CZ2000803A3 - Transgenní savci produkující oligosacharidy ve svém mléku - Google Patents
Transgenní savci produkující oligosacharidy ve svém mléku Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2000803A3 CZ2000803A3 CZ2000803A CZ2000803A CZ2000803A3 CZ 2000803 A3 CZ2000803 A3 CZ 2000803A3 CZ 2000803 A CZ2000803 A CZ 2000803A CZ 2000803 A CZ2000803 A CZ 2000803A CZ 2000803 A3 CZ2000803 A3 CZ 2000803A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- lacto
- fucopentaose
- derivative
- milk
- sialylated
- Prior art date
Links
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 title claims abstract description 153
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 152
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 134
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 title claims abstract description 124
- 239000008267 milk Substances 0.000 title claims abstract description 124
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 title claims abstract description 124
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 66
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 66
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 42
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 40
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 claims description 39
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 36
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 36
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 32
- 229930193965 lacto-N-fucopentaose Natural products 0.000 claims description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 27
- SNFSYLYCDAVZGP-UHFFFAOYSA-N UNPD26986 Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)OC(CO)C(O)C1O SNFSYLYCDAVZGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 22
- AUNPEJDACLEKSC-ZAYDSPBTSA-N 3-fucosyllactose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@H](CO)[C@@H]1O AUNPEJDACLEKSC-ZAYDSPBTSA-N 0.000 claims description 20
- 229940062827 2'-fucosyllactose Drugs 0.000 claims description 16
- HWHQUWQCBPAQQH-UHFFFAOYSA-N 2-O-alpha-L-Fucosyl-lactose Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O HWHQUWQCBPAQQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- HWHQUWQCBPAQQH-BWRPKUOHSA-N 2-fucosyllactose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O HWHQUWQCBPAQQH-BWRPKUOHSA-N 0.000 claims description 16
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 16
- 108010019236 Fucosyltransferases Proteins 0.000 claims description 13
- 102000006471 Fucosyltransferases Human genes 0.000 claims description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 claims description 10
- PDWGIAAFQACISG-QZBWVFMZSA-N beta-D-Gal-(1->3)-beta-D-GlcNAc-(1->3)-[beta-D-Gal-(1->4)-beta-D-GlcNAc-(1->6)]-beta-D-Gal-(1->4)-D-Glc Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H]([C@@H](O[C@@H]1CO)OC[C@@H]1[C@@H]([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O1)O)NC(=O)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O PDWGIAAFQACISG-QZBWVFMZSA-N 0.000 claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 9
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 9
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 8
- DUKURNFHYQXCJG-JEOLMMCMSA-N alpha-L-Fucp-(1->4)-[beta-D-Galp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-beta-D-Galp-(1->4)-D-Glcp Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O[C@@H]2[C@H]([C@H](O[C@@H]3[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]3O)CO)O[C@H](CO)[C@@H]2O)O)O[C@@H]1CO DUKURNFHYQXCJG-JEOLMMCMSA-N 0.000 claims description 8
- -1 gluconylepimerase Proteins 0.000 claims description 8
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 8
- 108060003306 Galactosyltransferase Proteins 0.000 claims description 7
- 102000030902 Galactosyltransferase Human genes 0.000 claims description 7
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 7
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 claims description 7
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 7
- IEQCXFNWPAHHQR-UHFFFAOYSA-N lacto-N-neotetraose Natural products OCC1OC(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)C(NC(=O)C)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O IEQCXFNWPAHHQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229940062780 lacto-n-neotetraose Drugs 0.000 claims description 7
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010092364 Glucuronosyltransferase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016354 Glucuronosyltransferase Human genes 0.000 claims description 6
- TVVLIFCVJJSLBL-SEHWTJTBSA-N Lacto-N-fucopentaose V Chemical compound O[C@H]1C(O)C(O)[C@H](C)O[C@H]1OC([C@@H](O)C=O)[C@@H](C(O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](OC2[C@@H](C(OC3[C@@H](C(O)C(O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 TVVLIFCVJJSLBL-SEHWTJTBSA-N 0.000 claims description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 6
- AXQLFFDZXPOFPO-UHFFFAOYSA-N UNPD216 Natural products O1C(CO)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(=O)C)C1OC(C1O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)OC1CO AXQLFFDZXPOFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- CMQZRJBJDCVIEY-JEOLMMCMSA-N alpha-L-Fucp-(1->3)-[beta-D-Galp-(1->4)]-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-beta-D-Galp-(1->4)-D-Glcp Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H]([C@H](O[C@@H]3[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]3O)CO)O[C@H](CO)[C@@H]2O)O)[C@@H]1NC(C)=O CMQZRJBJDCVIEY-JEOLMMCMSA-N 0.000 claims description 6
- AXQLFFDZXPOFPO-UNTPKZLMSA-N beta-D-Galp-(1->3)-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-beta-D-Galp-(1->4)-beta-D-Glcp Chemical compound O([C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]([C@H]1O)O[C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O1)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)C)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO AXQLFFDZXPOFPO-UNTPKZLMSA-N 0.000 claims description 6
- FKADDOYBRRMBPP-UHFFFAOYSA-N lacto-N-fucopentaose II Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(C)=O)C(OC2C(C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C2O)O)OC1CO FKADDOYBRRMBPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- USIPEGYTBGEPJN-UHFFFAOYSA-N lacto-N-tetraose Natural products O1C(CO)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(=O)C)C1OC1C(O)C(CO)OC(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)C1O USIPEGYTBGEPJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- RBMYDHMFFAVMMM-PLQWBNBWSA-N neolactotetraose Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H]([C@@H](O[C@@H]1CO)O[C@@H]1[C@H]([C@H](O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O[C@H](CO)[C@@H]1O)O)NC(=O)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O RBMYDHMFFAVMMM-PLQWBNBWSA-N 0.000 claims description 6
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 108010087568 Mannosyltransferases Proteins 0.000 claims description 5
- 102000006722 Mannosyltransferases Human genes 0.000 claims description 5
- 102000004896 Sulfotransferases Human genes 0.000 claims description 5
- 108090001033 Sulfotransferases Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims description 5
- CMQZRJBJDCVIEY-UHFFFAOYSA-N lacto-N-fucopentaose III Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(CO)OC(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)C1NC(C)=O CMQZRJBJDCVIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- QNSWVQWPVUZACH-ZQTNVGDNSA-N Lacto-N-difucopentaose II Chemical class O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@H](O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O[C@H]3[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O3)O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 QNSWVQWPVUZACH-ZQTNVGDNSA-N 0.000 claims description 3
- 102100023315 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010056664 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 claims description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims description 2
- KFOPKOFKGJJEBW-ZSSYTAEJSA-N methyl 2-[(1s,7r,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-1,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-3-oxo-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]acetate Chemical compound C([C@H]1O)C2=CC(=O)C[C@H](O)[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](CC(=O)OC)[C@@]1(C)CC2 KFOPKOFKGJJEBW-ZSSYTAEJSA-N 0.000 claims 4
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 claims 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 claims 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 69
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 57
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 31
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 25
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 23
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 18
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- WJPIUUDKRHCAEL-UHFFFAOYSA-N 3FL Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(CO)OC(O)C1O WJPIUUDKRHCAEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 10
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 9
- 102000012086 alpha-L-Fucosidase Human genes 0.000 description 9
- 108010061314 alpha-L-Fucosidase Proteins 0.000 description 9
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 9
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- SNFSYLYCDAVZGP-OLAZETNGSA-N 2'-fucosyllactose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O SNFSYLYCDAVZGP-OLAZETNGSA-N 0.000 description 8
- 101710188695 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Proteins 0.000 description 8
- 102100035248 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Human genes 0.000 description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 8
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 8
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 5
- 230000001983 lactogenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 4
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 4
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 4
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 3
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 3
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 3
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010090473 UDP-N-acetylglucosamine-peptide beta-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000469 ethanolic extract Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 3
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 108010083651 3-galactosyl-N-acetylglucosaminide 4-alpha-L-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710105077 Agglutinin-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150082479 GAL gene Proteins 0.000 description 2
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 2
- 101001022185 Homo sapiens Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Proteins 0.000 description 2
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 2
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 2
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 2
- LFTYTUAZOPRMMI-CFRASDGPSA-N UDP-N-acetyl-alpha-D-glucosamine Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-CFRASDGPSA-N 0.000 description 2
- LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N UNPD164450 Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(NC(=O)C)C1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012511 carbohydrate analysis Methods 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000021244 human milk protein Nutrition 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- GAPYKZAARZMMGP-UHFFFAOYSA-N pyridin-1-ium;acetate Chemical compound CC(O)=O.C1=CC=NC=C1 GAPYKZAARZMMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100040842 3-galactosyl-N-acetylglucosaminide 4-alpha-L-fucosyltransferase FUT3 Human genes 0.000 description 1
- YGEHCIVVZVBCLE-FSYGUOKUSA-N 3alpha-galactobiose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](O)C=O)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YGEHCIVVZVBCLE-FSYGUOKUSA-N 0.000 description 1
- 101710098620 Alpha-1,2-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000893749 Arabidopsis thaliana Alpha-L-fucosidase 3 Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102100035687 Bile salt-activated lipase Human genes 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100352919 Caenorhabditis elegans ppm-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000045576 Lactoperoxidases Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100121079 Mus musculus Gal gene Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241000588660 Neisseria polysaccharea Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241001337451 Polyblastus cancer Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000185994 Pseudarthrobacter oxydans Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N UDP-alpha-D-galactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N 0.000 description 1
- 240000003864 Ulex europaeus Species 0.000 description 1
- 235000010730 Ulex europaeus Nutrition 0.000 description 1
- 101001089018 Ulex europaeus Anti-H(O) lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- FZIVHOUANIQOMU-YIHIYSSUSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->3)-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-beta-D-Galp-(1->4)-D-Glcp Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@@H]2[C@H]([C@H](O[C@@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]4[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]4O)CO)O[C@H](CO)[C@@H]3O)O)O[C@H](CO)[C@H]2O)NC(C)=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O FZIVHOUANIQOMU-YIHIYSSUSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 108010087173 bile salt-stimulated lipase Proteins 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 108010001671 galactoside 3-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020251 goat milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N hydrogen peroxide Substances OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000004020 intracellular membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- FZIVHOUANIQOMU-UHFFFAOYSA-N lacto-N-fucopentaose I Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(OC3C(C(OC4C(OC(O)C(O)C4O)CO)OC(CO)C3O)O)OC(CO)C2O)NC(C)=O)OC(CO)C(O)C1O FZIVHOUANIQOMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000012609 strong anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 1
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Způsob pro přípravu transgenníchsavců s výjimkou člověka,
kteří produkují různé oligosacharidy a glykokonjugaty ve
svém mléku. Dále se řešení týká takto připravených savců,
mléka, které tito savci produkují, prostředků obsahujících
mléko, frakcí mléka a přečištěných oligosacharidů, stejně jako
CO glykokonjugátů přítomných v mléku.
Description
Transgenní savci produkující oligosacharidy ve svém mléku
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobů pro přípravu transgenních savců s výjimkou člověka, kteří produkují různé oligosacharidy ve svém mléku. Dále se předkládaný vynález týká takto připravených savců, mléka, které tito savci produkují, prostředků obsahujících mléko, frakcí mléka a přečištěných oligosacharidů, stejně jako glykoproteinů, přítomných v mléku.
Dosavadní stav techniky
V minulosti dosáhlo několik jednotlivců transgenní exprese primárních genových produktů (t.j. proteinů) v mléku transgenních savců (U.S. patent č. 5322775, Wall et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 1696-1700 (1991) a Krimpenfort, P. Cancer Detection and Prevention 17(2): 301-305 (1993)). Taková exprese byla provedena pro produkci velkých množství heterologních proteinů v mléku (Velander et al., Scientific American, Leden 1997, str. 70-74).
Nově bylo také prokázáno, že je možná exprese sekundárních třansgenních produktů, například oligosacharidů, glykoproteinů a glykolipidů (Prieto et al., Journal of Biological Chemistry 49: 29515-29519 (1995)). Pokusy provedené Prietem et al. znamenaly pokrok ve využití mléčných žláz transgenních savců jako bioreaktorů, ne pouze jako alternativního systému pro syntézu proteinů.
Většina pokusů popsaných ve výše uvedených článcích byla provedena pomocí exprese heterologních transgenů. Jedním důvodem pro takovou expresi je to, že homologní geny, které ··· ·
9999 •
9 • 9 jsou transgenně exprimovány, mohou způsobit obtíže z důvodů konfliktu s vlastní proteinovou syntézou při vývoji mléčné žlázy (Burdon et al., Mechanisms of Devolopment 36: 64-67 (1991)). Jiným důvodem pro použití heterologních transgenů je to, že většina pokusů, které byly provedeny, byla navržena pro produkci lidských biologických produktů.
