[go: up one dir, main page]

CZ20021701A3 - Místně řízená mutageneze fytázy z Escherichia coli - Google Patents

Místně řízená mutageneze fytázy z Escherichia coli Download PDF

Info

Publication number
CZ20021701A3
CZ20021701A3 CZ20021701A CZ20021701A CZ20021701A3 CZ 20021701 A3 CZ20021701 A3 CZ 20021701A3 CZ 20021701 A CZ20021701 A CZ 20021701A CZ 20021701 A CZ20021701 A CZ 20021701A CZ 20021701 A3 CZ20021701 A3 CZ 20021701A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
phytase
amino acid
mutant
acid phosphatase
host cell
Prior art date
Application number
CZ20021701A
Other languages
English (en)
Inventor
Xingen Lei
Original Assignee
Cornell Research Foundation, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cornell Research Foundation, Inc. filed Critical Cornell Research Foundation, Inc.
Publication of CZ20021701A3 publication Critical patent/CZ20021701A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03026—4-Phytase (3.1.3.26), i.e. 6-phytase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03008—3-Phytase (3.1.3.8)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)

Description

Oblast techniky
Předložený vynález se týká do místa orientované mutageneze fosfatázy/fytázy z Escherichia coli.
Dosavadní stav techniky
Specifická skupina monoesterů fosfatáz, fytázy jsou potřebné pro iniciování uvolňování fosfátu („P) z fytátu (myoinositolhexafosfát) důležitá zásobná forma P v obilních potravinách a krmivech (Reddy, N. R. et al., „Phytates in Legumes and Cereals, Advances in Food Research, 28:1 (1982)). Protože živočichy s jednoduchým žaludkem, jako je například prase a drůbež a rovněž člověk, mají nízkou fytázovou aktivitu v svém gastrointestinálním traktu, téměř všechny z přijímaných fytátových P jsou nestravitelné. To má za následek v případě potřeby doplňování anorganického P, drahou a neobnovitelnou výživu ve stravování těchto živočichů. Více nežádoucí je to, že nevyužitý fytát-P vylučovaný trusem těchto zvířat se stává fosfátovou kontaminací v životním prostředí (Cromwell, G. L. et al., „P-A Key Essential Nutrient, Yet a Possible Major Pollutant — Its Central Role in Anímal Nutrition, Biotechnology In the Feed Industry; Proceedings Alltech 7th Annual Symposium, str. 133 (1991)). Dále fytát vytváří cheláty s esenciálními stopovými prvky, jako je například zinek, a • · • · · · vyvolává deficity živin, jako je například retardace růstu a mentální retardace u dětí přijímajících hlavně potravu rostlinného původu bez odstranění fytátu.
Z Aspergillus niger NRRL3135 se klonovaly a sekvenovaly dvě fytázy phyA a phyB (Ehrlich, K. C. et al., „Identificatuon and Cloning of a Second Phytase Gene (phys) from Aspergillus( niger (ficuum)Biochem. Biophys. Res. Commun. 195:5357(1993); Piddington, C.S. et al., „The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH 2,5-optimum Acid Phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. AwamoriGene, 133-56-62 (1993)). Nedávno se izolovaly nové geny pro fytázu z Aspergillus terreus a Myceliophthora thermophila (Mitchell et al., The Phytase Subfamily of Histidine Acid Phosphatases: Isolation of Genes for Two Novel Phytases From the Fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila, Microbiology 143:245-52, (1997)), Aspergilus fumigatus (Pasamontes et al., Gene Cloning, Purification, and Characterization of a Heat-Stable Phytase from the Fungus Aspergillus fumigatus
Appl. Environ. Microbiol., 63:1696-700(1997)), Emericella nidulans and Talaromyces thermophilus(Pasamontes et al., Cloning of the Phytase from Emericella nidulans and the Thermophilic Fungus Talaromyces thermophilus, Biochim.
Biophys. Acta., 1353:217-23(1997)), and kukuřice (Maugenest et al., Cloning and Characterization of a cDNA Encoding a Maize Seedling Phytase, Biochem.J. 322:511-17(1997)).
Z Enterobacter sp.4 se izolovaly a/nebo purifikovaly různé typy fytázových enzymů (Yoon et al., Isolation and Identification of Phytase-Producing Bacterium, Enterobacter sp. 4, and Enzymatic Properties of Phytase Enzyme., Enzyme and Microbial Technology 18:449-54(1996)), Klebsiella terigena (Greiner et al., Purification and Characterization of a Phytase from
Klebsiella terrigena, Arch. Biochem. Biophys. 341:201-06 (1997)), and Bacillus sp. DS11 (Kim et al.,Purification and Properties of a Thermostable Phytase from Bacillus sp. DS11, Enzyme and Microbial Technology 22:2-7(1998)). Studovaly se vlastnosti těchto enzymů. Kromě toho se zveřejnila krystalická struktura phyA z Aspergillus ficuum (Kostrewa et al., Crystal Structure of Phytase from Aspergillus ficuum at 2,5 A Resolution, Nátuře Structure Biology 4:185-90(1997)).
Hartingveldt et al. zavedli gen phyA do A. niger a získali desetinásobní zvýšení fytázové aktivity ve sorvnání s divokým typem („Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene {phyA) of Aspergillus Niger, Gene 127:87-94(1993)). Doplňková mikrobiální fytáza z tohoto zdroje ve výživě pro prasata a drůbež se projevila jako účinná při zlepšení využití fytát-P a zinku (Simons et al., Improvement of Phosphorus Availability By Microbial Phytase in Broilers . and Pigs, Br. J. Nutr., 64:525(1990); Lei, X.G. et al., Supplementing Corn-Soybean Meal Diets With Microbial Phytase Linearly Improves Phytate P Utilization by Weaning Pigs, J. Anim. Sci., 71:3359(1993); Lei, X.G. et al., Supplementing Corn-Soybean Meal Diets With Microbial Phytase Maximizes Phytate P Utilization by Weaning Pigs, J. Anim. Sci., 71:3368(1993); Cromwell, G.L. et al., P-A Key Essential Nutrient, Yet a Possible Major Pollutant -- Its Central Role in Animal Nutrition, Biotechnology In the Feed Industry; Proceedings Alltech 7th Annual Symposium, str. 133(1991)).
Avšak cena limitované ponuky komerční fytázy a její nestálost při vystavení teplu během peletizace krmivá vylučuje její praktické využití v živočišné výrobě (Jongbloed, A.W. et al., Effect of Pelleting Mixed Feeds on Phytase Activity and Apparent Absorbability of Phosphorus and Calcium in Pigs, > Animal Feed Science and Technology, 28:233-42(1990)). Kromé • · · · • · · ·
i toho fytáza produkovaná z A. niger pravděpodobně není nejbezpečnějším zdrojem pro výrobu potravy pro lid.
Proto je potřebné zlepšit produkci fytázy pro využití v potravinářském průmyslu a průmyslu krmiv.
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká izolované mutantní kyselé fosfatázy/fytázy, která je produkována provedením velkého počtu substitucí aminokyselin v kyselé fosfatáze/fytáze divokého typu z Escherichia coli, která má aminokyselinovou sekvenci SEQ. ID. No. 1. Tyto substituce aminokyselin se provádějí v polohách 200, 207 a 211 v SEQ. ID. No. 1. Předložený vynález zahrnuje také izolovanou mutantní kyselou fosfatázu/fytázu, která se odlišuje od kyselé fosfatázy/fytázy divokého typu, která má aminokyselinovou sekvenci SEQ. ID. No. 1, alespoň jednou substitucí aminokyselin, která narušuje tvorbu disulfidové vazby mezi aminokyselinovými zbytky Cys v poloze 200 a 210. Mutantní kyselá fosfatáza/fytáza podle předloženého vynálezu je užitečná pro živočišní krmivové kompozice.
Předložený vynález se týká také způsobu zlepšení enzymatických vlastností kyselé fosfatázy/fytázy divokého typu z Escherichia coli s aminokyselinovou sekvencí SEQ. ID. No. 1. Tento způsob zahrnuje změnu aminokyselinové sekvence kyselé fosfatázy/fytázy divokého typu zavedením substitucí aminokyselin do SEQ. ID. No. 1 v polohách 200, 207 a 211. Jiné provedení tohoto způsobu zahrnuje změnu aminokyselinové sekvence kyselé fosfatázy/fytázy divokého typu s SEQ. ID. No.
zavedením alespoň jedné substituce aminokyselin, která • · · · narušuje tvorbu disulfidové vazby mezi aminokyselinovými zbytky Cys v· poloze 200 a 210.
Jiný aspekt předloženého vynálezu se týká izolované molekuly DNA, která kóduje mutantní kyselou fosfatázu/fytázu podle předloženého vynálezu. Zveřejňují se také expresní systémy rekombinantní DNA a hostitelské buňky obsahující molekulu DNA podle předloženého vynálezu. Tyto konstrukce se mohou použít pro rekombinantní produkci mutantní kyselé fosfatázy/fytázy podle předloženého vynálezu.
Předložený vynález poskytuje také způsob založený na molekulách bází, který se může rozsáhle aplikovat pro konstrukci mutantních kyselých fosfatáz/fytáz odvozených od různých výchozích organismů za vzniku mutant, které zesilují enzymatické vlastnosti, jako je například vyšší tepelná stabilita a katalytická účinnost. Tento způsob zahrnuje identifikaci a izolaci genu pro enzym divokého typu a použití tohoto genu jako objektu do místa orientované mutageneze za účelem zesílení funkce a/nebo stability enzymu. Jedním aspektem předloženého vynálezu je použití do místa orientované mutageneze pro vytvoření cílených mutací genu divokého typu za účelem přidání N-glykozylačních míst do enzymu divokého typu a/nebo změny fyziochemických vlastnosti enzymu (například zvýšení celkového kladného náboje enzymu). Kromě toho se mohou vytvořit cílené mutace genu divokého typu za účelem eliminování jistých disulfidových vazeb nacházejících se v konečném proteinovém produktu za získání zvýšené tepelné stability a katalytické funkce.
Přehled obrázků na výkresech • · · ·
• ♦ · ·* ··
Obrázek 1 znázorňuje nukleotidovou (SEQ. ID. No. 2) a odvozenou aminokyselinovou (SEQ. ID. No. 1) sekvenci fosfatázy/fytázy divokého typu z E. coli (appA). Primery jsou podtrženy a označeny šipkou. Oblast smyčky GH (202-211) je vyznačen tučně a C200 (v helixu G) a C210 (ve smyčce GH) vytvářejí jedinou disulfidovou vazbu v α-doméně. Nahrazené aminokyseliny (A131, V134N, C200, D207 a S211) jsou podtrženy a vyznačeny tučně.
Obrázek 2 znázorňuje SDS-gelovou elektroforetickou (15%) analýzu purifikováných rekombinantních proteinů exprimovaných v Pichia pastoris. Na pás se přidalo třicet mikrogramů proteinu. Pás M předem zabarvený markér (Biorad, kDa) (fosforyláza b, 103; bovinní sérový albumin, 76; ovalbumin,
49; karbonanhydráza, 33,2; sojový trypsinový inhibitor, 28); pás 1, Endo Hf, (endoglykozidáza Hf) ; pás 2, r-AppA (rekombinantní protein produkovaný appA v Pichia pastoris); pás 3, r-AppA + Endo Hf, pás 4, mutanta U; pás 5, mutanta U + Endo Hf, pás 6, mutanta R; pás 7, mutanta R + Endo Hf; pás 8, mutanta Y; pás 9, mutanta Y + Endo Hf.
Obrázek 3 znázorňuje závislost enzymatické aktivity na pH při 37 °C purif i kovaného r-AppA (·) a mutant (U, ; Y, A, R, ♦) za použití fytátu sodného jako substrátu. Maximální aktivita pro každou mutantu a r-AppA byla definována jako 100 %. Pufry: pH 1,5 až 3,5, 0,2M glycin-HCl; pH 4,5 až 5,0, 0,2M citrát sodný; pH 8,5 až 11, 0,2M Tris-HCl. Hvězdičky označují významné rozdíly (P < 0,05) mezi r-AppA a jinými mutantami. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± SE ze tří pokusů.
Obrázek 4 znázorňuje zbytkovou enzymatickou aktivitu purifikovaného r-AppA {·) a mutant (U, ; Y, A, R, ♦) po vystavení indikované teplotě na 15 minut. Purifikovaný enzym • · · ·
I · ♦ · #· ·· se inkuboval 15 minut v 0,2M glycin-HCl, pH 2,5. Po ukončení zahřívání se reakční směs chladila na ledě 30 minut. Počáteční aktivita s fytátem sodným pro každý rekombinantní enzym byla definována jako 100 %. Hvězdičky označují významné rozdíly (P < 0,05) mezi r-AppA a jinými mutantami. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± SE ze tří pokusů.
