CZ20013037A3 - Způsob mikrobiální výroby L-valinu - Google Patents
Způsob mikrobiální výroby L-valinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20013037A3 CZ20013037A3 CZ20013037A CZ20013037A CZ20013037A3 CZ 20013037 A3 CZ20013037 A3 CZ 20013037A3 CZ 20013037 A CZ20013037 A CZ 20013037A CZ 20013037 A CZ20013037 A CZ 20013037A CZ 20013037 A3 CZ20013037 A3 CZ 20013037A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- activity
- microorganism
- ilvd
- valine
- Prior art date
Links
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims abstract description 79
- 229960004295 valine Drugs 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 41
- 101150043028 ilvD gene Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 31
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 29
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 24
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 17
- 101150095957 ilvA gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101150105723 ilvD1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 13
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims abstract description 3
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 34
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 10
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 8
- 108700016168 Dihydroxy-acid dehydratases Proteins 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 7
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 7
- 101150081585 panB gene Proteins 0.000 claims description 7
- 108010036575 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase Proteins 0.000 claims description 6
- 101100028493 Haloferax volcanii (strain ATCC 29605 / DSM 3757 / JCM 8879 / NBRC 14742 / NCIMB 2012 / VKM B-1768 / DS2) pan2 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 claims description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 11
- 101150090497 ilvC gene Proteins 0.000 abstract description 7
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 abstract description 6
- 101100125907 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) ilvC1 gene Proteins 0.000 abstract description 6
- 108010000200 Ketol-acid reductoisomerase Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 34
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- -1 L-isoleucine amino acid Chemical class 0.000 description 10
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 9
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 9
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 9
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 7
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 101150033780 ilvB gene Proteins 0.000 description 4
- 101150077793 ilvH gene Proteins 0.000 description 4
- 101150060643 ilvN gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108010070495 2-dehydropantoate 2-reductase Proteins 0.000 description 3
- 108010005694 Aspartate 4-decarboxylase Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102100038750 Myc-associated zinc finger protein Human genes 0.000 description 3
- 101710146400 Myc-associated zinc finger protein Proteins 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 2
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 2
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 2
- 150000005693 branched-chain amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- GXOGLXKLKOVKEA-UHFFFAOYSA-N formyl pentanoate Chemical compound CCCCC(=O)OC=O GXOGLXKLKOVKEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 2-oxobutanoic acid Chemical compound CCC(=O)C(O)=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAWVHZJZHDSEOC-UHFFFAOYSA-M 3,3-dimethyl-2-oxobutanoate Chemical compound CC(C)(C)C(=O)C([O-])=O IAWVHZJZHDSEOC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RCWFNCXDFSOVLG-UHFFFAOYSA-N 3-chloro-2-oxopropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CCl RCWFNCXDFSOVLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXABZTLXNODUTD-UHFFFAOYSA-M 3-fluoropyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=O)CF CXABZTLXNODUTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OJOLFAIGOXZBCI-UHFFFAOYSA-N 3-mercaptopyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CS OJOLFAIGOXZBCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251556 Chordata Species 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-SCSAIBSYSA-N D-valine Chemical compound CC(C)[C@@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 229930182831 D-valine Natural products 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101100242684 Mesorhizobium japonicum (strain LMG 29417 / CECT 9101 / MAFF 303099) panD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- ALEXXDVDDISNDU-JZYPGELDSA-N cortisol 21-acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O ALEXXDVDDISNDU-JZYPGELDSA-N 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N lipoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002897 organic nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 101150078841 pan gene Proteins 0.000 description 1
- 101150019254 panC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150076071 panD gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004417 patella Anatomy 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1014—Hydroxymethyl-, formyl-transferases (2.1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Předložený vynález se vztahuje na způsob mikrobiální přípravy L-valinu podle nároku 1 až 13, jakož i na transformované buňky případně mikroorganismy podle nároků 14-17 ve způsobu výroby použitelné,
Aminokyselina L-valin představuje obchodně významný produkt, který nalézá použití ve výživě zvířat, lidí a v medicíně. Je proto v obecném zájmu připravit zlepšený postup výroby L-valinu.
Dosavadní stav techniky
Valin se může vyrábět chemickou syntézou nebo biotechnologicky fermentací ve vhodných živných roztocích. Výhoda biotechnologické výroby pomocí mikroorganismů spočívá v tvorbě korektní stereoizomerní formy, totiž L-formy valinu, prosté D-valinu.
Různé druhy bakterií, jako např. Escheríchia coli, Serratia marcescens, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum nebo Brevibacteríum lactofermentum, mohou produkovat L-valin v živném roztoku, obsahujícím glukosu. Patent US 5 658 766 uvádí, že Escheríchia coli může dosáhnout zvýšené tvorby L-valinu mutací v aminoacyl-tRNA-ligase. Patentová přihláška WO 96 06926 ukazuje dále, že auxotropií liponové kyseliny může být dosaženo zvýšené tvorby L-valinu s Escheríchia coli. EP 0 694 614 A1 popisuje kmeny Escheríchia coli, které mají resistenci proti α-keto-máselné kyselině a v živném roztoku, obsahujícím glukosu, produkují L-valin, L-isoleucin nebo L-leucin.
EP 0 477 000 popisuje, že mutagenesí Corynebacterium nebo Brevibacterium a selekcí na resistenci k valinu může být zlepšena tvorba L-valinu. V tomtéž EP spise je ukázáno, že selekcí Corynebacterium nebo Brevibacteríum na resistenci proti různým analogům pyruvatu, jako β-fluoropyruvat, β-chloropyruvat, β-mercaptopyruvat nebo trimetylpyruvat, může být dosaženo zlepšené tvorby L-valinu. Díky Nakayamovi (Nakayama et al. 1961, J. Gen.Appl.Microbiol, JP) je známo, že nesměřovanými mutacemi zavedené auxotropie mohou vést k zlepšené akumulaci L-valinu.
V EP 0 356 739 A1 je ukázáno, že při amplifikaci DNA-úseku kódujícího syntézu acetohydroxykyseliny (ilvBN, viz též obr. 1) prostřednictvím plasmidu pAJ220V3 je zlepšena tvorba L-valinu.
Úlohou předloženého vynálezu je poskytnout nové podklady k mikrobiální výrobě L-valinu, zejména s pomocí coryneformních bakterií.
| • 0 • 0 0 | 0 0 0 0 0 | 0 0 | 0 0 | 0 0 | 0 0 • « 0 0 | 0 • | 00 0- 0 | Φ • 0 0 • |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | • | 0 | 0 | |
| Φ 00 0 | 0000 | 0 0 | 0 Φ | 0 · | 000 |
Podstata vynálezu
Tato úloha je podle vynálezu řešena tak, že v mikroorganismu je posílena aktivita hydratasy dihydroxykyseliny, kódovaných (ilvD)-geny a/nebo ilvD - genová exprese. Alternativně nebo v kombinaci s tím je aktivita synthasy acetohydroxykyseliny kódovaných (ilvBN-geny) a isomeroreduktasy (ilvC-) a/nebo exprese ilvBNC-genu v mikroorganismu posílena.
Pro postup podle vynálezu mohou být dodatečně použity mikroorganismy, v nichž je aktivita alespoň jednoho enzymu, který se účastní na cestě výměny látkové a snižuje tvorbu L-valinu, zeslabena nebo vyřazena. Tak jsou v postupu podle vynálezu s výhodou nasazeny mikroorganismy s defektní mutací v ilvA-genu threonindehydratasy a/nebo s defektní mutací v jednor < nebo více genů syntézy panthotenátu.
Pod pojmem valin nebo L-valin je v smyslu nárokovaného vynálezu míněna nejen volná kyselina, nýbrž také její sůl, např. vápenatá, sodná, amonná nebo draselná.
