CZ20004509A3 - Způsob genové terapie - Google Patents

Abstract

Popisuje se použiti polypeptidu transkripčního faktoru Egr-1 nebo jeho biologicky aktivní fragment a molekuly nukleové kyseliny kódující takové polypeptidy při výrobě léku vhodného pro ošetření ran u savce zahrnujícího člověka. Navíc se popisuje sekvence, která pravděpodobně zahrnuje důležité oblasti, které se podílejí na transkripci faktoru egr-1 u lidí a při její regulaci. Tato sekvence se může použít k navržení vhodných molekul nukleové kyseliny a vektorů, které se mohou použít při ošetření ran, stejně jako při jiné léčbě.

Description

Způsob genové terapie

Oblast techniky '

Vynález popisuje použiti metod genové terapie při hojeni ran a příbuzných stavech. Zvláště popisuje nové použití polynukleotidu, které kódují transkripční faktor časné růstové odezvy-1 (Egr-1), při léčbě ran, hojení ran a příbuzných stavech, jako je léčba kožních vředů, které vznikají při ischémii, neuropatie spojené s cukrovkou, okluzivní onemocnění periferních arterií, trombózy hlubokých žil, chronické venózní nedostatečnosti a proleženin, zmenšení pooperačních jizev spojených například s katarakty, při aplikaci kožních štěpů po popáleninách, lupénky, při zrychlení, remodelování a regeneraci tkáně, reparaci tvrdé tkáně, což jsou například kosti, reparaci měkké tkáně, jako je například šlacha, vaz, sval, pří podpoře angiogeneze, obnovení buněčné výstelky cév následující perkutánní trans-luminální koronární angíoplastice, inhibice levé ventrikulární hypertrofie srdce, modulace kalcifikace stěn cév a podpora regenerace nervů.

Dále se vynález týká inhibice fibrotických stavů, což jsou například pulmonární a jaterní fibróza a prevence plešatosti.

Vynález popisuje transkripci Egr-1 a její regulaci.

Dosavadní stav techniky

Hojení ran je široké rozmezí buněčných, molekulárních, fyziologických a biochemických jevů. Během procesu hďjení buňky migrují do místa ran, kde se pomnožují a syntetizují se komponenty extrabuněčné matrice za účelem obnovit tkáň tak, aby byla velmi podobná původní nezraněné tkáni. Tato aktivita se reguluje mediátory vybranými z buněk, které se nacházejí na okrajích ran. Jsou to například růstový faktor získaný z krevních destiček (PDGF), epidermální růstový faktor (EGF),

• · · • ♦ 9 9

9 9 9 9 • · 9

9 9 transformační růstový faktor beta (TGF) a jiné cytokiny. Pozitivní účinky těchto činidel na buňky se demonstrovaly jak in vitro tak in vivo (popisuje se v publikaci Moulin et al., J. Cell Biol. 68, 1-7, 1995) a zahrnují výhodné aplikace PDGF u krysích modelů cukrovky (popisuje se v publikaci Brown et al., J. Surg. Res. 56, 562-570, 1994).

Během posledních pěti let se ukázalo, že řada faktorů urychluje proliferaci buněk in vitro a tak podporuje hojení ran ve zvířecích modelech. Největší pozornost se věnuje TGF beta v kontextu s hojením ran, protože podporuje proliferaci, diferenciaci buněk a produkci matrice. TGF beta aplikovaná buď povrchově nebo systémově urychluje hojení kožních ran ve zvířecích modelech. (Aschcroft et al., Nátuře Medicine, 3, 1209-1215, 1997, Sporn and Roberts J. Cell Biol. 119, 10171021, 1997, Beck et al., J. Clin. Invest. 92, 2841-2849, 1993). Ukázalo se, že také PDGF podporují obnovu epitelu a cév u ischématíckých tkání a u zvířat s cukrovkou (popisuje se v publikaci Uhl et al., Lagenbecks Archiv fur ChirurgieSupplement-Kongerssband 114, 705-708, 1997 a Dirks and

Bloemers Mol. Biol. Reports 22, 1-24, 1996).

Transkripční faktor Egr-1 je potencionální regulátor 30-ti genů a má důležitou úlohu při růstu, vývoji a diferenciaci (popisuje se v publikaci Liu et al., Crit Rev. Oncogenesis 7, 101-125, 1996, Khachigian and Collins Circ. Res. 81, 457-461,

1997). Egr-1 se vyvolá při poranění vaskulárního endotelia (popisuje se například v publikaci Khachigian et al., Science, 271, 1427-1431, 1996) a cíle transkripční aktivace je řada genů, které zahrnují epidermální růstový faktor (EGF), růstový faktor A získaný z krevních destiček (PDF-A), základní fibroblastový růstový faktor (bFGF), indukce PDGF A, PDGF B, TGF beta, bFGF, aktvátor uro-plasminogenu (u-PA), tkáňový faktor a růstový faktor podobný inzulinu-2 (IGF-2).

Transkripční komplex, který zprostředkovává vyvolání vaskulárního endoteliálního faktoru (VEGF) závisí na AP2 a nikoli přímo na Egr-1 (publikace Gille et al., EMBO J. 16, 750-759, 1997) . PDGF B přímo snižuje expresi VEGF (Finkelzeller Oncogene 15, 669-676, 1997). Transkripce mRNA

VEGF se zesílila počtem faktorů, které zahrnují PDGF B, bFGF, keratinocytového růstového faktoru (KGF) , EGF, faktoru nekrotízujícího nádory alfa (TNF) a TGF betal. VEGF podporují opětnou tvorbu endotelia při poranění arterie. Data získaná v testech s králíky ukazují pasivaci stentů ovlivňující inhibici in-stentních formací neo-intimy, snížení výskytu trombotických okluzí, zrychlení obnovení endotelu u protéz a zvýšení vasomotorické aktivity (popisuje se v publikaci van Belle, E. et al., Bichem. Biophys. Res. Comm. , 235, 311-316,

1997, van Belle, E. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 29, 13711379, 1997, Asahara, T., et al., Circulation, 94, 3291-3302, 1997). V roce 1996 NIH schválil pilotní studii zkoumající, zda VEGF podporuje obnovu endotelu u lidí. Navíc se ukázalo, že HGF také podporuje obnovu endotelu následující po angioplastiku v krysím modelu poranění krční tepny (Nakamura et al., Abstract 1681, American Heart Addociation Meeting, Dallas, 1998). Ve zvířecím modelu se ukázalo, že pasivace kovových stentů řízená VEGF inhibuje tvorbu neointimy, zrychluje obnovení endotelu a zvyšuje vasomotorickou aktivitu (Asahara et al., Circulation, 94, 3291-3302).

Exprese VEGF se spojuje s hojením ran a kůže zasaženou lupénkou. V obou případech je TGF alfa a jeho ligand receptorů EGF (EGFr) pozitivně regulovány. Exprese EGF indukuje Egr-1 (popisuje se v publikaci Iwami et al., Am. J. Physiol. 270, H2100-2107, 1996, Fang et al., Calcified Tissue International

57, 450-455, 1995, J. Neuroscience Res. 36, 58-65, 1993).

Existuje důkaz, že Egr-1 může aktivovat expresi vnitrobuněčné adhezivní molekuly-1 (ICAM-1) v B lymfocytech stimulovaných forbolesterem (popisuje se v publikaci Maltzman et al., Mol.

• ·

Cell. Biol. 16, 2283-2294, 1996) a mohou aktivovat expresi TNF alfa přítomností vazebného místa Egr-1 v promotoru TNF alfa (popisuje se v publikaci Kramer et al., Biochim. Biophys. Acta 1219, 413-421, 1994) . Nakonec myši s vyřazenými geny Egr-1 jsou sterilní a vykazují nedostatečnost luteinizuj ícího hormonu (LH) (popisuje se v publikaci Lee et al., Science 273, 1219-1221, 1996), z čehož vyplývá, že promotor LH může také být cílem aktivace Egr-1.

Pronikání do kostí, mechanické namáhání a tok tekutiny v buňkách podobných osteoblastům MC3T3E1 indukuje Egr-1 (popisuje se v publikaci Dolce et al., Archs. Oral Biol. 41, 1101-1118, 1996, Ogata J. Cell Physiol. 170, 27-34, 1997) s konkominatní aktivací růstových faktorů. Ve chrupavkách a kostech vyvíjecích se myší převládá exprese Egr-1 popisuje se v publikaci McMahon et al., Development 108, 281-287) a způsobuje regulaci růstu a diferenciaci osteoblastových buněk (popisuje se v publikaci Chaudhary et al., Mol. Cell. Biochem. 156, 69-77, 1996) . Egr-1 a příbuzný „zinc finger transkripčního faktoru Wilmova nádoru 1 (WT1) se implikuje při regulaci osteoklastogeneze (popisuje se v publikaci Kukita et al., Endocrinology 138, 4384-4389, 1997) a prostacyklin E2(PGE2) a EGF se indukují pomocí Egrl (popisuje se v publikaci Fang et al., Calcífíed Tissue Intarnational 57, 450-455, 1995, Fang et al., Prostoglandind, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 54, 109-114, 1996) . Vaskulární kalcifikace se aktivně reguluje způsobem podobným tvorbě kostí zahrnující buňky a faktory známé tím, že jsou důležité při regulaci kostního metabolizmu (popisuje se v publikaci Dermer et al., Trends Cardiovsc. Med. 4, 45-49, 1994). Regulátory osteoblastogeneze a/nebo osteoklastogeneze se mohou upravit stupeň kalcifikace cév.

Hypertrofní stimuly, jako jsou hemodynamická dávka a angiotensin II se mohou použít k řízení produkce negativních

dominant Egr-1, které jsou řízeny promotorem specifickým pro myocyty a používají se při léčbě selhání .srdce.

Egr-1 je podstatný při expresi receptoru P75 nervového růstového faktoru (NGF) v Schwannových buňkách (popisuje se v publikaci Nikam et al., Mol. Cell. Neuroscience 6, 337-348, 1995) . NGF vyvolává expresi Egr-1 s průvodní aktivací růstových faktorů (popisuje se v publikaci Kendall et al., Brain Research. Molecular Brain Research. 25, 73-79, 1994, Kujubu et al., Journal of Neuroscience Research 36, 58-65, 1993) .

Zjistilo se, že aplikace polynukleotidů kódujícího transkripční faktor Egr-1 v místě rány a jeho následná exprese podporuje zrychlené hojení.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje použití molekuly nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující polypeptid transkripčního faktoru Egr-1 nebo jeho biologicky aktivní fragment při výrobě léčiva pro ošetření ran u savců, které zahrnují člověka.

Aby se předešlo omylu, termín „polynukleotid odpovídá libovolnému odkazu na molekulu nukleové kyseliny.

Vynález dále popisuje způsob léčby ran u savců, které zahrnují člověka. Tento způsob zahrnuje aplikaci savci molekulu nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující polypeptid transkripčního faktoru Egr-1 nebo jeho biologicky aktivní fragment.

Vynález dále popisuje molekulu nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující polypeptid transkripčního faktoru Egr-1 nebo jeho biologicky aktivní fragment, který je možné použít při hojení ran.

• · ·

Vynález dále popisuje farmaceutickou sloučeninu obsahující molekulu nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující Egr-1 nebo jeho biologicky aktivní fragment spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči.

Vynález dále popisuje terapeutické použití polynukleotidů kódujících transkripční faktor Egr-1 při léčbě ran. Vynález dále popisuje terapeutické použití samotného transkripčního faktoru Egr-1 při léčbě ran, jak se popisuje dále v textu.

«

Vynález dále popisuje použití polypeptidů Egr-1 a sekvencí t nukleových kyselin kódujících Egr-1 libovolného původu nebo druhu. Proteinové sekvence jsou mezi druhy vysoce konzervativní. U krysy a myši se sekvence vykazují například 98 % homologii. Je známa sekvence DNA myšího Egr-1 (popisuje se v publikaci Cell, 53, 37-43, (1998)). Dedukovaná aminokyselinová sekvence vykazuje dlouhý otevřený čtecí rámec s stop kodonem (TAA) v poloze 1858). Dedukovaná aminokyselinová sekvence předpokládá polypeptid zahrnující 533 aminokyselin s molekulovou hmotností 56 596. Odpovídající sekvence z každého druhu se mohou získat způsoby, které jsou známy v oboru, například testováním genomové knihovny nebo knihovny cDNA, kdy se jako sondy použijí oligonukleotidové sekvence založené nebo odvozené ze sekvence myšího Egr-1. Je známo, že cDNA lidského Egr-1 se popisuje v publikaci Nucleic Acids Research 18 p4283, 1990. Podobnost mezi myší a lidskou . sekvencí je 87 % a 94 % na úrovní nukleosidů respektive proteinů.

Reference na zde popsané polypeptidy Egr-1 a polynukleotidy je možné obecně aplikovat na sekvence libovolného původu, které zahrnují myší DNA Egr-1 a odpovídající aminokyselinové sekvence, jak se popisuje v publikaci Cell, 53, 37-43 (1988) a lidské sekvence uvedené v publikaci Nucleic Acids Research 18, p4283, 1990 a sekvence • · • · · · • · · · · · • · · ·* ·

z jiných druhů. Jak se popisuje shora v textu termin Egr-1 také zahrnuje varianty, fragmenty a analogy Egr-1. Nejvíce se preferuje použití lidské sekvence.

Termín „léčba ran zahrnuje léčbu stavů spojených s poraněním, hojení ran a příbuzné stavy a terapii, která podporuje, zvyšuje nebo urychluje hojení tkáně a zahrnuje léčbu vředů vytvořených ve spojení s cukrovkou a okluzivní onemocnění periferních arterií, pooperačních jizev, popálenin, lupénky, urychlení remodelování tkáně a korekce kostí a podpora angiogeneze, opětovná tvorba endotelu následující po perkutánní trans-luminární koronární angioplastice, inhibice levé ventrikulární kardiální hypertrofie, úprava kalcifikace stěn cév a podpora neurogenerace. Dále tento termín zahrnuje inhibici fibrotických stavů, jako jsou například pulmonární a jaterní fibróza a prevence alopecie.

Termín „biologicky aktivní fragment Egr-1 znamená fragment, který vykazuje aktivitu Egr-1 zahrnující vlastnosti hojení ran podle vynálezu.

Termín „genetické elementy znamená polynukleotidy obsahující oblast, která kóduje polypeptid nebo oblast polynukleotidu, která reguluje replikaci, transkripci nebo translaci nebo jiné procesy, které jsou důležité pro expresi polypeptidů v hostitelské buňce, nebo polynukleotid obsahující obě oblasti kódující polypeptid a operativně připojenou oblast, která reguluje expresi. Genetické elementy mohou být obsaženy ve vektoru, který se replikuje jako epizomální element. To znamená, že existuje jako molekula fyzicky nezávislá na genomu hostitelské buňky. Tyto molekuly mohou být obsažené v plazmidech. Genetické elementy se mohou také vyskytovat v genomu hostitelské buňky, nikoliv v jejím přirozeném stádiu. Pak následuje manipulace jako je izolace,

	8	• 00 · 0 · • * · · · 0 · • · · · 0 0 · • ··· 0 0 · ·0·· • · · 0 0 ··· ·· «« i	• · · * · 0 0 • 0 0 0 0 0 0 •»0 • 0 0 0 0
klonování a	zavedení do hostitelské	buňky ve formě	čištěné DNA
nebo ve vektoru.
Termín	„hostitelská	buňka	je buňka,	která se

transformovala nebo transfekovala nebo je schopná transformace nebo transfekce exogenní polynukleotidovou sekvencí.

Termín „shoda je vztah mezi dvěmi a více polypeptidovými sekvencemi nebo dvěmi a více polynukleotidovými sekvencemi, jak se definuje porovnáním sekvenci. Tento termín také znamená stupeň příbuznosti sekvence mezi polypeptidovými nebo ř polynukleotidovými sekvencemi, jako příklad se může uvést párování mezi pruhy takových sekvenci. Shodu je možné jednoduše vypočítat (popisuje se v publikaci Computational

Molecular Biology, Lesk, A.M. ed., Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academie Press, New York, 1993, Computer Analysis of Sequence Data, Partl, Griffín, A.M. a Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994, Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. Academie Press, 1987, and Sequence Analysis Priemr, Gribskov, M. and Devereux, J. eds., M. Stockton Press, New York, 1991). Zatím co zde existuje řada metod, které stanovují míru shody mezi dvěmi polynukleotidovými nebo polypeptidovými sekvencemi, tento termín je vemi dobře znám v oboru (popisuje se v publikaci Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academie Press, 1987, Sequence Analysis Primer, gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, new York, 1991 a Carillo, H., nad Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Metody běžně používané pro stanovení shody mezi sekvencemi zahrnují, ale nejsou omezeny na ty popsané v publikaci Carillo, H., and Lipman, D., Siam J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Preferované metody stanovení shody se navrhly tak, aby daly vzniku maximálního počtu párů mezi testovanými sekvencemi. Metody pro stanovení shody se « * • · • · · ·

kodifikují počítačovým programem. Preferované počítačové metody vhodné pro stanovení shody mezi dvěmi sekvencemi zahrnují, ale nejsou omezeny na program GCG (popisuje se v publikaci Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTIN a FASTA (Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403 (1990)).

Termín „izolovaná znamená změněná „člověkem ze svého přirozeného stádia. To znamená, že jestliže se objevuje v přírodě, odstraní se ze svého přirozeného prostředí nebo se její přirozené prostředí změní nebo obojí. Například přirozeně se vyskytující polynukleotid nebo polypeptid, který se vyzkytuje v živém organizmu ve svém přirozeném stádiu se nepovažuje za „izolovaný, ale stejný polynukleotid nebo polypeptid separovaný z existujícího materiálu jeho přirozeného stádia se nazývá izolovaný. Jako součást procesu izolace nebo po izolaci se takové polynukelotidy mohou spojit s jinými polynukleotidy, jako je DNA, za účelem mutageneze, za vzniku fúzního proteinu a za účelem propagace nebo exprese v hostiteli. Izolované polynukleotidy samotné nebo spojené s jinými polynukleotidovými sekvencemi , například ve formě vektorů, se mohou zavést do hostitelských buněk, do kultury buněk nebo do celých organizmů. Jestliže se DNA zavede do hostitelské buňky v kultuře nebo v celém organizmu, pak taková DNA bude stále izolovaná, protože se nevyskytuje ve svém přirozené formě nebo ve svém přirozeném prostředí. Zůstává izolovanými polynukleotidy nebo polypeptidy ve zde vysvětleném významu.