Následuje podrobný popis vynálezu.
Předložený vynález se týká izolované mutantní kyselé fosfatázy/fytázy, která je produkována do místa orientovanou mutagenezou kyselé fosfatázy/fytázy divokého typu z
Escherichia coli. Podle jednoho provedení se mutantní kyselá fosfatáza/fytáza vytváří zavedením velkého počtu cílených substitucí aminokyselin do kyselé fosfatázy/fytázy divokého typu z Escherichia coli. V jiném provedení se mutantní kyselá fosfatáza/fytáza divokého typu z Escherichia coli produkuje zavedením alespoň jedné substituce aminokyselin do kyselé fosfatázy/fytázy divokého typu z Escherichia coli za účelem narušení tvorby disulfidové vazby mezi aminokyselinovými zbytky Cys mutantní kyselé fosfatázy/fytázy. Kyselá fosfatáza/fytáza divokého typu má aminokyselinovou sekvenci odpovídající SEQ. ID. No. 1:
Met 1 Lys Ala Ile Leu 5 Ile Pro Phe Leu Ser 10 Leu Leu Ile Pro Leu 15 Thr
Pro Gin Ser Ala 20 Phe Ala Gin Ser Glu 25 Pro Glu Leu Lys Leu 30 Glu Ser
Val Val Ile 35 Val' Ser Arg His Gly 40 Val Arg Ala Pro Thr 45 Lys Ala Thr
Gin Leu 50 Met Gin Asp Val Thr 55 Pro Asp Ala Trp Pro 60 Thr Trp Pro Val
Lys 65 Leu Gly Trp Leu Thr 70 Pro Arg Gly Gly Glu 75 Leu Ile Ala Tyr Leu 80
Gly His Tyr Gin Arg 85 Gin Arg Leu Val Ala 90 Asp Gly Leu Leu Ala 95 Lys
Lys Gly Cys Pro 100 Gin Pro Gly Gin Val 105 Ala Ile Ile Ala Asp 110 Val Asp
• · · · · ·
Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala 115 120
Asp Cys Ala lle Thr Val His Thr Gin 130 - 135
Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly 145 150
Asn Val Thr Asp Ala lle Leu Ser· Arg 165
Phe Thr Gly His Arg Gin Thr Ala Phe 180 185.
Asn Phe Pro Gin Ser Asn Leu Cys Leu 195 200
Ser Leu Thr Gin Ala Leu Pro 215
Val Ser Leu Thr Gly Ala Val 230
Phe Leu Leu Gin Gin Ala Gin 245 lle Thr Asp Ser His Gin Trp 260 265
Gin Phe-Tyr Leu Leu Gin Arg 275 280
Thr Pro Leu Leu Asp Leu lle 295
Gin Lys Gin Ala Tyr Gly Val 310
Ala Gly His Asp Thr Asn Leu 325
Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gin 340 345
Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg 355 360
Gin Val Ser Leu Val Phe Gin 375
Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro 390
Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala 405
Thr Gin lle Val Asn Glu Ala 420 425
Ser Cys 210
Asp Asn 225
Glu lle
Gly Arg
Asn Ala
Arg Ala 290
Pro Pro 305
Phe Xle
Glu Leu
Gly Glu
Trp lle 370
Lys Thr 385
Leu Ala
Gly Phe
Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro 125
Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp 140
Val Cys Gin Leu Asp Asn Ala 155 160
Ala Gly Gly Ser lle Ala Asp 170 175
Arg Glu . Leu Glu Arg Val Leu 190
Lys Arg Glu Lys Gin Asp Glu 205
Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala 220
Ser Leu Ala “Ser Met Leu Thr 235 240
Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp 250 255
Asn Thr Leu Leu Ser Leu His 270
Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser 285
Lys Thr Ala Leu Thr Pro His 300
Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu 315 320
Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu 330 335
Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly 350
Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gin 365
Thr Leu Gin Gin Met Arg Asp 380
Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr 395 400
Gin Gly Met Cys Ser Leu Ala
410 415
Arg lle Pro Ala Cys Ser Leu * 430 ·· ····
Kyselá fosfatáza/fytáza divokého typu s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ. ID. No. 1 je kódována kódující sekvencí bází 187-1486 nukleotidové sekvence SEQ. ID. No. 2:
1 taa gga gca gaa aca ATG TGG TAT TTA CTT TGG TTC GTC GGC ATT
4e TTG TTG ATG TGT. TCG CTC TČC ACC CTT GTG TTG GTA TGG CTC GAC
91 CCG CGA TTG AAA AGT T aac gaa cgt agg cct gat gcg gcg cat
134 tag cat cgc atc agg caa tca ata atg tca gat atg aaa agc gga
• · · · · · · · ···· • · · · · · ·· · • · · · · · ·· • · . · ·· · · ·· · ·· ·· · · · · · · · ··
179 aac ata tcg ATG AAA GCG ATC TTA ATC CCA TTT TTA TCT CTT CTG
224 ATT CCG TTA ACC CCG CAA TCT GCA TTC GCT CAG AGT GAG CCG GAG
269 CTG AAG CTG GAA AGT GTG GTG ATT GTC AGC CGT CAT GGT GTG CGT
314 GCC CCA ACC AAG GCC ACG CAA CTG ATG CAG GAT GTC ACC CCA GAC
359 GCA TGG CCA ACC TGG CCG GTA AAA CTG GGT TGG CTG ACA CCA CGC
404 GGT GGT GAG CTA ATC GCC TAT CTC GGA CAT TAC CAA CGC CAG CGT
449 CTG GTG GCC GAC GGA TTG CTG GCG AAA AAG GGC TGC CCG CAG CCT
494 GGT CAG GTC GCG ATT ATT GTC GAT GTC GAC GAG CGT ACC CGT AAA
539 ACA GGC GAA GCC TTC GCC GCC GGG CTG GCA CCT GAC TGT GCA ATA
584 ACC GTA CAT ACC CAG GCA GAT ACG TCC AGT CCC GAT CCG TTA TTT
629 ATT CCT CTA AAA ACT GGC GTT TGC CAA CTG GAT AAC GCG AAC GTG
674 ACT GAC GCG ATC CTC AGC AGG GCA GGA GGG TCA ATT GCT GAC TTT
719 ACC GGG CAT CGG CAA ACG GCG TTT CGC GAA CTG GAA CGG GTG CTT-
764 AAT TTT CCG CAA TCA AAC TTG TGC CTT AAA CGT GAG AAA CAG GAC
809 GAA AGC TGT TCA TTA ACG CAG GCA TTA CCA TCG GAA CTC AAG GTG
854 AGC GCC GAC AAT GTT TCA TTA ACC GGT GCG GTA AGC CTC GCA TCA
899 ATG CTG ACG GAA ATA TTT CTC CTG CAA CAA GCA CAG GGA ATG CCG
944 GAG CCG GGG TGG GGA AGG ATC ACT GAT TCA CAC CAG TGG AAC ACC
989 TTG CTA AGT TTG. CAT AAC GCG CAA TTT TAT TTA CTA CAA CGC ACG
1034 CCA GAG GTT GCC CGC AGT CGC GCC ACC CCG TTA TTG GAT TTG ATC
1079 AAG ACA GCG TTG ACG CCC CAT CCA CCG CAA AAA CAG GCG TAT GGT
1124 GTG ACA TTA CCC ACT TCA GTG CTG TTT ATT GCC GGA CAC GAT ACT
1169 AAT CTG GCA AAT CTC GGC GGC GCA CTG GAG CTC AAC TGG ACG CTT
1214 CCA GGT CAG CCG GAT AAC ACG CCG CCA GGT GGT GAA CTG GTG TTT
1259 GAA CGC TGG CGT CGG CTA AGC GAT AAC AGC CAG TGG ATT CAG GTT
1304 TCG CTG GTC TTC CAG ACT TTA CAG CAG ATG CGT GÁT AAA ACG CCG
1349 CTA- TCA TTA AAT ACG CCG CCC GGA GAG GTG AAA CTG ACC CTG GCA !
1394. GGA TGT GAA GAG CGA AAT GCG CAG GGC ATG TGT TCG TTG GCC GGT
1439 TTT ACG CAA ATC GTG AAT GAA GCG CGC ATA CCG GCG TGC AGT TTG
1464 TAA
0 0 ···· «10»
Tato kyselá fosfatáza/fytáza je odvozena z E. coli.
Při produkci mutantní kyselé fosfatázy/fytázy podle předloženého vynálezu se provádějí substituce aminokyselin v poloze 200, 207 a 211 SEQ. ID. No. 1. Obzvláště přednostní jsou následující substituce aminokyselin v kyselé fosfatáze/fytáze se SEQ. ID. No. 1: v poloze 200 bude aminokyselinový zbytek Asn místo aminokyselinového zbytku Cys; v poloze 207 bude aminokyselinový zbytek Asn místo aminokyselinového zbytku Asp, a v poloze 211 bude aminokyselinový zbytek Asn místo aminokyselinového zbytku Ser. Následkem toho má mutantní kyselá fosfatáza/fytáza následující aminokyselinovou sekvenci SEQ. ID. No. 3 (záměny aminokyselin jsou potrženy a vyznačeny tučně):
Met 1 Lys Ala Ile Leu 5 Ile Pro Phe Leu Ser 10 Leu Leu Ile Pro Leu 15 Thr
Pro Gin Ser Ala 20 Phe Ala Gin Seř Glu 25 Pro Glu Leu Lys Leu 30 Glu Ser
Val Val Ile 35 Val Ser Arg His Gly 40 Val Arg Ala Pro Thr 45 Lys Ala Thr
Gin Leu 50 Met Gin Asp Val Thr 55 Pro Asp Ala Trp Pro 60 Thr Trp Pro Val
Lys 65 Leu Gly Trp Leu Thr 70 Pro Arg Gly Gly Glu 75 Leu Ile Ala Tyr Leu 80
Gly His Tyr Gin Arg . 85 Gin Arg Leu Val Ala 90 Asp Gly Leu Leu Ala 95 Lys
Lys Gly Cys Pro 100 Glň Pro Gly Gin Val 105 Ala Ile Ile Ala Asp 110 Val Asp
Glu Arg Thr 115 Arg Lys Thr Gly Glu 120 Ala Phe Ala Ala Gly 125 Leu Ala Pro
Asp Cys 130 Ala Ile Thr Val His 135 Thr Gin Ala Asp Thr 140 Ser Ser Pro Asp
Pro 145 Leu Phe Asn Pro Leu 150 Lys Thr Gly Val Cys 155 Gin Leu Asp Asn Ala 160
Asn Val Thr Asp Ala 165 Ile Leu Ser Arg Ala 170 Gly Gly Ser Ile Ala 17S Asp
Phe Thr Gly His 180 Arg Gin Thr Ala Phe 185 Arg Glu Leu Glu Arg 190 Val Leu
Asn Phe Pro Gin Ser Asn Leu Asn Leu Lys Arg Glu Lys Gin Asn Glu
195 '200 205 ···· ♦ ···
Ser Cys 210 Asn Leu Thr Gin Ala 215 Leu Pro Ser Glu Leu 220 Lys Val Ser Ala
Asp 225 Asn Val Ser Leu Thr 230 Gly Ala Val Ser Leu 235 Ala Ser Met Leu Thr 240
Glu Ile Phe Leu Leu 245 Gin Gin Ala Gin Gly 250 Met Pro Glu Pro Gly Trp 255
Gly Arg Ile Thr 260 Asp Ser His Gin Trp 265 Asn Thr Leu Leu Ser 270 Leu His
Asn Ala Gin 275 Phe Tyr Leu Leu Gin 280 Arg Thr Pro Glu Val 285 Ala Arg Ser
Arg Ala 290 Thr ProLeu Leu Asp 295 Leu Ile Lys Thr Ala 300 Leu Thr Pro His
Pro 305 Pro Gin Lys Gin Ala 310 Tyr Gly Val Thr Leu 315 Pro Thr Ser Val Leu 320
Phe Ile Ala Gly Bis 325 Asp Thr Asn Leu Ala 330 Asn Leu Gly Gly Ala Leu 335
Glu Leu Asn Trp 340 Thr Leu Pro Gly Gin 345 Pro Asp Asn Thr Pro 350 Pro Gly
Gly Glu Leu 355 Val Phe Glu Arg Trp 360 Arg Arg Leu Ser Asp 365 Asn Ser Gin
Trp Ile 370 Gin Val Ser Leu Val 375 Phe Gin Thr Leu Gin 380 Gin Met Arg Asp
Lys 385 Thr Pro Leu Ser Leu 390 Asn Thr Pro Pro Gly 395 Glu Val Lys Leu Thr 400
Leu Ala Gly Čys Glu 405 Glu Arg Asn Ala Gin 410 Gly Met Cys Ser Leu Ala 415
Gly Phe Thr Gin Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
420 425 430
Mutantní kyselá fosfatáza/fytáza s SEQ. ID. No. 3 má molekulovou hmotnost 45 až 48 kDa po deglykosylaci a má specifickou fytázovou aktivitu 63 U/mg. Zralý protein je představován aminokyselinovou sekvencí aminokyselin 21 až 432 v SEQ. ID. No. 3.
