17 až 460 v SEQ ID No. 4 nebo její část. Tyto protilátky jsou s výhodou například protilátky, které se vážou k jakémukoli peptidu, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou u aminokyselin číslo 17 až 455 (s výhodou 19 až 455) v SEQ ID No. 2 v seznamu sekvencí a k polypeptidů, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou u aminokyselin číslo 17 až 460 v SEQ ID No. 4, ale který se neváže k jakémukoli jinému proteinu, který pochází z myši nebo člověka.

Protilátka pro toto provedení může být získána imunizováním živočicha pomocí proteinu, který má být antigenem nebo jakýmkoli polypeptidem, který obsahuje sekvenci vybranou z aminokyselinové sekvence pomocí běžného postupu (například Shin-seikagaku jikkenkouza 1, protein 1, str. 389-397, 1992) a potom je protilátka vytvořená v těle extrahována a čištěna. Kromě toho může být také získána monoklonální protilátka tím, že je pomocí buněčné fúze buněk produkujících protilátky a myelomových buněk podle známého postupu připraven hybridom (například Kohler a Milstein, Nátuře 256, 495-497, 1975, Kennet, R. vyd., Monoclonal Antibody str. 365367, 1980, Prenum Press, N.Y.), který produkuje protilátku proti proteinu, který je předmětem tohoto vynálezu.

Antigen pro přípravy protilátky, použité v tomto provedení, může být polypeptid, který obsahuje aminokyseliny číslo 17 až 455 (s výhodou 19 až 455) v SEQ ID No. 2 v seznamu sekvencí nebo polypeptid, který obsahuje částečnou sekvenci alespoň šesti jeho po sobě následujících aminokyselin, polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou u aminokyselin číslo 17 až 460 v SEQ ID No. 4, nebo polypeptid, který obsahuje částečnou sekvenci alespoň šesti jeho po sobě následujících aminokyselin nebo derivát, kde jsou k němu přidány libovolné aminokyselinové sekvence nebo nosiče. S výhodou je to ten, který byl získán fúzí hemokyaninu plže „keyhole limpet“ jako nosiče k C-konci polypeptidů, který obsahuje aminokyseliny číslo 1 až 14 SEQ ID No. 9 v seznamu sekvencí nebo k N-konci polypeptidů, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou u aminokyselin číslo 1 až 14 SEQ ID No. 10.

Polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou u aminokyselin číslo 17 až 455 (s výhodou 19 až 455) v SEQ ID No. 2 v seznamu sekvencí nebo polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou u aminokyselin číslo 17 až 460 v SEQ ID No. 4, může být získán tak, že se pomocí genové manipulace • · « · hostitelská buňka přiměje produkovat polypeptid kódovaný nukleotidovou sekvencí uvedenou u nukleotidů číslo 47 až 1411 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí nebo nukleotidovou sekvencí uvedenou u nukleotidů číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí. Hostitelská buňka jiných prokaryot nebo eukaryot může být specificky transformována vložením DNA, která obsahuje výše uvedené nukleotidové sekvence, do vhodného DNA vektoru. Gen je možné exprimovat v každém hostiteli tím, že je do těchto vektorů vložen vhodný promotor a sekvence indukující expresi genu.

Příklady prokaryotických buněk vhodných pro použití jako hostitelé, zahrnují Escherichia coli, Bacillus subtilis nebo podobné. Aby byly tyto hostitelské buňky transformovány cílovým genem, je hostitelská buňka transformována plazmidovým vektorem, který obsahuje replikon, tedy replikační počátek, pocházející z druhů, které jsou slučitelné s hostitelem a regulační sekvenci. Jako vektor je výhodný takový vektor, který obsahuje sekvenci, která dodává transformované buňce selektivní fenotyp.

Například jako Escherichia coli je obyčejně používán kmen K12 a jako vektor jsou všeobecně používány plazmidy pBR322 a systém pUC, ale předložený vynález na ně není omezen, ale mohou být také použity jiné známé kmeny a vektory. Jako promotor v Escherichia coli může být použit tryptofanový (trp) promotor, laktózový (lac) promotor, promotor systému tryptofan-laktóza (tac), lipoproteinový (Ipp) promotor, promotor faktoru pro napětí polypeptidového řetězce Tu (tufB) nebo podobné. Jakýkoli z těchto promotorů může být použit pro produkování cílového polypeptidu.

V případě Bacillus subtilis je například výhodné použít jako vektor kmen 207-25 a pTUB228 (Ohmura, K. a kol., (1984) J. Biochem. 95, 87-93) nebo podobné, ale předložený vynález na ně není omezen. Exprese se sekrecí z buňky je možno dosáhnout připojením DNA sekvence kódující sekvenci signálního peptidu a-amylázy Bacillus subtilis.

Příklady eukaryotických hostitelských buněk zahrnují: buňky obratlovců, hmyzu a kvasinek nebo podobné. Mezi příklady buněk obratlovců patří: buňky COS (Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182, ATCC CRL-1650), které jsou opičího původu, kmen buněk pocházející zvaječníku čínského křečka (CHO buňky, ATCC CCL-61), které jsou deficientní na reduktázu kyseliny dihydrofolové, nebo podobné, ale předložený vynález na ně není omezen (Urlaub, G. a Chasin, L.A. (1980) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220).

Jako expresní promotory pro buňky obratlovců mohou být použity takové, které mají promotor proti směru přepisu genu, který má být exprimován, místo pro sestřih RNA, polyadenylační místo, a kromě toho, pokud je to žádoucí, i počátek replikace. Mezi příklady expresních vektorů patří pSV2dhfr (Subramani, S. a kol., (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864) nebo podobné, ale předložený vynález na ně není omezen.

Když jsou jako hostitelské buňky použity buňky COS, vhodné expresní vektory obsahují počátek replikace SV40 v buňkách COS, který umožňuje autonomní replikaci, promotor transkripcde, signál pro ukončení transkripce a místo pro sestřih RNA. Expresní vektory mohou být použity pro transformaci buněk COS pomocí známého postupu, jako je metoda používající diethylaminoethyl (DEAE)-dextran [srv. Luthman. H, a Magnusson. G. (1983), Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308], metoda koprecipitace fosforečnanu vápenatého s DNA [Graham, F. L. a Van der Eb, A. J., (1973), Virology, 52, 456-457] a elektroporační metoda s elektrickými pulsy [cf. Neumann, E., et. al., (1982), EMBO J, 1, 841-845] nebo podobné. V případě, že jako hostitel je použita buňka CHO, transformované buňky stabilně produkující protein, který je předmětem tohoto vynálezu, mohou být získány společnou transfekcí expresním vektorem a vektorem, který může exprimovat gen neo, fungující jako faktor rezistence proti antibiotiku G418, například pRSVneo (Sambrook, J. a kol., (1989): “Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY), pSV2-neo (Southern, P. J. a Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341) nebo podobné, a poté selekcí kolonií, rezistentních ke G418.

V případě, že jsou jako hostitelské buňky použity buňky hmyzí, často používanými jsou kmen buněk linie (Sf-9 nebo Sf-21), pocházející z buněk vaječníku Spodoptera frugiperda z motýlů čeledi Phalaenidae, buňky High Five, pocházející z„ootid“ Trichoplusiani (Wickham, T. J. a kol., (1992) Biotechnol. Prog. I: 391-396 nebo podobné). Vektor pVL1392/1393, používající promotor polyhedrinového genu z polyhedronového viru (AcNPV), je často používán jako bakulovirový vektor (Kidd, I. M. a V. C. Emery (1993) Použití bakulovirů jako expresních vektorů, Applied Biochemistry and Biotechnology 42,137-159). Kromě toho může být také použit vektor, který používá promotor bakulovirového P10 nebo zásaditého proteinu. Mimoto je možné exprimovat rekombinantní protein jako sekretovaný protein tím, že je fúzována sekvence sekrečního signálu obalového povrchového proteinu GP67 z AcNPV s Nkoncem cílového proteinu (Zhe-mei Wang, et al. (1998) Biol. Chem., 379, 167-174).

• · • «

Jako expresní systém, používající jako hostitelskou buňku mikroskopický eukaryotický mikroorganismus, jsou obecně známé kvasinky, a z nich výhodné jsou například pekařské kvasinky Saccharomyces cerevisiae a ropné kvasinky Pichia pastoris. Jako expresní vektor pro eukaryotické mikroorganismy, jako jsou kvasinky, mohou být s výhodou použity promotor genu pro alkoholdehydrogenázu (Bennetzen, J. L. a Halí, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025), promotor genu pro kyselou fosfatázu (Miyanohara, A. a kol., (1983) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 1-5) nebo podobné. Aby byl exprimován jako sekretovaný protein, je možno jej také exprimovat jako rekombinantní protein, který má na svém N-konci sekvenci sekrečního signálu a štěpné místo pro zralou endogenní proteázu, která je obsažena v hostitelské buňce nebo pro jinou známou proteázu. Například je známo, že aktivní forma tryptázy bude vylučována do média poté, co bude fúzována sekvence sekrečního signálu alfa faktoru kvasinky se štěpným místem proteázy KEX2 ropné kvasinky na N-konci a potom budou exprimovány v systému, kde je tryptáza lidské žímé buňky, což je serinová proteáza trypsinového typu, exprimována v ropné kvasince (Andrew, L. Niles, a kol., (1998) Biotechnol. Appl. Biochem. 28,125-131).

Transformanty získané pomocí výše uvedenými postupy mohou být kultivovány běžnými metodami, a tak může být protein předloženého vynálezu produkován buď uvnitř buňky nebo vně buňky. Vhodná kultivační média zahrnují různá běžně používaná média, v závislosti na vybraném hostiteli. Například pro buňky COS může být použito médium RPMI-1640 a Eaglovo médium modifikované podle Dulbecca (dále zde označované jako DMEM), které může být doplněno, pokud je to žádoucí, složkami séra, jako je fetální hovězí sérum.

Rekombinantní protein exprimovaný transformovanou buňkou, jak bylo výše popsáno, buď uvnitř buňky nebo vně buňky, může být izolován a čištěn různými dobře známými separačními postupy, v závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech proteinu. Vhodné specifické separační postupy zahrnují: působení běžně používanými precipitačními činidly pro protein; různé chromatografické postupy, jako je ultrafiltrace, chromatografíe na molekulárních sítech (gelová filtrace), adsorbční chromatografíe, iontovýměnná chromatografíe, afinitní chromatografíe a vysokovýkonná kapalinová chromatografíe (HPLC), dialýza a jejich kombinace. Kromě toho může být účinně purifikováno na niklovém afinitním sloupci tím způsobem, že je k exprimovanému rekombinantnímu proteinu fúzováno šest histidinů. Polypeptid, který je předmětem

9 · · · ·

v ♦

.. · · tohoto vynálezu, může být kombinováním výše uvedených postupů snadno připraven ve velkých množstvích, ve vysokém výtěžku a ve vysoké čistotě.

Protilátka získaná výše uvedenými postupy může být použita pro různé imunologické testy, jako je metoda RIA, metoda ELISA, technika fluorescenčních protilátek a metoda pasivní hemaglutinace, imunitní barvení tkání nebo podobné.

4) Detekce

Protilátka získaná postupem popsaným výše v bodu 3) je přímo označena nebo použita pro detekci jakožto primární protilátka ve spolupráci se značenou sekundární protilátkou, která specificky tuto protilátku rozpoznává (rozpoznává protilátku živočicha použitého pro produkci protilátky).

Třebaže látka výhodná pro značení je enzym (alkalická fosfatáza nebo křenová peroxidáza) nebo biotin (avšak pak je dále přidána operace vazby enzymem označeného streptavidinu k biotinu, jako sekundární protilátce), předložený vynález na něj není omezen. Komerčně jsou dostupné předem označené protilátky (nebo streptavidin) pro postup, který používající značenou sekundární protilátku (nebo streptavidin). V případě RIA je měření provedeno v měřícím zařízení v tekutém scintilačním roztoku nebo podobně, za pomoci protilátek označených radioaktivním izotopem jako je I¹²⁵ nebo podobným.

Množství polypeptidu, který je antigenem, je měřeno detekováním aktivity těchto enzymů použitých pro označení. Pokud jde o alkalickou fosfatázu nebo křenovou peroxidázu, substráty které se zabarvují nebo emitují světlo v závislosti na katalytickém působení těchto enzymů, jsou komerčně dostupné.

Když je použit barevný substrát, ten může být v technice westernového přenosu nebo metodě tečkové hybridizace detekován vizuálně. V metodě ELISA je kvantifikace převážně prováděna pomocí měření extinkčního koeficientu (vlnová délka světla použitého pro měření závisí na druhu substrátu) v každé jamce za pomoci komerčního čtecího zařízení na mikrodestičky. Kromě toho je možné kvantifikovat koncentraci antigenu v jiných vzorcích tak, že se připraví ředící série antigenu,s výhodou použitého výše v bodu 3) pro produkci protilátek, a ta je použita jako standardní vzorek antigenu, detekována společně s ostatními vzorky a současně tak vytváří standardní křivku, kde jsou vyneseny koncentrace standardního antigenu a naměřená hodnota.

Naproti tomu když je použit substrát, který emituje světlo, detekce může být u techniky westernového přenosu nebo u tečkové hybridizace provedena . » · · · ·

autoradiografií na rentgenový film či zobrazovací plochu nebo fotograficky pomocí okamžitého fotografického přístroje, a kvantifikace je pak provedena pomocí denzitometrie nebo pomocí systému BAS2000II. Kromě toho, když je v metodě ELISA použit substrát emitující světlo, enzymová aktivita je měřena pomocí čtecích zařízení pro mikrodestičky (například vyráběných Bio-Rad či podobných).

5) Měřící operace

i) V případě westernového přenosu nebo kapkové hybridizace

Zaprvé, aby bylo zabráněno nespecifické adsorbci protilátky, je membrána předem ponořena na určitou dobu (blokování) do roztoku pufru obsahujícího látku, která takovou nespecifickou adsorbci inhibuje (odstředěné mléko, hovězí sérumalbumin, želatina, polyvinylpyrrolidon nebo podobně). Jako blokující roztok je použit například fosforečnanem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) nebo fyziologický roztok pufrovaný Tris (TBS), obsahující 5 % odstředěného mléka a 0,05 až 0,1 % Tween 20. Namísto odstředěného mléka mohou být použity 1 až 10% hovězí sérumalbumin, 0,5 až 3% želatina nebo 1 % polyvinylpyrrolidon nebo podobně. Doba blokování je 16 až 24 hodin při 4 °C, nebo 1 až 3 hodiny při teplotě místnosti. Po promytí membrány PBS nebo TBA obsahujícími 0,05 až 0,1 % Tween 20 (dále zde označován jako „promývací roztok“), aby došlo k odstranění jakéhokoli přebytku blokujícího roztoku, protilátka produkovaná metodou uvedenou výše v bodu 3) je ponořena na určitou dobu v roztoku vhodně zředěném promývacím roztokem tak a umožněno protilátce, aby vytvořila vazbu s antigenem na membráně. Stupeň zředění protilátky v tomto okamžiku může být určen provedením předběžného pokusu s westernovým přenosem, kde je jako vzorek použit stupňovitě ředěný rekombinantní antigen, popsaný výše v bodu 3). Tato reakce protilátky je s výhodou prováděna při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Membrána je po ukončení reakce protilátky promyta promývacím roztokem. Když je použita značená protilátka, detekční operace může být provedena bezprostředně po této době. Když je použita neznačená protilátka, je poté provedena reakce s druhou protilátkou. V případě že se jedná o komerční protilátku, tato druhá značená protilátka je zředěna 2000 nebo 20 OOOkrát promývacím roztokem (pokud je vhodné ředění uvedeno v přiloženém návodu, protilátka by měla být zředěna podle něho). Membrána, z níž je primární protilátka odstraněna promytím, je ponořena do roztoku sekundární protilátky při teplotě místnosti po dobu 1 až 3 hodin a po promytí promývacím roztokem je provedena detekce odpovídající metodě značení. Promytí je

.......

provedeno inkubací membrány v promývacím roztoku po dobu 15 minut, obnovením promývacího roztoku, inkubací v něm po dobu 5 minut, a opětným obnovením promývacího roztoku a inkubací v něm po dobu 5 minut. Pokud je to nezbytné, promývací roztok je znovu obnoven a provádí se další promývání.

ii) ELISA/RIA

Zaprvé, aby bylo zabráněno nespecifické adsorbci protilátky na dno jamky destičky, na kterém je vzorek imobilizován pomocí metody uvedené výše v bodu 2), je předem provedeno blokování, stejně jako v případě westernového přenosu. Podmínky blokování jsou popsány v odstavci týkajícím se westernového přenosu.