Syntéza sekundárních genových produktů, jako jsou mléčné oligosacharidy, závisí primárně na expresi glykosyltransferas během laktace. Dále, existuje mnoho výhod takové produkce oligosacharidů. Například, v transgenním systému pro syntézu oligosacharidů je nutné pouze katalytické množství glykosyltransferas. Také původ transgenů nemusí být významný, takže sekundární genový produkt nebo produkty mohou být vybrány volně.
Je třeba si uvědomit, že savci jiní než lidé mají různé glykosyltransferasy, které mají své protějšky mezi enzymy u člověka (Thurin et al., The Journal of Biological Chemistry 265(12): 7055-7061 (1990)). Některé z těchto glykosyltransferas byly klonovány ze tkání savců jiných než lidí, například od myší (Larsen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8227-8231 (1989)). Proto představuje transgenní exprese homologních glykosyltransferas v mléčných žlázách savců jiných než lidí prostředek pro produkci oligosacharidů, spolu s oligosacharidy produkovanými za použití heterologních glykosyltransferas. Exprese obou takových typů enzymů, stejně jako oligosacharidů, které jsou připraveny působením takových enzymů, a příbuzných glykoproteinů, spadá do rozsahu předkládaného vynálezu.
Oligosacharidy popsané výše mohou být přidány, například, do kojeneckých přípravků, takže kojenec krmený takovým přípravkem může mít stejné výhody jako kojený kojenec. Například, je •fe ···· ·· ···· ·· ·· • · · · · 9 9 9 9 9 ··· · · · · · · « • · · · · · *····· α · · ............
□ ·>» ·· ·· ·· ....
možné, aby oligosacharidy způsobovaly resistenci na infekci patogenními bakteriemi (Prieto et al., výše). Dále mohou být takové oligosacharidy přidány do jiných prostředků, jako jsou nutriční doplňky nebo farmaceutická činidla. Cílem předkládaného vynálezu je produkce transgenních savců s výjimkou člověka, kteří produkují takové oligosacharidy, buď za použití homologních, nebo heterologních enzymů, jako jsou například glykosyltransferasy. Takové oligosacharidy mohou být potom přidány do různých prostředků pro své výhodné vlastnosti.
Dále, přítomnost oligosacharidů a jiných glykokonjugátů v mléce transgenních savců může vést k získání ochrany před nebo resistence na virové, bakteriální nebo mykotické infekce nebo toxiny u potomstva takových zvířat.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález obsahuje způsob pro syntézu oligosacharidů a glykoproteinů pomocí transgenní exprese enzymů, například glykosyltransferas, během laktace. Dále vynález také obsahuje produkci oligosacharidových struktur, které nejsou v přírodě přítomné. Takové struktury mohou být vyrobeny transgenní expresí vhodných vybraných prokaryotických nebo eukaryotických enzymů, například glykosyltransferas, v savci. Proto předkládaný vynález umožňuje produkci homologních, heterologních a nových struktur v mléce transgenních zvířat.
Přesněji předkládaný vynález obsahuje způsob pro produkci non-lidských, transgenních savců, jejichž somatické a germinální buňky obsahují alespoň jeden transgen. Exprese transgenu vede k produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléku savců. Způsob obsahuje kroky: (a) přípravu alespoň jednoho transgenu; (b) vložení transgenu nebo transgenů do non«« ··»· ·· ···· ·„ ,» * ; . · · · · ··*.
• · · · · e ···· • · »»· « · <ι « * « * lidského, savčího embrya a přenesení vzniklého embrya do samice; a (c) identifikaci alespoň jednoho samičího potomka. Exprese transgenu nebo transgenů vede k produkci alespoň jednoho enzymu, který potom katalyzuje produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléku savce. Každý transgen obsahuje, v operativní vazbě, alespoň jednu expresní regulační sekvenci funkční v sekrečních buňkách savce, DNA sekvenci kódující signální sekvenci funkční v sekrečních buňkách savce a DNA sekvenci kódující enzym. Savcem jiným než je člověk může být, například, myš, krysa, králík, prase, koza, ovce nebo kráva. Enzym může být, například, glykosyltransferasa jako je fukosyltransferasa, galaktosyltransferasa, acetylasa, glukuronyltransferasa, glukonylepimerasa, sialyltransferasa, mannosyltransferasa, sulfotransferasa, βacetylgalaktosaminyltransferasa nebo N-acetylglukosaminyltransferasa. Dále, oligosacharidem může být například, galaktosa a-l-3-galaktosa-p-l-4-glukosa, 2'-fukosyllaktosa, 3'fukosyllaktosa, lakto-N-neo-tetraosa, lakto-N-tetraosa, laktoN-fukopentaosa, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy, lakto-N-fukopentaosa II, sialylovaný derivát lakto-Nfukopentaosy II, lakto-N-fukopentaosa III, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy III, lakto-N-fukopentaosa IV, sialyžovaný derivát lakto-N-fukopentaosy IV, lakto-N-fukopentaosa V, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy V, lakto-N-difukopentaosa I, sialylovaný derivát lakto-N-di-fukopentaosy I, lakto-N-di-fukopentaosa II, sialylovaný derivát lakto-N-difukopentaosy II, lakto-N-hexaosa, fukosylovaný derivát lakto-Nhexaosy, sialyltetrasacharid.tv fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu z^sialyltetrasacharid b, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu b, sialyltetrasacharid c nebo fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu c.
• 9 • 9 · 9
Dále obsahuje předkládaný vynález transgenní savce s výjimkou člověka. Genom savce obsahuje alespoň jednu DNA sekvenci kódující enzym operativně navázanou na promotor specifický pro mléčnou žlázu. Exprese DNA sekvence nebo sekvencí vede k produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléku savce. Savci, enzymy a oligosacharidy mohou být ty, které jsou uvedeny výše.
Dále obsahuje předkládaný vynález způsob pro produkci mléka u transgenních savců jiných než lidí. Způsob obsahuje: (a) přípravu alespoň jednoho transgenu; (b) inserci transgenu nebo transgenů do transgenního savce s výjimkou člověka; a (c) dojení transgenního savce jiného než člověka za zisku mléka. Mléko obsahuje oligosacharidy a glykoproteiny. Každý transgen obsahuje, v operativní vazbě, promotor funkční v sekrečních buňkách mléčných žláz a DNA sekvenci kódující enzym. Exprese každého transgenu vede k produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléku savce. Savci, enzymy a oligosacharidy mohou být ty, které jsou uvedeny výše.
Dále obsahuje předkládaný vynález mléko produkované transgenním savcem s výjimkou člověka. Genom transgenního savce jiného než člověka obsahuje alespoň jednu DNA sekvenci kódující enzym. DNA sekvence je operativně navázaná na promotor. Exprese DNA sekvence vede nakonec k produkci oligosacharidů a glykoproteinů. Savci, enzymy a oligosacharidy mohou být ty, které jsou uvedeny výše.
Kromě toho předkládaný vynález také obsahuje frakci mléka popsaného výše. Frakce může obsahovat, například, jeden nebo více solubilních oligosacharidů a/nebo glykokonjugátů produkovaných v důsledku exprese transgenu nebo transgenů. Tak může frakce mléka obsahovat jednu nebo více uvedených složek • · 4 · · ♦ · · · · · • · » « « · * · · · · · · « * ·· ·♦ 4 ·
(t.j. oligosacharidů a glykokonjugátů) nebo jakoukoliv jejich kombinaci. Taková frakce může také obsahovat přirozené mléčné oligosacharidy transgenních zvířat v kombinaci s jedním nebo více oligosacharidy a/nebo glykokonjugaty produkovanými v důsledku přítomnosti transgenu nebo transgenů.
Dále předkládaný vynález obsahuje oligosacharid nebo glykoprotein přečištěný z mléka popsaného výše, stejně jako nutriční výrobek obsahující mléko, jeho frakci nebo oligosacharidy a/nebo glykoproteiny, které byly popsány výše. Tímto nutričním výrobkem může být kojenecký prostředek, v kapalné nebo pevné formě.
Předkládaný vynález také obsahuje způsob pro dodání výživy pacientovi. Způsob obsahuje podání mléka, jeho frakce nebo oligosacharidů nebo glykoproteinů pacientovi v množství dostatečném pro výživu pacienta.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1-6 se týkají způsobu využívajícího expresi homologního enzymy , (t.j. myší UDP-Gaip-D-galaktosyltransferasy) .
Obr. 1 ilustruje přípravu konstruktu pWAP-GT.
Obr. 2 ilustruje chromatografickou analýzu galaktosa-a.1-3galaktosa- β1-4 -glukosy, nového oligosacharidů produkovaného jedním ze způsobů podle předkládaného vynálezu.
Obr. 3 znázorňuje elektroforetickou analýzu glycidů za pomoci fluoroforu (FACE) galaktosa-al-3-galaktosa-pi-4-glukosy.
Obr. 4 představuje FACE analýzu myšího mléka, do kterého byla přidána galaktosa-al-3-galaktosa-3l-4-glukosa.
Obr. 5 ilustruje příklad oligosacharidového profilu negativního transgenního, pozitivního transgenního a negativního kontrolního myšího mléka, jak byl určen za použití Dionex způsobu 2. Hlavní pík eluující ve 31-32 minutě by měl být trisacharid.
Obr. 6 znázorňuje FACE analýzu vzorků použitých v příkladu 5. Konkrétně, FACE analýza byla provedena pro potvrzení toho, že nový pík detekovaný na obr. 5 byl trisacharid. Proužek, který putuje shodně s proužkem standardu tvořeného G3 Škrobovým hydrolyzátem, je skutečně trisacharid.
Obr. 7-13 se týkají způsobu využívajícího expresi heterologního enzymu (t.j. H-a-1,2-fukosyltransferasy).
Obr. 7 znázorňuje oligosacharidové profily dvou vzorků králičího mléka získané za použití aniontové iontoměničové chromatografie při vysokém pH (HPAEC). Panel A je oligosacharidový profil vzorku získaného od kontrolního, netransgenního zvířete. Tento vzorek obsahuje laktosu a pouze stopové množství 2'-fukosyllaktosy (Fucal-2Gaipi-4Glc). Panel B je profil vzorku získaného od králíka v laktaci, jehož genom obsahoval transgen kódující lidskou Η-αΙ-2-fukosyltransferasu. Tento vzorek obsahoval měřitelné množství 2'-fukosyllaktosy a obsahoval méně než 1/10 koncentrace laktosy přítomné ve vzorku mléka od netransgenního zvířete. Panel C je profil získaný ze stejného vzorku použitého pro získání profilu na Panelu B, ale po kontaminaci vzorku 20 mg/l 2'-fukosyllaktosy.
« ·
Obr. 8 znázorňuje iontové chromatografické profily dalších vzorků mléka transgenních králíků. Panel A je kontrolní mléko, panel B je transgenní vzorek č. 2, panel C je transgenní vzorek č. 3 a panel D je transgenní vzorek č. 4. Pouze vzorek č. 4 (panel C) obsahoval významné množství 2'-fukosyllaktosy (t.j. > 50 mg/1). Vzorek č. 3 (panel B) měl značně sníženou koncentraci laktosy.
Obr. 9 znázorňuje elektroforetickou analýzu glycidů za použití fluoroforu (FACE) mléčných oligosacharidů před a po trávení al-2-fukosyllaktosou z nezpracovaného a enzymem zpracovaného králičího mléka, mléka transgenního králíka a standardu. Konkrétně, dráha 1 představuje autentický 2'fukosyllaktosový standard, dráha 2 představuje nezpracovaný transgenní vzorek č. 5, dráha 3 představuje fukosidasou zpracovaný transgenní vzorek č. 5, dráha 4 představuje nezpracovaný, netransgenní kontrolní vzorek a dráha 5 představuje fukosidasou zpracovaný kontrolní vzorek. Dráha 6 představuje sadu standardů tvořených lineárními glukosovými polymery, kde G2 znamená dvě glukosové jednotky a G3 znamená tři glukosové jednotky.
Obr. 10 představuje FACE dalších vzorků od transgenních králíků. Konkrétně, dráha 1 představuje autentický 2'fukosyllaktosový standard, dráha 2 představuje nezpracovaný transgenní vzorek č. 5, dráha 3 představuje další vzorek transgenního mléka, dráha 4 představuje transgenní vzorek č. 4, dráha 5 představuje netransgenní kontrolní vzorek, dráha 6 představuje sadu standardů tvořených lineárními glukosovými polymery a dráha 7 představuje transgenní vzorek č. 3.
Obr. 11 znázorňuje Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA-1) westernovou analýzu proteinů transgenního a kontrolního králičího mléka. Dráha 1 představuje netransgenní kontrolní vzorek, dráha 2 představuje transgenní vzorek č. 1, dráha 3 představuje transgenní vzorek č. 2a dráha 4 představuje druhou netransgenní kontrolu.