Pojem zesílení popisuje zvýšení mezibuněčné aktivity jmenovaných enzymů, kódovaných geny ilvD, ilvB, ilvN a ilvC. Ke zvýšení aktivity enzymů je zvýšena zejména endogenní aktivita v mikroorganismu. Zvýšení aktivity enzymu může být např. dosaženo, když v něm po změně katalytického centra následuje zvýšená obrátka substrátů, nebo v němž je zrušeno působení inhibitorů enzymů. Také může být vyvolána zvýšená aktivita enzymů zvýšením synthesy enzymů, např. amplifikací genů nebo vypnutím faktorů, které biosynthesu enzymů reprimují (zabržďují). Endogenní aktivita enzymů je podle vynálezu s výhodou zvýšena mutací odpovídajících endogenních genů. Takové mutace mohou být dosaženy buď klasickými necílenými metodami, jako např. ozářením UV-paprsky, či chemikáliemi, vyvolávajícími mutace, nebo cíleně pomocí metod genové technologie, jako jednoduchá či vícenásobná delece, jednoduchá či vícenásobná inserce a/nebo výměna/y nukleotidů.
Posílení exprese genu nastane podle vynálezu s výhodou zvýšením počtu kopií genu. K tomu je gen, příp. geny zabudován do genového konstruktu, příp. do vektoru, který obsahuje přednostně genům přiřazené regulační sekvence genů, zejména takové, které posilují expresi genů. Návazně je mikroorganismus, přednostně Corynebacterium glutamicum transformován s odpovídajícím genovým konstruktem .
Bylo zjištěno, že posílením exprese genu synthesy valinu ilvD z Corynebacterium glutamicum , kódovaného pro enzym hydratysy dihydroxykyseliny je produkován L-valin zlepšeným způsobem. Podle vynálezu působí zlepšenou tvorbu L-valinu v Corynebacterium glutamicum vedle zesílené exprese ilvD-genu také posílená exprese ilvBN-genů, kódujících pro enzym synthasy acetohydroxykyseliny a ilvC-genu, kódujícím pro enzym isomeroreduktasu. Další zlepšení tvorby L-valinu je dosaženo zvýšenou expresí všech jmenovaných genů v Corynebacterium glutamicum. Geny, nebo genové konstrukty mohou být k disposici v hostitelském organismu buď v plasmidech s různým počtem kopií, nebo být do chromosomu integrovány a anipíifikovány.
| • 99 | 99 | ·· | 99 | |||
| ♦ · 9 | • | • | 9 9 | 9 | 9 | • 9 |
| « · | • | • | 9 9 | 9 | 9 | |
| • | 9 | • | 9 9 | 9 | 9 | |
| 99 | 9 9 | ·· | 9 9 |
Další zvýšení exprese genu může být ovlivněno - alternativně nebo kombinovaně se zvýšením počtu genových kopií - posílením regulatorních faktorů, které positivně ovlivňují expresi genu. Tak může následovat posílení regulatorních prvků na transkripční rovině, kdy jsou použity zejména zesílené transkripční signály. Také může být mutována promotorni a regulační oblast, která se nachází proti proudu strukturního genu. Stejným způsobem působí kasety exprese, které jsou zabudovány proti proudu strukturního genu. Díky indukovatelným promotorům je dále možné stupňovat expresi během fermentativní tvorby L-valinu. Vedle toho je možné také posílení translace, čímž bude zlepšena např. stabilita m-RNA. Dále mohou být užity geny, které kódují pro odpovídající enzym s vysokou aktivitou. Alternativně může být dosažena zvýšená exprese daného genu změnou složení media a kultivačních podmínek. Návody k tomu nalezne odborník m.j. v publikacích : Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), u Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98,(1991)), v evropském patentovém spise EP 0 472 869, v US patentu 4,601,893, dále v publikacích autorů Schwarzer a Půhler (Bio/Technology 9, str.84-87 (1991)), Reinscheid et al.: (Applied and
Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)) a v patentové přihlášce WO 96/15246.
Pro posílení exprese genu jsou možná všechna výše zmíněná opatření ve všech myslitelných kombinacích.
Mikroorganismy, použitelné v postupu podle vynálezu, mohou vyrábět L-valin z glukosy, sacharosy, laktosy, fruktosy, maltosy, melasy, škrobu, celulosy nebo z glycerinu a ethanolu. Může se jednat o Gram-positivní bakterie např. rodu Bacillus nebo o coryneformní bakterie již zmíněného rodu Corynebacteríum nebo také o Arthrobacter. U rodu Corynebacteríum byl již zmíněn druh Corynebacteríum glutamicum, který je v odborném světě znám pro svoji schopnost tvořit aminokyseliny K tomuto druhu· patří divoké kmeny jako např. Corynebacteríum glutamicum ATCC13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacteríum lactofermentum ATCC13869, Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240, Corynebacteríum melassecola ATCC17965 a další.
K isolaci genu ilvD z Corynebacteríum glutamicum nebo jiných genů je nejdříve založena genová banka. Zakládání genových bank je popsáno ve známých učebnicích a příručkách. Jako příklad budiž uvedena učebnice Winnacker: Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Německo, 1990) nebo příručka Sandbrook et al. : Molecular Cloning, A laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989). Taková známá genová banka je W3110 kmene E.coli K-12 , jež byla založena v λ-vektorech, ( Kohara et al. :Cell 50, 495-508 (1987)). Bathe et al. (Molecular and Generál Genetics, 252, str. 55-265, (1996)) popisují genovou banku Cqrynebacteríum glutamicum ATCC13032, která byla s pomocí cosmidového vektoru SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84, str.2160-2164) založena v E.coli K-12 NM554 (Raleigh et al.,1988, Nucleic Acids Research 16, str. 1563-1575). K výrobě genové banky Corynebacteríum glutamicum v Escheria coli mohou být použity také plasmidy jako pBR 322 (Bolivar, Life Sciences, 25, str.807-818 (1979)) nebo pUC19 (Norrander et al. 1983, Gene, 26, str. 101-106). K přípravě genové banky Corynebacteríum glutamicum v Corynebacteríum glutamicum mohou být použity plasmidy jako jJC1 (Cremer et al., Mol. Gen.Genet. (1990) 220, str. 3221-3229) nebo pECM2 (Jágei et al., J.Bacteriol (1992) 174, str.5462-5465). Jako hostitelé se hodí zejména takové kmeny bakterií, které jsou restriktivně- a rekombinačně defektní. Příklad proto je kmen Eschería coli DH5amcr, popsaný v publikaci : Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) nebo kmen Corynebacterium glutamicum R127, isolovaný Lieblem et al. (FEMS Létt. (1989) 65, 299-304).
Genová banka je následné zabudována do indikátorového kmene transformací (Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, 557-580,1983) nebo elektroporací (Tauch et al. :1994, FEMS Microbiological Letters, 123, 343-347). Indikátorový kmen se vyznačuje tím, že má mutaci ve sledovaném genu, která vyvolá detekovatelný fenotyp, např. auxotrofii. Indikátorové kmeny příp mutanty lze získat z publikovaných zdrojů nebo sbírek kmenů, nebo musí být rovněž zvlášť připraveny. V rámci předloženého vynálezu byl izolován mutant 127/7 Corynebacterium glutamicum, který je defektní v ilvD-genu, kódujícím hydratasu dihydroxykyseliny. Po transformaci indikátorového kmene jako např. ilvD-mutant R127/7 s rekombinantním plasmidem, který nosí sledovaný gen, jako např. ilvD-gen a jehož expresí se stane indikátorový kmen vzhledem k odpovídající vlastnosti, jak např. potřebnost L-valinu , prototrofní.
Takto izolovaný gen, případně DNA-fragment, může být charakterizován stanovením Sekvence, jak např. popisuje Sanger a další (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 74, 5463-5467, 1977). Návazně může být analysován publikovanými metodami (Altschul a další, 1990, Journal of Molecular Biology 215, 403-410) stupeň identity ke známým genům, jež jsou obsaženy v datových bankách jako např. GenBank (Benson a další, 1998, Nucleic Acids Research,
26,1-7).