Jiný aspekt předloženého vynálezu zahrnuje produkci mutantní kyselé fosfatázy/fytázy zavedením alespoň jedné substituce aminokyseliny do aminokyselinové sekvence SEQ. ID. No. 1 za účelem narušení tvorby disulfidové vazby v mutantní kyselé fosfatáze/fytáze. Pro eliminaci disulfidové vazby mezi těmito zbytky se může provést zejména cílená substituce aminokyselinového zbytku Cys v poloze 200 a/nebo 210 SEQ. ID. No. 1.
Mutantní kyselá fosfatáza/fytáza s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ. ID. No. 3 je kódována kódující sekvencí báz 187 až 1486 následující nukleotidové sekvence SEQ. ID. No. 4 (kodony pro zaměněné zbytky Asn v aminokyselinové poloze 200, 207 a 211 jsou potrženy a vyznačeny tučně):
1 taa gga gca gaa aca ATG TGG TAT TTA CTT TGG TTC GTC GGC ATT
46 TTG TTG ATG TGT TCG CTC TCC ACC CTT GTG TTG GTA TGG CTG GAC
91 CCG CGA TTG AAA AGT T aac gaa cgt agg cct gat gcg gcg cat
134 tag cat cgc atc agg caa tca ata atg tča -gat atg aaa agc gga
179 aac ata tcg ATG AAA GCG ATC TTA ATC CCA TTT TTA TCT CTT CTG
224 ATT CCG TTA ACC CCG CAA TCT GCA TTC GCT CAG AGT GAG CCG GAG
269 CTG AAG CTG GAA AGT GTG GTG ATT GTC AGC CGT CAT GGT GTG CGT
314 GCC CCA ACC AAG GCC ACG CAA CTG ATG CAG GAT GTC ACC CCA GAC..
359 GCA TGG CCA ACC TGG CCG GTA AAA CTG GGT TGG CTG ACA CCA CGC
404 GGT GGT GAG ČTA ATC GCC TAT CTC GGA CAT TAC CAA CGC CAG CGT·
44 9 CTG GTG GCC GAC GGA TTG CTG- GCG AAA AAG GGC TGC CCG CAG CCT
494 GGT CAG GTC GCG ATT ATT GTC GAT GTC GAC GAG CGT ACC CGT AAA
539 ACA GGC GAA GCC TTC GCC GCC GGG CTG GCA CCT GAC TGT GCA ATA
• · · ·
584 ACC GTA CAT ACC CAG GCA GAT ACG TCC AGT CCC GAT CCG TTA TTT
629 ATT CCT CTA AAA ACT GGC GTT· TGC CAA CTG GAT AAC GCG AAC GTG
674 ACT GAC GCG ATC CTC AGC AGG GCA GGA GGG TCA ATT GCT GAC TTT
719 ACC GGG CAT CGG CAA ACG GCG TTT CGC GAA CTG GAA CGG GTG CTT
764 AAT TTT CCG CAA TCA AAC TTG AAC CTT AAA CGT GAG AAA CAG AAT
809 GAA AGC TGT AAC TTA ACG CAG GCA TTA CCA TCG GAA CTC AAG GTG
854 AGC GCC GAC AAT GTT TCA TTA ACC GGT GCG GTA AGC CTC GCA TCA
899 ATG CTG ACG GAA ATA TTT CTC CTG CAA CAA GCA CAG GGA ATG. CCG
944 GAG CCG GGG TGG GGA AGG ATC ACT GAT TCA CAC CAG TGG AAC ACC
989 TTG CTA AGT TTG CAT AAC GCG CAA TTT TAT TTA CTA CAA CGC ACG
1034 CCA GAG GTT GCC CGC AGT CGC GCC ACC CCG TTA TTG GAT TTG ATC
1079 AAG ACA GCG TTG ACG CCC CAT CCA CCG CAA AAA CAG GCG TAT GGT
1124 GTG ACA TTA CCC ACT TCA GTG CTG TTT ATT GCC GGA CAC GAT ACT
1169 AAT CTG GCA AAT CTC GGC GGC GCA CTG GAG CTC AAC TGG ACG CTT
1214 CCA GGT CAG CCG GAT AAC ACG CCG CCA GGT. GGT GAA CTG GTG TTT
1259 GAA CGC TGG CGT CGG CTA AGC GAT AAC AGC CAG TGG ATT CAG GTT
1304 TCG CTG GTC TTC CAG ACT TTA CAG CAG ATG CGT GAT AAA ACG CCG
1349 CTA TCA TTA AAT ACG CCG CCC GGA GAG GTG AAA CTG ACC CTG GCA
1394 GGA TGT GAA GAG CGA AAT GCG CAG GGC ATG TGT TCG TTG GCC GGT
1439 TTT ACG CAA ATC GTG AAT GAA GCG CGC ATA CCG GCG TGC AGT TTG
1484 TAA
Jedno provedení předloženého vynálezu zahrnuje vložení genu pro mutantní kyselou fosfatázu/fytázu do expresního vektorového systému za použití techniky rekombinantní DNA, která je v daném oboru dobře známa. To umožní expresi tohoto genu v hostitelské buňce poskytující produkci a purifikaci kyselé fosfatázy/fytázy pro použití v kompozicích, jako například pro krmivo pro zvířata.
DNA genu pro mutantní kyselou fosfatázu/fytázu se může izolovat a/nebo identifikovat za použití technik hybridizace DNA. Sondy nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) podle předloženého vynálezu se budou hybridizovat s komplementární nukleovou kyselinou za stringentních podmínek. Podmínky menší stringence se mohou zvolit rovněž. Obecně jsou stringentní podmínky zvoleny jako přibližně o 50 °C nižší než teplotní bod tání (TM) pro specifickou sekvenci při definované iontové síle a pH. TM je teplota (při definované iontové síle a pH), při které 50 % cílových sekvencí hybridizuje na bezchybně přizpůsobenou sondu. TM je závislý na podmínkách roztoku a kompozici bází sondy a pro DNA:RNA hybridizaci se může vypočítat za použití následující rovnice:
T(n s=79.8°C + (18.5 x Log[Na+]) + (58.4°C x %[G+CJ) (820 / #bp v duplexu) (0.5 x % fonmamid )
Promega Protocols and Application Guide, 2. vydání, Promega Copr., Madison, WI (1991), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu. Nespecifické vazby se mohou rovněž kontrolovat za použití jedné z velkého počtu technik známých v oboru, jako je například blokování membrány pomocí roztoků obsahujících proteiny, přidání heterologních RNA, DNA a SDS k hybridizačnímu pufru a zpracování RNázou.
Obecně jsou vhodné stringentní podmínky pro hybridizační analýzy nukleových kyselin nebo detekčních postupů genové amplifikace, jak se uvádí výše, nebo jak se popisuje v práci Southern, Detection of Specific Sequences Among DNA Fragments Separated by Gel Electrophoresis, J. Mol. Biol., 98:50317 (1975), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu. Například podmínky hybridizace při 42 °C pomocí 5X SSPE a 50% formamidu s promýváním při 50 °C pomocí 0,5X SSPE se může použít u sondy nukleové kyseliny obsahující alespoň 20 bází, přednostně alespoň 25 bází nebo více přednostně alespoň 30 bází. Stringence se může zvýšit například promýváním při 55 °C nebo více přednostně 60 °C za použití vhodně zvoleného promývacího média se zvýšenou koncentrací sodíku (například IX SSPE, 2X SSPE, 5X SSPE atd.). Pokud trvají problémy spojené s křížovou hybridizací, může se také zvolit další zvýšení teploty, například promýváním při 65 °C, 70 °C, 75 °C nebo 80 °C. Nastavením podmínek hybridizace je možno identifikovat sekvence s požadovaným stupněm homologie (tj. větším než 80 %, 85 %, 90 % nebo 95 %), jak se definuje v programu TBLASTN (Altschul, S.F., et al., Basic Local Alignment Search Tool, J. Mol. Biol. 215:403-410(1990), který je tímto začleněn pomocí odkazu) na její předem nastavené poloze.
Přednostní metodou detekce mutantní kyselé fosfatázy/fytázy podle předloženého vynálezu je použití metod známých v oboru, například detekční reakce za použití ligázy (LDR) a ligázová řetězová reakce (LCR), přičemž tato prácese popisuje v práci Barany, „(Genetic Disease Detection and DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88(1):189-193(1991), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu.
Molekula DNA podle předloženého vynálezu se může exprimovat v jakémkoliv prokaryontním nebo eukaryontním expresním systému vložením molekuly. DNA do expresního systému • · ·· · ve vhodné orientaci a správném čtecím rámci. Pro expresi sekvence kódující protein se mohou použít různé hostitelské vektorové systémy. Přednostní vektory zahrnují virový vektor, plazmid, kozmid nebo oligonukleotid. Vektorový systém musí být hlavně kompatibilní s použitou hostitelskou buňkou.
Hostitelské vektorové systémy zahrnují bez omezení baktérie transformované bakteriofágem DNA, plazmidovou DNA nebo kozmidovou DNA; mikroorganismy, jako je například kvasinka obsahující kvasinkové vektory; savčí buňkové systémy infikované virem (například virus vakcínie, adenovírus atd.); hmyzí buňkové systémy infikované virem (například baculovirus); a rostlinné buňky infikované baktériemi.
Expresní elementy těchto vektorů se mění vzhledem k své síle a specifičnosti. V závislosti na použitém hostitelském vektorovém systému se může použít jakýkoliv z velkého počtu vhodných transkripčních a translačních elementů. Například molekula DNA podle předloženého vynálezu se upravuje spojuje v rámci s transkripčním enhacerovým elementem.
Přednostní hostitelské systémy pro expresi molekuly DNA podle předloženého vynálezu zahrnuje buňky plísní, včetně druhů kvasinek nebo se mohou použít vláknité houby jako hostitelské buňky podle předloženého vynálezu. Přednostní kvasinkové hostitelské buňky zahrnuje různé kmeny Saccharomyces cerevisiae. Mohou se použít rovněž jiné kvasinky, například Kluyveromyces, Torulaspora a
Schizosaccharomyces. Přednostní hostitelské buňky vláknitých hub zahrnuje Aspergillus a Neurospora. Více přednostní kmen Aspergillus je Aspergillus niger.
V dalším přednostním provedení předloženého vynálezu je kvasinkovým kmenem methylotrofní kmen kvasinek. Methylotrofní kvasinky jsou takové rody kvasinek, které jsou schopné využívat methanol jako zdroj uhlíku pro vytváření ··· ·
energetických zdrojů potřebných pro udržováni buněčných funkcí a které obsahují gen pro expresi alkoholoxidázy. Typickými methylotrofnimi kvasinkami jsou členy rodu Pichia, Hansenula, Torulupsis, Candida a Karwinskia. Tyto rody kvasinek mohou využívat methanol jako výhradní zdroj uhlíku. Ve více přednostním provedení je methylotrofním kmenem kvasinek Pichia pastoris.
Purifikované proteiny se mohou získat několika způsoby. Protein nebo polypeptid podle předloženého vynálezu se přednostně produkuje v purifikované formě (přednostně alespoň s přibližně 80%, více přednostně 90% čistotou) vhodnými technikami. Typicky se protein nebo polypeptid podle předloženého vynálezu vylučuje do růstového média rekombinantní hostitelské buňky. Alternativně protein nebo polypeptid podle předloženého vynálezu se produkuje, ale nevylučuje do růstového média. V takových případech se za účelem izolování proteinu hostitelská buňka nesoucí rekombinantní plazmid rozmnožuje, lyžuje sonikací, teplem nebo chemickým zpracováním a homogenáty se centrifugují za účelem odstranění zlomků buněk. Supernatant se potom podrobí sekvenční precipitaci síranem amonným. Frakce obsahující protein nebo polypeptid podle předloženého vynálezu se podrobí gelové filtraci na dextranovém nebo polyakrylamidovém sloupci o vhodné velikosti za účelem separace proteinů. Pokud je to potřebné, proteinová frakce se může dále purifikovat pomocí HPLC.