Obr. 12 znázorňuje UEA-1 westernovou analýzu proteinů dalších vzorků králičího mléka. Dráha 1 představuje netransgenní kontrolní vzorek, dráha 2 představuje transgenní vzorek č. 4, dráha 3 představuje transgenní vzorek č. 3, dráha 4 představuje netransgenní kontrolní vzorek a dráha S představuje standardy molekulové hmotnosti.
Obr. 13 znázorňuje SDS elektroforetické gely barvené Coomassie modří, ve kterých byly analyzovány proteiny králičího mléka. Dráha 1 ukazuje barvené proteiny z mléka netransgenní kontroly, dráha 2 je transgenní vzorek č. 3, dráha 3 je transgenní vzorek č. 4, dráha 4 je transgenní vzorek č. 5 a dráha S představuje barvené standardy molekulové hmotnosti.
Obr. 14-16 se týkají způsobu exprese enzymu (t.j. lidské fukosyltransferasy IV) za použití heterologní laktogenně indukované transgenní exprese.
Obr. 14 představuje chromatografické profily mléčných oligosacharidových extraktů. Panel A představuje kontrolní oligosacharidý extrakt, panel B představuje oligosacharidový extrakt z transgenního mléka a panel C představuje představuje oligosacharidový extrakt z transgenního mléka zpracovaný enzymem (t.j. 3-fukosyltransferasou).
Obr. 15 znázorňuje FACE analýzu gelové elektroforesy použité k analýze fluoroforem-značených oligosacharidů. Dráha 1 je značený škrobový hydrolyzát použitý jako standard molekulové • 0 0 00 0 hmotnosti, dráha 2 je neutrální profil získaný z mléka netransgenního kontrolního zvířete, dráha 3 je skutečná 3fukosyllaktosa, dráha 4 je neutrální profil transgenního zvířete exprimujícího FucT-IV, a dráha 5 je stejný materiál jako ve dráze 4, ale po trávení fukosidasou.
Obr. 16 ilustruje FACE vybraných frakcí z oligosacharidových extraktů z kontrolního a transgenního mléka po aniontové iontoměničové chromatografií při vysokém pH. Panel A představuje vzorek transgenního mléka a panel B představuje netransgenní kontrolu. Dráha 1 gelu představuje barvivo, dráha 2 transgenní oligosacharidový extrakt (frakce eluující v 19,5 minutě), dráha 3 je transgenní oligosacharidový extrakt (frakce eluující ve 20,0 minutě), dráha 4 představuje transgenní oligosacharidový extrakt (frakce eluující ve 20,5 minutě), dráha 5 je skutečná 3-fukosyllaktosa, dráha 6 je kontrolní f
oligosacharidWyextrakt (frakce eluující ve 20,0 minutě) a dráha 7 je kontrolní oligosacharidový extrakt (frakce eluující ve
20,5 minutě) a dráha 8 představuje oligosacharidový standard.
Obr. 17 a 18 se týkají simultání transgenní exprese glykosyltransferas u myší.
Obr. 17 je chromatogram mléčného oligosacharidového profilu od kontrolního, netransgenního zvířete.
Obr. 18 je chromatogram mléka získaného od transgenního savce exprimujícího lidskou Fuc al-2-transferasu a myší Galal3-transferasu.
Obr. 19 - 21 se týkají způsobu pro transgenní expresi bakteriální glykosyltransferasy v laktujících mléčných žlázách myši.
•fl*??
*· ··· · ·«
Obr. 19 ukazuje chromátogram získaný z testu enzymové aktivity kontrolních L-buněk.
Obr. 20 a 21 ukazují oligosacharid syntetizovaný transfektovanými L buňkami exprimujícími bakteriální Nacetylglukosaminyltransterasu.
Jak bylo uvedeno výše, předmětem vynálezu je způsob pro produkci jednoho nebo více oligosacharidů a/nebo glykokonjugátů v mléku transgenních savců s výjimkou lidí za použití transgenní technologie. Jeden oligosacharid, který může být připraven způsobem podle předkládaného vynálezu (t.j. galaktosa-ccl-3-galaktosa β1-4 glukosa) , má novou strukturu a dosud nikdy nebylo popsáno, že by existoval jako volný oligosacharid. Takové transgenně produkované oligosacharidy a/nebo glykokonjugaty produkované způsobem podle předkládaného vynálezu mohou být přidány do kojeneckých přípravků nebo lékařských nutričních prostředků podávaných ve stáří nebo imunokompromitovaným pacientům. Způsoby podle předkládaného vynálezu a jejich varianty mají tu výhodu, že umožňují navržení mléčných oligosacharidových profilů transgenních zvířat.
Stručně, pro produkci vybraného mléčného oligosacharidů nebo oligosacharidů je segment DNA kódující vybraný enzym izolován z určitého eukarotického nebo prokaryotického organismu. Tento enzym je odpovědný za produkci sekundárního genového produktu nebo mléčného oligosacharidů. Po izolaci je DNA segment vložen do vektoru obsahujícího různé genetické složky, jako je například polyadenylační signál a promotor. Část vektoru obsahující vybrané složky je potom insertována do projádra embrya stejného nebo jiného savčího druhu jako je druh, od • 9 · 9 9 · «9 9
9 9 •9 9 • 9 9 9
9 9 9
9999
9 9
9 9
9 · • · f 9
9 · C>
«9 * 9 9 *· 9
9 9 •9 9 kterého byl DNA segment izolován. Embryo je potom implantováno samici a nechá se proběhnout porod. Vzorky mléka potomstva obsahují vybraný oligosacharid nebo oligosacharidy. Další generace jsou také vyšetřovány na produkci oligosacharidů nebo oligosacharidů a tak na inkorporaci genu nebo genů kódujících vybraný enzym nebo enzymy do svých genomů. Je třeba zdůraznit, že do embrya může být vložen více než jeden transgen, což vede k produkci více než jednoho oligosacharidů. Proto je potenciál předkládaného vynálezu neomezený. Každý krok způsobu podle předkládaného vynálezu je podrobně popsán dále.
Enzym
Vybraný enzym, který má být exprimován, je vybrán podle oligosacharidů nebo oligosacharidů, které mají být produkovány v mléku transgenních savců s výjimkou člověka. Enzym může být, například, glykosyltransferasa. Mezi vhodné glykosyltransferasy patří například fukosyltransferasy, jako je a-1,2fukosyltransferasa, fukosyltransferasa IV nebo H fukosa-a1,2-transferasa, galaktosyltransferasy jako je gal a-1-3transferasa, acetylasa, glukuronyltransferasa, glukosylepimerasa, sialyltransferasa, mannosyltransferasa, sulfotransferasa, β-acetylgalaktosaminyltrahsferasa nebo Nacetylglukosaminyl-transferasa. Enzymem volby je výhodně galaktosyltransferasa, nejlépe UDP-Gal-B-D-a 1,3galaktosyltransferasa, sialyltransferasa nebo al-3/4fukosyltransferasa jako je FucT-III nebo FucT-IV.
Glykosyltransferasy kódované transgeny jsou směrovány signálními sekvencemi, buď přirozenými kódovanými cDNA nebo genomovou DNA, nebo sekvencemi přidanými pomocí standardních technik genetického inženýrství. Mohou být přítomny v ·· ·· · · • · » · · · • · 9
9 9 • 9 9 • 9 9 9
9 9 9
9 9
9 9 • 9 9 9 9
9 9 9
9 9
99
9 9 9
9 9 · • 9 9 9 laktogenní buňkách transgenních zvířat a mohou být navázány na intracelulární membránové kompartmenty (například na endoplasmatické retikulum, Golgiho aparát nebo sekreční vesikuly) laktogenních buněk, nebo mohou existoval jako volné katalytické polypeptidy v lumen takových kompartměntů. Vzhledem ke vhodné intracelulární lokalizaci mají enzymy přístup k nukleotidům obsahujícím cukry nebo k jinému zdroji cukrů syntetizovanému buňkami laktující mléčné žlázy nebo získanému takovými buňkami z krve zvířete. Takovými donory cukrů jsou výhodně nukleotidy obsahující cukry.
Glykosyltransferasy mají schopnost katalyzovat přenos monosacharidových jednotek z donorového cukru na akceptor, jako je laktosa, jiné oligosacharidy, glykolipidy nebo glykoproteiny. Glykosyltransferasy mají omezenou nebo širokou specificitu jak pro donory, tak pro akceptory a mohou přenášet více než jednu monosacharidovou jednotku na vznikající nebo prodlužující se glykokonjugat. Tak mohou být opakovaným nebo neopakovaným působením glykosyltransferas syntetizovány větší oligosacharidy a/nebo polysacharidy. Glykosyltransferasy mohou být sami o sobě glykoproteiny nebo neglykosylované glykoproteiny a mohou a nemusí mít další translační a posttranslační modifikace.
Je třeba opět uvést, že oligosacharidový profil transgenního zvířete může být určen volbou jednoho nebo více vhodných enzymů, které produkují vybrané oligosacharidy a glykoproteiny.
Dále je třeba si uvědomit, že předkládaný vynález umožňuje simultání expresi dvou nebo více enzymů a tím příslušných oligosacharidů a glykoproteinů. Tak může být potenciálně vytvořen transgenní savec jiný než člověk, například kráva, který je schopen produkce mnoha oligosacharidů přítomných v • ft ftftftft • ft « ftft· ft· · • ftft · • ft · · ft lidském mateřském mléku. Tyto oligosacharidy mohou být potom přidány například do kojeneckých prostředků, čímž získají kojenecké prostředky výhody spojené s oligosacharidy v mateřském mléku. Savci, jako je kráva popsaná výše, se mohou pářit (t.j. křížit) pro získání potomstva, které je schopno produkce různých oligosacharidů ve svém mléce.
Dále předkládaný vynález také zahrnuje produkci enzymů (například glykosyltransferas) z bezobratlých. Mezi takové bezobratlé patří, například, Schistosoma mansonii nebo bakterie, jako jsou bakterie rodu Neisseriae. Tyto enzymy mohou být exprimovány v aktivní formě v savčích tkáních v průběhu laktace.
Transgenní savci s výjimkou lidí
Savec, ze kterého může být izolována cDNA kódující vybraný enzym, je vybrán ze skupiny zahrnující, například, myš, krysu, králíka, prase, kozu, ovci, koně a krávu. Nicméně, může být použit jakýkoliv savec, pod podmínkou, že má schopnost inkorporovat DNA kódující vybraný enzym do svého genomu.
Emryo, do kterého je vložena cDNA, může a nemusí odpovídat druhu, od kterého byla DNA izolována, podle toho, zda je žádoucí heterologní exprese nebo homologní exprese enzymu. Přesněji, pokud se produkuje lidský enzym, který způsobuje produkci lidského oligosacharidů v mléce transgenního savce jiného než člověka (t.j. je použita heterologní exprese enzymu), tak je transgenním savcem jiný savec než člověk, například prase nebo koza. Pokud se produkuje například kozí enzym, který způsobuje produkci alespoň jednoho oligosacharidů v kozím mléku ((t.j. je použita homologní exprese enzymu), tak je použitým transgenním savcem koza.
♦ 0 0000
• · 0 φ · 0 • * · · • φ · 0 • φ 00 • · 0 0
Φ · Φ Φ
Φ « Φ 0 • 0 0 0
Φ · 00
Při homologní expresi umožňuje předkládaný vynález syntézu oligosacharidů, které se přirozeně nevyskytují, jako je například galaktosa al-3 galaktosa β1-4 glukosa, stejně jako všech přirozených oligosacharidů. Dále předkládaný vynález umožňuje analýzu účinnosti syntézy enzymu kočovaného vybraným genem. Dále, protože je enzym přirozený pro savce (t.j. je odvozený od stejného druhu), je redukován potenciál vlastní imunitní reakce proti enzymu nebo intolerance u kojeného potomstva. Dále, protože některé enzymy (například glykosyltransferasy) se vyskytují pouze u některých druhů, je při použití dostupných genů kódujících homologní enzymy spektrum potenciálních oligosacharidů, které mohou být transgenně syntetizovány v mléku, zvětšeno.
Také je třeba s ohledem na homologní expresi uvést, že homologní glykosyltransferasa, například, může být získána a klonována ze tkání jiných než je laktující mléčná žláza. Například, myší glykosyltransferasa, které je normálně exprimována v játrech a jiných tkáních, ale která není exprimována v laktujících mléčných žlázách myši, může být exprimována během laktace pomocí působení laktogenně reaktivního promotoru. Sekunární genové produkty (t.j. oligosacharidy a glykokonjugaty) jsou potom přítomné v mléku transgenní myši. Proto je možné, jak je popsáno v příkladu 1, syntetizovat oligosacharidy, které nejsou normálně syntetizovány laktující mléčnou žlázou daného savce, stejně jako je možné transgenně exprimovat v laktující mléčné žláze glykosyltransferasy, které jsou normálně exprimovány v jiných tkáních.
