CZ20011382A3

CZ20011382A3 - Způsob přípravy chirálních karboxylových kyselin z nitrilů pomocí nitriláz nebo mikroorganizmů, které obsahují gen nitrilázy

Info

Publication number: CZ20011382A3
Application number: CZ20011382A
Authority: CZ
Inventors: Marion Dr. Ress-Löschke; Thomas Dr. Friedrich; Bernhard Dr. Hauer; Ralf Prof. Dr. Mattes; Dirk Dr. Engels
Original assignee: Basf Aktiengesellschaft
Priority date: 1998-10-19
Filing date: 1999-10-13
Publication date: 2002-03-13
Also published as: HUP0104802A2; ES2280125T3; DE19848129A1; PT1123386E; EE05008B1; WO2000023577A1; CA2347521C; JP4489298B2; HU228092B1; EE200100232A; CZ302494B6; ID29136A; ATE349517T1; KR20010085938A; US6869783B1; EP1123386B1; ZA200104066B; DK1123386T3; DE59914102D1; JP2002527106A

Description

Vynález se týká sekvencí nukleových kyselin, které kódují polypeptid, jež má aktivitu nitrilázy, konstrukci nukleových kyselin, které obsahují tyto sekvence a vektorů, obsahující sekvence nukleových kyselin nebo konstrukce nukleových kyselin. Vynález se dále týká sekvencí aminokyselin, které jsou kódovány sekvencemi nukleových kyselin a mikroorganizmů, obsahujících tyto nukleokyselinové sekvence, dále se vynález týká konstrukcí nukleových kyselin nebo vektorů, obsahující tyto sekvence nukleových kyselin nebo tyto konstrukce nukleových kyselin.

Vynález se dále také týká způsobu přípravy chirálních karboxylových kyselin z racemických nitrilů.

Dosavadní stav techniky

Existuje potřeba chemické syntézy chirálních karboxylových kyselin. Jsou to výchozí sloučeniny pro velké množství farmaceutických účinných látek nebo účinných složek, používaných v prostředcích pro ochranu úrody. Chirálni karboxylové kyseliny se mohou používat ke klasickému dělení racemátů pomocí diastereomerních solí. Tak, R-(-)- nebo S-(-)-mandlová [sic] kyselina se používá např. pro dělení racemických aminů. R—(—)— mandlová kyselina se kromě toho používá jako meziprodukt pro syntézu semisyntetických antibiotik a velkého počtu zemědělských produktů.

• ·

Různé syntetické cesty k chirálním karboxylovým kyselinám jsou známy z literatury. Tak např. opticky aktivní aminokyseliny se získají průmyslově fermentačními procesy. Tyto metody mají nevýhodu, která spočívá v tom, že specifické procesy se musí vyvinout pro každou aminokyselinu zvlášť. To je důvod, proč se používají enzymatické nebo chemické procesy, které jsou schopny připravit velmi široký rozsah různých sloučenin. Nevýhodou chemických procesů je, že opticky aktivní centrum obvykle se konstruuje komplikovaně, získává se ve více stupních a není možné aplikovat běžnou syntézu.

Enzymatické syntézy chirálních karboxylových kyselin lze nalézt v řadě patentů nebo patentových přihlášek. WO 92/05 275 popisuje syntézu enantiomernich α-hydroxy-cc-alkyl- nebo aalkylkarboxylových kyselin za přítomnosti biologických materiálů. EP-B-0 348 901 chrání způsob příprav opticky aktivních α-substituovaných organických kyselin, využívající organizmy rodů Alcaligenes, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynebacterium sp. kmen KO-2-4, Acinetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Rhodcoccus a Candida. Příprava L-a-aminokyselin s použitím mikroorganizmů je chráněná v EP-B-0 332 379.

Příprava α-hydroxykarboxylových kyselin, zejména příprava opticky aktivní kyseliny mléčné nebo mandlové, s použitím různých mikroorganizmů, jako jsou mikroorganizmy rodů Alcaligenes, Aureobacterium, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynebacterium, Acinetobacter, Caseobacter, Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus, Brevibacterium, Nocardia, Variovorax, Arthrobacter a Candida nebo s použitím enzymů je popsána v patentech EP-A-0 348 901 nebo jeho US ekvivalent US

I ·

283 193, EP-A-0 449 648, ΕΡ-Β-0 473 328, EP-B-0 527 553 nebo jeho US ekvivalent US 5,296,373, EP-A-0 610 048, EP-A-0 610 049, EP-A-0 666 320 nebo WO 97/32030.

Nevýhody těchto postupů spočívají v tom, že často vedou k produktům, které mají pouze nízkou optickou čistotu a/nebo v tom, že probíhají pouze s malým objemem a malým výtěžkem po dlouhou dobu. Toto vede k ekonomicky neatraktivním procesům. Byl dokonce provedeny pokusy zvýšit produktivitu přidáním látek jako je siřičitan, disiřičitan, dithiouhličitan, fosfornan nebo fosforitan (viz EP-A 0 486 289) nebo použitím mikroorganizmů, které mají zvýšenou rezistenci vůči a-hydroxynitrilům (viz WO 97/32 030) vedly k zanedbatelnému růstu produktivity.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je vyvinou snadno, po stránce nákladů efektivně, široce aplikovatelný proces pro přípravu opticky aktivních chirálních karboxylových kyselin, který by neměl shora zmíněné nevýhody.

Nalezli jsme, že tento předmět je možné vyřešit způsobem podle vynálezu pro přípravu chirálních karboxylových kyselin obecného vzorce I

COOH (I) který zahrnuje konverzi racemických nitrilů obecného vzorce II

(II) za přítomnosti sekvence aminokyselin, která je kódována sekvenci nukleových kyselin, zvolenou ze souboru zahrnujícího:

a) sekvenci nukleových kyselin, která má sekvenci označenou v příloze jako SEQ ID NO: 1,

b) sekvence nukleových kyselin, které jsou odvozeny od této znázorněné sekvence SEQ ID NO: 1 jako výsledek degenerace genetického kódu,

c) deriváty sekvence nukleových kyselin, znázorněné v SEQ ID NO:

1, které kódují polypeptidy, které mají aminokyselinové sekvence znázorněné v SEQ ID NO: 2 a mají nejméně 80% homologii v hladině aminokyselin, přičemž mají nepatrně sníženou enzymatickou účinnost polypeptidů, nebo růstem, latentních nebo narušených mikroorganismů, které obsahuji buď sekvenci aminových kyselin ze shora uvedeného souboru nebo konstrukci nukleových kyselin, která váže nukleovou kyselinu z uvedeného souboru na jeden nebo více regulačních signálů, přičemž alespoň 25 mmol nitrilů se konvertuje za hodinu a na mg proteinu nebo 25 mmol nitrilů se konvertuje za hodinu a na 1 g suché hmotnosti na chirální karboxylové kyseliny, přičemž substituenty ve vzorcích I a II jsou proměnné a mají následující významy: (* znamená opticky aktivní centrum) ······ · · · « · ··· · · · · ··· · ♦ · ·· · · · ·

R¹, R², R³ nezávisle jeden na druhém znamenají vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo lineární Ci-Cio-alkyl, C₂-Ci₀-alkenyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, heteroaryl, OR⁴ nebo NR⁴R⁵ a kde radikály R¹, R² a R³ jsou vždy navzájem od sebe odlišné,

R⁴ vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo lineární Ci-Ci₀-alkyl, C₂-C₁₀-alkenyl, Ci-Cio-alkylkarbonyl, C₂-Cio-alkenylkarbonyl, aryl, arylkarbonyl, heteroaryl nebo heteroarylkarbonyl,

R⁵ vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo lineární Ci-Cio-alkyl, C₂-Cio-alkenyl, aryl nebo heteroaryl.

R¹, R², R³ ve sloučeninách vzorců I a II jsou, nezávisle, jeden na druhém, hydrogen, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo lineární Ci-Cio-alkyl, C₂-Cio-alkenyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, heteroaryl, OR⁴ nebo NR⁴R⁵ a kde radikály R¹, R² a R³ jsou vždy různé.

Alkylové radikály, které lze uvést, jsou: substituovaný nebo nesubstituovaný, rozvětvený nebo lineární Ci-Cio-alkyl řetězec jako je, například metyl, etyl, n-propyl, 1-metyletyl, n-butyl,

1-metylpropyl, 2-metylpropyl, 1,1-dimetyletyl, n-pentyl,

1-metylbutyl, 2-metylbutyl, 3-metylbutyl, 2,2-dimetylpropyl,

1-etylpropyl, n-hexyl, 1,1-dimetylpropyl, 1,2-dimetylpropyl,

1- metylpentyl, 2-metylpentyl, 3-metylpentyl, 4-metylpentyl,

1.1- dimetylbutyl, 1,2-dimetylbutyl, 1,3-dimetylbutyl,

2.2- dimetylbutyl, 2,3-dimetylbutyl, 3,3-dimetylbutyl, 1-etylbutyl,

2- etylbutyl, 1,1,2-trimetylpropyl, 1,2,2-trimetylpropyl,

1-etyl-l-metylpropyl, l-etyl-2-metylpropyl, n-heptyl, n-oktyl, n-nonyl nebo n-decyl. Metyl, etyl, n-propyl, n-butyl, i-propyl nebo i-butyl jsou výhodné.

Alkenylové radikály které lze zmínit, jsou rozvětvený nebo lineární C2-Cio~alkenylový řetězec jako je například, ethenyl, propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 2-metylpropenyl,

1-pentenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, 1-metyl-l-butenyl,

2-metyl-1-butenyl,

2-metyl-2-butenyl,

3-metyl-l-butenyl,

3-metyl-2-butenyl, l-metyl-2-butenyl, l-metyl-3-butenyl,

2-metyl-3-butenyl,

3-metyl-3-butenyl,

1,l-dimetyl-2-propenyl,

1,2-dimetyl-l-propenyl, 1,2-dimetyl-2-propenyl, 1-etyl-l-propenyl, l-etyl-2-propenyl, 1-hexenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 4 hexenyl, 5 hexenyl, 1-metyl-l-pentenyl, 2-metyl-l-pentenyl,

3- metyl-l-pentenyl, 4-metyl-l-pentenyl, l-metyl-2-pentenyl,

2- metyl-2-pentenyl, 3-metyl-2-pentenyl, 4-metyl-2-pentenyl, l-methyl-3-pentenyl, 2-metyl-3-pentenyl, 3-metyl-3-pentenyl,

4- metyl-3-pentenyl, l-metyl-4-pentenyl, 2-metyl-4-pentenyl,

3- metyl-4-pentenyl, 4-metyl-4-pentenyl, 1,l-dimetyl-2-butenyl,

1,l-dimetyl-3-butenyl,	1,2-dimetyl-l-butenyl,
1,2-dimetyl-2-butenyl,	1,2-dimetyl-3-butenyl,
1,3-dimetyl-1-butenyl,	1,3-dimetyl-2-butenyl,
1,3-dimetyl-3-butenyl,	2,2-dimetyl-3-butenyl,
2,3-dimetyl-1-butenyl,	2,3-dimetyl-2-butenyl,
2,3-dimetyl-3-butenyl,	3,3-dimetyl-l-butenyl,
3,3-dimetyl-2-butenyl,	1-etyl-1-butenyl, l-etyl-2-butenyl,

1- etyl-3-butenyl, 2-etyl-l-butenyl, 2-etyl-2-butenyl,

2- etyl-3-butenyl, 1,1,2-trimetyl-2-propenyl, l-etyl-l-metyl-2-propenyl, l-etyl-2-metyl-l-propenyl, l-etyl-2-metyl-2-propenyl, 1-heptenyl, 2-heptenyl, 3-heptenyl,

4-heptenyl, 5-heptenyl, 6-heptenyl, 1-oktenyl, 2-oktenyl, * ·

3-oktenyl, 4-oktenyl, 5-oktenyl, 6-oktenyl, 7-oktenyl, nonenyl nebo decenyl. Ethenyl, propenyl, butenyl nebo pentenyl jsou výhodné.