Termín „polynukleotidy v obecném případě znamená libovolný polyribonukleotid nebo polydeoxyribonukleotid, který může představovat neupravenou RNA nebo DNA nebo upravenou RNA nebo cDNA. Tak například mezi polynukleotidy patří mezi jinými jednořetšzcová a dvouřetězcová DNA, DNA, která je směsí jednořetězcových a dvouřetězcových oblastí nebo • · φ φφφφ · · · · • · · φ Β · ·· · ·· · Φ ♦ jednořetězcových, dvouřetězcových a třířetězcových oblastí, jednořetězcové a dvouřetězcové RNA a RNA, která je směs jednořetězcových a dvouřetězcových oblastí, hybridní molekuly obsahující DNA a RNA, které mohou být jednořetězcové, typicky dvouřetězcové a třířetězcové nebo se mohou vyskytovat ve formě směsi jednořetězcových a dvouřetězcových oblastí. Navíc polynukletid zde znamená třířetězcové oblasti obsahující RNA a DNA nebo jak DNA tak RNA. Řetězce takových oblastí mohou pocházet ze stejné molekuly nebo z různých molekul. Oblasti mohou zahrnovat všechny molekuly, ale v typickém případě zahrnují pouze oblast některé z molekul. Jedna z molekul trojšroubovice oblasti je často oligonukleotid. Termín polynukleotid zahrnuje DNA nebo RNA, jak se popisuje shora v textu, která obsahuje jednu nebo více upravených baží. DNA nebo RNA s kostrou upravenou tak, aby byla více stabilní, nebo splňovala jiné účely, jsou „polynukleotidy ve smyslu zde uvedeného termínu. DNA nebo RNA obsahující neobvyklé báze, jako je inozin nebo upravené báze, jako je tritylované báze, jsou polynukleotidy ve smyslu zde uvedeného termínu. Je výhodné, aby se provedlo velké množství úprav DNA a RNA, které pak mohou sloužit pro mnoho různých účelů, které jsou dobře známy v oboru. Termín „polynukleotid znamená chemicky, enzymaticky nebo metabolicky upravené formy polynukleotidů, stejně jako chemické formy DNA nebo RNA charakteristických virů a buněk, které zahrnují jednotlivé buňky nebo jejich komplexy. Polynukleotidy znamenají krátké polynukleotidy, které se zde označují jako oligonukleotidy.

Termín „polypeptidy zahrnuje všechny polypeptidy, jak se popisuje dále v textu. Základní struktura polypeptidů je dobře známa a popisuje se v mnoha učebnicích a v jiných publikacích. Zde používaný termín znamená libovolný peptid nebo protein obsahující dvě nebo více aminokyselin vzájemně spojených do lineárního řetězce peptidovými vazbami. Tento termín zahrnuje krátké řetězce, které se běžně v oboru nazývají peptidy, ··· oligopeptidy a oligoméry a delší řetězce, které se v obecném případě nazývají proteiny, kterých existuje mnoho druhů. Je vhodné, aby polypeptidy obsahovaly aminokyseliny jiné než 20 přirozeně se vyskytujících aminokyselin. Tyto aminokyseliny zahrnující terminální aminokyseliny se mohou v daném polypeptidu upravovat buď přirozenými procesy, jako je posttranslační úpravy, ale také metodami chemické modifikace, které jsou dobře známy v oboru. Dokonce běžných modifikací, které se vyskytují přirozeně v modifikacích, je tolik, že jejich seznam zde nemůže být uveden. Tyto modifikace se však velmi jasně popisují v základních učebnicích a ve větších detailech v monografiích stejně jako ve vědecké literatuře a jsou dobře známy v oboru.

Mezi známé modifikace polypeptidů je možné zařadit několik ilustrativních příkladů. Je to acetylace, acylace, ADPríbosylace, amidace, kovalentní připojení flavinu, kovalentní připojení hemočásti, kovalentní připojení nukleotidu nebo nukleotidového derivátu, kovalentní připojení lipidu nebo lipidového derivátu, kovalentní připojení fosfotídylinositolu, síťování, vytvoření cyklu, vytvoření disulfidové vazby, demetylace, vytvoření kovalentního zesítění, vytvoření cystinu, vytvoření proglutamátu, formylace, gamma-karboxylace, glykosylace, vytvoření kotvy GPI, hydroxylace, jodizace, methylace, myristoylace, oxidace, proteolytické zpracování, fosforylace, prenylace, racemizace, selenoylazice, sulfatace, přenos RNA zprostředkovaný adicí aminokyselin na proteiny, jako je arginylace a ubikvitinace. Takové modifikace jsou dobře známy v oboru a popisují se v odborné literatuře. Několik zvláště běžných modifikací, glykosylace, připojení lipidu, sulfatace, gamma-karboxylace zbytků glutamové kyseliny a ADP-ribosylace se popisují například v publikaci Proteinsstructure and molecular properties, 2^nd Ed., T.E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993). V publikaci Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and • · • · · • ·· ·«

Prospects, pgs. 1-12 v Postranslational covalent modification of proteins, B.C. Johnson, (1983), Seifter et al., Math, Ratten et al., Protein

Ed., Academie Press, New york Enzymol. 182: 626-646 (1990) a

Synthesis: Posttrantlational modifications and aging, Ann. N.Y. Aca. Sci. 663: 48-62 (1992). Je vhodné, aby polypeptidy byly vždy celé lineární.

Polypeptidy mohou být v obecném případě výsledky posttranslačního zpracování, zahrnující přirozené zpracování nebo manipulaci člověkem, ke které přirozeně nedochází. Cyklické, větvené a větvené cyklické polypeptidy se mohou syntetizovat netranslačním přirozeným procesem a zcela syntetickým procesem. Modifikace se mohou vyskytovat na libovolném místě polypeptidu, zahrnujíce peptidovou kostru, aminokyselinový božní řetězec a N- nebo C-konec. Ve skutečnosti blokování aminoskupiny nebo karboxylové skupiny v polypeptidu nebo zablokování obou uvedených skupin kovalentní modifikací je běžné v přirozeně se vyskytujících a syntetických polypeptidech a takové modifikace se mohou vyskytovat v polypeptidech podle vynálezu. Například zbytek N-konce polypeptidů připravených v E. coli nebo v jiných buňkách dříve než dojde k proteolytickému zpracování bude skoro bez výjimky N-formylmethionin. Během post-translační modifikace peptidů, se může deletovat methioninový zbytek na NH2~konci. Vynález předpokládá použití variant proteinu podle vynálezu, které na konci obsahují nebo neobsahují methionin. Modifikace polypeptidu často fungují tak, jak se provedly. V případě polypeptidů připravených expresí klonovaného genu v hostiteli, podstata a rozsah modifikací bude s velké části stanovena post-translační modifikační kapacitou hostitelské buňky a modifikačními signály přítomnými v aminokyselinové sekvenci polypeptidu. Například, jak je známo, ke glykosylaci často nedochází v bakteriálních hostitelích, jako je například E. coli. V případě, že je nutná glykosylace, polypeptid se může exprimovat v hostiteli, kde glykosylace probíhá, v obecném • · • · · • «··· modifikacích přítomen ve se popisuji se liší případě v eukaryontní buňce. Hmyzích buňkách částo dochází k post-translační gykosylaci, jako savčí buňky a z toho důvodu se vyvinuly expresívní systémy hmyzích buněk, aby mohly účinně exprimovat savčí proteiny, které mají přirozený paterny glykosylace. Podobné uvažování se může zvažovat i při jiných Je vhodné, aby stejný typ modifikace byl stejném nebo v kolísavém stupni na několika místech v daném polypeptidů. Daný polypeptid může obsahovat různé typy úprav. V obecném případě termín polypeptid zahrnuje všechny takové modifikace, zvláště ty, které jsou přítomny v polypeptidech. syntetizovaných rekombinantně expresí polynukleotidu v hostitelské buňce.

Termín „varianty polynukleotidu nebo polypeptidů zahrnuje polynukleotidy nebo polypeptidy, které se liší od referenčního polynukletidu nebo polypeptidů. Takové varianty dále v textu. (1) Polynukleotid, který svou nukleotidovou sekvencí od jiných se nazývá referenční polynukleotid. V obecném případě se rozdíly omezují tak, že referenční nukleotidová sekvence a varianta jsou si podobné a mnoho oblastí je stejných. Jak se uvádí dále v textu, změny v nukleotidové sekvenci variant jsou tiché. To znamená, že nemění aminokyseliny kódované polynukleotidem. V případě, že změny jsou omezeny na tiché změny tohoto typu varianta polynukleotidu kóduje polypeptid se stejnou aminokyselinovou sekvencí, jako referenční polynukleotid. Jak se také popisuje dále v textu změny v nukleotidové sekvenci mohpu změnit aminokyselinovou sekvenci polypeptidů kódovaného referenčním polynukleotidem. Takové změny nukleotidů mohou vést k substitucím, adicím, delecím, fúzím a zkrácení aminokyselin v polypeptidů kódovaném referenční sekvencí, jak se popisuje 2) Polypeptid, který se liší aminokyselinovou jiného se nazývá, referenčního polypeptidů.

V obecném případě rozdíly se omezují tak, že referenční sekvence a varianta jsou podobné a v mnoha oblastech shodné.

dále v textu, sekvencí od • · • flflfl fl · · • fl · • flfl fl · • flfl flfl fl · • fl • fl • fl ·

Varianta a referenční polypeptid se může lišit aminokyselinovou sekvencí jednou nebo více substitucí, adic, delecí, fúzí a zkrácení, které se mohou také vyskytovat v libovolné kombinaci.

Termín „léčba/terapie zahrnuje režim, který je výhodný pro člověka nebo zvíře. Léčba může probíhat s ohledem na existující podmínky nebo může být profylaktickou léčbou (preventivní léčba).

Termín „obsahující zahrnuje vše vykazující specifikovaný znak/charakteristiku, ale také cokoliv má jeden nebo více dalších znaků/charakteristik. Tak v případě sekvence nukleové kyseliny/proteinu obsahující danou sekvenci je samotná sekvence pokryta delší sekvencí.

Termín „homolog zahrnuje libovolnou variantu specifikované biologické molekuly, která vykazuje jednu nebo více biologických aktivit molekuly.

Vynález popisuje terapeutické použití molekul nukleových kyselin obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid Egr-1. Vynález také popisuje terapeutické použití fragmentů uvedené polynukleotidové sekvence, která kóduje biologicky aktivní fragmenty Egr-1 nebo varianty polynukleotidové sekvence, které následkem genetického kódu kódují funkční to znamená biologicky aktivní fragmenty Egr-1 a funkčně ekvivalentní alelické varianty a příbuzné sekvence upravené adicí, substitucí a/nebo delecí jediné nebo více bází, které kódují polypeptidy mající aktivitu Egr-1.

Tyto polypeptidy je možné standardním postupem klonování, který je dobře znám v oboru.

Polynukleotidy kódující transkripční faktor Egr-1 se mohou vyskytovat ve formě DNA, cDNA nebo RNA tak, že mRNA se získá • · ··· ·

klonováním nebo se produkuje způsobem chemické syntézy. DNA je jednořetězcová nebo dvouřetězcová. Jednořetězcová DNA může být kódující nebo antikódující DNA-řetězec nebo to může být nekódující nebo kódující DNA-řetězec. V případě terapeutického použití je polynukleotid ve formě schopné exprimovat funkční transkripční faktor Egr-1 v místě rány léčeného jedince. Polynukleotidy se mohou také používat při in vitro produkci polypeptidu Egr-1 vhodného pro další terapeutickou aplikaci, jak se popisuje dále v textu.

Polynukleotidy podle vynálezu, které kódují polypeptid transkripčního faktoru Egr-1, mohou zahrnovat, ale nejsou omezeny na kódující sekvenci polypeptidu Egr-1 nebo jeho biologicky aktivních fragmentů. Polynukleotid se může připravit spolu s dalšími kódujícími sekvencemi, které zahrnují například nekódující sekvence 5'a 3', jako jsou přepisované nepřekládané sekvence, které se účastní transkripce (zahrnující například terminační signály), navázání na ribozóm, elementy stability mRNA a další kódující sekvence, které kódují další aminokyseliny, jako jsou ty, které vykazují další funkce. Polynukleotidy podle vynálezu také zahrnují, ale nejsou omezeny na polynukleotidy obsahující strukturální gen Egr-1 a jeho přirozeně spojené genetické elementy.

Termín „polynukleotid kódující polypeptid popisuje polynukleotidy, které zahrnují sekvenci kódující polypeptid transkripčního faktoru Egr-1. Termín popisuje polynukleotidy, které zahrnují jedinou kontinuální oblast nebo nekontinuální oblasti kódující polypeptid (například přerušené začleněným fágem nebo začleněnou sekvencí) spolu s dalšími oblastmi, které také mohou obsahovat kódující a/nebo nekódující sekvence.

Vynález dále popisuje varianty shora popsaných polynukleotidů, které kódují fragmenty, analogy a deriváty ·· · · ··» * · ·* • ♦ » ««·« *« « < · ··· · · « ···· · « · ·

Ιο · ··»» · · · ·· · · · ·· · ·9 «·· polypeptidu. Varianta polynukleotidu může zahrnout přirozeně se vyskytující variantu nebo to může být varianta, která se nevyskytuje přirozeně. Takové nepřirozeně se vyskytující varianty polynukleotidu mohou být vyrobeny metodami mutageneze, které zahrnují ty metody, které se aplikují na polynukleotidy, buňky a organizmy.

Mezi tyto varianty patří varianty , které se liší od dříve zmiňovaných polynukleotidů substitucí, delecí nebo adicí nukleotidů. Substituce, delece nebo adice mohou zahrnovat jeden nebo více nukleotidů. Varianty se mohou měnit v kódující nebo nekódujících oblastech nebo v obou případech. Změny v kódujících oblastech mohou produkovat konzervativní nebo nekonzervativní aminokyselinové substituce, delece nebo adice.

Dále preferovaným provedením vynálezu jsou polynukleotidy, které vykazují alespoň 70 % shodu po celé délce polynukleotidu kódujícího polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v publikaci Cell 53 37-43 (1988) (myší sekvence), více se upřednostňuje alespoň 70 % shoda po celé délce polynukleotidu kódujícího sekvenci lidské cDNA a jejích komplementárních polynukleotidů (lidská sekvence) (popisuje se v publikaci Nucleic Acids Research 18 4283, 1990 a polynukleotidy, které jsou komplementární s takovými polynukleotidy. V jiném případě nejvíce preferované jsou polynuleotidy, které obsahují oblast, která vykazuje alespoň 80 % shodu po celé délce polynukleotidu kódujícího polypeptid podle vynálezu. Co se týče polynukleotidů preferuje se alespoň 90 % shoda po celé délce.

Preferují se polynukleotidy, které kódují polypeptidy, které si uchovávají v podstatě stejnou biologickou funkci nebo aktivitu, jako zralý polypeptid Egr-1 kódovaný sekvencí myší DNA (popisuje se v publikaci Cell 53, 37-43 (1988). Více se preferuje, jestliže polypeptid je kódovaný lidskou sekvencí popsanou v publikaci Nucleic Acids Research 18, 4283, 1990.

• 99 · ♦ · · • 99· • ♦

999 ··

9 9 • · · ·

9 9999

9 ·

9« ·

Vynález dále popisuje polynukleotidy shora popsanými sekvencemi. Vynález polynukleotidy, které hybridizují shora popsanými polynukleotidy.

znamená, že k hybridizaci dojde, alespoň 95 % a přednostně 97 sekvence, které hybridizují podle vynálezu, kódovaly biologickou aktivitu Egr-1.

hybridizující se dále popisuje za přísných podmínek se Termín „přísné podmínky jestliže sekvence vykazují i shodu. Je výhodné, aby uvedeným způsobem se sekvencí polypeptid, který vakazuje

Polynukleotidy mohou kódovat polypeptid, kterým je zralý protein plus další aminokyseliny N- a C-konce. Takové další sekvence se mohou podílet například na prodlužování nebo zkracování poločasu rozpadu proteinu a umožňují manipulaci proteinu vhodného pro test nebo produkci. V obecném případě in vivo další aminokyseliny se mohou získat ze zralého proteinu pomocí buněčných enzymů.

Polynukleotidy vhodné pro použití v genové terapii podle vynálezu se mohou připravit samotné nebo jako součást vektoru, jako expresívní vektor, které jsou známy v oboru.

Polynukleotid kódující Egr-1 se může použít terapeuticky při metodě podle vynálezu způsobem genové terapie, při kterém se polynukleotid aplikuje do rány nebo do jiných tkání, které je nutno léčit, ve formě, která je schopna řídit produkci Egr1 nebo jeho biologicky aktivního fragmentu in šitu. Věří se, že Egr-1 podporuje hojení ran aktivací genů, které se podílejí na hojení ran, jako jsou geny kódující VEGF, PDGF, EGF, TGF beta, základní růstový faktor fibroblastů, UPA a tkáňový faktor.

Při genové terapii se přednostně polynukleotid exprimující se v jedinci aplikuje tak, že se aplikuje ve formě rekombinantní molekuly DNA obsahující polynukleotid kódující

·* ♦ • A A • · · A • · AAAA • · · ·· ·

Egr-1 operativně spojený se sekvencí nukleové kyseliny, která řídí expresi, jako je například exprese vektoru. Takový vektor pak bude zahrnovat vhodné transkripční řídící signály, které zahrnují oblast promotoru schopného exprimovat kódující oblast, přičemž uvedený promotor je operativně spojen s léčeným subjektem. V případě genové terapie aplikované u lidí termín nezahrnuje pouze sekvenci nezbytnou pro řízení polymerázy RNA do místa počátku transkripce, ale také, jestliže je to vhodné operační a řídící sekvence, které zahrnují zesilovač, lidskou promotorovou sekvenci z lidského genu nebo z genu, který se v typickém případě exprimuje u lidí, jako je promotor z lidského cytomegaloviru (CMV) . Mezi známé vhodné eukaryontní promotory patří středně časný promotor, promotor tymidinové kinázy HSV, časný a pozdní promotor SV40, promotory retrovirové LTR, takové jako jsou virus Rousova sarkomu (RSV) a metalothioneinový promotor, jako je myší metalothioneinový promotor I.

Jak se diskutuje dále v textu může se použít přirozený promotor Egr-1. Zjistilo se, že publikovaná sekvence uvedená v případě lidského promotoru Egr-1 není správná a publikovala se nová sekvence s různými rozdíly ve srovnání s uvedenou publikovanou sekvencí.

Polynukleotidové sekvence a sekvence řídící transkripci se může klonovat do replikovatelného plazmidového vektoru, založeného na běžně dostupných plazmidech, jako je pBR322 nebo se mohou konstruovat z dostupných plazmidů dobře známým publikovaným postupem.

Vektor může také zahrnovat signály řídící transkripci, umístěné na polyadenylační rozeznatelné.

3' konci sekvence signály, které kódující Egr-1 jsou v léčeném

Jako jsou například odpovídající a také subjektu sekvence z virů. V případě léčby člověka se může použít například virus • · · • · · · • ···· · 9 • · « 49 ·

SV40. V oboru jsou dále dobře známy další sekvence řídící transkripci a tyto sekvence se mohou také použít.

Expresívní vektory mohou také zahrnovat selektovatelné markéry, jako je rezistence na antibiotika, které umožňují propagaci vektorů.

Expresívní vektory schopné in šitu syntetizovat Egr-1 se mohou zavést do místa poranění přímo fyzikálními metodami. Příklady tohoto postupu zahrnují povrchovou aplikaci obnažené nukleové kyseliny vektoru ve vhodném prostředku například v roztoku ve farmaceuticky přijatelném ekcipientu, jako je fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem nebo aplikace vektoru fyzikálními metodami, jako je bombardování částicemi, jak se popisuje v patentu US-537 1015, kdy inertní částice, jako jsou zlaté částice potažené vektorem jsou dostatečně urychleny, aby prošly povrchem v místě poranění například buňky kůže pomocí vystřelení ze zařízení za vysokého tlaku, (vynález také popisuje částice potažené molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu a zařízení obsahující takové částice).

Další fyzikální metody aplikace DNA přímo do recipientu zahrnují ultrazvuk, elektrickou stimulaci, elektroporaci a mikrovýsev.

Zvláště se preferuje zavedení mikrovýsevem, což je systém pro zavedení genetického materiálu do buněk pacienta. Způsob se popisuje v US patentu č. 5,697,901.