Tímto způsobem byla získána DNA-sekvence Corynebacterium glutamicum, kódující pro gen ilvD, jež tvoří složku SEQ ID NO 1 předloženého vynálezu. Dále byly odvozeny z předložené DNA-sekvence výše popsanými metodami sekvence aminokyselin odpovídajících enzymů. V SEQ ID NO 2 je představena vyplývající sekvence aminokyselin ilvD-genového produktu, totiž hydratasa dihydroxykyseliny
Takto charakterisovaný gen může být přiveden ve vhodném mikroorganismu k expresi, jednotlivě nebo v kombinaci s jinými. Známá metoda, geny exprimovat příp značně x primovat, spočívá v tom, žx sx gxny pomocí plasmidových vektorů amplifikují, a to takových, které mohou být navíc vybaveny signály exprese. Jako plasmidové vektory přicházejí v úvahu takové, které mohou replikovat v odpovídajících mikroorganismech. Pro Corynebacterium glutamicum přicházejí v úvahu např. vektory pEKExI (Eikmanns a další., Gene 102, 93-98 (1991)) nebo pZ8-1 (Evropský patentový spis 0 375 889) nebo pEKEx2 (Eikmanns a další, Microbiology 140, 1817-1828 (1994)) nebo pECM2 (Jáger a další, Journal of Bacteriology 174 (16), 5462-5465 (1992)). Příklady pro takové plasmidy jsou pJCIilvD, pECM3ilvBNCD, a pJCIilvBNCD. Tyto plasmidy jsou Eschería colilCorynebacterium glutamicum kyvadlový vektor, které nosí gen ilvD příp. gen ilvD dohromady s geny ilvB, ilvN a ilvC.
Vynálezci dále zjistili, že posílení genů jednotlivě nebo v kombinaci s geny ilvB, ilvN a ih/C se výhodně projevuje v takových mikroorganismech, které vykazují sníženou syntézu aminokyseliny L-isoleucin. Tato redukovaná syntéza může být dosažena delecí ilvA-genu,který kóduje pro syntézu L-isoleucinu specifický enzym threonindehydratasu.
φφ ♦· φφ ♦ « ·« · • ΦΦΦ ·«♦· Φ · ΦΦ φ ΦΦΦΦΦ · · · φ Φ Φ · ΦΦΦΦΦ· Φ φ Φ φ φ φ Φ φ Φ Φ
ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ ·Φ Φ« ·Φ*
Delece může nastat cílenými rekombinantními DNA-technikami. Pomocí těchto technik může být v chromosomu deletován threoninhydratasu kódující ilvA-gen. Vhodné metody k tomu jsou popisuje Scháfer et al (Gene (1994),145,69-73), nebo také Link et al (Journal of Bacteriology (1998) 179, 6228-6237). Také mohou být deletovány jen části genů, nebo také vyměněny mutované fragmenty genu threonindehydratasy. Delecí se docílí ztráta aktivity threonindehydratasy. Příklad takového mutanta je kmen Corynebacterium glutamicum ATCC13032áíIvA, který obsahuje deleci v ilvA- genu.
Vynálezci dále zjistili, že posílení genů ilvD, ilvB, ilvN a ilvC v další kombinaci se sníženou syntézou D-pantothenatu, především v kombinaci s další delecí ilvA-genu, se projevuje v mikrorganismech výhodně na tvorbě L-valinu, např.delecí genu panB a panC. Snížená syntéza D-pantothenatu může být dosažena oslabením nebo vyřazením odpovídajících enzymů biosyntézy příp. jejich aktivit. Zde přicházejí v úvahu enzymy ketopantoathydroxymethyltransferasa (EC 2.1.2.11), ketopantoatreduktasa, pantothenatligasa (EC 6.3.2.1) a aspartatdekarboxylasa (EC 4.1.1.11). Možností, jak enzymy a jejich aktivity vyřadit nebo oslabit, jsou postupy mutagenese.
K tomu přísluší necílené postuoy, které používají k mutagenesi chemické látky, jako •např. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin, nebo také ozáření UV-paprsky, s následujícím vyhledáním žádaných mikroorganismů s potřebností D-pantothenatu. Postupy k vyvolání mutace a hledání mutantů jsou všeobecně známé a mohou být převzaty z publikace Miller : A short course in bacterial genetics, A laboratory manual and Handbook for Escheria coli and related bacteria. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992) nebo v příručce Manual of methods for generál Bacteriology Americké bakteriologické společnosti (Washington D.C. USA, 1981).
Dále zde přísluší cílené rekombinantní DNA-techniky. S pomocí těchto metod mohou např. být v chromosomu deletovány geny panB, panC, panE a panD kódujících' ketopantoathydroxymethyltransferasu, pantothenatligasu, reduktasu ketopantoinkyseliny nebo aspartatdekarboxylasu jednotlivě nebo společně. Vhodrié metody k tomu jsou popsány v publikaci Scháfer et al (Gene (1994) 145, 69-73) nebe · také v publikaci Link (Journal of Bacteriology (1998) 179, 6228-6237). Také mohou být deletovány jen části genů nebo také vyměněny mutované fragmenty ketopantoathydroxymethyltransferasy, pantothenatligasy, reduktasy ketopantoinkyseliny nebo aspartatdekarboxylasy. Delecí nebo výměnou se tak docílí ztráta nebo snížení okamžité aktivity enzymů. Příklad takového mutantu je kmen Corynebacterium glutamicum ATCC13032ÁpanBC, který nese deleci v panBC operonu.
Podle vynálezu připravené mikrorganismy mohou být kultivovány kontinuálně nebo diskontinuálně v lázni (násadová kultivace), nebo v průtočné lázni (přítokový způsob) nebo opakovaným průtočný m způsobem (opakovaný přítok) za účelem výroby L-valinu. Shrnutí o známých kultivačních metodách je uvedeno v učebnici Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) nebo v učebnici Storhas : Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden,1994).
Použité kultivační medium musí vhodným způsobem splňovat nároky daného mikroorganismu. Popisy kultivačních medií různých mikroorganismů jsou obsaženy v příručce Manual of methods for generál Bacteriology Americké bakteriologické společnosti (Washington D.C., USA,1981). Jako zdroj uhlíku mohou být použity cukr a uhlovodany, jako např. glukoaa.sacharoaa, laktoaa, fruktoaa, maltoaa, melasa, škrob a * A
| AA | A A | ♦ A | |
| • A | A A | A | • |
| • | A | A | • |
| • | A A | A | A |
| A | A | A | A |
| A AA A | A· A A | A A |
| • A | A A | A | |
| A | A | A A | A A |
| A A | • A | A | |
| A | A A | • A | A |
| A | A | • A | A |
| AA | A A | AA A |
celulóza, oleje a tuky jako např. sojový olej, slunečnicový olej, podzemnicový olej a kokosové máslo, mastné kyseliny jako např. palmitová kyselina, stearová kyselina, linolová kyselina, alkoholy jako např. glycerin a ethanol a organické kyseliny jako např. octová kyselina. Tyto látky mohou být použity jednotlivě nebo ve směsi. Jako zdroj dusíku mohou být použity organické dusíkaté sloučeniny, jako peptony, extrakt z droždí, extrakt z masa, extrakt ze sladu, extrakt z nabobtnané kukuřice, sójová moučka, močovina nebo anorganické sloučeniny jako síran amonný, chlorid amonný, fosforečnan amonný, uhličitan amonný, a dusičnan amonný.Zdroje dusíku mohou být použity jednotlivě nebo ve směsí. Jako zdroj fosforu může být použit dihydrogenfosforečnan draselný nebo hydrogenfosforečnan draselný nebo odpovídající sole sodné. Kultivační medium musí dále obsahovat kovové soli, jako např. síran hořečnatý, nebo síran železnatý, které jsou nutné pro růst. Navíc mohou být přidány esenciální růstové látky jako arr.nokyseliny a vitaminy dodatečně k výše uvedeným látkám. Vyjmenované násadové látky mohou být přidány jako jednorázová násada nebo vhodným způsobem může být kultura během kultivace přikrmována.