Arylové radikály, které lze zmínit, jsou substituované a nesubstituované arylové radikály, které obsahují 6 až 20 uhlíkových atomů v kruhu nebo cyklickém systému. Poslední z nich může zahrnovat aromatické kruhy, které jsou kondenzované spolu navzájem nebo aromatické kruhy navázané přes alkylový, alkylkarbonylový, alkenylový nebo alkenylkarbonylový řetězec, karbonyl, kyslík nebo dusík. Arylové radikály mohou být, pokud je to žádoucí, také k základnímu skeletu navázány přes Ci-Ci₀-alkylový, C₃-C₈-alkenylový, C₃-C₆-alkinylový nebo C₃-C₈-cykloalkylový řetězec. Fenyl nebo naftyl jsou výhodné.

Heteroaryly, které lze zmínit, jsou substituované nebo nesubstituované, monocyklické nebo kondenzované aromatické cyklické systémy jedním nebo více heteroaromatickými 3- až

7-člennými heteroatomů kruhy, jako je navázány přes které mohou

N, O nebo S a obsahovat jeden nebo více

Ci- Cio- a 1 ky 1 ový, řetězec k mohou, pokud je to vhodné, být

C₃-C₈-alkenylový nebo

C3-C₈-cykloalkylový heteroarylových radikálů tohoto základnímu typu j sou skeletu.

pyrazol,

Příklady imidazol, oxazol, isooxazol, thiazol, triazol, pyridin, chinolin, isochinolin, akridin, pyrimidin, pyridazin, pyrazin, fenazin, purin nebo pteridin.

k základnímu skeletu

Heteroarylové radikály mohou být přes heteroatomy nebo přes různé navázány uhlíkové atomy v kruhu nebo v cyklickém systému nebo přes substituenty. Výhodné jsou pyridin, imidazol, pyrimidin, purin, pyrazin nebo chinolin.

• · · · · * · · · · · ♦ ··« ··>!· ···· »···» · · ··· «>· · Μ · · · · ·· ··· ··· ···· ·· ··*

Vhodnými substituenty na místě uvedených radikálů R¹· R² nebo R³ jsou například jeden nebo více substituentů jako je halogen, jako je fluor, chlor nebo brom, thioskupina, nitroskupina, aminoskupina, hydroxyl, alkyl, alkoxy, alkenyl, alkenyloxyl, alkinyl nebo jiné aromatické nebo jiné nasycené nebo nenasycené nearomatické kruhy nebo cyklické systémy. Důraz je kladen na alkylové radikály jako je Ci-C₆-alkyl jako je metyl, etyl, propyl nebo butyl, aryl jako je fenyl, halogen jako je chlor, fluor nebo brom, hydroxyl nebo aminoskupina.

R⁴ v OR⁴ nebo v radikálech NR⁴R⁵ je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, rozvětvený nebo lineární Ci-Cio-alkyl, C2“Cio-alkenyl, Ci-Cio-alkylkarbonyl, C₂-Cio-alkenyl karbony 1, aryl, arylkarbonyl, heteroaryl nebo hetarylkarbony1.

Alkyl radikály které lze zmínit jsou substituovaný nebo nesubstituovaný, rozvětvený nebo lineární Ci-Ci₀-alkyl řetězec jako je, například, metyl, etyl, n-propyl, 1-metyletyl, n-butyl,

1-metylpropyl, 2-metylpropyl, 1,1-dimetyletyl, n-pentyl,

1-metylbutyl, 2-metylbutyl, 3-metylbutyl, 2,2-dimetylpropyl,

1-etylpropyl, n-hexyl, 1,1-dimetylpropyl, 1,2-dimetylpropyl,

1- metylpentyl, 2-metylpentyl, 3-metylpentyl, 4-metylpentyl,

1.1- dimetylbutyl, 1,2-dimetylbutyl, 1,3-dimetylbutyl,

2.2- dimetylbutyl, 2,3-dimetylbutyl, 3,3-dimetylbutyl, 1-etylbutyl,

2- etylbutyl, 1,1,2-trimetylpropyl, 1,2,2-trimetylpropyl,

1-etyl-l-metylpropyl, l-etyl-2-metylpropýl, n-heptyl, n-oktyl, n-nonyl nebo n-decyl. Metyl, etyl, n-propyl, n-butyl, i-propyl nebo i-butyl jsou výhodné.

Alkenyl radikály které lze zmínit jsou rozvětvený nebo lineární C₂-Cio~alkenyl řetězec jako je, například, ethenyl, propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl,. 2-metylpropenyl,

1-pentenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, 1-metyl-1-butenyl,

2-metyl-1-butenyl,

2-metyl-2-butenyl,

3-metyl-1-butenyl,

3-metyl-2-butenyl, l-metyl-2-butenyl, l-metyl-3-butenyl,

2-metyl-3-butenyl,

3-metyl-3-butenyl,

1,l-dimetyl-2-propenyl,

1,2-dimetyl-l-propenyl, 1,2-dimetyl-2-propenyl, 1-etyl-l-propenyl, l-etyl-2-propenyl, 1-hexenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 4-hexenyl,

5-hexenyl, 1-metyl-

3- metyl-1-pentenyl,

2- metyl-2-pentenyl, l-metyl-3-pentenyl,

4- metyl-3-pentenyl,

3- metyl-4-pentenyl,

-pentenyl, 2-metyl-

4-metyl-l-pentenyl,

3- metyl-2-pentenyl,

2-Metyl-3-pentenyl, l-metyl-4-pentenyl,

4- metyl-4-pentenyl,

-pentenyl,

1- metyl-2-pentenyl,

4-metyl-2-pentenyl,

3-metyl-3-pentenyl,

2- metyl-4-pentenyl,

1,l-dimetyl-2-butenyl,

1,l-dimetyl-3-butenyl, 1,2-dimetyl-l-butenyl,

1.2- dimetyl-2-butenyl,

1.3- dimetyl-l-butenyl,

1.3- dimetyl-3-butenyl,

2.3- dimetyl-l-butenyl,

1.2- dimetyl-3-butenyl,

1.3- dimetyl-2-butenyl,

2.2- dimetyl-3-butenyl,

2.3- dimetyl-2-butenyl,

2.3- dimetyl-3-butenyl, 3,3-dimetyl-l-butenyl,

3.3- dimetyl-2-butenyl, 1-etyl-l-butenyl, l-etyl-2-butenyl,

1- etyl-3-butenyl, 2-etyl-l-butenyl, 2-etyl-2-butenyl,

4-heptenyl, 5-heptenyl, 6-heptenyl, 1-oktenyl, 2-oktenyl,

Alkylkarbonyl radikály které lze zmínit jsou substituovaný nebo nesubstituovaný, rozvětvený nebo lineární Ci-Cio-alkylkarbonyl ♦ · · ·» · * · · • · · · « ·· ··· řetězec jako je, například, metylkarbony1, etylkarbonyl, n-propylkarbony1, 1-metyletylkarbonyl, n-butylkarbonyl,

1-metylpropylkarbonyl, 2-metylpropylkarbonyl,

1.1- dimetyletylkarbonyl, n-pentylkarbonyl,

1-metylbutylkarbonyl, 2-metylbutylkarbonyl, 3-metylbutylkarbony1,

2.2- dimetylpropylkarbonyl, 1-etylpropylkarbonyl, n-hexylkarbony1,

1.1- dimetylpropylkarbonyl, 1,2-dimetylpropylkarbonyl,

1-metylpentylkarbonyl, 2-metylpentylkarbonyl,

3-metylpentylkarbonyl, 4-metylpentylkarbonyl,

1.1- dimetylbutylkarbonyl, 1., 2-dime ty lbutyl karbony 1,

1, 3-dimetylbutylkarbonyl, 2,2-dimetylbutylkarbonyl,

2.3- dimetylbutylkarbonyl, 3,3-dimetylbutylkarbonyl,

1-etylbutylkarbonyl, 2-etylbutylkarbonyl,

1,1,2-trimetylpropylkarbonyl, 1,2,2-trimetylpropylkarbonyl,

1-etyl-l-metylpropylkarbonyl, l-etyl-2-metylpropylkarbonyl, n-heptylkarbonyl, n-oktylkarbonyl, n-nonylkarbonyl nebo n-decylkarbonyl. Metylkarbonyl, etylkarbonyl, n-propylkarbonyl, n-butylkarbonyl, i-propylkarbonyl nebo i-butylkarbonyl jsou výhodné.

Alkenylkarbonyl radikály které lze zmínit jsou rozvětvený nebo lineární C2-Cio-alkenylkarbonyl řetězec jako je, například, ethenylkarbonyl, propenylkarbonyl, 1-butenylkarbonyl,

2-butenylkarbonyl, 3-butenylkarbonyl, 2-metylpropenylkarbonyl,

1-pentenylkarbonyl, 2-pentenylkarbonyl, 3-pentenylkarbonyl,

4-pentenylkarbonyl, 1-metyl-l-butenylkarbonyl,

2- metyl-l-butenylkarbonyl,

1- metyl-2-butenylkarbonyl,

3- metyl-2-butenylkarbonyl,

2- metyl-3-butenylkarbonyl,

3-metyl-l-butenylkarbonyl,

2- metyl-2-butenylkarbonyl, l-metyl-3-butenylkarbonyl,

3- metyl-3-butenylkarbonyl,

1,l-dimetyl-2-propenylkarbonyl, 1,2-dimetyl-l-propenylkarbonyl,

1,2-dimetyl-2-propenylkarbonyl, 1-etyl-l-propenylkarbonyl, l-etyl-2-propenylkarbonyl, 1-hexenylkarbonyl, 2-hexenylkarbonyl,

3-hexenylkarbonyl, 4-hexenylkarbonyl, 5-hexenylkarbonyl,

1-metyl-l-pentenylkarbonyl,

3-metyl-1-pentenylkarbonyl, l-metyl-2-pentenylkarbonyl,

3-metyl-2-pentenylkarbonyl, l-metyl-3-pentenylkarbonyl,

3-metyl-3-penteny1karbonyl, l-metyl-4-pentenylkarbonyl,

3-mety1-4-pentenylkarbonyl,

2-metyl-l-pentenylkarbonyl,

4-metyl-l-pentenylkarbonyl,

2-metyl-2-pentenylkarbonyl,

4-metyl-2-pentenylkarbonyl,

2-metyl-3-pentenylkarbonyl,

4-metyl-3-pentenylkarbonyl,

2-metyl-4-pentenylkarbonyl,

4-metyl-4-pentenylkarbonyl,

1.1- dimetyl-2-butenylkarbonyl,

1.2- dimetyl-l-butenylkarbonyl,

1.2- dimetyl-3-butenylkarbonyl,

1.3- dimetyl-2-butenylkarbonyl,

2.2- dimetyl-3-butenylkarbonyl,

2.3- dimetyl-2-butenylkarbonyl,

3.3- dimetyl-l-butenylkarbonyl,

1.1- dimetyl-3-butenylkarbonyl,

1.2- dimetyl-2-butenylkarbonyl,

1.3- dimetyl-l-butenylkarbonyl,

1.3- dimetyl-3-butenylkarbonyl,

2.3- dimetyl-l-butenylkarbonyl,

2.3- dimetyl-3-butenylkarbonyl,

3, 3-dimetyl-2-butenylkarbonyl,

1- etyl-l-butenylkarbonyl, l-etyl-2-butenylkarbonyl, 1-etyl

3-butenylkarbonyl, 2-etyl-l-butenylkarbonyl,

2- ety1-2-butenylkarbonyl, 2-etyl-3-butenylkarbonyl,

1,1,2-trimetyl-2-propenylkarbonyl, l-etyl-l-metyl-2-propenylkarbonyl, l-etyl-2-metyl-l-propenylkarbonyl,

1- etyl-2-metyl-2-propenylkarbonyl, 1-heptenylkarbonyl,

2- heptenylkarbonyl, 3-heptenylkarbonyl, 4-heptenylkarbonyl,

5-heptenylkarbonyl, 6-heptenylkarbonyl, 1-oktenylkarbonyl,

2-oktenylkarbonyl, 3-oktenylkarbonyl, 4-oktenylkarbonyl,

5-oktenylkarbonyl, 6-oktenylkarbonyl, 7-oktenylkarbonyl, nonenylkarbonyl nebo decenylkarbonyl. Výhodné jsou ethenylkarbony1, propeny1karbony1, butenylkarbonyl nebo pentenylkarbonyl.