Předložený vynález rovněž poskytuje kmen kvasinek s heterologním genem, který kóduje protein nebo polypeptid s fytázovou aktivitou. Heterologní gen by měl být funkčně spojen s promotorem schopným exprimovat fytázu v kvasince.
Ještě dalším aspektem předloženého vynálezu je vektor pro expresi fytázy v kvasince. Tento vektor nese gen z nekvasinkového organismu, který kóduje protein nebo polypeptid s fytázovou aktivitou. Gen pro fytázu se může klonovat do jakéhokoliv vektoru, který se replikuje autonomně nebo včleňuje do genomu kvasinky. Počet kopii autonomně replikujících plazmidů, například plazmidů YEp, může být vysoký, ale jejich mitotická stabilita může být nepostačující (Bitter et al., Expression and Secretion Vectors for Yeast, Meth. Enzymol. 153:516-44(1987), které jsou tímto začleněny pomocí odkazu). Mohou obsahovat 2 mu-plazmidovou sekvenci odpovědnou za autonomní replikaci a sekvenci z E. coli odpovědnou za replikaci v E. coli. Tyto vektory přednostně obsahují genetický markér pro výběr kvasinkových transformantů a gen pro rezistenci na antibiotika pro selekci v E. coli. Episomální vektory obsahující sekvence ARS a CEN se vyskytují jako jednoduché kopie na buňku a jsou více stabilní než vektory YEp. Integrační vektory se používají, když se integruje fragment DNA jako jedna nebo více kopií do kvasinkového genomu. V tomto případě rekombinantní DNA je stabilní a není potřebná žádná selekce (Struhl et al., HighFrequency Transformation of Yeast: Autonomous Replication of Hybrid DNA Molecueeus, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76:103539(1979); Powels et al.,Cloning Vectors,I-IV, et seq.
Elsevier,(1985); a Sakai et al., Enhanced Secretion of Human Nerve Growth Factor from Saccharomyces Cerevisiae Using an Edvanced δ-Integration System, Biotechnology 9:1382-85(1991), přičemž tyto práce jsou tímto začleněny pomocí odkazu. Některé vektory mají počátek replikace, který působí ve vybrané hostitelské buňce. Vhodné počátky replikace zahrnují 2μ, ARS1 a 25μΜ. Tyto vektory mají místa restrikce endonukleázami pro vložení sekvencí fúzního genu a promotoru a selekční markéry, Vektory se mohou modifikovat odstraněním nebo přidáním restrikčních míst nebo odstraněním jiných nežádoucích nukleotidů.
Gen pro fytázu se může umístit pod kontrolu jakéhokoliv promotoru (Stetler et al., Secretion of Active, Full- and Half-Lenght Human Secretory Leukocyte Protease Inhibitor by Saccharomyces cerevisiae, Biotechnology 7:55-60(1989), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu. Může se zvolit konstituční nebo regulační kvasinkový promotor. Vhodné promotorové sekvence pro kvasinkové vektory zahrnují mezi jinými promotory pro metallothionein, 3-fosfoglycerátkináza (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073(1980), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu nebo jiné glykolytické enzymy (Hess et al., J. Adv.Enzyme Reg. 7:149(1968); a Holland et al., Biochem. 17:4900, (1978), přičemž tyto práce jsou tímto začleněny pomocí odkazu), jako je například enoláza, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza, hexokináza, pyruvátdekarboxyláza, fosfofruktokináza, triózafosfátisomeráza, fosfoglukózaisomeráza a glukokináza. Jiné vhodné vektory a promotory pro použití při expresi kvasinek dále popisuje Hitzeman v EP A-73,657, která je tímto začleněna pomocí odkazu. Jinou alternativou je glukózu potlačující promotor ADH2 popsaný v práci Russell et al., J. Biol. Chem. 258:2674(1982) a Beier et al., Nátuře 300:724(1982), která je tímto začleněna pomocí odkazu.
Může se zvolit konstituční nebo regulovaný kvasinkový promotor. Silné promotory, například gen pro fosfoglycerátkinázu (PGK), jiné geny kódující glykolytické enzymy a gen pro alfa-faktor, jsou konstituční. Když se použije konstituční promotor, produkt se syntetizuje během růstu buňky. Promotor ADH2 je regulován ethanolem a glukózou, promotory GAL1-10 a GAL7 jsou regulovány galaktózou a glukózou, promotor PHO5 fosfátem a metallothioninový promotor mědí. Promotory tepelného šoku, ke kterým se řadí promotor HSP 150, jsou regulovány teplotou. Mohou se použít také hybridní promotory. Regulované promotory se používají, když trvalá exprese požadovaného produktu je pro hostitelskou buňku škodlivá.
Místo kvasinkových promotorů se může použít silný prokaryontní promotor, jako je například promotor T7, ale v tomto případě se kmen kvasinek má transformovat genem kódujícím příslušnou polymerázu. pro transkripční terminaci se používá terminátor HSP150 nebo jakýkoliv jiný funkční terminátor. Zde se promotory a terminátory nazývají kontrolní elementy.
Předložený vynález není omezen žádným specifickým vektorem, promotorem nebo terminátorem.
Vektor může rovněž nést volitelný markér. Volitelné markéry jsou často geny pro rezistenci na antibiotika nebo geny schopné komplementace kmenů kvasinek se správně charakterizovanými metabolickými deficity, jako jsou například mutanty s deficitem tryptofanu nebo histidinu. Přednostní volitelné markéry zahrnují URA3, LEU2, HIS3, TRPÍ, HIS4, ARG4 nebo geny pro rezistenci na antibiotika.
Vektor může mít rovněž počátek replikace schopný replikace v bakteriální buňce. Manipulace s vektory je více účinná v bakteriálních kmenech. Přednostní bakteriální počátky replikace jsou ColEl, Ori nebo oriT.
Přednostně protein nebo polypeptid s fytázovou aktivitou je vylučován buňkami do růstového média. To umožňuje vysoké hladiny exprese a snadnější izolaci produktu. Protein nebo polypeptid s fytázovou aktivitou je spojen se signální sekvencí schopnou usměrňování proteinu ven z buňky. Přednostně se signální sekvence odštěpuje z proteinu.
Může se použít určující sekvence z kvasinky nebo z genů pro fytázu nebo jiné zdroje pro podporování vylučování exprimovaného fytázového enzymu do média. Předložený vynález není omezen žádným specifickým typem určující sekvence nebo signálního peptidu.
Vhodné určující sekvence zahrnují určující sekvenci kvasinkového alfa-faktoru, která se může použít pro usměrnění vylučování fytázy. Určující sekvence alfa-faktoru se často vkládá mezi sekvenci promotoru a sekvenci strukturního genu (Kurjan et al., Cell 30:933,(1982); Bitter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:5330, (1984); US patent č. 4,546,082 a evropská publikovaná patentová přihláška č. 324,274, přičemž tyto práce jsou tímto začleněny pomocí odkazu). Jiná vhodná určující sekvence je MF alfa 1 (alfa-faktor) ze S. cerevisiae se syntetizuje jako „prepro forma 165 aminokyselin obsahující signál nebo prepeptid s 19 aminokyselinami následovaný „vůdcem nebo prepetidem se 64 aminokyselinami obklopujícími tři N-vázanými glykosylačními místy následovanými (LysArg(Asp/Glu, Ala)2-3 alfa-faktor)4 Kurjan et al., Cell 30:933-(1982), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu). Signální určující část preproMF alfa 1 se široce využívala pro dosažení syntézy a vylučování heterologních proteinů v S. cerevisiae. Použití signálních/určujících peptidovů homologních s kvasinkami je známo z US patentu č. 4,546,082; evropských patentových přihlášek č. 116,201,
123,294, 123544, 163,529 a 123,289 a DK patentové přihlášky č. 3614/83, které jsou tímto začleněny pomocí odkazu. V evropské patentové přihlášce č. 123,289, která je tímto začleněna pomocí odkazu, se popisuje využití prekurzoru a-faktoru z S. cerevisiae, zatímco WO 84/01153, který je tímto začleněn pomocí odkazu, uvádí využití invertázový signální peptid ze Saccharomyces cerevisiae a německá patentová přihláška DK 361/83, která je tímto začleněna pomocí odkazu, popisuje využití signálního peptidu PH05 ze Saccharomyces cerevisiae pro sekreci cizích proteinů.
Signální „vůdce alfa-faktor ze Saccharomyces cerevisiae (MF alfa 1 nebo MF alfa 2) se může rovněž využít v procesu sekrece exprimovaných heterologních proteinů v kvasinkách (US patent č. 4,546,082; evropské patentové přihlášky č. 16,201, 123,294, 123,544 a 163,529, které jsou tímto začleněny pomocí
odkazu). Fúzí sekvence DNA kódující signální/určující sekvenci MF alfa 1 z S. cere.visíae na 5'-konci genu pro požadovaný protein se demonstrovala sekrece a zpracování požadovaného proteinu. Použití signálního peptidu myší slinné amylázy (nebo její mutanty) pro poskytnutí sekrece heterologních proteinů exprimovaných v kvasinkách se popsalo v publikovaných PCT přihláškách č. WO 89/02463 a WO 90/10075, které jsou tímto začleněny pomocí odkazu.
US patent č. 5,726,038 popisuje použití signálního peptidu kvasinkové aspartátproteázy 3, která je schopná poskytnout zlepšenou sekreci proteinů exprimovaných v kvasinkách. Jiné určující sekvence vhodné pro podporování sekrece rekombinantních polypeptidů z kvasinkových hostitelských buněk jsou odborníkům v tomto oboru známy. Určující sekvence se může modifikovat blízko svého 3'-konce, aby obsahovala jedno nebo více restrikčních míst. To bude podporovat fúzi určující sekvence se strukturním genem.
Protokoly transformace kvasinek jsou odborníkům v tomto oboru známy. Jeden z takových protokolů je popsán v práci Hinnen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75:1929(1978), která je tímto začleněna pomocí odkazu. Protokol od Hinnena et al. selektuje transformanty v selekčním médiu, přičemž toto selekční médium obsahuje 0,67 % kvasinkové dusíkaté báze, 0,5 % casaminokyselin, 2 % glukózy, 10 pg/ml adeninu a 20 pg/ml uracilu.
Gen se může udržovat v stabilním expresním vektoru, umělém chromozómu nebo integrací do chromozómu kvasinkové hostitelské buňky. Integrace do chromozómu se může provést • · • · · · • « · · · · ····«<· · · ··«· c· · ···· ···· · · * ·· · klonováním genu pro fytázu do vektoru, který bude rekombinovat v chrc^nozómu kvasinky. Vhodné vektory mohou zahrnovat nukleotidové sekvence, které jsou homologní s nukleotidovými sekvencemi v chromozómu kvasinky. Alternativně se gen pro fytázu může umístit mezi rekombinanční místa, jako jsou například transponzabilní elementy, které mohou mobilizovat gen do chromozómu.
Další aspekt předloženého vynálezu se týká zlepšení enzymatických vlastností fosfatázy/fytázy divokého typu. Toho se vhodně dosahuje změnou aminokyselinové sekvence fosfatázy/fytázy divokého typu v polohách 200, 207 a 211, jak se popisuje výše. Tyto modifikace způsobují například to, že kyselá fosfatáza/fytáza má zlepšenou tepelnou stabilitu. Alternativně je zlepšenou enzymatickou vlastností fytázová aktivita při pH přibližně 3,5 až přibližně 5,5.
Zatímco enzym fytáza produkovaný v kvasinkovém systému uvolňoval fytát-P z kukuřice a sóje účinně jako běžná komerční fytáza, zdál se být více stabilní za tepla. Tato zvýšená exprese fytázového systému v kvasinkách se může použít pro získání fytázy stabilní za tepla pro použití v potravinářském průmyslu a při výrobě krmiv.
Zlepšená kyselá fosfatáza/fytáza podle předloženého vynálezu se může použít v potravě pro zvířata pro zlepšení trávení fosfátu u takových zvířat s jednoduchým žaludkem, jako je například drůbež, prase, mláďata přežvýkavců, zvířata ze zoologické zahrady a domácí zvířata (například kočky a psi). Předložený vynález by také snižoval poptávku po potravě pro zvířata doplněné velkým množstvím anorganických fosfátů tím, že by poskytoval méně drahou formu potravy pro zvířata, která obsahuje méně neobnovitelné formy fosfátů. Protože předložený • · · · · ·«····· · · «· ·· · ·· · · vynález zvyšuje schopnost zvířat s jednoduchým žaludkem absorbovat fosfáty, fekální odpad těchto zvířat bude obsahovat méně nevyužité fosfatázy/fytázy, která zvyšuje množství kontaminace fosfáty.