Sekvence nukleové kyseliny kódující Egr-1 vhodné pro použití při terapii podle vynálezu se také může zavést pomocí zavedení vektorů. Tyto vektory zahrnují virové vektory, jako je adenovirové nebo retrovirové zaváděcí vektory, které jsou dobře známé v oboru.

• · • · «

·«····« · * · 9 9

Jiné nevirové zaváděcí vektory zahrnují lipidové zaváděcí vektory zahrnující lipidové zavádězí vehikly, které jsou dobře známy v oboru.

Sekvence nukleové kyseliny kódující Egr-1 se mohou také aplikovat na místo poranění pomocí transformovaných hostitelských buněk. Takové buňky zahrnují buňky získané ze subjektu, do kterého se zavedla sekvence nukleové kyseliny metodami transferu genů, která je dobře známa v oboru. Pak následuje kultivace transformovaných buněk a zavedení štěpu do subj ektu.

Expresívní konstrukce, jak se popisují shora v textu se mohou také použít v různých způsobech terapie podle vynálezu. Mohou se přímo zavést do místa poranění subjektu nebo se také mohou použít při přípravě samotného rekombinantního transkripčního faktoru Egr-1, který se může aplikovat na místo poranění. Vynález dále popisuje hostitelské buňky, které se geneticky manipulují konstrukcemi, které obsahují polynukleotid Egr-1 nebo polynukleotidy podle vynálezu nebo genetické alementy definové shora v textu. Dále vynález popisuje použití uvedených vektorů a buněk při terapeutických metodách podle vynálezu. Tyto konstrukce se mohou použít při terapeutických metodách podle vynálezu nebo se mohou použít při přípravě polypeptidu Egr-1.

Vektorem může například být plazmidový vektor, jednořetězcový nebo dvouřetězcový fágový vektor, jednořetězcový nebo dvouřetězcový RNA nebo DNA virový vektor, což závisí na skutečnosti, zda se vektor aplikuje přímo do místa poranění (to je například v případě syntézy in šitu v případě Egr-1) nebo je možné použít syntézu rekombinantního Egr-1. Zde popsané počáteční plazmidy jsou veřejné dostupné a mohou se zkonstruovat z dostupných plazmidů běžnou aplikací dobře známého publikovaného postupu. Řada plazmidů a jiné

2ΐ ..... .. . ·..· klonovací a expresívní vektory, které se mohou použít podle vynálezu jsou dobře známy a jednoduše dostupné.

V obecném případě vektory vhodné pro expresi polypeptidu Egr-1 při použití podle vynálezu obsahují cis-působící kontrolní oblasti, které jsou účinné při expresi v hostiteli, který je operativně spojen s exprimovaným polynukleotidem. Vhodné trans-působící faktory poskytuje buď hostitel nebo doplňkový vektor nebo samotný vektor po zavedení do hostitele.

V jistém provedení vynálezu se používají vektory vhodné pro expresi. V případě produkce rekombinantního Egr-1 takovou specifickou expresí může být indukovatelná exprese nebo exprese pouze u jiných typů buněk nebo může být indukovatelná a buněčně specifická. Zvláště se mezi indukovatelnými vektory preferují vektory, u kterých se může indukovat exprese faktory prostředí, které je možné jednoduše ovlivnit. Jsou to například teplota a nutriční doplňky. Různé vektory vhodné pro použití podle vynálezu zahrnují konstitutivní a indukovatelné expresívní vektory použitelné v prokaryontních a eukaryontních hostitelích.

Velké množství expresívních vektorů se může použít při expresi Egr-1 pro použití podle vynálezu. Takové vektory mezi jinými zahrnují chromozomální, epizomální vektory a vektory odvozené z viru. Jsou to například vektory získané z bakteriálních plazmidů, z bakteriofága, z transpozonů, z kvasinkových epizomů, z inzerčních elementů, z kvasinkových chromozomálních elementů, z virů jako jsou bakuloviry, papova viry, jako je například SV40, viry vakcinie, adenoviry, virus neštovic, virus vztekliny a retroviry a vektory získané z jejich kombinací, jako jsou například ty vektory odvozené z plazmidů a bakteriofágových genetických elementů, jako jsou například kosmidy a fágemidy. Všechny se mohou použít při expresi podle vynálezu. V obecném případě se libovolný vektor ·» ♦ • « • · · • « *·« • · *· » ·· • ·

vhodný pro udržování, propagaci nebo expresi polynukleotidů za účelem exprimovat polypeptid v hostiteli se může použít při expresi.

Vhodná sekvence DNA se může začlenit do vektoru libovolnými dobře známými metodami, jako se například popisuje v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Sekvence nukleové kyseliny v expresívním vektoru je operativně spojená s vhodnou expresívní kontrolní sekvencí, které zahrnují například promotor vhodný pro řízení transkripce mRNA. Představitelé takových promotorů zahrnují, ale nejsou omezeny na promotor fága lambda PL, promotory lac, trp a tac bakterie E. coli, v případě rekombinantní exprese a časné a pozdní promotory SV40 a promotory retrovirových LTR v případě exprese in šitu.

V obecném případě expresívní konstrukce budou obsahovat místa vhodná pro iniciaci a ukončení transkripce a v transkribované oblasti vazebné místo pro ribozom vhodné pro translaci. Kódující část zralých transkriptů exprimovaných konstrukcemi zahrnuje translaci inicijující AUG kodonem a terminační kodon vhodně uložený na konci polypeptidů, který se má přeložit.

Konstrukce mohou navíc obsahovat kontrolní oblasti, které regulují a vyvolají expresi. V obecném případě v souladu s běžně používanými postupy takové oblasti mohou pracovat na základě řízení transkripce. Jsou to například transkripční faktory, vazebná místa represorů a terminace.

Vektory vhodné pro pomnožení a expresi zahrnují vhodné markéry a amplifikační oblasti , jako se například popisují v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory ·· • · • · ··· • ·· ·· · • · ♦ • · · · • · ···· • · * ·· · *· • · ··

Manual, 2^nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Spring Harbor, New York (1989).

Cold

Reprezentativní příklady vhodných hostitelů v případě rekombinantní exprese Egr-1 zahrnují bakteriální buňky, jako jsou stafylokoky, streptokoky, E. coli, streptomyces a buňky Bacillus subtillis, buňky hub , takové jako jsou kvasinky a buňky Aspergillus, hmyzí buňky, jako jsou buňky Drosophila S2 a buňky Spodoptera Sf9, zvířecí buňky , jako jsou buňky CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 a buňky Bowesova melanomu a rostlinné buňky.

Následující vektory, které jsou běžně dostupné se způsobem popsaným v příkladech. Mezi vektory, které se preferují při použití v bakteriích jsou pQE70, pQE60 a pQE-9, dostupné u firmy Qiagen, vektory pBS, vektory Phagescript, vektory Bluescript, pNH8A, pNHl6a, pNH18A, pNH46A, dostupné u firmy Stratagene a ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 dostupné u firmy Pharmacia a pBR322 (ATCC 37017) . Mezi preferovanými eukaryontními vektory jsou pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl a pSG dostupné u firmy Stratagene a pSVK3, pBPV, pMSG a pSVL dostupný u firmy Pharmacia. Tyto vektory, které se mohou použít při rekombinantní expresi a při expresi in šitu se uvádějí způsobem vyobrazení mnoha běžně dostupných a dobře známých vektorů. Je vhodné, aby libovolný jiný plazmid nebo vektor vhodný například pro zavedení, udržování, propagaci nebo expresi polynukleotidu nebo polypeptidu použitelného při terapii podle vynálezu.

Příklady vektorů vhodných pro použití podle vynálezu zahrnují expresívní vektory, ve kterých sekvence cDNA Egr-lse začlenily do plazmidu, přičemž exprese genu se řídí lidským středně časným zesilovacím promotorem cytomegaloviru (popisuje se v publikaci Foecking and Hofstetter, Cell, 45, 101-105,

1986) . Takové expresívní plazmidy mohou obsahovat signály pro • · · zpracování RNA SV40 takovými signály jsou polyadenylační a terminační signály. Expresívní konstrukce, které používají CMV promotor a které jsou běžně dostupné jsou pCDM8, pcDNAl a jeho deriváty, pcDNA3 a jeho deriváty (Invitrogen) . Jiné běžné expresívní vektory, které je možné použít, jsou pSVK3 a pSVL, které obsahují promotor SV40 a místo sestřihu mRNA a polyadenylační signály z SV40 (pSVK3) a signály zpracování SV40 VP1 (pSVL, vektory z Pharmacie).

Promotorové oblasti se mohou vybrat z libovolného požadovaného genu za použití vektorů, které obsahují transkripční jednotku, která reportérovou promotorovou oblast, jako je transkripční postrádá j ednotka chloramfenikolacetyltransferáza (CAT) , po směru exprese genu od restrikčního místa nebo míst pro zavedení promotorového fragmentu, to znamená fragmentu, který může obsahovat promotor. Jak je dobře známo, zavedení fragmentu, který obsahuje promotor, do vektoru do restrikčního místa proti směru exprese od štěpeného místa vyvolává produkci aktivity CAT, kterou je možné detekovat standardními testy CAT. Vektory vhodné pro tento konec jsou dobře známé a snadno dostupné. Jsou to například pKK232-8 a pCM7. Promotory vhodné pro expresi polynukleotidů, které se používají při terapii podle vynálezu, nezahrnují pouze dobře známé a snadno dostupné promotory, ale také promotory, které se mohou snadno získat následujícím postupem za použití reportního genu. V případě exprese in šitu je nutné takový promotor rozeznat v léčeném subjektu.

Mezi známými prokaryontními promotory vhodnými pro expresi polynukleotidů a polypeptidů podle vynálezu při terapii podle vynálezu se mohou použít promotory lacl bakterie E. coli a lacZ a promotory T3 a T7 a gpt, lambda PR, promotory PL a trp.

Rekombinantní expresívní vektory zahrnují například počátky replikace, promotor přednostně získaný ze silně exprímovaného genu, přičemž tyto fragmenty řídí transkripci po směru exprese genu od strukturální sekvence a selekční markér, který umožňuje izolaci vektoru obsahujícího buňky po zavedení vektoru.

Polynukleotidy vhodné pro použití při terapii podle vynálezu, které kódují heterologní strukturální sekvenci polypeptidu podle vynálezu se v obecném případě začlení do vektoru za použití standardních postupů tak, že se operativně spojí s promotorem exprese. Polynukleotid se umístí tak, že místo počátku transkripce se nachází přesně na 5konci od vazebného místa na ribozomu. Vazebné místo na ribozomu bude směrem na 5' konec od kodonu AUG, který iniciuje translaci exprímovaného polypeptidu.

V obecném případě neexistuje žádný jiný otevřený čtecí rámec, který začíná iniciačním kodonem obvykle AUG a leží mezi ribozomovým vazebným místem a iniciačním kodonem. V obecném případě také se vyskytuje kodon ukončující translaci na konci polypeptidu a v konstrukcích bude polyadenylační signál v eukaryontních hostitelích. Signál ukončující transkripci se s výhodou nachází na 3konci transkribované oblasti a může se také. nacházet v polynukleotidové konstrukci.

Za účelem vylučovat přeložený protein do lumenu endoplazmatického retikula, do periplazmatického prostoru nebo do extrabunečného prostředí je nutné začlenit vhodné sekreční signály do exprímovaného polypeptidu při jeho rekombinatní syntéze. Tyto signály mohou být endogenní vůči polypeptidu nebo to mohou být heterologní signály.

Polypeptid se může exprimovat v upravené formě, jako je například fúzní protein a mohou zahrnovat nikoli pouze sekreční signály, ale také další heterologní funkční oblasti.

Tak například oblast nabitých aminokyselin, polypeptidů, aby se v hostitelské buňce dalších aminokyselin, zvláště pak se může přidat na N- nebo C-konec zlepšila stabilita a přetrvávání během čištění nebo během následné manipulace a skladování. Také se do polypeptidů může přidat oblast, která umožňuje čištění. Takové oblasti se mohou odstranit dříve než dojde ke konečné přípravě polypeptidů. Vedle peptidových částí polypeptidů, aby došlo k sekreci nebo exkreci, aby se zlepšila stabilita nebo umožnilo čištění se používají metody, které jsou dobře známy v oboru. Preferovaný fúzní protein obsahuje heterologní oblast z imunoglobulinu, který je možné použít k rozpuštění nebo čištění polypeptidů. Buňky se pak v typickém případě sklízejí centrifugaci, otevírají se fyzikálními nebo chemickými způsoby a výsledný surový extrakt se uchovává pro další čištění.

Mikrobiální buňky, které se používají při expresi proteinů se mohou otevřít libovolnou jinou metodou, která zahrnuje cyklus tání a zmrazení, sonikaci, mechanické porušení nebo použití činidel lyžujících buňky. Takové metody jsou dobře známy v oboru.

Savčí expresívní vektory mohou obsahovat počátek replikace, vhodný promotor a zesilovač a také libovolné ribozomální vazebné místo, polyadenylační oblasti, donor sestřihu a akceptorová místa, sekvence ukončující trankripci a sekvence lemující 5'konec, které se nepřepisují a které jsou nezbytné pro expresi.

Dále je možné použít při přípravě polypeptidů Egr-1 podle vynálezu geneticky manipulované hostitelské buňky. Zavedení polynukleotidu do hostitelské buňky se může ovlivnit transfekci fosforečnanem sodným, transfekci zprostředkovanou

DEAE-dextranem, zprostředkovanou transvekcí kationickými mikroinjekcí, transfekci lipidy, elektroporací, transdukcí, zavedením za použití střel, infekcí nebo pomocí jiných metod. Takové metody se popisují v mnoha standardních manuálech, jako je Davis et al., Basic methods in molecular biology, (1986) a sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989).

Zralé proteiny je možné exprímovat v hostitelských buňkách, které zahrnují savčí buňky takové, jako jsou buňky CHO, kvasinky, bakterie nebo jiné buňky řízené vhodným promotorem. Translační systémy, kde se nepoužívají buňky, se mohou použít při produkci takových proteinů za použití RNA získané z konstrukcí DNA podle vynálezu. Vhodné klonovací a expresívní vektory vhodné pro použití v prokaryontních a eukaryontních hostitelích, jak se popisuje v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2

Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) .

nd

Polypeptid je možné získat a čistit z rekombinantní buněčné kultury známými metodami, které zahrnují precipitaci síranem amonným nebo etanole, kyselou extrakcí, chromatografií s výměnou aniontů a kationtů, chromatografií na fosfocelulóze, chromatografií s hydrofobními interakcemi, afinitní chromatografií, chromatografií na hydroxylapatitu a chromatografií na lektinu. Nejvíce se upřednostňuje, když se při čištění použije vysokovýkonná kapalinová chromatografie. V případě opětného sbalení proteinu se může použít regenerovaná aktivní konformace, kdy polypeptid se denaturuje během izolace a čištění.

V případě terapie polynukleotid kódující Egr-1 například ve formě rekombinantního vektoru se může čistit způsoby, které jsou dobře známy v oboru, jako je kolonová chromatografie, jak se popisuje v publikací Sambrook et al., Molecular Cloning: A • ·

laboratory manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

Jak se uvádí dále v textu Egr-1 se může aplikovat do místa poranění, buď jako nukleová kyselina kódující Egr-1, která se přepisuje a překládá na Egr-1 v samotném místě poranění ve formě genové terapie nebo se může přímo aplikovat samotný transkripční faktor.

Dále vynález popisuje použití polypeptidu transkripčního faktoru Egr-1 nebo jeho biologicky aktivního fragmentu při výrobě léku pro léčbu poranění u savců, kteří zahrnují člověka.

Dále vynález popisuje způsob léčby poranění u savců zahrnujících člověka, která zahrnují aplikaci savci terapeuticky účinného množství polypeptidu transkripčního faktoru Egr-1 nebo jeho biologicky aktivního fragmentu.

Dále vynález popisuje použití transkripčního faktoru Egr-1 nebo jeho biologicky aktivního fragmentu při použití pro léčbu poranění a hojení ran.

Dále vynález popisuje farmaceutickou kompozici obsahující transkripční faktor Egr-1 nebo jeho biologicky aktivní fragment spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči.

Termín „polypeptid transkripčního faktoru Egr-1 zahrnuje přirozeně a rekombinantnš produkovaný transkripční faktor Egr1, přirozené, syntetické a biologicky aktivní polypeptidové analogy nebo varianty nebo jeho deriváty nebo jeho biologicky aktivní fragmenty nebo varianty, deriváty a analogy uvedených fragmentů.

Produkty proteinu transkripčního faktoru Egr-1 zahrnující biologicky aktivní fragmenty transkripčního faktoru Egr-1 se ·· A • ·

A · • · · • · ·

A A · · • · ··· mohou generovat a/nebo izolovat dobře známa v oboru.

obecnou metodou, která je

Egr-1 a dříve v textu uvedené fragmenty a jejich deriváty vhodné pro použití pří terapií podle vynálezu se mohou extrahovat z přirozených zdrojů způsoby, které jsou dobře známy v oboru. Takové metody zahrnují čištění způsoby DNA afinitní chromatografie, která je specifická pro sekvence, jak se popisuje v publikaci Briggs et al., Science 234, 47-52, 1986 za použití oligonukleotidu vázajícího DNA, které rozeznávají Egr-1. Polypeptid se může také připravit způsoby rekombinace DNA, jak se popisuje shora v textu, to znamená expresí popsané konstrukce v hostitelských buňkách. V jiném případě polypeptidy podle vynálezu se mohou synteticky produkovat na běžných syntetizérech peptidů.

Vynález se také týká použití fragmentů, analogů a derivátů Egr-1. Termíny „fragment, „derivát a „analog znamená polypeptid, který vykazuje stejnou biologickou funkci nebo aktivitu jako polypeptid. Tak analog zahrnuje proprotein, který se může aktivovat štěpením proproteínové části za vzniku aktivního zralého polypeptidů.

Fragment, derivát nebo analog polypeptidů může být i) ten, aminokyselinových zbytků se ve kterém jeden nebo více substituuje konzervativním aminokyselinovým zbytkem aminokyselinovým zbytkem) aminokyselinový zbytek může genetickým kódem nebo ii) nebo (přednostně a takový nekonzervativním konzervativním substituovaný být nebo nemusí být kódován ten, kde jedna nebo více aminokyselinových zbytků zahrnuje substituční skupinu nebo iii) ten, kde zralý polypeptid fúzuje s jinou sloučeninou tak, jak sloučenina zvyšuje poločas rozpadu polypeptidů (například polyethylenglykol) nebo iv) ten, ve kterém další aminokyseliny fúzují se zralým polypeptidem, jako je vedoucí nebo sekreční sekvence nebo sekvence, která se používá při čištění zralého polypeptidu nebo proproteinové sekvence. Takové fragmenty, deriváty a analogy jsou obsahem vynálezu.

Mezi preferované varianty patří ty, které se odlišují od přirozeně se vyskytujícího Egr-1 konzervativními substitucemi aminokyselin. Takové substituce jsou ty, které substituují danou aminokyselinu v polypeptidu jinou aminokyselinou s podobnými charakteristikami. V typickém případě se za konzervativní substituce považuje nahrazení jedné aminokyseliny za druhou mezi alifatickými aminokyselinami Ala, Val, Leu a Ile, vnitřní záměna hydroxylových zbytků Ser a Thr, změna kyselých zbytků Asp a Glu, substituce mezi amidovými zbytky Asn a Gin, aromatických zbytků Phe, Tyr.