Aryl radikály které lze zmínit jsou substituovaný a nesubstituovaný aryl radikály které obsahovat 6 to 20 uhlíkových atomů v kruhu nebo cyklickém systému. Poslední z nich může obsahovat aromatické kruhy které jsou kondenzované spolu navzájem nebo aromatické kruhy které jsou navázané přes alkylový, alkylkarbonylový, alkenylový nebo alkenylkarbonylový řetězec, karbonyl, kyslík nebo dusík. Arylové radikály mohou, pokud je to vhodné, také být navázány přes Ci-Cio-alkylový, C₃-C8-alkenylový, C3-C6-alkinylový nebo C₃-C₈-cykloalkylový řetězec k základnímu skeletu. Fenyl nebo naftyl jsou výhodné.

Arylkarbonyl radikály které lze zmínit jsou substituovaný a nesubstituovaný arylkarbonyl radikály které obsahovat 6 to 20 uhlíkových atomů v kruhu nebo cyklickém systému. Poslední z nich může obsahovat aromatické kruhy které jsou kondenzované spolu navzájem nebo aromatické kruhy které jsou navázané via alkyl, alkylkarbonylový, alkenylový nebo alkenylkarbonylový řetězec, karbonyl, kyslík nebo dusík. Fenylkarbonyl nebo naftylkarbonyl j sou výhodné.

Heteroaryly, které lze zmínit, nesubstituované, cyklické systémy monocyklické nebo jedním nebo více jsou substituované nebo kondenzované aromatické

7-člennými kruhy, heteroatoms jako je navázán přes heteroaromatickými 3- až které mohou obsahovat jeden nebo více N, O nebo S a může, pokud je to vhodné, být

C₃-C8-alkenylový

Ci-Cio-al kýlový, nebo řetězec k základnímu skeletu. Příklady

C₃-Cg-cykloal kýlový heteroarylových radikálů tohoto typu jsou pyrazol, imidazol, • « ·

• · ·

• · ♦ ·· · • · • · · · • ♦ · • · · · · oxazol, isooxazol, thiazol, triazol, pyridin, chinolin, isochinolin, akridin, pyrimidin, pyridazin, pyrazin, fenazin, purin nebo pteridin. Heteroarylové radikály mohou být vázané k základnímu skeletu přes heteroatomy nebo přes různé uhlíkové atomy v kruhu nebo uhlovém systému nebo přes substituenty. Heterokarbonylové radikály je termín, kterým se rozumí heteroaromatické radiály, které jsou vázané přes karbonylové radiály na základní skelet. Výhodné jsou pyridin, imidazol, pyrimidin, purin, pyrazin nebo chinolin.

Vhodnými substituenty ve významu uvedeného radikálu R⁴ jsou např. jeden nebo více substituentů jako je halogen, jako je fluor, chlor, brom, thio, nitro, amino, hydroxyl, alkyl, alkoxy, alkenyl, alkenyloxy, alkinyl nebo jiné aromatické nebo jiné nasycené nebo nenasycené nearomatické kruhy nebo cyklické systémy. Důraz se zde klade na výhodné alkylové radikály jako jsou Ci-C6~alkyl jako methyl, ethyl, propyl nebo butyl, halogen jako je chlor, fluor nebo brom, hydroxyl nebo aminoskupina.

Radikál R⁴ je výhodně vodík.

R⁵ v radikálu NR⁴R⁵ je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo lineární Ci-Cio-alkyl, C₂-Cioalkenyl, aryl nebo heteroaryl, přičemž alkyl, alkenyl, aryl a heteroarylový radikál mají shora uvedené významy. Zde je výhodný vodík nebo Ci-Cio-alkyl jako je metyl, etyl nebo propyl.

Vhodné substituenty ve významu R⁵ radikálu jsou např. jeden nebo více substituentů jako je halogen, jako je fluor, chlor, brom, thioskupina, nitro, amino, hydroxyl, alkyl, alkoxy, alkenyl, alkenyl, alkenyloxy, alkinyl nebo jiné aromatické nebo jiné nasycené nebo nenasycené nearomatické kruhy nebo cyklické systémy. Zde je důraz kladen na alkylové radikály jako je Ci-C₆alkyl jako je metyl, etyl, propyl nebo butyl, aryl jako je fenyl, halogen jako chlor, fluor nebo brom, hydroxyl nebo aminoskupina.

Dále je možné, aby dva přiléhající R substituenty R⁴ nebo R⁵spolu tvořily jiný substituovaný nebo nesubstituovaný aromatický, nasycený nebo částečně nasycený kruh s 5 až 6 atomy v kruhu, který může obsahovat jeden nebo více heteroatomů jako je 0, N nebo S.

Je výhodné, když jeden ze substituentů R¹, R², nebo R³ ve vzorcích I a II je aryl, jako např. fenyl. Dále je výhodné, aby jeden ze substituentů R¹, R², nebo R³ ve vzorcích I a II byl hydroxyl a jeden aby byl vodík nebo metyl.

Způsob podle vynálezu se výhodně provádí při pH v rozmezí od 4 do 11, výhodně od 4 do 9.

Dále je výhodné použít od 0,01 do 10 hmotnostních % nitrilu nebo 0,01 až 10 hmot. % odpovídajícího aldehydu nebo ketonu a 0,01 až 10 % hmot, kyanovodíkové kyseliny. Způsob se výhodně provádí v přebytku kyanovodíkové kyseliny. Za určitých okolností to vede k obsahům kyanovodíkové kyseliny, které jsou vyšší než ty, které jsou uvedeny. Pro reakci lze použít různá množství nitrilu, což závisí na povaze nitrilu. Nejmenší množství (= množství mezi 0,01 až 5 % hmotnostními) nitrilu se výhodně používá pokud jde o nitrily, (kyanhydriny), které jsou v rovnováze s odpovídajícími aldehydy a kyanovodíkovou kyselinou. Aldehyd je pochopitelně obvykle toxický pro organizmy nebo enzymy. Těkavé nitrily jsou obdobně výhodné v množstvích mezi 0,01 a 5 hmotn. %. Tato reakce se zpomaluje působením větších množství kyanhydrinu nebo nitrilu. V případě nitrilů, které mají pouze nízkou nebo zdánlivou rozpouštěcí schopnost nebo nitrilů, které se rozpouštějí pouze v malých množstvích ve vodném prostředí je možné a výhodné použít větších množství, než jsou ta, která jsou uvedená shora. Ke zvýšení konverze a výtěžku se může reakce výhodně provádět za použití kontrolovaného přidávání racemického nitrilu. Produkt se dá po dokončení reakce izolovat nebo nějakým způsobem kontinuálně odstraňovat z reakce ve vedlejším proudu.

Shora uvedené aldehydy a ketony znamenají sloučeniny, které tvoří nitril po reakci mezi aldehydem a ketonem a kyanovodíkovou kyselinou, přičemž reakce je kysele katalyzována. Reakce mezi aldehydem a kyanovodíkovou kyselinou má za následek kyanhydriny, které mají výhodu v tom, že jsou v rovnováze s aldehydem a kyanovodíkovou kyselinou. Nastavení rovnováhy pomocí kyanhydrinu znamená, že je možné pomocí enzymu, který převádí pouze jeden enantiomer nitrilu, získat 100 % výtěžek teorie tohoto enantiomeru, neboť racemický nitril se kontinuálně převádí zpět na výchozí složky. Všechny ostatní nitrily, vzhledem k tomu, že nejsou převáděny enzymem (= „špatný nebo jiný enantiomer) se výhodně racemizují pomocí chemické reakce a vracejí se do procesu s cílem dosáhnout opět teoretického výtěžku 100 %, nebo se musejí odstraňovat nebo čistit a chemicky hydrolyzovat, přičemž zůstává chirální centrum ve sloučenině.

Způsob podle vynálezu se výhodně provádí při teplotě mezi 0°C a 80°C, výhodně mezi 10°C a 60°C, mimořádně výhodně mezi 15°C a 50°C.

······ · · ··· · · ·· ·· · ····· · · ··· · ·· · · • · ·· ······ • · · ♦ ···· ·· ··· ··· ···· ·· ···

Racemické nitrily v tomto způsobu podle vynálezu znamenají nitrily, které sestávají ze směsi enantiomerů 50 : 50 nebo jakékoliv jiné směsi, ve které je obohacen jeden nebo druhý enantiomer.

Chirální karboxylové procesy při popisu způsobu podle vynálezu znamenají ty, které jsou obohaceny o některý enantiomer. Způsob se výhodně vede tak, že výsledná látka je stereochemicky čistá alespoň do 90 %, výhodně minimálně 95 %. Zejména výhodně minimálně 98 %, velmi výhodně minimálně 99 %.

Způsob podle vynálezu umožňuje převádět velká množství racemických nitrilů na chirální karboxylové kyseliny. V tomto procesu je možno převést nejméně 25 mmol nitrilů za hodinu x mg proteinu nebo nejméně 25 mmol nitrilů za hodinu x g suché hmotnosti mikroorganizmů, výhodně nejméně 30 mmol nitrilů za hodinu x mg proteinu nebo nejméně 30 mmol nitrilů za hodinu x g suché hmotnosti, zejména výhodně nejméně 40 mmol nitrilů za hodinu x mg proteinu nebo nejméně 40 mmol nitrilů za hodinu x g suché hmotnosti, velmi výhodně nejméně 50 mmol nitrilů za hodinu x mg proteinu nebo nejméně 50 mmol nitrilů za hodinu x g suché hmotnosti.

Ve způsobu podle vynálezu je možné použít kultury buněk, které obsahují nukleové kyseliny, konstrukce nukleových kyselin nebo vektory podle vynálezu. Je také možné použít spících (latentních) nebo narušených buněk. Narušené buňky znamená např. buňky, které jsou upraveny jako polopropustné působením např. rozpouštědel nebo buňky, které byly dezintegrovány ošetřením enzymem, mechanickým působením (např. francouzský lis nebo ultrazvuk) nebo nějakou jinou metodou. Surové extrakty, získané tímto způsobem, jsou vhodné a dokonce výhodné pro způsob podle vynálezu. Čištěné nebo částečně čištěné enzymy se pro tento proces také dají použít. Při reakci se mohou výhodně použit imobilizované mikroorganismy nebo enzymy.

Chirální karboxylové kyseliny, připravené způsobem podle vynálezu, se mohou výhodně izolovat z vodného reakčního roztoku extrakcí nebo krystalizací nebo extrakcí a krystalizací. Pro se okyselí reakční roztok kyselinou, např. jako je kyselina (např. HC1, H2SO4 ) nebo organickou výhodně hodnoty pH pod 2, a poté se dá použít tento'účel minerální kyselinou, v extrakci několikrát, organické čímž rozpouštědlo, je možné se v tomto rozpouštědla, která v podstatě veškerá rozpouštědla, s vodou, přičemž po případě se

Extrakce se dá opakovat výtěžek zvýšit. Organická případě mohou použít, jsou která vykazují fázovou hranici přidává do směsi nějaká sůl.

Vhodnými rozpouštědly jsou rozpouštědla jako je toluen, benzen, hexan, metylterc.butyléter nebo etylacetát.

Po zahuštění organické fáze se může produkt obvykle izolovat v dobré chemické čistotě, což znamená chemickou čistotu větší než 90 %. Po extrakci se může produkt nicméně dále čistit a zahušťovat a krystalovat. Pro tyto účely se roztok výhodně ochladí na teplotu v rozmezí 0°C až 10°C. Krystalizace se také může provádět přímo z organického roztoku. Krystalizovaný produkt se může oddělit pomocí stejného rozpouštědla nebo různých rozpouštědel pro opakovanou krystalizací a může se krystalovat opět. Následné krystalizace mohou být alespoň jednou podle postavení eutektické kompozice, dále čistit za účelem zvýšení enantiomerní čistoty produktu.

·· ···· · »· ·· ··· · · · · ·· • · · · · · · · ·

Nicméně, chirálni karboxylové kyseliny se mohou také vykrystalovat z vodného reakčniho roztoku ihned po okyseleni kyselinou na pH výhodně pod 2. Tento postup se výhodně provádí tak, že vodný roztok se zahustí zahřátím a snížením objemu o 10 až 90 %, výhodně o 20 až 80 %, zejména výhodně o 30 až 70 %. Krystalizace se výhodně provádí ochlazením. Teploty mezi 0°C až 10°C jsou výhodné pro krystalizaci. Přímá krystalizace z vodného roztoku je výhodná, neboť nepředstavuje příliš velké náklady. Je také výhodné pracovat s chirálními kyselinami pomocí extrakce a, pokud je to nutné, následné krystalizace.