Při realizaci krmivové kompozice pro zvířata se mutantní kyselá fosfatáza/fytáza kombinuje se surovým rostlinným materiálem a potom zpracovává na granulovanou nebo práškovou formu. Surový rostlinný materiál může obsahovat různé kombinace velkého počtu rostlin a rostlinných vedlejších produktů běžně používaných v krmivech pro zvířata, včetně kukuřice, sóje, pšenice, rýže, bavlníkového semena, řepkového semena, čiroku a brambor. Kromě toho krmivová kompozice pro zvířata může být obohacena různými vitaminy, minerály, živočišními proteiny a antibiotiky. Jedno z provedení krmivové kompozice pro zvířata zahrnuje směs vhodných koncentrací mutantní kyselé fosfatázy/fytázy, zdroj energie (například kukuřici, pšenici), zdroj proteinů (například sóju, rýži, bavlníkové semeno, řepkové semeno, čirokovou mouku) a vitaminové a minerální doplňky. Množství mutantní kyselé fosfatázy/fytázy by bylo zejména 300 až 1 000 jednotek/kg krmivá. Příklad typické krmivové kompozice pro zvířata by obsahoval 50 až 70 % kukuřice, 20 až 30 % sóje, přibližně 1 % vitaminových a minerálních doplňků a vhodné množství mutantní kyselé fosfatázy/fytázy.
Kromě toho mutantní kyselá fosfatáza/fytáza podle předloženého vynálezu by se mohla použít pro zlepšení lidské výživy, zejména zvýšením příjmu takových minerálů, jako je například zinek a železo. Přidáním mutantní kyselé fosfatázy/fytázy do potravy lidí by se mohlo zabraňovat různým problémům vyplývajícím z deficitů živin, jako je například zakrnělý růst a mentální retardace u dětí.
• · · ··· ··» · · « • · ··· ··««««* » β
Předložený vynález poskytuje také způsob založený na molekulách bází, který se může rozsáhle aplikovat pro konstrukci mutantních kyselých fosfatáz/fytáz odvozených od různých výchozích organismů za vzniku mutant, které zesilují enzymatické vlastnosti, jako je například vyšší tepelná stabilita a katalytická účinnost. Tento způsob zahrnuje identifikaci a izolaci genu pro enzym divokého typu a použití tohoto genu jako objektu do místa orientované mutageneze za účelem zesílení funkce a/nebo stability enzymu. Jedním aspektem předloženého vynálezu je použití do místa orientované mutageneze pro vytvoření cílených mutací genu divokého typu za účelem přidání N-glykosylačních míst do enzymu divokého typu a/nebo změny fyziochemických vlastnosti enzymu (například zvýšení celkového kladného náboje enzymu). Kromě toho se mohou vytvořit cílené mutace genu divokého typu za účelem eliminování jistých disulfidových vazeb nacházejících se v konečném proteinovém produktu za získání zvýšené tepelné stability a katalytické funkce.
ί· • ·· · ·
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Sekvenční analýza navrhovaných mutací
Kritéria pro navrhované mutace pro zesílení glykosylace enzymu Appa byly: 1) potenciální glykosylační místo by mělo mít 25% selekční přístupnost nebo vyšší a 2) toto místo by mělo být snadno vytvořeno jednoduchou výměnou zbytků za vzniku N-vázáného glykosylačního motivu (Asn-X-Ser nebo Asn-X-Thr, kde X není prolin). Zpočátku v nepřítomnosti krystalické struktury pro enzym AppA se použila krystalická struktura krysí kyselé fosfatázy (35% identita sekvence) (Schneider, G. et al., EMBO J. 12:2609-15(1993), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu) pro výpočet přístupností následujícím způsobem. Za prvé enzym AppA a krysí kyselá fosfatáza se seřadily do několika blízce příbuzných fosfatáz/fytáz za použití multisekvenčního seřazovacího programu ΡΙΜΑ (Smith, R. et al., Protein Engineering 5:35-41(1992), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu). Spojené sekvence zahrnovaly: prekurzor lidské prostatické kyselé fosfatázy (přírůstkové číslo v genové bance: P15309); histidinovou kyselou fosfatázu z Caenorhabditis elegans (přírůstkové číslo v genové bance: Z68011); fytázu z Aspergillus fumigatus (přírůstkové číslo v genové bance: U59804); potlačitelnou kyselou fosfatázu z Pichia angusta (přírůstkové číslo v genové bance: AF0511611); krysí kyselou fosfatázu (přírůstkové číslo v genové bance: 576257) a appA z E. coli (přírůstkové číslo v genové bance: M58708). Dále se stanovil povrch všech aminokyselin krysí fosfatázy přístupný pro selekci za použití programu DSSP (definice sekundární struktury proteinů) (Kabsch, W. et al., Biopolymers 22:2577-637(1983), přičemž • · · · · · ·· ·· · · · • · · · · · « tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu) konverzí těchto hodnot na procentickou přístupnost dělením celkové plochy povrchu příslušné aminokyseliny, jak se to předtím popsalo (Eisenberg, D. et al., Chemica Scripta 29A, 217-221(1989), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu). Pouze zbytky s větší než 25 % přístupností byly stanoveny jako přístupné. Hodnoty se přidělily příslušným aminokyselinám v enzymu AppA na základě seřazení sekvencí popsaného výše za předpokladu, že celková struktura krysí kyselé fosfatázy a enzymu AppA by se zachovala. Konečně předpokládané zbytky přístupné pro selekci se přezkoušely za účelem stanovení, který by se mohl snadno konvertovat na N-glykosylačním místě bodovou mutací. Z 31 potenciálních míst bylo selektováno 5, která nejlépe splňovala požadovaná kriteria. Zavedla se přídavná mutace C200N za použití primeru P2 navrhovaného pro jinou studii mutageneze appA. Z provedeného seřazení je mutace C200N v otevřené oblasti a C200 je zabalena s C210 (označená jako C178/C188 v práci Lim et al., Nat. Struct. Biol. 7:10813(2000), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu) při vytváření jediné disulfidové vazby mezi helixem G a smyčkou GH (a neorganizovaná konfigurace mezi helixy G a H) v α-doméně proteinu (Lim et al., Nat. Struct. Biol. 7:10813(2000), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu). Podobně se navrhlo 6 PCR primeru: E2 a K2 pro amplifikaci sekvence appA divokého typu (Dassa, J. et al., J. Bacteriol. 172:5497-500(1990), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu) a ostatní pro vývoj čtyř mutant (tabulka 1 a obrázek 1). Všechny tyto primery se syntetizovaly pomocí z^&ízehí. pro syntézu oligonukleotidů od Cornell University (Ithaca, NY).
• · · · • ·
Tabulka 1
Modifikované primery a index selekční přístupnosti povrchu pro mutace
Primer1 Poloha2 Sekvence primeru3 Modi- fikace4 Přístup- nost5 (%)
E2(f) 241- 5’ GGAATTCGCTCAGAGCCGGA 3’ EcoRl
264 (SEQ. ID. No. 5) restrikci Árieto
Al(r) 565- 5’ CTGGGTATGGTTGGTTATATTACAG A131N 1.05
592 TCAGGT3’ (SEQ. ID. No. 6) V134N 0.55
P2(f) 772- 5’ CAAACTTGAACCTTAAACGTGAG 3’ C2O0N nd
795 (SEQ. ID. No. 7)
P3 (r) 796- 5’ CCTGCGTTAAGTTACAGCTTTCATT D207N 0.63
825 CTGTTT3’ (SEQ. ID. No. 8) S21 IN 0.65
K2(r) 1469- 5’ GGGGTACCTTACAAACTGCACG 3’ ApnI _ '
1491 (SEQ. ID. No. 9) restrik«hi m'sto
x: f - směřující dopředu; r - reverzní;
2: nukleotidová poloha založená na periplazmatické fosfatáze z E. coli, pH 2,5 (přírůstkové číslo v genové bance: M58708);
3: podtržené nukleotidy byly substituovány;
4: přidaná aminokyselinová substituce nebo restrikční místo.
Kódující oblast začíná u kodónu 20 a končí u kodónu 432. Aminokyseliny A131, V134, C200, D207 a S211 jsou označeny . A109, V112, C178, D185 a S189 podle Lim et al. (Lim et al., Nat. Struct. Biol. 7:108-13(2000), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu).
5: Procentický podíl povrchové selekční přístupnosti aminokyselin (Smith, R. et al., Protein Engineering 5:3541(1992); Kabsch, W. et al., Biopolymers 22:2577-637(1983), přičemž tyto práce jsou tímto začleněny pomocí odkazu); nd - nestanoveno.
Příklad 2
Konstrukce mutant pomocí PCR
Mutanty appA E. coli se skonstruovaly za použití megaprimerové do místa orientované mutageneze upravené podle předcházejících studií (Seraphin, B. et al., Nucl. Acids Res. 24:3276-77(1996); Smith, A. M. et al., Bio Techniques 22:43839(1997), přičemž tyto práce jsou tímto začleněny pomocí odkazu). Za účelem amplifikace neporušené kódující oblasti appA se připravila PCR v 50 μΐ konečného objemu obsahujícího 200 ng DNA appA vložené do plazmidu pAPPAl izolovaného z kmene E. coli BL21 (Dassa, J. et al.., J. Bacteriol. 172:5497500(1990), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu), 50 pmol každého z primerů E2 a K2, 5 U DNA-polymerázy AmpliTaq (Perkin Elmer, Norwalk, CT), 10 mM Tris-HCl pH 8,3, mM KC1, 12,5 mM MgCl2 a 200 mM každého dNTP (Promega Corp., Madison, WI). Reakce se prováděla za použití systému GeneAmp PCR 2400 (Perkin Elmer) a zahrnovala 5 cyklů při 94 °C (3 min), 30 cyklů [94 °C (0,5 min), 54 °C (1 min) a 72 °C (1,5 min)] a 1 cyklus při 72 °C (10 min). Megaprimery pro mutanty se produkovaly v odděleném cyklu PCR (tabulka 2).
Tabulka 2
Denominace a konstrukce mutanty appA E. coli
Konstrukt1 Velikost bp Počet glykosylací
Mutanty R E2A1P3K2 1350 7
U E2P2P3K2 1350 5
Y E2A1P2P3K2 1350 7
Divoký typ r-AppA E2K2 1350 3
1 Viz tabulku 1 pro denominaci primerů
První mutagenní PCR reakce (100 μΐ) se prováděla tak, jak se popisuje výše, za použití 4 μΐ neporušené PCR reakční směsi appA a příslušných modifikovaných primerů uvedených v tabulce 1. Všechny megaprimerové PCR produkty se rozložily gelovou elektroforézou v 1,5% agaróze s nízkou teplotou tání (Gibco BRL, Grand Island, NY). Předpokládané fragmenty se vyštěpily a eluovaly pomocí kitu GENECLEAN II (Bio 101, Vista, CA).
Konečná mutagenní PCR reakce (100 μΐ) se prováděla podle popisu uvedeného výše, za použití 4 μΐ PCR produktu appA a měnících se koncentrací purifikovaného megaprimeru (50 ng až 4 μg) v závislosti na jeho velikosti. Provádělo se pět termálních cyklů 1 min při 94 °C a 2 min při 70 °C. Zatímco při 70 °C se přidal 1 pmol primeru směřujícího dopředu a 2 U DNA-polymerázy • · · • ·
AmpliTaq a jemně smíchal s reakční směsí, termální cykly pokračovaly 25-krát 1 min při 94 °C, 1 min při 56 °C a 1,5 min při 70 °C.
Příklad 3
Subklonování a exprese
Kmen E. coli TOPIOF' (Invitrogen, San Diego, CA) se použil jako počáteční hostitel. Fragmenty PCR se purifikovaly a klonovaly do vektoru pGEMT-Easy (Promega) podle návodů výrobce. Pro vyhledávání pozitivních transformantů se použilo štěpení izolované plazmidové DNA pomocí EcoRI. Výsledné inzerty se klonovaly do pPICZaA (kit Easy-Select, Invitrogen) u místa EcoRI a transformovaly do buněk TOPIOF' nanesených na médiu LB (Luria-Bertani) obsahujícím 25 gg/ml zeocinu. Kolonie s požadovanými inzerty se správnou orientaci se selektovaly za použití restrikčního štěpení plazmidové DNA pomocí Sall nebo BstXl. Kmen P. pastoris X33 (Mut+ His+) se použil jako hostitel pro expresi proteinu (Invitrogen) a pěstoval se v kapalném médiu YPD (médium s kvasinkovým extraktem obsahujícím pepton a dextrózu) před elektroporací. Dva gg plazmidové DNA se linearizovaly za použití restrikčního enzymu Bglll nebo Pmel a potom transformovaly do X33 podle návodů výrobce (Invitrogen). Po selekci se transformanty inkubovaly v minimálním médiu s glycerolem (GMGY) 24 hodin, pro vyvolání exprese proteinů se použilo médium s 0,5 % methanolu (GMGY).