Dále se zvláště z tohoto důvodu preferují varianty, analogy a deriváty fragmentů, které mají aminokyselinovou sekvenci polypeptidu, ve kterém několik 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 2, 1 nebo žádný aminokyselinový zbytek se substituuje, deletuje nebo přidá v libovolné kombinaci. Zvláště se preferují tzv. tiché substituce, adice a delece, které nemění vlastnosti a aktivity polypeptidu podle vynálezu. Zvláště se také preferují konzervativní substituce.

Zvláště preferované fragmenty jsou biologicky aktivní fragmenty. To znamená fragmenty, které si uchovávají vlastnosti hojení ran rodičovského polypeptidu.

Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu se mohou přednostně vyskytovat v izolované formě a přednostně se čistí do dosažení stupně homogenity.

Polypeptidy Egr-1 vhodné pro použití podle vynálezu zahrnují polypeptid Egr-1 stejně jako polypeptidy, které vykazují alespoň 70 % shodu přednostně alespoň 80 % shodu, více se upřednostňuje alespoň 90 % shodu a stále se více • · upřednostňuje alespoň 95 % shodu (stále se více upřednostňuje alespoň 99 % shodu) s myší polypeptidovou sekvencí, jak se popisuje v publikaci Cell 53 37-43 (1988) a s polypeptidy kódovanými lidskou sekvencí a také zahrnují části takových polypeptidů kódovaných lidskou sekvencí a také zahrnují části takových polypeptidů s takovou částí polypeptidu, která v obecném případě obsahuje alespoň 30 aminokyselin a upřednostňuje se alespoň 50 aminokyselin.

Fragmenty a části polypeptidů, které se používají při terapii podle vynálezu se mohou použít při produkci odpovídajícího polypeptidu v plné délce peptidovou syntézou. Proto se tyto fragmenty mohou použít jako meziprodukty při produkci polypeptidů v plné délce. Fragmenty nebo části polynukleotidů podle vynálezu se mohou použít k syntéze polynukleotidů v plné délce podle vynálezu.

Vynález dále popisuje použití fragmentů polypeptidu Egr-1 definovaného shora v textu a fragmentů jeho variant a derivátů.

Fragment je polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci, která je zcela stejná jako část, ale nikoliv jako celá aminokyselinová sekvence polypeptidů Egr-1 a jejich variant nebo derivátů.

Takové fragmenty se mohou vyskytovat volně, to znamená, že nejsou součástí ani nefúzují s jinými aminokyselinami nebo polypeptidy nebo nejsou obsaženy ve větším polypeptidu, jehož tvoří část nebo oblast. V případě, že tvoří část většího polypeptidu, uvedené fragmenty ve většině případů tvoří jedinou nepřerušovanou oblast. V jediném větším polypeptidu je obsaženo několik fragmentů. Například v jistém preferovaném provedení vynálezu se používají fragmenty polypeptidu podle vynálezu obsažené v prekurzorovém polypeptidu navrženém za účelem exprese v hostiteli a vykazující prepolypeptidové a propolypeptidové oblasti fúzované s N-koncem fragmentu a další oblast fúzovaná s C-koncem fragmentu. Proto termín „fragmenty znamená část nebo části fúzního polypeptidu nebo fúzního proteinu získaného z polypeptidu podle vynálezu.

Vynález popisuje fragmenty charakterizované strukturálními nebo funkčními znaky polypeptidu, který je možné použít při terapii podle vynálezu. Preferovaná provedení podle vynálezu zahrnují fragmenty, které obsahují alfa-helix a oblasti tvořící alfa-helix, list beta a oblasti tvořící list beta, smyčku a oblasti tvořící smyčku, spirálu a oblasti tvořící spirálu, hydrofilní oblasti, hydrofóbní oblasti, alfa amfipatické oblasti, beta amfipatické oblasti, flexibilní oblasti, oblasti tvořící povrch, oblast vázající substrát a oblasti polypeptidu podle vynálezu s oblastmi s vysokým antigenním indexem a kombinace takových fragmentů.

Nejvíce se preferují fragmenty, které mají chemické, biologické nebo jiné aktivity polypeptidu podle vynálezu, které zahrnují podobné aktivity nebo zlepšené aktivity nebo se sníženou požadovanou aktivitou. Dalšími preferovanými polypeptidovými fragmenty jsou ty, které obsahují antigenní nebo imunogenní determinanty u zvířete zvláště u člověka.

Je také vhodné, aby se vynález mezi jinými také popisoval polynukleotidy popisující dříve uvedené fragmenty, zvláště pak ty, které hybridizují za přísných podmínek a polynukleotidy takové jako jsou PCR primery pro amplifikaci polynukleotidů, které kódují fragmenty. Preferované polynukleotidy jsou ty, které odpovídají preferovaným fragmentům, jak se popisuje shora v textu.

Další provedení vynálezu zahrnuje biologicky, profylakticky, klinicky nebo terapeuticky použitelné varianty, analogy nebo jeho deriváty nebo fragmenty zahrnující fragmenty variant, analogů a derivátů a kompozic, které obsahují to samé. Vynález dále popisuje biologicky aktivní varianty, analogy nebo fragmenty.

Vynález dále popisuje kompozice obsahující polynukleotidy nebo polypeptidy popsané shora v textu. Proto polynukleotidy nebo polypeptidy podle vynálezu se mohou použít v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo nosiči.

Takové nosiče mohou zahrnovat, ale nejsou omezeny na fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, dextrózu, vodu, glycerol, etanol a jejich kombinace.

Polypeptidy a polynukleotidy se mohou použít podle vynálezu samotné nebo ve spojení s jinými sloučeninami, jako jsou například terapeutické kompozice.

Farmaceutické kompozice se mohou aplikovat libovolným účinným vhodným způsobem, který je účinný v případě cílení míst poranění, takové způsoby zahrnují mezi jinými například povrchovou, intravenózní, intramuskulární, intranasální nebo intradermální aplikaci. V obecném případě se kompozice mohou aplikovat lokálně na rány nebo v případě podobných stavů.

V případě terapie nebo profylaxe se aktivní činidlo může aplikovat jednotlivci jako injektovatelná kompozice. Například jako sterilní vodní disperze, přičemž se upřednostňuje izotonická disperze.

V jiném případě se může připravit sloučenina pro povrchovou aplikaci například ve formě masti, krémů, roztoků, očních mastí, očních kapek, ušních kapek, ústní vody, nasycených obvazů a chirurgických nití a aerosolů a může obsahovat vhodná běžná aditiva zahrnující například konzervační činidla, rozpouštědla, které napomáhají penetraci léků, a změkčující prostředky do mastí a krémů. Takové povrchové formulace mohou také obsahovat kompatibilní běžné • · • ·φ ·· · ·· J · · · · • · · « · » * · · · · · ··

FA · · · · ··»·· nosiče vhodné například jako základ mastí nebo krémů a ethanol nebo olejový alkohol v případě roztoků. Takové nosiče mohou obsahovat přibližně 1% až přibližně 98 % hmotnosti formulace. Obvykle obsahují až přibližně 80 % hmotnosti formulace.

V případě aplikace savcům a zvláště lidem se očekává, že denní dávka aktivní látky je 0,01 mg/kg až 1,0 mg/kg. V typickém případě je denní dávka lmg/kg. Lékař stanoví aktuální dávku, které bude nejvhodnější pro jednotlivce na základě jeho věku, tělesné hmotnosti a individuální odezvy. Shora uvedené dávky jsou příklady průměrného příkladu. Mohou samozřejmě existovat jednotlivé příklady, kdy je vhodné aplikovat vyšší nebo nižší dávky.

Vynález popisuje farmaceutickou sloučeninu obsahující transkripční faktor Egr-l molekulu nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující Egr-l spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů.

Výhoda pří terapii, kde se používají transkripční faktory za účelem zrychlení hojení ran spočívá v aktivaci více cílových genů, které podporují zrychlené hojení. Egr~l se přirozeně aktivuje jako odezva na poranění a zesílení přirozené odezvy je také výhodou. Léčba je založena na DNA a poskytuje vhodný a reprodukovatelný zaváděcí systém.

V případě, že se v terapeutických metodách používá polynukleotid Egr-l podle vynálezu, polynukleotid se používá jako část expresívní konstrukce. Například ve formě expresívního vektoru. Při takové metodě se konstrukce zavede do místa poranění, kde se produkuje Egr-l in šitu. Používané konstrukce mohou být standardní vektory a/nebo systémy pro zavádění genů, jako jsou lipozomy, zaváděcí systémy zprostředkované receptorem a virové vektory.

·♦

• · · • · ♦ · • 4444 « 4 • · ·

Vynález je dále vhodný pro účely hojení ran, které zahrnují vředy na končetinách doprovázející cukrovku a periferní arteriální okluzivní onemocnění, hojení pooperačních jizev, popálenin a lupénky.

Jak se popisuje shora v textu polypeptidy Egr-1 nebo nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou aplikovat lokálně do místa poškození tkáně libovolným vhodným způsobem, například povrchovou aplikací. Jedním .způsobem zavedení produktů nukleových kyselin je použití technologie genového děla, kde molekula izolované nukleové kyseliny Egr-1 například ve formě cDNA nebo ve formě expresívního vektoru se imobílizuje na zlatých částicích a vystřeluje se přímo do místa poranění. Vynález dále popisuje použití molekuly nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující Egr-1 v genovém děle při léčbě poranění. Dále se popisuje sloučenina vhodná pro terapii za použití genového děla, která zahrnuje sekvenci kódující transkripční faktor Egr-1 a zlaté částice.

Preferované zavedení nukleové kyseliny nebo polypeptidu podle vynálezu je mikrovýsev, jak se popisuje v publikaci US 5,697,901.

Jak se popisuje dříve v textu polynukleotid obsahující sekvenci kódující Egr-1 nebo jeho biologicky aktivní fragment může být řízen alespoň částí přirozeného promotoru Egr-1. Přičemž se upřednostňuje lidský promotor Egr-1.

Izoloval se a sekvenoval myší promotor Egr-1 (popisuje se v publikaci Morris, Nucleic Acíd Research, 16: 8835-3346). Potencionální regulační sekvence zahrnují element AAATA („TATA homologie) v poloze -26 až -22, CCAAT box v polohách 337 až -333, elementy odezvy na pět sér (SRE) v polohách -110 až -91, -342 až -324, -358 až -339, -374 až -355 a -412 až 393, dvě místa Apl v polohách -610 až -603 a -867 až -860, čtyři místa Spi v polohách -285 až -280, -649 až -644, -700 až • · 9 • · · · • ♦··· < 9

-695 a -719 až -714 a dva elementy odezvy na cAMP v polohách 138 až -131 a -631 až -624. Egr-1 ukazuje, že se váže na promotor myšího Egr-1 a snižuje transkripci své vlastní exprese. Sekvence tohoto promotoru se popisuje na obrázku č.

9.

Méně se ví o regulaci promotoru lidského Egr-1 připravila se údajná sekvence lidského Egr-1. Vzhledem k počátečnímu místu v poloze +1 mRNA se identifikovalo 695 nukleotidů sekvence proti směru exprese genu. Tato sekvence proti směru exprese genu obsahuje element AAATA („TATA homologie) v poloze -26 až -22 a řada potencionálních regulačních elementů, které zahrnují dvě místa Spi v polohách -505 až -499 a -647 až -642, dva cyklické elementy odezvy na AMP v polohách -134 až -127 a -630 až -623, elementy odezvy na pět sér (SRE) v polohách -108 až -89, -344 až -326, -359 až -340, -376 až 357 a -410 až -394, vazebné místo pro Egr-1 (EBS) v poloze 597 až 598 a responzivní element na tetradekanoylforbolacetát (TPA) (vazebné místo Apl) v poloze -609 až -602. Je známo, že vazebné místo TPA je funkční jak TPA stimuluje expresi z plazmidu exprimujícího exprimujícího gen chloramfeníkolacetyltransferázy. SRE 3 a 4 zprostředkovává odezvu promotoru Egr-1 na stres a může potvrdit odezvu na stres promotoru SV40. Delece EBS z lidského promotorového elementu vede ke zvýšení odezvy na stres tohoto promotoru, což vede k diskuzi o roli Egr-1 při snížení regulace aktivity z lidského promotoru.

Zjistilo se, že publikovaná sekvence připravená pro lidský promotor Egr-1 není správná a poskytuje novou sekvenci s různými rozdíly od publikované sekvence. Tyto sekvenční rozdíly není možné předpovídat a alespoň některé z nich se považují za funkčně podstatné. Dále se připravila celá sekvence, zatímco uvedené promotorové sekvence lidského Egr-1 zahrnuje různé díry.

• · · · ·; . , : ·♦ j / ..............:

*·· ·· ·· * .. .:.

Molekula nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující Egr-1 nebo jeho biologicky aktivní fragment se může operativně spojit se sekvencí nukleové kyseliny, která

a) vykazuje řetězec obsahující sekvenci uvedenou na obrázku č. 7 v případě GW SEQ nebo

b) vykazuje řetězec obsahující jednu nebo více delecí, inzercí a/nebo substitucí vztažených k GW SEQ, ale který neobsahuje sekvenci zobrazenou na obrázku 7 jako ON SEQ a která dále neobsahuje sekvenci zobrazenou na obrázku č. 9.

Vynález dále popisuje molekulu nukleové kyseliny, která

a) má řetězec obsahující sekvenci uvedenou na obrázku č. 7 v případě GW SEQ

b) má řetězec obsahující jednu nebo více delecí, inzercí a/nebo substitucí vztažených k GW SEQ, ale které neobsahují sekvenci zobrazenou na obrázku č. 7 jako ON SEQ a která také neobsahuje sekvenci zobrazenou na obrázku č. 9 nebo

c) má řetězec, který hybridizuje s řetězcem jak se popisuje v odstavci a) nebo b) shora v textu.

Molekuly podle vynálezu popsané v odstavcích a) , b) nebo

c) se popisují detailněji:

a) molekula nukleové kyseliny, která vykazuje sekvenci uvedenou na obrázku č. 7 v případě GW SEQ

Je možné vidět, že sekvence GW SEQ zobrazená na obrázku č. 7 vykazuje různé oblasti uzavřené v rámečku. Věří se, že tyto oblasti jsou funkčně podstatné a funkce různých oblastí uzavřených v rámečku jsou zobrazeny na obrázku č. 7 se popisují dále v textu:

Spi (dvě oblasti)

Spi označuje sekvenci vhodnou pro navázání transkripčního faktoru Spi a homologů.

• · · 0 0 0 • · 0 · 0 0 • 0 0 0 0 · · 0 0 • · 0 0 0

3tí pro navázání indukuje pomocí • 0 0 · ♦ 0 0 • »0» · • 0 » » 0 00 cAMP RE (dvě oblasti) cAMP RE označuje sekvenci vhodnou transkripčního faktoru ATF a homologů. To se cAMP a sekvence se pak nazývá jako element odezvy na cAMP.

TPA RE

TPA RE označuje sekvenci vhodnou pro navázání transkripčního faktoru API a homologů. Ty zahrnují například forbolester TPA a sekvenci, která se nazývá element odezvy na TPA.

EBS

EBS označuje sekvenci pro navázání transkripčního faktoru Egr-1 a homologů.

SRE (SRE5, SRE4, SRE3, SRE2, SRE1)

SRE označuje sekvenci poskytující odpověď na sérum (to znamená element odezvy na sérum). Spolu se spojenými Ets (specifické pro transformaci E26) vazebná místa elementů odezvy na sérum váže transkripční faktory, jako je SRF, Elk-1 a/nebo F-ACT1, stejně jako jeho homologové.

TATA

Věří se, že TATA box je nutný pro sestavení transkripčního komplexu, který obsahuje řadu transkripčních faktorů nutných pro iniciaci transkripce. Jestliže je potřeba nezahrnují přesnou sekvenci TATA, protože je to konvenční sekvence a objevuje se jistý stupeň variace.

GW SEQ vykazuje různé rozdíly sekvencí vzhledem k publikované sekvenci lidského Egr-1 (zde se označuje jako „ON SEQ). Rozdíly se diskutují s ohledem na uspořádání sekvencí GW SEQ a ON SEQ zobrazené na obrázku č. 7.

Jak je možné vidět z obrázku 7, GW SEQ vykazuje pět nukleotidů, které se změnily ze specifických nukleotidů • 0

000· • 0 «·· poskytovaných v odpovídájících polohách v sekvenci ON SEQ. Ty se považují za substituce ve vztahu k ON SEQ. Dvě z nich se nachází v oblastech, které jsou ohraničeny v rámečcích. Tyto dvě substituce jsou substituce G s T a substituce G s C. Nacházejí se v prvním rámečku cAMP RE a v rámečku SRE3.

GW SEQ také vykazuje další nukleotidy příbuzné s ON SEQ (to je nukleotidy, které nejsou specificky identifikované v ON SEQ) . Ty se mohou považovat za inzerty příbuzné sekvenci ON SEQ. Čtyři z nich se jsou přítomny v rámečku SRE5 (Tři z nich jsou inzerty A a jedno je začlenění C).

Sekvence GW SEQ vykazuje jednu deleci ve srovnání se sekvencí ON SEQ. Je to delece G. Není to v oblasti rámečků. Nachází se mezi druhým boxem Spi a SRE5.

Molekuly popsané ve vynálezu a) mají samozřejmě další sekvence proti a po směru exprese genu ve srovnání s GW SEQ. Může se připravit například jedna nebo více oblastí, které se podílejí na transkripci/translaci nebo jejich regulaci. Může se také připravit kódující oblast (přednostně kódující Egr-1 nebo jeho biologicky aktivní fragment). Další oblasti se popisují dále v textu.

b) molekula nukleové kyseliny, které má řetězec obsahující jeden nebo více delecí, inzercí a/nebo substitucí ve srovnání s GW SEQ, ale které neobsahují sekvenci zobrazenou na obrázku č. 7 jako ON SEQ a které také neobsahují sekvenci zobrazenou na obrázku č. 9

Mohou se připravit změny v nukleotidové sekvenci vzhledem k sekvenci GW SEQ za vzniku jiných molekul, které se stále využívají. Takové změny popisuje vynález. Zahrnují alelické a nealelieké varianty.

Preferované varianty podle vynálezu b) budou obvykle obsahovat jednu nebo více regulačních oblastí, které mají » » · · · · • · · · « ♦ · *·· · » ··«·· « «

..*··· * ·· ·· « , funkci odpovídající funkci jedné nebo více oblastí ohraničených v rámečku zobrazených v GW SEQ (dokonce jestliže funkce se reguluje pozitivně nebo negativně vzhledem k jedné nebo více oblastí uzavřených v rámečku zobrazených v případě GW SEQ). Nejvíce se preferuje, aby takové molekuly.měly jednu nebo více oblastí, které vykazují stejné sekvence, jako jedna nebo více oblastí uzavřených v rámečku zobrazených v případě GW SEQ.

Požadované varianty podle vynálezu b) budou vykazovat podstatnou shodu sekvence s celou nebo s částí uvedené GW SEQ po celé délce uvedené sekvence QW SEQ nebo její části.