Pro řízení pH kultury jsou vhodným způsobem nasazeny zásadité látky jako hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak, nebo kyselé látky jako kyselina fosforečná nebo kyselina sírová. K řízení vývinu pěny mohou být použity protipěnové prostředky, jako např. polyglykolester mastných kyselin. K udržení stability plasmidů mohou být přidány do media vhodné, selektivně působící látky, jako např. antibiotika. K udržení aerobních podmínek se do kultury vnáší kyslík, nebo kyslík obsahující směsi plynů, jako např.vzduch. Teplota kultury leží normálně mezi 20 až 50°C, s výhodou mezi 25 až 45°C. V kultivaci se pokračuje potud, až se vytvoří maximum L-valinu. Tento cíl je dosažen v normálních podmínkách během 10 až 160 hodin.
Koncentrace vznikajícího L-valinu může být stanovena známým způsobem (Jones a Gilligan (12983) Journal of Chromatography 266:471-482).
Příklady provedení vynálezu
Vynález je blíže osvětlen na následujících příkladech provedení.
Příklad 1 .Klonování, sekvenování a exprese ilvD-genu,kódujícího dehydratázu dihydroxykyseliny z Corynebacterium glutamicum.
1. Izolace ilvD mutanta z Corynebacterium glutamicum
Kmen Corynebacterium glutamicum R127 (Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: 329-334) byl mutován pomocí N-methy-N-nitro-N-nitrosoguanidinu (Sambrook et al., Molecular cloning, A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). K tomu bylo do 5 ml přes noc nasazené kultury Corynebacterium glutamicum vpraveno 250 μΙ N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidinu (5 mg/ml dimethylformamidu) a po dobu 30 minut při 30°C a 200 otáček/min inkubováno (Adelberg 1958, Journal of Bacteriology 76:326). Buňky byly následně • t · · 9 9 9 ·999
9 9 9 99 99 • 9 9 9 9 9 9 99
9999 9999 99 9· 99999 dvakrát vypláchnuty sterilním roztokem NaCl (0.9%). Replikačním rozetřením na misce s minimálním mediem CG XII s 15 ml g/l agaru (Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175:5595-5603) byly izolováni jen ti mutanti, kteří rostli při přídavku L-valinu,Lisoleucinu, L-leucinu (po 0,1 g/l).
Aktivita enzymu dehydratasy dihydroxykyseliny byla stanovena v surovém extraktu těchto mutantů. K tomu byly klony v 60 ml LB-media kultivovány a v exponenciální růstové fázi odstředěny. Buněčná peleta byla jednou omyta 0,05 M pufrem s fosforečnanem draselným a v tomtéž pufru resuspendována. Rozbití buňek nastalo pomočil0-minutového ošetření Litrazvukem (Branson-Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury US). Následně byly buněčné zbytky odděleny pomocí 30minutového odstřeďování při 13 000 ot./min a 4°C a zbytek nasazen jako surový extrakt (supernatant) pro stanovení enzymové aktivity . Směs na stanovení enzymové aktivity obsahovala 0,2 ml 0,25 M Tris/HCI, pH 8,0,05 ml surového extraktu a 0,15 ml 65 mM a,p-dihydroxy-p-methylvalerátu. Testovací násada byla inkubována při 30 °C, po 10, 20 a 30 minutách bylo vždy 200 μΙ vzorku odebráno a stanovena jejich koncentrace ketomethylvalerátu pomocí HPLC-analytiky (Hara et al. 1985, Analytica Chimica Acta 172:167-173). Jak ukazuje Tab. 1 nevykazuje kmen R 127/7 žádnou aktivitu dehydratasy dihydroxykyseliny, naproti tomu je ještě přítomna aktivita isomeroreduktasy a synthasy acetohydroxykyseliny jako dalších enzymů syntézy rozvětvených aminokyselin.
Tabulka 1 :Specifické aktivity (μηηοΙ/ηιίη a mg proteinu) enzymů biosyntesy valinu v kmenech Corynebacterium glutamicum
| Kmen | Dehydratasa Dihydroxykyseliny | Isomeroreduktasa | Synthasa acetohydroxykyseliny |
| R127 | 0,003 | 0,05 | 0,07 |
| R127/7 | 0,000 | 0,06 | 0,09 |
2. Klonování ilvD-genu Corynebacterium glutamicum
Chromosomální DNA z Corynebacterium Glutamicum R127 byla izolována způsobem jak popsali Schwarzer a Puhler (Bio/Technology 9 (1990) 84-87). Ta byla restrikčním enzymem Sau3A (Boehringer Mannheim) rozštěpena a rozdělena odstřeďováním v hustotním gradientu sacharosy (Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). Podíly s velikostí frakcí asi 6-10 kb byly nasazeny k ligaci s vektorem pJC1 (Cremer et al.,Molecular and Generál Genetics 220 (1990) 478-480). Vektor pJC1 byl s BamHI linearisován a defosforylován. Pět ng z toho bylo ligováno s 20 ng zmíněné frakce chromosomální DNA a tím transformovány mutanty R127 elektroporací (Haynes a Brotz.FEMS Microbiology Letters 61 (1989) 329-334). Transformanti byli testováni na schopnost růstu na misce s agarem a CGXII bez přídavku rozvětvených aminokyselin. Z více než 5000 testovaných transformantů po replikačním rozetření na misce s minimálním mediem a dvoudenní inkubaci při 30 °C vyrostlo 8 klonů. Z těchto klonů byla provedena preparace plasmidů, jak popsal Schwarzer et. al (Bio/Technology (1990) 9:84-87). Restrikční analysy plasmidové DNA ukázaly, že ve všech 8 klonech byl obsažen stejný • · plasmid, dále označovaný jako pRV. Plasmid nosil insert 4,3 kb a byl testován retransformací na svoji schopnost komplementovat ilvD-mutanty R127/7. Subklonováním byla vymezena oblast odpovědná za komplementaci mutantů R127/7 na jeden 2,9 kb Scal/Xhol-fragment (obr.2)
3. Sekvenování ilvD-genu
Byla provedena sekvenace nukleinových kyselin 2,9 kb Scal/Xhol-fragmentu metodou terminace řetězce pomocí dideoxynukleotidů Sangera et. al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA (1977 74:5463-5467). Přitom byla použita samočtecí sekvenační souprava (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, SE). Elektroforetická analysa gelu byla provedena automatickým, laserem excitovaným fluorescenčním sek/enátorem (A.L.F.) fy Amersham PharmaciaBiotech (Uppsala, ŠE). Získané sekvence nukleotidů byly analysovány souborem programů HUSAR (Verse 4.0, EMBL, Cambridge, GB). Sekvence nukleotidů je označena jako ID SEQ NO1. Analysa poskytla otevřený čtecí rámec 1836 základních párů, identifikovaných jako ilvD-gen a kódujících polypeptid 612 aminokyselin, který je zde označován jako SEQ ID NO 2.
4. Exprese ilvD-genu
Plasmid pRV byl rozštěpen restrikčními enzymy Scal a Xhol, podle pokynů výrobce restrikčního enzymu (Roche, Boehringer Mannheim). Následně bylo isolováno 2,9 kb ilvD fragmentu pomocí iontoměničové kolony (Quiagen, Hilden). Přečnívající konec Xhol- řezu isolovaného fragmentu byl vyplněn Klenowovou polymerázou. Vektor pJC1 (Cremer et al., Mol.Gen. Genet (1990) 220:478-480) byl odštípnut enzymem Pstl, rovněž ošetřen Klenowovou polymerázou a následně fragment a vektor ligován.