• ·
Příklad 4
Purifikace enzymů a biochemická charakterizace
Exprimovaný r-AppA a mutantní enzymy v supernatantu z média se podrobily dvojstupňovému srážení síranem amonným (25% a 75%), jak bylo dříve popsáno (Rodriguez, E. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:117-23(1999), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu). Suspenze z první série se centrifugovala 20 minut při 4 °C a 25.000 x g. Peleta z druhé série se supendovala v 10 ml a dialyzovala přes noc proti 25 mM Tris-HCl, pH 7. Po dialýze se proteinový extrakt naplnil do sloupce DEAE(diethylaminoethyl)-Sepharose (Sigma, St. Louis, MO) ekvilibrovaného pomocí 25 mM Tris-HCl, pH 7. Navázaný protein se eluoval 1M NaCl v 25 mM Tris-HCl, pH 7. Tři frakce projevující nejvyšší aktivity se spojily a dialyzovaly proti 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 pro následující analýzu. Fytázová aktivita se měřila za použití fytátu sodného jako substrátu (Rodriguez, E. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:117-23(1999); Piddington, C.S. et al., Gene 133:55-62(1993), přičemž tyto práce jsou tímto začleněny pomocí odkazu). Enzym se zředil v 0,25M glycin-HCl, pH 2,5 a přidal se stejný objem roztoku substrátu obsahujícího 11 mM fytátu sodného (Sigma). Po 15-minutové inkubaci vzorku při 37 °C se reakce ukončila přidáním stejného objemu 15% trichloroctové kyseliny. Volný anorganický fosfor se stanovil při 820 nm po smíchání 0,2 ml vzorku s 1,8 ml H2O a 2 ml roztoku obsahujícího 0,6 M H2SO4, 2 % askorbové kyseliny a 0,5 % molybdenanu amonného a potom následovala 20-minutová inkubace při 50 °C. Jedna fytázová jednotka se definovala jako velikost aktivity, která uvolní 1 pmol anorganického fosforu z fytátu sodného za minutu při 37 °C. Konečné koncentrace fytátu sodného použitého pro kinetiku enzymu byly: 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2,5, 10 a 25 mM. Aktivita kyselé fosfatázy se analyzovala za použití pNPP (Sigma) při konečné koncentraci 25 mM (Smith, R. et al., Protein Engineering 5:35-41(1992), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu). K 50 μΐ enzymu (40 nmol) se přidalo 850 μΐ 250mM glycin-HCl, pH 2,5. Po 5-minutové inkubaci při 37 °C se přidalo 100 μΐ pNPP. Uvolněný p-nitrofenol se měřil při 450 nm po smíchání 0,1 ml vzorku s 0,9 ml 1M NaOH a inkubaci po 10 min. Konečné koncentrace pNPP použitého pro kinetiku enzymu byly: 0,1, 0,2, 0,75, 1,
2,5, 10 a 25 mM. Jedna jednotka aktivity kyselé fosfatázy/fytázy byla definována jako množství enzymu katalyzujícího vytvoření 1 μιηοΐ p-nitrofenolu za minutu. Před zkouškou tepelné stability se enzym (2 mg/ml) zředil 1:400 v 0,2M glycin-HCl, pH 2,5. Zředěné vzorky se inkubovaly 15 minut při 25, 55, 80 a 90 °C. Po ochlazení vzorků na ledě během 30 minut se stanovila jejich zbylá fytázová aktivita, jak se popisuje výše. Deglykosylace purifikovaných enzymů se provedla inkubací 100 pg celkového proteinu s 0,5 IU endoglykosidázy Hf (Endo Hf) během 4 hodin při 37 °C podle návodu výrobce (New England Biolabs, Beverly, MA). Gelová elektroforéza v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE), 15% (hmotnost/objem) se provedla tak, jak se popsalo dříve (Laemmli, U.K., Nátuře 227:680-85(1970) přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu). Koncentrace protein se stanovily za použití Lowryho metody (Lowry, O.H. et al., J. Biol. Chem. 193:265-75(1951), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu).
Údaje se analyzovaly za použití SAS (zveřejnění 6.04, SAS insitute, Cary, NC, USA).
Příklad 5
Účinky do místa orientované mutageneze na expresi fytázy a glykosylaci
Genomová DNA z každého kvasinkového transformantu se extrahovala za účelem amplifikace požadovaného mutovaného appA pomocí PCR (polymerázová řetězová reakce) za použití primerů E2 a K2. Všechny požadované mutace se potvrdily sekvenováním. Pro každou mutantu se analyzovalo 24 kolonií na fytázovou aktivitu v různých dobách po indukci. Všechny tři mutanty, mutanta R, mutanta U a mutanta Y spolu s r-AppA se exprimovaly a sekretovaly za vzniku časově závislé akumulace extracelulární fytázové aktivity, která dosáhla plato v době 96 hodin po indukci methanolem. Aktivita platě v supernatantu z média byla 35, 175, 57 a 117 U/ml (tabulka 3). Kvasinka X33 transformovaná expresním vektorem pPICZaA se použila jako kontrola a neměla žádnou aktivitu nebo fytázový protein v SDSPAGE. Na purifikovaném proteinovém základě měla mutanta U nejvyšší specifickou fytázovou aktivitu 63 U/mg, potom mutanta Y, r-AppA a mutanta R (51, 41 a 32 U/mg proteinu v daném pořadí). Výtěžek proteinu získaného po purifikaci byl 645,
324, 688 a 425 mg/1 pro mutantu U a Y, r-AppA a mutantu R v daném pořadí (tabulka 3).
· • · • · · ·
Tabulka 3
Výtěžek fytázy a specifická aktivita r-AppA a tří mutant
Protein Fytázová aktivita1 Výtěžek proteinu2 Specifická aktivita3
-Endo Hf +Endo Hf
r-AppA 117 ± 15 688 ±44 41 ±3 37±4
R 35 ±4 425 ±26 32±2 29±2 ..
U 175 ±19 654 ±39 63 ±4* 65 ±5*
Y 57 ±8 324 ±18 .51 ±5 46±6
Fytázová aktivita (U/ml) v médiu GMMY po 96-hodinové kultivaci;
2: Výtěžek proteinu (miligramy purifikovaného proteinu na litr kultury);
3: Specifická fytázová aktivita (jednotky na miligram purifikovaného proteinu);
4: Označuje významný rozdíl (p < 0,05) ve srovnání s kontrolou r-AppA. Výsledky jsou reprezentativní pro tři pokusy.
V SDS-PAGE byla velikost pásu purifikovaného r-AppA 50 až 56 kDa, zatímco u mutanty R byla 68 až 70 kDa a u mutanty Y byla 86 až 90 kDa (obrázek 2). To poskytlo zvýšení hladiny glykosylace ze 14 % v r-AppA na 48 % v mutantě R a 89 % v mutantě Y. Hladina glykosylace v mutantě U se ukazovala stejná jako u r-AppA. Všechny tyto rekombinantní enzymy ukazovaly podobnou molekulovou hmotnost 45 až 48 kDa po deglykosylaci působením Endo Hf. Deglykosylace neovlivňovala významně specifickou aktivitu všech mutant nebo r-AppA (tabulka 3). Avšak zpracování těchto purifikovaných proteinů s β-merkaptoethanolem a Endo Hf způsobilo úplnou ztrátu fytázové aktivity.
Příklad 6
Účinky do místa orientované mutageneze na pH fytázy a teplotní optimum a tepelnou stabilitu
I když mutanty R, U a Y sdílejí stejné optimální pH (2,5) s r-AppA, mutanta U byla aktivnější (p < 0,05), zatímco mutanta Y byla méně aktivní (p < 0,05) než r-AppA při pH 3,5, 4,5 a 5,5 (obrázek 3). Teplotní optimum bylo 65 °C pro mutantu U a 55 °C pro ostatní dvě mutanty a r-AppA. V 0,2M glycin-HCl, pH 2,5, projevovala mutanta U vyšší (p < 0,05) zbytkovou fytázovou aktivitu než r-AppA po zahřívání při 80 °C a 90 °C po dobu 15 minut (obrázek 4).
Příklad 7
Účinky do místa orientované mutageneze na kinetiku enzymu
Hodnota Km pro pNPP (p-nitrofenylfosfát) se snižovala po polovině nebo po jednom pro fytát sodný po 70% s mutantou U versus r-AppA (P < 0,05) (tabulka 4). Následkem toho mutanta U demonstrovala 1,9-násobné zvýšení své zdánlivé katalytické účinnosti kcat/Km pro pNPP a 5,2-násobné zvýšení pro fytát sodný ve srovnání s r-AppA. I když hodnoty kcat/An, pro mutantu Y byly rovněž významně odlišné od hodnot r-AppA pro fytát sodný, skutečné zvýšení bylo relativně malé. Naopak mutanta R projevovala významně nižší katalytickou účinnost než r-AppA vůči oběma substrátům.
• «
Tabulka 4
Katalytické vlastnosti r-AppA a tří mutant
Substrát
Enzym pNPP Na- fytat
k-cat kca/K„ ^cai
(mM) (min1) (min1 M'1) (mM) (min1) (min1 M*)
r-AppA 3.66 ± 752 ± (2.0 ± 0.18) 1.95 1 2148 ± (1.11 ±0.13)
0.44 - 7.9 x 10J 0.25 33 x 106
R 7.87 1 390 ± (0.5 1 0.07) 3.07 ± 1657 ± (0.5410.09)
0.84’ 5-9' x 103’ 026* 23* x 106’
U 1.86 ± 1073 ± (5.8 ± 037) 0.581 4003 1 (6.9010.70)
35’ 13* x 10” 0.08* 56* x 106‘
Y 3.181 787 1 (2.510.17) 2.03 ± 3431 1 (1.69 1 021)
039 6.7 x 105 0.19 41* x 10”
Měření reakční rychlosti se prováděla trojitě, jak se zde
popisuje. Hodnoty Km se vypočítaly za použití grafické metody
Lineweaver-Burk. Všechny reakce se srovnávaly v 0,25 M glycinHC1, pH 2,5.
* Označuje významný rozdíl (P < 0,05) ve srovnání s kontrolou r-AppA. Výsledky jsou reprezentativní pro pět nezávislých příkladů.
Výše uvedené výsledky naznačují, že k enzymu AppA se mohou přidat přídavná N-glykosylační místa a/nebo jiné záměny aminokyselin prostřednictvím do místa orientované mutageneze.
Ve srovnání s r-AppA produkovaným neporušeným genem appA, mutantní enzymy R a Y jasně projevovaly zvýšenou glykosylaci, jak se znázorňuje prostřednictvím jejich rozdílů v molekulové hmotnosti před a po deglykolysaci. Tedy vytvořená N-glykosylační místa u těchto dvou mutant byla skutečně rozpoznána pomocí P. pastoris a správně zpracována. Kvůli vícenásobné mutaci u mutant R a Y tyto výsledky nemohou stanovit hladinu glykosylace v specifických upravených místech, ale užitečná informace se může odvodit srovnáním mezi mutantami a r-AppA.
Za prvé i když obě mutanty R a Y měly přídavná N-glykosylační místa vzhledem k r-AppA, mutanta Y ukazovala o 40 % vyšší glykosylaci než R (89% k 48 %). Protože substitucí C200N v mutantě Y byl rozdíl pouze mezi dvěma z těchto variant, a tak mutace nepřidala žádné předpokládané N-glykosylační místo, zdá se, že samotná záměna C200N může stupňovat N-glykosylaci v jistých místech. Za druhé i když mutanta U měla dvě přídavná N-glykosylační místa (Asn 207 a Asn 211), je zřejmé, že molekulová hmotnost byla stejná jako u r-AppA, naznačujíc, že tato dvě glykosylační místa v mutantě U byla mlčící (tichá).