Pomocí těchto typů zpracování je možné získat způsobem podle vynálezu produkt ve výtěžku od 60 do 100 %, výhodně od 80 do 100 %, zejména výhodně od 90 do 100 %, počítáno na nitril použitý pro reakci. Izolovaný produkt má vysokou chemickou čistotu větší než 90 %, výhodně větší než 95 %, zejména výhodně větší než 98 %. Kromě toho má produkt vysokou enantiomerní čistotu, která se dá ještě zvýšit další krystalizaci.

Produkty získané touto cestou jsou použitelné jako výchozí látky pro organické syntézy k přípravě účinných látek nebo agrochemikálií nebo pro dělení racemátu.

Vynález se dále týká izolace sekvence nukleových kyselin, která kóduje peptid, který má aktivitu nitrilázy, vybrané ze souboru, do kterého patří:

a) sekvence nukleových kyselin, která je znázorněna v SEQ ID NO: 1,

4444 4 44 444

4 4 4 4 4 4 4444

44444 44444

44 4 44444

4 44444 • 4 444 444 4444 44444

b) sekvence nukleových kyselin, které jsou odvozeny od sekvence nukleových kyselin, znázorněné na SEQ ID NO: 1, které jsou výsledkem degenerace genetického kódu,

c) deriváty sekvence nukleových kyselin, znázorněné na SEQ ID NO: 1, které kódují polypeptidy, které mají sekvence aminokyselin, znázorněné na SEQ ID NO: 2a mají nejméně 95% homologii na úrovni aminových kyselin, při zanedbatelném snížení enzymatické účinnosti.

Homology sekvence nukleových kyselin podle vynálezu, které mají sekvenci SEQ ID NO: 1, znamená, např. alelové varianty, které mají alespoň 95% homologii na úrovni odvozené od aminových kyselin, výhodně alespoň 97% homologii, velmi specificky výhodně alespoň 98% homologii, přičemž tato homologie se počítá přes celý rozsah sekvence. Je možné a výhodné, aby byly homologie v průběhu regionu, tvořících část sekvencí vyšší. Sekvence aminokyselin, odvozené od SEQ ID NO: 1, jsou vidět na SEQ ID NO: 2.

Alelové varianty zahrnují zejména funkční varianty, které jsou získatelné vypuštěním, vložením nebo náhradou nukleotidů ze sekvence, znázorněné na SEQ ID NO: 1, a získané odvozené syntetizované proteiny organismu, který se po zavedeni jednoho nebo více těchto genů získá, by neměly mít znatelně nižší enzymatickou aktivitu, do. Vynález se také týká sekvencí aminokyselin, které jsou kódovány souborem sekvencí nukleových kyselin, který byl popsán shora. Vynález se výhodně týká sekvencí aminokyselin, kódovaných sekvencí SEQ ID NO: 1.

*·		····	• ··	<··
•	•	•	·· · ·	•	•	• ·
•	«	• ··	• ·	•	•
•	9	•	• ·	♦	•
• ·		···	t«« ····

Výraz homology SEQ ID NO: 1 také znamená např. houbové nebo bakteriální homology, omezené sekvence, jednořetězcové DNA nebo RNA kódujících nebo nekódujících DNA sekvencí. Homology SEQ ID NO: 1 jsou na DNA úrovni homology nejméně 60%, výhodně alespoň 70%, velmi výhodně alespoň 80%, mimořádně.velmi výhodně alespoň 90%, počítáno přes celý DNA region, uvedený v SEQ ID NO: 1.

Termín homology SEQ ID NO: 1 kromě toho také znamená deriváty jako jsou např. promotory. Tyto promotory, které předcházejí uvedeným nukleotidovým sekvencím se mohou modifikovat jednou nebo více výměnami nukleotidů, vložením (i) a/nebo vypuštěním (i), pokud při těchto změnách nedojde k nežádoucímu vlivu na funkci nebo účinnost promotoru. Promotory se mohou kromě toho po stránce účinnosti vylepšit modifikací jejich sekvence nebo úplným zaměněním více účinnými za více účinné promotory, dokonce z organismů jiného druhu.

Termín deriváty také znamená varianty, jejichž sekvence nukleových kyselin v regionu od -1 do -200 v řadě od výchozího kodonů nebo od 0 do 1000 párů bází po stop kodonů jsou modifikovány takovým způsobem, že exprese genu a/nebo exprese proteinu je pozměněná, výhodně zvýšená.

SEQ ID NO: 1 nebo její homology se mohou výhodně izolovat způsoby, které jsou odborníkům z oboru známy z bakterií, výhodně z gram-negativních bakterií, zejména výhodně z bakterie rodu Alcaligenes, velmi výhodně z bakterie rodu a druhu Alcaligenes faecalis.

	····	4 ··
• 4		• 4 1 4	• ·	··
• «	• 4®	• 4	•	*
• 4	•	• ·	<4	•
• «			44	»4

SEQ ID NO: 1 nebo její homology nebo části těchto sekvencí se mohou připravit z jiných druhů hub nebo bakterií, např. s použitím běžných hybridizačních technik nebo PCR technik. Tyto DNA sekvence hybridizují za standardních podmínek se sekvencemi podle vynálezu. Hybridizace se výhodně provádí s krátkými oligonukleotidy konzervovaných regionů, např. z aktivního centra a tyto připravené meziprodukty se pak identifikují způsobem, který je pracovníkovi zběhlému v oboru známý, přičemž se provádějí srovnání s jinými nitrilázami nebo nitrilhydratázami. Nicméně pro hybridizaci je také možné použít delších fragmentů nukleových kyselin podle vynálezu nebo úplných sekvencí. Tyto standardní podmínky se mohou poněkud měnit v závislosti na použitém oligonukleotidu nukleové kyseliny, délce fragmentu nebo úplné sekvenci nebo v závislosti na tom, jaký typ nukleové kyseliny, DNA nebo RNA, se používá pro hybridizaci. Takže např. teploty táni hybridů DNA:DNA jsou o zhruba 10 % nižší, než teploty tání hybridů DNA:RNA stejné délky.

Termín standardní podmínky znamená, např. v závislosti na nukleové kyselině, teploty mezi 42 a 58°C ve vodném pufrovaném roztoku s koncentrací mezi 0,1 až 5 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM citronanu sodného, pH 7,2) nebo přídavně za přítomnosti 50% formamidu, jako je např. 42°C v 5 x SSC, 50% formamid. Hybridizačni podmínky DNA:DNA hybridy výhodně zahrnují 0,1 x SSC a teploty mezi asi 20°C až 45°C, výhodně mezi 30°C a 45°C. Hybridizační podmínky pro hybridy DNA:RNA výhodně zahrnují 0,1 x SSC a teploty mezi asi 30°C a 55°C, výhodně mezi asi 45°C a 55°C. Tyto teploty, které jsou zde uvedeny pro hybridizaci, jsou teploty tání, vypočtené pomocí příkladu nukleové kyseliny s délkou asi 100 nukleotidů a obsahem G + C 50 % při absenci formamidu. Experimentální podmínky pro DNA hybridizaci jsou

popsány v odpovídajících příručkách a textech z oboru genetiky jako je např. Sambrook et al., „Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, a mohou být stanoveny pomocí vzorců, které jsou známy odborníkům v oboru, např. v závislosti na délce nukleové kyseliny, povaze hybridů nebo obsahu G + C. Zkušený pracovník může další informace o hybridizaci najít v následujících publikacích: Ausubel et al. (eds), 1985, Current

Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A

Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Výraz konstrukt nebo konstrukce nukleové kyseliny podle vynálezu znamená nitrilázový gen sekvence SEQ ID NO: 1 a jeho homology, který má výhodně funkční napojení na jeden nebo více regulačních signálů, které zvyšují expresi genu. Tyto regulační sekvence jsou např. sekvence, ke kterým se indukční členy nebo represory váží a tím regulují expresi nukleové kyseliny. Kromě těchto nových regulačních sekvencí je také možné, aby byla přítomna přírodní regulace těchto sekvencí ve frontě aktuálních strukturálních genů a pokud je to žádoucí, aby byly geneticky modifikovány tak, že přírodní, regulace je vypnuta a exprese genů je zvýšena. Konstrukt nukleové kyseliny může, nicméně, také mít jednodušší strukturu, což znamená, že nejsou vloženy žádné regulační signály ve frontě sekvence SEQ ID NO: 1 nebo jejich homologů a přírodní promotor s regulací není zrušen. Místo toho je přírodní regulační sekvence mutována takovým způsobem, že regulace se již neuplatňuje a je zvýšená exprese genu. Konstrukt nukleové kyseliny může kromě toho výhodně zahrnovat jedenu nebo ······ · ·· · · ··· ♦ · ♦ · · · » ····· · · ·· dvě podpůrné sekvence, které zvyšuji expresi možné sekvence aminových kyselin, funkčně napojené na promotor. Je také možné vložit výhodné přídavné sekvence na 3' zakončení a DNA sekvence tak, jako by to byly jiné regulační elementy nebo terminátory. Nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být přítomny v konstruktu v jedné nebo více kopiích. Konstrukt může také zahrnovat další markéry jako jsou geny rezistence proti antibiotikům nebo auxotrofně komplementační, pokud je to vhodné pro výběr konstruktu.

Výhodné regulační sekvence pro způsob podle vynálezu jsou např. přítomny v promotorech jako je cos, tac, trp, tet, trptet, lpp, lac, lpp-lac, lacl^q, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-Ρ_κ nebo λ—P_L promotor, které jsou výhodně používány v gramnegativních bakteriích. Další výhodné regulační sekvence jsou, např. gram-pozitivní promotory amy a SPO2, v houbových nebo kvasinkových promotorech ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28 a ADH. V tomto směru jsou také výhodné promotory pyruvátdekarboxylázy a metanoloxidázy např. z Hansenuly. Pro regulaci je také možné použít umělé promotory.

Konstrukt nukleové kyseliny se výhodně vkládá do vektoru jako je např. plazmid, fág nebo jiná DNA pro expresi v hostitelském organismu, což způsobuje optimální expresi genů v hostiteli, která je možná. Tyto vektory představuje další vývoj vynálezu. Příklady vhodných plazmidů v E.Coli jsou pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-Bl, Zgtll nebo pBdCI, u Streptomyces jsou to pIJlOl, pIJ364, pIJ702 nebi pIJ361, u Bacillus jsou to pUBUO, pC194 or pBD214, u Corynebacterium jsou to pSA77 nebo pAJ667, u hub jsou to pALSl, pIL2 nebo ρΒΒΙΙβ, v kvasinkách jsou 2μΜ, pAG-1, Yep6, Yepl3 nebo pEMBLYe23· nebo v rostlinách jsou pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 nebo pDH51. Uvedené plazmidy představují malý výběr možných plazmidu. Další plazmidy jsou dobře známy odborníků v oboru a lze je nalézt např. v knize Cloning Vectors (eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018.

Konstrukt nukleové kyseliny také výhodně obsahuje, za účelem exprese jiných přítomných genů, navíc 3' a/nebo 5' terminální regulační sekvence, které zvyšují expresi, což je zvoleno pro optimální expresi v závislosti na zvoleném hostitelském organismu a genu nebo genech.

Tyto regulační sekvence jsou připojovány za tím účelem, aby se dosáhlo nejlépe specifické exprese genů a proteinů, která je možná. To může znamenat, že např. v závislosti na hostitelském organismu, ve kterém je gen exprimován nebo exprimován pouze po indukci nebo že je ihned exprimován nebo exprimován.

Regulační sekvence nebo faktory mohou kromě toho výhodně mít vliv pozitivní a tím zvyšovat expresi zaváděných genů. Podpora regulačních elementů se také může výhodně provádět na úrovni transkripce, použitím ostrých transkripčních signálů jako jsou promotory a/nebo podpůrné elementy.

Chybí překlad jedné věty.

V dalším provedení mohou vektory podle vynálezu obsahovat konstrukt nukleové kyseliny nebo nukleovou kyselinu podle vynálezu obsahuj ící vektor ve formě lineární

DNA v mikroorganismech, a dokonce heterologní nebo homologní rekombinace v genomu účinného \

organismu, které' j sou tam

integrovány. Tyto lineární DNA mohou být z linearizovaného vektoru jako je plasmid nebo pouze mohou představovat konstrukt nukleové kyseliny nebo nukleovou kyselinu.