S ligační násadou byl kmen E.cofi DH5amcr (Grant et al., Proceeding of the National of Sčiénces of the United States of America USA, 87 (1990) 4645-4649) transformován (Hanahan.Journal of Molecular Biology 166(1983) 557-580). Preparací plasmidu (Sambrook et ál. Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour •Laboratory Press) byl z klonů identifikován jeden klon, který obsahoval rekombinantní plasmid pJCIilvD. S tímto plasmidem bylo transformováno Corynebacterium glutamicum ATCC13032 pomocí elektroporace podle Haynese et al. (1989.FEMS Microbiol.Lett.61:329-334). Následně byla určena ilvD kódovaná aktivita dehydratázy dihydroxykyseliny v Corynebacterium glutamicum ATCC13032 pJC1 a Corynebacterium glutamicum ATCC13032 pJCIilvD. Ktomu účelu byly klony kultivovány v 60 ml LB-mediu a v exponenciální růstové fázi odstředěny. Buněčná peleta byla jednou opláchnuta 0,05 M draselnofosfátového pufru a ve stejném pufru resuspendována. Rozbití buněk následovalo pomocí 10-ti minutového ošetření ultrazvukem (Branson-Sonifier W-250, Branson Sonic Pověr Co, Danbury.USA). Pak byly zlomky buňky odděleny 30-minutovým odstředěním při 13000 ot/min a 4°C a zbylý surový extrakt nasazen do enzymového testu. Reakční násada enzymového testu obsahovala 0,2 ml 0,25 Tris/Hcl, pH 8, 0,05 ml hrubého extraktu a 0,15 ml 65 mM alfa, p-dihydroxy-p-methylvalerátu. Testovací násada byla inkubována při 30°C, po 10,20 a 30 minutách byly odebrány vzorky 200 μΙ a stanovena koncentrace ketomethylvalerátu pomocí HPLC-analytiky (Hara et al. 1985, Analytica Chimica Acta 172:167-173). Jak vyplývá z tabulky 2, vykazuje kmen Corynebacterium glutamicum
| ♦ · • | ·· • · • | ·* * · • · | • • | • · | « • | • · | ||
| • | 9 * | |||||||
| • | ♦ | • | • | i · | • | |||
| ··· * | ·· | ·· | ·· | • · |
ATCC13032 pJCIilvD vystupňovanou aktivitu dehydratasy dihydroxykyseliny oproti kontrolnímu kmenu.
Tabulka 2: Specifická aktivita (μπΊοΙ/ηηίη a mg Proteinu) dehytratasy dihydroxykyseliny
| Plasmid | Aktivita dehydratasy dihydrokyseliny |
| PJCIilvD | 0,05 |
Příklad 2: Konstrukce ilvA deletovaného mutanta z Corynebacteríum glutamicum
Byla provedena vnitřní delece (vyštípnutí) ilvA-genu Corynebacteríum glutamicum ATCC13032 systémem genové výměny, kterou popsal Scháfer et.al. (Gene 145.6973 (1994)). Ke konstrukci inaktivačního vektoru pK19mobsacBAilvA byl nejdříve odstraněn vnitřní fragment 241 bp Bg1ll ilvA-genu na jednom EcoRI-fragmentu ve vektoru pBM21 (Móckel et al. 1994, Molecular Microbiology 13::833-842). Zde byl vektor v Bglll štěpen a po oddělení ilvA vnitřního Bglll-fragmentu pomocí elektroforézy agarového gelu religován. Následně byl izolován z vektoru neúplný gen jako EcoRI-fragment a ligován s EcoRI linearisovaným vektorem pk19mobsacB (Scháfer 1994, Gene 145:69-73). Vzniklý inaktivační vektor pK19mobsacBAilvA byl transformací zaveden do kmene E.coli S17-1 (Hanahan 1983, Journal of Molecular Biology 166:557-580) a konjugací do Corynebacteríum glutamicum ATCC13032 přenesen (Scháfer et al 1990, Journal of Bacteriology 172:1663-1666). Byly získány kanamycin-resistentní klony Corynebacteríum glutamicum, u nichž byl inaktivační vektor integrován do genomu. Aby se selektovaly na excisi vektoru, byly rozetřeny kanamycin-resistentní klony na LB-medium, obsahující sacharosu (Sambrook et.al. Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) s 15 g/l agaru 2% glukosy/10 % sacharosy a vznikly kolonie, které vektor díky druhé rekombinaci opět ztratily (Jáger et al. 1992, Journal of Bacteriology 174:5462-5465). Přeočkováním na misce s minimálním mediem (Medium CGXII s 15 g/l agaru (Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175 (1993) 5595-5603) s- i bez- 2 mM Lisoleucinu, příp. s- i bez- 50 pg/ml kanamycinu, bylo 36 klonů isolováno, které byly díky excisi vektoru na kanamycin sensitivní a na isoleucin auxotrofní, a u nichž byl v genomu jen neúplný ilvA gen (ÁilvA-Allel). Kmen byl označen jako ATCC13032AilvA a použit dále.
Příklad 3 : Klonování genů syntézy pantothenatu panB a panC z C.glutamicum
Klonování operonu
Chromosomální DNA z C.glutamicum ATCC13032 byla izolována a rozřezána restrikční endonukleázou Sau3A. Po elektroforetickém rozdělení gelu byly DNAfragmenty řádové velikosti 3 až 7 případně 9 až 20 kb extrahovány a následně ligovány do klonovacího místa BamHI vektoru pBR322. Kolonie nesoucí insert byly pomocí jejich
Ing. Marie SMRuKřOVÁ pa te ti to vý zás t rtpce
Velílikova 8, !60 00 Praha 6 ·· 99 • 9 ·
citlivosti na tetracyklin po přeočkování na LB- plotnách s 10pg/ml tetracyklinu isolovány. Preparacemi plasmidú (Sambrook et aLMolecular cloning.A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) byla izolováno ze svázaných klonů 8 knihoven plasmidú, které obsahovaly po 400 plasmidech s velikosti insertů od 9 do 20 kb a 9 knihoven plasmidú po 500 plasmidech s velikostí insertů 3 až 7kb. panB mutant SJ2 E. coli (Cronan et al. 1982, J.Bacteriol. 149:916-922) byl s touto genovou bankou pomocí elektroporace (Wehrmann et al. 1994, Microbiology 140: 3349-3356) transformován.Transformační násada byla přímo na CGXII-medium rozetřena (J.Bacteriol. (1993) 175:5595-5603). Z kmenů, které byly schopné růst bez přídavku pantothenatu byl izolován plasmid-DNA (Sambrook et al.1989) a pomocí retransformace se získalo 8 klonů u nichž byla potvrzena potřebnost D-pantothenatu.
,S 8 plasmidy bylo provedeno rastrikční mapování. Jeden ze zkoumaných vektorů, nazývaný dále pUR1 obsahoval insert 9,3 kb (obr. 3).Transformace E. coli panCmutantu DV39 (Vallari et al. 1985,J.Bacteriol. 164:136-142) dokázala, že vektor pUR1 je rovněž, schopen panC defekt tohoto mutantu komplementovat. Jeden 2,2 kb velký fragment insertu pUR1 byl sekvenován metodou štěpení řetězce pomoci dideoxynukleotidů podle Sanger et al. (Proč. Natl.Acad. Sci. USA (1977) 74: 54635467). Elektroforetická analysa gelu byla provedena automatickým laserovým fluorescenčním sekvencionálním analysátorem (A.L.F.) fy Amersham Pharmacia Biotqch (Uppsala, SE). Získaná sekvence nukleotidů byla analysována souborem programů HUSAR (Vydáni 4.0 EMBL, Cambridge, GB). Sekvence nukleotidů je zde označena jako No 3. Z analysy vznikly dva otevřené čtecí rámce. První zahrnuje 813 párů bázi a vykazuje vysokou homologii k již známým panB-genům z jiných organizmů. Gen panB z C.glutamicum , kóduje polypeptid 271 aminokyselin (viz SEQ ID No 4.). Druhý otevřený čtecí rámec zahrnuje 837 párů bází a vykazuje vysokou homologii k již známým panC-genům z jiných organismů. Gen panC z C.glutamicum kóduje polypeptid 279 aminokyselin (viz SEQ ID No. 5).