Jestliže varianta má jednu nebo více oblastí, které odpovídají jedné nebo více v rámečku uzavřených oblastí zobrazených na obrázku č. 7 v případě GW SEQ, preferuje se, aby se nevyskytovaly žádné rozdíly vzhledem k uvedeným oblastem uzavřených v rámečcích nebo pouze několik takových rozdílů (v obecném případě se například preferuje, aby měly maximálně pouze 1, 2 nebo 3 rozdíly s ohledem na danou oblast uzavřenou v rámečku). Vně oblastí uzavřených v rámečku může existovat více změn v sekvencích. Takové varianty mohou relativně vykazovat nižší stupeň shody sekvencí s odpovídající částí GW SEQ s ohledem na oblasti, které nejsou uzavřeny v rámečcích na obrázku č. 7. Některé varianty nemají jednu nebo více oblastí, které odpovídají jedné nebo více oblastí vně uvedených oblastí uzavřených v rámečku s ohledem na GW SEQ.

Preferované molekuly nukleové kyseliny popsané ve vynálezu zahrnujíjednu nebo více regulačních oblastí schopných změnit sílu transkripce Egr-1 u savců (více se upřednostňuje u lidí) při odezvě na podmínky in vivo. Takové molekuly nukleových kyselin se mohou aplikovat savcům za vzniku Egr-1 způsobem, který umožňuje regulaci jejich exprese na úrovní transkripce ·· 9

9·· v obecném vykazuj e mohou proto látku, která (tyto molekuly nukleových kyselin případe zahrnovat oblast kódující aktivitu Egr-1) .

Mohou být přítomny jeden nebo více elementů odezvy na sérum (SRE) . Je nutné, aby jeden nebo více z nich byl elementy odezvy na stres. Jsou to oblasti, které potvrzují odpověď na stres v případě transkripce.

Velké množství SSRE může spolupracovat při umožnění odpovědi na stres. Je nutné, aby byly spojeny s jedním nebo více míst Ets nebo aby tato místa zahrnovaly. V některých případech je nutné, aby bylo přítomno pouze jedno místo (přednostně spolu s místem Ets) za účelem poskytnou stupeň odezvy na stres.

Preferované SSRE se uvádí na obrázku č. 7 jako SRE5 v případě sekvence „GW SEQ. Prokázalo se, že tyto oblasti jsou funkční, zatímco sekvence SRE5 se zdá být s ohledem na sekvenci ON SEQ nefunkční. Samotná oblast SRE5 stejně jako varianty SRE5 jsou schopny poskytnout.odpověď na stres podle vynálezu. Takové varianty přednostně zahrnují alespoň jeden rozdíl nukleotidu přítomný v GW SEQ SRE5 ve srovnání s ON SEQ SRE5.

Jiné preferované SSRE jsou SRE3 a SRE4, jak je zobrazeno na obrázku č. 7 v případě GW SEQ stejně jako jeho varianty schopné poskytnout odezvu na stres.

Nejvíce se preferuje, když jsou přítomny všechny oblasti SRE3, SRE4 a SRE5 (nebo jejich varianty, které jsou schopné poskytnout odpověď na stres).

Bez ohledu na skutečnost, zda je přítomna určitá oblast SRE, molekula nukleové kyseliny podle vynálezu je nutně obsažena v TATA boxu (která nebude nezbytně zahrnovat • · · • · · · · ··· · ‘i Z.

konvenční sekvencí TATA). Také bude obvykle zahrnovat box CCAAT (který nebude nezbytně zahrnovat konvenční sekvenci CCAAT).

Je obvyklé, že je přítomna alespoň jedna nebo více vazebných oblastí Spi. Jedna z vazebných oblastí Spi nebo obě mohou být sekvence vázající Spi zobrazené na obrázku č. 7 v případě GW SEQ.

Může být přítomna oblast odezvy na cAMP. Takové preferované oblasti obsahují sekvence zobrazené na obrázku č. 7 a mají označení cAMP RE s ohledem na sekvenci GW SEQ. Nejvíce se preferuje první cAMP RE zobrazená na obrázku č. 7 v případě GW SEQ. To umožňuje regulaci transkripce pomocí cAMP.

Může být přítomno vazebné místo EGR-1 (EBS) . Věří se, že toto místo vykazuje důležitou úlohu při negativní regulaci transkripce Egr-1 po té, co množství Egr-1 překročil jistou parhovou hodnotu. Tak Egr-1 může omezovat svou vlastní expresi po stimulaci stresem. V obecném případě se použije EBS, jestliže je nutné omezit tímto způsobem množství Egr-1. EBS může mít sekvenci zobrazenou na obrázku č. 7 v případě GW SEQ jako EBS. Nukleotidové změny se mohou provést za vzniku EBS, přičemž vznikají jejich varianty. Varianty je možné připravit s omezenou afinitou pro Egr-1 ve srovnání s EBS, jak je zobrazeno na obrázku č. 7 v případě GW SEQ. Jedna taková varianta je EBS zobrazené na obrázku č. 8. V některých případech funkční EBS nemůže být přítomno a proto regulace pomocí Egr-1 se může zcela odstranit (může například dojít k úplné deleci EBS) . Nukleotidové změny se mohou také připravit v EBS za vzniku zvýšené afinity pro Egr-1. Je použitelné, jestliže je nutné posílit samoregulaci exprese Egr-1.

··· • ·♦

c) molekula nukleové kyseliny, která má řetězec, jenž má řetězec, který hybridizuje s řetězcem jak se popisuje v odstavci a) nebo b) uvedeném shora v textu

Vynález popisuje molekuly nukleové kyseliny, které mohou hybridizovat s jednou nebo více molekul nukleových kyselin popsaných shora v textu. Takové molekuly nukleové kyseliny se nazývají jako „hybridizující molekuly nukleové kyseliny. Je nutné, aby hybridizující molekuly podle vynálezu obsahovaly alespoň 10 nukleotidů a upřednostňuje se alespoň 25, alespoň 50, alespoň 100 nebo alespoň 200 nukleotidů.

Molekula hybridizující nukleové kyseliny podle vynálezu může vykazovat vysoký stupeň shody sekvencí po celé délce s molekulou nukleové kyseliny komplementární s nukleovou kyselinovou podle vynálezu a) a b) (například alespoň 50 %, alespoň 75 %, alespoň 90 %, alespoň 95 % nebo alespoň 98 % shody), ačkoli to není podstatné. Čím vyšší stupeň sekvenční shody, který je dán molekulou jednořetězcové nukleové kyseliny s jinou molekulou jednořetězcové nukleové kyseliny, tím vyšší pravděpodobnost, že bude hybridizovat s molekulou jednořetězcové nukleové kyseliny, která je komplementární s molekulou jiné jednořetězcové nukleové kyseliny za vhodných podmínek.

Preferované hybridizační molekuly hybridizuj! za podmínek střední nebo vysoké přísnosti . Hybridizační podmínky se popisují na straně 1.101 až 1.110 a 11.45 až 11.61 publikace Sambrook et al (Molecular Cloning, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) . Jeden příklad hybridizačních podmínek, které se mohou použít, zahrnují použití prepromývacího roztoku 5 x koncentrovaného SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA (pH8,0), přičemž hybridizace probíhá přes noc při teplotě 55 °C za použití 5 x SSC. Existuje však řada jiných možností. Některé z nich jsou uvedeny v tabulce č. 1 publikace WO 98/45 435 (zvláště je vhodné prozkoumat podmínky označené písmeny A»·· « • * · · · ·« • · · · · · « » * «»»# « « « «

-. * » · · • · · ·« · · »

F v tabulce a méně výhodné jsou podmínky označené písmeny G až L nebo M až R) .

Další přístup je stanovení Tm pro daný úplný duplex (to je bez žádného nesprávného párování) listé délky za daných podmínek pak uskutečnit hybridizaci s jedním řetězcem duplexu za uvedených podmínek, ale při teplotě, která je dostatečně pod teplotou Tm, aby došlo ke vzniku formace stabilních hybridů přijatelnou rychlostí. Zatímco je potřeba významný stupeň hybridizační specifity. Teplota Tm v případě takového duplexu se může stanovit empiricky poskytnutím duplexu a postupným zvyšováním teploty, až se dosáhne hodnoty Tm. Tm se může také odhadnout například za použití rovnice Tm - 81,5 + 16, 6 (logio[Na⁺]) + 0,41 (frakce G + C) - (600/N), kde N je délka řetězce (tento vzorec je přesný v případě koncentrace Na⁺ 1 M nebo nižší a v případě délek polynukleotidů 14 až 70, ale je méně přesný v případě, že se nedosahuje těchto parametrů). V případě molekuly nukleové kyseliny větší než 200 nukleotidů může hybridizace probíhat při teplotě, která je nižší o 15 až 25 °C než je hodnota Tm preferktního hybridu (to je bez nesprávného párování) za daných podmínek. Jak se dílka zvyšuje hodnota Tm se snižuje tak, že někdy není vhodné provádět hybridizaci při hodnotě Tm -25 °C. Hybridizace s kratšími molekulami nukleových kyselin se proto často provádí při teplotě, která je nižší pouze o 5 až 10°C než je hodnota Tm. Existuje pravidlo, že každé 1 % nesprávného párování snižuje hodnotu Tm o 1 až 1,5 °C. Upřednostňuje se, aby se hybridizační podmínky vybraly tak, aby se vyskytovalo méně než 25 % nesprávných párů. Více se upřednostňuje výskyt nesprávných párů nižší jak 10 % nebo nižší jak 5 %. Hybridizaci následuje promytí za přísnějších podmínek. Počáteční promývání se může provést za málo přísných podmínek, ale pak následuje promývání za přísných podmínek až do dosažení podmínek, při kterých probíhala hybridizace.

φ«

Φ Φ

Φ · • ΦΦ « ν

φφ φφ · • >

Φ •

Φ • ΦΦ φ Φ · • ·Φ4 » • φ • φ Φ • φφφ • · · • · · φ φ « • Φ φφφ

Protože odborník je schopný měnit parametry podle toho jak je to vhodné za účelem dosáhnout vhodné hybridizační podmínky a je možné také do proměnných zahrnout délku polynukleotidů, zastoupení bází, podstatu duplexu (to je DNA/DNA, RNA/RNA nebo DNA/RNA), typ přítomného iontu atd. .

Nejvíce se preferuje, když hybridizující molekuly nukleových kyselin podle vynálezu hybridizují s molekulou DNA, která má sekvence uvedené na obrázku č. 7 v případě GW SEQ nebo s jednou nebo více oblastí uzavřených v rámečku na obrázku č. 7.

Hybridizující molekuly nukleových kyselin se mohou použít například jako sondy nebo primery.

Sondy se mohou použít při čištění a/nebo identifikaci nukleových kyselin. Mohou se také použít při diagnostikování. Sondy se mohou například použít pro stanovení zda jednotlivci vykazují defekt ve svém genomu, který může ovlivnit transkripcí Egr-1 nebo regulaci takové transkripce. Takové defekty mohu vést u jedinců k různým poruchám, které se mohou léčit podle vynálezu. Hojení ran je možné například porušit mutacemi v jednom nebo ve více SRE. Takové mutace se mohou identifikovat za použití sond, které hybridizují s vyšším stupněm specifity s jedním nebo více SRE zobrazeným v případě GW SEQ ve srovnání s odpovídajícím mutantem SRE (a naopak) .

Jestliže je to nutné, hybridizující molekuly podle vynálezu silněji hybridizují s molekulou DNA vykazující sekvenci zobrazenou na obrázku č. 7 v případě GW SEQ nebo s jednou nebo více rámečkem označených oblastí ve srovnání s molekulou DNA, která má zobrazenou sekvenci na obrázku č. 7 v případě sekvence ON SEQ nebo s jednou nebo více jejích oblastí v boxu. Hybridizující molekula se může například navrhnout s vysokým stupněm specifity pro jeden nebo více ·· • 91

• · « ·· · • · ···· · oblastí SRE3, SRE5 a cAMP zobrazených v případě GW SEQ na obrázku č. 7 (všechny tyto oblasti vykazují rozdíly v sekvenci z odpovídajících oblastí ON SEQ).

Hybridizující molekuly nukleových kyselin podle vynálezu zahrnují primery. Primery je možné použít při amplifikaci nukleových kyselin nebo jejích částí, například postupu PCR.

Vedle toho, že hybridizující molekuly nukleových kyselin je možné použít jako sondy a primery, mohou se použít jako antisense molekuly za účelem změnit expresi. Tento postup je možné použít při antisense terapii. Antisense molekuly se mohou například použít k blokování nebo k omezení exprese Egr1 prevencí nebo omezení síly transkripce. V jiném případě se mohou použít k prevenci nebo ke snížení regulace transkripce Egr-1 daným regulátorem navázání na oblast, na kterou se bude regulátor v normálním případě vázat.

Je nutné poznamenat, že molekuly nukleové kyseliny vhodné pro použití podle vynálezu zahrnují ne pouze ty molekuly s klasickou strukturou DNA nebo RNA, ale také ty varianty s upravenými (nikoli s fosfodiesterovou) hlavními řetězcemi. Jsou to například morfolinoderiváty a peptidové nukleové kyseliny (PNA), které obsahují pseudopeptidovou kostru založenou na N-(2-aminoethyl)glycinu (popisuje se v publikaci Nielsen, P.E., Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 24 167-83 (1995)). Varianty nukleových kyselin s upravenou kostrou mohou vykazovat zvýšenou stabilitu ve srovnání s neupravenými nukleovými kyselinami a jsou zvláště použitelné, kdfy je nutné dosáhnout dlouhotrvající hybridizace (například při antisense terapii).

Z dříve popsaných skutečností vyplývá, že vynález popisuje velký počet nukleových kyselin. Z obsahu vyplývá, že molekuly nukleových kyselin podle vynálezu mohou vykazovat jednu nebo více z následujících charakteristik:

·· *· · .· • · · · · · ·

1) Mohou se vyskytovat ve formě DNA nebo RNA (zahrnující varianty přirozeně se vyskytujících struktur DNA nebo RNA, které vykazují nepřirozeně se vyskytující báze a/nebo nepřirozeně se vyskytující kostry).

2) Mohou být jednořetězcové nebo dvouřetězcové (zahrnují jak daný řetězec tak jeho komplement, ať už jsou nebo nejsou spojeny).

3) Mohou existovat v rekombinantní formě, to znamená, že jsou kovalentně spojeny heterologní sekvencí lemující 5' a/nebo 3'konec, aby vznikla chimérová molekula (například vektor), která se neobjevuje v přírodě.

4) Mohou se vyskytovat bez sekvencí lemujících 5' a/nebo

3'konec, které se v normálním případě objevují v přírodě.

5) Mohou se vyskytovat v podstatě čisté formě (například v izolované formě). To je možné provést například za použití sond, aby se izolovaly klonované molekuly, které mají požadovanou cílovou sekvenci nebo použitím způsobu chemické syntézy. Tak se nukleové kyseliny mohou vyskytovat ve formě, která v podstatě neobsahuje žádné kontaminující proteiny a/nebo jiné nukleové kyseliny.

6) Mohou se vyskytovat s introny (například jako gen v plné délce) nebo bez intronů.

Molekuly nukleových kyselin podle vynálezu mohou obsahovat libovolnou požadovanou sekvenci. Například jeden nebo více elementů odezvy na sérum se může operativně vázat na kódující sekvenci, která není v normálním případě spojená s takovými elementy. To je možné využít například při hojení ran, jestliže je nutné získat odezvu na sérum s ohledem na dané terapeutické činidlo kódované kódující sekvencí, které v normálním případě nevykazuje odezvu na sérum.

Preferuje se však, že molekuly nukleových kyselin podle vynálezu obsahují kódující sekvenci Egr-1 nebo její biologicky aktivní fragment.

Je nutné, aby molekuly nukleových kyselin podle vynálezu zahrnovaly promotorovou oblast a mohly se použít za vzniku Egr-1 tím, že umožňují transkripci mRNA Egr-1. Ta se může překládat pomocí ribozomů přítomných v hostiteli. Molekuly nukleových kyselin se mohou aplikovat subjektu (přednostně člověku nebo jinému savci) tak, že se může syntetizovat další v subjektu nebo (méně výhodné je) se mohou použít při přípravě samotného Egr-1, který se pak může aplikovat subjektu.

Molekuly preferovaných nukleových kyselin podle vynálezu aplikované subjektu se mohou přepsat takovým způsobem, že transkripce se může regulovat jedním nebo více faktorů, které regulují transkripci Egr-1 v subjektu.

Může se například připravit jeden nebo více SSRE (jak se popisuje shora v textu), aby se dosáhlo transkripce Egr-1 s odezvou na stres. Je zvláště výhodné, aby se molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu aplikovaly pacientovi (spíše než se aplikovalo samotné Egr-1). Odezva na stres je výhodná tam, kde molekuly nukleových kyselin podle vynálezu se používají in vivo při léčbě ran. To je z důvodu, že stres v místě poranění může vést k vylučování faktorů, které se váží na SSRE, které mohou stimulovat zvýšenou transkripcí Egr-1. Zvýšené množství Egr-1 může urychlit hojení ran.

V některých případech může být nutné omezit sílu odpovědi na stres. Může být například nutné tímto způsobem zpomalit léčbu poranění (například za účelem omezení jizev). V jiném případě je nutné redukovat nebezpečí kardiovaskulárních problémů spojených s odezvou na stres.

Vynález dále popisuje celé sekvence pěti lidských SRE spojených s regulací transkripce lidského Egr-1. Jeden nebo více SRE se může upravit mutací, aby se omezila odezva na • ·

stres a to na sílu odezvy získatelné za použití jednoho nebo více SRE zobrazeného na obrázku č. 7 v případě GW SEQ.

V jiném případě může být nutné zvýšit sílu odpovědi na stres tím, že se provedou mutace v jednom nebo více z pěti SRE tak, že se zvýší odezva na stres ve srovnání s odezvou za použití SRE zobrazeném pro případ GW SEQ na obrázku č. 7. Takové mutace mohou například použít při zrychlení léčby poranění.

Molekuly nukleových kyselin podle vynálezu mohou, být ve formě vektorů, ačkoli to není podstatné. Mohou se aplikovat pacientovi pomocí fyzikálních metod. Takové metody zahrnují povrchovou aplikaci obnažených vektorů nukleové kyseliny ve vhodném vehiklu, například v roztoku farmaceuticky přijatelného ekcipientu, jako je fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem (PBS). Takové metody zahrnují bombardování částicemi (které je také známo jako technologie genového děla) a popisuje se v publikaci US-5 371 015. Inertní částice, jako jsou zlaté částice potažené nukleovou kyselinou jsou urychlovány rychlostí dostatečnou, aby prostoupily povrchem do místa poranění (například kůží) způsobem vypuštění za vysokého tlaku z vhodného střílecího zařízení (částice jsou potažené molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu, stejně vynález popisuje i zařízení, které obsahuje takové částice). Jiné fyzikální metody aplikace DNA přímo do recipietnu zahrnují ultrazvuk, elektrickou stimulaci, elektroporaci a mikrovýsev. Zvláště se preferuje mód mikrovýsevu. To se popisuje v publikaci US-5 697 901.

Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou také aplikovat způsobem specializovaných zaváděcích vektorů.

Může se použít libovolný vektor vhodný pro genovou terapii. Přístupy genové terapie se popisují například • ·

v publikaci Věrna et al, Nátuře 389: 239-242. Mohou se použít jak virové tak nevírové systémy.

Systémy založené na virech zahrnují retrovirový, lentivirový, adenovirový, adenoasociovaný virový systém a systém založený na viru herpes a vakcinie.

Nevirové systémy zahrnují přímou aplikaci nukleových kyselin a systémy založené na lipozomech.

Sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou dokonce aplikovat způsobem transformovaných hostitelských buněk. Takové buňky zahrnují buňky získané z objektu. Molekuly nukleových kyselin podle vynálezu se mohou zavést do takových buněk in vitro a transformované buňky se mohou později vrátit do subjektu. Molekuly nukleových kyselin se nemusí zavádět jako vektory, protože se mohou zavést nevektorové molekuly nukleových kyselin. Některé molekuly se mohou začlenit do nukleové kyseliny, která se už nachází v hostitelské buňce homologní rekombinací.

Vynález dále zahrnuje expresívní systémy, které se mohou použít za vzniku polypeptidů (například Egr-1) . Takové polypeptidy se mohou pak použít při terapii.

Preferovanými expresívními vektory jsou eukaryontní vektory. Mohou se však použít také prokaryontní vektory. Vhodné vektory v obecném případě zahrnují kódující sekvenci operativně spojenou s jednou nebo více regulačních sekvencí. Upřednostňuje se, když kódující sekvence kóduje Egr-1.

Řada různých expresívních systémů se popisují v publikaci Sambrook et al (molecular Cloning, 2 nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

Z předchozí diskuse vyplývá, že je vhodné, aby nukleové kyseliny podle vynálezu (které mohou být přítomny ve formě • · · · · • · · · · · • · 9 9 4 9 «·

4 4 4 4 9444994 4 ·· · · · vektorů) se mohly použít při různých terapeutických aplikacích, stejně jako polypeptidy produkované za použití takových nukleových kyselin. Vynalez dále popisuje farmaceuticky přijatelné sloučeniny obsahující uvedené nukleové kyseliny nebo polypeptidy, zvláště v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo nosiči.

Takové nosiče mohou zahrnovat, ale nejsou omezeny na fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, dextrózu, vodu, glycerol, etanol a jejich kombinace.

Polypeptidy a nukleové kyseliny se mohou použít podle vynálezu samotné nebo ve spojení s jinými látkami, jako jsou terapeutické látky. Za jistých okolností se mohou aplikovat represory Egr-1 (takové jako NABl a/nebo NAB2) (například jestliže je nutné minimalizovat tvorbu jizev, aby se inhibovala resterióza, aby se upravila kalcifikace stěny cév a/nebo aby se inhibovala proliferace buněk (například při zhoubném bujení)). Jestliže se mají aplikovat dvě nebo více aktivních činidel může se to provést kombinovanou přípravou pro současné, oddělené nebo postupné použití.

Farmaceutické sloučeniny podle vynálezu se mohou aplikovat libovolným účinným způsobem, který zahrnuje mimo jiné například povrchovou, intravenózní, intramuskulární, intranasální nebo intradermální cestou. V obecném případě se preferuje, že sloučeniny se mohou aplikovat lokálně například do nebo blízko místa poranění. Může se však použít systémová aplikace.

Aktivní činidlo se může aplikovat jednotlivci jako injektovatelná sloučenina na příklad jako sterilní vodná disperze. Upřednostňuje se, aby byla prakticky izotonická s tělními tekutinami pacienta (například s krví pacienta).

* · • · · • · · · • · · · · · 4 může připravit tak, aby byla například ve formě mastí.

xj Z

V jiném případě se sloučenina vhodná pro povrchovou aplikaci krémů, roztoku, očních mastí, očních kapek, ušních kapek, ústní vody, nasycených obvazů a chirurgických nití a ve formě aerosolů. Mohou obsahovat aditiva, která zahrnují například konzervační činidla, rozpouštědla, jenž napomáhají prostupu léků a změkčující prostředek v případě mastí a krémy. Takové povrchové sloučeniny mohou také obsahovat kompatibilní nosiče, jako jsou například krémy nebo základ mastě a etanol nebo oleylalkohol v případě roztoků. Takové nosiče mohou tvořit přibližně 1% až přibližně 98 % hmotnosti sloučeniny. Je obvyklé, že budou tvořit až přibližně 80 % hmotnosti formulace.

Nejvíce se preferují farmaceutické sloučeniny obsahující nukleové kyseliny podle vynálezu adaptované pro aplikaci technologií genového děla. Takové nukleové kyseliny se mohou spojovat s částicemi (například se zlatými částicemi), které se pak mohou použít jako projektily.

V případě aplikace savcům zvláště pak lidem se očekává, že denní dávka aktivního činidla se bude pohybovat v rozmezí 0,01 mg/kg až 10 mg/kg, v typickém případě přibližně 1 mg/kg. V praxi lékař stanoví aktuální dávku, která bude nejvhodnější pro jednotlivce a ta může kolísat s věkem, tělesnou hmotností a stavem určitého jednotlivce. V případě, že se vyvinou vedlejší účinky, dávku je možné snížit v souladu s klinickou praxí.

Vedle terapeutického použití se může také vynález použít při diagnostikování. Jak se uvádí shora v textu vynález popisuje sondy, které se mohou použít při diagnostikování různých poruch. Ty mohou existovat jako součást diagnostického kitu, který může zahrnovat i jiné komponenty. Například jeden nebo více promývacích roztoků, způsoby detekování hybridizace, * · instrukce použiti. Sondy se mohou značit detekovatelným markérem (například fluorescenční markér nebo radioaktivní značka).

Vynález se může použít ke skriningu. Molekula nukleové kyseliny podle vynálezu (jako je molekula obsahující GW SEQ zobrazená na obrázku č. 7 nebo jeho část) se může použít při testování sloučenin, které se na ni váží. Takové látky se mohou testovat, aby se zjistilo, zda ovlivňují .transkripci Egr-1. Mohou se také použít při navrhování léků pro léčbu, která se popisuje shora v textu. V jiném případě molekula nukleové kyseliny podle vynálezu se může použít při testování látky schopné blokovat navázání jiné sloučeniny na molekulu nukleové kyseliny. V případě, že jiná sloučenina je regulátorem transkripce sloučeniny Egr-1, pak sloučeniny blokující uvedené navázání se mohou také použít při navrhování léků vhodných při léčbě uvedené shora v textu.

Vynález je také možné použít při- výzkumu. Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou použít jako počáteční materiál ve studii, kdy se provede jedna nebo více změn a vztahují se k dané molekule nukleové kyseliny. To je možné provést, aby se zjistilo, která jejich část je důležitá při transkripci Egr-1 nebo jsou důležité při regulaci takové transkripce. Například inzerce/delece/nahrazení se mohou provést vzhledem k jedné nebo více oblastí uzavřených v rámečku zobrazených na obrázku č. 7 v případě GW SEQ a je možné zkoumat účinek takové inzerce/delece/nahrazení. Změny se mohou provést, aby se zkusily identifikovat molekuly nukleových kyselin schopné zvýšit nebo snížit transkripci Egr1.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku la a b je zobrazena exprese Egr-1 VEGF.

• · · · ·· ·

Na	obrázku	lc a	d j e	zobrazena	exprese	Egr-l	TGF-	Bl.
Na	obrázku	le a	f je	zobrazena	exprese	Egr-l	PDGF	A.
Na	obrázku	2a	je	zobrazen	účinek	Egr-l	na	zatažení

vyříznutých ran u krys.

Na obrázku 2b je zobrazen účinek transfekce DNA Egr-l na histologii hojení vyříznutých ran u krys.

Na obrázku 2c je zobrazen účinek Egr-l na ukládání kolagenu do vyříznutých ran u krys.

Na obrázku 2d je zobrazen účinek Egr-l na angiogenní profil ve vyříznutých ranách u krys za použití imunologického barvení WF.

Na obrázku 3a je zobrazena optimalizace poměru lipid:DNA (objem/hmotnost) při transfekcí plazmidu pGL3 řídícího luciferázu do systému ko-kultívace při angiogenezi za použití Mirus TranslT (Cambridge Bioseciences).

Na obrázku č. 3b je zobrazen účinek Egr-l na angiogenezi.

Na obrázku č. 4a jsou zobrazeny vzorky vstupu do kostí za použití westernový blotační analýzy.

Na obrázku č. 4b je zobrazena westernová blotační analýza proteinu Egr-l v lidských kostních buňkách TE85, které se vystavily nanesení.

Obrázek č. 4C zobrazuje analýzu PDGF BB pomocí testu ELISA, přičemž PDGF BB se produkuje z kostních buněk TE85 po expozici nanesení.

Na obrázku č. 4d je zobrazena detekce VEGF a TGF-Bl po transfekcí CMV-TGF-B1 do buněk ROS.

• · · ··· · * «

Na obrázku č. 4e je zobrazena detekce VEGF a TGF-Bl po transfekci CMV-TGF-Bl do buněk MC3tEl.

Obrázek č. 5 zobrazuje účinek Egr-1 na množství alkalické fosfatázy v modelu tvorby ektopických kostí.

Na obrázku č. 6a je zobrazeno barvení buněk lidského hladkého svalstva transfekovaných CMV Egr-1 za použití antiEgr-1 protilátek.

Na obrázku č. 6b je znázorněno barvení buněk hladkého svalstva transfekovaných DNA CMV Egr-1 pomocí anti-Egr-1 protilátek.

Na obrázku č. 6c je zobrazena optimalizace transfekce kontroly pGL3 lucifarázy do lidských SMC pomocí Fugene.

Obrázek č. 6d zobrazuje optimalizaci transfekce kontroly pGL3 lucifarázy do prasečích SMC pomocí Fugene.

Obrázek č. 6e zobrazuje aktivaci produkce/vylučování VEGF transfekci CMV-Egr-1 do lidských SMC.

Obrázek č. 6f zobrazuje aktivaci produkce/vylučování HGF transfekci CMV-Egr-1 do lidských SMC.

Obrázek č. 6g zobrazuje aktivaci produkce/vylučování PDGF transfekci CMV-Egr-1 do lidských SMC.

Obrázek č. 6h zobrazuje imunobarvení proteinu Egr-1 ve stěně cév před a po poranění.

Obrázek č. 7 zobrazuje porovnání dvou nukleotidových sekvencí označených jako GW SEQ a ON SEQ. Sekvence ON SEQ představuje publikovaný promotor odezvy časného růstu 1 (Sakamoto et al., Oncogene .6, 867-871, 1991) a GW SEQ je sekvence v souladu s vynálezem, která obsahuje řadu začlenění/delecí baží a substitucí (tlustě podtrženo).

• «

A • · • · • · · • ··· ι • 9

Na obrázku 8 je zobrazena varianta sekvence zobrazená na obrázku č. Ί, která vykazuje upravenou oblast EBS. Mutace ve vazebném místě Egr-1 (EBS) je zvýrazněna podtržením tlustou čarou.

Na obrázku č. 9 je zobrazena publikovaná 5'upstream sekvence genu myšího Egr-1 (popisuje se v publikaci Morris, Nucleic Acids Research, 16: 8835-8846). Nukleotidy se číslují od místa mezery = +1. Putativní elementy TATA a CCAAT jsou uzavřeny do rámečků. Potencionální regulační elementy jsou podtrženy a jsou uvedeny na obrázku. Čárkované podtržení ukazuje polohu 29-méru používaného při studiích extenze primerů.

Na obrázku č. 10 je zobrazena aktivace SRE5 transientní transfekcí pFA-MEKl.

Příklady provedení vynálezu

Příklady 1 a 2 popisuje zavedení plazmidové DNA exprimující βgalaktozidázu a Egr-1 pomocí genového děla do kůže hlodavců, přičemž uvedená DNA tvoří komplex se zlatými částicemi.

a) Příprava potrubí

Zařízení pro přípravu potrubí se umístilo do sterilní digestoře s laminárním odtahem vzduchu a vytřelo se 70 % I.M.S. a sušilo se na vzduchu v digestoři. Plynové potrubí od válce s dusíkem ke zařízení pro přípravu potrubí se sterilizovalo v autoklávu a vložil se filtr Gelman o velikosti pórů 0,2 μιη. Autoklávované potrubí se spojilo s vtokovým otvorem pro plyn na přípravném zařízení luerovým konektorem a plyn se nechal protékat rychlostí 0,2 litry/minutu, aby se potrubí zcela vysušilo.

• · • 9

Potrubí pro zavedení částic se připojilo k přípravnému zařízení a plyn se nechal protékat, aby zcela vyschl vnitřek trubek. Zbytková vlhkost v trubkách vznikla na základě slabého nebo nedokonalého nanesení zlatých částic na stěny trubek a může negativně poškodit výstupní data experimentu.

b) příprava mikronosičových zlatých částic s DNA:

Zlaté částice o velikosti 1,0 μπι se získaly od firmy BioRad UK. Alikvot zlatých částic (53 mg) se odvážil do mikrocentrifugační zkumavky a přidalo se 100 μΐ 0,05 M spermidinu a zkumavka se jemně míchala na vortexu.

Přidalo se 100 μΐ roztoku DNA, který obsahuje 100 až 120 μρ plazmidové DNA exprimující buď Egr-1 nebo β-galaktozidázu, pak se za stálého míchání na vortexu po kapkách přidalo 100 μΐ 1M roztoku CaCl2· Tato směs se nechala stát po dobu deseti minut při teplotě místnosti a pak se centrifugovala. Odstranil se supernatant pelet zlatých částic se promyl třikrát v absolutním EtOH.

Zlaté částice se nakonec resuspendovaly v absolutním etanolu, který obsahuje 0,1 mg/ml polyvinylpyrolidonu (PVP).

Odhad potahovací účinnosti DNA na zlaté mikronosiče a uvolnění ve vodném roztoku: U všech vzorků (počáteční materiál, supernatant po srážení, tvorba komplexů DNA/zlato a eluovaný materiál) se testovala přítomnost DNA za použití testu GeneQuant (Pharmacia). Zbytková DNA po precipitaci udává míru nevázaného materiálu a poměr vázaného ku počátečnímu materiálu dává účinnost potahování.

c) nanesení suspenze DNA/mikronosič do potrubí pro zavedení zlata:

• 0 • 00 • 000 0 b8 • ·· · «

Suspenze zlatých částic ve směsi etanol/PVP se pak nanesla do zaváděcího potrubí za použití stříkačky a suspenze se nechala stát po dobu 3 až 5 minut v potrubí. Během této doby se částice srážely na vnitřním povrchu potrubí, což umožní, že se etanol odstraní stříkačkou. Když se měl etanol odstranit, potrubí se otáčelo a částice se distribuovaly na vnitřním povrchu potrubí. Po 2 až 3 minutách otáčení dusík prošel skrz potrubí rychlostí 0,1 litrů/minutu, aby se odstranil zbylý etanol a aby se zlaté částice nechaly adherovat. Po 10 minutách se potrubí vyňalo, nařezalo se na vhodné délky za použití nože, který poskytuje firma Bio-Rad UK) a nařezané potrubí se v neslo do genového děla.

Exprese Egr-1 a aktivita se stanovila za použití standardní imunohistochemie s běžně dostupnými protilátkami za účelem detekce Egr-1 (Santa Cruz) a 1 až 7 dní se monitorovala produkce a exprese Egr-1 cílového genu (Santa Cruz nebo R plus D systémy). Negativní kontrola neobsahovala DNA.

Příklad 1: Zavedení DNA Egr-1 do nepoškozené kůže hlodavce

1.1 Způsoby

Exprese plazmidů obsahujícího cDNA Egr-1 řízená z promotoru lidského cytomegaloviru (hCMV, popisuje se v publikaci Houston et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 19, 281-289, 1999) se zavedla do zad neporaněných myší prpstře.dh.i.pfeyim technologie genového děla. Komplexy zlato/DNA se připravily způsobem, který se popisuje shora v textu a 0,5 až 1,0 pg DNA se zavedlo do jednoho zvířete za použití genového děla za tlaku 2,45 MPa a zlatých částic o velikosti 1,6 mikrometrů. Zvířata se usmrtila v den 0, 1, 2 a 6 po zavedení DNA a kůže se uložila do OTC a rychle se zmrazila ve směsi suchého ledu/hexanu. Připravily se sekce o tloušťce 0,7 pm a cílové růstové faktory Egr-1 se testovaly imunologickým • · • · ··· ♦ ·

barvením za použití protilátek řízených proti VEGF, PDGF A, TGF β a Egr-1.

1.2 Výsledky

Imunohistochemická data jsou zobrazena v případě Egr-1 aktivace VEGF (obrázky č. la a lb), TGF β (obrázky č. lc a Id) a PDGF A (obrázky č. le a lf) . Výsledky vykazují dramatickou pozitivní regulaci proteinu VEGF v den 1 a 2 upadající v den 6, pozitivní regulaci TGFb v den 6, ale nikoli v dny 1 a 2 a rychlou pozitivní regulaci PDGF A dvě hodiny po zavedení DNA Egr-1 (označeno jako den 0).

1.3 Závěr

Tyto data potvrzují, že Egr-1 může aktivovat expresi cílových růstových faktorů in vivo. Tato data ilustrují, že aktivace Egr-1 růstových faktorů se objevuje na dočasně oddělené časové ose.

Po potvrzení aktivace cílových genů Egr-1 za použití neporaněné kůže hlodavců (příklad 1) , se provedlo zavedení genů Egr-1 a β-galaktozidázy do vyříznutých ran krys pomocí genového děla za účelem zjištění účinku Egr-1 na rychlost hoj ení.

Příklad 2: Použití transkripčního faktoru Egr-1 za účelem podpořit hojení ran u hlodavců

2.1 Metody

2.1.1 Konstrukce plazmidů

V této studii se používaly expresívní plazmidy CMV řízené β-gaiaktozidázou a Egr-1 (popisuje se v publikaci Houston et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 19, 281-289, 1999).

♦ «9 9« 9 •••9 9 · 9

9 · « 9 9 9

Λ' Μ · ··· · · 9999

OU · · · 9 9 ··· ·· 99 ·

Plazmidy se pomnožily v bakteriích Escherichia coli XL-2 Blue MR a DNA se připravila za použití kitu Qiagen.

2.1.2 Transfer genu zprostředkovaný částicemi krys Sprague Dawley, které mají tělesnou hmotnost 250 g se uspaly izofloranem ve směsi 2:1 kyslík/oxid dusíku. Na hřbetě krys se připravily dvě místa pro transfekci (8 cm od lebky, 1,5 cm na obou stranách páteře) a to tak, že se nejdříve secvakla kůže a pak se prořízla žiletkou. V jednom místě poranění 8 mm stranou se provedly dvě transfekce urychlenými komplexy DNA/zlaté částice buď s Egr-1 nebo βgalaktozidázou do kůže při tlaku 2,45 MPa. Celkové množství DNA bylo menší než 1,7 pg na jednu transfekci (3,4 pg na jednu ránu) .

2.1.3. Model hojení řezných ran hodin po transfekci se zvíře uspalo a připravily se 2 rány plné šířky (8 mm v průměru) za použití žiletky na biopsie ve skutečném místě transfekce (popisuje dále v textu). Bezprostředně po přípravě ran se každá rána zašila za použití sady kamera/video a zvíře se nechalo zotavit z anesteze. -2., 4 a 6 den po vytvoření ran se 6 zvířat usmrtilo a každá rána se zašila za použití stejné sady kamera-video. Rány se pitvaly a následuje odebrání vzorků pro histologii a imunohistochemii.