Potom po promývání vnitřku jamky pomocí PBS nebo TBS obsahujícím 0,05 až 0,1 % Tween 20 (dále zde označován jako „promývací roztok“), aby došlo k odstranění jakéhokoli přebytku blokujícího roztoku, roztok získaný vhodným zředěním protilátky produkované metodou uvedenou výše v bodu 3) v promývacím roztoku je rozplněn do jamek a inkubován po určitou dobu, při čemž se protilátka naváže na antigen. Stupeň zředění protilátky v tomto okamžiku může být určen provedením předběžného pokusu ELISA, kde je jako vzorek použit stupňovitě ředěný rekombinantní antigen, popsaný výše v bodu 3). Tato reakce protilátky je s výhodou prováděna při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Membrána je po ukončení reakce protilátky promyta promývacím roztokem. Když je použita značená protilátka, detekční operace může být provedena bezprostředně po této době. Když je použita neznačená protilátka, je poté provedena reakce s druhou protilátkou. V případě že se jedná o komerční protilátku, tato druhá značená protilátka je zředěna 2000 nebo 20 OOOkrát promývacím roztokem (pokud je vhodné ředění uvedeno v přiloženém návodu, protilátka by měla být zředěna podle něho). Membrána, z níž je primární protilátka odstraněna promytím, je ponořena do roztoku sekundární protilátky při teplotě místnosti po dobu 1 až 3 hodin a po promytí promývacím roztokem je provedena detekce odpovídající metodě značení. Promytí je provedeno inkubací membrány v promývacím roztoku po dobu 15 minut, obnovením promývacího roztoku, inkubací v něm po dobu 5 minut, a opětným obnovením promývacího roztoku a inkubací vněm po dobu 5 minut. Pokud je to nezbytné, promývací roztok je znovu obnoven a provádí se další promývání.

V předloženém vynálezu může být provedena tak zvaná sendvičová ELISA, a to postupem uvedeným dále. Zaprvé v jakékoli aminokyselinové sekvenci uvedené u aminokyselin číslo 17 až 455 (s výhodou 19 až 455) v SEQ ID No. 2 v seznamu ·*· sekvencí a aminokyselinové sekvenci uvedené u aminokyselin číslo 17 až 460 v SEQ ID No. 4 jsou vybrány dvě vysoce hydrofilní domény, a z každé domény jsou syntetizovány částečné peptidy obsahující šest a více aminokyselinových zbytků, potom jsou získány pro každou doménu dva druhy protilátek pro tyto částečné peptidy, jakožto antigeny. Jedna z těchto protilátek je označena, jak bylo popsáno výše v bodu

4). Protilátka, která není označena, je imobilizována na dno jamky 96jamkové destičky pro ELISA postupem popsaným výše v bodu 2). Po blokování je do jamky nanesen roztok vzorku a inkubován při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po promytí vnitřku jamky je do každé jamky nanesen roztok značené protilátky. Po opětném promytí vnitřku jamky je provedena detekční operace, odpovídající metodě značení.

6) Hodnocení

Výsledky detekce získané metodou popsanou výše jsou porovnávány mezi vzorkem, pocházejícím z buněk kultivovaných v přítomnosti testované látky a vzorkem, pocházejícím z buněk kultivovaných v nepřítomnosti testované látky. Testovaná látka, při níž je snížena úroveň produkce polypeptidu, k němuž se protilátka specificky váže, může být terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii. Kromě toho může být poskytnuta souprava pro testování terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemii tím, že je zabalena protilátka produkovaná postupem popsaným výše v bodu 3) a reakční činidla používaná pro řadu výše zmíněných postupů.

Polypeptid, který má být detekován pomocí metody předloženého vynálezu, může být získán zmíněnou metodou přípravy antigenu pro produkci protilátky nebo může být získán tak, že jsou živočišné buňky přinuceny kjeho produkci pomocí adenovirového vektoru, do něhož je vložena DNA obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou jako nukleotidy číslo 47 až 1411 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí nebo nukleotidovou sekvenci uvedenou jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí. Způsobem konstrukce takového rekombinantního adenovirového vektoru může být metoda používající komerční soupravu (např. souprava pro adenovirový expresní vektor, TAKARA SHUZO CO., LTD.). Skutečnost že gen, který má být detekován pomocí metody předloženého vynálezu těsně koreluje s koncentrací neutrálního tuku v krvi savců, může být prokázána skutečností, že zvýšení koncentrace neutrálního tuku v krvi je pozorováno v případě, že je savci, například myši, injekčně podán rekombinantní adenovirus obsahující rekombinantní adenovirový vektor, získaný jak bylo uvedeno výše, a gen nesený rekombinantním adenovirovým vektorem je potom ···· exprimován, a skutečností, že stupeň exprese nukleotidové sekvence, představované nukleotidy 47 až 1411 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí je u dědičně hypolipidemické myši nižší než u hyperlipidemické myši.

Předložený vynález se také vztahuje na metodu testování terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemii za použití živočicha jiného než člověk, do něhož je pomocí genové manipulace vložen cizí gen obsahující nukleotidovou sekvenci popsanou výše v jakémkoli z bodů a) až e) tak, že může být ve velkém množství exprimován. Živočich použitý pro tuto metodu může být například myš KK/San, která může být infikována výše uvedeným rekombinantním adenovirem, nebo transgenní myš získaná vnesením DNA, jejíž nukleotidová sekvence odpovídá nukleotidové sekvenci nukleotidů 47 až 1411 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí nebo nukleotidů 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí, ale předložený vynález na ně není omezen.

Transgenní živočich je získán tak, že je z živočicha vzato oplozené vajíčko, je do něho vnesen gen, a poté je transplantováno do živočicha s falešnou březostí a po narození jsou tito živočichové dále udržováni jako transgenní linie. Může být použita již zavedená metoda (viz Hasseikougaku mannual, vydali Tatsuji Nomura a Motonari Katsuki, 1987 výroční publikace), “Manipulating the Mouše Embryo and A Laboratory Manual” B. Hogan, F. Costantini a E. Lacy, přeložili Kazuya Yamauchi, Hiroshi Toyoda, Hiroatu Moři, Yoichiro Iwakura, 1989, a japonská patentová publikace (Kokoku) č.5-48 093]. Specificky v případě myši, je například samici myši podáno činidlo indukující ovulaci (výhodná je myš, u které je koncentrace neutrálního tuku v krvi nižší, než je obvyklé, například myš KK/San, ale předložený vynález na ni není omezen) a křížena se samcem téže linie, a potom následující den je pronukleus oplozeného vajíčka z vejcovodu samice extrahován. Poté je pomocí jemné skleněné trubičky vnesen do pronukleusu oplozeného vajíčka roztok DNA. Pro expresi genu v živočišné buňce mohou být použity jakékoli regulační geny jako jsou promotor a zesilovač transkripce, pokud fungují v buňce živočicha, do které byly vneseny. Oplozené vajíčko, do něhož byla vnesena DNA, je transplantováno do vejcovodu myší samice s falešnou březostí, která bude fungovat jako adoptivní matka (Sic: IRC nebo podobná) a je ponechán proběhnout přirozený porod nebo je asi po 20 dnech proveden císařský řez. Jako metoda pro zjištění, zda takto získaný živočich má vnesený gen může být použita metoda extrakce DNA z ocasu tohoto živočicha nebo z jeho jiné části, provedení PCR za použití specifického pozitivního primeru a negativního primeru pro vnesený gen a • · • · • · · · ·· · ..........

použití výše získané DNA jako matrice, metoda štěpení této DNA několika sadami restrikčních enzymů, po kterém následuje elektroforéza a přenos DNA z gelu na nitrocelulózovou membránu, nylonový film nebo podobně, a provedení Southernovy analýzy pomocí sondy tvořené částí nebo celým značeným genem, který je do živočicha vnesen. Dále může být zkontrolováno, zda vnesený gen je skutečně v těle živočicha exprimován a to měřením koncentrace neutrálního tuku v periferní krvi. Pokud je vnesený gen v těle živočicha skutečně exprimován koncentrace neutrálního tuku v krvi se stává vyšší než u živočicha, do kterého gen vnesen není.

Testovaná látka je podávána takto získanému transgennímu živočichovi a je vybrána taková látka, která snižuje koncentraci neutrálního tuku v krvi (s výhodou je testovaná látka podávána také živočichovi, do kterého gen vnesen není, výsledky jsou porovnány a je vybrána látka, která zřetelně snižuje koncentraci neutrálního tuku v krvi transgenního živočicha). Pomocí tohoto postupu mohou být nalezeny nejen látky, které snižují nebo potlačují expresi vneseného genu, ale také látky, které potlačují jakékoli životní reakce spojené se zvýšením koncentrace neutrálního tuku v krvi působením polypeptidu, jako je faktor přispívající k expresi funkce polypeptidu samotného nebo funkce interagující s tímto polypeptidem při expresi funkce tohoto polypeptidu (např. receptor). Takové látky mohou také sloužit jako terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii.

Předložený vynález se týká polypeptidu jiného než je protilátka, který se specificky váže na polypeptid, který má být detekován metodou, která je předmětem předloženého vynálezu (dále zde označován jako „detekovaný polypeptid“), a to receptoru. Když je receptorem protein, který se nachází v buněčné membráně, může být klonován následujícím postupem. Zaprvé je zkonstruován rekombinantní vektor, pomocí něhož může být v savčí buňce exprimována DNA obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou jako nukleotidy číslo 47 až 1411 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí nebo nukleotidovou sekvenci uvedenou jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí, potom je vnesen do COS-1, supernatanty kultur jsou odebírány a následuje purifikace rekombinantního polypeptidu z polypeptidu, který má být detekován. Získaný rekombinantní polypeptid je označen fluoresceinisothiokyanátem (dále zde označován jako „FITC“). Potom je značený rekombinantní polypeptid přidán ke kultivovaným buňkám pocházejícím z různých druhů savců a tímto způsobem jsou identifikovány buňky, kde se rekombinantní polypeptid specificky váže k jejich buněčné membráně, tedy buňky exprimující receptor. cDNA knihovna pocházející z identifikovaných buněk je vložena do vektorů, které mohou být exprimovaný v savčí buňce a ponechány exprimovat v buňkách, které neexprimují receptor (s výhodou buňka COS-1 nebo buňka CHO, výhodněji buňka CHO). Rekombinantní polypeptid značený FITC je přidán k buňkám, kde je cDNA knihovna exprimována, buňky jsou po určité době kultivace odebrány a buňky, k nimž je navázán rekombinantní polypeptid označený FITC, jsou vybrány zařízením pro třídění buněk. Vnesená cDNA je ze získaných buněk klonována pomocí PCR nebo podobně. Pokud je to nutné, je výše uvedená operace opakována a nakonec je klonována cDNA kódující receptor, který se specificky váže na rekombinantní polypeptid, značený FITC. Kromě toho receptor samotný je možno izolovat z buněk, klonovaných jak bylo uvedeno výše.

Tedy, jestliže je získána cDNA kódující receptor polypeptidu, který má být detekován, buňky použité jako zdroj materiálu pro cDNA knihovnu jsou dále použity pro hromadné vyšetření látek, které inhibují interakci mezi polypeptidem, který má být detekován a receptorem, a látek, které se vážou k receptoru a mají stejnou funkci jako polypeptid, který má být detekován nebo látek, které inhibují přenos signálu zahájený interakcí mezi polypeptidem, který má být detekován, a receptorem. Přesněji řečeno, myší genomová DNA vhodně fragmentována štěpením pomocí restrikčního enzymu nebo podobně a vektor, ve kterém je DNA kódující zeleně fluoreskující protein, je připojen k jejímu konci (pEGFP-1 (vyrábí Clontech) je prodáván jako vektor pro test genu reportéru) a toto je vneseno do buněk, použitých jako zdroj materiálu pro výše uvedenou cDNA knihovnu. V průběhu kultivace buněk je přidán rekombinantní polypeptid (který není označený) polypeptidu, který má být detekován a buňky, které produkují zeleně fluoreskující protein, jsou vytříděny pomocí zařízení pro třídění buněk. Vytříděné buňky produkují zeleně fluoreskující protein v přítomnosti tohoto rekombinantního polypeptidu. Buňky jsou kultivovány tak, že počet buněk na jamku bude téměř stejný v každé jamce 96jamkové kultivační destičky, a po určité době kultivace po přidání samotné testované látky nebo po přidání rekombinantního polypeptidu a testované látky současně je měřeno množství produkce zeleně fluoreskujícího proteinu pomocí zařízení odečítacího fluorescenci na destičkách nebo podobně. Pokud produkce zeleně fluoreskujícího proteinu nastává pouze při kultivaci se samotnou testovanou látkou, je tato látka považována za agonistu polypeptidu, který má být detekován. Na druhé straně, když produkce zeleně fluoreskujícího proteinu • · • · · · • · · · · · • · v jamce, do níž byly přidány rekombinantní polypeptid a testovaná látka současně, je nižší než její produkce v jamce, do níž byl přidán pouze rekombinantní polypeptid, tato látka je antagonista polypeptidu, který má být detekován nebo represor přenosu signálu tohoto polypeptidu, a je považována za vhodnou jako terapeutické a preventivní činidlo proti hyperlipidemii.

Když je takto získaný antagonista protein nebo peptid, pak může být polynukleotid, který má nukleotidovou sekvenci kódující tento protein nebo peptid, použit pro genovou terapii hyperlipidemie. Takový polypeptid může být získán například analyzováním aminokyselinové sekvence zjištěného antagonistického proteinu nebo peptidů a syntetizováním oligonukleotidové sondy, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci, a prohledáváním různých cDNA knihoven nebo genomových knihoven. Kromě toho když peptid, který má aktivitu antagonisty, pochází z uměle připravené, náhodně syntetizované peptidové knihovny, DNA obsahující nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci peptidů, je syntetizována chemicky. Při genové terapii je polynukleotid kódující antagonistu, který byl získán výše uvedeným postupem, vložen například do virového vektoru a pacient je infikován virem (detoxikován), který obsahuje rekombinantní virový vektor.

V těle pacienta je antagonista produkován a funkce polypeptidu, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID No. 4 v seznamu sekvencí je inhibována a proto může být redukována koncentrace neutrálního tuku v krvi.

Jako způsob vnesení činidla genové terapie do buňky jsou použitelné buď transgenní metoda používající virový vektor nebo nevirová (Nikkei science, duben, 1994, strany 20 až 45, speciální číslo věnované experimentální medicíně, 12 (15) a (1994), zvláštní svazek věnovaný experimentální medicíně “základní technologie genové terapie”, Youdosha (1996)).

Příklady metody vnesení genu pomocí virového vektoru do buňky zahrnují metodu vnesení DNA, která kóduje TR4 nebo variantu TR4 do DNA viru nebo RNA viru, jako je retrovirus, adenovirus, adenoviru podobný virus, herpesvirus, virus vakcínie, poxvirus, virus poliomyelitidy a Sindbis virus. Mezi nimi jsou zvláště výhodné metody používající retrovirus, adenovirus, adenoviru podobný virus a virus vakcínie. Jako nevirové transgenní metody jsou zmíněny jako zvláště výhodné metoda přímého podání expresního plazmidu do svalů (metoda DNA vakcíny), lipozómová metoda, lipofektinová metoda, mikroinjekce, metoda s fosforečnanem vápenatým, • · · · • · • · • · ·· · · · · · ·· • ·· ·· ·· ··· · · ··· · · · · · · ·

.............

elektroporační metoda nebo podobné, a zvláště výhodné jsou metoda DNA vakcíny a lipozomová metoda.

Kromě toho, aby bylo zabezpečeno, že činidlo genové terapie bude fungovat jako terapeutické činidlo, lze použít in vivo metodu, která vnáší DNA do těla přímo a ex vivo metodu, kde je určitý druh buněk odebrán z lidského těla, DNA je do buňky vnesena vně těla a buňka je potom do těla vrácena (Nikkei science, duben 1994, strany 20 až 45, Gekkanyakuji, 36 (1), 23 až 48 (1994), Jikkenigaku zoukan, 12 (15), (1994)).