Příklad 4 : Konstrukce panBC-de'ečního mutantu z Corynebacterium glutamicum
Genomický panBC-fragment Corynebacterium glutamicum ATCC13032 jakož i Corynebacterium glutamicum ATCC 13032ΔίΙνΑ byl podroben výměně genu systémem popsaným Scháfer et. al. (Gene 145:69-73 (1994)). Ke konstrukci delečního vektoru pK19mobsacBApanBC byl nejdříve ligován fragment Sspl/Sall o velikostí 3,95 kb s panBC s pUC18, předem naštěpeným Smal/Sall. Poté byl restrikčním štěpením a religací odstraněn1293 bp velký fragment EcoRV/Nrul z roztrhané oblasti genu panBC. Aby se umožnilo překlonování v pK19mobsacB, byl s dvěma priméry 5'-GAGAACTTAATCGAGCAACACCCCTG,5'GCGCCACGCCTAGCCTTGGCCCTCAA a polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) deletovaný panBC-úsek v pUC18 amplifikován, aby se obdržel 0,5kb velký ApanBC fragment, nosící na koncích řez Sall, příp. EcoRI. Polymerázová řetězcová reakce (PCR) byla provedena podle Sambrook el.ál. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). s bybridisační teplotou 55 °C. Získaný fragment byl ligován vektorem pK19mobsac, předtím byl štěpen EcoRI/Sall a ošetřen s alkalickou fosfatasou. Získaný inaktivační vektor pK19mobsacBApanBC byl pomoci transformace vpraven do kmene S 17-1 Escherichia coli (Hanahan (1983) J.Mol.Biol. 166:557-580) a konjugaci transferován do Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (Scháfer at al.(1990) J.Bacteriol. 172:1663-1666). Byly tak získány klony Corynebacterium glutamicum, pately zást Velllikova 8, 16000, <· «· «« ··*
4 Λ 9 · · 4 * 4 9·· • · ® · 9 9 4 ·· • 4 44 44 444 44 • 4 4 4 4 4 4 44 «444 4444 4» 4» 44 444 resistentní ke kanamycinu, u nichž byl do genomu integrován inaktivační vektor. Aby se provedla selekce vektoru na excisi byly rozetřeny klony resistentní na kanamycin na LB-medium, obsahující sacharozu (Sambrook et al.,Molecular cloning.A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) s 15 g/l agaru, 2% glukosy/10 % sacharózy a získaly se tak kolonie, které vektor druhou rekombinací opět ztratily (Jáger et al. 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465). Přeočkováním na misce s minimálním mediem (Medium CGXII s 15 g/l agaru- Keilhauer et al. Journal of Bacteriology 175 (1993) 5595-5603), a s- či bez-přídavku 2mM L-isoleucinu, příp. s- či bez- přídavku 50 pg/ml kanamycinu, bylo 36 klonů izolováno, které následkem excize vektoru byly citlivé na kanamycin a k isoleucinu auxotrofní, a v nichž je neúplná sekvence pan genu (ApanBC-Allele) v genomu. Kmen byl označen jako ATCC13032ApanBC. Stejným způsobem popsaným podrobně na tomto, byla také zavedena delece panBC v ATCC13032AilvA, aby se obdržel kmen ATCC13032AilvAApanBC.
Příklad 5 : Exprese genů ilvD, ilvBN, ilvC v Corynebacterium glutamicum
Geny syntasy acetohydroxykyseliny (ilvBN) a isomeroreduktasy (ilvC) (Cordes et al. 1992, Gene 112:113-116 a Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology 175:55955603) a dehydratasy dihydroxykyseliny (ilvD) - příklad 1, byly klonovány k expresi ve vektoru pECM3. Vektor pECM3 je derivátem pECM2 (Jáger et al. 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465), který vznikl delecí cca 1 kbp dlouhého BamHl/BglII fragmentu DNA, nosícího resistenci ke kanamycinu.)
Ve vektoru pKK5 (Cordes et. al. 1992, Gene 112: -116) jsou již geny ilvBNC ve vektoru pJC1 (Cremer et al. 1990,Molecular and generál Genetics 220: 478-480) klonovány. Z něj byl izolován 5,7 kb Xbal-ilvBNC-fragment a spolu s jedním Xbalfragmentem vektoru pRV, o velikosti 3,1 kb a obsahujícím ilvD-gen, byl zaveden do vektoru pECM3, linearisovaného Xbal. Ligační násada byla zde transformována do kmene DH5amcr. Z klonu se obdržel plasmid pECM3ilvBNCD.
Pomocí elektroporace (Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61:329-334) a selekcí na resistenci k chloramfenikolu (3 pg/ml) byl zaveden plasmid pECM3ilvBNCD do kmene ATCC13032AilvA a vznikl kmen ATCC13032AilvA/pECM3ilvBNCD.
Příklad 6 : Výroba Lvalinu s různými kmeny Corynebacterium glutamikcum
Pro zkoušky na tvorbu valinu byly kmeny, uvedené v tabulce 4 .předkultivovány v BHI -mediu (Brain-Heart Infusion), výrobce Difco Laboratories.Detroit, USA, během 14 hodin při 30 °C. Následně byly buňky jednou oprány 0,9 % roztokem NaCl (hmotn./obj.) a s toto suspenzí vždy 0 ml media CGXII bylo tak naočkováno, že OD 600 (optická densita při 600 nm) činila 0,5. Medium bylo identické s tím, které popsal Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603). Pro kultivaci ΔΐΙνΑ kmenů obsahovalo medium navíc 250 mg/l L-isoleucinu. Složení media je uvedeno v tabulce 3.
Irtg. Marie SMMOVÁ patentový záhubce
Velílíkova 8, 160 00/Praha 6
| ·<· Φ· | ·· · | ||||
| 9 · | • « · | • | • | • · · | ·· |
| • | • · | • | ·· · · | • | |
| ♦ | • · · | • | • | • · · · | • |
| • ···· | • · ···· ·· | • | • | • · · ·· «· | • ··· |
Tabulka 3 : Složení media CGXII
| Složka | Koncentrace |
| (NH4)2 so4 | 20 g/l |
| Močovina | 5 g/l |
| KH2 P04 | 1 g/l |
| K2HPO4 | 1 g/l |
| MgSO4 .7H2O | 0,25 g/l |
| Kyselina 3-morfolinopropansulfonová | 42 g/l |
| CaCI2 | 10 mg/l |
| FeSO4.7 H20 | 10 mg/l |
| MnS04. H20 | 10mg/l |
| ZnSO . 7 H20 | 1 mg/l |
| CUSO4 | 0,2 mg/l |
| NiCI 2. 6 H20 | 0,02 mg/l |
| Biotin (pH 7) | 0,2 mg/l |
| Glukóza | 40 g/l |
| Kyselina protokatechuová | 0,03 mg/l |
Po 48-hodinové kultivaci byly odebrány vzorky, buňky byly odstředěny a zbytek sterilně filtrován. Koncentrace L-valinu ve zbytku byla určena pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie s integrovanou předkolonovou derivatisací aminokyselin s o-ftaldialdehydem dle Jonese a Gilligana (J.Chromatogr. 266 (1983) 471-482). Výsledky obsahuje tabulka 4.