2.1.4 Analýza hojení

i) Makroskopické hodnocení

Plocha poranění se stanovila za použití analýzy zobrazení a hojení se exprimovalo jako zvětšení původní plochy rány. Statistická významnost rozdílů mezi ošetřenými a kontrolními skupinami se hodnotila za použití testu Mann-Whitney.

ii) Mikroskopické hodnocení ♦♦ 00 0 • · · · « • · · 0 0 0

000 00 0 0000 •••0

Histologická analýza:

Každá rána v určitém časovém bodě se po vyříznutí horizontálně rozpůlila. Jedna polovina se umístila do 4% formaldehydu po dobu 24 hodin a zpracovala se pro histologickou analýzu za použití vosku. Z každé rány se nařezaly sekce o tloušťce 5 pm za použití mikrotomu a sekce se barvily podle van Geisona. Za použití uvedeného histologického barviva se hodnotily klíčové markéry hojení ran zahrnující obnovu epitelu a obsah kolagenu a tyto markéry se porovnávaly « mezí kontrolními a ošetřenými sekcemi.

Imunohistochemie:

Imunologická cytochemická analýza se provedla za účelem kvantifikovat rozdíly za použití histologie. Po zamrazení v OCT se druhá polovina každé rány rozdělila na sekce o tloušťce 7 pm za použití kryostatu. Dvě sekce z každé rány se fixovaly v acetonu chlazeném ledem a provedlo se fluorescenční imunologické barvení kolagenu I a faktoru von Willebrand (vWF). Bezprostředně po imunologickém barvení se každé sklíčko umístilo pod fluorescenční mikroskop a plocha rány se sešila za použití 25x zvětšení. Obraz se integroval a stanovil se pás citlivosti, aby se minimalizovalo pozadí. Plocha a intenzita barvení se měřila za použití analýzy obrazu a vynesla se do grafu. Statisticky významné rozdíly mezi ošetřenou a kontrolní skupinou se hodnotily za použití Man-Whitney testu bez parametrů.

2.2 Výsledky

2.2.1 Účinek Egr-1 na hojení řezných ran u krys (i) Stažení rány

Plná tloušťka krysích řezných dermálních ran, což je 8 mm v průměru, se stáhla zjevně rychleji následkem odezvy na

9 · • 9 9 9 • 99999 • 9 9

9 • 9 · 9 · 9 *99 ·

9 9 • * 9 9 9 transfekci Egr-1 ve srovnání s kontrolou (β-galaktozidáza) až do 6-tého dne po vytvoření rány. Statisticky podstatné zvýšení stáhnutí (p<0,05) se objevilo 6 dní po vytvoření rány, přičemž rány ošetřené Egr-1 se smrštily na plochu o 7 % menší než v případě kontroly (Obrázky č. 2a).

ii) Histologická analýza

Sekce ran obarvené podle van Gieson vykazují velké rozdíly v histologii ran 4 až 6 dní po vytvoření rány. Druhý den po vytvoření rány existoval malý rozdíl mezi ránami transfekovanými Egr-1 a β-galaktozidázou. Při obou typech léčby existují v místě poranění mononukleární buňky, které indikují časnou zánětlivou odezvu s vytvořením strupu, ale nedochází k opětnému vytvoření epitelu. 4 dni po vytvoření epitelu se rány zcela nezhojily, ale rány transfekované Egr-1 měly více kolagenu ve srovnání s místem poranění transfekovaným βgalaktozidázou. 6 dní po té, co se rány ošetřily Egr-1, vykazovaly více zralou granulovanou tkáň, která vykazuje znatelné více kolagenu v místě poranění ve srovnání s βgalaktozidázou až do rozsahu, kdy je možné jasně vidět tenká vlákna kolagenu. Obnova epitelu je dokončena u 50 % poranění ošetřených Egr-1 ve srovnání s 0 % β-galaktozidázy. Z hlediska histologie rány ošetřené Egr-1 vykazují zrychlené hojení ve srovnání s β-galaktozidázou (obrázek č. 2b).

(iii) kvantifikace účinku Egr-1 na ukládání kolagenu za použití analýzy imunohistochemie a analýzy zobrazení:

Imunologické barvení kolagenu I se uskutečnilo za použití cryosekcí ran o tloušťce 7 gm, které se ošetřily Egr-1 nebo βgalaktozidázou a barvení se kvantifikovalo za použití analýzy zobrazení. Poranění ošetřená β-galaktozidázou vykazovaly podstatné více kolagenu 2 dni po vytvoření rány ve srovnání s Egr-1. 4 a 6 dní po transfekci rány Egr-1 se v ranách začalo • ♦ 99» • · ··· ·· • · • · · • ··· · » » · ·· · ukládat více kolagenu než v kontrolách (β-galaktozidáza), což potvrzuje zjištění za použití rutinních histologických metod s voskem. Transfekce Egr-1 zvýšila množství ukládání kolagenu čtyři až dní po vytvoření ran (obrázky č. 2c) .

(iv) Kvantifikace účinku Egr-1 na angiogenezi za použití imunohistochemické analýzy a analýzy zobrazení:

Angiogeneze se kvantifikovala za použití imunologického barvení von Willenbrandova faktoru za použití kryosekcí ran a analýzy zobrazení za účelem měření plochy pozitivního barvení v místě poranění. Dva dni po tranfekci Egr-1 rány vykazovaly podstatně větší množství krevních cév (hodnota p je méně než 0,01) ve srovnání s kontrolou (β-galaktozidáza). 4 a 6 dní po transfekci Egr-1 a β-galaktozidázou se dosáhlo podobného stupně angiogeneze. Transfekce DNA exprimující Egr-1 vykazuje angiogenezi o dva dni dříve β-galaktozidázou. Transfekce DNA exprimující Egr-1 podporuje angiogenezi o dva dni později než v případě kontroly (obrázek č. 2d).

2.3 Závěry

Transfekce Egr-1°řezných ran u krys zrychlila hojení zvýšení rychlosti zacelení, obnovení epitelu a ukládání kolagenu. Transfekce Egr-1 také podporuje angiogenezi dva dni po vytvoření rány.

Příklad 3: Použití transkripčního faktoru Egr-1 za účelem podpory angiogeneze

3.1 Metody

Egr-1 řízený promotorem hCMV (popisuje se v publikaci

Houston et al., Aretrioscler. Thromb. Vasc. Biol., 19, 281289, 1999) se transfekovala do systému ko-kultur lidských buněk, aby se stanovila míra angiogeneze in vitro. Sada pro angiogenezi (TCS Biologicals) se použil způsobem, jak popisuje • ·

9 ·

9 9 9«

9 ··« « • 9 • 99 99 výrobce za použití proteinu VEGF (2 ng/ml) a suraminu (20 μΜ) jako pozitivních a negativních kontrol v případě angiogeneze.

Optimalizace transfekce v systému ko-kultur se uskutečnila za použití pGL3 kontrolní luciferázy (Promega) s 1,0 gg a 0,5 gg CMV-β gal, jako normalizačního plazmidu vhodného pro řízení transfekce. Použily se dva poměry lipid:DNA (objem/hmotnost) , 2:1 a 4:1 (obrázek č. 3a) . DNA CMV Egr-1 se transfekoval v množství 0,5, 1,0 a 1,5 a 2,5 gg na jednu prohlubeň ve třech provedeních na mikrotitrační destičce s 24 prohlubněmi za použití činidla Mirus Transit (Cambridge Biosciences) v poměru s DNA 2:1 (objem/hmotnost). Do prohlubní se přidal jako pozitivní kontrola protein VEGF a jako negativní kontrola suramin. Po 11 dnech ko-kultivace se stanovila angiogeneze barvením endoteliálního buněčného markéru PECAM-1 a vizualizací substrátu BCIP/NBT.

Zaznamenávalo se reprezentativní zobrazení tvorby tubulu za použití všech čtyř dávek expresívního plazmidu Egr-1 spolu s proteinem VEGF (pozitivní kontrola) a suramin (negativní kontrola) a zpracovávalo se analýzou zobrazení za použití analyzátoru zobrazení Quantimet 600 a vhodného software.

3.2 Výsledky

Angiogeneze popsaná tvorbou tubulů viditelná světelným mikroskopem se detekovala po 11 dnech společné kultivace. Angiogenní skóre se prezentuje jako analýza zobrazení, uvedené v celé buňce a výsledky se prezentují jako tubuly na jednotku plochy verzus ošetření (obrázek č. 3b).

Buňky ošetřené proteinem VEGF vykazují zvýšenou tvorbu tubulů (buňky ošetřené proteinem suramin a zvýšená tvorba tubulu). Ukázalo se, že Egr-1 vykazuje zvýšenou tvorbu tubulů způsobem v závislosti na inverzní dávce.

0

0

0 • 0

0··· *0

0 0 0

000

3.3 Závěry

V ko-kultivačním systému je exprese transkripčního faktoru Egr-1 angiogenní. Tuto skutečnost podporují data z příkladu 1, přičemž se ukázalo, že Egr-1 pozitivně reguluje expresi růstového faktoru (například VEGF), když se zavede do myší kůže genovým genem a dále data z příkladu 5, kde transfekce Egr-1 vykazuje zvýšené množství VEGF produkovaného v buňkách lidského vaskulárního hladkého svalstva. Inverzní dávková odezva Egr-1 jako pro-angiogenní stimul je konsistentní s výsledky získanými v příkladu 6 a s představou, že Egr-1 může negativně regulovat jeho vlastní produkci (popisuje se v publikaci Cao, X. et al., J. Biol. Chem. 268, 16949-16957,

1993, Schwachtgen, J.-L. et al. , J. Clin. Invest., 101, 2542549, 1998) .

Příklad 4: Použití transkripčního faktoru za účelem podpořit osteogenezi in vitro

4.1 Aplikace do kostí a stanovení růstových faktorů

4.1.1 Metody:

Používané buňky byly TE85, což je buněčná linie podobná osteoblastům získaným z osteosarkomu. Sub-konfluentní buněčné vrstvy se trypsinizovaly a resuspendovaly v DMEM, které obsahuje 10 % zárodečné telecí sérum (FCS) a 1% penicilinstreptomycin (PS). Buněčná suspenze se vysela na substrát (čtverec plastu upraveného pro tkáňovou kulturu o rozměrech 18x18 mm) . Buňky se nechaly zachytit přes noc. Když se buňky zachytí na substrátu přenesou se do nádoby, která obsahuje DMEM s 2 % FCS a 1% PS, kde se nechají v klidu po dalších 24 hodin, aby došlo ke stimulaci.

Na obrázku 4a jsou zobrazeny čtyři sady podmínek pro každý časový okamžik:

(1) nanesení (200 cyklů 2 000 mikrořetězců pří rychlosti 3

232 mikrořetězců za vteřinu).

* ·♦ ·

2)	Kontrola	(není nanesena)
3)	pozitivní	kontrola (100 ng/ml PMA po dobu 1 hodiny)
4)	rozpustná	kontrola.
	V případě	nanesení buněk se buňky asepticky přenesly ze

standardní tkáňové kultury do komory. Trvání nanesení buněk do komory je 4 minuty. Po nanesení se buňky vrátily do svých původních kultivačních podmínek. Kontrolní ošetřené buňky se ošetřily skutečně stejným způsobem s tou výjimkou, že nedošlo k nanesení do komory.

Výsledky se analyzovaly dvěma různými způsoby. Nejdříve se stanovila přítomnost transkripčního faktoru Egr-1 analýzou buněčného peletu Westernovým přenosem. Buněčné pelety se shromáždily po nanášecích experimentech (Obrázek č. 4b).. Za druhé se stanovila přítomnost vylučovaných růstových faktorů testem ELISA média pro tkáňové kultury (obrázek č. 4C).

4.1.2 Závěry

Tyto výsledky zobrazují za podmínek vnesení do kostí, že transkripční faktor Egr-1 se produkuje v buňkách podobných osteoblastům získaných z lidského osteosarkomu. Aplikace vnesení v případě lidských buněk TE85 stimuluje produkci a vylučování růstových faktorů, kterým je například PDGF B.

4.2 Transfekce CMV TGF-βΙ do MC3T3E1 a buněk ROS, přičemž pak následují testy ELISA lidských TGF-βΙ a myších VEGF v supernatantech buněčných kultur.

4.2.1 Materiály:

(í) Transfekce

Myší osteoblastové buňky (MC3T3E1) a buňky krysího osteoblastomu (ROS17/2.8) se použily k výsevu na plotnách se 6 prohlubněmi.

Buňky MC3T3E1 se kultivovaly v kuktivačním médiu MEM-a (Sigma), 10 % zárodečném telecím séru (Life technologies), 1%

L-glutaminu (Life Technologies), 1 % penicilin-streptomycinu (Life Technologies) .

Buňky ROS se kultivovaly v F12 HAM, F-12 HAM s glutaminem (Life Technologies), 10 % zárodečném telecím séru (Life

Technologies), 1% penicilin-streptomycinu (Life Technologies).

Buňky se transfekovaly za použití Fugene (Boehringer

Mannheim) s plazmidem exprimujícím CMV TGF-βΙ, jak se popisuje v publikaci Benn, S.I. et al., J. Clin. Invest., 98, 28942902, 1996) . Transfekce do buněk se provedla popsaným způsobem:

1) Připravila se destička s 6 prohlubněmi, kdy v každé je 2 x 10⁵ buněk a nechala se stát přes noc, až se dosáhlo konfluentnosti 50 až 70 %.

2) Další den se přidalo 94 μΐ kultivačního média bez séra (SFM) a do každé zkumavky Eppendorf se přidalo 6 μΐ přípravku Fugene a nechaly se stát při teplotě místnosti po dobu 5 minut.

3) Ze 6 oddělených zkumavek se do 2 zkumavek nedala žádná DNA, zatímco do zbývajících 4 se přidaly 4 pg DNA CMV-TGF-βΙ.

4) Směs. popsaná v kroku 2) fugene/SFM se po kapkách přidávala do zkumavek popsaných v odstavci 3), zkumavky se několikrát obrátily a inkubovaly se po dobu 15 minut při teplotě místnosti.

5) Transfekční směs fugene/SFM/DNA se přidala po kapkách do každé daných prohlubní, zatímco se míchala destička se 6 prohlubněmi. Destička se inkubovala při teplotě 37 °C po dobu 48 hodin.

6) Supernatanty buněčné kultury se rozdělily do alikvotů a uchovávaly se při teplotě -20 °C. Shora popsaný protokol se provedl v případě obou druhů buněk MC3T3E1 a ROS.

¹ · · « · · > · · · · · · ·*· · · flflfl·· · · btí

Přítomnost TGF-βί a VEGF v supernatantu buněčné kultury se detekovala testem ELISA (R plus D Systems) za použití barevného detekčního systému založeném na použití strepatividin-HRP.

4.2.2 Výsledky:

Produkce a detekce TGF-βί a VEGF po transfekci CMV-TGF-βΙ je zobrazena v případě buněk ROS (obrázek č. 3) a v případě buněk MC3T3E1 (Obrázek č. 4). Tato data ukazují, že cílový gen Egr-1 v tomto příkladu TGF-βί, aktivuje produkci VEGF.

4.3 Závěr

Exprese Egr-1 a aktivace cílových genů Egr-1 může synergisticky aktivovat VEGF.

Příklad 5: Použití transkripčního faktoru Egr-1 za účelem podpořit osteogenezi in vivo

5.1 Tvorba ektopických vazeb u krys

Podkožní implantace sloučenin indukujících možnou vazbu u hlodavců reprezentuje biologický testovaný systém (popisuje se v příkladu Wozney, J.M., Cell. Mol. Biol., 131-167, 1993).

Použití nosičové matrice zvyšuje reprodukovatelnost a citlivost vazebné indukční odezvy. V systému testů (popisuje se v publikaci Reddi, A.H., et al., Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 69, 1601-1605, 1972, Sampath, T.K. ibid, 78, 7599-7603,

1981) se nosičová matrice získala diafyseální části krysích dlouhých kostí, které se nařezaly na části o určité velikosti, následně se demineralizovaly a biologická aktivita se odstranila extrakcí guanidinem. Zbývající nosič obsahuje primárně vázaný kolagen bez osteoinduktivní kapacity. Testovaná sloučenina nebo látka se pak ukládá do matrice srážením s alkoholem, dialyzovala proti vodě nebo se lyofilizovala. Tato matricová kombinace se pak implantovala do z · · · · · a z*· · · · * · • ··· · · » _e ;

• · · · · * ·· * ·* · a podkožních tkání krysy po řadu dní (v případě experimentu je to 12 dní) . U implantátů se pak uvedeného testovala histologicky a biochemicky jejich schopnost indukovat tvorbu kostí (popisuje se v publikaci Sampath, T.K. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80, 6591-6595, 1983, Sampath, T.K. et al., ibid, 84, 7109-7113, 1987, Wang, E. ibid, 85, 9484-9488,

Wang, E. et al., ibid, 87, 2220-2224, Sampath, T.K. et al., J. Cell Biol., 98, 2192-2197, 1984).

5.1.1 Experimentální metody

Připravilo se 20 samců krys Sprague Dawley (věk 42 až 49 dní, hmotnost 170 až 220 g) . Vybraly se náhodně, aby se jim aplikovaly dva implantáty zavedené pod kůži do dorzálního thoraxu při anestezi halothanem. Implantáty se ošetřily jedním ze čtyř ošetření:

• negativní kontrola - samotný nosič (demineralizace kostní matrice DGBM extrahované guanidinem) • DNA CMV Egr 1, 500 qg na nosiči DGBM • DNA CMV Egr 1, 500 qg plus rekombinantní kostní morfogenetický protein (BMP) 4, 5 μς na nosiči DGBM, (BMP4 se používá pro jeho chemotaktické účinky) • rekombinantní protein BMP4, 5 qg na nosiči DGBM

Den začlenění se označil jako den 0 a o 12 dní později se se operativně všechny krysy usmrtily za použití upravené metody, odstranily se implantáty, odstranila se měkká tkáň a rozdělily se na stejné poloviny. Jedna polovina se umístala do 10 % formalinu za účelem histologického testování a další polovina se zamrazila a skladovala se při teplotě -20 °C. U tohoto vzorku se pak testoval obsah vápníku a aktivita alkalické fosfatázy.

5.1.2 Příprava demineralizovaných kostí u krys

Odstranila se střední část femuru, tibie a humerus dospělých krys Sprague Dawley, odstranila se měkká část a

Φ99 • · • · ··· *·

9 • 9 9 • 9 9 9 ·· 9 9999 9 «99 99 · ·

9

9

9

999 morkové dutiny se vypláchly normálním fyziologickým roztokem. Z kostí se pak odstranil tuk mícháním ve 100 ml směsi chloroform:metanol (2:1) po dobu 30 minut. Tento krok se opakoval ještě jednou a pak následovalo sušení na vzduchu v sušárně. Střední části kostí se pak zmrazily v kapalném dusíku pulverizovaly se na CRC mikro-mlýnku. Výsledný prášek se prosel, aby se zachytily diskrétní velikost částic 75 až 425 μπι a pak se demineralizoval v 0,5 M HCI po dobu 3 hodin za stálého míchání. Směs se pak centrifugovala po dobu 30 minut při 190 000 ot./min. (Kontron CentriksT124, Rotor A8.24) při teplotě 15 °C. Pelet se resuspendoval ve 100 ml vody, míchal se po dobu jedné hodiny a centrifugoval se. Tento krok se pak opakoval. Pelet se pak resuspendoval ve 100 ml etanolu, míchal se po dobu jedné hodiny a centrifugoval se. Etanol se odpařil a vzorek se resuspendoval ve směsi 4M guanidinhydrochlorid/50 mM Tris, pH7,4 a míchal se přes noc. Další centrifugace se provedla s peletem resuspendovaným v 50 ml vody míchané po dobu jedné hodiny a centrifugovaným. Tento krok se dále opakoval dvakrát. Vzorek se pak sušil přes noc v sušárně. Mechanickým mícháním a lyofilizací se přidala ke kostem DNA.