Například když je činidlo genové terapie podáváno pacientovi pomocí in vivo metody, lék je pacientovi podáván vhodnou cestou jako je intravenózní, intraarteriální, podkožní, kožní a intramuskulární, v závislosti na konkrétní poruše, symptomu nebo podobně. Kromě toho, třebaže toto činidlo pro genovou terapii je obecně formulováno jako injekce nebo podobné, když je podáváno pacientovi in vivo metodou, pokud je to nezbytné, může být přidán běžně používaný nosič. Dále, pokud je formulováno ve formě lipozomu nebo lipozomu fúzujícího s membránou (Sendai virus lipozom nebo podobně), může být formulován jako lipozomový přípravek, jako suspenze, kryogenní přípravek nebo centrifugační separací koncentrovaný kryogenní přípravek nebo podobně.

Nukleotidová sekvence komplementární k částečné sekvenci z nukleotidové sekvence uvedené jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí, může být použita pro tzv. léčení negativním DNA řetězcem. Molekula negativního DNA řetězce může být použita jako DNA, která se obvykle skládá z 15 až 30 nukleotidů, komplementárních k části nukleotidové sekvence uvedené jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí, nebo jako stabilní DNA derivát jako je fosforothioát, methylfosfonát nebo morfolinový derivát nebo podobně, nebo jako stabilní RNA derivát, jako je např. 2’-O-alkyl RNA. Taková molekula negativního DNA řetězce může být do buňky vnesena metodou dobře známou z oblasti technického zázemí předloženého vynálezu, jako je mikroinjekce, zapouzdření do lipozomu nebo exprese pomocí vektoru, obsahujícího protismyslnou sekvenci nebo podobně. Taková terapie negativním DNA řetězcem je výhodná u nemocí, kde je vhodné snížit aktivitu proteinu kódovaného nukleotidovou sekvencí uvedenou jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí, zvláště pro léčení hyperlipidemie.

Prostředek vhodný jako lék, který obsahuje výše uvedený protismyslný oligonukleotid, může být vyráběn dobře známými metodami, jako je smísení s nosičem, který je přípustný jako součást léku. Příklady takových nosičů a výrobních postupů jsou popsány v Pharmaceutical Sciences od Remingtona. Dostatečné množství léku pro léčení hyperlipidemie, při které exprese genu obsahujícího nukleotidovou sekvencí uvedenou jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 nebo aktivita genového produktu je abnormální, je podáno v každém z těchto případů. Účinná dávka se může měnit kvůli různým faktorům, jako jsou stav pacienta, jeho hmotnost, pohlaví a věk, a kvůli rozdílům ve způsobech podávání, jako jsou podkožní, místní, orální a intramuskulární. Například se jedná o 0,02 až 0,2 mg/kg/hod za 2 hodiny, když je lék podáván pomocí intravenózní injekce a 1 až 200 mg/m²/den v případě podkožního podávání.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje výsledek analýzy northernového přenosu u vzorků pocházejících z orgánů myši KK. Čísla na pravé straně pruhů (28S a 18S) ukazují sedimentační koeficienty markerových RNA.

Obr. 2 ukazuje výsledek analýzy westernového přenosu u vzorků supernatantu kultury transfekovaných buněk COS-1 pomocí. Čísla na levé straně pruhů ukazují molekulární hmotnosti (kDa) markérů molekulární hmotnosti.

Obr. 3 ukazuje výsledek analýzy westernového přenosu u vzorků supernatantu kultury transfekovaných buněk HeLa pomocí. Čísla na levé straně ukazují molekulární hmotnosti (kDa) markérů molekulární hmotnosti.

Obr. 4 ukazuje výsledky měření koncentrace neutrálního tuku v periferní krvi myši KK/San, infikované rekombinantním adenovirem.

Obr. 5 ukazuje výsledek analýzy northernového přenosu vzorku pocházejícího z jater myši KKa myši KK/San, infikovaných rekombinantním adenovirem pomocí. Čísla na levé straně pruhů ukazují sedimentační koeficienty markerových RNA.

• · · • ·

Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález bude dále podrobněji vysvětlen s odkazem na příklady, avšak předložený vynález na ně není omezen. V následujících příkladech byla každá operace genetické manipulace, pokud není uvedeno jinak, provedena podle metody popsané v 1989 “Molecular Cloning” [Sambrook, J., Fritsch, E.F. a Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press]. V alternativním případě, když byla použita komerční reagencie a komerční souprava, operace byla provedena podle přiložených instrukcí.

Referenční příklad 1. Klonování cDNA cDNA která má nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí byla získána za použití myších jater jako zdrojového materiálu, a to pomocí následujícího postupu.

a) Extrakce mRNA z myších jater

Dvě devět týdnů staré myši KK (samci, získáni v Ústavu pro živočišné pokusy, který je připojen k Lékařské Univerzitě Hamamatsu) byly rozpitvány a jejich játra byla vyjmuta a okamžitě vložena do tekutého dusíku, aby došlo k rychlému zmražení. Byla zjištěna jejich hmotnost a 3,1 gramu jich bylo rozemleto v hmoždíři v tekutém dusíku. Ktomu byl přidán roztok 5,5 M guanidinthiokyanátového pufru (dále zde označován jako GT) (5,5 M guanidinthiokyanát, 25 mM citronan sodný (pH 7,0), 0,5% sarkosyl, 0,2 M β-merkaptoethanol) (30 ml). Potom byl vzorek drcen pomocí pístu, byl opětně přidán roztok GT pufru (10 ml), opět drcen pomocí pístu a roztok byl odebrán. Poté byl hmoždíř vymyt roztokem GT (20 ml) a roztok byl také odebrán. Potom bylo 36 ml odebraného roztoku centrifugováno při 3000 otáčkách za minutu při teplotě 10 °C po dobu 10 minut, supernatant byl přenesen do nové zkumavky a 20krát bylo opakováno nasávání a vytlačování injekční jehlou kalibru 18. Potom byla celková RNA oddělena na hustotním gradientu za použití česné soli kyseliny trifluoroctové (CsTFA). Zásobní roztok CsTFA (19 ml) byl zředěn vodou bez ribonukleázy (18,924 ml) a tento zředěný roztok (6,18 ml) byl rozplněn do 6 zkumavek 13PA (vyrábí Beckman), a na něj byl navrstven dříve odebraný vzorek (5,2 ml na jednu zkumavku). Po ukončení centrifugace při 30 000 otáčkách za minutu (asi 125 000 g), při teplotě 20 °C v ultracentrifuze (typ Hitachi SCP70H), po dobu 20,5 hodiny ve výkyvném rotoru (Hitachi Koki Co., Ltd. P40 ST), byl sediment získaný po odebrání supernatantu resuspendován v 3,3 ml roztoku pufru pro extrakci, který je součástí purifikační soupravy pro RNA (Quick prep mRNA purifying kit vyráběný Amersham Pharmacia). mRNA byla čištěna pomocí purifikační soupravy podle přiloženého návodu. Pomocí soupravy pro přípravu cDNA knihovny byla podle přiloženého návodu připravena cDNA knihovna ve fágu lambda za použití 5 pg takto získané mRNA jako matrice (ZAP express, cDNA Giga pack III gold cloning kit vyráběná Stratagene).

b) Primární prohledávání cDNA knihovny

Escherichia coli infikovaná fágem lambda obsahujícím cDNA knihovnu, získanou výše uvedeným postupem, byla vyseta na agarovou plotnu (kultivační médium NZY: 0,5% chlorid sodný, 0,2% síran hořečnatý heptahydrát, 0,5% kvasničný extrakt, 1% kaseinový hydrolyzát a 1,5% agar) připravenou v kultivační laboratorní misce o průměru 9 cm tak, že se může vytvořit 1,8 x 10⁵ plaků na plotnu a byla kultivována při teplotě 37 °C po dobu 8 hodin. Na 14 místech tohoto agaru, na kterém se vytvořily plaky, byl agar včetně plaku vypíchnut pomocí dolní části 250 pl pipety o velkém průměru (vyráběno RAININ) a tyto agarové kousky byly jednotlivě vloženy do umělohmotných centrifugačních zkumavek obsahujících 100 pl roztoku SM pufru (0,1 M chlorid sodný, 8 mM síran hořečnatý, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5) a 0,01% želatina), třepány na mixéru vortex do zakalení a potom ponechány při teplotě 4 °C po dobu 1 až 2 hodiny. Potom byly supernatanty odebrány pomocí centrifugace při 12 000 g po dobu 5 minut a použity jako fágová suspenze.

Jako primery používané pro PCR reakcí byly pomocí automatického zařízení na DNA syntézu (model 394: výrobek firmy Perkin-Elmer, fosforamiditovou metodou (Matteucci, M.D., a Caruthers, Μ. H. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191) syntetizovány oligonukleotidy, které mají následující nukleotidové sekvence Primer 1: 5’-gactgatcaa atatgttgag ctt -3’ (SEQ ID No. 5 v seznamu sekvencí);

Primer 2: 5’-tgcatccaga gtggatccag a -3’ (SEQ ID No. 6 v seznamu sekvencí)

Pět pl takto získané fágové suspenze bylo smícháno s2,5 pl 10x koncentrovaného roztoku pufru pro PCR (přiložen kTaq polymeráze od by TAKARA SHUZO CO., LTD.), 4 pl směsi dNTP (2,5 mM každý, přiloženy kTaq polymeráze od by TAKARA SHUZO CO., LTD.), 1 pl každého výše uvedeného primerů 1 a 2, upraveného na 7,5 pM, 0,25 pl Taq polymerázy (TAKARA SHUZO CO., LTD.) a 11,25 pl sterilizované vody a směs byla zahřáta napřed na teplotu 94 °C po dobu 5 minut a potom byl 30krát opakován cyklus 94 °C po dobu 30 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund

..· ..........

a 72 °C po dobu 30 sekund, nakonec byla směs držena při teplotě 72 °C po dobu 7 minut a poté uložena při teplotě 4 °C. S výsledkem reakce byla provedena elektroforéza na 4% agarózovém gelu (agaróza NuSieve 3:1 (vyrábí FMC bioProducts)) a analyzována, zda došlo k amplifikaci specifického fragmentu. Jako výsledek výše uvedeného prohledávání 14 fágových suspenzí byly získány dva pozitivní vzorky, ve kterých byl amplifikován zamýšlený cDNA fragment.

c) Sekundární prohledávání

DNA fragmenty amplifikované při PCR provedené za stejných podmínek, jak byly popsané výše v bodu b), za použití 100 ng myší genomové DNA (vyrobena v Clontech) jako matrice, byly shromážděny pomocí agarózové elektroforézy. DNA fragmenty označené ³²P byly připraveny pomocí multi-prime DNA značícího systému (vyrábí Amersham Pharmacia) za použití těchto DNA fragmentů jako matric a reakční směs byla nanesena na sloupec (Amersham Pharmacia). Sloupec byl jednou promyt 400 pl TE (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA), pak bylo naneseno dalších 400 μΙ TE a byly odebírány eluáty. Všechny eluované frakce byly použity v následujícím sekundárním prohledávání jako značená sonda.

Na druhé straně fágová suspenze u které byl výše v bodu b) učiněn závěr že je pozitivní, byla 100krát zředěna roztokem SM pufru, Escherichia coli infikovaná 2 μΙ fága byla nanesena na agarovou plotnu v laboratorní kultivační misce o průměru 9 cm a byla kultivována při teplotě 37 °C po dobu 8 hodin. Na tento agar, na němž se vytvořily plaky, byla položena kruhová nylonová membrána (vyrábí Amersham Pharmacia, High bond N+), jejíž průměr souhlasí s vnitřním průměrem laboratorní misky, a plaky byly přeneseny tím, že membrána byla ponechána ležet na agaru po dobu 5 minut při teplotě 4 °C. Na třech místech byla membrána propíchnuta až do agaru injekční jehlou 18G, aby byly vyznačeny značky pro orientaci membrány, a poté byla membrána sejmuta, ponořena do alkalického roztoku (1,5 M chlorid sodný, 0,5 M hydroxid sodný) po dobu 2 minut, potom do neutralizačního roztoku (1,5 M chlorid sodný, 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0)) po dobu 5 minut a dále do roztoku obsahujícího 2 x SSC a 0,2 M Tris-HCl (pH 7,5) po dobu 30 sekund a poté byla při teplotě místnosti zcela vysušena.

Po inkubaci (prehybridizaci) membrány v 20 ml hybridizačního roztoku (hybridizační roztok Express Hyb, vyráběný Clontech) při teplotě 68 °C po dobu 1 hodiny, byl roztok zaměněn za 8 ml hybridizačního roztoku obsahujícího značenou • «

Λ Λ. · · · ’ ·· · · · · · ......

sondu a inkubace pokračovala po dobu 6 hodin při teplotě 68 °C. Poté byla 3krát provedena operace promývání membrány roztokem obsahujícím 2 x SSC a 0,05% SDS při teplotě místnosti po dobu 15 minut, poté byla 3krát provedena operace promývání membrány roztokem obsahujícím 2 x SSC a 0,05% SDS s mírným mícháním po dobu 15 minut a dále byla 3krát provedena operace promývání membrány roztokem obsahujícím 0,1 x SSC, 0,1% SDS při teplotě 50 °C po dobu 30 minut

Po promývání byla membrána podrobena autoradiografii a původní plaky v pozici, která je uznána za pozitivní, byly z agaru odebrány a s fágovou suspenzí byla provedena PCR za stejných podmínek, uvedených výše v bodu b). Specifická amplifikace DNA fragmentu byla zjištěna u šesti z deseti pozitivních vzorků plaků.

Fágová suspenze vzorku, u kterého byla amplifikace ze všech nejsilnější, byla podrobena in vivo vyštěpení za pomoci pomocného fága a hostitelské bakterie, které byly součástí klonovací soupravy ZAP express cDNA Giga pack lil gold cloning kit (vyrábí Stratagene) podle přiloženého návodu, a byly tak vytvořeny na agaru kolonie Escherichia coli, které obsahují fágomidy. Tyto kolonie byly izolovány a fágomidy byly extrahovány a byla s nimi provedena PCR podle metody popsané výše v bodu b). Výsledkem bylo, že byly vybrány a kultivovány kolonie, u kterých byla zjištěna specifická amplifikace DNA fragmentu, z nich byla izolována transformovaná Escherichia coli, která nese fágomid #55-1, obsahující cDNA inzert dlouhý 1,6 kb, E.coli pBK/m55 -1 SANK72199.

Celá nukleotidová sekvence cDNA vložená v takto získaném fágomidů #55-1 byla analyzována pomocí sekvenátoru ABI prism 377 DNA sequencer, vyrábí PerkinElmer japonské oddělení aplikovaných biotechnologických systémů nebo sekvenátoru 3700 DNA. Výsledkem bylo zjištění, že je to sekvence uvedená v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí (avšak nukleotidy číslo 1 až 8 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí jsou sekvence adaptéru pocházející z vektoru). Tato sekvence byla stejná jako sekvence (registrační číslo: AF162224) registrované v databázi GenBank jako protein 3 podobný myšímu angiopoietinu. Kromě toho transformovaná Escherichia coli, E.coli pBK/m55-1 SANK72199 nesoucí fágomid #55-1 byla pro mezinárodní použití uložena 19. prosince 1999 v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo (Národní institut pro pokročilou průmyslovou vědu a technologii, Depozitář mezinárodních patentů) Japonsko 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, a bylo ji uděleno přístupové číslo FERM BP-6940.