Tabulka 4 : Produkce L-valinu s rrůznými kmeny Corynebacterium glutamicum
| Kmen Corynebacterium glutamicum | produkce L-valinu (mM) |
| ATCC13032 | 0,5 |
| ATCG13032 pJCIilvD | 2,2 |
| ATCC13032 pJCIilvBNC | 20,0 |
| ATCC13032 pJCIilvBNCD | 26,2 |
| ATCC13032 ΔιΙνΑ | 2,7 |
| ATCC13032 ΔιΙνΑ pJCIilvD | 7,0 |
| ATCC13032 ΔΐΙνΑ pJCIilvBNCD | 28,5 |
| ATCC13032 ÁpanBC | 8,2 |
| ATCC13032 ÁilvAÁpanBC | 31,1 |
| ATCC13032 ÁilvAApanBC pJCIilvBNCD | 72,7 |
Ing. Marto - ,
Claims (17)
1. Způsob mikrobiální výroby L-valinu při němž je ilvD-aktivita dehydratasy dihydroxykyseliny a/nebo exprese genu ilvD v jednom organismu posílena.
2, Žpůsob mikrobiální výroby L-valinu, při němž v jednom mikroorganismu posílena ilvBN-aktivita syntasy acetohydroxykyseliny a ilvC-aktivita isomeroreduktasy a/nebo exprese genu ilvBNC.
3. Způsob mikrobiální výroby L-valinu podle nároku 1 a 2.
4. Způsob podle jednoho nebo více předchozích nároků, vyznačený tím, že endogenní ilvD- a/nebo ilvBNC-aktivita je v mikroorganismu zvýšena.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že mutací endogenního ilvD-genu a/nebo ilvBNC-genů jsou připraveny odpovídající enzymy s vyšší aktivitou.
6. Způsob podle jednoho nebo více předchozích nároků 1 až 5,v y z n a č e n ý tím, že exprese genu ilvD a/nebo ilvBNC je posílena zvětšením počtu kopií.
7. Způsob podle nároku 6, v y z n a č e n ý t í m, že pro zvýšení počtu genových kopií je zabudován do genového konstruktu ilvD-gen a/nebo ilvBNC-geny.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačený tím, že mikroorganismus je transformován genovým konstruktem, obsahujícím ilvD-gen a/nebo ilvBNC-· geny.
9. Způsob podle nároku 8,v y z n a č e n ý t í m, že jako mikroorganismus je použit Corynebacteriufn glutamicum.
10. Způsob podle jednoho nebo více předchozích nároků 1 až 9,v y z n a č e n ý tím, že se použije mikroorganismus, v němž je zeslabena nebo vyřazena aktivita alespoň jednoho enzymu, podílejícího se na cestě výměny látkové, který snižuje tvorbu L-valinu.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že aktivita enzymu threonindehydratasy (ilvA), podílejícího se na syntéze L-valinu, je oslabena nebo vyřazena.
Ing. Marie ^MRČKOVA pa tentowNástupce
Veiflikova 6 • · • ·
12. Způsob podle nároku 11 nebo 12, vyznačený tím, že aktivita jednoho nebo více na syntéze D-pantothenátu se specificky podílejících enzymů, je oslabena nebo vyřazena.
13. Způsob podle nároku 12,vyznačený tím,že aktivita enzymu ketopantoathydroxymethyltransferasy (panB) a/nebo enzymu pantothenatligasy (panC) je oslabena nebo vyřazena.
14. Mikroorganismus, transformovaný genovým konstruktem obsahujícím ilvD-gen a/nebo ilvBNC-geny, v mikroorganismu je aktivita jednoho nebo více na syntéze Dpanthotenátu se specificky účastnících enzymů, oslabena nebo vyřazena.
15. Transformovaný mikroorganismus podle nároku 14, v němž je aktivita enzymu ketopantoathydroxymethyltransferasy (panB) a/nebo aktivita enzymu pantothenatligasy (panC) oslabena nebo vyřazena.
16. Transformovaný mikroorganismus podle nároku 14 nebo 15, v němž je aktivita enzymu threonindehydratasy (ilvA), podílejícím se na syntéze L-isoleucinu, oslabena nebo vyřazena..
17. Transformovaný mikroorganismus podle jednoho nebo více nároků 14 až 16 vyznačený tím, že mikroorganismem je Corynebacteríum glutamicum.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19907567A DE19907567B4 (de) | 1999-02-22 | 1999-02-22 | Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Valin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20013037A3 true CZ20013037A3 (cs) | 2002-01-16 |
Family
ID=7898429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20013037A CZ20013037A3 (cs) | 1999-02-22 | 2000-02-21 | Způsob mikrobiální výroby L-valinu |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7632663B1 (cs) |
| EP (1) | EP1155139B2 (cs) |
| JP (1) | JP4638048B2 (cs) |
| KR (1) | KR100614029B1 (cs) |
| AT (1) | ATE236991T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20013037A3 (cs) |
| DE (2) | DE19907567B4 (cs) |
| DK (1) | DK1155139T4 (cs) |
| ES (1) | ES2197076T5 (cs) |
| PT (1) | PT1155139E (cs) |
| SK (1) | SK285870B6 (cs) |
| WO (1) | WO2000050624A1 (cs) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19855312A1 (de) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien |
| EP1377662A2 (en) * | 2001-01-19 | 2004-01-07 | Basf Aktiengesellschaft | Methods and microorganisms for the production of 3-(2-hydroxy-3-methyl-butyrylamino)-propionic acid (hmbpa) |
| KR100442768B1 (ko) * | 2001-05-21 | 2004-08-04 | 주식회사 한국표지화합물연구소 | 방사성동위원소 표지화합물로서 ｌ-발린의 제조방법 |
| KR100451299B1 (ko) * | 2002-03-21 | 2004-10-06 | 씨제이 주식회사 | Ｌ―쓰레오닌의 제조방법 |
| GB2391083B (en) * | 2002-07-19 | 2006-03-01 | Picochip Designs Ltd | Processor array |
| DE102004046933A1 (de) * | 2004-09-28 | 2006-03-30 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Valin sowie dafür geeigneter Mikroorganismus |
| DE102005019967A1 (de) * | 2005-04-29 | 2006-11-02 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren |
| US9303225B2 (en) | 2005-10-26 | 2016-04-05 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Method for the production of isobutanol by recombinant yeast |
| US8273558B2 (en) | 2005-10-26 | 2012-09-25 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Fermentive production of four carbon alcohols |
| UA96928C2 (ru) | 2005-10-26 | 2011-12-26 | Э.И. Дю Пон Де Немур Энд Компани | Ферментативное продуцирование спиртов с четырьмя атомами углерода |
| EP1860193A1 (en) * | 2006-05-22 | 2007-11-28 | Evonik Degussa GmbH | Promoter-activity modulation for branched-chain amino acid production |
| JP2010017082A (ja) | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| KR100832740B1 (ko) * | 2007-01-17 | 2008-05-27 | 한국과학기술원 | 분지쇄 아미노산 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를이용한 분지쇄 아미노산의 제조방법 |
| MX2009008416A (es) | 2007-02-09 | 2010-01-25 | Univ California | Produccion de biocombustible mediante microorganismos recombinantes. |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| WO2009093703A1 (ja) | 2008-01-23 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ-アミノ酸の製造法 |
| EP2395096B1 (en) * | 2009-02-09 | 2014-04-09 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing L-amino acids |
| JP5882202B2 (ja) * | 2009-06-05 | 2016-03-09 | エボニック デグサ ゲーエムベーハーＥｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ | ２−ケトカルボン酸の製造方法 |
| JPWO2011013707A1 (ja) | 2009-07-29 | 2013-01-10 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2012223091A (ja) | 2009-08-25 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| KR101251540B1 (ko) | 2010-10-08 | 2013-04-08 | 한국과학기술원 | Ｌ-발린 생성능이 개선된 변이 대장균 ｗ 균주 및 이를 이용한 ｌ-발린의 제조방법 |
| KR101117022B1 (ko) | 2011-08-16 | 2012-03-16 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-발린 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-발린 제조방법 |