Pro optimální expresi heterologních genů v organismu je výhodné modifikovat sekvence nukleových kyselin v souladu s kodonem, specificky používaném v daném, organismu. Použití kodonu se dá snadno navrhnout na základě počítačové analýzy jiných známých genů v relevantním organismu.

Vhodnými hostitelskými organismy pro nukleovou kyselinu podle vynálezu nebo pro konstrukt nukleových kyselin jsou principiálně všechny prokariotické nebo eukariotické organismy. Hostitelskými organismy, které se dají výhodně použit, jsou mikroorganismy . jako výhodně výhodně zejména

Rhodococcus. Velmi významné jsou rody a druhy používat bakterie výhodně jsou bakterie, houby nebo kvasinky. Je gram-pozitivní nebo gram-negativní bakterie, čeledi Enterobacteriaceae nebo Nocardiaceae, bakterie rodu Escherichia pseudomonas nebo

Escherichia coli.

Hostitelský organismus podle vynálezu kromě toho může výhodně obsahovat nejméně jedno proteinové činidlo pro zachycování polypeptidů, které jsou syntetizovány a zejména sekvenci nukleových kyselin, které mají nitrilázovou aktivitu, popsaných v tomto vynálezu a/nebo geny kódující toto činidlo, přičemž množství tohoto činidla, které je přítomno, by mělo být větší než odpovídající základní množství v mikroorganismu. Geny, kódující toto činidlo jsou přítomny v chromozomu nebo v extrachromozomálnich útvarech jako jsou např. plazmidy.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Čištění nitrilázy od směsi získané kultivací

Alcaligenes faecalis 1650

1. Namnožení buněk

Alcaligenes faecalis 1650 byl kultivován s pomocí třepání v kultivačním roztoku A při 35°C po dobu 8 hodin.

Kultivační roztok A:

Kvasinkový extrakt	5	g/i
pepton	3,5	g/i
CH3CO2NH4	5	g/i
KH2PO4	5	g/i
MgSO₄	0,2	g/i
FeSO₄	0,03	g/i
NaCl	1	g/i
Butyronitril	1	g/l

200 ml této předem připravené kultury bylo použito k inokulaci a 10 1 fermentoru, obsahujícího 8 1 čerstvého kultivačního roztoku

A. pH, teplota, průtok vzduchu a rychlost míchání byly 7,2; 30°C, 300 1/hod. a 300 otáček/min. Po 22 hodinách bylo získáno 81 g vlhké biomasy. To odpovídá suché hmotnosti buněk 3,8 g/1 a optické hustotě při 600 nm 8.

······ · · · *· ··· ···· *··

2. Stanoveni enzymatické aktivity nitrilu kyseliny mandlové

Buňky byly získány způsobem, který je popsán v příkladu 1 a dvakrát promyty v 10 mM Na/K fosfátového pufru, pH 7,2. 4 0 mg suché hmotnosti buněk bylo resuspendováno ve 20 ml 10 nM Na/K fosfátového pufru, pH 6,8 a reakce byla zahájena přidáním 8,3 mM nitrilu kyseliny mandlové. Reakce byla prováděna při 40°C, přičemž byla reakční směs protřepávána. Kinetika dělení racemátu byla sledována odebíráním vzorku a následným odstraňováním buněk s použitím vysoce výkonné kapalinové chromatografie (ODS Hypersil) . V tomto případě byly stanoveny nitril kyseliny mandlové, benzaldehyd, amid kyseliny mandlové a mandlová kyselina. Výsledky jsou znázorněny na obr. 1 (konverze nitrilu kyseliny mandlové na mandlovou kyselinu, vsázky). Rychlost vzniku kyseliny mandlové je 41,3 U/g suché hmotnosti buněk s 30% konverzí, přičemž 1 U je definováno jako vznik 1 gmolu kyseliny mandlové za minutu při 40°C.

3. Stanovení enzymatické selektivity na nitril kyseliny mandlové

Buňky byly získány jak je popsáno v příkladu 1 a promyty dvakrát 10 mmol/1 Na/K fosfátového pufru, pH 7,2. 4 0 mg suché hmotnosti buněk bylo resuspendováno ve 20 ml 10 mMol/1 Na/K fosfátového pufru, pH 6,8 a reakce byla zahájena přidáním 8,3 mM nitrilu kyseliny mandlové. Reakce byla prováděna s použitím třepání při 30°C. Kinetika byla sledována odebíráním vzorků a následným odstraněním buněk s přídavnou vysoko účinnou kapalinou chromatografií (Nucleodex β-ΡΜ). V tomto případě byla stanovena

S-(+)- a R—(—)— mandlová kyselina. Optická čistota vytvořené R28 ······ · ·· · · · ··· ···· ···· • · · ·· « · « · · • · · · · ····· • · · · · · · · ·· ··· ··· ·«·· ·· ··· (-)-mandlové kyseliny (r-ma) byla 98 % při 50% konverzi.

Selektivita enzymů (= E) byla 499 při 50% konverzi.

4. Čištění

Pokud není	stanoveno	j inak,	ve	všech pufrech	v průběhu
čištění bylo přítomno 10 mM	DTT.
Krok 1: Narušení	buněk
Buňky byly	získány	podle	postupu, který	je	popsán
v příkladě 1 ze	dvou 10 1	fermentací	v každém případě	a byly

odstředěny a dvakrát promyty 1 1 0,1 M Tris/HCl pufru pH 7,2. Výtěžek byl asi 162 g vlhké hmotnosti buněk. V každém z případů bylo 81 g vlhkých buněk resuspendováno v 160 ml 0,1 M Tris/HCl pufru, pH 7,2 a byly narušeny čtyřikrát v zařízení Menton-Gaulin při tlaku 750 barů. Homogenizát byl pak odstředěn při 30 000 g po dobu 39 minut a peleta byla odstraněna. Supernatant (140 ml) měl zbytkovou aktivitu 73 %, jak je ukázáno v tabulce 1.

Krok 2: Chromatografie na iontoměniči

Supernatant byl zředěn na 400 ml pufrem A (20 mM Tris/HCl, pH 8,5) a odstředěn ještě jednou při 23 000 g po dobu 20 min. 350 ml bylo pak vloženo na Q-sepharosovou kolonu (průměr 5 cm, výška 22 cm, objem 432 ml, náplň: Q-sepharose Fast Flow od firmy Pharmacia) v pufru A. Zprvu bylo použito pro promývání kolony 10% pufru B (jako pufr A s přídavkem 1 M NaCl) při průtoku 20 ml/min. (celkové množství přivedeného objemu odpovídalo 1,5 1). V průběhu 90 min. byl objem zvýšen na 60 % B, přičemž zvýšení bylo lineární. Od 91. do 120. minuty byl pak použit k vymytí kolony 100% pufr B. Na výstupu kolony bylo odebráno 100 40 ml frakcí. Nitriláza byla eluována mezi frakcemi 50 a 60. Frakce byly spojeny a zahuštěny na objem 10 ml ultrafiltrací přes membránu o propustnosti 10 kDa (Amicon).

Krok 3: Chromatografie na molekulárním sítě

Koncentrát z chromatografie na iontoměniči (z kroku 2) byl dále čištěn ve dvou částech, z nichž každá byla 5 ml, pomocí chromatografie na molekulárním sítě (Superdex 200 preparátivní kvalita, Pharmacia, separační interval 10 až 600 kDa, průměr 2,6 cm, výška 60 cm, objem 325 ml). Detekce se prováděla při 280 nm. Kolona byla vyrovnána 20 mM fosfátovým pufrem, pH 7,4; 5 mM DTT a 150 mM NaCl a byla používána při průtoku 1,5 ml/min. Bylo shromážděno 40 frakcí a nitrilově-hydrolyzační aktivita byla nalezena ve frakcích 3 až 5.

Krok 4: Chromatografie na iontoměniči

Spojené frakce z chromatografie na molekulárním sítě (z kroku 3) byly čištěny dále iontoměničovou chromatografií na koloně Mono Q (objem kolony 1 ml, Mono Q HR515, Pharmacia) . Byl použit pufr A, 20 mM Tris/HCl, pH 8,5; 5 mM DTT a pufr B byl stejný jako A s přídavkem 1 M NaCl. Průtok byl 1 ml/min. Účinná frakce z molekulárního síta (asi 100 ml) byla zředěna na vodivost asi 6 mS/cm a byla nanesena přímo kolonu Mono Q, přičemž protein byl tímto způsobem adsorbován. Kolona byla promyta 5 % .pufru ihned po nanesení dělené směsi. Kolona pak byla eluována s gradientem od 5 % do 40 % B v průběhu 30 min., načež následovalo promytí 100 % B po dobu 10 min. Nitriláza byla eluována ve frakcích 17 a 18, v průběhu gradientu.

• 9 ··· · • 9

Kroky 1-4 jsou znázorněny v tabulce I.

Tabulka I: Schéma čištění

Vzorek	Objem (ml)	Aktivita (U/l)	Celková aktivita (mU)	Výtěžek (%)	Protein (mg/ml)	Celkový protein (mg)	Specif. aktivita (U/g)
Před narušením	160	480	76 800	100	—	—	—
Po narušení	140	400	56 000	72,9		—	—
Q-Sepharose
Naneseno	140	192	26 880	35	12,4	1736	15
AF	400	77	30 800	40,1	0,26	104	296
Superdex 200
Naneseno	9,5	>378	>3591	4,7	2,41	22,90	>157
AF	43	59	2537	3,3	0,21	9,03	281
Mono Q
Naneseno	100	4,8	480	0, 6	0,06	6,33	76
AF	4	>77	308	0,4	0,19	0,76	>405

Aktivní frakce (= AF, v tab. I) z chromatografie na molekulárním sítě (krok 3) a z iontoměničové chromatografie (krok 4) byly frakcionovány na Mono Q pomocí SDS-PAGE, jak je znázorněno na obr. 2.

Krok 5: Kapalinová chromatografie na reverzní fázi (RP) s vysokou účinností [lacuna]

Aktivní frakce (frakce 17 a 18) z chromatografie na Mono Q (krok 4) byly kontrolovány na homogenitu pomocí RP chromatografie a dále čištěny, aby se připravilo tripsinové štěpeni. Oddělováni bylo prováděno pomocí kolony Abimed (3 cm) na zařízeni Hewlett-Packard (HP 1090). Mobilní fáze byla pufr A: voda s 0,1 % TFA a pufr B: acetonitril s 0,1 % TFA. Vstřikovaný objem byl 0,1 ml, průtok byl 0,5 ml/min. Ruční gradient měl následující profil:

Minuty	% pufru A	% pufru B
0	80	20
2	80	20
22	30	70
22,1	0	100
24	0	100
25	100	0
30	100	0

Nitriláza se vymývala mezi 12. a 13. minutou. To odpovídá pásmu 37 kDa v SDS-PAGE. Toto pásmo bylo potom specielně sekvencováno pomocí proteinového sekvenceru Applied Biosystems 494 Procise. N-terminální sekvence 39 aminokyselin, která byla získána touto cestou, je uvedena jako SEQ ID NO: 3 v dalším textu. Tato sekvence je zahrnuta v příloze sekvencí a je:

Met

Gin

Thr

Arg

Lys

Ile

Val

Arg

Ala

Val

Gin

Ala

Ser

Pro

Asn

Tyr

Asp

Leu

Ala

Thr

Gly

Val

Asp

Lys

Thr

Ile

Glu.

Leu

Ala

Arg

Gin

Ala

Arg

Asp

Glu

Gly.