• ·

Příklad 1. Northernová analýza

a) Extrakce celkové RNA z myších orgánů

Northernová analýza byla provedena proto, aby byl určen orgán, kde byla exprimována cDNA, získaná v referenčním příkladu 1. Zaprvé byla celková RNA extrahována z varlete, sleziny, ledviny, tenkého střeva, jater a mozku myši KK (hyperlipidemická myš) a myši KK/San (hypolipidemická varianta myši, Shiraki a kol., 7. studijní skupina pro diabetické živočichy (1993)). 18 týdnů stará myš KK a KK/San byly rozpitvány, potom byly všechny jejich orgány vyňaty a okamžitě vloženy do tekutého dusíku, aby se rychle ochladily, a byly uloženy při -80 °C. K 0,5 g každého z orgánů bylo přidáno 15 ml reagencie TRIzol (vyrábí Gibco BRL) a homogenizováno na ledu pomocí vysokorychlostního homogenizátoru Polytron (vyrábí Ckinematica) (stupeň 6, po dobu 2 minut). Po 5 minutách stání při teplotě místnosti byly přidány 3 ml chloroformu a směs byla prudce ručně třepána po dobu 15 sekund. Po dalších 3 minutách stání při teplotě místnosti byla směs centrifugována při 12 000 x g při teplotě 4 °C po dobu 15 minut. Po centrifugací byla odebrána horní vrstva, bylo přidáno 0,8 objemu isopropylalkoholu bez ribonukleázy a smícháno. Po 10 minutách stání při teplotě místnosti a centrifugování při 12 000 x g při teplotě 4 °C po dobu 10 minut, byl supematant odebrán a byl kněmu přidán 70% alkohol bez ribonukleázy. Po centrifugování při 12 000 x g při teplotě 4 °C po dobu 10 minut, byl supematant odebrán a sediment byl sušen a potom uložen při -80 °C.

b) Elektroforéza a přenos celkové RNA na membránu

Celková RNA z každého odebraného orgánu byla naředěna na koncentraci 4 μρ/μΙ v destilované vodě bez ribonukleázy a potom bylo smícháno 5 pl roztoku RNA a 16 pl roztoku pufru pro vzorky RNA (roztok pufru 1,15 x MOPS (roztok pufru 1 x MOPS obsahuje 20 mM MOPS, 5 mM octan sodný a 1 mM kyselinu ethylendiaminotetraoctovou (dále zde označována jako „EDTA“)), 2,4 M formaldehyd, 57 % formamidu, 7 % glycerolu, 18 pg/ml bromfenolové modři, 18 pg/ml xylenkyanolu a 0,18 mM EDTA) a drženo při teplotě 65 °C po dobu 10 minut a potom ponecháno na ledu po dobu 5 minut. Celé množství roztoku tohoto vzorku bylo pro elektroforézu naneseno do jedné jamky na agarózovém gelu (roztok pufru 1 x MOPS, 1,17% agaróza (pro analýzu, vyrábí Bio-Rad), 0,66 M formaldehyd), která obsahuje 1,17% formalín a byla provedena elektroforéza. Elektroforéza byla provedena při 50 V po dobu 1,5 hodiny v zařízení pro elektroforézu na gelu ponořeném v roztoku pufru 1 x MOPS obsahujícím 500 ng/ml ethidiumbromidu. Po skončení elektroforézy byla RNA z agarózového gelu přenesena na nylonovou membránu (High bond N+, vyráběno Amersham Pharmacia) přes noc (jako roztok pro přenos byl použit roztok 20 x SSC) pomocí kapilární metody přenosu (Maniatis, T. a kol., (1982) in “Molecular Cloning A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, NY). Membrána byla promyta 2 x SSC po dobu 5 minut, vysušena na vzduchu a potom ozářena ultrafialovými paprsky pomocí aparátu pro ozařování ultrafialovými paprsky, aby došlo ke křížovému propojení (Spestrolinker XL-1000, Tomy Seiko) (1200 J/cm²), čímž byla RNA fixována.

c) Příprava sondy

PCR byla provedena za následujících podmínek pomocí termocykleru (Gene amplifier PCR systém 9600, vyrábí Perkin-Elmer japonské oddělení aplikovaných biotechnologických systémů) za použití primeru syntetizovaného v bodu b) referenčního příkladu 1. Po přidání sterilizované vody k primeru (konečná koncentrace 0,5 μΜ každý) a Tweenu 80 (vyrábí Sigma, konečná koncentrace 0,1%) do konečného objemu 7,5 μΙ byl přidán předem namíchaný 2 x PCR Taq reakční roztok (vyrábí TAKARA SHUZO CO., LTD.: 0,05 jednotky/μΙ Taq polymerázy, 0,4 mM dNTP, 20 mM Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM chlorid draselný a 3 mM chlorid hořečnatý). Dále byl k tomu přidán 1 μΙ (ekvivalent 100 ng) myší genomové DNA a tím byla připravena reakční směs. Po počátečním zahřátí reakční směsi na teplotu 94 °C po dobu 3 minut byl 35krát opakován cyklus 94 °C po dobu 30 sekund, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 45 sekund, a potom byla směs držena při teplotě 4 °C.

Jeden μΙ reakční směsi po PCR byl odebrán a amplifikovaný fragment byl klonován do plazmidového vektoru pomocí soupravy TA cloning kit (verze A s duálním promotorem, vyrábí Invitrogen), podle přiloženého návodu. Kompetentní kmen Escherichia coli byl transformován rekombinantním plazmidovým vektorem a kultivován na LB agaru, obsahujícím 50 pg/ml ampicilínu. Jako výsledek pokusu byly vybrány kolonie Escherichia coli, prokazující svým růstem rezistenci k ampicilínu, a ty byly kultivovány při teplotě 37 °C přes noc ve 4 ml tekutého kultivačního média LB, které obsahovalo 50 pg/ml ampicilínu. Z 3,5 ml tekutého média těchto kultur byla odebrána plazmidová DNA za pomoci automatického extraktoru plazmidů (PI-50, vyrábí Kurabo Industries, Ltd.). Nukleotidové sekvence získaných plazmidových DNA byla analyzována a plazmid, v němž byl zabudován cílový PCR produkt, byl použit pro • · • · * ·

následující operace.

Po štěpení 8 μΙ vybrané plazmidové DNA pomocí restrikčního enzymu EcoRI, byly provedeny extrakce směsí fenol/chloroform a precipitace ethanolem. Získaná sraženina byla rozpuštěna v 10 pl sterilní vody. K roztoku byly přidány 2 μΙ roztoku pigmentů (0,25% bromfenolová modř, 0,25% xylenkyanol, 15% Ficcol (typ 400)) a pak byla provedena polyakrylamidová elektroforéza (koncentrace gelu 8 %, 100 V, při teplotě místnosti po dobu 3 hodin). Po elektroforéze byl gel obarven ethidiumbromidem a kousek gelu v místě proužku odpovídajícímu cílové DNA (asi 200 párů bází, SEQ ID No. 11 v seznamu sekvencí) byl pod osvětlením ultrafialovým světlem vyříznut žiletkou a přenesen do mikrocentrifugační zkumavky a rozdrcen. Ktomu bylo přidáno 300 μΙ roztoku elučního pufru (0,5 M octan amonný, 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% SDS), drženo přes noc při teplotě 37 °C, potom byla dvakrát provedena extrakce směsí fenol/chloroform, jednou byla provedena precipitace ethanolem a sraženina byla rozpuštěna v 20 μΙ sterilní vody.

Z 5 μΙ takto získaného roztoku DNA byla pomocí postupu uvedeného v bodu c) referenčního příkladu 1 připravena sonda (400 μΙ) označená ³²P.

d) Hybridizace

Membrána připravená výše v bodu b) byla ponořena do 20 ml hybridizačního roztoku (ExpressHyb Hybridization Solution, vyrábí Clontech) a byla provedena inkubace při teplotě 68 °C po dobu 1 hodiny (prehybridizace), poté byla provedena přes noc hybridizace při teplotě 68 °C v 20 ml hybridizačního roztoku obsahujícího sondu značenou ³²P. Poté byla membrána promyta 3x roztokem obsahujícím 2 x SSC a 0,05% SDS při teplotě místnosti po dobu 20 minut a 3x roztokem obsahujícím 0,1 x SSC a 0,1% SDS při teplotě 50 °C po dobu 20 minut, a potom byla provedena autoradiografie.

Exprese detekovaného genu byla pozorována pouze v játrech a bylo zřejmé, že úroveň jeho exprese byla zřetelně snížena v myši KK/San (hypolipidemická myš) ve srovnání s myší KK (hyperlipidemická myš) (obr. 1).

Ve výše uvedeném experimentálním systému může být zkoumán účinek testované látky, pokud jde o její působení jako terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii tak, že se připraví vzorek RNA z primární kultury hepatocytů myši KK, pěstovaných v přítomnosti nebo nepřítomnosti testované látky, a provede se stejná operace, jak je popsána výše. Testované látky, které snižují úroveň exprese genu • · tftf * 1 * * detekovaného v tomto pokuse, mohou sloužit jako terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemií. Když je proveden test hromadného testování více látek, elektroforéza může být vynechána a může být také provedena tečková hybridizace.

Referenční příklad 2: Klonování lidské cDNA

a) Příprava sondy

Aby byla získána lidská cDNA odpovídající myší cDNA uvedené v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí, byly syntetizovány oligonukleotidové primery s následující sekvencí:

5’-tcctctagtt atttcctcca g -3’ (SEQ ID No. 7 v seznamu sekvencí); a

5’-tggtttgcca gcgatagatc -3’ (SEQ ID No. 8 v seznamu sekvencí).

Potom byly smíchány 1 μΙ lidské genomové DNA (vyrábí Boehringer Mannheim,

200 mg/ml), 1 μΙ Taq polymerázy (rTaq, TAKARA SCHUZO CO., LTD., 5 jednotek/μΙ), 10 μΙ roztoku 10 x pufru pro PCR (vyrábí TAKARA SHUZO CO., LTD.), 16 μΙ roztoku směsi dNTP (2,5 mM každý), 2 μΙ každého 20 μΜ primeru a 68 μΙ sterilní vody. Reakční směs byla zahřáta na 94 °C po dobu 5 minut a potom byl 30x opakován teplotní cyklus zahřátí na 94 °C po dobu 30 sekund, na 55 °C po dobu 30 sekund a na 72 °C po dobu 30 sekund, nakonec zahřáta na 72 °C po dobu 10 minut a potom uložena při teplotě 4 °C. U reakční směsi byla provedena elektroforéza na 2% agarózovém gelu a gel v místě zóny amplifikované DNA byla vyříznuta a purifikována. Takto získaná DNA byla označena ³²P pomocí soupravy pro značení DNA (BcaBest labeling kit, TAKARA SCHUZO CO., LTD.,) a použita jako sonda v následujícím bodu 2).

2) Primární prohledávání cDNA knihovny

1x10⁶ plaků DNA z komerčních cDNA knihoven pocházejících z lidských jater (Human liver 5'-STŘECH cDNA Library, vyrábí Clontech) bylo fixováno na nylonovou membránu. Escherichia coli infikovaná knihovnou cDNA byla rozdělena na 20 agarových ploten, které byly připraveny na laboratorních kultivačních miskách o průměru 9 cm tak, že se na plotně vytvořilo 5 χ 10⁴ plaků, a bylo potom kultivováno při teplotě 37 °C po dobu 8 hodin. Na agar, na kterém se vytvořily plaky, byla položena nylonová membrána (vyráběno Amersham Pharmacia, High bond N+), jejíž průměr souhlasí s vnitřním průměrem laboratorní misky, a plaky byly přeneseny tím, že membrána byla ponechána ležet na agaru po dobu 5 minut při teplotě 4 °C. Na třech místech byla membrána propíchnuta až do agaru injekční jehlou 18G, aby byly r · ·*·* vyznačeny značky pro orientaci membrány, a poté byla membrána sejmuta, ponořena do alkalického roztoku (1,5 M chlorid sodný, 0,5 M hydroxid sodný) po dobu 2 minut, potom do neutralizačního roztoku (1,5 M chlorid sodný, 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0)) po dobu 5 minut a dále do roztoku obsahujícího 2 x SSC a 0,2 M Tris-HCl (pH 7,5) po dobu 30 sekund a poté byla při teplotě místnosti zcela vysušena. Potom byla DNA fixována pomocí UV ozařovacího přístroje (Spectro-linker XL-1000, vyráběno Tomy seiko) (1200 J/cm²).

Takto připravená membrána byla inkubována při teplotě 65 °C přes noc v hybridizačním roztoku (Express Hyb, vyráběný Clontech). Potom byla membrána 3krát promývána roztokem obsahujícím 2 x SSC a 0,05% SDS za jemného třepání po dobu 15 minut, dále 3krát roztokem obsahujícím 0,1 x SSC a 0,1% SDS při teplotě 50 °C po dobu 30 minut a potom byla membrána podrobena autoradiografii.

Plaky, které byly zjištěny v pozici pozitivního signálu, byly odebrány včetně kultivačního média zvýše uvedené agarové plotny a vloženy do 100 pl roztoku SM pufru (0,1 M chlorid sodný, 8 mM síran hořečnatý, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,01% želatina), suspendovány v něm a ponechány při teplotě 4 °C po dobu 2 hodin. Supernatant byl odebrán po centrifugací při 12 000 g po dobu 5 minut.

Escherichia coli infikovaná takto získaným primárním pozitivním fágovým roztokem byla kultivována na agarovém médiu připraveném na laboratorní kultivační misce o průměru 9 cm tak, že se vytvořilo 500 plaků na laboratorní misku a sekundární hromadné prohledávání bylo provedeno opakováním výše uvedeného postupu. Escherichia coli kmen BM25.8 (vyrábí Clontech) infikovaný získaným sekundárním pozitivním klonem fága byl kultivován při teplotě 37 °C na agarovém médiu, aby se vytvořily kolonie Escherichia coli, které obsahují fágomid. Kolonie byly izolovány, kultivovány v malém množství tekutého média a takto získaný fágomid byl extrahován. Inzert byl analyzován pomocí štěpení restrikčním enzymem a byla izolována Escherichia coli E. coli pTrip/h55-1 SANK 72 299, obsahující klon #h5-1, který má inzert 1,6 kb. Byla analyzována nukleotidová sekvence inzertu v tomto klonu a bylo potvrzeno, že je shodná se sekvencí cDNA registrovanou v GenBank jako protein 3, podobný lidskému angiopoietinu (registrační číslo; AF 152 562) (SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí. Avšak nukleotidy číslo 1 až 14 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí jsou sekvence adaptéru, pocházející z vektoru). Kromě toho byla transformovaná Escherichia coli E. coli pTrip/h55-1 SANK 72 299, nesoucí fágomid #h5-1, pro • · , » · I • to ·· »* *» • · · · * « * » · * • * · • · toto·· mezinárodní použití uložena 19. listopadu 1999 v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo (Národní ústav pro pokročilou průmyslovou vědu a technologii, Depozitář mezinárodních patentů) v 1-1-3, Higashi-cho, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, a bylo mu přiděleno přístupové číslo FERM BP-6941.

Příklad 2. Produkce polyklonální protilátky

Chemicky byly syntetizovány peptidy, které mají dva druhy aminokyselinových sekvencí vybraných z domény konzervované mezi polypeptidy myší a lidí, které sloužily jako antigen pro produkci protilátky, která rozpoznává každý polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí, a zejména aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID No. 2 v seznamu sekvencí a SEQ ID No. 4 v seznamu sekvencí: Glu-Pro-Lys-Ser-Arg-Phe-Ala-Met-Leu-Asp-Asp-Val-Lys-Cys (55-1-N1, SEQ ID No. 9 v seznamu sekvencí) a Cys-Gly-Glu-Asn-Asn-Leu-Asn-Gly-Lys-Tyr-Asn-Lys-Pro-Arg (551-C1, SEQ ID No. 10 v seznamu sekvencí) (použitý přístroj: Perkin-Elmer Japan model 433). Avšak na C-konec původní aminokyselinové sekvence v aminokyselinové sekvenci 55-1-N1 byl přidán cysteinový zbytek, k němuž bude později jako nosič připojen hemokyanin plže „keyhole limpet“ (dále zde označován jako „KLH“). Na druhé straně cystein na N-konci 55-1-C1, k němuž se váže KLH, pochází z původní aminokyselinové sekvence.

Tedy 11,2 mg syntetického peptidu 55-1-N1 a 21,5 mg KLH respektive 10,2 mg 55-1-C1 a 21,2 mg KLH bylo kondenzováno pomocí N-(6maleinimidokaproyloxy)sukcinimidu (EMCS, vyrábí Dojinkagakukenkyusho) (bylo drženo při teplotě místnosti po dobu 15 hodin za použití roztoku 0,02 M pufru kyseliny fosforečné (pH 7,5), který obsahuje 8 M močovinu a 0,9% chlorid sodný jako rozpouštědlo kondenzační reakce). Tato reakční směs byla přidána do 8 M roztoku močoviny, dialyzována proti tekoucí vodě a dialyzována proti čištěné vodě a potom za mrazu vysušena, čímž byl získán peptidový antigen vázaný na KLH. Jeden mililitr fyziologického roztoku byl přidán kaši 10 mg těchto peptidových antigenů a poté byly převedeny na jemnou suspenzi pomocí ultrazvukového oscilačního přístroje (sonikátoru), vortexového mixéru, skleněné tyčinky nebo podobně. Potom bylo celé množství doplněno do 7,5 ml fyziologickým solným roztokem a každý z nich byl po jednom mililitru rozdělen do lahviček, zmražen a uložen.