| CN103946370B (zh) | 2011-08-22 | 2016-08-17 | 公益财团法人地球环境产业技术研究机构 | 棒状细菌转化体和使用该转化体的缬氨酸的制造方法 |
| BR112015007916B1 (pt) | 2013-05-13 | 2023-04-04 | Ajinomoto Co., Inc | Método para produzir l-aminoácido |
| JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| BR112016008830B1 (pt) | 2013-10-23 | 2023-02-23 | Ajinomoto Co., Inc | Método para produzir uma substância alvo |
| JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| JP7124338B2 (ja) | 2018-02-27 | 2022-08-24 | 味の素株式会社 | 変異型グルタチオン合成酵素、及び、γ－グルタミルバリルグリシンの製造法 |
| EP3861109A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| KR102344689B1 (ko) * | 2020-09-01 | 2021-12-29 | 씨제이제일제당 주식회사 | L-발린 생산 미생물 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 |
| KR20240128697A (ko) * | 2021-12-22 | 2024-08-26 | 시에이치알. 한센 에이/에스 | 올리고당의 발효 생산에서 감소된 판토텐산 수준 |
| JPWO2023195475A1 (cs) | 2022-04-04 | 2023-10-12 | ||
| WO2024096123A1 (ja) * | 2022-11-04 | 2024-05-10 | 株式会社バイオパレット | 遺伝子が改変された微生物およびその生産方法 |
| CN116731933B (zh) * | 2023-08-03 | 2023-10-03 | 欧铭庄生物科技(天津)有限公司滨海新区分公司 | 一种谷氨酸棒杆菌及其在生产缬氨酸中的应用 |
| WO2025239610A1 (ko) * | 2024-05-14 | 2025-11-20 | 씨제이제일제당 (주) | 폴리뉴클레오타이드 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산방법 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU875663A1 (ru) | 1978-06-30 | 1982-09-15 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени |
| EP0336452B1 (en) | 1983-02-17 | 1993-10-13 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for preparing l-phenylalanine |
| JPH0746994B2 (ja) * | 1984-10-04 | 1995-05-24 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2748418B2 (ja) * | 1988-08-03 | 1998-05-06 | 味の素株式会社 | 組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物 |
| DE3942947A1 (de) * | 1989-12-23 | 1991-06-27 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur herstellung von l-isoleucin und dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna |
| US5534421A (en) * | 1991-05-30 | 1996-07-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Production of isoleucine by escherichia coli having isoleucine auxotrophy and no negative feedback inhibition of isoleucine production |
| JPH05344893A (ja) * | 1992-06-12 | 1993-12-27 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | アセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用 |
| JPH06277067A (ja) * | 1993-03-26 | 1994-10-04 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝子ｄｎａ |
| DE4400926C1 (de) * | 1994-01-14 | 1995-06-01 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Herstellung von L-Isoleucin mittels rekombinanter Mikroorganismen mit deregulierter Threonindehydratase |
| US5998178A (en) * | 1994-05-30 | 1999-12-07 | Ajinomoto Co., Ltd. | L-isoleucine-producing bacterium and method for preparing L-isoleucine through fermentation |
| US5888783A (en) * | 1994-08-30 | 1999-03-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Methods for producing L-valine and L-leucine |
| JPH0889249A (ja) * | 1994-09-29 | 1996-04-09 | Mitsubishi Chem Corp | ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を含むｄｎａ断片 |
| DE19855312A1 (de) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien |
-
1999
- 1999-02-22 DE DE19907567A patent/DE19907567B4/de not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-02-21 JP JP2000601187A patent/JP4638048B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-21 PT PT00906363T patent/PT1155139E/pt unknown
- 2000-02-21 CZ CZ20013037A patent/CZ20013037A3/cs unknown
- 2000-02-21 US US09/914,006 patent/US7632663B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-21 DE DE50001708T patent/DE50001708D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-21 EP EP00906363A patent/EP1155139B2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-21 DK DK00906363T patent/DK1155139T4/da active
- 2000-02-21 ES ES00906363T patent/ES2197076T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-21 WO PCT/EP2000/001405 patent/WO2000050624A1/de not_active Ceased
- 2000-02-21 KR KR1020017009864A patent/KR100614029B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-21 AT AT00906363T patent/ATE236991T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-02-21 SK SK1205-2001A patent/SK285870B6/sk not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100614029B1 (ko) | 2006-08-23 |
| EP1155139B1 (de) | 2003-04-09 |
| SK285870B6 (sk) | 2007-10-04 |
| ES2197076T5 (es) | 2009-05-20 |
| DK1155139T4 (da) | 2009-04-20 |
| DE19907567A1 (de) | 2000-08-24 |
| ES2197076T3 (es) | 2004-01-01 |
| US7632663B1 (en) | 2009-12-15 |
| EP1155139A1 (de) | 2001-11-21 |
| DK1155139T3 (da) | 2003-07-28 |
| SK12052001A3 (sk) | 2002-01-07 |
| DE50001708D1 (de) | 2003-05-15 |
| PT1155139E (pt) | 2003-08-29 |
| JP4638048B2 (ja) | 2011-02-23 |
| WO2000050624A1 (de) | 2000-08-31 |
| DE19907567B4 (de) | 2007-08-09 |
| KR20010108172A (ko) | 2001-12-07 |
| EP1155139B2 (de) | 2009-02-25 |
| ATE236991T1 (de) | 2003-04-15 |
| JP2002537771A (ja) | 2002-11-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20013037A3 (cs) | Způsob mikrobiální výroby L-valinu | |
| RU2262532C2 (ru) | Полинуклеотид, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксикиназу, и зонд, предназначенный для его получения | |
| US6177264B1 (en) | Method for the fermentative production of D-pantothenic acid using Coryneform bacteria | |
| KR100758831B1 (ko) | Ｌ-라이신 생산 코리네박테리아 및 ｌ-라이신의 제조방법 | |
| JP2926991B2 (ja) | 発酵法によるｌ−リジン及びｌ−グルタミン酸の製造方法 | |
| US20050196848A1 (en) | Process for the fermentative production of L-amino acids by attenuation of the poxB gene | |
| JP2001095592A (ja) | ｔｈｒＥをコードする新規ヌクレオチド配列およびコリネフォルムバクテリアを使用したＬ−スレオニンの酵素的製法 | |
| SK10202000A3 (sk) | Koryneformn baktrie produkujce l-lyzn a spsob vroby lyznu | |
| US6872553B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the pck gene | |
| KR20080007263A (ko) | 발효에 의한 ｌ-아미노산의 제조방법 | |
| JP2001008693A (ja) | 複製可能なｄｎａ、アミノ酸配列、コリネ型微生物、シャトルベクター及びｌ−アミノ酸の製造方法 | |
| US8334126B2 (en) | Coryneform host-vector systems comprising a chromosomal ALR gene which is attenuated or eliminated and methods of using | |
| JP2001078788A (ja) | Ｄｎａ、アミノ酸配列、コリネフォーム微生物、シャトルベクター、ならびにスーパーオキシドジスムターゼ活性を増加させる方法および代謝産物の製造法 | |
| MXPA00009770A (es) | Nuevas secuencias nucleotidicas que codifican para el gen irp. | |
| US20030148476A1 (en) | Nucleotide sequences that code for the rplK gene and methods of use thereof | |
| WO2002055711A2 (de) | Verfahren zur fermentativen herstellung von pantothensäure | |
| CZ428299A3 (cs) | Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající koryneformních bakterií | |
| SK4252001A3 (en) | Nucleotide sequences which code for the rp1k gene | |
| MXPA99010768A (en) | Procedure for the preparation by fermentation of d-pantothenic acid using corinefor bacteria |