Příprava tryptických peptidu

Vzorek z Mono Q chromatografie (krok 4) byl předběžně zpracován následovně: protein (asi 0,6 mg) byl vysrážen přídavkem 12,5 % TCA a peleta byla promyta třikrát 1 ml směsi éteru s etanolem (1:1). Tato peleta byla pak rozpuštěna v 0,2 ml v 6 M guanidinu HC1, 25 mM tris/HCl, pH 8,5. K tomuto roztoku pak bylo přidáno 2,6 μΐ 1 M DTT, aby se omezily disulfitové můstky. Získaný vzorek byl třepán v temném prostředí po dobu 1 hodiny. Protein pak byl uveden do reakce s 1,5 μΐ 4 vinylpyridinového roztoku (35 %) v temném prostředí a po dobu 2 hodin. Reakce byla ukončena s inkubací s 2,6 μΐ 1 M DTT roztoku po dobu 1 hodiny. Vinylpyridovaný enzym byl čištěn pomocí RPHPLC, jak je popsáno shora. Doba zdržení byla v tomto případě mezi 10 a 11 minutami. Aktivní frakce, která byla identifikována podle molekulové hmotnosti, byla shromážděna a zahuštěna na objem 0,02 ml. Takto získaný produkt byl adjustován na objem 0,2 ml přidáním 0,01 ml acetonitrilu a 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5. pH bylo upraveno také, což bylo provedeno přidáním 0,05 ml 0,1 M NaOH. Tento vzorek (odhadnuté množství proteinu 0,3 mg) byl smíchán s 0,032 ml roztoku s obsahem 1 mg/ml trypsinu v 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5; 5 % acetonitrilu a inkubován při 37°C přes noc. Digesce byla zastavena přidáním 0,01 ml kyseliny octové, načež následovalo odstředění. Supernatant byl oddělen pomocí RPHPLC na C18 (eluční systém: pufr A: voda, 0,01 % TFA, pufr B: acetonitril, 0,1 % TFA). Peptidy (detekce při 205 nm a 280 nm) byly odděleny a sekvencovány. Při tom byl použit sekvencér Applied Biosystems 494 Procise pro sekvencování proteinů. Vnitřní peptidová sekvence 21 aminokyselin je uvedena dále jako SEQ ID NO: 4 a vnitřní sekvence 11 aminokyselin je dále uvedena jako SEQ ID NO: 5. Obě tyto sekvence jsou také přiloženy v seznamu sekvencí, a jsou:

SEQ ID NO: 4

Glu Glu Ala Pro Glu Gin Gly Val Gin Ser Lys Ile Ala Ser Val Ala

Ile Ser His Pro Gin

SEQ ID NO: 5

Glu Glu Ala Pro Glu Gin Gly Val Gin Ser Lys

6. Aktivita čištěné nitrilázy na nitril kyseliny mandlové ·* • · • · ·· ···· • 41 • · ·· ·· • ·

• · · • · ·· · • · ·· ···

Aktivita čištěné nitrilázy na nitril kyselina mandlové byla zkoumána způsobem, který je popsán v příkladu 2. Specifická aktivita čištěného proteinu na nitril kyseliny mandlové byla 12 380 U/cf proteinu.

Příklad 2: Klonování nitrilázy z mikroorganismu Alcaligenes faecalis 1650

Nejprve byly syntetizovány nukleotidové próby, odvozené od peptidových sekvencí SEQ ID NO: 3 a 4, které jsou popsány V příkladu 1. Nukleotidové próba, odvozená od SEQ ID NO: 3, Nterminální peptidová sekvence, byla 64 krát degenerována 23 merními (v sekvenci nukleotidové próby A, C, G nebo T je nahrazeno N; A nebo G je nahrazeno R; C nebo G je nahrazeno S). Vysoké procento GC v kmenech Alcaligenes, popsaných v literatuře (Wada et al., 1992, Nucl. Acids Res., 20, 2111-2118) znamená, že v tomto případě byl ve třetí pozici kodonu předpovězen glutamin a izoleucin. Nukleotidové próba, o které se zde hovoří, dále jako SEQ ID NO: 6, je 5' primér pro následné PCR, přičemž S = C neb G a N = A, C, G nebo T a je:

SEQ ID NO: 6

5'-ATGCAGACNAGNAARATCGTSCG-3'

256krát degenerovaný 20 mer byl odvozen jako nukleotidové próba z SEQ ID NO: 4, což je vnitřní peptidová sekvence (v sekvenci nukleotidových bází je A, C, G nebo T nahrazeno N; A nebo G je nahrazeno R; C nebo G je nahrazeno S). Vysoké procento GC v kmenech Alcaligenes, které v tomto případě znamenalo předpověď lysinu na třetí pozici v kodonu. Tato nukleotidové

9»	• 99 9	9 »9	• 9	•
• ·	•	9 9 9 9	«	9	9 9
• 9	9 99	9 9	9 ' *	9
•	•	9 9	9 9	9 9	9	9
•	9	9	• 9	•	9	9
99	♦ ·*	999 ··«»	99	999

próba je 3' primér pro následné PCR a je uvedena v následujícím textu jako SEQ ID NO: 7. Je také zahrnutá do přiloženého seznamu sekvencí a je:

SEQ ID NO: 7

5'-TNGCSACNGANGCRATCTTG-3'

Tyto párové priméry, SEQ ID NO: 6 a 7, byly použity k uskutečnění PCR na chromozomální DNA z organismu Alcaligenes faecalis 1650. Izolace chromozomální DNA se provádělo po rozkladu buněk lysozymem a proteinázou K klasickou metodou, která je odborníkům v oboru známá (Ausubel, F. M. et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons).

PCR pomocí polymerázy Pwo zahrnovala denaturaci při 95°C po dobu 3 minut, 35 cyklů denaturace při 95°C po dobu 1 minuty, zesílení primeru při 58°C po dobu 1 min. 30 sekund a polymeraci při 72°C po dobu 1 min. 30 sec.; a následnou polymeraci při 72°C po dobu 5 min.

Za těchto podmínek byl zesílen fragment o velikosti asi 1 kb chromozomální DNA z Alcaligenes faecalis 1650. Aby se nakloňoval PCR produkt, byly připojeny ke každému ze shora uvedených primérů dva přídavné nukleotidy (5'-AATCTAGA a 5'ATTCTAGA), což bylo provedeno v Xbal restrikčním štěpném místě a reakce PCR byla opakována za shora uvedených podmínek. Poté bylo znovu opakováno zesílení fragmentu o velikosti asi 1 kb, který po čištění a Xbal digesci, byl napojen na analogně digestovaný pUC18. Po transformaci E. coli JM109 a izolaci výsledného plazmidu byla DNA čištěna sekvencováním a následným genomovým Southern blot. Metody používané v molekulární biologii a mikrobiologii, pro izolaci úplného nitrilázového genu, byly použity v souladu s klasickými metodami, které jsou odborníkovi v oboru známy. Úplná nitrilázová sekvence je znázorněna jako SEQ ID NO: 1.

Příklad 3: Homologie s jinými proteiny, identifikace homologní sekvence

Srovnání se sekvencemi z databáze proteinů SWISSPROT ukázalo, že nitrilázový gen v tom vynálezu má 11 až 96% homologii se známými nitrilázami na úrovni aminokyselin. Největší homologie sekvence byla nalezena s arylacetonitrilověspecifickou nitrilázou z Alcaligenes faecalis JM3 (Nagasawa et al., Eur. J. Biochem. 1990, 194, 765-772). Tyto dva nitrilázové geny mají identitu 93,2 % na nukleotidové úrovni v regionu 1071 bp. Odvozená aminokyselinová sekvence má identitu 96,1 % v regionu 356 aminokyselin. Nejmenší homologie 11,4 % v průběhu regionu 534 aminokyselin byla nalezena s nitrilázou z Rhodococcus erythropolis SK92 (EP-A-0 719 862).

Příklad 4: Heterologní exprese nitrilázy v E. coli

Gen nit byl zesílen pro klonování do expresního vektoru pJOE2702. 5' primér, zvolený v tomto případě pro PCR, byl shora zmíněná SEQ ID NO: 3, přičemž se používalo štěpné místo Ndel s překrytími s translačním startem, připojeném na zakončení nit 5'. Primér je zde uveden jako SEQ ID NO: 8 a je také přiložen v seznamu sekvencí. Zvoleným 3' primérem byl 24 mer z 3' regionu genu nit, se štěpnými místy BamHI přiléhajícími k stop kodonů. Je veden v dalším textu jako SEQ ID NO: 9 a je přiložen v seznamu sekvencí.

5'-TTAATCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCCG-3' (= SEQ ID NO: 8) 5'-AAGGATCCTCAAGACGGCTCTTGCACTAGCAG-3' (= SEQ ID NO: 9)

Použiti PCR s použitím Pwo polymerázy zahrnovalo denaturaci při 94°C po dobu 3 minut, 25 cyklů denaturace při 93°C po dobu 1 minuty, primární zesílení při 55°C po dobu 1 min. 30 sek. a polymeraci při 72°C po dobu 1 min. 30 sek. a závěrečnou polymeraci při 72°C po dobu 5 min. Výsledný PCR fragment byl čištěn, digestován pomocí Ndel/BamHI a zaveden do analogně digestovaného vektoru pJOE2702 (Volff et al., 1996, Mol. Microbiol., 21(5), 1037-1047). Výsledný plazmid byl nazván pDHE

19.2 a je znázorněn na obr. 3. Zapojení přes Ndel/BamHI štěpné místo znamená, že v plazmidu pDHE19.2 je gen nit kontrolován transkripcí promotoru rha_P, který je přítomen v zmíněném vektoru pJOE2702 a pochází z pozitivně regulovaného L-rhamnozového operonu rhaBAD v E. coli (Egan & Schleif, 1994, J.Mol. Biol., 243, 821-829). Zakončení transkripce nit genu a iniciace translace byla podobně provedena přes sekvence vektoru. Kromě toho plazmid obsahoval gen, který poskytuje rezistenci proti ampicilinu Ap^R.

Heterologní exprese nitrilázy byla provedena s kmenem JM109 E. coli, obsahujícím plazmid pDHE19.2. Pro tyto účely byl s použitím třepání kultivován kmen JM109 (pDHE19.2) v kultivačním prostředí TB se 100 pg/ml ampicilinu (Tartof, Hobbs 1987). Při OD₆₀o = 1/7 byla kultura přenesena v poměru 1 : 200 do čerstvého kultivačního roztoku TB, který obsahoval 0,2 % (hmotn./obj.) L-rhamnózy, aby se indukovala nitriláza a byla prováděna kultivace za současného třepání při 30°C. Po 8 hod. byly buňky narušeny, promyty 10 mM Na/K fosfátovým pufrem, pH =

3Ί

7,2, resuspendovány ve stejném pufru na OD₆₀o = 10 a poté byly narušeny působením ultrazvuku.

Přiklad 5: Stanovení aktivity nítrilázy ve rekombinačním kmenu

E. coli JM109 (pDHE19.2)

1. Namnožení buněk

E. coli JM109 (pDHE19.2) byly kultivovány v TB živném roztoku + 100 pg/ml ampicilinu s použitím třepání při 37°C po dobu 6 hodin. Při hodnotě ΟΌβοο = 4 bylo použito 100 ml této předem připravené kultury k inokulaci 10 1 fermentoru obsahujícího 8 litrů čerstvého TB živného roztoku + 100 pg/ml ampicilinu + 2 g L-rhamnózy. pH, teplota, průtok vzduchu a rychlost míchání byly 7,2; 30°C, 300 1/hod. a 400-650 otáček za min. Buňky byly sklizeny po 16 hod. Optická hustota při 600 nm byla v tomto případě 18, což odpovídá suché hmotnosti buněk 7,8 g/1.

2. Stanovení specifické aktivity na nitril kyseliny mandlové

Buňky byly získány, jak je popsáno v příkladu 1 a promyty v 10 mM Na/K fosfátového pufru, pH 7,2. 2 ml suché hmotnosti buněk byly resuspendovány v 1 ml 10 mM Na/K fosfátového pufru, pH 7,2 a reakce byla zahájena přidáním 8,3 mM nitrilu kyseliny mandlové. Reakce byla prováděna s použitím třepání při 40°C. Kinetika byla sledována odebíráním vzorků a následnou vysoko účinnou kapalinovou chromatografií (ODS Hypersil). Byl stanoven nitril kyseliny mandlové, benzaldehyd, amid kyseliny mandlové a dále byla stanovena samotná kyselina mandlová. Rychlost vzniku kyseliny mandlové je 403 U/g suché hmotnosti buněk s konverzí • · · · · ·

····· · · · %, přičemž 1 U je definován jako tvorba 1 pmolu kyseliny mandlové za minutu při 40^QC.