Vektor ·· 0*0 0 ··· • 000
·· 0 • 0 0 ·
Entita, do které je insertována cDNA (kódující enzym), je označována jako vektor. Vektorem může být, například, bakteriální plasmid (například pBR-322). Pokud je použit bakteriální plasmid, tak by měl obsahovat alespoň jednu rekombinantní DNA sekvenci, která řídí expresi genu a syntézu proteinů, výhodně během laktace, buď cDNA nebo genového fragmentu kódujícího alespoň jednu glykosyltransferasu, a dále by měl obsahovat DNA sekvenci kódující polyadenylační místo nutné pro správné zpracování RNA. Alternativně může být vektor konstruován za použití jiných plasmidů, kosmidů, fágové DNA, virů a jiných vektorů specifických pro kvasinky, rostliny, savce a jiné vhodné hostitele.
Promotor, který reguluje expresi cDNA, genu nebo genového fragmentu kódujícího enzym a který je operativně navázán na tuto sekvenci, může být, například, laktalbuminový promotor, kaseinový promotor, promotor syrovátkového kyselého proteinu (WAP) nebo jiný laktogenní promotor.
Polyadenylačním signálem může být, například, savčí nebo virový signál, včetně například poly-a signálu SV-40T-antigenu, ovalbuminu nebo hovězího růstového hormonu (bGHpdyA).
Oligosacharidy
Oligosacharidy, které mohou být připraveny způsobem podle předkládaného vynálezu, zahrnují, například, galaktosa a-1-3galaktosa-p-l-4-glukosa, 2'-fukosyllaktosa, 3’-fukosyllaktosa, lakto-N-neo-tetraosa, lakto-N-tetraosa, například a-lakto-Ntetraosa, lakto-N-fukopentaosa I a její sialylovaný derivát, lakto-N-fukopentaosa II a její sialylovaný derivát, lakto-Nfukopentaosa III a její sialylovaný derivát, lakto-N17 ·· ···· fukopentaosa IV a její sialyj.ováný derivát, lakto-Nfukopentaosa V a její sialyiovaný derivát, lakto-N-difukopentaosa I a její sialy. i ováný derivát, lakto-N-difukopentaosa II a její sialyiovaný derivát, lakto-N-hexaosa a její fukosylovaný derivát, sialyltetrasacharid a, bača jejich fukosylované deriváty a jiné lidské a non-lidské mléčné oligosacharidy.
Galaktosa a-l-3-galaktosa-p-l-4-glukosa a al-2fukosyllaktosa jsou připraveny způsobem uvedeným v příkladech. První sloučenina představuje nový, nepopsaný sekundární genový produkt syntetizovaný transgenní technologií. Nikdy před publikováním předkládaného vynálezu nebylo popsáno, že by galaktosa a-l-3-galaktosa-p-l-4-glukosa existovala.v přírodě jako volný oligosacharid. Předpokládá se, že tento oligosacharid může být použit například jako činidlo pro indukci tolerance na Galal-3 antigen u lidí před xenotransplantací orgánů, jako je srdce, játra a ledviny, od zvířat.
Je třeba si uvědomit, že předkládaný vynález zahrnuje mléko produkované transgenními savci s výjimkou člověka, které obsahuje jeden nebo více výše uvedených oligosacharidů. Dále předkládaný vynález obsahuje frakcé mléka, stejně jako oligosacharidy a glykokonjugaty (například glykoproteiny) izolované a přečištěné z mléka. Takové frakce mohou zahrnovat, například, pevné složky mléka, delipidované mléko nebo mléko po sebrání smetany, mléko, ze kterého byla odstraněna smetana nebo lipidy, solubilní glycidovou frakci (t.j. specifické oligosacharidy buď samostatně, nebo v kombinaci s přirozenými uhlovodany produkovanými savcem) a/nebo specifické glykokonjugaty nebo skupiny glykokonjugátů. Takové frakce mohou • Φ Φ 1 • Φ φφ být získány způsoby známými odborníkům v oboru, jako je například odpařování, lyofilizace, krystalizace, ultrafiltrace, dialýza nebo chromatografie (například afinitní, aniontová iontoměničová chromatografie nebo gelová vylučovací chromatografie).
Dále obsahuje předkládaný vynález glykokonjugaty (například proteiny lidského mléka a proteiny lidského séra), které jsou modifikovány působením transgenně exprimovaného enzymu. Takové glykokonjugaty mohou být endogenně nebo transgenně exprimovány. Příklady proteinů lidského mléka (t.j. glykoproteinů), které mohou být takto modifikovány, zahrnují imunoglobuliny, lysozym, laktoferin, kappa-kasein, a-laktalbumin, β-laktalbumin, laktoperoxidasu a lipasu stimulovanou žlučovými solemi. Enzym může, například, přidávat vazebnou skupinu na glykoproteinů, které se přirozeně nevyskytuje (viz Prieto et al., Journal of Biological Chemistry 270: 29515-29519 (1995)). Proto může být glykoprotein substrátem pro enzym.
Je třeba si uvědomit, že jak homologní, tak heterologní glykoproteiny mohou být transgenně exprimovány u savce, který již exprimuje transgeny kódující glykosyltransferasy. Proto může být přímá glykosylace důsledkem působené endogenních, stejně jako transgenně exprimovaných glykosyltransferas.
Předkládaný vynález bude dále dokreslen následujícími příklady, které nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
V příkladu 1 byla použita následující činidla a přístrojové vybavení:
·· ·«·· • · · φ · · φ • 9 9 9 ·· ··
Činidla :
1) 500 mM hydroxid sodný a 200 mM hydroxid sodný, RICCA Chemical Company (Arlington, TX), prostý uhličitanů, National Institute of Standards and Technology (NIST)-traceable (Baxter Inc., McGaw Park, IL);
2) Octan sodný, ACS čistota (Sigma, St. Louis, MO);
3) kit obsahující FACE činidla (Glyko Inc., Novato, CA);
4) Milli-Q voda (Millipore, Bedford, MA); a
5) kyselina sírová, Ultrex Ultrapure čistota (Baxter).
Přístrojové vybavení:
Sušení vzorků: Všechny vzorky a standardy byly sušeny za použití Speed Vac Plus SC210A vybaveného mrazícím lapačem par RVT4104 (Savant, Farmingdale, IL).
Příklad 1: Exprese myší UDP-Gaip-D-al,3-galaktosyltransferasy (homologní exprese)
A. Příprava plasmidu a vytvoření transgenních myších embryí
Genetický konstrukt byl připraven v Edison Biotechnology Institute na Ohio University (Athens, Ohio). cDNA kódující myší UDP-Gal:β-D-Galal,3-galaktosyltransferasu byla insertována do plasmidu obsahujícího polyadenylační signál hovězího růstového hormonu (bGHpolyA) a laktogenně indukovatelný promotor myšího syrovátokového kyselého proteinu (WAP) (viz obr. 1). EcoRIBamHI fragment byl injikován mikroinjekčně do pronukleu myších embryí. Přítomnost genu byla detekována přenosem na membránu se značením. Mléko od laktujících myší bylo odebíráno a skladováno při -70 °C do přesunu do Ross Labs pro analýzu glycidů.
B. Vysokoúčinná aniontová iontoměničová chromatografická analýza oligosacharidů z A.:
•0 ·0·« ··
Myší mléčné oligosacharidové standardy byly analyzovány na
Dionex Bio-LC systému s následujícím vybavením:
Pumpa: Dionex Advanced Gradient pumpa
Detektor: Dionex Pulsed Elektrochemical Detector vybavený zlatou pracovní elektrodou a pH/refereční elektrodou
Automatický dávkovač:
Spectrophysics Refrigerated AS3500
Kolony: Způsob 1: Dionex CarboPac PA1 analytická kolona (4 x 250 mm) s předkolonou (4 x 50 mm) ;
Způsob 2: Dionex CarboPac PA1 analytické kolony (4 x 250 mm každá, zapojené sériově) s předkolonou (4 x 50 mm);
Chemická úprava:
Dionex AMMS-II Anion Micromembrane Suppresion (umístěný po detektoru, ale před sběračem frakce použitý pro neutralizaci vzorků), regenerovaný 0,15% kyselinou sírovou za použití Dionex AutoRegen přístroje a Anion Regenerate Cartrige
Sběrač frakcí:
BioRad Model 2110 (BioRad lne., Hercules, CA) .
Veškeré vybavení bylo zakoupeno od Dionex, lne. (Sunnyvale,
CA), pokud není uvedeno jinak. Byla použita následující eluens:
(A) Milli-Q voda (nebo ekvivalent); (B) 500 mM hydroxid sodný;
(C) 600 mM octan sodný ve 100 mM hydroxidu sodném; a/nebo (D) 200 mM hydroxid sodný, při průtoku 1,0 ml/min. Tabulka 1 ukazuje eluční profily pro dvě použité metody. Nastříknutý objem byl 20 μΐ.
• ♦ <
» · · 4 ·· 9 9 ···· ·· 99 • 9 4
Analýza vzorků a standardů na Dionex: Všechny vzorky a/nebo standardy byly analyzovány bez dalšího ředění.
Tabulka 1: Eluční profily Způsob 1:
| Čas (min) | %A | %B | %c | %D |
| 0, 0 | 50 | 0 | 0 | 50 |
| 12, 0 | 50 | 0 | 0 | 50 |
| 12,1 | 46 | 0 | 7 | 47 |
| 20,0 | 46 | 0 | 7 | 47 |
| 20, 1 | 45 | 0 | 10 | 45 |
| 27,0 | 45 | 0 | 10 | 45 |
| 27,1 | 25 | 0 | 50 | 25 |
| 32, 0 | 25 | 0 | 50 | 25 |
| 32, 1 | 50 | 0 | 0 | 50 |
| 59, 0 | 50 | 0 | 0 | 50 |
Způsob 2:
| Čas (min) | %A | %B | %c | %D |
| O o | 99 | 1 | 0 | 0 |
| 60, 0 | 0 | 100 | 0 | 0 |
| 60, 1 | 99 | 1 | 0 | 0 |
| 75, 0 | 99 | 1 | 0 | 0 |
A = Milli-Q voda;
B = 500 mM NaOH;
C = 600 mM NaOHAc/lOO mM NaOH; D = 200 mM NaOH.
9499 • 4
4 • 4 4
4 4 • 4 ··»·
4 ·
4 4 • 4 4 4 • 4 4 4 • 4 44
4« 49
4 4 4 • ·4 9
4 4 4
4 4 4 »4 44
Tabulka 2: Nastavení detektoru
| Integrační parametry | Způsob 1 | Způsob 2 |
| Výchozí šířka píku | 50 | 8, 0 |
| Práh píku | 0, 5 | 25 |
| pEAK AREA reject | 500 | 1000 |
| PED recorder range | 0,100 μο | 0,300 μθ |
Způsob 1: Forma vlny:
Integrace:
| Čas (s) | Potenciál (V) | Začátek (s) | Konec (s) |
| 0, 00 | 0,40 | 0, 30 | 0, 50 |
| 0, 50 | 0, 40 | ||
| 0, 51 | 0, 90 | ||
| 0, 59 | 0, 90 | ||
| 0, 60 | -0, 30 | ||
| 0, 65 | -0,30 |
Způsob 2: Forma vlny
Integrace:
| Čas (s) | Potenciál (V) | Začátek (s) | Konec (s) |
| 0, 00 | 0, 00 | 0, 20 | 0,40 |
| 0, 40 | 0, 05 | ||
| 0,41 | 0, 75 | ||
| 0, 60 | 0, 75 | ||
| 0, 61 | -0, 15 | ||
| 1, 00 | -0, 15 |
C. Elektroforesa glycidů s navázaným fluoroforem (FACE)
Vzorky a standardy pro FACE byly připraveny za použití činidel (Glyko) a návodu dodaného výrobcem. Elektroforesa byla • · · · · · • · · · · · i • β ··· ·· · • ·· * · ·· · provedena za doporučených podmínek. Obrazování gelů bylo provedeno za použití FACE Imager (Glyko).
Standard syntetické Galctl-3Gaipi-4Glc, 15 mM (7,5 μg) byl resuspendován ve 37,5 μΐ vody za vzniku 200 ppm roztoku. 4 μΐ tohoto roztoku byly ředěny 36 μΐ vody a byly analyzovány HPAEC (viz obr. 2 za použití způsobu 1) (zbylý roztok standardu byl rozdělen do 5 μΐ alikvot a byl skladován zmrazený pro další použití). Frakce (0,5 ml) byly odebírány a frakce odpovídající standardovému píku (38-44) byly odebrány a sušeny přes noc na Speed Vac při teplotě okolí. Výsledný sušený materiál byl značen během 3 hodin při 45 °C podle návodu výrobce. Vzorek byl potom resuspendován ve 14 μΐ vody a 2 μΐ (105 pmol) byly ředěny ve 2 μΐ zaváděcího pufru a byly vneseny do polyakrylamidového gelu. Elektroforesa gelu byla provedeny podle návodu výrobce. Fluorografické zobrazení gelu je uvedeno na obr. 3.