To ukazuje, že i když přítomnost takové signální sekvence je pro glykosylaci potřebná, nemá nutně za následek glykosylaci (Meldgaard, M. et al., Microbiol. 140:159-66(1994), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu). Možná, že zbytky mutované v případě mutanty U nebyly selekčně přístupné, jak by se předpokládalo v důsledku seřazení sekvencí na základě struktury. Nedávno publikovaná krystalická struktura enzymu AppA může pomoci odpovědět na tuto otázku (Lim et al., Nat. Struct. Biol. 7:108-13(2000); Jia, Z. et al., Acta
Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 54:647-49(1998), přičemž tyto práce jsou tímto začleněny pomocí odkazu). Konečně mutanta R měla významné zvýšení glykosylac^e ve srovnání s mutantou U. Rozdíl mohl být způsoben dvěma přídavnými Nglykosylačními místy v A131N a V134N v mutantě R. Vzhledem k výše uvedeným výsledkům se mohou uskutečnit následující pozorování: 1) substituce A131N a V134N mají za následek zvýšenou glykosylaci enzymu AppA; 2) substituce D207N a S211N byly tiché; 3) substituce C200N zdánlivě zvyšuje glykosylaci v jiných místech v případě mutanty Y, ale ne u mutanty U.
• ♦ • · · · ·«»· · · · • ·· · · · ····»*· · ·
Obecně se přídavná glykosylace proteinů projevila v podporování blokování a zvýšení stability (Haraguchi, M. et al., Biochem. J. 312:273-80(1995); Imperiali, B. et al.,Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 92:97-112(1995), přičemž tyto práce jsou tímto začleněny pomocí odkazu). Naproti očekáváním mutanty R a Y neukazovaly zvýšenou tepelnou stabilitu přes zvýšené hladiny glykosylace. Překvapivě mutanta U ukazovala zvýšenou tepelnou stabilitu přesto, že má stejnou hladinu glykosylace jako rAppA. I když provedení C200N nenaznačuje, že se vyskytla Nglykosylace na jiných místech, vyšší glykosylace na specifických místech je možná. Jak se zdá, k tomuto jevu přispěly mutace samy o sobě spíše než glykosylace. Nedávná studie popsala produkci šesti odlišných fytáz exprimovaných v Aspergillus niger nebo v kvasince Hansenula polymorpha (Wyss, M. et al., Appl. Erviron. Microbiol. 65:359-66(1999), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu). Tyto výsledky ukázaly, že hladiny glykosylace závisely na zvoleném hostiteli, ale neměly žádný významný účinek na tepelnou stabilitu, specifickou aktivitu nebo opětovné sbalování proteinů (Wyss, M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 65:35966(1999), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu).
Kinetické údaje naznačují, že všechny tři mutanty a r-AppA mají nižšíKn, a vyšší kcat/Km pro fytát sodný než pro pNPP. Tyto pro rekombinantní enzymy mají jasně vyšší zdánlivou účinnostVfytát sodný než pro pNPP, ukazujíc tak, že enzym AppA je více fytázou než kyselou fosfatázou (Lim et al., Nat. Struct. Biol. 7:108-13(2000); (Rodriguez, E. et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:117-23(1999), přičemž tyto práce jsou tímto začleněny pomocí odkazu). Mutanta U projevovala nejvyšší zvýšení své zdánlivé účinnosti vůči oběma substrátům, vyšší než r-AppA. Zvýšení kcat/Km je nejpravděpodobněji způsobeno • · velkým snížením Km (1,86 k 3,66 mM pro pNPP a 0,58 k 1,95 mM pro fytát sodný). To znamená, že mutanta U je nasycena při mnohem nižší koncentraci substrátu, než r-AppA. Kromě toho existoval rovněž významný rozdíl v kcat pro oba substráty mezi těmito dvěma formami fytázy. Na základě struktury krysí kyselé fosfatázy (Schneider, G. et al., EMBO J. 12:2609-15(1993), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu), tyto mutace se nezdají zahrnuty v enzymovém aktivním místě nebo při tvorbě dimeru kyselé fosfatázy. Tyto mutanty pravděpodobně samotné nebo dohromady způsobují konformační flexibilitu enzymu, která se popsala předtím pro jiné proteiny (Kern, G. et al., Protein Sci. 2:1862-68(1993), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu). Na základě nedávno vyřešených krystalických struktur fytázy z E. coli (Lim et al., Nat. Struct. Biol. 7:108-13(2000), (Jia, Z. et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 54:647-49(1998), přičemž tyto práce jsou tímto začleněny pomocí odkazu) žádná z těchto mutací není přímo zapojena v oblasti vázající substrát. Avšak C200 a C210, označené jako C178 a C188 podle Lima et al. (Lim et al., Nat. Struct. Biol. 7:108-13(2000), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu) jsou zapojeny v disulfidové vazbě mezi helixem G a smyčkou GH v α-doméně proteinu (Lim et al., Nat. Struct. Biol. 7:108-13(2000), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu). Pomocí mutace C200N jediná disulfidová vazba v α-doméně již není přítomná ve smyčce GH. Tato záměna může mít za následek lepší flexibilitu a-domény vůči centrální dutině nebo „místu vázajícímu substrát enzymu (Lim et al., Nat. Struct. Biol. 7:108-13(2000), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu). Tato vnitřní flexibilita může být rovněž podporována skutečností, že mutanta U a v menší míře mutanta Y demonstrují zlepšení katalytické účinnosti při hydrolýze fytátu sodného. Protože u mutanty U nebyla glykosylace zvýšena, vytvořená glykosylační • · místa N207 a N211 označená jako D185 a S198 podle Lima et al. (Lim et al., Nat. Struct. Biol. 7:108-13(2000), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu) se mohou skrýt z odkrytého povrchu. Zlepšení tepelné stability pro mutantu U se může proto vysvětlit zvýšením počtu hydrofobních interakcí, které se nevyskytují u mutanty Y nebo mutanty R.
Stojí za zmínku, že specifické aktivity fytázy u všech tří mutant a r-AppA nebyly významně způsobeny deglykosylací. Avšak deglykosylace, jak se ukazuje v glykoproteinových hormonech (Terashima, M. et al., Eur. J. Biochem. 226:249-54(1994), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu) nebo v Schwanniomyces occidentalis α-amyláze exprimované v S. cerevisiae (Han, Y. et al., Appl. Erviron. Microbiol. 65:191518(1999), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu), může být spojena s možnými změnami konformace, které modulují vázání substrátu a (nebo) rychlost jeho zužitkování. Všechny mutanty a neporušená kontrola se úplně inaktivovaly βmerkaptoethanolem a deglykosylačním zpracováním. To naznačuje, že čtyři disulfidové vazby hrají celkem klíčovou roli při udržování katalytické funkce těchto rekombinantních fytáz (Ullah, A. H. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 227:311-17(1996), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí odkazu).
Závěrem, když helix G a smyčka GH neobsahují disulfidovou vazbu C200/C210 v mutantě U, α-doména se může stát nepatrně flexibilnější, což má za následek pozitivní modulaci katalytické účinnosti a tepelné stability enzymu. Protože krystalická struktura fytázy z E. coli bude zveřejněna v blízké budoucnosti (Lim et al., Nat. Struct. Biol. 7:10813(2000), přičemž tato práce je tímto začleněna pomocí »· ·* *9 9 • « · · '* * · « * *· · * • * · < * · Μ Ο» • · · · · · · » · * · odkazu), více studií cílené mutageneze by mělo objasňovat změny konformace, které mohou zlepšovat vlastnosti enzymu.
I když se zde podrobně znázornila a popsaly přednostní provedení, odborníkům v příslušném oboru bude zřejmé, že se mohou uskutečnit různé modifikace, doplňky, záměny a podobně bez odchýlení se od ducha předloženého vynálezu a tyto proto spadají do rozsahu předloženého vynálezu, který se definuje v následujících nárocích.

Claims (52)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaná mutantní kyselá fosfatáza/fytáza produkovaná provedením velkého počtu substitucí aminokyselin v kyselé fosfatáze/fytáze z Escherichia coli divokého typu s aminokyselinovou sekvencí SEQ. ID. No. 1, přičemž substituce aminokyselin zahrnují substituce v polohách 200, 207 a 211.
  2. 2. Izolovaná mutantní kyselá fosfatáza/fytáza podle nároku 1, vyznačující se tím, že substitucí aminokyselin v poloze 200 je substituce aminokyselinového zbytku Cys za aminokyselinový zbytek Asn, substitucí aminokyselin v poloze 207 je substituce aminokyselinového zbytku Asp za aminokyselinový zbytek Asn a substitucí aminokyselin v poloze 211 je substituce aminokyselinového zbytku Ser za aminokyselinový zbytek Asn, přičemž izolovaná mutantní kyselá fosfatáza/fytáza má aminokyselinovou sekvenci SEQ. ID. No. 3.
  3. 3. Izolovaná mutantní kyselá fosfatáza/fytáza podle nároku 1, vyznačující se tím, že tato izolovaná mutantní kyselá fosfatáza/fytáza je v čisté formě.
  4. 4. Izolovaná mutantní kyselá fosfatáza/fytáza podle nároku 1, vyznačující se tím, že tato izolovaná mutantní kyselá fosfatáza/fytáza je rekombinantní.
  5. 5. Způsob zlepšení enzymatických vlastností kyselé fosfatázy/fytázy z Escherichia coli divokého typu s aminokyselinovou sekvencí SEQ. ID. No. 1, vyznačující se tím, že zahrnuje
    1V7
    000 ♦
    000 >
    0« · ·
    0 · 1 • · · « • * ·
    0 <· · * · změnu aminokyselinové sekvence této kyselé fosfatázy/fytázy divokého typu zavedením substituce aminokyselin do SEQ. ID.
    No. 1 v polohách 200, 207 a 211.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že substitucí aminokyselin v poloze 200 je substituce aminokyselinového zbytku Cys za aminokyselinový zbytek Asn, substitucí aminokyselin v poloze 207 je substituce aminokyselinového zbytku Asp za aminokyselinový zbytek Asn a substitucí aminokyselin v poloze 211 je substituce aminokyselinového zbytku Ser za aminokyselinový zbytek Asn, přičemž výsledkem těchto substitucí aminokyselin je mutantní kyselá fosfatáza/fytáza s aminokyselinovou sekvencí SEQ. ID. No. 3.
  7. 7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že zlepšenou enzymatickou vlastností je zvýšená tepelná stabilita.
  8. 8. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že zlepšenou enzymatickou vlastností je zvýšená fytázová aktivita při pH přibližně 3,5 až přibližně 5,5.
  9. 9. Izolovaná molekula DNA kódující mutantní kyselou fosfatázu/fytázu podle nároku 1.
  10. 10. Izolovaná molekula DNA podle nároku 9, vyznačující se tím, že kyselá fosfatáza/fytáza divokého typu je izolována z Escherichia coli.
  11. 11. Izolovaná molekula DNA podle nároku 10, vyznačující se tím, že tato molekula DNA obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ. ID. No. 4 nebo hybrídizuje s molekulou DNA obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ. ID. No.
    4 za stringentních podmínek zahrnujících hybridizaci při 42 °C v hybridizačním médiu obsahujícím 5X SSPE a 50 % formamidu s promýváním 0,5X SSPE při 50 °C.
  12. 12. Izolovaná molekula DNA podle nároku 9, vyznačující se tím, že substitucí aminokyselin v poloze 200 je substituce aminokyselinového zbytku Cys za aminokyselinový zbytek Asn, substitucí aminokyselin v poloze 207 je substituce aminokyselinového zbytku Asp za aminokyselinový zbytek Asn a substitucí aminokyselin v poloze 211 je substituce aminokyselinového zbytku Ser za aminokyselinový zbytek Asn, přičemž výsledkem těchto substitucí aminokyselin je mutantní kyselá fosfatáza/fytáza s aminokyselinovou sekvencí SEQ. ID. No. 3.
  13. 13. Expresní systém rekombinantní DNA zahrnující molekulu DNA podle nároku 9.
  14. 14. Expresní systém podle nároku 13, vyznačuj ící se t í m , že molekula DNA je v heterologním expresním vektoru.
  15. 15. Expresní systém podle nároku 13, vyznačuj ící se t í m , že molekula DNA je vložena do expresního systému ve vhodné orientaci a správném čtecím rámci.
  16. 16. Hostitelská buňka obsahující heterologní molekulu DNA podle nároku 9.
  17. 17. Hostitelská buňka podle nároku 16, vyznačuj í cí se tím, že heterologní molekula DNA má nukleotidovou sekvenci SEQ. ID. No. 4.
    ···· · ·· ···· ι· ···· • · · · · · · * · • · · · · » · · • ···· · · · · · • · · · · · · · · * · • · ··· ·· ·· ·· · ·
  18. 18. Hostitelská buňka podle nároku 16, vyznačuj í cí se tím, že heterologní molekula DNA je v expresním systému rekombinantní DNA.
  19. 19. Hostitelská buňka podle nároku 16, vyznačuj í cí se tím, že hostitelskou buňkou je kvasinková buňka.