Příklad 6:

Syntéza R-mandlové kyseliny hydrolýzou nitrilu kyseliny mandlové s použitím E. coli

JM109 (pDHE19.2) v suspenzi

Nitril kyseliny mandlové v koncentraci 1,3 g/1 byl dávkován v průběhu 10 hodin do objemu 1 litru 10 mM Na/K fosfátového pufru, pH 7,2, který obsahoval kmen E. coli JM109 (pDHE19.2) v koncentraci 2 g/1, přičemž byla směs míchána lopatkovým míchadlem při 40°C. Dávkování bylo kontrolováno pomocí měření spotřeby nitrilu. Rychlost spotřeby R-mandlové kyseliny byla sledována způsobem, který je popsaný v příkladu 5. Výsledky jsou znázorněny na obr. 4.

Příklad 7: Izolace R-mandlové kyseliny extrakcí z reakční směsi z hydrolýzy nitrilu kyseliny mandlové pomocí E. coli

JM109 (pDHE19.2) v suspenzi

Vodná reakční směs obsahující kyselinu mandlovou, získaná v příkladu 6 byla odstředěna, aby se odstranily buňky, pH bylo upraveno na 2 přidáním kyseliny a směs byla třikrát extrahována metylterc.butyléterem (MTBE). Po odstranění organického rozpouštědla z extraktu kyseliny mandlové odpařením byly výsledné bílé krystaly kyseliny mandlové znovu rozpuštěny a testovány na chemickou a optickou čistotu pomoci vysoko účinné kapalinové chromatografie. Chemická čistota byla 99 % a optická čistota R-mandlové kyseliny byla 97,4 %.

Přiklad 8: Izolace . R-mandlové kyseliny krystalizaci, která se provádí ochlazením reakční směsi z hydrolýzy nitrilu kyseliny mandlové pomocí E. coli JM109 (pDHE19.2) v suspenzi

Vodná reakční směs s kyselinou mandlovou, získaná v příkladu 6, byla odstředěna, aby se odstranily buňky, zahuštěna na 40 % původního objemu zahříváním a mícháním, a její pH bylo upraveno kyselinou na pH = 2. Kyselina mandlová byla krystalizována ochlazením v ledové lázni a výsledné bílé krystaly kyseliny mandlové byly odfiltrovány s použitím odsávání a vysušeny. Tyto krystaly byly opět rozpuštěny a testovány na chemickou a optickou čistotu vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. Chemická čistota byla 99,1 % a optická čistota R-mandlové kyseliny byla 99,8 %.

Příklad 9: Konverze různých nitrilů

Kmen E. coli (viz příklad 6) nebo výchozí kmen Alcaligenes byl použit ke konverzi různých nitrilů. Buňky Alcaligenes byly kultivovány ve 400 ml živného prostředí pro tento kmen (viz kultivační roztok shora) při 30°C a 160 otáčkách za min. po dobu 16 hodin. Buňky byly sklizeny odstředěním (4°C a 5000 otáček za min., 30 minut). Podíly 150 μΐ buněčné suspenze byly jednotlivě odpipetovány do jamek mikrotitrové destičky. Tato destička pak byla odstředěna. Supernatant byl odsát a buněčné pelety byly dvakrát promyty Na2HPO₄ (1,42 g/1 v Finnaqua, pH 7,2) . Roztok substrátu (150 μΐ) pak byl pipetován a buňky byly resuspendovány. V každé řadě 12 jamek v mikrotitrové destičce byl použit jeden substrát. Řada s roztokem substrátu, ale bez buněk, byla použita jako kontrola (= slepý pokus).

• ·

Mikrotitrové destičky byly ponechány na třepačce v inkubátoru při 200 otáček za minutu a 30°C 2 hodiny. Pak byly buňky odstředěny a bylo pomocí zařízení Biomek stanoveno množství NH₄ ⁺ iontů,, vyprodukovaných do supernatantu. Tato měření byla prováděna při 620 nm pomocí kalibrační křivky, vytvořené pomocí roztoků NH₄OH o různé koncentraci (viz Obrázek 5). Jako testovací látky byly použity:

nitril kyseliny mandlové

2-fenylpropionitril (= 2

2-fenylbutyronitril (= 3 benzylkyanid (= 4),

4-chlorbenzylkyanid (= 5

4-brombenzyl-kyanid (= 6 propionitril (= 7),

2-metylbutyronitril (= 8 geranonitril (= 9), valeronitril (= 10),

2-kyanobutan),

3-kyanopyridin (= 11),

3- bifenyl-2-hydroxybutyronitril (= 12),

4- fluorbenzylkyanid (= 13, 4-fluorfenylacetronitril) a a-(3-heptyl)-nitro-triacetonitril (= 14)..

Každá testovací látka byla rozpuštěna na 0,2 molární zásobní roztok v metanolu a tyto roztoky byly zředěny na koncentraci 10 mmol/1 přídavkem Na₂HPO₄ (1,42 g/1 Finnaqua, pH 7,2). Suspenze buněk byly standardizovány na 2 g/1 suché biomasy. Tabulka II ukazuje průměrné konverze pro každou řadu mikrotitrové destičky.

• · · · · · • · · β · · · ·

Tabulka II: Konverze různých nitrilů nitrilázou 1650

Látka č.	pmol/l	Aktivita	% konverze
1	2141,2	8,9	86,3
2	. 1001,1	4,1	70,2
3	24,4	0,1	44,3
4	2210,5	9,2	100
5	2136,3	8,9	100
6	1500,8	6,2	100
7	4,9	0,02	NA
8	-	-	NA
9	-	-	NA
10	113,4	0,47	NA
11	-	-	NA
12	-	-	NA
13	2222,9	9,2	100
14	84,8	0,35	44

Obrázek 6 znázorňuje tyto stanovené konverze, vyjádřené jako aktivity.

PŘEHLED

SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A)	JMÉNO:	BASF Aktiengesellschaft
(B)	ULICE:	Carl-Bosch-Strasse 38
(C)	MĚSTO:	Ludwigshafen
(D)	STÁT:	Porýní-Falc
(E)	ZEMĚ:	Spolková republika Německo
(F)	POŠTOVNÍ KÓD: D-67056

(ii) NÁZEV PŘIHLÁŠKY: A process for preparing chiral carboxylic acids from nitriles using a nitrilase or microorganisms which comprise a gene for the nitrilase (iii) POČET SEKVENCÍ: 9 (iv) POČÍTAČOVĚ ČITELNÁ FORMA:

(Ά) TYP MEDIA: disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.25 (EPO) (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1071 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTISENZE: NE (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Alcaligenes faecalis (B) KMEN: 1650 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/HESLO: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1..1071 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

ATG Met 1

CAG Gin

ACA AGA

AAA ATC

GTC CGG GCA GCC GCC

GTA CAG GCC

GCC Ala 15

TCT Ser

Thr

Arg

Lys 5

Ile

Val Arg

Ala

Ala 10

Ala

Val

Gin

Ala

CCC

AAC

TAC

GAT

CTG

GCA

ACG

GGT

GTT

GAT

AAA

ACC

ATT

GAG

CTG

GCT

Pro

Asn

Tyr

Asp

Leu

Ala

Thr

Gly

Val

Asp

Lys

Thr

Ile

Glu

Leu

Ala

20

25

30

CGT

CAG

GCC

CGC

GAT

GAG

GGC

TGT

GAC

CTG

ATC

GTG

TTT

GGT

GAA

ACC

Arg

Gin

Ala

Arg

Asp

Glu

Gly

Cys

Asp

Leu

Ile

Val

Phe

Gly

Glu

Thr

35

40

45

TGG

CTG

CCC

GGA

TAT

CCC

TTC

CAC

GTC

TGG

CTG

GGC

GCA

CCG

GCC

TGG

Trp

Leu

Pro

Gly

Tyr

Pro

Phe

His

Val

Trp

Leu

Gly

Ala

Pro

Ala

Trp

50

55

60

TCG

CTG

AAA

TAC

AGT

GCC

CGC

TAC

TAT

GCC

AAC

TCG

CTC

TCG

CTG

GAC

Ser

Leu

Lys

Tyr

Ser

Ala

Arg

Tyr

Ala

Asn

Ser

Leu

Ser

Leu

Asp

65

70

75

80

AGT

GCA

GAG

TTT

CAA

CGC

ATT

GCC

CAG

GCC

GCA

CGG

ACC

TTG

GGT

ATT

Ser

Ala

Glu

Phe

Gin

Arg

Ile

Ala

Gin

Ala

Arg

Thr

Leu

Gly

Ile

85

90

95

TTC

ATC

GCA

CTG

GGT

TAT

AGC

GAG

CGC

AGC

GGC

AGC

CTT

TAC

CTG

Phe

Ile

Ala

Leu

Gly

Tyr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gly

Ser

Leu

Tyr

Leu

100

105

110

GGC

CAA

TGC

CTG

ATC

GAC

AAG

GGC

GAG

ATG

CTG

TGG

TCG

CGT

CGC

Gly

Gin

Cys

Leu

Ile

Asp

Lys

Gly

Glu

Met

Leu

Trp

Ser

Arg

115

120

125

44

• ·

• ·· ·

··

•

«

•

9 '

•

» ·

• ·

• 4

1 · ··

► ·

•

• ·

•

» «

•

AAA

CTC

AAA

CCC

ACG

CAT

GTA

GAG

CGC

ACC

GTA

TTT

GGT

GAA

GGT

TAT

Lys

Leu

Lys

Pro

Thr

His

Val

Glu

Arg

Thr

val

Phe

Gly

Glu

Gly

Tyr

130

135

140

GCC

CGT

GAT

CTG

ATT

GTG

TCC

GAC

ACA

GAA

CTG

GGA

CGC

GTC

GGT

GCT

Ala

Arg

Asp

Leu

Ile

Val

Ser

Asp

Thr

Glu

Leu

Gly

Arg

Val

Gly

Ala

145

150

155

160

CTA

TGC

TGG

GAG

CAT

TTG

TCG

CCC

TTG

AGC

AAG

TAC

GCG

CTG

TAC

Leu

Cys

Trp

Glu

His

Leu

Ser

Pro

Leu

Ser

Lys

Tyr

Ala

Leu

Tyr

165

170

175

TCC

CAG

CAT

GAA

GCC

ATT

CAC

ATT

GCT

GCC

TGG

CCG

TCG

TTT

TCG

CTA

Ser

Gin

His

Glu

Ala

Ile

His

Ile

Ala

Trp

Pro

Ser

Phe

Ser

Leu

180

185

190

TAC

AGC

GAA

CAG

GCC

CAC

GCC

CTC

AGT

GCC

AAG

GTG

AAC

ATG

GCT

GCC

Tyr

Ser

Glu

Gin

Ala

His

Ala

Leu

Ser

Ala

Lys

Val

Asn

Met

Ala

195

200

205

TCG

CAA

ATC

TAT

TCG

GTT

GAA

GGC

CAG

TGC

TTT

ACC

ATC

GCC

AGC

Ser

Gin

Ile

Tyr

Ser

Val

Glu

Gly

Gin

Cys

Phe

Thr

Ile

Ala

Ser

210

215

220

AGT

GTG

GTC

ACC

CAA

GAG

ACG

CTA

GAC

ATG

CTG

GAA

GTG

GGT

GAA

CAC

Ser

Val

Thr

Gin

Glu

Thr

Leu

Asp

Met

Leu

Glu

Val

Gly

Glu

His

225

230

235

240

AAC

GCC

CCC

TTG

CTG

AAA

GTG

GGC

AGT

TCC

ATG

ATT

TTT

GCG

Asn

Ala

Pro

Leu

Lys

Val

Gly

Ser

Met

Ile

Phe

Ala

245

250

255

CCG

GAC

GGA

CGC

ACA

CTG

GCT

CCC

TAC

CTG

CCT

CAC

GAT

GCC

GAG

GGC

Pro

Asp

Gly

Arg

Thr

Leu

Ala

Pro

Tyr

Leu

Pro

His

Asp

Ala

Glu

Gly

260

265

270

TTG

ATC

ATT

GCC

GAT

CTG

AAT

ATG

GAG

ATT

GCC

TTC

GCC

AAA

GCG

Leu

Ile

Ala

Asp

Leu

Asn

Met

Glu

Ile

Ala

Phe

Ala

Lys

Ala

275

280

285

ATC

AAT

GAC

CCC

GTA

GGC

CAC

TAT

TCC

AAA

CCC

GAG

GCC

ACC

CGT

CTG

Ile

Asn

Asp

Pro

Val

Gly

His

Tyr

Ser

Lys

Pro

Glu

Ala

Thr

Arg

Leu

290

295

300

GTG

CTG

GAC

TTG

GGG

CAC

CGA

GAC

CCC

ATG

ACT

CGG

GTG

CAC

TCC

AAA

Val

Leu

Asp

Leu

Gly

His

Arg

Asp

Pro

Met

Thr

Arg

Val

His

Ser

Lys

305

310

315

320

AGC GTG ACC AGG GAA GAG GCT CCC GAG CAA GGT GTG CAA AGC AAG ATT

Ser Val Thr Arg Glu Glu Ala Pro Glu Gin Gly Val Gin Ser Lys Ile

325 330 335

GCC Ala

TCA Ser

GTC Val

GCT Ala 340

ATC Ile

AGC Ser

CAT His

CCA Pro

CAG Gin 345

GAC Asp

TCG Ser

GAC Asp

ACA Thr

CTG Leu 350

CTA Leu

GTG Val

CAA

GAG

CCG

TCT

TGA

Gin

G1U

Pro

Ser

355

(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 2:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 356 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Met Gin Thr Arg Lys