Jak je uvedeno v popisu obrázků, ukazuje obr. 5 příklad oligosacharidových profilů negativního transgenního, pozitivního transgenního a negativního kontrolního myšího mléka, jak byly analyzovány HPAEC za použití způsobu 2. Předpokládá se, že velký pík eluující v 31-32 minutě je trisacharid. Při HPAEC způsobu 1 se vytváří malý arteficiální pík, který eluuje velmi blízko trisacharidovému standardu a který je přítomen také při způsobu 2, což potvrzuje, že tento nový detekovaný pík je trisacharid. Potom byly oligosacharidové extrakty z těchto vzorků značeny a testovány FACE. 8 μΐ oligosacharidových extraktů bylo sušeno a zančeno podle návodu pro kit. Značené vzorky byly resuspendovány v 10 μΐ vody a 2 μΐ byly vneseny do gelu. Do gelu byl také vnesen dříve označený vzorek trisacharidového standardu. Zobrazení • ·· ·
tohoto gelu je uvedeno na obr. 6. Proužek migrující spolu se standardem tvořeným G3 škrobovým hydrolyzátem je trisacharid.
D. Extrakce myšího mléka
Vzorky myšího mléka, které byly uskladněny při -70 °C, byly rozmraženy při teplotě okolí. 100 μΐ bylo pipetou přeneseno do 500 μΐ Eppendorfovy centrifugační zkumavky a byla provedena centrifugace po dobu 20 minut při llOOO rpm za použití Biofuge 15 (Baxter, McGaw Park, II). Pečlivě byla odstraněna lipidová vrstva a střední vrstva byla přenesena do druhé 500 μΐ zkumavky. Do zkumavky se přidal dvojnásobný objem chladného (4 °C) ethanolu a zkumavka se promísila a umístila se alespoň na 20 minut na led. Potom se provedlo centrifugování způsobem uvedeným výše. Čirý supernatant se přenesl do třetí zkumavky a tento extrakt se sušil při střední teplotě přes noc ve SpeedVac. Proteinové pelety se také sušily a uskladnily se při -70 °C do analýzy. Sušené oligosacharidové extrakty se resuspendovaly ve 100 μΐ vody a uskladnily se při -70 °C do analýzy. Z důvodů malého množství dostupného standardu nebyl celý tento postup proveden pro standard; nicméně, u jiných oligosacharidů byla provedena tato extrakční. metoda bez významné ztráty množství (data nejsou uvedena).
Tabulka III ukazuje souhrn všech testovaných WAP/GT očíslovaných transgenních mlék. Z 23 testovaných transgenních vzorků (kde transgenní znamená pozitivní na kopie transgenu v přenosu na membránu se značením) bylo 10 zvířat (neboli 44% všech zvířat v relevantních zárodečných liniích), pozitivních na syntézu trisacharidu. (Poznámka: vzorky označené jako B6SLJ byly potomky negativní kontrolní/netransgenní myši).
• · · ·
• · ·
Tabulka III
| 18 | B6SLJ | ||||||
| 12 | B6SLJ | ||||||
| 21 | B6SLJ | ||||||
| 25 | B6SLJ | ||||||
| 4 | 8 | 1 | 19 | hemi | 3061,187 | negativní | 3 |
| 5 | 8 | 1 | 20 | hemi | 3061,187 | negativní | |
| 3 | 8 | 1 | 22 | hemi | 3061,187 | negativní | |
| β | 8 | 2 | 13 | homo | 3147,19 | negativní | |
| 11 | 8 | 2 | 23 | homo | 3061,242 | negativní | |
| 1 | 64 | 0 | 3061,11 | negativní | 2 | ||
| 13 | 82 | 1 | 71 | hemi | 3147,23 | negativní | 1-2 |
| 7 | 98 | 8 | 3147,2 | negativní | 1 | ||
| 16 | 106 | 1 | 93 | hemi | 3147,199 | negativní | 1 |
| 29 | 106 | 2 | 61 | hemi | 3147,200 | negativní | |
| 8 | 109 | 1 | 48 | hemi | 3147,21 | pozitivní | 1-2 |
| 15 | 109 | 1 | 67 | hemi | 3147,24 | pozitivní | |
| 20 | 109 | 1 | 118 | hemi | 3147,2 | negativní | |
| 22 | 109 | 2 | 50 | hemi | 3147,2 | negativní | |
| 27 | 109 | 2 | 51 | hemi | 3147,2 | pozitivní | |
| 17 | 109 | 2 | 51 | hemi | 3147,2 | pozitivní | |
| 18 | 109 | 2 | 53 | hemi | 3147,2 | pozitivní | |
| 28 | 109 | 2 | 54 | hemi | 3147,2 | pozitivní | |
| 2 | 156 | 0 | 3061,187 | pozitivní | 5 | ||
| 9 | 156 | 0 | 3061,242 | pozitivní | |||
| 10 | 156 | 1 | 42 | hemi | 3061,242 | pozitivní | |
| 23 | 156 | 1 | 100 | hemi | 3147,199 | negativní | |
| 26 | 156 | 2 | 27 | hemi | 3147,2 | pozitivní | |
| 14 | 193 | 0 | netestováno | 1 | |||
| 24 | 193 | 1 | 120 | hemi | netestováno |
• ft ····
♦ • · ft · · · • ftft · · ·
Povšimněte si v tabulce III, že vzorky mléka potomků stejného zvířete mohou, ale nemusí být pozitivní na syntézu trisacharidu; přítomnost kopie (nebo kopií) transgenu v DNA nezaručuje to, že myš bude schopna syntetizovat trisacharid (viz například výsledky pro mléko od různých potomků zvířete č. 109). Je možné, že tyto vzorky obsahovaly trisacharid; nicméně, jeho produkce byla pod detekčním limitem metody (přibližně 10 ppm) .
E. Přidání trisacharidového standardu do kontrolního myšího mléka
1852 pmol trisacharidového standardu bylo sušeno v 500 μΐ ependorfově centrifugační zkumavce. Do zkumavky se přidalo 100 μΐ kontrolního (netransgenního) myšího mléka a obsah zkumavek se důkladně promísil. Z tohoto mléka s přidaným standardem se odstranily tuky a proteiny, způsobem uvedeným výše. Získalo se 45 μΐ ethanolového extraktu, z nichž se 20 μΐ (teoreticky obsahujících 820 pmol) trisacharidu) sušilo a provedlo se značení během 3 hodin při 45 °C pro oligosacharidovou analýzu (Glyko). Po sušení se vzorek resuspendoval v 10 μΐ vody a 2 μΐ se vnesly do FACE gelu. Zobrazení gelu je uvedeno na obr. 4.
Pro srovnání bylo také analyzován kontrolní vzorek mléka bez přidaného standardu.
Všechny vzorky a/nebo standardy v C a D byly analyzovány HPAEC bez dalšího ředění.
Příklad 2: Exprese lidské cti, 2-fukosyltransf erasy v králících (heterologní exprese) • ·· ·
Vytvoření transgenních embryí bylo provedeno ve spolupráci s Dr. John Kopchick a jeho spolupracovníky na Edison Biotechnology Institute na Ohio University v Athens, Ohio, a ve spolupráci s Zdizislaw Smorage na Zootechnics Institute v Balíce, Polsko. 90% použitých králíků bylo odrůdy New Zealand a zbylých 10% bylo odrůdy California.
A. Příprava transgenních zygot
Zygoty byly odebírány od králičích samic věku 4-6 měsíců, u kterých byla vyvolána superovulace. Superovulace byla vyvolána standardními postupy za použití 50-100 i.u,. sérového gonadotropinu z březích klisen (PMSG) injikovaného intramuskulárně, po kterém následovala za 72 hodin intravenosní injekce 50-100 i.u. lidského choriového gonadotropinu (HCG). Ihned po injekci HCG byly superovulované samice spářeny nebo inseminovány čerstvým nebo zmrazeným semenem od 5-měsíčních samců. 20-22 hodin po inseminaci nebo páření byly samice utraceny a zygoty byly odebrány výplachem vejcovodu PBS. Do zygot byla mikroinjekčně vpravena DNA (t.j. lineární DNA fragment excidovaný z plasmidu popsaného dříve (Prieto et al., Journal of Biological Chemistry 49: 29515-29519 (1995)) obsahující transkripční regulační region, který obsahoval promotor myšího syrovátkového kyselého proteinu, cDNA kódující lidskou Η-αΙ-2-fukosyltransferasu a sekvenci kódující polyadenylační signál hovězího růstového hormonu) kódující 2'fukosyltransferasu v množství 2-6 ng/ml, 1-2 hodiny po výplachu, za použití invertního mikroskopu s Namarskiho optikou a mikropipet připojených na Da Venbrinovíy nebo Leitzoviy mikromanipulátory.
B. Implantace transgenních zygot a odběr mléka • · · · • · · · · ·
Jednu hodinu po mikroinjekci byly zygoty chirurgicky přeneseny do vejcovodů synchronizovaných, pseudobřezích samic věku 5-6 měsíců. Popis průběhu inseminace je uveden v tabulce
4. Mláďata byla testována na úspěšnou transkripci DNA pomocí tečkové hybridizace. Mléko od dvou takových zvířat, spolu s mlékem od netransgenních kontrol, bylo odebráno a analyzováno.
Tabulka 4: Popis průběhu inseminace
| Skupina č. | Počet inseminováných samic | Počet březích samic | Počet živě narozených králíků | Počet mrtvě narozených králíků |
| I | 8 | 7 | 26 | 1 |
| II | 4 | 4 | 16 | 8 |
| III | 20 | 16 | 67 | 17 |
| IV | 20 | 7 | k k | * * |
| Celkem | 52 | 34 | 109 | 26 |
** Informace nejsou dosud k dispozici
C. Příprava mléka získaného od potomstva
Vzorky mléka od transgenních a kontrolních králíků byly ředěny 1:3 ethanolem a byly odeslány do Ross Laboratories (Columbus, OH). Tyto vzorky byly důkladně promíseny a centrifugovány lOminut při 10000 rpm. Ethanolová vrstva byla odebrána a byla přenesena do čisté zkumavky pro oligosacharidovou analýzu a sraženiny byly zmrazený pro další analýzu proteinů.
D. Oligosacharidové profily μΐ každého ethanolového extraktu bylo ředěno 50 μΐ vody. Roztoky byly filtrovány přes předem propláchnuté 30000 MWCO ···· • ♦ · · · • · · · · • · · · · ·
filtry (Microcon, Amicon, lne., Berverly, MA) a tento materiál byl analyzován HPAEC způsobem 1 (viz příloha 1 na konci tohoto příkladu). Kontaminované vzorky kontroly a transgenních vzorků byly připraveny ředěním 50 μΐ vzorku 48 μΐ vody a 2 μΐ 1000 ppm 2'-fukosyllaktosy a filtrací, která byla provedena způsobem popsaným výše. Tyto vzorky byly také analyzovány. Druhá sada vzorků mléka byla analyzována bez dalšího ředění.
Ze zbývajících ethanolových extraktů bylo 240 μΐ sušeno ve Speed Vac (Savant, lne., Farmingdale, IL). Extrakty byly potom resuspendovány na objem pomocí 7% IPA a byly filtrovány přes Micronon 30000 MWCO filtr způsobem uvedeným výše. 20 μΐ každého vzorku ze sady jedna a 50 μΐ každého vzorku ze sady dvě bylo sušeno a značeno přes noc podle návodu výrobce (Glyko, lne., Novato, CA) . Potom byly tyto vzorky značeny přes noc podle návodu výrobce (Glyko, lne.). Značené vzorky byly resuspendovány v 10 μΐ vody. 2 μΐ každého vzorku byly vneseny na oligosacharidový gel a byla provedena elektroforesa.