  20. 20. Hostitelská buňka podle nároku 19, vyznačuj í cí se tím, že kvasinková buňka je kmene zvoleného ze souboru zahrnujícího Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora a Schizosaccharomyces.
  21. 21. Hostitelská buňka podle nároku 19, vyznačuj í cí se tím, že kvasinková buňka je z methylotrofního kmene kvasinek.
  22. 22. Hostitelská buňka podle nároku 21, vyznačuj Ιοί se tím, že methylotrofní kmen kvasinek je zvolen ze souboru zahrnujícího Pichia, Hansenula, Torulupsis, Candida a Karwinskia.
  23. 23. Způsob rekombinantní produkce mutantní kyselé fosfatázy/fytázy zahrnující:
    transformaci hostitelské buňky s alespoň jednou heterologní molekulou DNA podle nároku 1 za podmínek vhodných pro expresi mutantní kyselé fosfatázy/fytázy a izolací mutantní kyselé fosfatázy/fytázy.
  24. 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je kvasinková buňka.
  25. 25. Způsob podle nároku 2, vyznačuj ící • · · · · · • · · • · · tím, že kvasinková buňka jeVkmene zvoleného ze souboru zahrnujícího Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora a Schizosaccharomyces.
  26. 26. Způsob podle nároku 24,vyznačující se tím, že kvasinková buňka je z methylotrofního kmene kvasinek.
  27. 27. Hostitelská buňka podle nároku 26, vyznačuj Ιοί se tím, že methylotrofní kmen* kvasinek je zvolen ze souboru zahrnujícího Pichia, Hansenula, Torulupsis, Candida a Karwinskia.
  28. 28. Krmivová kompozice pro zvířata obsahující izolovanou mutantní kyselou fosfatázu/fytázu podle nároku 1.
  29. 29. Způsob výroby krmivá pro zvířata zahrnující:
    zavedení izolované mutantní kyselé fosfatázy/fytázy podle nároku 1 do krmivá pro zvířata za podmínek účinných pro produkci krmivové kompozice pro zvířata.
  30. 30. Izolovaná mutantní kyselá fosfatáza/fytáza, která se odlišuje od kyselé fosfatázy/fytázy divokého typu z Escherichia coli s aminokyselinovou sekvencí SEQ. ID. No. 1 alespoň jednou substitucí aminokyselin, která narušuje tvorbu disulfidové vazby mezi aminokyselinovými zbytky Cys v poloze 200 a 210.
  31. 31. Izolovaná mutantní kyselá fosfatáza/fytáza podle nároku 30, vyznačující se tím, že tato izolovaná mutantní kyselá fosfatáza/fytáza je v čisté formě.
  32. 32. Izolovaná mutantní kyselá fosfatáza/fytáza podle nároku 30, vyznačující se tím, že tato izolovaná mutantní kyselá fosfatáza/fytáza je rekombinantní.
  33. 33. Způsob zlepšení enzymatických vlastností kyselé fosfatázy/fytázy z Escherichia coli divokého typu s aminokyselinovou sekvencí SEQ. ID. No. 1, vyznačující se tím, že zahrnuje změnu aminokyselinové sekvence této kyselé fosfatázy/fytázy divokého typu zavedením alespoň jedné substituce aminokyselin, která narušuje tvorbu disulfidové vazby mezi aminokyselinovými zbytky Cys v poloze 200 a 210.
  34. 34. Způsob podle nároku 33,vyznačující se tím, že zlepšenou enzymatickou vlastností je zvýšená tepelná stabilita.
  35. 35. Způsob podle nároku 33,vyznačující se tím, že zlepšenou enzymatickou vlastností je zvýšená fytázová aktivita při pH přibližně 3,5 až přibližně 5,5.
  36. 36. Izolovaná molekula DNA kódující mutantní kyselou fosfatázu/fytázu podle nároku 30.
  37. 37. Expresní systém rekombinantní DNA zahrnující molekulu DNA podle nároku 36.
  38. 38. Expresní systém podle nároku 37, vyznačuj íc se t í m , že molekula DNA je v heterologním expresním vektoru.
  39. 39. Expresní systém podle nároku 37, vyznačuj íc • · • φ se t í m , že molekula DNA je vložena do expresního systému ve vhodné orientaci a správném čtecím rámci.
  40. 40. Hostitelská buňka obsahující heterologní molekulu DNA podle nároku 36.
  41. 41. Hostitelská buňka podle nároku 40, vyznačuj í cí se tím, že heterologní molekula DNA je v expresním systému rekombinantní DNA.
  42. 42. Hostitelská buňka podle nároku 40, vyznačuj í cí se tím, že hostitelskou buňkou je kvasinková buňka.
  43. 43. Hostitelská buňka podle nároku 42, vyznačuj i cí se tím, že kvasinková buňka je kmene zvoleného ze souboru zahrnujícího Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora a Schizosaccharomyces.
  44. 44. Hostitelská buňka podle nároku 42, vyznačuj i cí se tím, že kvasinková buňka je z methylotrofního kmene kvasinek.
  45. 45. Hostitelská buňka podle nároku 44, vyznačuj ίο í se tím, že methylotrofní kmen kvasinek je zvolen ze souboru zahrnujícího Pichia, Hansenula, Torulupsis, Candida a Karwinskia.
  46. 46. Způsob rekombinantní produkce mutantní kyselé fosfatázy/fytázy zahrnující:
    transformaci hostitelské buňky s alespoň jednou heterologní molekulou DNA podle nároku 36 za podmínek vhodných pro expresi mutantní kyselé fosfatázy/fytázy a izolaci mutantní kyselé fosfatázy/fytázy.
    • »
    9 ·
  47. 47. Způsob podle nároku 46, vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je kvasinková buňka.
  48. 48. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že kvasinková buňka je kmene zvoleného ze souboru zahrnujícího Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora a Schizosaccharomyces.
  49. 49. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že kvasinková buňka je z methylotrofního kmene kvasinek.
  50. 50. Hostitelská buňka podle nároku 49, vyznačuj í cí se tím, že methylotrofní kmen kvasinek je zvolen z souboru zahrnujícího Pichia, Hansenula, Torulupsis, Candida a Karwínskia.
  51. 51. Krmivová kompozice pro zvířata obsahující izolovanou mutantní kyselou fosfatázu/fytázu podle nároku 30.
  52. 52. Způsob výroby krmivá pro zvířata zahrnující:
    zavedení izolované mutantní kyselé fosfatázy/fytázy podl nároku 30 do krmivá pro zvířata za podmínek účinných pro produkci krmivové kompozice pro zvířata.
CZ20021701A 1999-11-18 2000-11-17 Místně řízená mutageneze fytázy z Escherichia coli CZ20021701A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16617999P 1999-11-18 1999-11-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20021701A3 true CZ20021701A3 (cs) 2003-06-18

Family

ID=22602133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20021701A CZ20021701A3 (cs) 1999-11-18 2000-11-17 Místně řízená mutageneze fytázy z Escherichia coli

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP1230350B1 (cs)
JP (1) JP2003531574A (cs)
KR (1) KR100790918B1 (cs)
CN (1) CN1423694A (cs)
AU (1) AU1618801A (cs)
CA (1) CA2391739C (cs)
CZ (1) CZ20021701A3 (cs)
HU (1) HUP0203259A2 (cs)
MX (1) MXPA02004989A (cs)
PL (1) PL354805A1 (cs)
WO (1) WO2001036607A1 (cs)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6451572B1 (en) 1998-06-25 2002-09-17 Cornell Research Foundation, Inc. Overexpression of phytase genes in yeast systems
US6841370B1 (en) 1999-11-18 2005-01-11 Cornell Research Foundation, Inc. Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase
CA2465202C (en) 2001-10-31 2014-01-21 Phytex, Llc Phytase-containing animal food and method
SE0200911D0 (sv) 2002-03-22 2002-03-22 Chalmers Technology Licensing Phytase active yeast
CA2495660A1 (en) * 2002-08-12 2004-02-19 Genencor International, Inc. Mutant e. coli appa phytase enzymes
DE60335497D1 (de) 2002-09-13 2011-02-03 Cornell Res Foundation Inc Ergillus-phytasen
US7276362B2 (en) 2004-01-30 2007-10-02 Roche Diagnostics Operations, Inc. Recombinant histidine-tagged inosine monophosphate dehydrogenase polypeptides
DE102004050410A1 (de) * 2004-10-15 2006-06-08 Ab Enzymes Gmbh Polypeptid mit Phytaseaktivität und dieses codierende Nucleotidsequenz
US7919297B2 (en) 2006-02-21 2011-04-05 Cornell Research Foundation, Inc. Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase
PL2365064T3 (pl) * 2006-04-04 2015-05-29 Novozymes As Warianty fitazy
EP2069486A2 (en) 2006-08-03 2009-06-17 Cornell Research Foundation, Inc. Phytases with improved thermal stability
DK2057178T3 (da) * 2006-09-21 2014-02-03 Verenium Corp Phytaser, nucleinsyrer, som koder for dem, og fremgangsmåder til at fremstille og benytte dem
DE102006053059A1 (de) * 2006-11-10 2008-05-15 Ab Enzymes Gmbh Polypeptid mit Phytaseaktivität und erhöhter Temperaturstabilität der Enzymaktivität sowie dieses codierende Nukleotidsequenz
US8192734B2 (en) 2007-07-09 2012-06-05 Cornell University Compositions and methods for bone strengthening
AU2010249500B2 (en) 2009-05-21 2016-03-24 Basf Enzymes Llc Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN102102094B (zh) * 2009-12-16 2013-03-27 福建福大百特科技发展有限公司 热稳定脂肪酶,其编码基因的表达及其用途
CN104487571A (zh) * 2012-02-07 2015-04-01 丹尼斯科美国公司 糖基化作为植酸酶的稳定剂
DK3072962T3 (en) * 2013-11-12 2019-03-18 Feed Res Inst Caas PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF PHYTASE VARIANT WITH IMPROVED THERMOSTABILITY AND A PHYTASE VARIANT AND APPLICATION THEREOF
KR101695397B1 (ko) * 2016-02-29 2017-01-13 주식회사 비즈모델라인 가맹점의 고유코드를 이용한 결제 방법
CN107353327A (zh) * 2017-03-30 2017-11-17 南京百斯杰生物工程有限公司 植酸酶在黑曲霉中表达
EP3453719A1 (en) 2017-09-07 2019-03-13 Huvepharma Eood New thermostable phytases with high catalytic efficacy
CN110484520B (zh) * 2018-05-14 2023-08-04 广东溢多利生物科技股份有限公司 比活提高的植酸酶appa突变体及其基因和应用
CR20210147A (es) * 2018-08-20 2021-05-24 Locus Ip Co Llc Métodos para liberar fósforo desde materia orgánica
CN111218436B (zh) * 2018-11-27 2022-08-30 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种植酸酶突变体
EP4081645A4 (en) * 2019-12-23 2023-12-27 CARGILL, Incorporated FERMENTATION PROCESSES AND USES THEREOF
CN117683745A (zh) * 2020-04-29 2024-03-12 南京百斯杰生物工程有限公司 一种亲本植酸酶变体

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2231948C (en) * 1997-03-25 2010-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Modified phytases

Also Published As

Publication number Publication date
EP1230350A4 (en) 2003-02-19
JP2003531574A (ja) 2003-10-28
CN1423694A (zh) 2003-06-11
AU1618801A (en) 2001-05-30
EP1230350A1 (en) 2002-08-14
EP1230350B1 (en) 2014-01-22
KR100790918B1 (ko) 2008-01-03
KR20020061619A (ko) 2002-07-24
MXPA02004989A (es) 2003-01-28
HUP0203259A2 (hu) 2003-02-28
WO2001036607A1 (en) 2001-05-25
PL354805A1 (en) 2004-02-23
CA2391739C (en) 2013-04-09
CA2391739A1 (en) 2001-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20021701A3 (cs) Místně řízená mutageneze fytázy z Escherichia coli
US8540984B2 (en) Phytases with improved thermal stability
US7919297B2 (en) Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase
US6511699B1 (en) Enzymes with improved phytase activity
CN103224918B (zh) 具有肌醇六磷酸酶活性的多肽和编码它的多核苷酸
CA2332180C (en) Overexpression of phytase genes in yeast systems
US7736680B2 (en) Using mutations to improve Aspergillus phytases
US6841370B1 (en) Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase
US9353357B2 (en) Polypeptides having phytase activity and the encoding nucleic acids
AU2016260521B2 (en) Glucanase production and methods of using the same
CA2530809A1 (en) Novel phytase and gene
García et al. Technological Advances in the Production of Phytases