Ile

Val Arg Ala Ala Ala Val Gin Ala Ala Ser

1

5

10

15

Pro

Asn

Tyr

Asp

Leu

Ala

Thr

dy

Val

Asp

Lys

Thr

Ile

Glu

Leu

Ala

20

25

30

Arg

Gin

Ala

Arg

Asp

Glu

Gly

Cys

Asp

Leu

Ile

Val

Phe

Gly

Glu

Thr

35

40

45

Trp

Leu

Pro

Gly

Tyr

Pro

Phe

His

Val

Trp

Leu

Gly

Ala

Pro

Ala

Trp

50

55

60

Ser

Leu

Lys

Tyr

Ser

Ala

Arg

Tyr

Ala

Asn

Ser

Leu

Ser

Leu

Asp

65

70

75

80

Ser

Ala

Glu

Phe

Gin

Arg

Ile

Ala

Gin

Ala

Arg

Thr

Leu

Gly

Ile

85

90

95

Phe

Ile

Ala

Leu

Gly

Tyr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gly

Ser

Leu

Tyr

Leu

100

105

110

Gly

Gin

Cys

Leu

Ile

Asp

Lys

Gly

Glu

Met

Leu

Trp

Ser

Arg

115

120

125

	Lys	Leu 130	Lys	Pro	Thr	His	val 135	Glu
	Ala 145	Arg	Asp	Leu	Ile	Val 150	Ser	Asp
	Leu	Cys	Cys	Trp	Glu 165	His	Leu	Ser
	Ser	Gin	His	Glu 180	Ala	Ile	His	Ile
	Tyr	Ser	Glu 195	Gin	Ala	His	Ala	Leu 200
	Ser	Gin 210	Ile	Tyr	Ser	Val	Glu 215	Gly
	Ser 225	Val	Val	Thr	Gin	Glu 230	Thr	Leu
	Asn	Ala	Pro	Leu	Leu 245	Lys	Val	Gly
	Pro	Asp	Gly	Arg 260	Thr	Leu	Ala	Pro
	Leu	Ile	Ile 275	Ala	Asp	Leu	Asn	Met 280
	Ile	Asn 290	Asp	Pro	Val	Gly	His 295	Tyr
	Val 305	Leu	Asp	Leu	Gly	His 310	Arg	Asp
-	Ser	Val	Thr	Arg	Glu 325	Glu	Ala	Pro
*	Ala	Ser	Val	Ala 340	Ile	Ser	His	Pro

Gin Glu Pro Ser

355

	• • • • •	• · ·· · • · • · ··	• « • • · ♦ · · · ·	• • • • ·	·· • · • · • ♦ ··	• • · • • ·· ·
• • · · «	•
Arg	Thr	Val	Phe 140	Gly	GlU	Gly	Tyr
Thr	Glu	Leu 155	Gly	Arg	Val	Gly	Ala 160
Pro	Leu 170	Ser	Lys	Tyr	Ala	Leu 175	Tyr
Ala 185	Ala	Trp	Pro	Ser	Phe 190	Ser	Leu
Ser	Ala	Lys	Val	Asn 205	Met	Ala	Ala
Gin	Cys	Phe	Thr 220	Ile	Ala	Ala	Ser
Asp	Met	Leu 235	Glu	Val	Gly	Glu	His 240
Gly	Gly 250	Ser	Ser	Met	Ile	Phe 2 55	Ala
Tyr 265	Leu	Pro	His	Asp	Ala 270	Glu	Gly
Glu	Glu	Ile	Ala	Phe 285	Ala	Lys	Ala
Ser	Lys	Pro	Glu 300	Ala	Thr	Arg	Leu
Pro	Met	Thr 315	Arg	val	His	Ser	Lys' 320
Glu	Gin 330	Gly	Val	Gin	Ser	Lys 335	Ile
Gin 345	Asp	Ser	Asp	Thr	Leu 350	Leu	Val

·· ·»·· • · • 4 4 · (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 3:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTISENZE: NE (v) TYP FRAGMENTU: N-zakončení (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Alcaligenes faecalis (B) KMEN: 1650 (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:

(B) KLON: nitrilázový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

Met

Gin

Thr

Arg

Lys

Ile

Val Arg

Ala Ala Ala

Val

Gin

Ala

Ser

1

5

10

15

Pro

Asn

Tyr

Asp

Leu

Ala

Thr Gly

Val Asp Lys

Thr

Ile

Glu

Leu

Ala

20

25

30

Arg

Gin

Ala

Arg

Asp

Glu

Gly

4»		4 4«	i a
• ·	•	4» 4 ·	4 4	4
• ·	• 4 4	4 4	4 4
e 4	4 4	• a	• 4 a
e ·	4	4' 4	4 4
··	444	• 44 »*··	»4	4

(2) INFORMACE 0 SEQ ID NO: 4:
(i) VLASTNOSTI SEKVENCE: (A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: peptid
(iii	) HYPOTETIKÁ: NE
(iii	) ANTISENZE: NE
(V)	TYP FRAGMENTU: vnitřní
(Ví)	PŮVODNÍ ZDROJ: (A) ORGANIZMUS: Alcaligenes faecalis

(B) KMEN: '1650 (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:' (B) KLON: nitriázový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

Glu Glu Ala Pro Glu Gin Gly Val Gin Ser Lys Ile Ala Ser Val Ala

10 15

Ile Ser His Pro Gin (2) INFORMACE FOR SEQ ID NO: 5:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 11 aminokyselin
(B)	TYP: Aminokyselina
(D)	TOPOLOGIE: Lineární
TYP	MOLEKULY: Peptid

(iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTISENZE: NE (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(B) KLON: nitrilázový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

Glu Glu Ala Pro Glu Gin Gly Val Gin Ser Lys

10 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 6:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYPE: nukleová kyseina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ííi) HYPOTETICKÁ: NE (iíi) ANTISENZE: NE (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZM: Alcaligenes faecalis (B) KMEN: 1650 (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:

(B) KLON: nitrilázový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

ATGCAGACNA GNAARATCGT SCG (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 7:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYPE: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTISENZE: NE (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Alcaligenes faecalis (B) STRAIN: 1650 (Vii.)_ .BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:

(B) KLON: nitrilázový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

TNGCSACNGA NGCRATCTTG (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 8:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTISENZE: NE (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(B) KLON: nitrilázový • · · • · • · ·· • · · · · · • · ·

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

TTAATCATAT GCAGACAAGA AAAATCGTCC G (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 9:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 32 párů	bází
(B)	TYPE: nukleová	kyselina
(C)	POČET VLÁKEN:	jedno
(D)	TOPOLOGIE: lineární
TYP	MOLEKULY: DNA	(genomová

(iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTISENZE: NE (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(B) KLON: nitrilázový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:

AAGGATCCTC AAGACGGCTC TTGCACTAGC AG

Claims

1. Izolovaná sekvence nukleových kyselin, kódující polypeptid, který má nitrilázovou aktivitu, vybraná ze skupiny, do které patří

a) a sekvence nukleových kyselin, která má sekvenci, znázorněnou jako SEQ ID NO: 1,

b) sekvence nukleových kyselin, které jsou odvozeny od nukleové kyselina sekvence znázorněné jako SEQ ID NO: 1, jako výsledek degenerace genetického kódu,

c) deriváty sekvence nukleových kyselin, znázorněné jako SEQ ID NO: 1, kódující polypeptidy, které mají sekvence aminokyselin, znázorněné jako SEQ ID NO: 2 a jsou na aminokyselinové úrovni nejméně z 95 % homologické při zanedbatelném snížení enzymatické účinnosti těchto polypeptidů.

2. Sekvence aminokyselin kódovaná sekvencí nukleových kyselin podle nároku 1.

3. Sekvence aminokyselin podle nároku 2, kódovaná sekvencí znázorněné jako SEQ ID NO: 1.

4. Konstrukt nukleové kyseliny, zahrnující sekvenci nukleových kyselin podle nároku 1, přičemž tato sekvence nukleových kyselin je navázána na jeden nebo více regulačních signálů.

5. Vektor zahrnující sekvenci nukleových kyselin podle nároku 1 nebo konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 4.

6. Mikroorganizmus obsahující alespoň jednu sekvenci nukleových kyselin podle nároku

1 nebo alespoň jeden konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 4.

7. Mikroorganizmus podle nároku 6, kterým je bakterie rodů Escherichia, Pseudomonas nebo Alcaligenes.

8. Způsob přípravy chirálních karboxylových kyselin obecného vzorce I

COOH (I) při kterém se převádí racemické nitrily obecného vzorce II (II) za přítomnosti sekvence aminokyselin podle nároku 2 nebo 3 nebo rostoucího, latenního nebo narušeného mikroorganizmu podle nároku 6 nebo 7, přičemž se alespoň 25 mmol nitrilů konvertuje za hodinu na 1 mg proteinu, nebo se konvertuje alespoň 25 mmol nitrilů za hodinu a na 1 g suché hmotnosti, na chirální karboxylové kyseliny, přičemž substituenty a obecné zbytky ve vzorcích I a II mají následující významy: * opticky aktivní centrum

999**9 · 9999

999 .999 9 9*9

9*999 9 9*9

R¹, R², R³ nezávisle jeden na druhém znamenají vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo nevětvený Ci-Cio-alkyl, C₂-Ci₀-alkenyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, heteroaryl, OR⁴ nebo NR⁴R⁵, a kde radikály R¹, R² a R³ jsou vždy navzájem odlišné,

R⁴ znamená vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo nevětvený Ci-Ci₀-alkyl, C₂-Ci₀-alkenyl, Cj-Cioalkylkarbony1, C₂-Ci₀-alkenylkarbonyl, aryl, arylkarbonyl, heteroaryl nebo heteroarylkarbonyl,

R⁵ znamená vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo nevětvený Ci-Ci₀-alkyl, C₂-Cio~alkenyl, aryl nebo heteroaryl.

9. Způsob podle nároku 8, přičemž jeden ze substituentů R¹, R² nebo R³ je OR⁴.

10. Způsob podle nároku 8 nebo 9, přičemž jeden ze substituentů R¹, R² nebo R³ je aryl.

11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10, který se provádí ve vodném reakčním roztoku a při pH mezi 4 a 11.

12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 8 až 11, při kterém se uvádí do reakce od 0,01 do 10 % hmotnostních nitrilů nebo od 0,01 do 10 % hmotnostních odpovídajícího aldehydu nebo ketonu a od 0,01 do 10 % hmotnostních kyseliny kyanovodíkové.

13. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 8 to 12, který se provádí při teplotě 0 °C až 80 °C.

«····· · ·♦ ·· · ··· · · · · ···· • · · · · · · · · · · · · · · · · · •JU ·· · · · ······· · · ···

14. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 8 až 13, při kterém se chirálni karboxylová kyselina izoluje z reakčniho roztoku ve výtěžcích od 60 do- 100 % extrakcí nebo krystalizací nebo extrakcí a krystalizací.

15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 8 až 14, při kterém má chirálni karboxylová kyselina má optickou čistotu nejméně 90 %.