F. Zpracování fukosidasou μΐ filtrovaných IPA ředění ze sady jedna bylo sušeno ve dvou zkumavkách, spolu s 2'-fukosyllaktosovými (2'-FL) alikvotami o 1000 ppm. Vzorky byly resuspendovány ve 25 μΐ lx PBS, pH 8,5. 200 mU al,2-fukosidasy z Arthrobacter oxidans (Takara-Panvera, Madison, WI) v PBS bylo přidáno do jedné zkumavky. Stejný objem převaleného /deaktivovaného) enzymu byl přidán do druhé zkumavky. Vzorky byly inkubovány při 37 °C přes noc v toluenové atmosféře. Potom byly vzorky filtrovány přes vypláchnuté Centricon 10000 MWCO filtry )Amicon) za použití 950 μΐ vody pro výplach. Filtráty byly potom zpracovány na On-Guard
9 0 00 0 •0 ····
0· ·· ·
Φ 0· ♦
0· 00 ·
0 0 9 0
00
A - kolonkách obsahujících silný aniontový iontoměnič (Dionex), které byly připraveny podle návodu výrobce. Vzorky byly vyplachovány za použití 200 μΐ vody. Získané filtráty se zmrazily, sušily a značily přes noc pro FACE analýzu (Glyko). Vzorky byly ředěny v 10 μΐ vody a 2 μΐ alikvoty tohoto materiálu se zpracovaly elektroforesou a zobrazením.
F. SDS-PAGE a westernový přenos glykoproteinů
Proteinové pelety se rozmrazily při teplotě okolí, dvakrát se promyly chladným ethanolem a sušily se. Potom se resuspendovaly ve 2x SDS denaturačním pufru. Vzorky se zahřívaly ve vroucí vodě po dobu 5 minut pro denaturaci proteinů a potom se ochladily. Za použití lx SDS pufru se připravila ředění. Vzorky a předem barvený standard o nízké molekulové hmotnosti (Sigma, St. Louis, MO) se zavedly do polyakrylamidového gelu (Novex, lne., San Diego, CA) a provedla se elektroforesa v Xcell II Mini Cell Systému (též od Novex). Takto získaný gel se přenesl na PVDF membránu a sondoval se přes noc Aglutininem I Ulex europeanus (UEA I) (značeným peroxidasou, Sigma). Po promytí TBS-Tween 20 se gel vyvíjel za použití DAB-Hydrogen Peroxide Staining roztoku (Sigma). Sušený gel se snímal a digitalizoval za použití běžného 300 dpi skeneru.
Výsledky:
Obr. 7 ukazuje chromatografické oligosacharidové profily vzorků kontrolního netransgenního, pozitivního transgenního a pozitivního transgenního králičího mléka s přidaným trisacharidem , jak byly získány z jednoho vzorku. Transgenní vzorek č. 1 obsahoval 2'-FL, což je potvrzeno profilem vzorku s přidaným trisacharidem. Povšimněte si velkého rozdílu v koncentraci laktosy mezi kontrolním a transgenním vzorkem.
·· ···· ·· ····
Druhý transgenní vzorek (č. 2), o kterém bylo zjištěno, že je negativní (neobsahuje 2'-FL), není znázorněn. V profilech uvedených na obr. 8 obsahují vzorky č. 4 (panel C) ač. 5 (panel D) 2'-FL v množství detekovatelném touto metodou. Tento vzorek vykazuje značné snížení koncentrace laktosy, zatímco vzorek č. 3 (panel B) neobsahuje žádnou detekovatelnou laktosu.
Pro další potvrzení charakteru oligosacharidů přítomných ve vzorcích mléka od transgenních zvířat byly oligosacharidy z kontrolního netransgenního a transgenního mléka podrobeny hydrolýze al-2-fukosidasou. Tento enzym výlučně hydrolyzuje 12 vazby fúkosy. Výsledky jsou uvedeny na obr. 9. Skutečná 2'fukosyllaktosa (2'-FL) je ukázána v dráze 1, zatímco nezpracované oligosacharidy z transgenního vzorku jsou ukázány v dráze 2. Dráha 3 ukazuje stejný materiál jako dráha 2, ale po zpracování fukosidasou. Proužek migrující se skutečnou 2'-FL je pozorovatelný v dráze 2. Tento proužek zmizí po zpracování fukosidasou, což dále potvrzuje přítomnost 2'-FL ve vzorku transgenního mléka. Oligosacharidy z kontrolního netransgenního vzorku byly v podstatě nezměněny po zpracování fukosidasou (viz dráhy 4 a 5) .
FACE oligosacharidové profily dalších vzorků mléka jsou uvedeny na obr. 10. Dráha 2 tohoto obrázku ukazuje analyzované značené oligosacharidy z mléka vzorku č. 5. Dráha 3 ukazuje oligosacharidy jiných vzorků transgenního mléka. Dráha 4 ukazuje oligosacharidy vzorku č. 4. Dráha 5 je profil od kontrolního netransgenního zvířete a dráha 7 je vzorek č.
3.Tyto výsledky potvrzují chromatografické profily obr. 8 a dále podporují teorii, že některé vzorky transgenního mléka postrádaly laktosu.
···· ·· 99··
9
Obr. 11 srovnává westernové analýzy vzorků mléčných proteinů č. 1 a č.2, které byly sondovány UEA-1. Pozitivní proužky jsou přítomny pouze ve dráze 2 odpovídající jednomu pozitivnímu transgennímu vzorku. Ani vzorek č. 2,ani netransgenní kontrola neobsahovaly proteiny, které jsou glykosylovány fukosou v a1,2-vazbě. Westernové analýzy pro další vzorky jsou uvedeny na obr. 12. Jak bylo očekáváno, vzorek č. 4 obsahoval proteiny, které jsou fukosylovány v a-1,2-pozici. Vzorek č. 3, nicméně, také obsahoval podobné proteiny. Tyto výsledky nebyly očekávány vzhledem k chybění detekovatelně 2'-FL, která v dalších dvou metodách nebyla přítomna. Všechny další dosud analyzované vzorky (včetně myších) obsahovaly fukosylované proteiny.
Barvení gelu Coomassie modří bylo identické jako barvení na obr. 12 a je uvedeno na obr. 13. Tento obr. ilustruje, že ačkoliv nebyl UEA-I u netransgenních kontrol detekován žádný protein, bylo ve vzorků přítomno mnoho proteinů. Naopak, srovnej celkové proteiny nalezené ve vzorcích č. 3 a č. 4 s proužky detekovanými UEA-I westernovým přenosem. Ačkoliv byly přítomny v téměř nedetekovatelných množstvích, byly silně detekovány lektinem.
Příloha I: Chromatografické podmínky
Oligosacharidová analýza za použití vysoko aniontové iontoměničové chromatografie.
Vzorky byly analyzovány za použití Dionex Bio-LC systému vybaveného pulsním elektrochemickým detektorem, za použití jedné analytické CarboPac PA-1 kolony s předkolonou. Podmínky byly následující:
Sensitivita: 0,200 C
Doba analýzy: 45 minut ·· ···· ···· • * · . · · <
·· ··
Šířka píku: 8,0 sekund Práh píku: 25,00 Plocha nehodnocených plků: 1000 Objem vzorku: 20 1
Gradientový program:
0-12 minut: 100 mM NaOH
12.1 - 20 minut: 42 mM NaOAc ve 100 mM NaOH
20.1 - 27 minut: 60 mM NaOAc ve 100 mM NaOH
27.1 32 minut: 300 mM NaOAc ve 100 mM NaOH
32.1 - 45 minut: 100 mM NaOH
PED program:
Forma vlny: Integrace:
| Čas (s) | Potenciál (V) | Začátek (s) | Konec (s) |
| 0, 00 | 0, 05 | 0,20 | 0, 40 |
| 0,40 | 0, 05 | ||
| 0, 41 | 0, 75 | ||
| 0, 60 | 0,75 | ||
| 0, 61 | -0, 15 | ||
| 1,00 | -0, 15 |
Příklad 3: Exprese lidské fukosyltransferasy IV v myších (heterologní exprese)
Lidská fukosyltransferasa (t.j. H fukosa al-2-transferasa) byla dříve exprimována v laktujících mléčných žlázách myší (Prieto et al., Journal of Biological Chemistry 270: 29515-19 (1995)) . Její exprese vedla k produkci oligosacharidů a glykoproteinů syntetizovaných enzymem. Pro dokázání potenciální širší aplikace tohoto systému pro produkci sekundárních ftft ftftftft • ft · ftftft • · · • ftft · •ft ··♦· ftft ft • ftft • · · • · · ft ftft ftft • ft ftft ft ftft · • ftft · • ftft · • ft · · • ft ft* genových produktů se vynálezci rozhodly transgenně exprimovat glykosyltransferasu jinou než lidskou H-fukosa al-2transferasu u myší. Jedním takovým enzymem je fukosyltransferasa IV (Kukosawa-Latallo et al·., Genes and Devolopment 4: 1288-1303 (1989)). Tento enzymje přítomen v některých vzorcích lidského mléka (Serenella et al., Glycoconjugate Journal 6: 101-114 (1989)) a je významný proto, že je odpovědný za syntézu některých antigenů krevních skupin (Legault et al., The Journal of Biological Chemistry 270: 20987 - 20996 a Ginsburg et al., v Immunology of Erythrocyte, Alan R. Liss, lne., New York, New York). Tyto antigeny krevních skupin jsou významné, protože jsou zvýšeny při nádorových onemocněních (Orntof et al., The Journal of Biological Chemistry 271: 3226032268 (1996)) a předpokládá se jejich účast na fenoménu buněčné adhese, například při zánětech (Lowe et al., The Journal of Biological Chemistry 266: 17467—17477)). Exprese lidského enzymu fukosyltransferasy IV a syntéza 3-fukosyllaktosy byly provedeny způsobem popsaným dále.
Byla použita následující činidla:
• 500 mM hydroxid sodný a 200 mM hydroxid sodný, RICCA Chemical Company (Arlington, TX) , bezuhličitanový;
• NIST-traceable (Baxter lne., McGaw Park, IL) ;
• Octan sodný, ACS čistota (Sigma, St. Louis, MO);
• kit obsahující FACE činidla (Glyko lne., Novato, CA);
• Milli-Q voda (Millipore, Bedford, MA); a • kyselina sírová, Ultrex Ultrapure čistota (Baxter).
Sušení vzorků: Všechny vzorky a standardy byly sušeny za použití Speed Vac Plus SC210A vybaveného mrazícím lapačem par RVT4104 (Savant, Farmingdale, IL) .
9 ··* · ♦ ··«
A. Příprava plasmidu a vytvoření transgenních myších embryí
Genetický konstrukt byl připraven v Edison Biotechnology Institute na Ohio University (Athens, Ohio). cDNA (t.j. lineární DNA fragment excidovaný z plasmidu popsaného dříve (Prieto et al., Journal of Biological Chemistry 270: 2951529519 (1995)) obsahující transkripční regulační region, který obsahoval promotor syrovátkového kyselého proteinu, cDNA kódující lidskou al-3/4-fukosyltransferasu (FucT-IV) a sekvenci kódující polyadenylační signál hovězího růstového hormonu (bGHpolyA)) kódující lidskou fukosyltransferasu (IV) byla insertována do plasmidu obsahujícího polyadenylační signál hovězího růstového hormonu (bGHpolyA) a laktogenně indukovatelný promotor myšího syrovátokového kyselého proteinu (WAP). EcoRI-BamHI fragment byl injikován mikroinjekčně do pronukleu myších embryí. Přítomnost genu byla detekována membránovým přenosem se značením. Mléko od laktujících myší bylo odebíráno a skladováno při -70 °C do přesunu do Ross Laboratories (Columbus, OH) pro analýzu glycidů. Mléko od dvou z těchto samic bylo odebráno a analyzováno.
B. HPAEC analýzy vzorků a standardů:
Myší mléčné oligosacharidy a oligosacharidové standardy byly analyzovány na Dionex Bio-LC systému s následujícím vybavením: Pumpa: Dionex Advanced Gradient pumpa
Detektor: Dionex Pulsed Elektrochemical Detector vybavený zlatou pracovní elektrodou a pH/refereční elektrodou
Automatický dávkovač:
Spectrophysics Refrigerated AS3500
Dionex CarboPac PA1 analytické kolony (4 x 250 mm každá, zapojené sériově) s předkolonou
Kolony:
-•.'-Λ’..’·,·:'· • · fefefefe · · · · · · ·· · · • · · ·· · · · · · • fefe fefefe fefefefe fefe fefefefe ······ (4 x 50 mm);
Chemická úprava:
Dionex AMMS-II Anion Micromembrane Suppresion (umístěný po detektoru, ale před sběračem frakce, použitý pro neutralizaci vzorků), regenerovaný 0,15% kyselinou sírovou za použití Dionex AutoRegen přístroje a Anion Regenerate Cartrige
Sběrač frakcí:
BioRad Model 2110 (BioRad lne., Hercules, CA).
Veškeré vybavení bylo zakoupeno od Dionex, lne. (Sunnyvale, CA), pokud není uvedeno jinak. Byla použita následující eluens: (A) Milli-Q voda (nebo ekvivalent); (B) 500. mM hydroxid sodný;
(C) 600 mM octan sodný ve 100 mM hydroxidu sodném; a/nebo (D) 200 mM hydroxid sodný, při průtoku 1,0 ml/min. Tabulka 5, dále, ukazuje eluční profily pro dvě použité metody. Injikovaný objem byl 20 μΐ.