« •4 4444

Při imunizaci byl roztok antigenu v jedné z výše uvedených lahviček rozpuštěn, smíchán se stejným množstvím adjuvans a potom injekčně podán do zad dvou králíků hypodermálně respektive intradermálně. Jako adjuvans bylo použito kompletní Freudovo adjuvans. Pro druhou a další imunizace bylo použito nekompletní Freudovo adjuvans. Imunizace byla provedena čtyřikrát každé dva týdny, po druhé imunizaci byl proveden test odebrání krve a pomocí metody enzymatického imunologického testu na pevné fázi (ELISA) byl zjišťován titr protilátky v séru. Každý peptidový antigen byl nanesen na 96jamkovou destičku pro ELISA (vyrábí Sumitomo Bakelite CO., LTD., 96 jamek typ H) a jako druhá protilátka byla použita protikráličí IgG protilátka označené křenovou peroxidázou. Vykrvácení bylo provedeno 13 dní po 4. imunizaci.

Protilátka byla po odběru krve purifikována pomocí afinitního sloupce. Tedy peptid (55-1-N1: 7,82 mg, 55-1-C1: 8,07 mg) byl spojen s nosičem EMC-agarózou (5 ml), která byla aktivována reakcí N-(6-maleinimidokaproyloxy)sukcinimidu (EMCS, vyrábí Dojinkagakukenkyusho) a aminoalkyaagarózou (vyrábí Bio-Rad, Affigel 102). Inaktivace nezreagované EMC skupiny byla provedena působením 0,1 M merkaptoethylaminu kyseliny chlorovodíkové (byla přidána 5 mM EDTA). 85 ml antiséra bylo dvakrát zředěno PBS (obsahující roztok pufru 0,02 M kyseliny fosforečné (pH 7,0), 0,9% chlorid sodný) a sraženina byla získána metodou srážení pomocí síranu amonného (konečná koncentrace 40%), tato sraženina byla rozpuštěna v PBS a potom po odsolení dialyzována proti PBS. Dialyzovaný roztok byl použit jako hrubá frakce IgG. Chromatografie na afinitním sloupci byla provedena ve třech krocích. Tedy 1/3 množství hrubé frakce IgG bylo naneseno na afinitní sloupec a operace opětného nanášení prošlé frakce byla opakována 3x. 40 ml spojeného roztoku prošlé frakce a promývacího roztoku byly odebrány jako neadsorbující se frakce. Aby byla odstraněna protilátka, která se váže na sloupec nespecificky, sloupec byl dostatečně promyt PBS obsahujícím 1 M chlorid sodný a potom roztokem 4 M chloridu horečnatého, roztokem

3,5 M thiokyanátu draselného a na sloupec byl v poměru 1 : 1 nalit roztok pufru 0,1 M glycinu a kyseliny chlorovodíkové (pH 2,3) a protilátka specificky vázaná k peptidu, upevněném na nosiči sloupce, byla vymyta jakožto afinitně purifikovaná protilátka. Protože cílová protilátka byla obsažena v eluátu roztoku 4 M chloridu hořečnatého a roztoku 3,5 M thiokyanátu draselného, každý z těchto eluátů dialyzovaný proti PBS byl použit v následujících operacích jako protilátka.

• · ·· ·· • · · · • · ··.

• · · · • · · · • · · ·

Příklad 3. Exprese a westernová analýza buněk COS-1

DNA fágomidu #h5-1, získaného v referenčním příkladu 2 byla štěpena restrikčními enzymy EcoRI a Xbal, poté byla provedena elektroforéza na 8% polyakrylamidovém gelu, a postupem popsaným v bodu c) příkladu 1 byl izolován a purifikován fragment 1,6 kb obsahující cDNA. Současně byl podobně restrikčními enzymy EcoRI a Xbal štěpen silně exprimující vektor pME18S (Hara, T. a kol., (1992) EMBO. J. 11, 1875-, vydáno Takashi Yokota, Kennishi Arai, biotechnologická příručka série 3, experimentální metoda klonování genu, Yodosha, str. 18 až 20), konce byly defosforylovány a ligovány pomocí výše uvedených fragmentů cDNA a soupravy pro ligování DNA (DNA ligation kit, Version 2, TAKARA SCHUZO CO., LTD.). Pomocí DNA byla transformována Escherichia coli a DNA výsledného transformantu byla analyzována pomocí restrikčního enzymu. Byl vybrán kmen obsahující 1,6 kb DNA fragment a označen jako pMEh55-1.

Potom byla transformovaná Escherichia coli nesoucí pMEh55-1 kultivována při teplotě 37 °C přes noc ve 100 ml tekutého kultivačního média LB, obsahujícího 50 pg/ml ampicilínu. Z tohoto média byla získána pMEh55-1 DNA pomocí soupravy pro purifikaci plazmidů ((Wizard purefection plasmid DNA purifying systém, vyrábí Promega), a purifikována pomocí metody s chloridem česným.

Takto získaným plazmidem pMEh55-1 byly transfekovány buňky COS-1. Transfekce buněk COS-1 byla provedena elektroporační metodou pomocí zařízení GTE-1, vyráběného Shimadzu Corp. Tedy z láhve, ve které byly buňky COS-1 množeny dokud nedosáhly poloviny souvislého nárůstu, byly buňky získány působením trypsinu a EDTA, promyty roztokem pufru PBS (-) (TAKARA SCHUZO CO., LTD.). Dále byly buňky suspendovány v roztoku pufru PBS (-) na koncentraci 6 x 10⁷ buněk/ml. Plazmidová DNA (pMEh55-1) získaná výše uvedenou metodou byla zředěna na koncentraci 200 pg/ml roztokem pufru PBS (-). 20 pl buněčné suspenze a roztoku DNA bylo smícháno, vloženo do komůrky s rozmezím mezi elektrodami 2 mm a bylo působeno pulsy 600 V-30 psec, vždy 2x v intervalu 1 sekundy. Po ochlazení komůrky po dobu 5 minut při teplotě 4 °C, byla směs buňky-DNA přidána k 10 ml DMEM, které obsahovalo 10 % fetálního hovězího séra, přenesena do laboratorní misky a byla kultivována pod atmosférou 5% CO₂ při teplotě 37 °C přes noc. Potom byl odstraněn supernatant a buňky byly promyty médiem DMEM bez séra a poté bylo přidáno 1 % ml DMEM a kultivováno po dobu tří dnů.

• · • · « • · · • · · • ·

Z takto získané buněčné kultury byl odebrán supernatant. Na 0,3 ml každého supernatantu z bezsérových kultur buněk COS-1 transfekovaných negativním kontrolním plazmidem pME18S nebo pMEh55-1 bylo působeno kyselinou trichloroctovou (dále zde označována jako „TCA“) aby došlo k vysrážení proteinu a tato sraženina byla získána pomocí centrifugace.

Sraženina byla promyta acetonem vychlazeným na ledu, vysušena na vzduchu a pro provedení SDS-polyakrylamidové elektroforézy (SDS-PAGE) rozpuštěna v roztoku vzorkového pufru (vyrábí Bio-Rad), který obsahuje 2-merkaptoethanol. Potom je provedena SDS-PAGE za redukčních podmínek za použití 4 až 20% polyakrylamidového gradientového gelu (multi-gel 4/20, vyrábí Daiichikagaku).

Po elektroforéze byla zóna přenesena v roztoku transkripčního pufru (192 mM glycin, 20% methanol, 25 mM Tris) z polyakrylamidového gelu na nitrocelulózovou membránu (vyrábí Bio-Rad) za těchto podmínek: 200 mA po dobu 90 minut při teplotě 4 °C, pomocí přístroje pro transkripci membrány (vyrábí Marisol, NP7513).

Jako u nitrocelulózové membrány po transkripci, byl provedena westernová analýza za použití protilátky získané v příkladu 2 (zde označována jako „protilátka 551-ΝΓ nebo „protilátka 55-1-C1“). Tedy, nitrocelulózové membrána je napřed promyta PBS obsahujícím 0,05% Tween 20 (dále zde označován jako „0,05% Tween 20-PBS“) (při teplotě místnosti jednou po dobu 15 minut a potom dvakrát po dobu 5 minut). Potom byla vložena do umělohmotného sáčku (označovaný jako hybridizační sáček, vyrábí Cosmobio), bylo přidáno 20 ml 0,05% Tween 20-PBS, který obsahoval 5 % odstředěného mléka (Snow Brand Milk Products CO., LTD.) a bylo inkubováno při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po jedné hodině byla membrána vyjmuta a promyta jednou 15 minut a poté dvakrát po dobu 5 minut v 0,05% Tween 20-PBS. Po promytí byla membrána přenesena do nového umělohmotného sáčku a ínkubována po přidání 20 ml 0,05% Tween 20-PBS obsahujícího protilátku 55-1-N1 nebo protilátku 55-1-C1 (100x zředěné) a 1% hovězího sérumalbuminu (dále zde označován jako „BSA“, vyrábí Sigma). Po jedné hodině byla membrána vyjmuta a promyta jednou 15 minut a poté dvakrát po dobu 5 minut v 0,05% Tween 20-PBS. Potom byla membrána přenesena do nového umělohmotného sáčku do něhož bylo přidáno 20 ml roztoku získaného 2000násobným zředěním protilátky proti králičímu IgG, označené křenovou peroxidázou v 0,05% Tween 20-PBS, který obsahuje 1% BSA, a Ínkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po jedné hodině byla membrána vyjmuta a promyta jednou minut a poté čtyřikrát po dobu 5 minut v 0,05% Tween 20-PBS. Po promytí byla membrána položena na zabalený film a zóna, kníž se váže protilátka 55-1 -N1 nebo protilátka 55-1-C1, byla detekována pomocí ECL detekčního roztoku pro westernovou analýzu (vyrábí Amersham Pharmacia) (po ponoření na 1 minutu do ECL detekčního roztoku pro westernovou analýzu a položení na zabalený film bylo ponecháno při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Takto bylo zeslabeno pozadí a expozice byla provedena na rentgenový film (po dobu 3 sekund)). Tímto způsobem byla oběma protilátkami detekována specifická zóna v supernatantu kultur COS-1, knimž byla přidána DNA plazmidů pMEh55-1 (obr. 2).

Stejný pokus může být proveden také se supernatantem kultur buněk COS-1, ve kterých je exprimována myší cDNA získaná v referenčním příkladu 1. Tedy DNA vloženého fragmentu 1,6 kb, získaná štěpením DNA fágomidu #55-1, získaného v referenčním příkladu 1, pomocí restrikčních enzymů EcoRI a Xbal, je vložena do pME18S a je zkonstruován klon (pME55-1), který je potom vnesen do buněk COS-1 pomocí stejného postupu, jaký byl uveden výše a z buněčné kultury je odebrán supernatant. Když byl vzorek, připravený ze supernatantu této kultury, analyzován westernovou analýzou za použití protilátky 55-1-N1 a protilátky 55-1-C1, byla v supernatantu buněčných kultur COS-1, získaných vnesením DNA plazmidů pME55-1, detekována specifická zóna, kdykoli byla pro detekci použita kterákoli z těchto protilátek.

Ve výše uvedeném experimentálním systému může být účinek testované látky, zda se jedná o terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii, zjišťován tak, že je připraven vzorek ze supernatantu kultury primárních hepatocytů myši KK, kultivovaných v přítomnosti nebo nepřítomnosti testované látky, a provedením téže operace. Testovaná látka, která v tomto testu snižuje množství detekovaného antigenu, může sloužit jako terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii. Když je provedeno současné působení mnoha testovaných látek, elektroforéza může být vynechána a může být provedena tečková hybridizace.

Příklad 4. Příprava rekombinantního adenoviru a jeho exprese v kultivovaných buňkách

Aby byla provedena nucená exprese cDNA, pocházející z myši získané v referenčním příkladu 1, byl pomocí komerční soupravy (Adenovirus expression vector kit, TAKARA SCHUZO CO., LTD.) vytvořen rekombinantní adenovirus. Fágomidový klon #55-1, získaný v referenčním příkladu 1, byl tedy štěpen pomocí restrikčních enzymů EcoRI a Notl, konce získaného fragmentu DNA dlouhého asi 1,7 kb byly zarovnány a fragment byl použit v následujících krocích jako fragment vkládané DNA.

Kromě toho byl kosmid pAxCA/mAP5, v němž byl fragment vkládané DNA vložen v rozpoznávacím místě pro restrikční enzym Swal kosmidového vektoru pAxCAwt (přiložen k soupravě Adenovirus expression vector kit) navržen tak, že exprese může být provedena za použití cytomegalovirového zesilovače transkripce a promotoru pro kuřecí β-aktin. DNA pAxCA/mAP5 a DNA pro virový koncový protein (přiložena k soupravě DNA-TPC, Adenovirus expression vector kit), byly společně transfekovány do buněk 293 (ATCC CRL 1573) pomocí transfekčního systému s fosforečnanem vápenatým (vyrábí Lifetech), izolován rekombinantní adenovirus Ad/mAP-5, a ten byl namnožen v buňkách 293. Kromě toho byl v buňkách 293 rovněž množen adenovirus Ad/LacZ, nesoucí rekombinantní adenovirový vektor, do kterého byl vložen gen LacZ vyštěpený z kontrolního kosmidu pAxCAiLacZ. Namnožený adenovirus byl z buněk 293 získán ultrasonikací virem infikovaných buněk 293 čtyřikrát po dobu 30 sekund (B1200, vyrábí Branson) a potom byla dvakrát opakována purifikace na hustotním gradientu chloridu česného. Získaná virová tekutina byla dialyzována při teplotě 4 °C proti PBS, k němuž bylo přidáno 10 % glycerolu, zmražena a uložena do použití při teplotě -70 °C.

Buňky HeLa (ATCC CCL2) byly takto získaným rekombinantním adenovirem infikovány s multiplicitou infekce 5, kultivovány v médiu bez séra (Eaglovo kultivační médium modifikované podle Dulbecca (DMEM)) po dobu tří až čtyř dnů a potom byl z kultur odebrán supernatant. Jeden mililitr supernatantu byl dán do 1,5 ml zkumavky typu eppendorf, do níž bylo přidáno 100 μΙ kyseliny trichloroctové, ponecháno při teplotě místnosti po dobu 3 minut a potom centrifugováno při 15 000 otáčkách/minutu ve stolní centrifuze po dobu 5 minut. Supernatant byl odstraněn, bylo opět přidáno 0,5 ml acetonu vychlazeného na ledu, dobře promícháno a bylo znovu centrifugováno při 15 000 otáčkách/minutu ve stolní centrifuze po dobu 2 minut. Po odstranění supernatantu bylo opět přidáno 0,5 ml acetonu vychlazeného na ledu, promícháno a centrifugováno po dobu 2 minut při 15 000 otáčkách/minutu ve stolní centrifuze. Potom byl supernatant odstraněn a sraženina byla vysušena odpařením ve vakuu. Sraženina byla rozpuštěna v 10 μΙ destilované vody, smíchána s roztokem vzorkového pufru pro SDS-PAGE (vyrábí Bio-Rad), který obsahuje 2-merkaptoethanol, zahřívána po dobu 5 • · minut na teplotu 99 °C, čímž byl připraven vzorek pro elektroforézu. Se vzorkem byla provedena elektroforéza v hustotním gradientovém polyakrylamidovém gelu 4 až 20 % (roztok pufru pro elektroforézu: 25 mM Tris, 192 mM glycin a 0,1% SDS) a potom byl v roztoku přenášecího pufru přenášen na nitrocelulózovou membránu při 200 mA a teplotě 4 °C po dobu 1 hodiny. Membrána s přeneseným vzorkem byla přes noc při teplotě 4 °C blokována PBS, ke kterému bylo přidáno 0,5 % odstředěného mléka, a poté třikrát promyta promývacím roztokem (0,05% Tween 20-PBS). Potom byla membrána vložena do reakční směsi, získané smícháním antiséra protilátky 55-1-N1 před purifikaci a antiséra protilátky 55-1-C1 před purifikaci, to bylo potom zředěno 10 OOOkrát v 0,05% Tween 20-PBS, který obsahuje 5 % fetálního hovězího séra, dále probíhala inkubace při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a následovalo 3krát promytí promývacím roztokem. Dále byla membrána inkubována v reakční směsi získané naředěním 10 OOOkrát roztoku kozího protikráličího IgG značeného křenovou peroxidázou (H+L) (vyrábí Bio-Rad) v 0,05% Tween 20-PBS, který obsahuje 5 % fetálního hovězího séra, při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a potom následovalo 5krát promytí promývacím roztokem. Membrána byla položena na zabalený film a ponořena do ECL detekčního roztoku pro westernovou analýzu po dobu 1 minuty, potom byla ponechána při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, aby došlo k zeslabení pozadí, a poté byla exponována na rentgenový film (po dobu 3 sekund). Tímto způsobem byla detekována specifická zóna pocházející ze supernatantu kultury buněk HeLa infikovaných rekombinantním adenovirem Ad/mAP-5 (obr. 3).

Na druhé straně byl připraven rekombinantní adenovirus (Ad/hAP5), který obsahuje adenovirový vektor, do něhož byla vložena cDNA nesená fágomidovým klonem #h5-1, a byl s ním proveden podobný pokus. Při westernové analýze supernatantu kultury exprimujících buněk HeLa byla rovněž detekována specifická zóna (obr. 3).

Příklad 5. Exprese in vivo při použití rekombinantního adenoviru

Rekombinantní adenoviry Ad/mAP-5 nebo Ad/LacZ, čištěné jak bylo uvedeno výše, byly zředěny PBS obsahujícím 10 % glycerol tak, aby dosáhly 2 χ 10¹° pfu (jednotek vytvářejících plaky)/ml a 100 pl (2 x 10⁹) každého z nich bylo podáno injekčně třem (Ad/mAP-5) nebo dvěma (Ad/LacZ) 13 až 14 týdnů starým samcům myši KK/San pomocí injekce do ocasní žíly. Jeden den po injekci byla pomocí hematokritové pipety ·· ’ odebrána z očnice každé myši krev, centrifugována při 5200 otáčkách/minutu ve stolní centrifuze po dobu 15 minut, aby došlo k oddělení plazmy. Potom byla pomocí soupravy pro měření neutrálního tuku (triglyceridový E-test Wako, Wako Pharmaceuticals) změřena koncentrace neutrálního tuku. U skupiny myší, kterým byl podán Ad/LacZ, nebyla významná odchylka v koncentraci neutrálního tuku v krvi, zatímco významná odchylka v koncentraci neutrálního tuku v krvi (obr. 4) byla detekována mezi skupinou myší, kterým byl podán Ad/mAP-5 a ostatními dvěma skupinami (obr. 4).

Pokud jde o rekombinantní adenovírus (AdhAP5), který má adenovirový vektor do kterého je vložena cDNA nesená fágomidovým klonem #h5-1, byl u něho proveden stejný pokus. Byl tedy exprimován v samci myši KK/San. Jako výsledek bylo zjištěno významné zvýšení koncentrace neutrálního tuku v krvi a bylo tedy zřejmé, že lidský typ molekuly funguje také u myši (obr. 4).

Kromě toho, když byla odebrána celková RNA z jater myší skupiny infikované adenovirem, u kterých byla detekována významná odchylka v koncentraci neutrálního tuku v krvi, a podrobena northernové analýze podle metody popsané v příkladu 1, bylo potvrzeno, že vložený gen byl skutečně exprimován na vysoké hladině (obr. 5). Třebaže zóna detekovaná u skupiny myší KK/San, infikované adenovirem, je větší než zóna detekovaná u myši KK, která nebyla geneticky manipulována, předpokládá se, že účinné místo pro iniciaci transkripce nebo signál pro připojení (póly A) se v rekombinantním adenovirovém vektoru od původního genu liší. V každém případě rozdíl ve velikosti této mRNA neovlivňuje překládanou aminokyselinovou sekvenci, neboť kodon pro ukončení translace se nachází právě na 5'-koncové straně prvního kodonu pro iniciaci translace v cDNA, vložené do rekombinantního adenovirového vektoru ve stejném čtecím rámci.

Příklad 6: Purifikace rekombinantního proteinu a určení aminokyselinové sekvence na N-konci

Transformace živočišné buňky byla provedena následující metodou pomocí expresního vektoru pMEh55-1, který byl vytvořen v příkladu 3 a do něhož byla vložena lidská cDNA s nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí, byl vyčištěn rekombinantní protein sekretovaný do supernatantu kultury transformovaných buněk a byla určena aminokyselinové sekvence na jeho N-konci.

• · · ·

1) Získání transformanty a příprava supernatantu kultury

Buňky CHO (ATCC CRL-9096), kterým chybí reduktáza kyseliny dihydrolistové byly množeny v médiu aMEM (vyrábí Gibco BRL), obsahujícím 10 % FCS (vyrábí Gibco BRL), 10 jednotek/ml penicilinu a 10 pg/ml streptomycinu (výrobek Gibco BRL) a potom transfekovány plazmidem pMEh55-1 o koncentraci 1 pg/10⁶ buněk za použití reagencie pro transfekci (FuGENE6: vyrábí Roche Diagnostics). Buňky byly pěstovány v množství 1.5 x 10⁷ buněk/laboratorní misku na 200 laboratorních miskách pro buněčné kultury (φ 150 mm, vyrábí Coning). Pro transfekci bylo použito 15 pg plazmidu pMEh55-1 na laboratorní misku. Po transfekci byly buňky kultivovány 24 hodin v kultivačním médiu, které obsahuje výše uvedené FCS, a médium bylo zaměněno za aMEM bez séra (30 ml/laboratorní misku). Za tři dny po výměně média bylo sebráno 6 litrů supernatantu bez séra.

2) Purifikace rekombinantního proteinu

1) K 1,6 litru SEPHADEX G25 (vyrábí Amersham Pharmacia biotech), kterým byl naplněn sloupec (stream line C-100: vyrábí Amersham Pharmacia biotech), bylo přilito 600 ml supernatantu z buněčné kultury, který byl získán výše v bodu 1) (rychlost průtoku 20 ml/min). Poté byl přes sloupec ponechán protékat eluční pufr (20 mM TrisHCI (pH 7,5), 0,01% azid sodný (vyrábí Sigma), 0,05% směs inhibitorů proteázy (vyrábí Sigma), 0,05% Tween 20 (vyrábí Sigma)) (dále zde označován jako “roztok A”) rychlostí průtoku 50 ml/min, a bylo odebráno 1500 ml prvních eluátů. Operace byla provedena 10x, čímž bylo provedeno odsolení a odstranění molekul s nízkou molekulární hmotností z 6 litrů supernatantu z buněčné kultury

2) Dále byl eluát získaný výše v bodu 1) frakcionován iontovýměnnou chromatografií pomocí FPLC vybavení (systém Biopilot, vyrábí Amersham Pharmacia biotech) za následujících podmínek.

Sloupec: XK50/100 (vyrábí Amersham Pharmacia biotech) byl naplněn 100 ml Q Sepharose fastflow (vyrábí Amersham Pharmacia biotech).

Složení elučního pufru:

[roztok A] viz odkaz výše [roztok B] 20 mM Tris-HCI, 1 M chlorid sodný (pH 7,5), 0,01 % azid sodný, 0,05 % směs inhibitorů proteázy (vyrábí Sigma), 0,05 % Tween 20 Průtoková rychlost: 10 ml/minutu

Frakcionalizace: 10 ml/zkumavku • ·

Teplota: 4 °C

Eluční podmínky: lineární gradient od 100% roztoku A do 100% roztoku B (za dobu 60 minut), byly odebírány frakce eluované při koncentraci chloridu sodného 0,3 až 0,4 M.

3) U frakce odebrané při iontovýměnné chromatografií výše v bodu 2) byla provedena skupinově specifická afinitní chromatografie za následujících podmínek za pomoci FPLC zařízení.

Sloupec: XK16/40 (vyrábí Amersham Pharmacia biotech) byl naplněn 10 ml Affigel blue (vyrábí Bio-Rad).

Složení elučního pufru:

[roztok C] 20 mM Tris-HCl, 0,5 M chlorid sodný (pH 7,5), 0,01% azid sodný, 0,05% směs inhibitorů proteázy, 0,05% Tween 20 [roztok D] 20 mM Tris-HCl, 1 M chlorid sodný (pH 7,5), 0,01% azid sodný, 0,05% směs inhibitorů proteázy, 0,05% Tween 20 Průtoková rychlost: 1,5 ml/minutu Teplota: 4 °C

Po průchodu frakce odebrané výše v bodu 2) sloupcem byl sloupec promyt 60 ml roztoku C, bylo nalito 100 ml roztoku D a byly odebrány eluáty získané roztokem D.

4) K eluátu získanému výše v bodu 3) bylo přidáno stejné množství (100 ml) roztoku A. Byla u něho provedena skupinově specifická afinitní chromatografie za následujících podmínek uvedených níže a za pomoci FPLC zařízení..

Sloupec: XK16/40 byl naplněn 10 ml Sepharosou 4B s navázaným lektinem z čočky (vyrábí Amersham Pharmacia biotech).

Složení elučního pufru:

[C roztok] popis viz výše [F roztok] 20 mM Tris-HCl, 0,5 M chlorid sodný, 0,3 M methylmannopyranozid (pH 7,5), 0,01 % azid sodný, 0,05% směs inhibitorů proteázy, 0,05% Tween 20 Průtoková rychlost: 1 ml/minutu

Teplota: 4 °C

Po průchodu vzorku sloupcem byl sloupec promyt 50 ml roztoku C, bylo nalito 50 ml roztoku F a byly odebrány eluáty získané roztokem F.

Eluát byl přenesen do dialyzační zkumavky (hranice vylučovaných molekulových hmotností 10 kDa: vyrábí Gibco BRL) a byl dialyzován při teplotě 4 °C přes noc proti 2 litrům PBS(-) modifikovaného podle Dulbecca (vyrábí NISSUI PHARMACEUTICAL • : .* · ’·’ * t · · · · ·

CO., LTD.), který obsahuje 0,01% azid sodný a 0,1% směs inhibitorů proteázy. Potom byl roztok z dialyzační zkumavky odebrán. Ke 4 ml tohoto roztoku byla přidána 1/10 objemu (0,4 ml) TCA obsahující 4 mg/ml deoxycholátu sodného. Získaná sraženina byla odebrána a sraženina získaná přidáním acetonu byla odebrána a potom rozpuštěna v 50 pl sterilní ultračisté vody.

3) Určení aminokyselinové sekvence na N-konci

Ke vzorku vyčištěnému výše v bodu 2) byla přidána PNGázaF (vyrábí New

England Biolab) a odštěpen cukerný řetězec, který se váže na N-konec. Přesněji řečeno, k50 pl vzorku bylo přidáno 6 μΙ pufru 10 x G7 (přiložen kvýše uvedené reagencii PGNázaF), protřepáno a zahříváno ve vroucí lázni po dobu 10 minut. Po ochlazení na teplotu místnosti bylo přidáno 6 μ110% Nonidet P-40 a 6 μΙ pufru 10 x G7 v tomto pořadí (přiložen kvýše uvedené reagencii PGNázaF) a protřepáno. Byly přidány 3 μΙ PGNázyF, mícháno a potom byla směs udržována na vodní lázni při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin nebo déle.

Pokud jde o reakční směs, byla po této reakci, kterou je odstraněn cukerný řetězec vázající se na N-konec, provedena za redukčních podmínek SDS-PAGE za použití gradientového akrylamidového gelu o koncentraci 4 až 20 % (Multi gel 4/20, Daiichikagakuyakuhin) a zařízení pro minielektroforézu (vyrábí Nihoneido). Po elektroforéze byl protein oddělený v gelu přenesen na polyvinylidendifluoridový (PVDF) film (vyrábí Bio-Rad), který má velikost pórů 0,2 pm (2 mA/cm², 4 °C, po dobu 2 hodin) pomocí zařízení pro kopírování gelové membrány (vyrábí Marisol). Po zkopírování byl film po dobu 10 sekund namočen v 100% methanolu (Wako Pure Chem), promýván v ultračisté vodě po dobu 2 minut, barven po dobu 5 minut barvícím roztokem Coomasie (vyrábí Bio-Rad) a potom byla membrána ponořena po dobu 2 hodin do methanolu kvůli odbarvení. Jako výsledek byla vidět zóna odpovídající 50 kDa. Část zóny na filmu byla odříznuta a byla analyzována sekvence na N-konci pomocí zařízení pro zjišťování proteinové sekvence (PPSQ-10, vyrábí Shimadzu Seisakusho).

Aminokyselinová sekvence na N-konci u výše uvedené zóny, odpovídající 50 kDa, byla následující:

Ser-Arg-lle-Asp-GIn-Asp-Asn-Ser-Ser-Phe-Asp (aminokyseliny číslo 17 až 27 ze SEQ ID No. 4 v seznamu sekvencí).

Tedy savčí buňkou byl jakožto zralý protein vylučován protein kódovaný nukleotidovou sekvencí, uvedenou jako nukleotidy číslo 78 až 1457 ze SEQ ID No. 3 v • · seznamu sekvencí, poté co bylo 16 zbytků z N-konce (aminokyseliny číslo 1 až 16 ze

SEQ ID No. 4 v seznamu sekvencí) odštěpeno, a na jeho N-konci je serinový zbytek, který po nich bezprostředně následuje.

Průmyslová využitelnost

Jak je popsáno výše, tímto předloženým vynálezem bylo potvrzeno, že geny obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou jako nukleotidy číslo 47 až 1411 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí a nukleotidovou sekvenci uvedenou jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí, jsou dědičnou dispozicí, která zvyšuje koncentraci neutrálního tuku v krvi a proto látky, které kontrolují úroveň exprese těchto genů, mohou sloužit jako terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii. Tedy metoda předloženého vynálezu, polynukleotid použitý jako sonda nebo primer při postupu, který detekuje nukleovou kyselinu a protilátka použitá při postupu, který podobným způsobem detekuje polypeptid, jsou vhodné pro léčení hyperlipidemie nebo pro vyhledávání terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemii.

• * • ·*·

Seznam sekvencí <110> Sankyo Company, Limited <120> Způsob testováni účinku látky, polynukleotid, DNA, protilátka, souprava pro testováni, použiti polynukleotidu, použiti polypeptidů, použiti protilátky, RNA a terapeutické činidlo <130> FP-200054 <140>

<141>

<150> JP Hll-349976 <151> 1999-12-09 <160> 11 <170> Patentln version 2.0 <210> 1 <211> 1604 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (47)..(1411) <223>

<400> 1 ggcacgaggt tccaaattgc ttaaaattga ataattgaga caaaaa atg cac aca Met His Thr 1 att aaa tta ttc ctt ttt gtt gtt cct tta gta Ile Lys Leu Phe Leu Phe Val Val Pro Leu Val

10 att gca tcc aga gtg Ile Ala Ser Arg Val 15

103 • ·

» *» · « · • ·

gat Asp 20

cca Pro

gac Asp

ctt Leu

tca Ser

tca Ser 25

ttt Phe

gat Asp

tet Ser

gca Ala

cct Pro 30

tca Ser

gag Glu

cca Pro

aaa Lys

tca Ser 35

151

aga

ttt

gct

atg

ttg

gat

gtc

aaa

att

tta

gcg

aat

ggc

ctc

ctg

199

Arg

Phe

Ala

Met

Leu 40

Asp

Val

Lys

Ile 45

Leu

Ala

Asn

Gly

Leu 50

Leu

cag

ctg

ggt

cat

gga

ctt

aaa

gat

ttt

gtc

cat

aag

act

aag

gga

caa

247

Gin

Leu

Gly

His 55

Gly

Leu

Lys

Asp

Phe 60

Val

His

Lys

Thr

Lys 65

Gly

Gin

att

aac

gac

ata

ttt

cag

aag

ctc

aac

ata

ttt

gat

cag

tet

ttt

tat

295

Ile

Asn

Asp 70

Ile

Phe

Gin

Lys

Leu 75

Asn

Ile

Phe

Asp

Gin 80

Ser

Phe

Tyr

gac

cta

tca

ctt

ega

acc

aat

gaa

atc

aaa

gaa

gag

gaa

aag

gag

cta

343

Asp

Leu 85

Ser

Leu

Arg

Thr

Asn 90

Glu

Ile

Lys

Glu

Glu 95

Glu

Lys

Glu

Leu

aga

act

aca

tet

aca

cta

caa

gtt

aaa

aac

gag

gtg

aag

aac

391

Arg 100

Arg

Thr

Ser

Thr 105

Leu

Gin

Val

Lys

Asn 110

Glu

Val

Lys

Asn 115

atg

tca

gta

gaa

ctg

aac

tca

aag

ctt

gag

agt

ctg

gaa

gag

aag

439

Met

Ser

Val

Glu

Leu 120

Asn

Ser

Lys

Leu

Glu 125

Ser

Leu

Glu

Glu 130

Lys

aca

gcc

ctt

caa

cac

aag

gtc

agg

gct

ttg

gag

cag

cta

acc

aac

487

Thr

Ala

Leu

Gin 135

His

Lys

Val

Arg

Ala 140

Leu

Glu

Gin

Leu 145

Thr

Asn

tta

att

cta

agc

cca

gct

ggg

gct

cag

gag

cac

cca

gaa

gta

aca

tca

535

Leu

Ile

Leu 150

Ser

Pro

Ala

Gly

Ala 155

Gin

Glu

His

Pro

Glu 160

Val

Thr

Ser

ctc

aaa

agt

ttt

gta

gaa

cag

caa

gac

aac

agc

ata

aga

gaa

ctc

583

Leu

Lys 165

Ser

Phe

Val

Glu

Gin 170

Gin

Asp

Asn

Ser

Ile 175

Arg

Glu

Leu

cag

agt

gtg

gaa

cag

tat

aaa

caa

tta

agt

caa

cag

cac

atg

cag

631

Gin 180

Ser

Val

Glu

Gin 185

Tyr

Lys

Gin

Leu

Ser 190

Gin

His

Met

Gin 195

ata

aaa

gaa

ata

gaa

aag

cag

ctc

aga

aag

act

ggt

att

caa

gaa

CCC

679

Ile

Lys

Glu

Ile

Glu 200

Lys

Gin

Leu

Arg

Lys 205

Thr

Gly

Ile

Gin

Glu 210

Pro

tca

gaa

aat

tet

ctt

tet

aaa

tca

aga

gca

cca

aga

act

CCC

727

Ser

Glu

Asn

Ser 215

Leu

Ser

Lys

Ser 220

Arg

Ala

Pro

Arg

Thr 225

Thr

Pro

cct

ctt

caa

ctg

aac

gaa

aca

gaa

aat

aca

gaa

caa

gat

gac

ctt

cct

775

Pro

Leu

Gin 230

Leu

Asn

Glu

Thr

Glu 235

Asn

Thr

Glu

Gin

Asp 240

Asp

Leu

Pro

gcc

gac

tgc

tet

gcc

gtt

tat

aac

aga

ggc

gaa

cat

aca

agt

ggc

gtg

823

Ala

Asp 245

Cys

Ser

Ala

Val

Tyr 250

Asn

Arg

Gly

Glu

His 255

Thr

Ser

Gly

Val

tac

act

att

aaa

cca

aga

aac

tcc

caa

ggg

ttt

aat

gtc

tac

tgt

gat

871

Tyr 260

Thr

Ile

Lys

Pro

Arg 265

Asn

Ser

Gin

Gly

Phe 270

Asn

Val

Tyr

Cys

Asp 275

acc

caa

tca

ggc

agt

cca

tgg

aca

tta

att

caa

cac

cgg

aaa

gat

ggc

919

Thr

Gin

Ser

Gly

Ser

Pro

Trp

Thr

Leu

Ile

Gin

His

Arg

Lys

Asp

Gly

280

62 285

» » • · • < • < • ’ • ·

• I · l * » » • 290

« * ♦ · » * • · · • · • »

v · . · • · · • · » · . · · * ·

tca

cag

gac

ttc

aac

gaa

aca

tgg

gaa

aac

tac

gaa

aag

ggc

ttt

ggg

967

Ser

Gin

Asp

Phe

Asn

Glu

Thr

Trp

Glu

Asn

Tyr

Glu

Lys

Gly

Phe

Gly

295

300

305

agg

ctc

gat

gga

gaa

ttt

tgg

ttg

ggc

cta

gag

aag

atc

tat

gct

ata

1015

Arg

Leu

Asp

Gly

Glu

Phe

Trp

Leu

Gly

Leu

Glu

Lys

Ile

Tyr

Ala

Ile

310

315

320

gtc

caa

cag

tet

aac

tac

att

tta

ega

ctc

gag

cta

caa

gac

tgg

aaa

1063

Val

Gin

Ser

Asn

Tyr

Ile

Leu

Arg

Leu

Glu

Leu

Gin

Asp

Trp

Lys

325

330

335

gac

agc

aag

cac

tac

gtt

gaa

tac

tcc

ttt

cac

ctg

ggc

agt

cac

gaa

1111

Asp

Ser

Lys

His

Tyr

Val

Glu

Tyr

Ser

Phe

His

Leu

Gly

Ser

His

Glu

340

345

350

355

acc

aac

tac

acg

cta

cat

gtg

gct

gag

att

gct

ggc

aat

atc

cct

ggg

1159

Thr

Asn

Tyr

Thr

Leu

His

Val

Ala

Glu

Ile

Ala

Gly

Asn

Ile

Pro

Gly

360

365

370

gcc

ctc

cca

gag

cac

aca

gac

ctg

atg

ttt

tet

aca

tgg

aat

cac

aga

1207

Ala

Leu

Pro

Glu

His

Thr

Asp

Leu

Met

Phe

Ser

Thr

Trp

Asn

His

Arg

375

380

385

gca

aag

gga

cag

ctc

tac

tgt

cca

gaa

agt

tac

tca

ggt

ggc

tgg

1255

Ala

Lys

Gly

Gin

Leu

Tyr

Cys

Pro

Glu

Ser

Tyr

Ser

Gly

Trp

390

395

400

tgg

aat

gac

ata

tgt

gga

gaa

aac

cta

aat

gga

aaa

tac

aac

aaa

1303

Trp

Asn

Asp

Ile

Cys

Gly

Glu

Asn

Leu

Asn

Gly

Lys

Tyr

Asn

Lys

405

410

415

ccc

aga

acc

aaa

tcc

aga

cca

gag

aga

ggg

atc

tac

tgg

aga

1351

Pro

Arg

Thr

Lys

Ser

Arg

Pro

Glu

Arg

Gly

Ile

Tyr

Trp

Arg

420

425

430

435

cct

cag

agc

aga

aag

ctc

tat

gct

atc

aaa

tca

tcc

aaa

atg

ctc

1399

Pro

Gin

Ser

Arg

Lys

Leu

Tyr

Ala

Ile

Lys

Ser

Lys

Met

Leu

440 445 450 cag ccc acc acc taagaagctt caactgaact gagacaaaat aaaagatcaa 1451

Gin Pro Thr Thr

455

taaattaaat	attaaagtcc tcccgatcac tgtagtaatc tggtattaaa attttaatgg	1511
aaagcttgag	aattgaattt caattaggtt taaactcatt gttaagatca gatatcaccg	1571
aatcaacgta	aacaaaattt atctttttca atc	1604

<210> 2 <211> 455 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2

Met His Thr Ile Lys Leu Phe Leu Phe Val Val Pro Leu Val Ile Ala

Ser Arg Val Asp Pro Asp Leu Ser Ser Phe Asp Ser Ala Pro Ser Glu

25 30 < » r · • <

* * • * * * · ··· ·

Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45

Gly Leu Leu Gin Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60

Lys Gly Gin Ile Asn Asp Ile Phe Gin Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gin 65 70 75 80

Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Arg Thr Asn Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95

Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Ser Thr Leu Gin Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110

Val Lys Asn Met Ser Val Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125

Glu Glu Lys Thr Ala Leu Gin His Lys Val Arg Ala Leu Glu Glu Gin 130 135 140

Leu Thr Asn Leu Ile Leu Ser Pro Ala Gly Ala Gin Glu His Pro Glu 145 150 155 160

Val Thr Ser Leu Lys Ser Phe Val Glu Gin Gin Asp Asn Ser Ile Arg 165 170 175

Glu Leu Leu Gin Ser Val Glu Glu Gin Tyr Lys Gin Leu Ser Gin Gin 180 185 190

His Met Gin Ile Lys Glu Ile Glu Lys Gin Leu Arg Lys Thr Gly Ile 195 200 205

Gin Glu Pro Ser Glu Asn Ser Leu Ser Ser Lys Ser Arg Ala Pro Arg 210 215 220

Thr Thr Pro Pro Leu Gin Leu Asn Glu Thr Glu Asn Thr Glu Gin Asp 225 230 235 240

Asp Leu Pro Ala Asp Cys Ser Ala Val Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 245 250 255

Ser Gly Val Tyr Thr Ile Lys Pro Arg Asn Ser Gin Gly Phe Asn Val 260 265 270

• ·

Pro Trp Thr Leu Ile Gin His Arg

285 w···

··

Tyr Cys Asp Thr Gin Ser Gly Ser 275 280

Lys Asp Gly Ser Gin Asp Phe Asn 290 295

Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Glu Lys 300

Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu 305 310

Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 315 320

Tyr Ala Ile Val Gin Gin Ser Asn 325

Tyr Ile Leu Arg Leu Glu Leu Gin 330 335

Asp Trp Lys Asp Ser Lys His Tyr 340

Val Glu Tyr Ser Phe His Leu Gly 345 350

Ser His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu 355 360

His Val Ala Glu Ile Ala Gly Asn 365

Ile Pro Gly Ala Leu Pro Glu His 370 375

Thr Asp Leu Met Phe Ser Thr Trp 380

Asn His Arg Ala Lys Gly Gin Leu 385 390

Tyr Cys Pro Glu Ser Tyr Ser Gly 395 400

Gly Trp Trp Trp Asn Asp Ile Cys 405

Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 410 415

Tyr Asn Lys Pro Arg Thr Lys Ser 420

Arg Pro Glu Arg Arg Arg Gly Ile 425 430

Tyr Trp Arg Pro Gin Ser Arg Lys 435 440

Leu Tyr Ala Ile Lys Ser Ser Lys 445

Met Met Leu Gin Pro Thr Thr 450 455 <210> 3 <211> 1716 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (78)..(1457) <223>

• · · · • * <400> 3 gcggccgcgt cgacgtctag gtctgcttcc agaagaaaac agttccacgt tgcttgaaat 60

tgaaaatcaa gataaaa atg ttc aca att aag ctc ctt ctt ttt att gtt Met Phe Thr Ile Lys Leu Leu Leu Phe Ile Val

110

1

5

10

cct

cta

gtt

att

tcc

aga

att

gat

caa

gac

aat

tca

ttt

gat

158

Pro

Leu

Val

Ile

Ser

Arg

Ile

Asp

Gin

Asp

Asn

Ser

Phe

Asp

15

20

25

tet

cta

tet

cca

gag

cca

aaa

tca

aga

ttt

get

atg

tta

gac

gat

gta

206

Ser

Leu

Ser

Pro

Glu

Pro

Lys

Ser

Arg

Phe

Ala

Met

Leu

Asp

Val

30

35

40

aaa

att

tta

gcc

aat

ggc

ctc

ctt

cag

ttg

gga

cat

ggt

ctt

aaa

gac

254

Lys

Ile

Leu

Ala

Asn

Gly

Leu

Gin

Leu

Gly

His

Gly

Leu

Lys

Asp

45

50

55

ttt

gtc

cat

aag

acg

aag

ggc

caa

att

aat

gac

ata

ttt

caa

aaa

ctc

302

Phe

Val

His

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Ile

Asn

Asp

Ile

Phe

Gin

Lys

Leu

60

65

70

75

aac

ata

ttt

gat

cag

tet

ttt

tat

gat

cta

tcg

ctg

caa

acc

agt

gaa

350

Asn

Ile

Phe

Asp

Gin

Ser

Phe

Tyr

Asp

Leu

Ser

Leu

Gin

Thr

Ser

Glu

80

85

90

atc

aaa

gaa

aag

gaa

ctg

aga

act

aca

tat

aaa

cta

caa

398

Ile

Lys

Glu

Lys

Glu

Leu

Arg

Thr

Tyr

Lys

Leu

Gin

95

100

105

gtc

aaa

aat

gaa

gag

gta

aag

aat

atg

tca

ctt

gaa

ctc

aac

tca

aaa

446

Val

Lys

Asn

Glu

Val

Lys

Asn

Met

Ser

Leu

Glu

Leu

Asn

Ser

Lys

110

115

120

ctt

gaa

agc

ctc

cta

gaa

aaa

att

cta

ctt

caa

aaa

gtg

aaa

494

Leu

Glu

Ser

Leu

Glu

Lys

Ile

Leu

Gin

Lys

Val

Lys

125

130

135

tat

tta

gaa

gag

caa

cta

act

aac

tta

att

caa

aat

caa

cct

gaa

act

542

Tyr

Leu

Glu

Gin

Leu

Thr

Asn

Leu

Ile

Gin

Asn

Gin

Pro

Glu

Thr

140

145

150

155

cca

gaa

cac

cca

gaa

gta

act

tca

ctt

aaa

act

ttt

gta

gaa

aaa

caa

590

Pro

Glu

His

Pro

Glu

Val

Thr

Ser

Leu

Lys

Thr

Phe

Val

Glu

Lys

Gin

160

165

170

gat

aat

agc

atc

aaa

gac

ctt

ctc

cag

acc

gtg

gaa

gac

caa

tat

aaa

638

Asp

Asn

Ser

Ile

Lys

Asp

Leu

Gin

Thr

Val

Glu

Asp

Gin

Tyr

Lys

175

180

185

caa

tta

aac

caa

cag

cat

agt

caa

ata

aaa

gaa

ata

gaa

aat

cag

ctc

686

Gin

Leu

Asn

Gin

His

Ser

Gin

Ile

Lys

Glu

Ile

Glu

Asn

Gin

Leu

190

195

200

aga

agg

act

agt

att

caa

gaa

ccc

aca

gaa

att

tet

cta

tet

tcc

aag

734

Arg

Thr

Ser

Ile

Gin

Glu

Pro

Thr

Glu

Ile

Ser

Leu

Ser

Lys

205

210

215

cca

aga

gca

cca

aga

act

ccc

ttt

ctt

cag

ttg

aat

gaa

ata

aga

782

Pro

Arg

Ala

Pro

Arg

Thr

Pro

Phe

Leu

Gin

Leu

Asn

Glu

Ile

Arg

220

225

230

235

aat Asn

gta Val

aaa Lys

cat His

gat Asp 240

ggc att Gly Ile

cct Pro

get Ala

gaa Glu 245

tgt Cys

acc Thr

att Ile

tat Tyr 250

aac Asn

830

aga

ggt

gaa

cat

aca

agt

ggc

atg

tat

gcc

atc

aga

ccc

age

aac

tet

878

Arg

Gly

Glu

His

Thr

Ser

Gly

Met

Tyr

Ala

Ile

Arg

Pro

Ser

Asn

Ser

255

260

265

caa

gtt

ttt

cat

gtc

tac

tgt

gat

gtt

ata

tea

ggt

agt

cca

tgg

aca

926

Gin

Val

Phe

His

Val

Tyr

Cys

Asp

Val

Ile

Ser

Gly

Ser

Pro

Trp

Thr

270

275

280

tta

att

caa

cat

ega

ata

gat

gga

tea

caa

aac

ttc

aat

gaa

a cg

tgg

974

Leu

Ile

Gin

His

Arg

Ile

Asp

Gly

Ser

Gin

Asn

Phe

Asn

Glu

Thr

Trp

285

290

295

gag

aac

tac

aaa

tat

ggt

ttt

ggg

agg

ctt

gat

gga

gaa

ttt

tgg

ttg

1022

Glu

Asn

Tyr

Lys

Tyr

Gly

Phe

Gly

Arg

Leu

Asp

Gly

Glu

Phe

Trp

Leu

300

305

310

315

ggc

cta

gag

aag

ata

tac

tcc

ata

gtg

aag

caa

tet

aat

tat

gtt

tta

1070

Gly

Leu

Glu

Lys

Ile

Tyr

Ser

Ile

Val

Lys

Gin

Ser

Asn

Tyr

Val

Leu

320

325

330

ega

att

gag

ttg

gaa

gac

tgg

aaa

gac

aac

aaa

cat

tat

att

gaa

tat

1118

Arg

Ile

Glu

Leu

Glu

Asp

Trp

Lys

Asp

Asn

Lys

His

Tyr

Ile

Glu

Tyr

335

340

345

tet

ttt

tac

ttg

gga

aat

cac

gaa

acc

aac

tat

a cg

cta

cat

cta

gtt

1166

Ser

Phe

Tyr

Leu

Gly

Asn

His

Glu

Thr

Asn

Tyr

Thr

Leu

His

Leu

Val

350

355

360

gcg

att

act

ggc

aat

gtc

ccc

aat

gca

atc

ccg

gaa

aac

aaa

gat

ttg

1214

Ala

Ile

Thr

Gly

Asn

Val

Pro

Asn

Ala

Ile

Pro

Glu

Asn

Lys

Asp

Leu

365

370

375

gtg

ttt

tet

act

tgg

gat

cac

aaa

gca

aaa

gga

cac

ttc

aac

tgt

cca

1262

Val

Phe

Ser

Thr

Trp

Asp

His

Lys

Ala

Lys

Gly

His

Phe

Asn

Cys

Pro

380

385

390

395

gag

ggt

tat

tea

gga

ggc

tgg

cat

gat

gag

tgt

gga

gaa

aac

1310

Glu

Gly

Tyr

Ser

Gly

Trp

His

Asp

Glu

Cys

Gly

Glu

Asn

400

405

410

aac

cta

aat

ggt

aaa

tat

aac

aaa

cca

aga

gca

aaa

tet

aag

cca

gag

1358

Asn

Leu

Asn

Gly

Lys

Tyr

Asn

Lys

Pro

Arg

Ala

Lys

Ser

Lys

Pro

Glu

415

420

425

agg

aga

gga

tta

tet

tgg

aag

tet

caa

aat

gga

agg

tta

tac

tet

1406

Arg

Gly

Leu

Ser

Trp

Lys

Ser

Gin

Asn

Gly Arg

Leu

Tyr

Ser

430

435

440

ata

aaa

tea

acc

aaa

atg

ttg

atc

cat

cca

aca

gat

tea

gaa

age

ttt

1454

Ile

Lys

Ser

Thr

Lys

Met

Leu

Ile

His

Pro

Thr

Asp

Ser

Glu

Ser

Phe

445

450

455

gaa tgaactgagg caaatttaaa aggcaataat ttaaacatta acctcattcc 1507

Glu

460 aagttaatgt tttttttatc ggtctaataa ttaaagtcac tctggtatta aatccttaag agaaagcttg agaaatagat tgtctattta agattaaaca tacaatcaca taaccttaaa