5.2 Histologické zkoumání

Po počátečním fixování ve formalinu se vzorky zalily do methylmethakrylátu a nařezaly se sekce o tloušťce 1 μΜ a obarvily se podle von Kossa a toluidinovou modří. Z každého implantátu se hodnotily tři sekce, které spolu nesousedí.

V případě chrupavek a kostí se použil standardní skórovací systém.

± tentativní identifikace kosti nebo chrupavky

1.	>10	O. Ό	každé	sekce	nové	chrupavky	nebo	kosti
2.	>25	O, Ό	každé	sekce	nové	chrupavky	nebo	kosti
3.	>50	o, O	každé	sekce	nové	chrupavky	nebo	kosti
4.	>75	Q. Ό	každé	sekce	nové	chrupavky	nebo	kosti

• ·

5. >80 % každé sekce nové chrupavky nebo kosti

5.3 Biochemický test

Tkáň se homogenizovala ve 2 ml ledem chlazené směsi 0,25 M sacharózy a 3 mM NaHCCb. Homogenáty se centrifugovaly při 12 000 g po dobu 15 minut ve dvou stupních centrifugace a za účelem enzymatického testu se shromáždily suspernatanty. Aktivita alkalické fosfatázy se stanovila za použití colorimetrického testu s p-nitrofenylfosforečnanem (PNP), jako substrátem. Po inkubaci testovaných vzorků s PNP při teplotě 37 °C se stanovila optická hustota při vlnové délce 405 nm na čtecím zařízení pro standardní mikrotitrační destičky.

5.4. Výsledky

Výsledky jsou uvedeny na obrázku č. 5. Analyzovala se data získaná při ošetření dvou implantovaných nezávislých míst v případě každé krysy. Vzhledem k malému množství dat a asymetrické distribuci dat se prezentuje střední hodnota a vnitřní kvartilové rozmezí (IQR). Testy podle Kruskal Wallise se provedly na shora provedených proměnných a zjistilo se, že množství alkalické fosfatázy se vzájemně podstatně liší.

Tvorba kostí byla pozitivní v případě jednoho implantátu v případě pěti implantovaných míst pouze v jedné skupině (CMV Egr-l DNA/BMP). Počáteční experiment použil jediný časový bod v případě testu trvajícím 12 dní, který se vybral, aby se získaly předpokládané výsledky. V tomto časovém okamžiku se podstatně hodnotí aktivita alkalické fosfatázy u DNA CMV Egr-l a CMV Egr-l DNA/BMP4. Takové dočasné zvýšení aktivity alkalické fosfatázy je možné vidět v typickém případě (jako prekurzor při tvorbě kostí) se sloučeninami, jako je BMP, které stimulují tvorbu kostí maximálně 10 až 15 dní a pak klesá. Obsah vápníku ve vzorcích nevykazuje podstatné rozdíly, ačkoli se pozorovala časná kalcifikace u řady histologických

vzorků ve skupině CMV-Egr-1/BMP4. To je možné vysvětlit plánovanými biopsiemi v době, kdy právě začala kalcifikace.

5.5 Závěr

Egr-1 zvyšuje sílu alkalické fosfatázy v modelu hlodavců při tvorbě ektopických kostí a může podporovat lokalizovanou tvorbu kostí.

Příklad 6: Použití transkripčního faktoru při podpoře opětné endotelizace po perkutánní transluminární koronární angioplastice in vitro.

6.1 Metody

Buňky lidského nebo prasečího vaskulárního hladkého svalstva (SMC, Clonetics) se rozmrazily a udržovaly se v kultivačním médiu a prošly 4 pasážemi podle instrukcí výrobce. SMC se transfekovaly expresívním plazmidem, který obsahuje cDNA Egr-1 exprimovanou z promotoru CMV Houston et al. , Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 19, 218-289, 1999). DNA exprimující Egr-1 se transfekovala do SMC za použití fugene (Boehringer Mannheim) po optimalizaci SMC s kontrolou, kterou je lucifarázový reportní vektor pGL3 (Promega) nebo Mirus Transit (Cambridge Biosciences), přičemž oba tranfekční f

protokoly používaly β-galaktozidázu jako normalizační plazmid vhodný pro kontrolu transfekce.

6.2 Výsledky

DNA CMV Egr-1 se transfekovala do lidských SMC a protein Egr-1 se detekoval imunohistochemií za použití polyklonálních protilátek (Santa Cruz) a detekcí peroxidázou (Sigma and Vector Laboratories). Lidské SMC se transfekovaly DNA CMV Egr1 (panel na pravé straně) nebo falešné transfekce (panel na levé straně) jsou zobrazeny na obrázku č. 6a. Prasečí SMC se transfekovaly DNA CMV Egr-1 (panel na pravé straně) a nebo

falešné transfekce se (panel na levé straně) jsou zobrazeny na obrázku č. 6b. Exprese proteinu Egr-1 je detekovatelná jako hnědé zbarvení. Optimalizace transfekce DNA se dosáhlo za použití fugene 6 (při další charakterizaci in vitro, obrázek č. 6c) a Mirus Transit (podstatné ve studii in vivo, obrázek č. 6d) . Na základě těchto dat se při experimentech aktivace růstového faktoru použily 4 pg DNA CMV-Egr-1, přičemž se použila směs lipid:DNA v poměru 3:1. Směs lipid : DNA v poměru 3:1 se také použije v experimentech při zavedení genu in vivo.

Aktivace Egr-1	tří růstových	faktorů	se analyzovaly
buněčné supernatanty	pomocí testu ELISA.	Produkce VEGF
(obrázek č. 6e), HGF	(obrázek č. 6f)	a PDGF-AB	(obrázek č. 6g)
se zvýšila jako odezva na aktivaci	Egr-1. Dochází k aktivaci
na základě dávky a k	inverzní odezvě	na dávku,	jak se popisuje
shora v textu. Jisté	koncentrace DNA (Egr-1)	jsou zobrazeny
v příkladu 3.
6.3 Závěr

Protein Egr-1 se exprimoval v SMC tramsfekovaných DNA CMV Egr-1. Transfekce Egr-1 zvýšila produkci/vylučování PDGF, HGF a VEGF získaných z SMC.

Příklad 7: Promotorové sekvence EGR-1

Fragment promotoru lidského Egr-1 nacházející se v poloze -674 až +12 se syntetizoval pomocí PCR v reakci obsahující 0,5 pg lidské placentám! genomové DNA, jako templátu, 0,4 mM dATP, dCTP, dGTP a dTTP, 25 pmol řpímého primerů (5'-GGC CAC GCG TCG TCG GTT CGC TCT CAC GGT CCC-3', (místo, které rozeznává restrikční enzym Mlul je podtrženo), 25 pmolů reverzního primerů 5' -GCA GCT CGA GGC TGG ATC TCT CGC GAC TCC-3' (místo, které rozeznává restrikční enzym Xhol je podtrženo), a DNA polymerázu Vent (NEB). Fragment PCR se štěpil restrikčními enzymy Mlul a Xhol, oddělil se na agarózovém gelu a klonoval • ·

se mezi místa, které rozeznávají restrikčním enzymy Mlul a Xhol ve vícenásobném klonovacím místě základního vektoru pGL3 (Promega).

Celá sekvence se získala následujícím doplněním mezer v publikované sekvenci. To je zobrazeno na obrázku č. 7, kde celá sekvence (GW SEQ) se porovnávala s dříve publikovanou sekvencí (ON SEQ) . Tato promotorové sekvence je funkční a zkoumala se při studiu stresu u endoteliálních buněk.

Důležitý rozdíl mezi publikovanou sekvencí promotoru lidského Egr-1 a sekvence, která se popisuje (na obrázku č. 8), leží v dříve neznámých SRE. Zatímco se publikovala, že sekvence SRE 5 a SRE 1 neváže faktor odezvy na sérum (SRF) a není funkční (Nurrish SJ, Treisman R, Mol Cell Biol 1995, 15(8):4076-85), zjistilo se, že jsou v souladu se sekvencí SRF (obrázek č. 7) .

Velký zájem je o sekvenci SRE5. Syntetizovala se nová sekvence SRE5 ve spojení s vazebnými místy transkripčního faktoru Ets ve formě dvouřetězcového oligonukleotidů a začlenily se do restrikčního místa Nhel proti směru přepisu genu minimálního promotorového vektoru SV40 (pSV40).

SRE5 má sekvenci:

AG

GCTGCGACCCGGAAATGCCATATAAGGAGCAGGAAGGATCCCCCCGCGC

G

CGACGCTGGGCCTTTACGGTATATTCCTCGTCCTTCCTAGGGGGGCGGCC

GA

Dvě místa Ets jsou zvýrazněna tlustým písmem a SRE je zvýrazněno podtržením. Přesah AG se používá ke klonování do částečně vyplněného restrikčního místa Nhe promotoru pGLE.

» 9

/5

Výsledný reportní plazmid pSVSRE5 se dočasně transfekoval do buněk HeLa spolu s plazmidy pFA-dbd (konstrukce kódující vazebnou doménu DNA Gal4 (dbd) nebo pFA-MEKl (konstrukce kódující fúzni protein vazebné domény DNA Gal4 (dbd) a domény kinázy kináza MAP kináza MEK1). Fúzni protein Gal4-MEK1 je stále aktivní a fosforyluje Elkl a SRF a váže se na SRE5.

Výsledky zobrazená na obrázku č. 10 ukazují, že izolovaná sekvence SRE5 se třínásobně aktivuje přítomností MEK1, zatímco pormotor SV40 vykazuje pouze minimální aktivaci.

Výsledky indikují, že nové SRE5 je funkční.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁ • · · · • · · · 0 · • · 0

   0 0· · · 0 roky která obsahuje sekvenci faktoru Egr-1 nebo její

   1. Použití molekuly nukleové kyseliny, kódující polypeptidy transkripčního biologicky aktivní fragment při výrobě léku vhodného pro ošetření ran u savců, kteří zahrnují člověka.
2. 2. Použití podle nároku 1, kde Egr-1 je lidské Egr-1.
3. 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde molekula nukleové kyseliny obsahuje uvedenou sekvenci kódující polypeptid transkripčního faktoru Egr-1 nebo její biologicky aktivní fragment operativně spojený se sekvencí nukleové kyseliny, která řídí expresi.
4. 4. Použití podle nároku 3, kde sekvence nukleové kyseliny, která řídí expresi:

   a) vykazuje řetězec obsahující sekvenci uvedenou na obrázku č. 7 v případě GW SEQ nebo

   b) vykazuje řetězec obsahující jednu nebo více deleci, inzercí a/nebo susbtitucí příbuzných GW SEQ, ale neobsahuje sekvenci zobrazenou na obrázku č. 7 jako ON SEQ a která také neobsahuje sekvenci zobrazenou na obrázku č. 9.
5. 5. Použití podle libovolného z předchozích nároků, kde molekula nukleové kyseliny je sestavena tak, aby byla vhodná pro aplikaci savci fyzikálními způsoby.
6. 6. Použití podle nároku 5, kde molekula nukleové kyseliny je sestavena tak, aby byla vhodná pro aplikaci savci bombardováním částicemi.
7. 7. Použití podle nároku 6, kde molekula nukleové kyseliny se imobilizuje na zlatých částicích.
8. 8. Použití podle nároku 5, kde molekula nukleové kyseliny je sestavena tak, aby se aplikakovala mikrovýsevem.
9. 9. Použití podle libovolného nároku 1 až 9, kde molekula nukleové kyseliny je ve vektoru.

   • 9
10. 10. Použití podle nároku 9, kde molekula nukleové kyseliny je v buňce.
11. 11. Molekula nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující polypeptid transkripčního faktoru Egr-1 nebo jeho biologicky aktivní fragment vhodný pro použití při ošetření ran.
12. 12. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že zahrnuje molekulu nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující polypeptid transkripčního faktoru Egr-1 nebo její biologicky aktivní fragment spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči.
13. 13. Způsob ošetření ran u savců, kteří zahrnují člověka, vyznačující se tím, že obsahuje způsob aplikace savci molekuly nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující polypeptid transkripčního faktoru nebo jeho biologicky aktivní fragment.
14. 14. Použití polypeptidu transkripčního faktoru Egr-1 nebo jeho biologicky aktivního fragmentu při výrobě léku pro ošetření ran u savce, který zahrnuje člověka.
15. 15. Použití podle nároku 14, kde Egr-1 nebo jeho biologicky aktivní fragment se produkuje přirozeně, synteticky nebo rekombinantně.
16. 16. Použití podle nároku 14 nebo 15, kde Egr-1 je lidské Egr1.
17. 17. Polypeptid transkripčního faktoru Egr-1 nebo jeho biologicky aktivní fragment vhodný pro použití při ošetření ran.
18. 18. Způsob ošetření ran u savce zahrnující člověka, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci savci terapeuticky účinné množství polypeptidu transkripčního faktoru nebo jeho biologicky aktivního fragmentu.

    Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje transkripční faktor Egr-1 nebo / o • · · • · · · ·

    a)

    b)

    c) jeho biologicky aktivní fragment spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči.

    Molekula nukleové kyseliny, která vykazuje řetězec obsahující sekvenci uvedenou na obrázku č. 7 v případě GW SEQ, řetězec obsahující jednu nebo více delecí, inzercí a/nebo susbtitucí příbuzných s GW SEQ, ale neobsahuje sekvenci uvedenou na obrázku č. 7 jako ON SEQ a která také neobsahuje sekvenci uvedenou na obrázku č. 9 nebo řetězec, jenž hybridizuje s řetězcem, jak se popisuje v odstavci a) nebo b) shora v textu.

    Molekula nukleové kyseliny podle nároku 20, která obsahuje jeden nebo více elementů odezvy na sérum (SRE).

    Molekula nukleové kyseliny podle nároku 21, která obsahuje sekvenci uvedenou na obrázku č. 7 jako SRE 5 v případě GW SEQ nebo její funkční variantu.

    Molekula nukleové kyseliny podle nároku 22, kdy uvedená varianta výkazuje alespoň jeden z rozdílů nukleotidů přítomných v GW SEQ SRE 5 ve srovnání s ON SEQ SRE 5 zobrazené na obrázku č. 7.

    Molekula nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 23, která obsahuje elementy odezvy na sérum uvedené na obrázku č. 7 jako SRE3 a SRE4 nebo jeho funkční variantu.

    Molekula nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 24, která obsahuje TATA box.

    Molekula nukleové kyseliny podle nároku 25, kde TATA box obsahuje sekvenci AAATA.

    Molekula nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 26, která obsahuje vazebné místo Egr-1 (EBS).

    Molekula nukleové kyseliny podle nároku 27, kde vazebné místo Egr-1 má sekvenci zobrazenou na obrázku č. 7 v případě GW SEQ jako EBS nebo vykazuje variantu uvedené sekvence.

    fl · • fl · ·· • · · · · · · • · * · · · flfl ··· flfl · ···· « > · ····· ·· · flfl

    Molekula nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 28, kde uvedená varianta vykazuje omezenou afinitu pro Egr-1 ve srovnání se sekvencí zobrazenou jako EBS na obrázku č. 7 v případě GW SEQ.

    Molekula nukleové kyseliny podle nároku 29, kde uvedená varianta obsahuje sekvenci zobrazenou na obrázku č. 2 v případě EBS.

    Molekula nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 26, která neobsahuje vazebné místo Egr-1.

    Molekula nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 31, která obsahuje sekvenci schopnou vázat Spi.

    Molekula nukleové kyseliny podle nároku 32, která obsahuje dvě sekvence schopné vázat Spi.

    Molekula nukleové. kyseliny podle nároku 32 nebo 33 obsahující jednu nebo obě sekvence vázající Spi zobrazené na obrázku č. 7 v případě GW SEQ.

    Molekula nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 34, která obsahuje element odpovídající na cAMP.

    Molekula nukleové kyseliny podle nároku 35, která obsahuje alespoň jeden element odpovídající na cAMP zobrazený na obrázku č. 7 v případě GW SEQ jako cAMP RE.

    Molekula nukleové kyseliny podle nároku 35 nebo 36 obsahující nejdříve cAMP RE zobrazený na obrázku č. 7 v případě GW SEQ.

    Molekula nukleové kyseliny obsahující všechny sekvence uvedené v rámečcích na obrázku č. 7 v případě GW SEQ s možnou výjimkou sekvence EBS.

    Molekula nukleové kyseliny obsahující variantu molekuly uvedenou na obrázku č. 7 v případě GW SEQ, která je schopna zesílit transkripci Egr-1 ve srovnání s molekulou uvedenou na obrázku č. 7 v případě GW SEQ.

    40. Molekula nukleové kysekiny obsahující variantu molekuly uvedené na obrázku č. 7 v případě GW SEQ, která je schopna ♦ · · ♦ · · · a

    Způsob se tím, pooperačních remodelování zeslabit transkripci Egr-l ve srovnání s molekulou uvedenou na obrázku č. 7 v případě GW SEQ.

    Molekula nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 40 obsahující sekvenci kódující Egr-l.

    Vektor nukleové kyseliny obsahující molekulu podle libovolného z nároků 20 až 41.

    Buňka obsahující molekulu nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 41 nebo vektor podle nároku 42.

    léčby pacienta, vyznačuj ící ž e zahrnuje aplikaci pacientovi molekuly nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 41, vektoru podle nároku 42 nebo buňky podle nároku 43.

    Způsob léčby pacienta, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje aplikaci pacientovi Egr-l, který se produkoval za použití molekuly nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 41 za použití vektoru podle nároku 42 nebo použití buňky podle nároku 43.

    Způsob podle nároku 44 nebo 45, vyznačuj ící se tím, že léčbou je ošetření rány (zahrnující hojení a spojené podmínky a terapii, která podporuje, zesiluje nebo urychluje hojení tkáně a zahrnuje léčbu kožních vředů při cukrovce, okluzivního onemocnění periferních arterií, jizev, popáleniny, lupénka, zrychlení a regenerace kostí, podpora angiogeneze, obnovení buněčné výstelky cév následující perkutánní transluminální koronární angioplastiku.

    Způsob podle libovolného z nároků 44 až 46, vyznačující se tím, že molekula nukleové kyseliny nebo Egr-l se aplikuje přímo do rány nebo blízko k ráně.

    Způsob diagnostikování, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje použití molekuly nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 40 jako sondy pro stanovení, zda existuje nebo neexistuje genetická vada.

    O X • · · · • 4 4 4 4 4 94 4 4 4 • ♦ · • · 4 4 • · · · · « · • · · · · 4 4 4 4 4 49. Způsob testování, v y z n a č u j ící s e t i m, že zahrnuje použití molekuly nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 40, přičemž se na základě

    vazebných studií identifikuje potencionální terapeutické činidlo.

    50. Způsob identifikace činidla schopného pozitivně nebo negativně regulovat transkripci Egr-1, vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu molekuly nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 40 (například ve srovnání s molekulou obsahující GW SEQ zobrazenou na obrázku č. 7) a stanovení zda uvedené změny ovlivňují sílu transkripce Egr-1.

    51. Činidlo, vyznačující se tím, že se identifikovalo způsobem podle nároku 49 nebo 50.

    52. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a molekulu nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 41, vektor podle nároku 42 nebo buňku podle nároku 43.

    53. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a Egr-1 produkovaný za použití molekuly nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 20 až 41, vektor podle nároku 42 nebo buňku podle nároku 43.