Všechny vzorky a/nebo standardy byly analyzovány bez dalšího ředění. Někdy byla další charakterizace považována za nezbytnou. Frakce byly odebírány (0,5 min. na frakci) a sušeny ve zkumavkách použitých pro odběr. Tyto vzorky byly.potom použity pro FACE analýzu. Kdykoliv to bylo možné, byly provedeny chromatogramy pro transgenní a kontrolní zvířata. Pro předběžnou charakterizaci byly do alikvot přidány autentické standardy 3-fukosyllaktosy. Tímto způsobem byla prokázána současná eluce neooligosacharidu se skutečnou 3fukosyllaktosou.
·· 0000 00 ···· ·· 00 • « · 0 · 0 0 0 0 0 0 0 0 · 0 · · · 0 · • 0 0 0 0 · ··· ·· 0 • 0 00 «0 00 00 00
Tabulka 5: Eluční profily
A = Milli-Q voda;
B = 500 mM NaOH;
C = 600 mM NaOHAc/lOO mM NaOH; D = 200 mM NaOH
| Čas (min) | %A | %B | %c | %D |
| 0, 0 | 99 | 1 | 0 | 0 |
| 60,0 | 0 | 100 | 0 | 0 |
| 60, 1 | 99 | 1 | 0 | 0 |
| 75, 0 | 99 | 1 | 0 | 0 |
Tabulka 6: Nastavení detektoru
| Integrační parametry | Způsob 1 | Způsob 2 |
| Výchozí šířka píku | 50 | 8, 0 |
| Práh píku | 0, 5 | 25 |
| pEAK AREA reject | 500 | 1000 |
| PED recorder range | 0,100 μο | 0,300 μθ |
Způsob:
Forma vlny: Integrace:
| Čas (s) | Potenciál (V) | Začátek (s) | Konec (s) |
| 0, 00 | 0, 00 | 0,20 | 0,40 |
| 0, 40 | 0, 05 | ||
| 0, 41 | 0,75 | ||
| 0, 60 | 0, 75 | ||
| 0, 61 | -0, 15 | ||
| 1, 00 | -0, 15 |
♦ · · · • · · · · * • Φ · · · · • · · · · · · • · · · · · <
φ · ·· · ·
C. Elektroforesa glycidů s navázaným fluoroforem (FACE)
Vzorky a standardy pro FACE byly připraveny za použití činidel a návodu dodaných výrobcem (Glyko, Novalto, CA). Elektroforesa byla provedena za doporučených podmínek. Zbrazování gelů bylo provedeno za použití FACE Imager (Glyko).
Vzorky mléčných oligosacharidových extraktů (10 μΐ) byly sušeny a značeny 3 hodiny při 45 °C pro oligosacharidovou analýzu (Glyko), jak byla popsána dříve. Po sušení byly vzorky resuspendovány v 10 μΐ vody a 2 μΐ byly vneseny do polyakrylamidového gelu pro analýzu oligosacharidů. Zobrazení elektroforetogramů bylo provedeno za použití Glyko Face Imager.
D. Extrakce myšího mléka
Vzorky myšího mléka, které byly uskladněny při -70 °C, byly rozmraženy při teplotě okolí a důkladně promíseny. 50 μΐ bylo pipetou přeneseno do 500 μΐ Eppendorfovy zkumavky a přidalo se 100 μΐ chladného absolutního ethanolu. Výsledná směs se promísila a provedlo se centrifugování po dobu 15 minut při 4 °C a 11000 rpm za použití Biofuge 15 (Baxter, McGaw Park, IL). Po centrifugaci se 85 μΐ čirého supernatantu přeneslo do jiné 500 μΐ centrifugační zkumavky a přidalo se 199 μΐ destilované deionizované vody. Výsledná směs se dobře promísila a 50 μΐ se přeneslo do zkumavky automatického přístroje pro odběr vzorků, ředilo se 1:1 vodou a analyzovalo se aniontovou iontoměničovou chromatografii při vysokém pH (HPAEC). Tento konečný roztok se považoval za oligosacharidový extrakt vzorku mléka.
E. Přidání skutečné 3-fukosylaktosy do mléka φφ ·· · · · · · · · · φφφ φ · · φφφφ • · φ φ φ φ φφφ φφ φ φ · · · · ·Φ Φ φ φφ 4 φφ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ
Roztok 3-fukosyllaktosy Gaipi-4[Fucal-3]Glc ο koncentraci 50 mg/1 se přidal do 50 μΐ oligosacharidového extraktu popsaného výše a provedlo se důkladné promísení. Tento vzorek mléka obsahující skutečnou 3-fukosyllaktosu se potom přímo analyzoval chromatografií a výsledky se srovnávaly s výsledky získanými pro oligosacharidový extrakt ředěný vodou.
F. Zpracování exoglykosidasami
Fukosidasy z Corynebacterium sp (al-2 specifické) a Streptomyces sp. (al-3/4 specifické) byly získány od Takara Panvera (Madison, WI). E. coli a další použitá činidla byla maximální dostupné čistoty a pokud není uvedeno jinak, tak byly získány od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
G. Separace neutrálních a nabitých oligosacharidů
Oligosacharidové extrakty (200 μΐ alikvoty) byly separovány do neutrální a nabité frakce pro usnadnění detekce a identifikace neooligosacharidů syntetizovaných v důsledku působení transgenem kódované fukosyltransferasy.
Kolona (3 ml) DE-52 (diethylaminoethylcelulosa, Whatman, Maidstone, England) byla uvedena do rovnováhy ve 0,002 M pyridinacetatovém pufru (pH 5,4) za použití přibližně 20 objemů kolony. Alikvoty oligosacharidového extraktu byly aplikovány do kolony, nechaly se proniknout do pryskyřice a potom se ponechaly v klidu po dobu 5-10 minut. Neutrální oligosacharidý byly potom eluovány 6 objemy stejného pufru. Takto získaná frakce byla sušena a byla připravena pro značení a elektroforesu glycidů s navázaným fluoroforem. Frakce • · ·· · 9 9 9 9 · 9 9 • 99 ··· 9 9 · · • 9 9 · 9 9 999999 »9 9 9 99 9 9 99 9 «9 99 99 99 99 99 obsahující náboj byla eluována z kolony potom za použití 5 objemů kolony 0,2 M pyridinacetatového pufru.
Výsledky:
Obr. 14 ukazuje chromatogramy pro oligosacharidové extrakty kontrolních a transgenních mlék (panel A a B, v příslušném pořadí). Je jasně vidět, že pík byl získán pro mléko získané od zvířete transfektovaného fukosyltransferasou FucT-IV, zatímco v mléce od netransgenního kontrolního zvířete byl přítomen pouze stopový signál. Dále, do materiálu ukázaného na panelu B byla přidána skutečná 3-fukosyllaktosa pro stanovení toho, zda neooligosacharid přítomný v mléce transgenního zvířete byl skutečně 3-fukosyllaktosa (panel C). Eluce tohoto glycidu odpovídá nezávislé eluci skutečné 3-fukosyllaktosy, jak je znázorněna šipkou v panelu B.
Dále, oligosacharidové extrakty od kontrolních a transgenních zvířat byly separovány na neutrální oligosacharidy a sialyoligosacharidy nebo negativně nabité struktury. Toto umožnilo lepší zobrazení při analýze značených oligosacharidů gelovou elektroforesou. Obr. 15 je zobrazení gelu použitého pro rozdělení neutrálních značených oligosacharidů (dráha.1 je značený škrobový hydrolyzát použitý jako standard molekulové hmotnosti, dráha 2 je neutrální profil získaný z mléka netransgenního kontrolního zvířete, dráha 3 je skutečná 3fukosyllaktosa, dráha 4 je neutrální profil transgenního zvířete exprimujícího FucT-IV a dráha 5 je stejný materiál jako ve dráze 4, ale po specifickém trávení fukosidasou).Proužek migrující současně se skutečnou 3-fukosyllaktosoubyl jasnězřetelný pouze v profilu z transgenního vzorku a tento proužek zmizel po trávení specifickou 3-fukosidasou'. Dále, materiál nebyl citlivý na hydrolýzu al-2-fukosidasou.
(* · « 9 4 4
9 4 » 9 9 «
Pro další charakterizaci neooligosacharidu byly frakce odebírány přímo z chromatografických eluátů. Oligosacharidové extrakty byly analyzovány HPAEC, jak byla popsána výše, a eluaty byly odebírány ve frakcích. Každá frakce odpovídala 0,5 minutám eluce. Odebrané frakce jsou označeny na obr. 16, panelu A pro vzorky transgenního mléka a panelu B pro vzorky netransgenní kontroly. Tyto frakce byly značeny a aplikovány na FACE, jak je uvedeno v popisu elektroforetogramu na obr. 16.
Jak HPAEC, tak FACE ukázaly, že netransgenní zvíře má pouze stopové množství oligosacharidů migrujícího současně se skutečnou 3-fukosyllaktosou (dráha 5). Nicméně, frakce z oligosacharidového extraktu vzorku mléka získaného od transgenního zvířete obsahovala zřetelný signál migrující současně s 3-fukosyllaktosou. Toto dále podporuje teorii, že 3fukosyllaktosa je syntetizována expresí transgenu.
ú>v'č&SHC\P>
Příklad 4:iBxprese dvou transgenních fukosyltransferas pomocí křížení dvou dříve připravených myších transgenních linií
Samice stabilní genetické linie exprimující lidskou fukosyltransferasu H, řízenou laktogenním promotorem (Prieto et al., Journal of Biological Chemistry 49: 29515-29519 (1995)) se nechaly pářit s myšími samci ze stabilní transgenní linie exprimující myší Gal al-3-transferasu, též řízenou laktogenním promotorem (viz příklad 1).
Vzniklé potomstvo bylo testováno na přítomnost transgenů ve svém genomu, za použití biopsií z ocasu a sondování vhodnými hybridizačními sondami. Samice, které se zdály být pozitivní na oba transgeny, se dále pářily a nechaly se rodit v termínu. Od ·· ···· ·· ···· ·· ·· • * · · · · · · • · * · · · · · * « · · · · · · · · • · · · · · · · · · ·· ·· · · · · ·· těchto samic bylo získáno mléko, jehož glycidový profil byl stanoven aniontovou iontoměničovou chromatografií při vysokém pH (HPAEC), jak je popsána v příkladech 1 a 2.
Jak je vidět na obr. 17 a 18, hlavní signál byl pozorován v době eluce 2'-fukosyllaktosy, zatímco menší signál byl pozorován přesně v elučním čase syntetického trisacharidu Gal al-3 Gal pi-4Glc. Jsou uvedeny eluční pozice skutečných standardů.
Výše uvedené výsledky ukazují, že pro získání transgenních zvířat, které produkují mléko obsahující komplexní oligosacharidové a glykoproteinové profily je nutné začít de novo a injikovat myším embryím konstrukty kódující nové glykosyltransferasy. Křížení transgenních zvířat exprimujících různé glykosyltransferasy povede ke vzniku zvířat, které dědí transferasy od svých rodičů podle Mendeiových pravidel. Toto nakonec povede k syntéze příslušných sekundárních genových produktů.
Příklad 5: Transgenní exprese bakteriální glykosyltransferasy (t.j. UDP-GlcNAc:Gaipi-4) v laktujících mléčných žlázách myši
Byla použita GlcNAc-transferasa od Neisseria polysaccharea.
Pořadí kodonů genu kódujícího enzym bylo změněno tak, aby se upřednostnily kodony, které se běžně nacházejí v savčích genech. Pozměněný gen byl použit pro transfekci myších L buněk, které jsou běžně používány jako myší buněčná linie. Po ověření aktivity v těchto savčích buňkách je výsledná DNA kódující GlcNAc-transferasu použita pro přípravu konstruktu vhodného pro transgenní expresi v průběhu laktace u myší.
• · * · · · · • ·· » · ·« » »· ·· ·· ··
Aktivita GlcNAc transferasy byla testována testem syntézy v kapalné fázi. Myší L buňky (t.j. pelety z Petriho misek) byly resuspendovány ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku obsahujícím 1 mM CaCl2, 2 0 mM laktosy a 20 mM UDP-GlcNAc. Vzniklá směs se sonikovala po dobu 5 minut a inkubovala se přes noc při 37 °C. Vzniklá inkubační směs se potom filtrovala přes microcon (Amicon, Beverly, MA) centricon (10000 AMU limit molekulové hmotnosti) filtry a filtrát se ředil pro HPAEC analýzu.
Oligosacharidové extrakty byly připraveny způsobem popsaným v příkladu 1. Obr. 19-21 jasně ukazují, že bakteriální enzym je úspěšně exprimován v savčí tkáni.