1567

1627 gaataccgtt tacatttctc aatcaaaatt cttataatac tatttgtttt aaattttgtg 1687 • « atgtgggaat caattttaga tggtcacaa <210> 4 <211> 460 <212> PRT <213> Homo sapiens

1716

<400>	4
Met 1	Phe	Thr	Ile	Lys 5	Leu	Leu	Leu
Ser	Arg	Ile	Asp 20	Gin	Asp	Asn	Ser
Pro	Lys	Ser 35	Arg	Phe	Ala	Met	Leu 40
Gly	Leu 50	Leu	Gin	Leu	Gly	His 55	Gly
Lys 65	Gly	Gin	Ile	Asn	Asp 70	Ile	Phe
Ser	Phe	Tyr	Asp	Leu 85	Ser	Leu	Gin
Lys	Glu	Leu	Arg	Arg	Thr	Thr	Tyr

100

Phe Ile Val Pro Leu Val Ile Ser 10 15

Ser Phe Asp Ser Leu Ser Pro Glu 25 30

Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 45

Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 60

Gin Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gin 75 80

Thr Ser Glu Ile Lys Glu Glu Glu 90 95

Lys Leu Gin Val Lys Asn Glu Glu 105 110

Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125

Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gin Gin Lys Val Lys Tyr Leu Glu Glu Gin 130 135 140

Leu Thr Asn Leu Ile Gin Asn Gin Pro Glu Thr Pro Glu His Pro Glu 145 150 155 160

Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gin Asp Asn Ser Ile Lys 165 170 175

Asp Leu Leu

Gin Thr Val 180

Glu Asp Gin Tyr Lys 185

Gin Leu Asn Gin Gin 190

His Ser Gin Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gin Leu Arg Arg Thr Ser Ile 195 200 205 • *

Gin Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg

210 215 220 • · ···· ·· • · · ♦ • · · ·

Thr Thr Pro Phe Leu Gin Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 225 230 235 240

Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 245 250 255

Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gin Val Phe His Val 260 265 270

Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gin His Arg 275 280 285

Ile Asp Gly Ser Gin Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 290 295 300

Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320

Tyr Ser Ile Val Lys Gin Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 325 330 335

Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 340 345 350

Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 355 360 365

Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 370 375 380

Asp His Lys TVla Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 385 390 395 400

Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 405 410 415

Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 420 425 430

Ser Trp Lys Ser Gin Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 435 440 445

Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 450 455 460

<210>	5
<211>	23
<212>	DNA
<213>	Mus musculus
<400>	5

gactgatcaa atatgttgag ctt 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus

<400> 6 tgcatccaga gtggatccag a <210> 7	21
<211> <212> <213>	21 DNA Homo sapiens
<400>	7
tcctctagtt atttcctcca g	21
<210>	8
<211>	20
<212>	DNA
<213>	homo sapiens
<400>	8
tggtttgcca gcgatagatc	20
<210>	9
<211>	14
<212>	PRT

<213> Umělá sekvence • · • · • · · · <220>

<223> Popis umělé sekvence: Syntetický antigen pro získáni polyklonální <400> 9

Glu Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp oligopeptid, který je použit protilátky jako

Asp Val Lys Cys

1	5	10
<210>	10
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	10
Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn	Gly Lys Tyr
1	5	10
<210>	11
<211>	199
<212>	DNA
<213>	Mus musculus
<400>	11

Asn Lys Pro Arg ttgcatccag caagatttgc atggacttaa agtggatcca tatgttggat agattttgtc gacctttcat gatgtcaaaa cataagacta catttgattc ttttagcgaa agggacaaat tgcaccttca tggcctcctg taacgacata gagccaaaat cagctgggtc tttcagaagc

120

180 tcaacatatt tgatcagtc

199 • · · ·

VO • · · · “ · · • · · · · *

Claims

1 v seznamu sekvencí;

b) nukleotidové sekvence uvedená jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No.

1) kultivace buněk v přítomnosti nebo nepřítomnosti testované látky;

1. Způsob testování účinku látky jako terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemii, vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:

2) měření koncentrace neutrálního tuku v krvi živočicha uvedeného v bodu 1)

2) detekování úrovně produkce polypeptidu, který má aminokyselinovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí jakékoli z následujících sekvencí a) až e) nebo její částí, v supernatantu kultivovaných buněk, získaných výše v bodu 1), za pomoci protilátky, která polypeptid specificky rozpoznává:

a) nukleotidová sekvence uvedená jako nukleotidy číslo 47 až 1411 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí;

b) nukleotidová sekvence uvedená jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí;

c) nukleotidová sekvence DNA vložená do fágomidu, neseného v transformované Escherichia coli E.coli pBK/m55-1 SANK72199 (FERM BP6940) ;

d) nukleotidová sekvence DNA vložená do fágomidu, neseného v transformované Escherichia coli E.coli pTrip/h55-1 SANK72299 (FERM BP6941) ;

e) nukleotidová sekvence která za striktních podmínek hybridizuje s polynukleotidem obsahujícím protismyslnou sekvenci k nukleotidové sekvenci popsané v kterémkoli z výše uvedených bodů a) až d) a kóduje polypeptid, který má schopnost zvyšovat koncentraci neutrálního tuku v krvi; a

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kultivované buňky pocházejí z jater.

2) detekování úrovně exprese mRNA, která má nukleotidovou sekvenci kterékoli z následujících sekvencí a) až e) (avšak t v sekvenci je čteno jako u) v kultivovaných buňkách, získaných v bodu 1):

a) nukieotidová sekvence uvedená jako nukleotidy číslo 47 až 1411 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí;

b) nukieotidová sekvence uvedená jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí;

c) nukieotidová sekvence DNA vložená do fágomidu, neseného v transformované Escherichia coli E.coli pBK/m55-1 SANK72199 (FERM BP6940) ;

d) nukieotidová sekvence DNA vložená do fágomidu, neseného v transformované Escherichia coli E.coli pTrip/h55-1 SANK72299 (FERM BP6941) ;

e) nukieotidová sekvence která za striktních podmínek hybridizuje s polynukleotidem obsahujícím protismyslnou sekvenci k nukleotidové sekvenci popsané v kterémkoli z výše uvedených bodů a) až d) a kóduje polypeptid, který má schopnost zvyšovat koncentraci neutrálního tuku v krvi; a

3 v seznamu sekvencí;

c) nukleotidové sekvence DNA vložená do fágomidu, neseného v transformované

Escherichia coli E.coli pBK/m55-1 SANK72199 (FERM BP-6940);

d) nukleotidové sekvence DNA vložená do fágomidu, neseného v transformované

Escherichia coli E.coli pTrip/h55-1 SANK72299 (FERM BP-6941);

e) nukleotidové sekvence která za striktních podmínek hybridizuje s polynukleotidem obsahujícím protismyslnou sekvenci k nukleotidové sekvenci popsané v kterémkoli z výše uvedených bodů a) až d) a kóduje polypeptid, který má schopnost zvyšovat koncentraci neutrálního tuku v krvi.

3) jakožto výsledek detekce ve výše uvedeném kroku 2) porovnání úrovně exprese polypeptidu mezi buňkami kultivovanými v nepřítomnosti látky a buňkami kultivovanými v přítomnosti látky.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že kultivované buňky pocházejí z primáta nebo hlodavce.

3) jakožto výsledek detekce ve výše uvedeném kroku 2) porovnání úrovně exprese mRNA mezi buňkami kultivovanými v nepřítomnosti látky a buňkami kultivovanými v přítomnosti látky.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že kultivované buňky pocházejí z člověka nebo myši.

5. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že způsobem detekce množství exprimované mRNA je northernová analýza nebo tečková hybridizace.

6. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že způsobem detekce množství exprimované mRNA je RT-PCR.

7. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že metodou detekce množství exprimované mRNA je test protekce proti ribonukleáze.

8. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že metodou detekce množství exprimované mRNA je „run on“ test.

9 · » · · · W » · • · · » » * · « * « « ·· · · · · ·«· · * • · l ···· ♦ * · yy . » ·> »► ·· ···· číslo 19 až 455 v téže sekvenci, která byla uvedena výše, nebo její část, nebo polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako aminokyseliny číslo 17 až 460 v SEQ ID No. 4 v seznamu sekvencí nebo její část, pro přípravu protilátky, používané pro testování terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemii.

• 9 • · * · « » « ·

9. Polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která za striktních podmínek hybridizuje s mRNA obsahující jakoukoli nukleotidovou sekvenci, vybranou z následujících a) až d) (avšak t v sekvenci je čteno jako u) [s výjimkou těch, které obsahují sekvenci uvedenou v následujících a) až d)]:

a) nukleotidové sekvence uvedená jako nukleotidy číslo 47 až 1411 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí;

b) nukleotidové sekvence uvedená jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí;

c) nukleotidové sekvence DNA vložená do fágomidu, neseného v transformované Escherichia coli E.coli pBK/m55-1 SANK72199 (FERM BP-6940);

d) nukleotidové sekvence DNA vložená do fágomidu, neseného v transformované Escherichia coli E.coli pTrip/h55-1 SANK72299 (FERM BP-6941);

10. DNA obsahující alespoň 15 nukleotidů z nukleotidové sekvence uvedené jako nukleotidy číslo 47 až 1411 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí, přičemž jeden nebo více nukleotidů na jednom nebo obou jejích koncích chybí.

11. DNA obsahující alespoň 15 nukleotidů z nukleotidová sekvence uvedené jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 1 v seznamu sekvencí, přičemž jeden nebo více nukleotidů na jednom nebo obou jejích koncích chybí.

12. Způsob testování účinku látky jako terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemii, vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že protilátka, která specificky rozpoznává polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci kódovanou jakoukoli ze sekvencí a) až e) nebo jejich částí, je protilátka, která specificky rozpoznává polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako aminokyseliny číslo 17 až 455 v SEQ ID No. 2 v seznamu sekvencí nebo její část, polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako aminokyseliny číslo 19 až 455 v téže sekvenci nebo její část nebo polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako aminokyseliny číslo 17 až 460 v SEQ ID No. 4 v seznamu sekvencí nebo její část.

14. Způsob podle nároku 12 nebo 13, vyznačující se tím, že protilátka, která specificky rozpoznává polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci kódovanou jakoukoli ze sekvencí a) až e) nebo jejich částí, je protilátka, která specificky rozpoznává aminokyselinovou sekvenci uvedenou v aminokyselinové sekvenci uvedené jako aminokyseliny číslo 1 až 13 v SEQ ID No. 9 nebo aminokyseliny číslo 1 až 14 v SEQ ID No. 10 v seznamu sekvencí.

15. Způsob podle kteréhokoli z nároků 12 až 14, vyznačující se tím, že způsob detekce pomocí protilátky, která specificky rozpoznává polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci kódovanou jakoukoli ze sekvencí a) až e) nebo jejich částí, je westernová analýza nebo tečková hybridizace.

16. Způsob podle kteréhokoli z nároků 12až14, vyznačující se tím, že způsob detekce pomocí protilátky, která specificky rozpoznává polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci kódovanou jakoukoli ze sekvencí a) až e) nebo jejich částí, je enzymatický imunologický test na pevné fázi (metoda ELISA) nebo radioizotopový imunologický test (metoda RIA).

17. Protilátka, která specificky rozpoznává polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci kódovanou jakoukoli ze sekvencí a) až e) nebo její částí:

a) nukleotidová sekvence uvedená jako nukleotidy číslo 47 až 1411 v SEQ ID No.

18. Protilátka podle nároku 17, která specificky rozpoznává aminokyselinovou sekvenci uvedenou v aminokyselinové sekvenci uvedené jako aminokyseliny číslo 1 až 13 v SEQ ID No. 9 nebo aminokyseliny číslo 1 až 14 v SEQ ID No. 10 v seznamu sekvencí.

19. Souprava pro testování terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemii, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku z nároku 17 nebo 18.

20. Způsob testování účinku látky jako terapeutické nebo preventivní činidlo proti hyperlipidemii, vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky: 1) podání testované látky živočichovi jinému než je člověk, který byl získán genetickou manipulací, při níž je cizí gen, obsahující kteroukoli nukleotidovou sekvenci uvedenou v následujících bodech a) až e), vnesen tak, že tento gen může být silně exprimován;

c) nukleotidové sekvence DNA vložená do fágomidu, neseného v transformované Escherichia coli E.coli pBK/m55-1 SANK72199 (FERM BP6940);

• ·

d) nukleotidová sekvence DNA vložená do fágomidu, neseného v transformované Escherichia coli E.coli pTrip/h55-1 SANK72299 (FERM BP6941);

21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že živočichem v bodu 1) jiným než je člověk, je myš.

22. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že způsobem pro vnesení cizího genu do živočicha jiného než je člověk, je infekce živočicha adenovirem, který obsahuje adenovirový vektor, do kterého byl vložen gen.

23. Použití polynukleotidu, který má nukleotidovou sekvenci hybridizující za striktních podmínek s mRNA, obsahující nukleotidovou sekvenci z kterékoli z následujících sekvencí a) až e) (avšak t v sekvenci je čteno jako u), pro výrobu sondy, používané pro léčení hyperlipidemie.

c) nukleotidová sekvence DNA vložená do fágomidu, neseného v transformované Escherichia coli E.coli pBK/m55-1 SANK72199 (FERM BP-6940);

d) nukleotidová sekvence DNA vložená do fágomidu, neseného v transformované Escherichia coli E.coli pTrip/h55-1 SANK72299 (FERM BP-6941);

24. Použití polypeptidů obsahujícího aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako aminokyseliny číslo 17 až 455 v SEQ ID No. 2 v seznamu sekvencí nebo její část, polypeptidů obsahujícího aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako aminokyseliny « »

25. Použití protilátky, která specificky rozpoznává polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako aminokyseliny číslo 17 až 455 v SEQ ID No. 2 v seznamu sekvencí nebo její část, polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako čísla 19 až 455 v téže sekvenci, která byla uvedena výše, nebo její část, nebo polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako aminokyseliny číslo 17 až 460 v SEQ ID No. 4 v seznamu sekvencí nebo její část, pro výrobu soupravy pro testování terapeutického nebo preventivního činidla proti hyperlipidemii.

26. DNA nebo RNA obsahující protismyslnou sekvenci k nukleotidové sekvenci, která obsahuje 15 až 30 po sobě následujících nukleotidů z nukleotidové sekvence, uvedené jako nukleotidy číslo 78 až 1457 v SEQ ID No. 3 v seznamu sekvencí.

27. Terapeutické činidlo pro hyperlipidemii, vyznačující se tím, že obsahuje DNA nebo RNA podle nároku 26.