Mléko, transgenních zvířat může obsahovat tetrasacharid lakto-N-neotetraosu (NnnT) v důsledku exprese N-acétylglukosaminyl-transferasy.
Claims (26)
1. Způsob produkce transgenního savce jiného než člověka, jehož somatické a germinální buňky obsahují alespoň jeden transgen, kde exprese uvedeného transgenů vede k produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléku uvedeného savce vyznačující se tím, že obsahuje kroky:
(a) přípravu alespoň jednoho transgenů, který obsahuje v operativní vazbě (1) alespoň jednu expresní regulační sekvenci funkční v savčích sekrečních buňkách, (2) DNA sekvenci kódující signální sekvenci funkční v savčích sekrečních buňkách, a (3) DNA sekvenci kódující enzym;
(b) vložení uvedeného alespoň jednoho transgenů do savčího embrya jiného než lidského a přenesení vzniklého embrya do samice;
(c) identifikaci alespoň jednoho samičího potomka, u které exprese uvedeného alespoň jednoho transgenů vede k produkci alespoň jednoho enzymu, který katalyzuje produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléku uvedeného savce.
2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený transgenní savec jiný než člověk je vybrán ze skupiny zahrnující myš, krysu, králíka, prase, kozu, ovci a krávu.
3. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že uvedený enzym je glykosyltransferasa.
4. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že uvedená glykosyltransferasa je vybrána ze skupiny zahrnující fukosyltransferasu, galaktosyltransferasu, acetylasu, glukuronyltransferasu, glukonylepimerasu, sialyltransferasu, φφ φφ ··♦· • φ φφφφ φ · φφφφ φ φφφ φ φ φ • · φ φ φ φ φ mannosyltransferasu, sulfotransferasu, βacetylgalaktosaminyltransferasu nebo N-acetylglukosaminyltransferasu.
5. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že uvedený oligosacharid je vybrán ze skupiny zahrnující galaktosa a-l-3-galaktosa-^-l-4-glukosu, 2'-fukosyllaktosu, 3'fukosyllaktosu, lakto-N-neo-tetraosu, lakto-N-tetraosu, laktoN-fukopentaosu, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy, lakto-N-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-Nfukopentaosy II, lakto-N-fukopentaosu III, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy III, lakto-N-fukopentaosu IV, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy IV, lakto-N-fukopentaosu V, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy V, lakto-N-difukopentaosu I, sialylovaný derivát lakto-N-di-fukopentaosy, lakto-N-di-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-N-difukopentaosy II, lakto-N-hexaosu, fukosylovaný derivát lakto-Nhexaosy, sialyltetrasacharid a, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu a, sialyltetrasacharid b, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu b, sialyltetrasacharid c nebo fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu c.
6. Transgenní savec jiný než člověk vyznačující se tím, že jeho genom obsahuje alespoň jednu DNA sekvenci kódující enzym operativně navázanou na promotor specifický pro mléčnou žlázu, kde exprese uvedené alespoň jedné DNA sekvence vede k produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléce uvedeného savce.
7. Transgenní savec jiný než člověk podle nároku 6
0 · 0 0 0 0
00 0 00 0 0900
000 00 0 0000 0 0 0 0 0 0 000 00 0 • 0*000000000
............
vyznačující se tím, že je vybrán ze skupiny zahrnující myš, krysu, králíka, prase, kozu, ovci a krávu.
8. Transgenní savec jiný než člověk podle nároku 6 vyznačující se tím, že uvedeným enzymem je glykosyltransferasa.
9. Transgenní savec jiný než člověk podle nároku 8 vyznačující se tím, že uvedená glykosyltransferasa je vybrána ze skupiny zahrnující fukosyltransferasu, galaktosyltransferasu, acetylasu, glukuronyltransferasu, glukonylepimerasu, sialyltransferasu, mannosyltransferasu, sulfotransferasu, βacetylgalaktosaminyltransferasu nebo N-acetylglukosaminyltransferasu.
10. Transgenní savec jiný než člověk podle nároku 6 vyznačující se tím, že uvedený oligosacharid je vybrán ze skupiny zahrnující galaktosa a-l-3-galaktosa^-l-4glukosu, 2'-fukosyllaktosu, 3'-fukosyllaktosu, lakto-N-neotetraosu, lakto-N-tetraosu, lakto-N-fukopentaosu, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy, lakto-N-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy II, lakto-Nfukopentaosu III, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy III, lakto-N-fukopentaosu IV, sialylovaný derivát lakto-Nfukopentaosy IV, lakto-N-fukopentaosu V, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy V, lakto-N-di-fukopentaosu I, sialylovaný derivát lakto-N-di-fukopentaosy, lakto-N-di-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-N-di-fukopentaosy II, lakto-Nhexaosu, fukosylovaný derivát lakto-N-hexaosy,
99 99 • ·· · ftft ·»*· • · · · · • · · · · • · · 9 9 · • 9 9 9 9 9 9
9999 99
9 ♦ · · • · · · · • · 9 ·
99 99 sialyltetrasacharid a, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu a, sialyltetrasacharid b, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu b, sialyltetrasacharid c nebo fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu c.
11. Způsob produkce mléka v transgenním savci jiném než člověku vyznačující se tím, že obsahuje kroky:
(a) přípravu alespoň jednoho transgenu, který obsahuje v v
operativní vazbě (1) promotor funkční v savčích sekrečních buňkách, (2) DNA sekvenci kódující enzym, kde exprese uvedeného transgenu vede k produkci oligosacharidů a glykoproteinů v mléku uvedeného savce;
(b) vložení uvedeného alespoň jednoho transgenu do transgenního savce jiného než člověka;
(c) odběr mléka od uvedeného transgenního savce, kde uvedené mléko obsahuje uvedené oligosacharidy a glykoproteiny.
12. Způsob podle nároku 11 vyznačuj ící se tím, že uvedený transgenní savec jiný než člověk je vybrán ze skupiny zahrnující myš, krysu, králíka, prase, kozu, ovci a krávu.
13. Způsob podle nároku 11 vyznačuj ící se tím,
I že uvedený enzym je glykosyltransferasa.
14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že uvedená glykosyltransferasa je vybrána ze skupiny zahrnující fukosyltransferasu, galaktosyltransferasu, acetylasu, glukuronyltransferasu, glukonylepimerasu, sialyltransferasu, mannosyltransferasu, sulfotransferasu, β0 0 0 0 0 0
00 00··
00 0 00 t 0000
900 00 0 0099
00 0000 000 0·· 0000 0000 0009
Lf# ............
acetylgalaktosaminyltransferasu nebo N-acetylglukosaminyltransferasu.
15. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že uvedený oligosacharid je vybrán ze skupiny zahrnující galaktosa a-l-3-galaktosa-p-l-4-glukosu, 2'-fukosyllaktosu, 3'fukosyllaktosu, lakto-N-neo-tetraosu, lakto-N-tetraosu, laktoN-fukopentaosu, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy, lakto-N-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-Nfukopentaosy II, lakto-N-fukopentaosu III, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy III, lakto-N-fukopentaosu IV, sialylzovaný derivát lakto-N-fukopentaosy IV, lakto-N-fukopentaosu V, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy V, lakto-N-difukopentaosu I, sialylovaný derivát lakto-N-di-fukopentaosy, lakto-N-di-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-N-difukopentaosy II, lakto-N-hexaosu, fukosylovaný derivát lakto-Nhexaosy, sialyltetrasacharid a, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu a, sialyltetrasacharid b, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu b, sialyltetrasacharid c nebo fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu c.
16. Mléko vyznačující se tím, že je produkované transgenním savcem jiným než člověkem, kde genom uvedeného transgenního savce jiného než člověka obsahuje alespoň jednu sekvenci kódující enzym, kde uvedená DNA sekvence je operativně navázána na promotor, kde exprese uvedené alespoň jedné DNA sekvence vede k produkci oligosacharidů a glykoproteinů.
17. Mléko podle nároku 16 vyznačující se tím, že
99 9999 99 9999 99 ·· • · 9 9 9 * 9 9 9 9 • · 9 999 9999 • 9 9 9 9 9 999 99 9
9999 9999 9999
W ............
uvedený transgenní savec jiný než člověk je vybrán ze skupiny zahrnující myš, krysu, králíka, prase, kozu, ovci a krávu.
18. Mléko podle nároku 17 vyznačující se tím, že uvedený enzym je glykosyltransferasa.
19. Mléko podle nároku 18 vyznačující se tím, že uvedená glykosyltransferasa je vybrána ze skupiny zahrnující fukosyltransferasu, galaktosyltransferasu, acetylasu, glukuronyltransferasu, glukonylepimerasu, sialyltransferasu, mannosyltransferasu, sulfotransferasu, βacetylgalaktosaminyltransferasu nebo N-acetylglukosaminyltransferasu.
20. Mléko podle nároku 17 vyznačující se tím, že uvedený oligosacharid je vybrán ze skupiny zahrnující galaktosa a-l-3-galaktosa-p~l-4-glukosu, 2'-fukosyllaktosu, 3'fukosyllaktosu, lakto-N-neo-tetraosu, lakto-N-tetraosu, laktoN-fukopentaosu, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy, lakto-N-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-Nfukopentaosy II, lakto-N-fukopentaosu III, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy III, lakto-N-fukopentaosu IV, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy IV, lakto-N-fukopentaosu V, sialylovaný derivát lakto-N-fukopentaosy V, lakto-N-difukopentaosu I, sialylovaný derivát lakto-N-di-fukopentaosy I, lakto-N-di-fukopentaosu II, sialylovaný derivát lakto-N-difukopentaosy II, lakto-N-hexaosu, fukosylovaný derivát lakto-Nhexaosy, sialyltetrasacharid a, fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu a, sialyltetrasacharid b, fukosylovaný • fe fefefefe •fe fefefefe • fe derivát sialyltetrasacharidu b, sialyltetrasacharid c nebo fukosylovaný derivát sialyltetrasacharidu c.
21. Frakce mléka podle nároku 18 vyznačuj ící se tím, že obsahuje alespoň jeden oligosacharid, alespoň jeden glykoprotein nebo jejich kombinaci.
22. Oligosacharid nebo glykoprotein přečištěný z mléka podle nároku 16.
23. Nutriční prostředek vyznačující se tím, že obsahuje mléko podle nároku 18, frakci podle nároku 21 nebo oligosacharid nebo glykoprotein podle nároku 22.
24. Nutriční prostředek podle nároku 23 vyznačuj ící se tím, že se jedná o kojeneckou výživu.
25. Nutriční prostředek podle nároku 24 vyznačuj ící se t í m, že kojenecká výživa je v kapalné nebo pevné formě.
26. Způsob výživy pacientů vyznačující se tím, že obsahuje podání mléka podle nároku 18, frakce podle nároku 21 nebo oligosacharidů nebo glykoproteinů podle nároku 22 pacientovi v množství dostatečném pro uvedenou výživu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2000803A CZ2000803A3 (cs) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | Transgenní savci produkující oligosacharidy ve svém mléku |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2000803A CZ2000803A3 (cs) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | Transgenní savci produkující oligosacharidy ve svém mléku |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2000803A3 true CZ2000803A3 (cs) | 2000-07-12 |
Family
ID=5469830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2000803A CZ2000803A3 (cs) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | Transgenní savci produkující oligosacharidy ve svém mléku |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2000803A3 (cs) |
-
1998
- 1998-09-04 CZ CZ2000803A patent/CZ2000803A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6204431B1 (en) | Transgenic non-human mammals expressing heterologous glycosyltransferase DNA sequences produce oligosaccharides and glycoproteins in their milk | |
| US5891698A (en) | Oligosaccharides and glycoproteins produced in milk of transgenic non-human mammals | |
| US5700671A (en) | Methods of making transgenic animals producing oligosaccharides and glycoproteins | |
| US5750176A (en) | Transgenic non-human mammal milk comprising 2'-fucosyl-lactose | |
| US5756687A (en) | Isolation of components of interest from milk | |
| US6331658B1 (en) | Genetically engineered mammals for use as organ donors | |
| MXPA96003892A (en) | Method to produce transgenic animals that produce oligosacaridos and glucoprotei | |
| US7166278B2 (en) | Modified organs and cells for xenotransplantation | |
| MXPA96003890A (en) | Milk of non-human transgenic mammals accounting 2'fucosil-lact | |
| TW201446962A (zh) | 具有修飾的糖化作用之蛋白質及其製造方法 | |
| AU2002308533A1 (en) | Modified organs and cells for xenotransplantation | |
| Meade et al. | Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals | |
| US7485769B2 (en) | Transgenic mammals | |
| CZ2000803A3 (cs) | Transgenní savci produkující oligosacharidy ve svém mléku | |
| MXPA96003893A (en) | Humanized milk |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |