CZ122897A3

CZ122897A3 - Modified factor vii

Info

Publication number: CZ122897A3
Application number: CZ971228A
Authority: CZ
Inventors: Kathleen L Berkner; Lars Christian Petersen; Charles E Hart; Ulla Hedner; Claus Bregengaard
Original assignee: Zymogenetics Inc; Novo Nordisk As
Priority date: 1994-10-24
Filing date: 1995-10-24
Publication date: 1997-11-12
Also published as: PL184114B1; HUT78098A; AU4014295A; NO971878D0; BR9509135A; MX9702951A; EP0789759A1; PL319813A1; EP0789759A4; CN1162977A; CN1133743C; JPH11500408A; WO1996012800A1; US5788965A; NO971878L; CA2203280A1

Description

Oblast technikv

Tento vynález se týká bílkovin užitečných jako antikoagulanty. Konkrétněji se tento vynález týká modifikovaných forem faktoru VII, jež inhibují srážení krve a tkáňový faktor.

Dosavadní stav techniky

Srážení krve je proces sestávající z komplexní interakce různých krevních složek, neboli faktorů, jenž nakonec vytvoří fibrinovou sraženinu. Obecně jsou krevní složky, jež se zúčastňují toho, čemu se říká koagulační kaskáda, proenzymy neboli zymogeny, enzymaticky neaktivní bílkoviny jež se přemění na proteolytické enzymy působením aktivátoru, který je samotný aktivovaným faktorem srážení. Faktory srážení, jež prošly takovouto přeměnou se obecně nazývají aktivní faktory, a jsou označovány příponou malého a (např. faktor Vila).

Na přeměnu prothrombinu na thrombin je potřebný aktivovaný faktor X (Xa) a thrombin pak konvertuje fibrinogen na fibrin za konečného stádia tvorby fibrinové sraženiny. Jako na vnitřní dráhu se odkazuje na reakce jež vedou k tvorbě thrombinu prostřednictvím využití faktorů přítomných jen v plazmě. Série proteasami zprostředkovaných reakcí nakonec vytváří faktor IXa jenž, ve spojení s faktorem Vlila, štěpí faktor X na Xa. Stejná al., J. Biol. Chem. 264: Nati. Acad. Sci. USA 85:

proteolysa je prováděna faktorem Vila a jeho kofaktorem, tkáňovým faktorem, ve vnější dráze krevní koagulace. Tkáňový faktor je membránově vázaná bílkovina a normálně necirkuluje v plazmě. Při poškození cév však může vytvářet komplex s faktorem Vila ke katalýze aktivace Faktoru X nebo aktivace faktoru IX za přítomnosti Ca⁺⁺ a fosfolipidů (Nemerson a Centry, Biochem. 25: 4020—4033 (1986)). Zatímco relativní důležitost těchto dvou drah v hemostázi není jasná, u faktoru VII a tkáňového faktoru bylo v posledních letech zjištěno, že hrají základní roli v regulaci srážení krve.

Faktor VII je stopový plazmatický glykoprotein, který cirkuluje v krvi jako jednořetězcový zymogen. Tento zymogen je katalyticky inaktivní (Williams et

7536-7543 (1989); Rao et al., Proč.

6687-6691 (1988)). Jednořetězcový faktor VII může být konvertován na dvouřetězcový faktor Vila in vitro faktorem Xa, faktorem XUa, faktorem IXa nebo thrombinem. O faktoru Xa se soudí, že je hlavní fyziologický aktivátor faktoru VII. Podobně jako několik jiných plazmatických bílkovin, zapojených do hemostáze, je faktor VII závislý na vitaminu K pro jeho aktivitu, která je potřebná ke τ-karboxylaci vícero zbytků glutamové kyseliny, jež se vyskytují ve shluku v aminokonci bílkoviny. Tyto -r-karboxylované glutamové kyseliny jsou potřebné pro kovy zprostředkovanou interakci faktoru VII s fosfolipidy.

Konverze zymogenu faktoru VII na aktivovanou dvouřetězcovou molekulu probíhá štěpením interní peptidové vazby lokalizované přibližně uprostřed molekuly. V lidském faktoru VII je aktivační štěpící místo v Arg₁₅₂“^I]-^ei53 (Hagen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416 (1986; Thim et al., Biochem. 27: 7785-7793 (1988), což je obojí zde zahrnuto odkazem). Bovinní faktor VII je aktivován štěpením analogické Arg₁₅₂-riei53 vazby (Takeya et al., J. Biol. Chem. 263: 14868-14877, 1988). V přítomnosti tkáňového faktoru, fosfolipidů a vápníkových iontů dvouřetězcový faktor Vila rychle aktivuje faktor X nebo faktor IX limitovanou proteolysou.

Často je u pacienta potřebné selektivně blokovat koagulační kaskádu. Lze použít antikoagulanty jako jsou heparin, kumarin, kumarinové deriváty, indandion, indandionové deriváty a jiná činidla, například u dialýzy ledvin, u léčby hluboké žilné trombózy, roztroušené vnitrosvalové koagulace (DIC), a řady jiných medicinálních poruch. Například: Působení heparinu nebo mimotělní působení citrátovým iontem (U.S. patent 4 500 309) lze použít u dialýzy k prevenci koagulace v průběhu léčby. Heparin se používá také k prevenci žilné trombózy u chirurgických pacientů.

Léčba heparinem nebo nežádoucí vedlejší účinky, v celém těle, spíše než jinými antikoagulanty však může mít Dostupné antikoagulanty obecně působí by působily jen v konkrétním místě sraženiny. Heparin například může způsobovat krvácení. Navíc je heparin, s poločasem přibližně 80 minut, rychle odstraňován z krve a vyžaduje časté podávání. Jelikož heparin působí jako kofaktor pro antithrombin III (AT III), a AT III je rychle depletován u léčby DIC, ja často obtížné udržet správné dávkování heparinu a je potřebné nepřetržité sledování hladin AT III a heparinu. Heparin je také neúčinný při extrémní depleci AT III. Navíc: Dlouhé používání heparinu může také zvýšit agregaci krevních destiček a snížit jejich počet, a bylo implikováno ve vývoji osteoporózy. Indandionové deriváty mohou mít toxické vedlejší účinky.

Navíc k antikoagulantům stručně popsaným shora byla antikoagulační aktivita nalezena u několika přirozeně se vyskytujících bílkovin. Například: Reutelingsperger (U.S. patent 4 736 018) izoloval antikoagulační bílkoviny z bovinní aorty a z tepen lidské pupeční šňůry. Maki et al. (U.S. patent 4 732 891) zveřejňují antikoagulační bílkoviny odvozené z lidské placenty. Navíc: AT III byl navržen jako terapeutický antikoagulant (Schipper et al., Lancet 1 (8069): 854-856 (1978); Jordán, U.S. patent 4 386 025; Bock et al., U.S. patent 4 517 294).

Proliferace buněk hladkého svalstva (SMCs) v cévní stěně je důležitý moment tvorby cévních lézí u atherosklerózy, po rekonstrukci cév nebo při odezvě k jiným cévním poškozením. Například: léčba atherosklerózy často zahrnuje uvolnění blokovných cév pomocí angioplastie, endarterektomie nebo redukční atherektomie, nebo napojení na bypass, chirurgických postupů, u nichž se atherosklertická poškození komprimují nebo odstraní kathetrizací (angioplastie), odstraní z tepenné stěny prostřednictvím řezů (endarterektomie), nebo se vytvoří obchvat přirozenými nebo syntetickými štěpy. Tyto postupy odstraňují cévní endothel, narušují jeho intimální podložní vrstvu, a způsobují smrt mediálních SMCs. Toto poškození je následováno proliferaci mediálních SMC a migraci do intimální vrstvy, což charakteristicky nastává v průběhu několika prvních týdnů až do šesti měsíců po poranění a zastavuje se , když se obnoví krycí endotheliální vrstva. U lidí jsou tyto léze složeny přibližně a 20 % buněk a 80 % extracelulární matrice.

U asi 30 % nebo více pacientů léčených angioplastií, endarterektoraii nebo napojením bypass způsobuje trombóza nebo proliferace SMC v intimální vrstvě nové překážky v cévách a následné selhání rekonstitutivní chirurgie. Takovéto uzavření cév po chirurgickém zákroku je známo jako restenóza.

V tomto oboru existuje potřeba pro zlepšené prostředky s antikoagulační aktivitou, jež by mohly být podávány v poměrně nízkých dávkách a neměly nežádoucí vedlejší účinky, jež jsou spojeny s tradičními antikoagulačními prostředky. Tento vynález naplňuje tuto potřebu poskytnutím antikoagulant, jež účinkují specificky v místech poranění, a poskytuje další příbuzné výhody.

Podstata vynálezu

Poskytnuty jsou nové prostředky, jež zahrnuji modifikovaný faktor VII s antikoagulační aktivitou. Tyto prostředky modifikovaného faktoru VII inhibují také tkáňový faktor. Sekvence faktoru VII má modifikaci přinejmenším jedné aminokyseliny, přičemž tato modifikace je vybrána tak, aby podstatně snížila schopnost aktivovaného faktoru VII katalyzovat aktivaci plazmových faktorů X nebo IX, a tedy byla schopna inhibovat aktivitu ve srážení. Tento nový faktor VII má aktivní místo modifikováno substitucí přinejmenším jedné aminokyseliny, a jeho modifikovaná forma je schopna vazby s tkáňovým faktorem.

Prostředky modifikovaného faktoru VII mají typicky v podstatě čistou formu.

Prostředky podle vynálezu jsou ve způsobech léčby pacientů obzvlášt užitečné když jsou formulovány do farmaceutických prostředků, v nichž mohou být podávány jednotlivcům, trpícím řadou chorobných stavů, k léčbě stavů spojených s koagulací. Takovýto modifikovaný faktor VII, schopný vazby ke tkáňovému faktoru, ale mající podstatně sníženou schopnost kátalyzovat aktivaci jiných faktorů ve srážecí kaskádě, může mít delší plazmatický poločas a tedy, ve srovnání s jinými antikoagulanty, odpovídajícím způsobem zvýšenou dobu antikoagulační aktivity. Mezi medicinálními indikacemi pro předmětné prostředky jsou ty, jež se běžně léčí antikoagulanty, jako jsou například hluboká žilná trombóza, pulmonární embolizmus, mrtvice, roztroušená vnitrosvalová koagulace (DIC), depozice fibrinu v plicích a ledvinách spojená s gram-negativní endotoxemií, a infarktaee myokardu. Tyto prostředky mohou být používány k inhibicí vaskulární restenózy, jak nastává po mechanickém vaskulárním poškození, jako je poškození způsobené balónkovou angioplastií, endarterektomií, redukční atherektomií, vložením chlopni, laserovou terapií nebo rotablací, nebo jak nastává druhotně u vaskularních štěpů, chlopní, bypass štěpů nebo transplantovaných orgánů. Tyto prostředky tedy mohou být používány k inhibicí depozice destiček a spojených poruch. Tedy: Způsob inhibice koagulace, vaskulární restenózy nebo depozice destiček zahrnuje například podávání modifikovaného faktoru VII, jako je ten, co má substituci přinejmenším jedné aminokyseliny Asp₂42 a ^His193' pacientovi koagulace, vaskulární restenózy způsob nalezne uplatnění také v katalytické triádě Ser₃₄₄, v množství účinném k inhibicí nebo depozice destiček. Tento v léčbě akutní uzávěry koronární artérie u jednotlivce, přičemž bude zahrnovat podáváni modifikovaného faktoru VII, jenž zahrnuje DEGR-faktor VII, společně s tkáňovým aktivátorem plasminogenu (tPA) nebo streptokinasou, s možností urychlení tPA-indukované trombolýzy.

Pro podávání lidským subjektům bude farmaceutický prostředek typicky obsahovat bílkovinu modifikovaného lidského faktoru VII a farmaceuticky přijetelné nosiče a pufry.

Ve výhodných provedeních lidského a bovinního faktoru VII je zbytek aktivního místa Ser₃₄₄ modifikován, nahrazen Gly, Met, Thr nebo, výhodně j i, Ala. Takovéto substituce mohou být provedeny separátně nebo v kombinaci se substitucí(emi) v jiných místech katalytické triády, jež zahrnuje His₁₉₃ a Asp₂₄₂·

V jiném ohledu se vynález týká polynukleotidové molekuly obsahující dvě funkčně spojené sekvence kódujících oblastí, z nichž jedna kóduje pre-pro peptid a gla doménu na vitaminu K závislé plazmatické bílkoviny, a druhá bílkovinu faktoru VII bez domény gla, přičemž v expresi řečený polynukleotid kóduje molekulu modifikovaného faktoru VII, která významně neaktivuje faktory X nebo IX plazmy a je schopna vázat tkáňový faktor. Molekula modifikovaného faktoru VII exprimovaná tímto polynukleotidem je biologicky aktivní antikoagulant, to jest je schopna inhibice koagulační kaskády a tedy tvorby fibrinového depozitu nebo sraženiny. Pro expresi modifikovaného faktoru VII je tato polynukleotidová molekula transfekována do savčích buněčných linií, jako jsou například buněčné linie BHK, BHK 570 nebo 293.

Stručný popis obrázků

Obr. 1 ilustruje konstrukci vektoru exprese pro DNA sekvenci Ser₃₄₄-^>Ala modifikovaného faktoru VII. Použité symboly obsahují 0-1 pro 0-1 mapovací jednotku z adenoviru 5, E pro enhancer SV40, MLP pro hlavní pozdní promotor adenoviru 2, SS pro soubor míst sestřihu, a pA pro polyadenylační signál z SV40 v pozdní orientaci.

Obr. 2 ukazuje účinek bolus injekce DEGR-faktoru Vila na tvorbu trombů (ukládání destiček) na endartektomizované aortě baboona ve srovnání s kontrolami solného roztoku. Tepny byly měřeny po 60 minutách. DEGR-faktor Vila významně inhiboval vývoj

Ί trombů bohatých na destičky v tomto primátím modelu akutního cévního poškození.

Obr. 3 ukazuje výsledky získané když se buňky hladkého svalu baboona inkubovaly s rostoucími koncentracemi bud’ FVIIa (prázdné čtverce) anebo DEGR-FVIIa v přítomnosti konstantního množství FVIIa (5 nM) (plné čtverce). Hladina aktivace FX byla následně stanovena s použitím chromogenního substrátu S-2222. Údaje jsou prezentovány jako amidolytická aktivita jako procento aktivity generované v přítomnosti samotného 5 nM FVIIa.

Obr. 4 zobrazuje velikost intimální plochy u baboona po endartektomii aorty a působení DEGR-faktoru Vila po 7 nebo 30 dní, ve srovnání s kontrolními zvířaty.

Obr. 5 ilustruje poměr intimální plochy k intimální + mediální ploše stehenní tepny baboona po balónkovém poškození a působení DEGR-faktoru Vila, přičemž kontrolní skupina obsahoval 5 cév, po sedmidenním působení se prohlédlo 11 cév a po třicetidenním působení se prohlédly 2 cévy (n = počet prohlížených cév).

Příklady provedení vynálezu

Tímto vynálezem je poskytnut nový modifikovaný faktor VII s antikoagulační aktivitou. Modifikovaný faktor VII může být ve formě zymogenu (t.j. jednořetězcové molekuly) nebo může být rozštěpen ve svém aktivačním místě. Modifikovaný faktor VII je tedy míněn tak, že zahrnuje molekuly faktoru VII a faktoru Vila, jež váží tkáňový faktor a inhibují aktivaci faktoru IX na IXa nebo faktoru X na Xa. Prostředky modifikovaného faktoru VII jsou vhodné pro podávání řadě savců, obzvlášř lidem, k inhibici koagulační kaskády. Modifikovaný faktor VII může být podáván společně s jinými antikoagulačními látkami nebo místo nich.

Faktor VII hraje důležitou roli v koagulační kaskádě, obzvláště v té, co zahrnuje vnější dráhu. Je přítomen v obíhající plazmě jako inaktivní jednořetězcová bílkovina zymogenu, a po aktivaci jako faktor Vila aktivuje společně s tkáňovým faktorem a vápenatými ionty faktor X na Xa a faktor IX na IXa, za konečné tvorby fibrinové sraženiny.

Tímto vynálezem je poskytnuta schopnost inhibice daného pořadí událostí v koagulační kaskádě zábranou nebo jinou inhibici

Bílkoviny faktoru VII jež je modifikováno ke Vila, zatímco jejich organofosforová halomethylketon aktivace faktorů X a IX faktorem Vila. podle vynálezu mají katalytické místo, snížení katalytické aktivity faktoru molekuly si zachovávají schopnost vázat se k tkáňovému faktoru. Tyto molekuly modifikovaného faktoru Vil kompetují s nativním faktorem Vil nebo Vila o vazbu k tkáňovému faktoru. Důsledkem toho je, že aktivace faktorů X a IX je inhibována.

V jednom aspektu tohoto vynálezu je katalytická aktivita faktoru Vila inhibována chemickou derivatizací katalytického centra, neboli triády. Derivatizace může být provedena například reakcí faktoru VII s ireverzibilhimi inhibitory, jako je sloučenina, sulfonylfluorid, peptidový nebo azapeptid, nebo pomocí acylace. Výhodné peptidové halomethylketony zahrnují PPACK (D-Phe-Pro-Arg chlormethylketon, viz U.S. patent č. 4 318 904, zahrnuto zde odkazem) D-Phe-Phe-Arg a Phe-Phe-Arg chlormethylkétony, DEGRck (dansyl-Glu-Gly-Arg chlormethylketon).

V jiném ohledu může být katalytická aktivita faktoru Vila inhibována také substitucí, inzercí nebo deleci aminokyselin. Ve výhodných provedeních jsou substituce provedeny v aminokyselinové sekvenci katalytické triády faktoru VII, definované zde jako oblasti, obsahující aminokyseliny, jež přispívají ke katalytickému místu faktoru Vila. Tyto substituce, inzerce nebo delece v katalytické triádě jsou obecně v aminokyselinách, jež tvoří katalytické místo, nebo v přilehlých aminokyselinách. V bílkovinách lidského a bovinního faktoru VII jsou aminokyselinami, jež tvoří katalytickou triádu, aminokyseliny

Ser

344

Asp_24:

His

193 (číslování v indexech ukazuje pozici v sekvenci). Katalytická místa faktoru VII z jiných savčích druhů mohou být stanovena s použitím v současnosti dostupných technik včetně, mimo jiného, izolace bílkoviny a analýzy aminokyselinové sekvence. Katalytická místa mohou být rovněž stanovena pomocí srovnání sekvence se sekvencemi jiných serinových proteas, obzvlášť chymotrypsinu, jejichž aktivní místo bylo dříve stanoveno (Sigler et al., J. Mol. Biol. 35: 143-164 (1968), zahrnuto zde odkazem), a tudíž stanovením zbytků aktivního místa z řečeného srovnání.

Substituce, inzerce nebo delece aminokyselin se provádějí tak aby bránily nebo jinak inhibovaly aktivaci faktorů X nebo IX faktorem Vila. Takto modifikovaný faktor VII si však musí také zachovat schopnost kompetice s autentickým faktorem VII a/nebo faktorem Vila o vazbu k tkáňovému faktoru v koagulační kaskádě. Takováto kompetice může být snadno stanovena pomocí např. testu srážení popsaného zde nebo kompetičním vazebným testem s použitím např. buněčné linie mající buněčně-povrchový tkáňový faktor, jako je buněčná linie J82 lidského karcinomu močového měchýře (Sakai et al., J. Biol. Chem. 264: 9980-9988 (1989), zahrnuto zde odkazem).

Aminokyseliny vytvářející katalytické místo ve faktoru VII, jako jsou Ser₃₄₄, Asp₂₄₂ ^{a H;}*-^Si93 ^v lidském a bovinním faktoru VII, mohou být buď substituovány nebo deletovány. V rámci tohoto vynálezu se má za výhodné měnit jen jednu aminokyselinu a tak minimalizovat pravděpodobnost zvýšení antigenicity této molekuly nebo inhibice schopnosti vázat tkáňový faktor, avšak lze provádět dvě nebo více změn aminokyselin (substituce, adice nebo delece) a provádět také kombinace substituce(i), adice(í) nebo dělece(í). Ve výhodném provedení pro bovinní nebo lidský faktor VII je Ser₃₄₄ s výhodou nahrazen Ala, ale může být nahrazen Gly, Met, Thr nebo jinými aminokyselinami. Výhodné je Asp nahradit Glu a His nahradit Lys nebo Arg. Obecně se vybírají narušovaly terciární strukturu (v Atlas of Protein Structure substituce tak, aby co nejméně bílkoviny. Model Dayhoffa et al.

1978, Naťl Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), zahrnutý zde odkazem, může být použit jako vodítko pro další substituce. Lze zavádět záměny zbytků, jež jsou popsány shora, do katalytického místa patřičné sekvence lidského a bovinního faktoru VII nebo faktoru VII jiných biologických druhů, a testovat bílkoviny na žádoucí hladinu inhibice katalytické a výslednou antikoagulační aktivitu, jak je zde výsledné aktivity popsáno.

U modifikovaného faktoru VII bude katalytická aktivita podstatně inhibována, obecně na méně než asi 5 % katalytické aktivity faktoru VII divokého typu příslušného druhu, výhodněji na méně než asi 1 %.

Bílkoviny podle vynálezu mohou být produkovány s použitím technik rekombinantní DNA. Obecně se modifikuje klonovaná sekvence DNA faktoru VII divokého typu tak, aby kódovala žádanou bílkovinu. Tato modifikovaná sekvence se vloží do vektoru exprese, jenž se následně zavede transformací nebo transfekcí do hostitelských buněk. Výhodnými hostitelskými buňkami jsou buňky vyšších eukaryotů, obzvlášť kultivované savčí buňky. Pro lidský faktor VII jsou známé úplné nukleotidové a aminokyselinové sekvence. Viz U.S. patent č. 4 784 950, zahrnutý zde odkazem, kde je popsáno klonování a exprese rekombinantního lidského faktoru VII. Sekvence bovinního faktoru VII je popsána v Takeya et al., J. Biol. Chem. 263: 14868-14872 (1988), zahrnuto zde odkazem.

Záměny v aminokyselinové sekvenci lze provést řadou technik Modifikací DNA sekvence může být řízená mutageneza. Techniky řízené mutageneze jsou v oboru dobře známé a jsou popsány například Zollerem a Smithem (DNA 3: 479-488, 1984). S použitím nukleotidových a aminokyselinových sekvencí faktoru VII lze tedy zavádět záměny podle výběru.

Faktor VII modifikovaný podle tohoto vynálezu zahrnuje ty bílkoviny, jež mají aminokoncovou část (gla doménu) nahrazenu gla doménou jedné z vitamin K-dependentních plazmatických bílkovin faktoru IX, faktoru X, prothrombinu, proteinu C, proteinu S nebo proteinu Z. Domény gla plazmatických bílkovin závislých na vitaminu K jsou charakterizovány přítomností gama-karboxy zbytků glutamové kyseliny a obecně mají délku 30 až 40 aminokyselin s C-koncem odpovídajícím pozicím rozhraní exon-intron v příslušných genech. Způsoby produkce faktoru VII s heterologní gla doménou jsou zveřejněny v U.S. patentu č. 4 784 950, zahrnutém zde odkazem.

DNA sekvence k použití podle vynálezu budou typicky kódovat pre-pro peptid na aminokonci bílkoviny faktoru VII, aby se získalo správné post-translační zpracování (např. gama-karboxylace zbytků glutamové kyseliny) a sekrece z hostitelských buněk. Tato pre-pro sekvence může být z faktoru VII nebo z jiné plazmatické bílkoviny závislé na vitaminu K, jako je faktor IX, faktor X, prothrombin, protein C nebo protein S. Jak bude zřejmé osobám zběhlým v oboru, lze provést další modifikovaného nezasáhnou do modifikace faktoru VII, schopnosti aminokyselinové sekvenci tyto modifikace významně bílkoviny působit v

kde této antikoagulant. Například: Faktor VII modifikovaný v katalytické triádě může být modifikován také v aktivačním štěpícím místě k inhibicí konverze zymogenu faktoru VII na aktivovanou dvouřetězcovou formu, jak je obecně popsáno v U.S. patentu č. 5 288 629, zahrnutém zde odkazem.

Vektory exprese k provádění tohoto vynálezu budou obsahovat promotor schopný řízení transkripce klonovaného genu nebo cDNA. Výhodné promotory k použití v kultivovaných savčích buňkách zahrnují virové promotory a buněčné promotory. Virové promotory zahrnuji SV40 promotor (Subrami et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854-864, 1981) CMV promotor (Boshart et al., Cell 41: 521-530, 1985). Obzvláště výhodným virovým promotorem je hlavní pozdní promotor adenoviru 2 (Kaufman a Sharp, Mol. Cell. Biol. 2: 1304-1319, 1982). Buněčné promotory zahrnují promotor myšího kapa genu (Bergman et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 7041-7045,

1983) a myší V^ promotor (Loh et al., Cell 33: 85-93, 1983). Obzvláště výhodným buněčným promotorem je promotor myšího metalothioneinu-I (Palmiter et al., Science 222: 809-814, 1983). Vektory exprese mohou obsahovat také soubor míst sestřihu RNA, umístěný směrem dolů od promotoru a nahoru od místa inzerce pro sekvenci samotného faktoru VII. Výhodná místa sestřihu mohou být získána z adenoviru nebo imunoglobulinových genů. Ve vektorech exprese je obsažen také polyadenylační signál, umístěný směrem dolů od místa inzerce. Obzvlášť výhodné polyadenylační signály zahrnují ranný a pozdní polyadenylační signál z SV40 (Kaufman a Sharp, ibid.), polyadenylační signál z 5 Elb oblasti adenoviru, terminátor genu lidského růstového hormonu (DeNoto et al., Nud. Acids Res. 9: 3719-3730, 1981) nebo polyadenylační signál z genu lidského faktoru VII nebo bovinního faktoru VII. Vektory exprese mohou obsahovat také nekódující sekvenci virové vedoucí sekvence, jako je trojčlenná vedoucí sekvence adenoviru 2, umístěná mezi promotorem a místy sestřihu RNA, a zesilovací sekvence, jako je zesilovací sekvence SV40.

Klonované DNA sekvence se zavádějí do savčích buněk například transfekci zprostředkovanou kalcium fosfátem (Wigler et al., Cell 14: 725-732, 1978; Gorasro a Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603-616, 1981; Graham a Van der Eb, Virology 52d: 456-467, 1973) nebo elektroporací (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982). K identifikaci a selekci buněk exprimujících exogenní DNA se do buněk spolu s genem nebo s cDNA, o něž je zájem, zavádí obecně gen jež je spojen se selektovatelným fenotypem (selektovatelný markér). Výhodné selektovatelné markéry zahrnují geny, jež určují resistenci k léčivům, jako je neomycin, hygromycin a methotrexát. Selektovatelným markérem může být ampifikovatelný selektovatelný markér. Výhodným ampifikovatelným selektovatelným markérem je sekvence dihydrofolát reduktasy (DHFR). Přehled selektovatelných markérů je podán Thillym (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, zahrnuto zde odkazem). Výběr selektovatelných markérů je zcela na úrovni běžných znalostí v oboru.

Selektovatelné markéry mohou být zavedeny do buněk na zvláštním plasmidu současně s genem, jenž je předmětem zájmu, nebo mohou být zavedeny na stejném plasmidu. Pokud jsou na stejném plasmidu, mohou být selektovatelný markér a daný gen, jenž je předmětem zájmu, řízeny různými promotory nebo stejným promotorem, přičemž posledně jmenované uspořádání vytváří dvoucistronovou zprávu. Konstrukty tohoto typu jsou v oboru známé (například Levínson a Simonsen, U.S. patent 4 713 339). Může být také výhodné přidávat ke směsi, jež se zavádí do buněk, další DNA, známou jako nosičová DNA.

Buňky mohou, poté co inkorporovaly DNA, růst na patřičném růstovém médiu, typicky 1-2 dny než začnou exprimovat gen, jenž je předmětem zájmu. Výraz patřičné růstové médium, jak se zde používá, znamená médium obsahující živné složky a jiné složky potřebné k růstu buněk a expresi genu modifikovaného faktoru VII. Média obecně obsahují zdroj uhlíku, zdroj dusíku, esenciální aminokyseliny, esenciální cukry, vitaminy, sole, fosfolipidy, bílkoviny a růstové faktory. Pro produkci gama-karboxylovaného modifikovaného faktoru VII bude toto médium obsahovat vitamin K, s výhodou v koncentraci asi 0,1 μg/ml až as 5 pg/ml. Pro selekci na růst buněk, které stabilním žpůsobem exprimují selektovatelný markér, se pak použije selekce přidaným léčivem. Pro buňky, jež byly transfekovány ampifikovatelným selektovatelným markérem se může koncentrace léčiva zvyšovat, aby se provedla selekce na zvýšený počet kopií klonované sekvence, a tím se zvýšila hladina exprese. Klony stabilně transfekovaných buněk se pak hodnotí na expresi modifikovaného faktoru VII.

Výhodné linie savčích buněk k použití v tomto vynálezu zahrnují linie buněk CGS-1 (ATCC CRL 1650), křečcích ledvin (BHK) a 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977). Výhodná buněčná linie BHK je buněčná linie tk“ tsl3 BHK (Waechter a Baserga, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79: 1106-1110, 1982, zahrnuto zde odkazem), na niž se dále odkazuje jako na BHK 570 buňky. Buněčná linie BHK 570 byla deponována u American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852 pod ATTC přístupovým číslem CRL 10314. Jedna buněčná linie tk^- tsl3 BHK je dostupná také pod přístupovým číslem CRL 1632. Navíc lze v rámci tohoto vynálezu používat řadu jiných buněčných linií, včetně buněk Rat Hep I (potkaní hepatom, ATCC CRL 1600), Rat Hep II (potkaní hepatom, ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), lidských plic (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61) a DUKX (Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA ΊΊ z 4216-4220, 1980).

V rámci tohoto vynálezu může být k produkci modifikovaného faktoru VII využívána technologie transgenních zvířat. Výhodné je produkovat tyto bílkoviny v mléčné žláze hostitelské savčí samice. Exprese v mléčné žláze a následná sekrece bíkoviny, která je předmětem zájmu, do mléka překonává mnohé potíže, na něž se naráží při izolaci bílkovin z jiných zdrojů. Mléko se snadno odebírá, je dostupné ve větších množstvích, a je biochemicky dobře charakterizováno. Navíc: Hlavní bílkoviny mléka jsou v mléce přítomné ve vysokých koncentracích (typicky od asi 1 do 15 g/1). Z komerčního hlediska je jasně výhodné používat jako hostitele biologický druh s vysokou výtěžností mléka. I když lze používat menší zvířata, jako jsou myši a potkani (a jsou výhodné při vyzkoušení principiálního stádia), v tomto vynálezu je výhodné používat hospodářská zvířata včetně, ale bez omezení, prasat, koz, ovcí a skotu. Ovce jsou obzvláště výhodné pro takové faktory jako jsou dřívější historie transgeneze u tohoto druhu, dojivost, cena a běžná dostupnost zařízení ke shromažďování ovčího mléka. Pro porovnání faktorů, jež mají vliv na výběr hostitelského druhu, viz WIPO publikaci WO 88/00239. Obecně je žádoucí vybrat plemeno hostitelského zvířete, jež bylo šlechtěno k mlékárenskému využití, jako je východofrízská ovce, nebo zavést mléčnou užitkovost šlechtěním transgenní linie v pozdějších datech. V každém případě se musí užívat zvířata ve známém, dobrém zdravotním stavu.

K získání exprese v mléčné žláze se používá transkripční promotor z genu některé mléčné bílkoviny. Geny mléčných bílkovin zahrnují geny kódující kasein (viz U.S. patent č. 5 304 489, zahrnuto zde odkazem), beta-laktoglobulin, a-laktalbumin a kyselou bílkovinu syrovátky. Výhodný je beta-laktoglobulinový (BLG) promotor. V případě ovčího beta-laktoglobulinového genu se obecně obecně použije oblast přinejmenším proximálnich 406 bp 5’ přilehlé sekvence genu i když výhodné přilehlé sekvence až do asi 5 kbp, jako je obsahující 5' přilehlý promotor a beta-laktoglobulinového genu. Viz Whitelaw et al., Biochem. J. 286: 31-39 (1992). Vhodné jsou také podobné fragmenty promotorové DNA z jiných biologických druhů.

Do konstruktů mohou být také zařazeny jiné oblasti beta-laktoglobůlinového genu nebo mohou být exprimovány genomické oblasti tohoto genu. Obecně se v oboru přijímá, že konstrukty, jimž chybějí introny, se exprimují hůře ve srovnání s těmi, jež takovéto DNA obsahují (viz Brinster et al., Proč.

Sci. USA 85: 836-840 (1988); Palmiter et al., Proč.

Sci. USA 88: 478-482 (1991); Whitelaw et al., Transgenic Res. 1:

3-13 (1991); WO 89/01343 a WO/9102318, z nichž každý je Zde

V tomto ohledu je obecně výhodné, když je to genomické sekvence, obsahující všechny nebo introny genu kódujícího bílkovinu nebo jsou větší části 5' 4,25 kbp DNA segment nekóduj ící oblast

Nati. Acad. Nati. Acad.

zahrnut odkazem). možné, používat některé nativní prostředí pro tkáňově exprese. Je praktické polypeptid, jež jsou předmětem zájmu, a tedy výhodné je další zařazení přinejmenším některých intronů například z beta-laktoglobulinového genu. Jednou takovouto oblastí je DNA segment z 3’ nekódující oblasti ovčího beta-laktoglobulinového genu, který zajišťuje sestřih intronu a RNA polyadenylaci. Když je zařazen místo přirozené 3' nekódující sekvence nějakého genu, může tento segment ovčího beta-laktoglobulinového genu jak zvýšit, tak stabilizovat hladinu exprese bílkoviny nebo polypeptidu, jež jsou předmětem zájmu. V rámci jiných provedení je oblast obklopující iniciační ATG sekvence modifikovaného faktoru VII nahrazena odpovídající sekvencí z genu specifického pro mléčnou bílkovinu. Takováto náhrada zajišťuje předpokládané specifickou iniciaci k zajištění zvýšené zaměnit veškeré pre-pro a 5' nekódující sekvence modifikovaného faktoru VII například sekvencemi BLG genu, i když také lze zaměňovat menší oblasti.

Pro vytvoření jednotky exprese modifikovaného faktoru VII v transgenních zvířatech je DNA segment kódující modifikovaný faktor VII funkčně spojen s dalšími DNA segmenty, potřebnými pro jeho expresi. Takovéto další segmenty zahrnují shora uvedený promotor, jakož i sekvence, které zajišťují terminaci transkripce a polyadenylaci mRNA. Jednotka exprese bude dále zahrnovat DNA segment kódující sekreční signální sekvenci funkčně spojenou se segmentem kódujícím modifikovaný faktor VII. Sekvencí sekrečního signálu může být sekvence sekrečního signálu modifikovaného faktoru VII nebo může patřit jiné bílkovině, například mléčné bílkovině. Viz například Héinje, Nud. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986) a Meade et al., U.S. patent č. 4 873 316, jež jsou zde zahrnuty odkazem.

Konstrukce jednotky exprese pro použití v transgenních zvířatech se pohodlně provádí inzercí sekvence modifikovaného faktoru VII do plasmidového nebo fágového vektoru, obsahujícího další DNA segmenty, i když tuto jednotku exprese lze konstruovat v podstatě jakýmkoli pořadím ligací. Obzvlášť pohodlné je zajistit vektor obsahující DNA segment, jenž kóduje některou mléčnou bílkovinu a nahradit danou kódující sekvenci pro mléčnou bílkovinu sekvencí kódující modifikovaný faktor VII a tudíž vytvořit genovou fúzi, jež zahrnuje sekvence řídící expresi mléčné bílkoviny. V každém případě umožňuje klonováni jednotek exprese v plasmidech nebo jiných vektorech amplifikaci sekvence modifikovaného faktoru VII. Amplifikace se pohodlně provede v bakteriálních (např. E. coli) hostitelských buňkách, takže dané vektory budou typicky obsahovat počátek replikace a selektovatelné markéry funkční v bakteriálních hostitelských buňkách.

Jednotka exprese se pak zavede do oplodněného vajíčka (včetně embryí ranného stádia) vybraného hostitelského druhu. Zavedení heterologní DNA lze provést jednou z několika cest, včetně mikroinjekce (např. U.S. patent č. 4 873 191), retrovirovou infekcí (Jaenisch, Science 240: 1468-1474 (1988)) nebo cílenou integrací s použitím embryonálních kmenových (ES) buněk (přehled Bradley et al., Bio/Technology 10: 534-539 (1992)). Vajíčka se pak implantují do vejcovodů nebo děloh pseudobřezích samic a nechají se vyvíjet k vrhu. Potomstvo nesoucí zavedenou DNA ve své zárodečné linii může přenášet tuto DNA do své progenní populace normálním Mendelovským způsobem, což umožňuje vývoj transgenních stád.

Obecné postupy produkce transgenních zvířat jsou v oboru známy. Viz například Hogan et al., Manipulating the Mouše Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6:844-867, 1988; Wall et al., Biol. Reprod. 32:645-651, 1985; Buhler et al., Bio/Technology 8: 140-143, 1990; Ebert et al., Bio/Technology 9 z 835-838, 1991; Krimpenfort et al., Bio/Technology 9:844-847, 1991; Wall et al., J. Cell. Biochem. 49:113-120, 1992; US patenty č. 4 873 191 a 4 873 316; WIPO publikace WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; a GB 87/00458, což je zde zahrnuto odkazem. Techniky pro zavedení sekvencí cizí DNA do savců a jejich zárodečných buněk byly původně vyvinuty v myších. Viz např. Gordon et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:7380-7384, 1980; Gordon a Ruddle, Science 214:1244-1246, 1981; Palmiter a Brinster, Cell 41: 343-345, 1985; Brinster et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442, 1985; a Hogan et al., (ibid.). Tyto techniky byly následně adaptovány k použití na větších zvířatech, včetně

- 17 hospodářských zvířat (viz např. WIPO publikace WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; Simons et al., Bio/Technology 6:844-867, 1988). Ve shrnutí: V nejúčinnějších dosavadních cestách pro vytvoření transgenních myší nebo hospodářských zvířat se injikuje několik set lineárních molekul DNA, jež je předmětem zájmu, do jednoho z pro-jader oplodněného vajíčka pomocí technik, jež se staly standardními v oboru. Lze použít i injekci DNA do cytoplazmy nebo zygoty. Lze používat také produkci v transgenních rostlinách. Exprese může být zobecněná nebo řízená ke konkrétnímu orgánu, jako je hlíza. Viz Hiatt, Nátuře 344:469-479, 1990; Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12:449-453, 1992; Sijmons et al., Bio/Technology 8:217-221, 1990; a publikace Evropského patentového úřadu EP 255 378.

Modifikovaný faktor VII připravený podle tohoto vynálezu afinitní chromatografií na koloně protilátky VII. Použití monoklonálních protilátek dependentních na vápníku, jak jsou popsány Wakabayashim et al., «7. Biol. Chem. 261: 11097-11108 (1986) a Thimem et al., Biochem.

může být čištěn proti faktoru

27: 7785-7793 (1988), zahrnuto zde odkazem, je obzvlášť výhodné. Dalšího vyčištění lze dosáhnout prostředky konvenčni chemické purifikace, jako je vysokotlaká kapalinová chromatografie. V oboru jsou známé další způsoby purifikace, včetně srážení bárium citrátem, a mohou být aplikovány na purifikaci zde popsaného nového modifikovaného faktoru VII (viz obecně Scopes R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982). Pro farmaceutické využití je výhodný v podstatě čistý modifikovaný faktor VII s homogenitou u asi 90 až 95 %, a nejvýhodnějši je homogenita 98 až 99 % nebo vyšší. Po vyčištění, částečném nebo do homogenity, jak je žádoucí, lze pak modifikovaný faktor VII používat terapeuticky.

V rámci jednoho provedení vynálezu je modifikovaný faktor VII štěpen v aktivačním místě ke konverzi faktoru na jeho dvouřetězcovou formu. Aktivaci lze provádět podle postupů v oboru známých, jako jsou ty, co jsou zveřejněné Osterudem et al., Biochemistry 11: 2853-2857 (1972); Thomasem, U.S. patent č. 4 456 591; Henderem a Kisielem, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841 (1983); nebo Kisielem a Fujikawou, Behring Inst. Mitt.

73: 29-42 (1983), což je zde zahrnuto odkazem. Výsledné molekuly jsou pak formulovány a podávány jak je popsáno níže.

Molekuly modifikovaného faktoru VII podle vynálezu jsou obzvlášť: užitečné pro podávání lidem k léčbě řady stavů zahrnujících intravaskulární koagulaci. Například: Hluboká žilná trombóza a plicní embolizmus mohou být léčeny konvenčními prostředky, přičemž zde popsaný modifikovaný faktor VII může být použit k prevenci výskytu tromboembolických komplikací u pacientů s identifikovaným vysokým rizikem, jako jsou ti, co prošli operací nebo mají kongestivní srdeční vadu. Navíc může modifikovaný faktor VII působit jako antagonista indukce srážení zprostředkované tkáňovým faktorem, a tudíž blokovat tvorbu fíbrinu. Jako takový může být pro inhibici aktivity tkáňového k inhibici krevní koagulace, thrombinu a následné ukládání modifikovaný faktor VII užitečný faktoru, jež povede například trombózy nebo depozice destiček.

Molekuly modifikovaného faktoru VII podle vynálezu mohou být obzvlášť: užitečné při léčbě intimální hyperplazie nebo restenózy v důsledku akutního vaskulárního poškození. Akutní vaskulární poškození jsou ta, jež nastávají rychle (t.j. během dnů až měsíců) na rozdíl od chronických vaskulárních poškození (např. atherosklerózy) jež se vyvíjejí v průběhu celého života. Akutní vaskulární poškození jsou často důsledkem chirurgických procedur, jako je cévní rekonstrukce, kde se používají techniky angioplastie, endarterektomie, atherektomie, a zavedení cévních štěpů. Hyperplazie může také nastat jako pozdní odezva v odpovědi například na zavedení štěpů nebo na transplantaci orgánů. Jelikož modifikovaný faktor VII je selektivnější než heparin a obecně se váže jen ke tkáňovému faktoru, jenž byl exponován v místech poškození, a jelikož modifikovaný faktor VII neničí jiné koagulační bílkoviny, bude při profylaktickém použití v prevenci hluboké žilné trombózy účinnější než heparin a bude s menší pravděpodobností způsobovat komplikace krvácení. Dávka modifikovaného faktoru VII pro prevenci hluboké žilné trombózy je v rozsahu 50 μg až 500 mg/den, typičtěji 1 mg až 200 mg/den, výhodněji 10 až asi 175 mg/den u 70 kg pacienta, a podávání by mělo začít přinejmenším 6 hodin před operací a pokračovat dokud pacient nepřejde do ambulantní péče. Dávka modifikovaného faktoru VII pro léčbu restenózy se bude u každého pacienta lišit, ale obecně bude v rozsahu dávek doporučovaných shora.

Nedávné pokroky v léčení koronárních vaskulárních nemocí zahrnují použití mechanických intervencí buď k odstranění anebo k přemístění škodlivého chorobného materiálu za účelem nápravy adekvátního proudění krve v koronárních tepnách. Navzdory používání mnohých způsobů mechanické intervence, včetně balónkové angioplastie, endarterektomie, redukční atherektomie, vložení chlopní, laserové terapie nebo rotablace, účinnost těchto technik zůstává omezená pro přibližně 40 % výskytu restenózy v průběhu měsíců od dané léčby.

O restenóze se soudí, že pochází z komplexních interakcí biologických dějů včetně depozice destiček a tvorby trombů, uvolňování chemotaktických a mitogenních faktorů, a migrace a proliferace buněk vaskulárního hladkého svalstva do imtimy rozšířeného segmentu tepny.

Inhibice akumulace destiček v místech mechanického poškození může omezovat výskyt restenózy v lidských subjektech. Terapeutické použití monoklonální protilátky k destičkovému GpIIb/IIIa dává možnost omezení hladiny restenózy v lidských subjektech (Califf et al., N. Eng. J. Med., 330: 956-961 (1994)). Daná protilátka je schopna vazby ke GpIIb/IIIa receptorů na povrchu destiček a tudíž inhibice akumulace destiček. Tato data napovídají, že inhibice akumulace destiček v místě mechanického poškození v lidských koronárních tepnách prospívá konečné hojivé odezvě, jež nastává. Zatímco akumulace destiček nastává v místech akutního cévního poškození, tvorba thrombinu v těchto místech může být zodpovědná za aktivaci destiček a jejich následnou akumulaci.

Je je ukázáno v příkladech, jež následují, modifikovaný vynálezu tkáňovému vázat se Například:

faktor VII podle k buněčně-povrchovému DEGR-faktor Vila se váže s afinitou stejnou nebo schopen faktoru.

k buněčně-povrchovému tkáňovému faktoru vyšší jako faktor Vila divokého typu.

DEGR-faktor Vila však nemá žádnou enzymatickou aktivitu, váže se přesto ke tkáňovému faktoru a působí jako kompetitivní antagonista faktoru Vila divokého typu, a tudíž inhibuje následné kroky ve vnější dráze koagulace, jež vedou k tvorbě thrombinu.

Molekuly modifikovaného faktoru VII podle vynálezu, jež si zachovávají vazbu k tkáňovému faktoru, inhibují akumulaci destiček v místě cévního poškození blokováním tvorby thrombinu a následného ukládání fibrinu.

Díky této schopnosti DEGR-faktoru VII blokovat tvorbu thrombinu a omezovat ukládání destiček v místech akutního cévního' poškození, mohou být molekuly modifikovaného faktoru VII, jež si zachovávají vazebnou aktivitu e tkáňovému faktoru ale nemají enzymatickou aktivitu faktoru Vila, používány k inhibici vaskulární restenózy.

Prostředky a způsoby podle vynálezu mají tedy velkou řadu použití. Například: Jsou užitečné v prevenci nebo inhibici restenózy po intervenci, typicky mechanické intervenci, k odstranění nebo přemístění škodlivého chorobného materiálu při léčbě koronárních nebo periferálních vaskulárních chorob, jak je tomu po balónkové angioplastii, redukční atherektomii, vložení cévních chlopní, laserové terapii, rotablace a podobně, nebo ve spojitosti s nimi. Tyto prostředky se budou typicky podávat v průběhu asi 24 hodin před provedením intervence a až po tak dlouho, jako je období 7 dnů po ní. Podávání může být prováděno řadou cest, jak se zde dále popisuje. Prostředky podle vynálezu mohou být také podávány systémově nebo lokálně u vkládání cévních štěpů (např. pokrýváním syntetických nebo modifikovaných přírodních tepenných cévních štěpů), v místech anastomózy, chirurgické endarteroktomie (typicky endarteroktomie karotidové tepny), bypass štěpů a podobně. Modifikovaný faktor VII a Vila nalezne použití rovněž v inhibici intimální hyperplazie, rychlé atherosklerózy a žilně-okluzivních chorob spojených s transplantací orgánů, například po transplantaci kostní dřeně.

V léčbě vyvinuté hluboké žilné trombózy nebo plicního embolizmu leží dávka modifikovaného faktoru v rozmezí od 50 μg do 500 mg/den, typičtěji 1 mg až 200 mg/den, výhodněji 10 až asi 175 mg/den u 70 kg pacienta, jako vstupní a udržovací dávka, v závislosti na hmotnosti pacienta a vážnosti stavu. Pro menší pravděpodobnost, že infuze modifikovaného faktoru VII způsobí komplikace krvácení, může modifikovaný faktor VII nahradit nebo snížit dávky heparinu během chirurgického zákroku nebo po něm, ve spojitosti s trombektomiemi nebo embolektomiemi.

Prostředky modifikovaného faktoru VII podle vynálezu budou rovněž mít podstatné využití v prevenci kardiogenních embolií a v léčbě thrombotických mrtvic. Díky nízkému potenciálu způsobovat komplikace krvácení a své selektivitě může být modifikovaný faktor VII podáván postiženým mrtvicí a může bránit rozšiřování thrombotické tepenné ucpávky. Množství podávaného modifikovaného faktoru VII se bude u každého pacienta lišit v závislosti na povaze a síle mrtvice, ale obecně dávky budou v rozsahu doporučovaném níže.

Farmaceutické prostředky modifikovaného faktoru VII, včetně DEGR faktoru VII, zde poskytované, budou užitečnou léčbou u akutního infarktu myokardu, protože modifikovaný faktor má schopnost inhibovat in vivo koagulaci. Modifikovaný faktor VII může být podán jako adjuvans s tkáňovým aktivátorem plasminogenu (TPA) nebo streptokinasou v průběhu akutní fáze infarktu myokardu, a může urychlovat TPA-indukovanou thrombolýzu.

myokardu dostane pacient vstupní dávku μg až 500 mg/den, typičtěji 1 mg až 200 mg/den, a výhodněji 10 až asi 175 mg/den u 70 kg pacienta jako vstupní a udržovací dávky. Modifikovaný faktor VII se podá před, ve spojitosti s, nebo krátce po podání thrombolytického činidla, jako je tkáňový aktivátor plasminogenu.

Modifikovaný faktoru VII podle vynálezu je užitečný pro léčbu roztroušené vnitrosvalové koagulace (DIC) a jiných stavů spojených s gram-negativní bakteremií. Charakteristicky mají pacienti s DIC značně rozšířené mikrocirkulační tromby a mají často těžké problémy s krvácením, jež pocházejí z vyčerpání faktorů srážení. Díky své selektivitě nebude faktor VII zhoršovat problémy s krvácením spojené je zhoršují konvenčni antikoagulanty, ale bude nebo inhibovat tvorbu dalších mikrovaskulárních usazenin. Modifikovaný faktoru VII podle vynálezu, včetně DEGR-faktoru VII a DEGR-VIIa, je tedy užitečný pro inhibici depozice fibrinu spojené s endotoxemií a endotoxinovým

U akutního infarktu přinejmenším asi 50 esenciálních modifikovaný s DIC, jak zpomalovat fibrinových šokem a tudíž také zmírňuje účinky spojené s gram-negativní bakteremií. Na králících bylo ukázáno že DEGR-faktor Vila vykazuje na dávce závislý účinek v blokování ukládání fibrinu v ledvinách a plicích, a u baboonů prodlužoval přežití léčených zvířat. V případech akutní bakteremie, endotoxemie nebo DIC dostává pacient vstupní dávku přinejmenším asi 50 pg až 500 g/den, typičtěji 1 mg až 200 mg/den, a výhodněji 10 až asi 175 mg/den u 70 kg pacienta, s udržovacími dávkami poté v rozmezí 50 pg až 500 mg/den, typicky 1 mg až 200 mg/den u 70 kg pacienta.

Farmaceutické prostředky jsou zamýšleny pro parenterální, topické nebo lokální podávání k profylaxi nebo k terapii. S výhodu jsou farmaceutické prostředky podávány parenterálně, t.j. intravenózně, subkutánně nebo intramuskulárně. Tento vynález tedy poskytuje prostředky pro parenterální podávání, jež obsahují roztok molekul modifikovaného faktoru VII rozpuštěných v přijatelném nosiči, s Výhodou vodném nosiči. Lze použít řadu vodných nosičů, např. vodu, pufrovanou vodu, 0,4 % solný roztok, 0,3 % glycin a podobně. Molekuly modifikovaného faktoru VII mohou být rovněž formulovány do liposomových prostředků k dodání do míst poranění nebo k zacílení k nim. Liposomové prostředky jsou obecně popsány např. v U.S. 4 837 028, U.S. 4 501 728, a U.S. 4 975 282, zahrnuto zde odkazem. Prostředky mohou být sterilizovány konvenčními, dobře známými technikami. Výsledné vodné roztoky mohou být plněny k použití nebo filtrovány za aseptických podmínek a lyofilizovány, přičemž před podáváním se lyofilizovaný preparát spojí se sterilním roztokem. Prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné látky, jak jsou potřebné k přiblížení se k fyziologickým podmínkám, jako jsou činidla k nastavení pH a pufrováni, nastavení tonicity a podobně, například octan sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý atd. Koncentrace faktoru VII v těchto prostředcích se může široce méně než asi 0,5 %, obyčejně nebo přinejmenším kolem 1 % až po tak vysokou, jako je 15 nebo 20 %, a bude vybírána prvotně podle objemu tekutiny, viskozit, atd., v souladu s konkrétním způsobem podávání, jež bude přijat.

modifikovaného lišit, t.j. od

Tedy: Typický farmaceutický prostředek k intravenozní infuzi může být připravován tak, aby obsahoval 250 ml sterilního Ringerova roztoku a 10 mg modifikovaného faktoru VII. Konkrétní způsoby přípravy látek k parenterálnímu podávání jsou známé nebo zřejmé osobám zběhlým v oboru a jsou podrobněji popisovány například v Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 vyd., Mack Publishing Co., Easton PA (1982), což je zde zahrnuto odkazem.

Farmaceutické prostředky obsahující modifikovaný faktor VII mohou být podávány k profylaxi nebo k terapii. U terapeutického využití jsou prostředky podávány pacientovi, jenž už trpí chorobou, jak je popsána shora, v množství dostatečném pro léčbu nebo přinejmenším k částečnému zastavení dané choroby a jejich komplikací. Množství tomu adekvátní je definováno jako terapeuticky účinná dávka. Množství účinná pro toto použití budou záviset na vážnosti choroby nebo poškození a na hmotnosti a celkovém stavu pacienta, ale obecně budou v rozmezí od asi 0, 05 mg do asi 500 mg modifikovaného faktoru VII denně u 70 kg pacienta, přičemž se běžněji budou používat dávky od asi 1 mg do asi 200 mg modifikovaného faktoru VII denně. Je potřeba mít na paměti že materiály podle vynálezu mohou obecně být použity u vážných chorobných stavů nebo vážných poškození, to jest v situacích ohrožujících, nebo potenciálně ohrožujících, život. V takovýchto případech, s ohledem na minimalizaci cizích látek a na neimunogenicitu modifikovaného faktoru VII v lidech, bude možné, a bude snad ošetřujícím lékařem pociťováno jako žádoucí, podávat podstatné přebytky těchto prostředků modifikovaného faktoru VII.

U profylaktického použití jsou farmaceutické prostředky obsahující modifikovaný faktor VII podávány pacientovi náchylnému k chorobnému stavu nebo poškození, nebo s jiným rizikem v tomto ohledu, k podpoře pacientových vlastních antikoagulačních kapacit. Takovéto množství je definováno jako profylakticky účinná dávka. U tohoto použití budou přesná množství opět záviset na vážnosti zdravotního stavu pacienta a jeho hmotnosti, ale obecně budou v rozmezí od asi 0,05 mg do asi 500 mg modifikovaného faktoru VII u 70 kg pacienta, přičemž se běžněji budou používat dávky od asi 1 mg do asi 200 mg modifikovaného faktoru VII na 70 kg tělesné hmotnosti.

Mohou se provádět jednotlivá nebo opakovaná podávání, s hladinou dávek a schématem, jež vybere ošetřující lékař. U ambulančních pacientů, kteří potřebují denní udržovací dávky, může být modifikovaný faktor VII podáván například kontinuální infuzí s použitím přenosného pumpovacího systému.

Lokální podávání modifikovaného faktoru VII lze provádět například cestou perfuze, dvojitých balónkových kathetrů, chlopní, inkorporace do cévních štěpů nebo chlopní, hydrogelů použitých k pokrytí balónkových kathetrů zavedenými způsoby. V každém případě prostředek skýtat množství modifikovaného vynálezu, jež je dostatečné pro účinnou léčbu pacienta.

Následující příklady jsou poskytnuty pro vysvětlení, ne pro omezení.

nebo j inými dobře musí farmaceutický faktoru VII podle

Příklad 1

Exprese Ser₃₄₄~>Ala₃₄₄ faktoru VII

Pro vytvoření mutantu faktoru VII v aktivním místě, ^Ser344^->Ala344' w plasmid FVII (565+2463)/pDX (U.S. patent č. 4 784 950, jež je zde zahrnuty odkazem; uložený u American Type Culture Collection pod přístupovým číslem 40205) digerován Xba I a Κρη I, a výsledný 0,6 kb fragment, obsahující kódující oblast pro serin 344, byl izolován. Tento fragment byl klonován do Xba I, Kpn I-digerovaného M13mpl9 jak je ukázáno v Obrázku. Tato manipulace a následné kroky popsané níže byly obecně prováděny podle standardních protokolů (jak jsou popsány například Maniatisem et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982) zahrnuto zde odkazem).

Mutageneza byla provedena na Ml3 templátu podle metody Zollera a Smithe, výše, s použitím mutagenizačního oligonukleotidu ZC1656 (5' TGG GCC TCC GTC CCC CTT 3') a univerzálního druhého primeru ZC87 (5* TCC CAG TCA CGA CGT 3'). Reakční produkty byly hodnoceny s použitím kinasovaného ZC156. Pozitivní plaky byly odebrány a byla připravena templátová DNA a sekvenována od Pst I místa u pozice 1077 po Kpn I místo u pozice 1213. Sekvenční analýza potvrdila přítomnost žádané mutace. Mutantní klon byl označen 1656.

Vektor exprese byl pak zkonstruován s použitím 1656 klonu. Mutagenizovaná sekvence byla izolována z M13 vektoru jako -0,14 kb Pst Ι-Κρη I fragment. Tento fragment byl ligován k 1,7 kb kb kb

Hind III-Xba I fragmentu Xba I-Pst I fragmentu z Kpn I-Hind III fragmentu z z FVII (565+2463)/pDX, 0,5

FVII (565+2463)/pDX a 4,3

FVII (565+2463)/pDX, jak je ukázáno v Obrázku. Přítomnost žádané mutantní sekvence byla potvrzena Pst I digescí mutantních klonů a klonů divokého typu, a Kpn I a Pst I digescí insertu mutantního faktoru VII v M13, přípravou digerované DNA k Southernové hybridizaci a sondování pomocí radioaktivně značeného ZC1656.

Linie buněk křeččích ledvin BHK 570 (uložená u American Type Culture Collection pod přístupovým číslem 10314) byla transfekována dvěma izoláty (označenými #544 a #545) vektoru exprese 1656). Buňky byly připraveny 1:10 naředěním buněk BHK 570 z konfluentní 10 cm misky na pět 10 cm misek s neselektivním médiem (Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium [DMEM] obsahující 10 % fetálního bovinního séra a 1 % PSN antibiotické směsi [GIBCO Life Technologies, Gaithersburg, MD)). Po 24 hodinách, kdy buňky dosahovaly 10 - 30 % konfluence, s jedním izolátem vektoru exprese plasmidem p486 (obsahujícím ori adenoviru 5, SV40 enhancer, hlavní pozdní promotor adenoviru 2, trojčlennou vedoucí sekvenci adenoviru 2, 5'a 3' místa sestřihu, DHFR^r cDNA a SV40 polyadenylační signál v pML-1 (Lusky a Botchan, Nátuře 293: 79-81 (1981)) a 10 μg nosičové DNA (sonikované DNA lososího mlíčí), jak je ukázáno v Tabulce 1. DNA byla přidána do 15 ml zkumavky, pak bylo přidáno 0,5 ml 2X Hepes (25 g Hepes, 40 g NaCl, 1,8 g KC1, 0,75 g Na₂HPO₄.2H₂O, 5 g dextrosy zředěno na 2,5 1 destilovanou vodou a pH nastaveno na pH 6,95-7,0) a zkumavky promíchány.

byly buňky kotransfekovány kódujícího 1656 mutaci,

DNA v každé zkumavce byla precipitována přidáním 0,5 ml 0,25 M CaCl₂, přičemž se přes roztok DNA/Hepes probublával pomocí Pasteurovy pipety vzduch. Zkumavky byly pak promíchány na míchačce typu Vortex, inkubovány při pokojové teplotě po 15 minut a znovu promíchány. Směsi DNA pak byly přidány pipetou po kapkách na misky s buňkami. Miskami se zakroužilo a pak se inkubovaly při 37°C po 4 - 6 hodin. Po inkubaci se přidaly ke každé misce 2 ml 20 % glycerolu, ředěného v Tris-solném roztoku (0,375 g KC1, 0,71 g Na₂HPO₄.2H₂O, 8,1 g NaCl, 3,0 g Tris-HCI, 0,5 g sacharosy zředěno na celkově 1 1 a pH nastaveno na pH 7,9). S miskami pak bylo zakrouženo a misky byly pak ponechány při pokojové teplotě po dvě minuty. Médium pak bylo odstraněno z misek a nahrazeno 2 ml Tris-solného roztoku. Misky byly pak ponechány při pokojové teplotě po dvě minuty a Tris-solný roztok pak byl odstraněn a nahrazen 10 ml neselektivního média. Misky byly inkubovány při 37”C po dva dny.

Tabulka 1

	Transfekce*
544	545	544 kontrola	545 kontrola
Název plasmidu Klon 544	15 μΐ			15 μΐ
Klon 545	—	30 \|	íl	—	30 μΐ
p486	1,5 μΐ	1,5	μΐ	—	—
Nosičová DNA	1,6 μΐ	1,6	μΐ	1,6 μΐ	1,6 μΐ
* Použité 546 0,3 μg/μl,	koncentrace DNA p486 1,49 μg/μl.	byly:	klon 544 0	,7 μg/μl, klon

Po dvou dnech inkubace byly buňky naředěny do selektivního média (DMEM obsahující 10 % fetálního bovinního séra, 1 % PSN antibiotické směsi a 150 nM methotrexát) a naneseny v ředěních 1:100, 1:250 a 1:500 na maxi-misky. Misky byly inkubovány při 37°C po jeden týden. Po jednom týdnu bylo médium vyměněno

- 27 a nahrazeno selektivním médiem a misky byly hodnoceny na tvorbu kolonií.

O osm dní později, po vytvoření kolonií, bylo náhodně vybráno po 12 koloniích z misek ředění 1:500 transfekcí #544 a #545. Každý klon byl nanesen do jedné jamky šestijamkové destičky a rozrůstán v selektivním médiu. Po sedmi dnech byly destičky konfluentní a každý klon byl rozdělen na 10 cm misky se selektivním médiem.

Shora popsané klony a kontrolní buňky transfekované k expresi faktoru VII divokého typu byly metabolicky značeny pomocí ³⁵S-Methionine-Cysteine Protein Labeling Mix (NEN DuPont Biotechnology Systems, Wilmington, DE). Klony byly rozrůstány a připravovány k pokusům s pulzním značením v selektivním médiu. Buňky byly opláchnuty solným roztokem pufrovaným fosfátem (Sigma, St. Louis, MO) a podrobeny čtyřhodinovému pulzu v 20 uCi/ml ³⁵S-Cys-³⁵S-Met. Po čtyřech hodinách byly buňky a supernatanty sebrány. Buňky byly lyžovány v podstatě jak je popsáno Lenkem a Penmanem (Cell 16: 289-302 (1979)) a 400 μΐ každého lyzátů bylo předem vyčeřeno s 50 μΐ staph A (Sigma, St. Louis, MO).

Vzorky z metabolicky značených buňek byly radioimunoprecipitovány (RIP) s první inkubací vzorků s 6 μΐ anti-faktor VII polyklonálních antisér po čtyři hodiny. Do každého vzorku bylo přidáno 60 μΐ promytého stafylokokového proteinu A, a vzorky byly míchány kýváním po 1,5 hodiny při 4°C. Vzorky byly centrifugovány a supernatant odstraněn. Pelety byly promyty dvakrát v 0,7 M RIPA pufru (10 mM Tris, pH 7,4, 1 % kyselina desoxycholová [Calbiochem Corp., La Jolla, CA], 1 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 5 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Do každého vzorku bylo přidáno 100 μΐ lx SDS barviva (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM dithiothreitol, 2 % SDS, 0,1 % bromfenolová modř, 10 % glycerol), a vzorky byly povařeny po 5 minut s následnou centrifugací k odstranění proteinu A. Padesát mikrolitrů každého vzorku bylo podrobeno elektroforéze na 10 % polyakrylamidovém gelu. Výsledky ukázaly, že devět z deseti klonů secernovalo modifikovaný faktor VII.

Příklad 2

Antikoagulační aktivita modifikovaného faktoru VII

Schopnost bílkoviny modifikovaného faktoru VII inhibovat srážení se měřila v jednofázovém srážecím testu s použitím faktoru VII divokého typu jako kontroly. Rekombinantní bílkoviny byly připraveny v podstatě jak je popsáno shora z buněk kultivovaných v médiích obsahujících 5 ug/ml vitaminu K. Různá množství modifikovaného faktoru Vil (z klonu 544) nebo rekorabinantního faktoru VII divokého typu byla ředěna v 50 mM Tris pH 7,5, 0,1 % BSA na 100 μΐ. Směsi byly inkubovány se 100 μΐ plazmy deficientní na faktor VII (George King Bio-Medical Inc., Overland Park, KS) a 200 μΐ thromboplastinu C (Dade, Miami, FL; obsahuje thromboplastin králičího mozku a 11,8 mM Ca⁺⁺). Test srážení se provedl v automatickém přístroji k měření doby koagulace (MLA Electra 800, Medical Laboratory Automation Inc., Pleasantville, NY) a doby srážení byly konvertovány na jednotky aktivity faktoru VII s použitím standardní křivky konstruované s 1:5 až 1:640 ředěními normální spojené lidské plazmy (u níž se předpokládá obsah jedné jednotky faktoru VII na ml; připravena spojením citrátovaných sér od zdravých dárců). S použitím tohoto testu nevykazovaly preparáty modifikovaného faktoru VII žádnou koagulační aktivitu. Tabulka 2 ukazuje výsledky daného testu vyjádřené v dobách srážení pro kontrolní (netransfekované) BHK buňky-kondicionovaná média (+/- vitamin Κ), faktor VII divokého typu a dva izoláty buněk exprimujících modifikovaný faktor VII. Aktivita faktoru VII je viditelná jako zkrácení doby srážení proti kontrolním vzorkům.

Tabulka 2

Vzorek

Ředění

Doba srážení (sec)

Kontrola +K 1:5 33,1

1:10 33,4

Kontrola -K 1:5 34,3

1:10 33,2

Faktor VII 1:20 19,0 divokého typu 1:40 21,5

1:80 23,3 modif ikovaný 1:1 3 3,5

Faktor VII (#6) modif ikovaný 1:1 3 2,5

Faktor VII (#10)

Pro stanovení účinku modifikovaného faktoru VII na substráty plazmatických faktorů se preparáty modifikovaného faktoru VII a rekombinantního nebo nativního faktoru VII divokého typu inkubují buď s faktorem X, nebo s faktorem IX, a jejich aktivace se sléduje pomocí testů srážení nebo elektroforéz v polykrylamidových gelech.

Příklad 3

Schopnost modifikovaného faktoru VII vázat tkáňový faktor

Schopnost modifikovaného faktoru VII kompetovat s faktorem VII divokého typu o tkáňový faktor a inhibovat jeho srážecí aktivitu byla zjišťována v jednofázovém srážecím testu křivky, jež byla mírou plazmě. Tato standardní v přítomnosti limitujícího množství tkáňového faktoru (thromboplastinu).

Doby srážení byly stanoveny v jednofázovém srážecím testu, podobném tomu, jenž je popsán v Příkladu 2. V pokusech se směsmi byla používána limitující množství tkáňového faktoru, konstantní množství faktoru VII divokého typu a vzrůstající množství variantního faktoru VII. Inhibici prokoagulační aktivity faktoru VlI/VIIa je vidět jako vzrůst doby srážení v testech s obsahem vzrůstajícího množství variantního faktoru VII.

Množství aktivity faktoru VII v testovaných vzorcích se vypočítalo jako procento ze standardní aktivity faktoru VII v normální spojené křivka byla vytvořena s použitím seriálního ředění normální spojené plazmy ve fosfátem pufrovaném roztoku (PBS), jež mělo rozsah od 1:5 do 1:640. Pro tento účel se předpokládalo, že normální plazma obsahuje přibližně 500 ng/ml faktoru VII a toto se považovalo za jednu jednotku aktivity. K měření doby srážení na automatickém přístroji MLA Electra 800 se používaly směsi 100 μΐ plazmy deficientní na faktor VII, 100 μΐ různě zředěné plazmy, a 200 μΐ thromboplastinu C (Dade, Miami, FL). Pro získání standardní křivky se výsledky vynesly jako procento aktivity (1:5 - 100 % aktivity) proti době srážení v sekundách.

Test vyžadoval, aby média, obsahující faktor VII divokého typu a variantní faktor VII, obsahoval méně než jedno procento séra. Ředění se prováděla v PBS tak, aby doby srážení spadaly do hodnot standardní křivky. Typické bylo ředění alespoň 1:2. Konečný objem byl 100 μΐ. V experimentech se testovaly dva různé klony Ser₃₄₄~>Ala variantního lidského faktoru VII, označené #10 a #6. Výsledky předvedené v tabulace níže ukazují, že procento aktivity faktoru Vila se snižuje se vzrůstajícím množstvím variantního faktoru VII.

Tabulka 3

Výsledky testů (divoký typ) se	směsí se Ser₃₄₄~>Ala variantami (B4A1 médium
bralo jako 100 % aktivity	při 10 μΙ/reakci)
	množství	množství	BHK	Procento
^Ser344~^>Ala	variantního	média	kontrola⁴	aktivity
klon č.	média	Β4Α1		FVIIa
#10	10 μΐ	10 μΐ	0	70
#10	20 μΐ	10 μΐ	0	51
#10	30 μΐ	10 μΐ	0	⁴³
#10	40 μΐ	10 μΐ	0	34
#10	50 μΐ	10 μΐ	0	28
#10 (-K)*	20 μΐ	10 μΐ	0	78
#6	10 μΐ	10 μΐ	0	74
#6	20 μΐ	10 μΐ	0	56
#6	30 μΐ	10 μΐ	0	46
#6	40 μΐ	10 μΐ	0	41
#6	50 μΐ	10 μΐ	0	32
#6 (-K)	20 μΐ	10 μΐ	0	85
BHK kontrola	0	10 μΐ	20 μΐ	91
BHK kontrola(-K)	0	10 μΐ	20 μΐ	107

⁺ Netransfekované kondicionované médium * Pro expresi varianty faktoru VII byly buňky rozrůstány v přítomnosti vitaminu K, pokud není vyznačeno (-K)

Tyto pokusy ukázaly, že varianty faktoru VII, jež mají substituci Ser₃₄₄~>Ala, kompetují s nativním faktorem VII s dávkovou závislostí a inhibují prokoagulační aktivitu nativního faktoru VlI/VIIa. Lze tedy usoudit, že Ser₃₄₄~>Ala variantní lidský faktor VII kompetuje s nativním lidským faktorem Víla a v důsledku toho inhibuje aktivaci faktoru X nebo IX v lidské plazmě.

Příklad 4

Reakce faktoru VII s PPACK

Rekombinantní faktor VII byl produkován v transfekovaných křečcích ledvinných buňkách. Tato bílkovina byla purifikována a aktivována jak bylo zveřejněno Thimem et al. (Biochemistry 27: 7785-7793, 1988), Brinkousem et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 1382-1386, 1989) a Bjoernem a Thimem (Res. Discl. No. 269, 564, 1986), což je zde zahrnuto odkazem. Médium tkáňové kultury bylo odebráno, zfiltrováno a zředěno ke snížení koncentrace solí. Zředěné médium pak bylo frakeionováno chromatografii na anexu s použitím elučního pufru obsahujícího CaCl₂. Byla vzata frakce faktoru VII a dále čištěna imunochromatografii s použitím anti-faktor VII monoklonální protilátky dependentní na vápníku. Byla provedena další purifikace s použitím dvou kroků anexové chromatografie, přičemž faktor VII byl eluován s použitím CaCl₂respektive NaCl. Faktor Víla byl získán v konečném eluátu.

Rekombinantní faktor Vila (1 μΜ) v 50 mM Tris-HCI, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, pH 7,4, byl inkubován s 20 μΜ PPAck (D-fenylalanyl-prolyl-arginyl chlormethylketon; Calbiochem, La Jolla, CA) po 5, 20 a 60 minut. Pak byl přidán pufr obsahující chromogenní substrát S2288 (H-D-isoleucin-L-prolyl-L-arginin p-nitranilid; Kabi Vitrus AB, Molndal, Švédsko) k dosažení 2,5 násobného zředění a konečné koncentrace 0,3 mM S2288. Byla měřena tvorba p-nitroanilinu a porovnávána s výsledky s použitím nezpracovaného faktoru Víla jako kontroly. Výsledky ukázaly, že faktor Víla je za těchto reakčních podmínek plně inaktivován po asi 60 minutách.

Příklad 5

Tvorba DEGR-faktoru Vila

Rekombinantní lidský faktor Vila byl připraven jak je popsáno v Příkladu 4. Rekombinantní lidský faktor Vila v 10 mM glycinovém pufru, pH 8,0, 10 mM caci₂, 50 mM Naci byl naředěn na koncentraci 1,5 mg/ml. K faktoru Vila byl přidán desetinásobný molární přebytek dansyl-L-Glu-Gly-Arg-chlormethylketonu, DEGRck (Calbiochem, La Jolla, CA), jenž byl rozpuštěn v destilované vodě. Po 2 hodinové inkubaci při 37C byl ke směsi přidán druhý desetinásobný, molární přebytek DEGRck a směs byla inkubována další 2 hodiny 37°C. K faktoru Vila byl přidán třetí desetinásobný molární přebytek DEGRck a směs byla inkubována po přibližně 16 hodin při 4’C. Vzorek DEGR-faktoru Vila pak byl extenzivně dialyzován při 4’C proti Tris-pufrovanému solnému roztoku (0,05 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 7,5) k odstranění veškerého volného DEGRck.

Konečná směs DEGR-faktoru Vila byla testována na přítomnost volného DEGRck v testu Faktoru Xa s chromogenním substrátem. Směs DEGR-faktoru Vila byla přidána k purifikovanému lidskému faktoru Xa spolu s chromogenním substrátem S-2222. Tento substrát je specificky štěpen faktorem Xa a není štěpen faktorem Vila. Nenavázaný DEGRck ve směsi je schopen vázat se k faktoru Xa a tím inhibovat chromogenní aktivitu tohoto faktoru Xa. Přidáváním volného DEGRck ke směsi Xa byla generována standardní křivka k měření hladiny volného DEGRck v roztoku versus inhibice chromogenní aktivity faktoru Xa. Analýza směsi DEGR-faktoru Vila ukázala, že poměr volný DEGRck : DEGR-faktor Vila byl po extenzivní dialýze menší než 0,5 %, což zajišťovalo, že inhibice pozorovaná pro DEGR-faktor Vila v různých testovacích systémech popsaných níže nebyla způsobována přítomností volného DEGRck.

Příklad 6

Tvorba faktoru Xa na buňkách potkaního hladkého svalu vaskulárního hladkého svalu byly analyzovány na buněčně-povrchového tkáňového faktoru měřením buněk stimulovat konverzi faktoru X na faktor Xa chromogenního substrátu, jenž je specifický pro (Clowes et al., J. Clin. naneseny na 96-jamkové

Buňky přítomnost schopnosti s použitím faktor Xa.

Buňky potkaního hladkého svalu Invest. 93: 644-651 (1994)) byly kultivační destičky (Američan Scientifič Products, Chicago, II.) při 8 000 buněk na jamku v růstovém médiu (Tabulka 4).

Tabulka 4

500 ml Dulbeccova modifikovaného Eaglova média (DMEM) (GXBCO-BRL, Ga i thersburg, MD) % fetálního bovinního séra (Hyclone, Logan, UT) mM pyruvát sodný (Irvin, Santa Ana, CA)

0,9 mg/ml L-glutaminu (Hazelton, Lenexa, KS) lx PSN; (lOOOx je 5 mg/ml penicilín, 5 mg/ml streptomycin, 10 mg/ml neomycin) (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)

Po inkubaci 48 hodin při 37°C bylo médium vyměněno za bezsérové médium (Tabulka 5).

Tabulka 5

250 ml Dulbeccova modifikovaného Eaglova média (DMEM)

250 ml Hamova F-12 média (Fred Hutchinsdn Cancer Research Center,

Seattle, WA) mM pyruvát sodný

0,29 mg/ml L-glutaminu μΜ transferin (JRH, Lenexa, KS) μΜ insulin (GIBCO-BRL) ng selénu (Aldrich, Milwaukee, WI) mg/ml bovinního sérového albuminu (Sigma, St. Louis, MO)

Buňky byly inkubovány 72 hodin při 37°C. Po inkubaci byl k buňkám přidám bud PDGF-BB (10 ng/ml) anebo 10 % telecího séra ke stimulaci exprese tkáňového faktoru (Taubman et al., J. Clin. Invest. 91: 547-552, 1993). Paralelní soubor buněk nedostal ani PDGF-BB ani sérum k monitorování vnitřní aktivity nestimulovaných buněk. Po inkubaci po 6 hodin byl k buňkám přidán rekombinantní faktor Vila na konečnou koncentraci 10 nM. Jeden soubor buněk neměl přidaný faktor Vila jako negativní kontrola. Buňky byly inkubovány 2 hodiny při 37 C a promyty HEPES pufrem (10 mM HEPES, 137 mM NaCl, 4 mM KCl, 5 mM CaCl₂, 11 mM glukosa, 0,1 % BSA). Po promytí byly buňky inkubovány po 5 minut s 50 μΐ na jamku 200 nM lidského faktoru X, purifikovaného z plazmy, v Tris-pufrovaném solném roztoku doplněném 5 mM CaCl₂. Do každé jamky se přidalo 25 μΐ 0,5 M EDTA a 25 μΐ 800 μΜ roztoku S-2222 chromogenního substrátu (Kabi Pharmacia, Franklin, OH). Destičky byly inkubovány po 40 minut při pokojové teplotě a pak analyzovány při 405 nm s použitím čtečky mikrodestiček THERMOMAX (Molecular Devices, Menlo Park, CA).

Tabulka 6 ukazuje vzrůst absorbance pro jamky se zpracováním faktorem Vila v porovnání s kontrolními jamkami (bez přidání faktoru Vila). Vzrůst absorbance je přímým měřením hladiny faktoru Xa vytvořeného v jamkách a jeho následného štěpení chromogenního substrátu, jež uvolňuje chromofor. Data také prokazuji, že hladina chromogenní aktivity v buňkách předem zpracovaných PDGF-BB nebo 10 % fetálním telecím sérem je vyšší než u nestimulovaných buněk.

Tabulka 6

Testovaný vzorek	^OD405
Kontrola	0,043
Vnitřní	0,247
PDGF-BB	0,360
10 % FGS	0,342

Tyto výsledky jasně ukazují na existenci faktor Vlla-dependentní aktivace faktoru X na faktor Xa na buněčném povrchu buněk potkaního vaskulárního hladkého svalu.

Příklad 7

Inhibice buněčně-povrchové chromogenní aktivity

DEGR-faktorem Vila

Buňky potkaního hladkého svalu byly naneseny na 96-jamkové kultivační destičky jak je popsáno výše. Buňky byly kultivovány po 72 hodin v bezsérovém médiu jak je popsáno shora a pak se na ně působilo 6 hodin přidáním 10 % fetálního telecího séra ke stimulaci exprese tkáňového faktoru. Po stimulaci se do jamek přidal pouze pufr (kontrola), 10 nM faktor Vila, nebo 10 nM faktor Vila + 100 nM DEGR-faktor Vila. Buňky byly inkubovány 2 hodiny při 37°C a promyty HEPES pufrem. Po promytí byly buňky inkubovány po 5 minut s 50 μΐ na jamku 200 nM faktoru X v Tris-pufrovaném solném roztoku doplněném 5 mM CaCl₂- Do každé jamky se přidalo 25 μΐ 0,5 M EDTA a 25 μΐ S-2222 chromogenního substrátu (800 μΜ) (Kabi Pharmacia). Buňky byly inkubovány po 40 minut při pokojové teplotě. Chromogenní aktivita byla analyzována při 405 nm jak je popsáno shora.

Tabulka 7 ukazuje stimulaci chromogenní aktivity v jamkách zpracovaných pouze faktorem Vila a inihibici stimulace,když se s faktorem Vila koinkubuje DEGR-faktor Vila. Tyto výsledky

prokazují,	že DEGR-faktor Vila	působí	jako kompetítivní
antagonista	ve vazbě faktoru Vila	, čímž	inhibuje aktivaci
faktoru X na	faktor Xa a následné štěpení S-2222 chromogenu.
	Tabulka 7
	Testovaný vzorek		^od405
	Kontrola		0,035
	Faktor Vila		0,342
	Faktor Vila + DEGR-faktor	Vila	0,073

Příklad 8

Dávkově závislá inhibice buněčně-povrchové chromogenní aktivity na buňkách potkaního hladkého svalu DEGR-faktorem Vila

Buňky potkaního hladkého svalu byly naneseny na 96-jamkové kultivační destičky při 8 000 buněk na jamku v růstovém médiu doplněném 10 % fetálního telecího séra (jako v Tabulce 4 bez 10 % fetálního telecího séra). Po 5 dnech bylo médium odstraněno a k buňkám se přidaly rostoucí koncentrace faktoru Vila samotného nebo 10 nM faktor Vila s rostoucími koncentracemi DEGR-faktoru Vila. Buňky byly inkubovány se směsmi faktoru VII 2 hodiny při 37°C. Po inkubaci byly buňky promyty a inkubovány po 5 minut při pokojové teplotě s 50 μΐ 200 nM faktoru X v Tris-pufrovaném solném roztoku. Každá jamka měla přidáno 25 μΐ

0,5 M EDTA a 25 μΐ 800 μΜ S-2222 (Kabi Pharmacia) destičky byly inkubovány po 40 minut při pokojové teplotě. Chromogenní aktivita byla analyzována ve čtečce mikrodestiček při 405 nm jak je popsáno shora.

Tabulka 8 ukazuje dávkově závislý vzrůst ve chromogenní aktivitě s rostoucími množstvími faktoru Vila přidanými do jamek. Když se k buňkám přidávala směs DEGR-faktoru Vila s 100 nM faktorem Vila (Tabulka 9), nastávala dávkově závislá inhibice v chromogenní aktivitě. Molární poměr 1:1 DEGR-faktor Vila: faktor Vila inhiboval přibližné 95 % chromogenní aktivity. Tato data napovídají, že v tomto experimentálním uspořádání má na buňkách hladkého svalu v kultuře DEGR-faktor Vila afinitu k buněčně-povrchovému tkáňovému faktoru významně vyšší než nativní faktor Vila. Kdyby DEGR-faktor Vila a faktor Vila měly stejnou afinitu pro vazbu tkáňového faktoru, pak by pozorovaná hladina inhibice při přidání těchto dvou molekul k buňkám ve shodném molárním poměru nebyla tak vysoká.

Tabulka 8

Konc. faktoru Vila (nM) ^OD405

0,10	0,005
0,39	0,025
1,56	0,058
6,25	0,111
25,00	0,154
100,00	0,208

Tabulka 9 ukazuje dávkově závislou inhibici chromogenní aktivity na buňkách potkaního hladkého svalu DEGR-faktorem Vila. Rostoucí koncentrace DEGR-faktoru Víla byly koinkubovány s 100 nM faktorem Víla a pomocí chromogenního substrátu S-2222 byla stanovena chromogenní aktivita faktoru Xa.

Tabulka 9

Konc. DEGR-faktoru Víla (nM) ^OD405

0,10	0,208
0,39	0,176
1,56	0,116
6,25	0,073
25,00	0,026
100,00	0,014

Příklad 8

Inhibice tvorby faktoru Xa DEGR-faktorem Víla v testu s rozpustným tkáňovým faktorem

Konverze faktoru X na faktor Xa s použitím purifikovaného rekombinantního rozpustného tkáňového faktoru byla určována pomocí chromogenního testu. Tkáňový faktor byl exprimován a purifikován ze Saccharomyces cerevisiae (Shigematzu et al., <7. Biol. Chem. 267: 21329-21337, 1992). Rozpustný tkáňový faktor byl purifikován a charakterizován Dr. Kisielem (University of New Mexico). Byla připravena reakční směs obsahující 65,9 μΐ rozpustného tkáňového faktoru (2,2 μΜ),

Sigma, St. Louis, MO), 29,5 μΐ lidského

29,0 μΐ PCPS (1 mM, faktoru X (4,1 μΜ),

2,77 ml Hankova pufru (25 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM

KC1, 5 mM CaCl₂, 0,1 % BSA). Do každé jamky 96-jamkové mikrotitrační destičky se přidalo 40 μΐ směsi tkáňového faktoru/ faktoru X, dvacet pět mikrolitrů faktoru Vila ředěného TBS a 25 μΐ faktoru Vila ředěného TBS. Byla zařazena kontrola obsahující 40 μΐ směsi tkáňového faktoru/faktoru X, dvacet pět mikrolitrů faktoru Vila ředěného TBS a 25 μΐ samotného TBS. K reakčním směsím v jamkách se přidalo 10 μΐ S-2222 (4 mM) chromogenního substrátu a provedla se inkubace po 2 - 10 minut při pokojové teplotě. Výsledky byly analyzovány při 405 nM ve čtečce mikrodestiček jak je popsáno shora. ^;

Stanovení standardní křivky pro aktivaci faktorem Vila bylo provedeno s použitím rostoucích koncentrací faktoru Vila přidaných v nepřítomnosti DEGR-faktoru Vila. Tyto výsledky, předvedené v Tabulce 10, ukazují, že existuje vzrůst v chromogenní aktivitě dávkově závislý na rostoucích množstvích faktoru Vila, přidaných do reakční směsi. Současné přidání různých množství DEGR-faktoru Vila a 100 nM faktoru Vila vedlo k dávkově závislému poklesu v chromogenní aktivitě (Tabulka 11). Tato data dokládají, že DEGR-faktor Vila působí jako kompetitivní aňtagonista ve vazbě nativního faktoru Vila k rozpustnému tkáňovému faktoru, a že tedy inhibuje tvorbu faktoru Xa, jak je měřeno poklesem v chromogenní aktivitě na chromogenním substrátu S-2222.

Stimulace chromogenní aktivity faktoru Xa rostoucími koncentracemi faktoru Vila, přidaného k rozpustnému tkáňovému faktoru. Změny v optické hustotě byly měřeny s použitím chromogenního substrátu S-2222.

Tabulka 10

Konc. faktoru Vila (nM)

OD

405

0,78

1,56

3,12

6,25

12,50

25,00

50,00

100,00

0,168

0,288

0,478

0,694

0,764

0,790

0,738

0,770

Tabulka 11

Měřena je inhibice chromogenní aktivity faktoru DEGR-faktoru Vila k rozpustnému tkáňovému faktoru za nativního faktoru Vila. Změny v optické hustotě s použitím chromogenního substrátu S-2222.

Xa přidáním přítomnosti byly měřeny

Konc. DEGR-faktoru Vila (nM) ^OD405

0	0,810
50	0,750
100	0,609
200	0,296
400	0,167
800	0,083
1000	0,055

Příklad 10

Inhibice koagulace DEGR-faktorem Vila

Standardní srážecí testy k monitorování účinku DEGR-faktoru Vila na dobu srážení byly připraveny jak následuje:

s citrátem sodným jako μΐ DEGR-faktoru Vila (20 mM Tris, pH 7,4,

DEGR-faktoru Vila přidalo obsahujících 25 mM CaCl100 μΐ normální babooní plazmy, odebrané antikoagulantem, bylo přidáno k 100 o různých koncentracích, ředěnému v TBS

150 mM NaCl). Vzorky byly promíchány a krátce inkubovány při 37 °C. Vzorky byly dány do automatického přístroje k měření doby koagulace Electra 800 (Medical Laboratory Automation, Pleasantville, NY). Po inkubaci se se k preparátům 200 μΐ preparátů tkáňového faktoru, Preparáty tkáňového faktoru byly připraveny jako solný extrakt z babooního mozku z čerstvě zamrzlé mozkové tkáně a charakterizovány na schopnost iniciovat koagulaci v babooní plazmě. Byla vybrána koncentrace tkáňového faktoru, jež dává dobu srážení o asi 40 vteřinách.

Tato data, předvedená v Tabulce 12, dokládají dávkově závislý vzrůst doby sráženi DEGR-faktoru Vila. Dávka tak nízká, jako následek významné zvýšení doby srážení.

způsobovaný přidáním je 1 μg/ml, již měla za srážení způsobovaný

Tabulka 11

Dávkově závislý vzrůst doby

DEGR-faktorem Vila

DEGR-faktor Vila ^g/ml plazmy)	Doba srážení (vteřin)
0	40,7
0,5	46,2
1,0	50,8
2,5	64,5
5,0	108,1
10,0	158,4

Příklad 11

Inhibice akumulace destiček DEGR-faktorem Vila

DEGR-faktor Vila byl analyzován na schopnost inhibovat akumulaci destiček v místech tepenné trombózy způsobené mechanickým poškozením u primátů jiných než humánních. Použil se model aortické endarterektomie u baboonů, v podstatě jak je popsán Lumsdenem et al. (Blood 81: 1762-1770 (1993)). Řez babůoní aorty délky 1 2 cm byl vyňat, převrácen a seškrábán k odstranění intimy této tepny a přibližně 50 % médie. Tepna byla navrácena do své správné orientace, kanelována na obou koncích a umístěna do mimotělní odbočky u baboona, čímž byla mechanicky poškozená tepna exponována ke krvi baboona prostřednictvím odbočky. Těsně před otevřením této odbočky pro cirkulující krev byly do zvířete intravenózné injikovány ¹¹¹I-značené autologní destičky. Hladina akumulace destiček v daném místě poškozené tepny byla stanovena zobrazením gama kamerou v reálném čase.

Hodnocení DEGR-faktoru Vila na inhibici akumulace destiček se provedlo s použitím bolus injekce DEGR-faktoru Vila nebo kontrolního solného roztoku, což bylo podáváno těsně před otevřením odbočky. Poškozené tepny byly měřeny nepřetržitě po 60 minut. Dávka 0,005 mg/kg DEGR-faktoru Vila inhibovala akumulaci destiček. Při 1.0 mg/kg bolus injekci bylo inhibováno přibližně 90 % akumulace destiček v čase 1 hodina po podávání léku. Tyto výsledky jsou ukázány v Obr. 2.

že inhibice tkáňového faktoru významně inhibovat vývoj trombů

Tato data ukazují, DEGR-faktorem Vila může v primátím, jiném než lidském, modelu akutního cévního poškození.

Příklad 12

DEGR-FVIIa inhibuje cévní vaskulární restenózu následující po balónkové angioplastii u atherosklerotických králíků

DEGR-FVIIa byl hodnocen na schopnost modulovat vytváření lézí následující po balónkové angioplastii u bílých novozélandských (NZW) atherosklerotických králíků. Tento zvířecí model je dobře charakterizován a je prověřen jako dobrý model pro hodnocení anti-thrombotických sloučenin v tvorbě vaskulárních lézí (Gimple et al., Circulation 86: 1536-1546 (1992) a Rogosta et al., Circulation 89: 1262-1271 (1994)). Zvířecí model použitý k hodnocení DEGR-FVIIa je v podstatě jak je popsáno Ragostou, ibid.

Králíkům byla dána anesteze pomocí intramuskulární injekce 5 mg/kg xylazinu a 35 mg/kg ketaminu. Proximální femorální tepny byly exponovány řezem pod inguinálním ligamentem s proximálními a distálními ligaturami. Izolované segmenty byly kanylovány jehlami velikosti 27. Byl vytvořen otvor punkcí jehlou. Izolované segmenty byly promyty solným roztokem k odstranění zbytků krve a vysušeny vzduchem při rychlosti infuze 80 ml/min po 8 minut. Po vysušení vzduchem byly izolované segmenty znovu promyty solným roztokem a ligatury byly odstraněny. Hemostáze byla udržována rteokluzivním místním tlakem. Segmenty byly vyznačeny kovovými sponami. Lokální spazmata byla ošetřena Xylocainem 1 % lokálně. Den následující po operaci byla zvířata dána na dietu s 1 % cholesterolu a 6 % podzemnicového oleje po jeden měsíc, do balónkové angioplastie. K zmírnění postoperačních bolestí byl podáván orálně Tylenol 10 mg/kg po 3 - 5 dní. Ambipen lcc byl elastická protažení podán po chirurgickém zásahu během postoperačních dnů 3 až 5.

Podávání testovaného léku zvířatům sestávalo z počáteční bolus injekce těsně před balónkovou angioplastií, s následovnou nepřetržitou systémovou infuzi pomocí osmotické pumpy cestou vnitřní jugulární žíly. Trvání infuze bylo tři dny. Kontrolní zvířata dostala heparin, 150 U/kg IV boluš, před balónkovou angioplastií, s následovnou infuzi solného roztoku. Zvířata léčená DEGR-FVIIa dostala 1 mg/kg bolus injekci, následovanou infuzi 50 μg/kg/hod.

Pro umístění osmotických pump pr nepřetržitou systémovou infuzi byla zvířatům dána anesteze, jak je popsáno shora, a udržována během celé procedury dalšími IM injekcemi ketaminu a Xylazinu. Pravá vnitřní jugulární žíla byla izolován skrz středový krční řez tupou disekcí a distální konec byl podvázán. Do pravé vnitřní jugulární žíly byla zavedena silikonová hadička (PE-160). Byl vytvořen subkutánní tunel pro této trubičky, a tato trubička byla spojena s osmotickou pumpou. Osmotická pumpa byla implantována na záda králíka. Pravá společná karotidová tepna byla izolována tupou a distální konec podvázán. Cestou arterioktomie byl 5F zavaděč a bylo postupováno ke spojení aortického Byla vytažena krev pro stanovení parametrů hemostáze, disekcí umístěn oblouku.

a hladin léčiv a cholesterolu. Intraarteriálně bylo injikováno 20 mg xylocainu. Byl proveden kontrolní aortoiliofemorální angiogram cestou 5F Bermanova kathetru umístěného nad aortickým rozdvojením s použitím 3 - 4 ml renografinu injikovaného ručně v průběhu 3 vteřin.

Po odstranění Bermanova kathetru byl do sestupné aorty zaveden 0,014 palcový řídící drát a umístěn nad aortickým rozdvojením. Za fluoroskopického vedení byl zaveden kathetr tomto postupu, femorální tepny balónkové angioplastie patřičné velikosti 2,0 až 2,5 mm, bylo s ním postupováno podle řídícího drátu, a byl umístěn přes stenózu. Balónek byl nafouknut na 6 atmosfér po 60 vteřin ručním inflátorem. Byla provedena tři nafouknutí s 60 vteřinovými intervaly mezi sebou. Tento postup byl proveden u obou femorálních tepen každého zvířete.

Po balónkovém roztažení byl angioplastový kathetr vytažen a Bermanův kathetr znovu zaveden do polohy 3 cm na aortickým rozdvojením. K minimalizaci spazmat bylo intraarteriálně podáno 20 mg lidokainu. Angiogram, jak je popsán shora, byl proveden po Mřížka rozměru 1 cm byla umístěna na úrovni pro výpočet skutečného průměru. Pak byl kathetr vyňat. Pravá karotidová tepna byla podvázána 3-0 hedvábím a rána sešita vrstvami. Byl podán ambipen a acetaminofen jako shora.

Prothrombinové doba a koncentrace DEGR-FVXia v krvi byly stanoveny v čase těsně před bolus injekcí testované sloučeniny, 1 hod po injekci a ve 3. dni na konci nepřetržité infuze. Získaly se 1 až 2 ml citrátované plazmy s stanovovaly se prothrombinové doby a hladiny antigenu.

Standardní srážecí testy k monitorování prothrombinové doby u kontrolních a DEGR-faktorem Vila ošetřených zvířat byly použity jak následuje: 25 μΐ testované králičí plazmy, odebrané s citrátem sodným jako antikoagulantem, bylo přidáno k 150 μΐ TBS (20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl). Vzorky byly promíchány a dány do automatického přístroje k měření doby koagulace Electra 800 (Medical Laboratory Automation, Pleasantville, NY). Po inkubaci se se k preparátům plazmy přidalo 200 μΐ preparátů thromboplastinu (Sigma Chemical) obsahujících 25 mM CaCl₂· Byla vybrána koncentrace thromboplastinu, jež dává u kontrolní králičí plazmy dobu srážení o přibližně 20 vteřinách.

Ke stanovení koncentrace DEGR-FVIIa v plazmě kontrolních a DEGR-faktorem Vila ošetřených zvířat byl použit ELISA test. Tento test zahrnoval předně naředění monoklonální protilátky proti lidskému FVII (Dr. W. Kisiel, University of New Mexico) na 2 μg/ml v 0,1 M uhličitanovém pufru pH 9,6, a přidání 100 μΙ/jamku na 96-jamkové destičky. Destičky pak byly inkubovány při 4°C přes noc a poté promyty dvakrát promývacím pufrem (PBS,

4D pH 7,4, obsahující 0,05 % Tween 20). Blokování nespecifických vazebných míst bylo dosaženo s 200 μΐ blokovacího pufru na jamku (PBS, pH 7,4, obsahující 0,05 % Tween 20 1 % BSA) inkubací při 37°C po 2 hodiny s následným promytím promývacím pufrem.

Po blokování byla aplikována standardní diluční série DEGR-FVIIa v rozsahu od 20 do 0,027 ng/ml spolu s diluční sérií testované králičí plazmy (1:100 až 1:4000 v blokovacím pufru) v přidáních 100 μΙ/jamku. Neimunní králičí plazma se použila jako negativní kontrola. Destičky pak byly inkubovány 1 hod. při 37 °C s následnými čtyřmi promytími promývacím pufrem.

DEGR-FVIIa byl detegován přidáním 100 μΙ/jamku ředění 1:1000 králičí polyklonální protilátky proti lidskému FVII (Dr. Kisiel, University of New Mexico) v blokovacím pufru. Destičky byly inkubovány 1 hod. při 37°C s následnými pěti promytími promývacím pufrem. Specifická vazba protilátky byla detegována s použitím 100 μΙ/jamku ředění 1:2000 peroxidázového konjugátu ovčí proti-králičí inkubovány 1

Destičky byly šesti promytími substrátu v 0,2 M Po 1-3 (Tágo, lne.) s následnými h₂o₂) reakce zastavena

IgG protilátky hod. při 37’C promývacím pufrem. Nakonec se přidalo 100 μΐ roztoku (0,42 mg/ml o-fenylendiamin dihydrochloridu (OPO) citrátovém pufru, pH 5,0, obsahujícího 0,3 % minutách při pokojové teplotě byla barevná přidáním 100 μΐ/jamku 1 N H₂SO₄ a destičky byly odečteny při 490 nm na spektrofotometru pro mikrodestičky. Koncentrace DEGR-FVIIa ve vzorcích plazmy byla stanovena porovnáním hodnot A₄₉₀ neznámých s hodnotami DEGR-FVIIa standardní křivky.

Analýza vzorků plazmy na prothrombinové doby resp. hladiny DEGR-FVIIa antigenu je ukázána v Tabulce 13 resp. Tabulce 14. Data jsou prezentována pro každé jednotlivé zvíře. Tabulka 15 ukazuje souhrn středních srážecích dob. Ve všech případech měla DEGR-FVIIa ošetřená zvířata zvýšenou prothrombinovou dobu v časovém bodu u 1 hodiny po bolus injekci, jež se navrátila blízko k hladinám před působením v časovém bodu po 3 dnech. Analýza hladin DEGR-FVIIa antigenu rovněž ukazuje vysokou hladinu DEGR-FVIIa v plazmě v časovém bodu u 1 hodiny, v rozsahu mezi 2 6 μg/ml v plazmě, s mnohem nižšími hladinami v oběhu v časovém bodu po 3 dnech. Hladiny DEGR-FVIIa měřené v období 1 hod.

odpovídají předpovězenému vzrůstu prothrombinové doby, jak je stanoveno přidáním DEGR-FVIIa do normální králičí plazmy in vitro a stanovením prothrombinové doby ve standardním ředícím thromboplastinovém testu.

Tabulka 13

Měření prothrombinové doby

		Doba srážení (vteřin)
Zvíře č.	Působení	před působením	1 hod.	3 dny
73	kontrola	24,8	22,3	17,8
74	kontrola	24,8	27,9	18,6
75	kontrola	24,6	N/D	20,5
76	kontrola	22	N/D	17,9
169	kontrola	21,2	22,9	22
170	kontrola	24,9	23,5	18,6
173	kontrola	25,9	21	20,8
174	kontrola	25	29,4	20,1
77	DEGR-FVIIa	22,5	40,1	18,3
78	DEGR-FVIIa	24,3	34	20,9
80	DEGR-FVIIa	24,7	50	21,7
96	DEGR-FVIIa	N/A	N/A	21
97	DEGR-FVIIa	23,6	45,8	21,2
171	DEGR-FVIIa	20,6	41,6	21,9
172	DEGR-FVIIa	23,5	22,3	22,4

N/A = data nebyla dostupná

Tabulka 14

ELISA k detekci DEGR-FVIIa v králičí plazmě

		FVIIa ELISA (ng/ml)
Zvíře č.	Působení	před působením	1 hod.	3 dny
73	kontrola	0	13	0
74	kontrola	36	14	4
75	kontrola	0	N/A	9
76	kontrola	0	N/A	14
169	kontrola	0	0	1
170	kontrola	0	0	0
173	kontrola	36	31	0
174	kontrola	87	86	0
77	DEGR-FVIIa	0	3210	160
78	DEGR-FVIIa	1	4950	102
80	DEGR-FVIIa	13	4543	7
96	DEGR-FVIIa	65	4900	661
97	DEGR-FVIIa	4	4600	117
171	DEGR-FVIIa	13	2145	502
172	DEGR-FVIIa	9	2830	228

N/A = data nebyla dostupná

Tabulka 15

Statistický souhrn srážecí doby plazmy

NEPÁROVANÝ t-TEST X PŘEDODBĚR

DF: Nepárovaná t hodnota Pravděp. (2-okr.):

12	1,12	0,2852
Skupina:	Počet:	Střed:	St. odch.:	St. chyba:
kontrola	8	24,15	1,64	0,58
DEGR-FVIIa	6	23,2	1,48	0,6
NEPÁROVANÝ	t-TEST X		1 HOD	POST ANGIO
DF:	Nepárovaná	t hodnota	Pravděp	. (2-okr.):
10	-5,44		0,0003
Skupina:	Počet:	Střed:	St. odch.:	St. chyba:
kontrola	6	24,5	3,35	1,37
DEGR-FVIIa	6	40,8	6,53	2,67

NEPÁROVANÝ t-TEST X

DF: Nepárovaná t hodnota

1# -2,04

DNY POST ANGIO

Pravděp. (2-okr.): 0,0622

Skupina:	Počet:	Střed:	St. odch.:	St. chyba:
kontrola	8	19,54	1,53	0,54
DEGR-FVIIa	7	21,06	1,33	0,5

Tři týdny po angioplastií byl zopakován následný angiogram, jak je popsán shora, cestou levé karotidové tepny, těsně před usmrcením zvířete. Přes vertikální dolní abdominální řez byla izolována distální aorta, vyvázána proximálně, a nad aortickým rozdvojením byla zavedena perfuzní kanyla. Distální aorta byla vypláchnuta 50 ml solného roztoku s následnou in vivo fixací 500 ml roztoku Histochoice (AMRESCO, Solon, OH) pomocí infuze během 15 min. při 120 mmHg. Jakmile perfuze začala, zvířata byla usmrcena předávkováním nembutalem (3 ml fenobarbitalu sodného IV, 65 mg/ml). Úsek 5 cm femorální tepny byl oboustranně vyříznut. Tkáň byla uschována pro světelnou mikroskopii v roztoku Histochoice.

Ke stanovení vývoje intimálních lézí v místě balónkové angioplastie byly femorální tepny nařezány na postupné 3 mm řezy, zality do parafinu a řezány řezy z četných oblastí každé tepny. Řezy byly dány na skleněná podložní sklíčka a sklíčka byla barvena hematoxylinem a eosinem a Van Giemsonovými barvivý. Morfometrická analýza byla provedena s programem Bioquant k získání změřených ploch pro lumen, intima a média. Morfometrická analýza tkáňových řezů z poškozených tepen byla provedena měřením celkové luminální plochy; plochy intimy, stanovené měřením plochy v rámci vnitřní elastické laminy a odečtením odpovídající luminální plochy u každého tkáňového řezu; a plochy medie, stanovené měřením plochy uvnitř vnější elastické laminy a odečtením plochy uvnitř vnitřní elastické laminy. Měření iniciální lézí ve femorálních tepnách u kontrolních a DEGR-FVIIa ošetřených zvířat ukázaly, že existuje významný pokles v místech poškození intimy u DEGR-FVIIa ošetřených zvířat (Tabulka 16). Naproti tomu měření mediální plochy neukázaly žádný významný rozdíl mezi danými dvěma skupinami zvířat.

Tabulka 16

Měření intimy a medie u králíků podrobených balónkové angioplastii

Skupina	N	Intima (mm²)	St.odeh.	Pravděp. (2-okr.)
kontrola	13	0,819	0,414	0,0138
DEGR-FVIIa	10	0,438	0,192

Skupina	N	Media (mm²)	St.odch.	Pravděp. (2-okr.)
kontrola	13	0,389	0,098	0,172
DEGR-FVIIa	10	0,329	0,105

Data z angiografických měření jsou předvedena v Tabulce 17 jako střední luminální průměr (MLD) +/- standardní odchylka pro kontrolní a DEGR-FVIIa ošetřená zvířata pro všechny tři časové body: těsně před angioplastii, těsně po angioplastii a 21 dnů po angioplastii. U měření těsně před angioplastii ani těsně po angioplastii nebyl žádný významný rozdíl mezi kontrolními a DEGR-FVIIa ošetřenými zvířaty. Významný vzestup v MLD však byl pozorován u DEGR-FVIIa ošetřených zvířat při měření 21 dnů po angioplastii.

«

Tabulka 17

Měření minimálního luminálního průměru

Pre-PTCA měření MLD
Skupina	N	Střední MLD	St.odch.	Pravděp. (2-okr.)
kontrola	13	1,202	0,24	0,3883
DEGR-FVIIa	10	1,283	0,19

Post-PTCA měření MLD
Skupina	N	Střední MLD	St.odch.	Pravděp. (2-okr.)
kontrola	13	1,492	0,551	0,5326
DEGR-FVIIa	10	1,323	0,725

21 denní měřeni MLD
Skupina	N	Střední MLD	St.odch.	Pravděp. (2-okr.)
kontrola	13	0,889	0,228	0,0001
DEGR-FVIIa	10	1,393	0,242

Příklad 13

Inhibice tvorby buněčně-povrchového faktoru Xa na babooních SMC DEGR-faktorem Vila

Byl vyvinut buněčně-povrchový chromogenní test, v podstatě jak je popsán v Příkladu 8 shora, k měření účinnosti DEGR-FVIIa při blokování vazby FVIIa k buněčně-povrchovému tkáňovému faktoru a následné konverze faktoru X na babooních buněk hladkého svalu (SMC) metod popsaných Sakaiem et al.

(1989) a Wildgoosem et al., Proč. 7290-7294 (1990). Babooní SMC byly faktor Xa na monovrstvách Tato metoda je modifikací J. Biol. Chem. 264: 9980-9988 Nati. Acad. Sci. USA 87: získány z University of kultivovány z aortický

Washington, Seattle, WA, a byly transplantátů. Babooní SMC byly naneseny na 96-jamkové kultivační destičky při koncentraci 8 000 buněk na jamku v 200 μΐ/jamku DMEM kultivačního média doplněného 10 % fetálního telecího séra, a udržovány v tomto médiu po 4 dny při 37°C a 5 % C0₂- V čase testování bylo odebráno 110 μΐ kultivačního média a do jamek byly přidávány rostoucí koncentrace FVIIa nebo FVIla v kombinaci s s DEGR-FVIIa. Byla vytvořena standardní křivka pro koncentrace FVIIa v rozmezí 5 nM až 0,04 nM. Pro měření inhibiční aktivity DEGR-FVIIa na aktivitu FVIIa byly do testovaných jamek přidávány rostoucí koncentrace DEGR-FVIIa v přítomnosti stálého množství FVIIa (5nM). Jak FVIIa tak DEGR-FVIIa byly ředěny HEPES pufrem (10 mM HEPES, 137 mM NaCl, 4 mM KCl, 5 mM CaCl₂, 11 mM glukosa, 0,1 % BSA) a do jamek se přidávalo 10 μΐ lOx zásobních roztoků. Buňky byly inkubovány s testovanými látkami 2 hodiny při 37 °C, pak myty třikrát HEPES pufrem. Do každé jamky se pak přidalo 50 μΐ 200 nM roztoku faktoru X v Tris pufru (25 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 5 mM CaCl₂, 0,1 % BSA). Po 4 minutách při pokojové teplotě se přidalo 25 μΐ 0,5 M EDTA k zastavení konverze faktoru X na faktor Xa. Přidalo se 25 μΐ/jamku 0,8 mM S-2222 chromogenního substrátu specifického pro faktor Xa v Tris pufru a absorbaňce při 405 nm se odečetly po 60 minutách ve čtečce mikrodestiček Thermomax (Molecular Devices, Menlo Park, CA) .

Výsledky ukázané v Obr. 3 prokazují dávkově závislý vzrůst v amidolytické aktivitě pro jamky s FVIIa (prázdné čtverečky). Vzrůst absorbaňce je přímou mírou hladiny faktoru Xa vytvořeného v daných jamkách a následného štěpení chromogenního substrátu. Přidání rostoucích množství DEGR-FVIIa se stálým množstvím FVIIa (5nM) ukázalo dávkově závislý pokles v amidolytické aktivitě s rostoucími hladinami DEGR-FVIIa (plné čtverečky). Ekvivalentní molární poměr DEGR-FVIIa k FVIIa byl schopen inhibovat > 95 % chromogenní

DEGR-FVIIa aktivity

DEGR-FVIIa faktoru X monovrstev aktivity. Dokonce nastávala ještě 40 faktoru Xa. Tyto působí je krajně na Xa faktorem Vila při desetkrát nižší hladině % inhibice tvorby chromogenní výsledky podporují závěr, že účinný antagonista v aktivaci na povrchu intaktních buněčných

SMC.

Příklad 14

Účinek DEGR-faktoru Vila na tvorbu vaskulární trombózy a tvorbu vaskulárních lézí u baboonů

Lidský DEGR-faktoru Vila byl testován na schopnost inhibovat tvorbu vaskulárních lézí zprostředkovanou tkáňovým faktorem (TF) a aktivovaným faktorem VII (FVIIa), indukovanou mechanickým vaskulárním poškozením u primátů jiných než lidských.

Počínaje těsně před vytvořením mechanického vaskulárního poškození u baboonů byl DEGR-faktor Vila podáván intravenózní infuzí po 7 dnů (5 zvířat) nebo 30 dnů (1 zvíře). Měření tvorby vaskulárních lézí byla provedena v den 30. Výsledky u pěti ošetřených zvířat byly porovnány s nálezy u pěti souběžných kontrol s infuzemi nosného pufru.

Měření základní čáry se získaly u studovaných zvířat pro:

a) počty destiček, neutrofilů, monocytů a červených krvinek,

b) hladinu plazmového fibrinogenu, c) hladiny aktivit plazmatických koagulačních faktorů VII, Vila, X a V, spolu s antigenními hladinami FVIIa, ad) základní plazmatický vzorek na hladinu anti-FVIIa protilátky.

Zvířata značená autologními ^^^I-destičkami dostala pod halothanovou anestezí a za sterilních operačních podmínek intravenózní infuze DEGR-FVIIa s použitím propojeného systému na kontinuální intravenózní podávání (počáteční 1 mg/kg bolus injekci, následovanou kontinuální intravenózní infuzí 50 μg/kg/hod). Zvířata byla podrobena chirurgické karotidové endarektektomii a bilaterálním kathetrovým angioplastiím brachíálních tepen nebo femorálních tepen Fogartovým balónkovým kathetrem.

DEGR-VIIa byl podáván po 7 nebo 30 dnů kontinuální infuzí cestou venózního kathetru s použitím propojeného systému. 30 dnů po operaci byla zvířata anestetizována halothanem a podrobena in šitu tlakové perfužni fixaci s 4 % paraformaldehydem obsahujícím 0,1 % glutaraldehydu po 30 minut. V tomto čase byly odebrány vaskulární segmenty (obsahující místa dříve poškozená) s použitím postupů Harkera et al., Circulation 83: 41-44 (1991) a Hansona et al., Hypertension 18: 1170-1176 (1991). Vzorky byly post-fixovány in vitro (4 % paraformaldehyd obsahující 0,1 % glutaraldehyd), uloženy za kryo- podmínek a zpracovány k morfometrické analýze rozsahu lézi.

Bylo studováno jedenáct normálních dospělých baboonů (Paio anubis). Šest zvířat dostalo infuze DEGR-FVIIa (50 μg/kg/hod) a zbývajících pět byla kontrolní zvířata, jež nedostala DEGR-FVIIa. Zvířata byla odčervena a pozorována jako prosta chorob po tři měsíce před použitím. Všechny postupy byly schváleny institucionálním výborem pro péči o zvířata a používání zvířat a byly v souladu s postupy a metodami nečrtnutými NIH pravidly pro péči o laboratorní zvířata a jejich používání, jakož i s Animal Welfare Act a souvisejícími institucionálními přístupy. Invazivní postupy se prováděly pod halothanovou anestezí po indukci ketaminem (10 mg/kg intramuskulárně) a valiem (0,5 mg/kg intravenózné). Pro následnou krátkodobou imobilizaci při provádění experimentálních postupů po operacích se používal ketamin hydrochlorid (5-20 mg/kg intramuskulárně).

Karotidová endarterektomie se prováděla přes střední krční řez s použitím technik Hansona et al., Hypertension 18: 1170-1176 (1991) a Krupského et al., Circulation 84: 1749-1757 (1991), zahrnuto zde odkazem. Endarterektomie se použila jako model vaskulárního poškození pro svou klinickou relevance a proto, že VLF indukovaná endarterektomií normálních tepen se prokázala být reprodukovatelnou. Ve stručnosti: Společná karotidová tepna byla disekcí separována od obklopující tkáně od klíční kosti proximálné ke karotidovému rozdvojení distálně. Společná karotidová tepna byla opatřena příčnými svorkami s použitím atraumatickýeh cévních svorek umístěných na obou koncích exponované cévy tři minuty po bolus injekci heparin sulfátu (100 U/kg intravenózně; Elkins-Simm Inc., Cherry Hill, NJ) a rozdělených 1 cm proximálně k distální příčné svorce. Proximální segment tepny pak byl přetočen ná zakřivenou pinsetu. Po získání maximálního přetočení byl umístěn pár trvalých polypropylenových stehů (7-0) na obě strany proximálně a druhý pár umístěn distálně v segmentu s exponovaným lumenem.

Endarterektomie pak byla provedena počínaje 1 cm od rozděleného konce přetočeného segmentu cévy a s pokračováním k měřené Tento postup zahrnuje mechanické odstranění částečné tlouštky medie s použitím pinsety vzdálenosti 1 cm. normální intimy a

32X). Po endarterektomii konfigurace a provedena s 7-0 polypropylenovým šitím

2,5-násobným zvětšením, a rána mikroskopu s monitorem a chirurgického mikroskopu (zvětšení byla céva navrácena do normální anastomóza koncem ke konci a kontinuální technikou pod byla uzavřena ve vrstvách.

Morfometrickou analýzou VLF pomocí přístroje Zeiss Photoscope, spojeného se systémem analýzy obrazu (Thomas Optical Measurement Systems, Columbus, GA), sestávajícího z CCD s vysokým rozlišením (580 linií), spojeného s vysokým rozlišením (700 linií), čipem IMB 386, a 80 MB počítačem s digitablet grafikou o vysokém rozlišení pro získání a uložení obrazu byly hodnoceny řezy zalité do parafinu a barvené na složky vazivových tkání (kolagen, elastin) a s hematoxylinem-eosinem. Kvantitativní analýza obrazu byla prováděna s použitím driveru morfometrického software (Optimas, Bioscan, Inc., Edmonds, WA). Příčné řezy tepen byly analyzovány s ohledem na celkovou plochu neointimální proliferativní léze a odpovídající plochu arteriální medie. Ve statistické analýze se prováděly porovnání mezi skupinami s použitím Studentova (dvoustranného) t testu a nepárovaných dat.

Výsledky ukázaly, že intimální plocha byla významně snížena u zvířat ošetřených DEGR-faktorem Víla po sedm dnů a studovaných v den 30 v porovnání s kontrolními zvířaty, jež byla podrobena stejnému vaskulárnímu poškození, ale nedostala DEGR-faktor Víla (Obr. 4). Podobný výsledek byl nalezen u zvířete ošetřovaného

DEGR-faktorem Vila po 30 dní a prohlédnutého v den 30.

Předběžné studie s modelem balónkové angioplastie brachiální artěrie nenapověděly žádnou měřitelnou prospěšnost terapie DEGR-faktorem Vila. Tento model však nebyl u baboonů prokázán jako prothrombický model, u něhož by tkáňový faktor hrál klíčovou roli.

Studie s modelem balónkového poškození femorální artérie ukázaly statisticky významnou prospěšnost DEGR-faktoru Vila v porovnání s kontrolami, jak ukazuje Obr. 5.

Příklad 14

Účinek DEGR-faktoru Vila na tPA-indukovanou trombolýzu

Postupující tvorba koronárních trombů při akutním infarktu myokardu je primárně zprostředkovaná tkáňovým faktorem (TF) v komplexu s faktorem Vila prostřednictvím vnější koagulační dráhy. Byl stanoven efekt inhibice přidružené koagulační kaskády na účinnost tkáňového aktivátoru plasminogenu v různých bodech vnější dráhy.

psů s elektricky indukovaným koronárním trombem a podrobovaných trombolýze s tPA (1 mg/kg během 20 minut) dostalo jednu ze čtyř léčeb: 9 dostalo hmyzí antikoagulační peptid (TAP, selektivní inhibitor faktoru Xa, při 30 μg/kg/min po 90 minut. Komplex TF-faktor Vila byl inhibován rekombinantním inhibitorem dráhy tkáňového faktoru (TFPI) (100-150 ůg/kg/min po 90 minut) u devíti psů, a DEGR-faktorem Vila (1-2 mg/kg bolus) jako kompetitivním antagonistou faktoru Vila u devíti psů. Devět psů dostalo kontrolu solného roztoku. Psi byli pozorováni na reokluzi po 120 minut po trombolýze. Efekty těchto činidel na účinnost trombolýzy jsou ukázány níže v Tabulce 18 (data jako střed + SD).

Tabulka 18

Solný	DEGR Vila	TFPI	TAP

Doba do obnovy proudění	32 + 13	20 +	7*	21 + 6*	18 + 10*
(min)
Trvání obnoveného proudění	65 + 45	70 +	48	91 + 35*	120
(min)
Cyklické změny proudění	70 %	89	%	56 %	0 %
Reokluze	70 %	78	%	67 %	0 %

Hodnota odlišná od kontroly solného roztoku na a hladině významnosti 0,05

Tato data ukazují, že inhibice vnější dráhy blokováním buď faktoru Xa nebo komplexu TF-faktor Vila DEGR-faktorem Vila nebo TFPI urychluje tPA indukovanou trombolýzu. Selektivní inhibice faktoru Xa účinněji udržovala arteriální otevřenost po úspěšné reperfuzi.

Příklad 15

Modifikovaný faktor Vila inhibuje intravaskulární tvorbu trombů bez efektu na systémovou koagulaci

Pro stanovení zda inhibice vazby faktoru VII k TF povede k antitrombotickým účinkům byly pomocí umístění externích konstriktorů kolem endotheliálné poškozených králičích karotidových tepen iniciovány cyklické změny proudění (CFV) v důsledku rekurentní tvorby trombů (Fottův model). Proudění krve karotidou bylo měřeno kontinuálně Doplerovou sondou proudění umístěnou proximálně ke konstriktorů. Po umístění konstriktorů kolem tepny se CFV vyvinuly u šesti ze šesti králíků se střední frekvencí 11+2 cyklů/hod, přičemž rychlost proudění krve karotidou měla při nadiru CFV v průměru 5 + 2 % hodnoty základní čáry. Poté, co CFV byly pozorovány po 30 minut, zvířata dostala infuzi lidského rekombinantního faktoru Vila blokovaného v aktivním místě (Phe-Phe-Arg chlormethylketonem) (FVIIai) (0,1 mg/kg/min po 10 minut). Faktor Vllai úplně odstranil CFV u šesti ze šesti zvířat (CFV frekvence = 0 cyklů/hod, p < 0,05, rychlost proudění krve karotidou = 106,9 % hodnoty základní čáry, p = NS proti základní čáře). Třicet minut po inhibici CFV byla provedena infuze lidského rekombinantního faktoru Vila v dávkách 0,1 mg/kg/min po 10 minut. Po infuzi faktoru Vila se CFV navrátily u všech zvířat, což ukazuje, že vazba faktoru Vila k TF je kompetitivní. Prothrombinové doby, doby částečně aktivovaného thromboplastinu, a ex vivo agregace destiček v odpovědi na ADP a thrombin nebyly odlišné po infuzi FVIIai v porovnání s hodnotami základní čáry. Faktor VlI-VIIa tedy hraje tedy důležitou roli v iniciaci tvorby trombů in vivo. Podání faktoru Vllai vykazuje potentní antitrombotický účinek v tomto modelu bez ovlivnění systémové koagulace.

Z předchozího je zřejmé, že jsou poskytnuty prostředky faktoru VII nebo Vila, majících modifikovaná katalytická místa, a že tyto prostředky jsou schopné vázat tkáňový faktory aniž by byly schopné podstatně aktivovat faktory X a IX. Protože modifikovaný faktor VII působí specifické přerušení srážecí kaskády bez degradace nebo spotřeby faktorů srážení, bude podávání prostředků modifikovaného faktoru VII provázeno méně nežádoucích vedlejších účinků, než tomu nastává při současných terapiích. Dále: Modifikovaný faktor VII zde popsaný lze snadno produkovat rekombinantními prostředky. Mezi výhody týkající se prostředků podle tohoto vynálezu tedy patří účinnost, pohodlnost a hospodárnost nižšího dávkování a méně častého podávání a relativní nepřítomnost toxicity.

I když předchozí vynález byl z důvodů jasnosti porozumění popsán do určitých podrobností cestou vysvětlování a příkladů, bude zřejmé, že v rámci přiložených nároků lze provádět určité změny a modifikace.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob inhibice aktivity tkáňového faktoru u pacienta, vyznačující se tím, že'se pacientovi podává terapeuticky účinná dávka prostředku obsahujícího faktor VII, jenž má ve svém katalytickém centru přinejmenším jednu modifikaci, kterážto modifikace podstatně inhibuje

schopnost modifikovaného faktor X nebo IX. faktoru VII aktivovat plazmatický 2. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j i c i se tím, že modifikace zahrnuje serinové proteasy. reakci faktoru VII s inhibitorem 3 . Způsob podle nároku 2, v y z n a č u j í c i se tím, že inhibitor proteasy je organofosforová sloučenina,

sulfanyfluorid, halomethylketon peptidů, nebo azapeptid.
4. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že inhibitor proteasy je halomethylketon peptidů vybraný z dansyl-Phe-Pro-Arg chlorraethylketonu, dansyl-Glu-Gly-Arg chlormethylketonu, dansyl-Phe-Phe-Arg chlormethylketonu a Phe-Phe-Arg chlormethylketonu.
5. Způsob inhibice ukládání destiček u pacienta, vyznačující se tím, že se pacientovi podává terapeuticky účinná dávka prostředku obsahujícího faktor VII, jenž má ve svém katalytickém centru přinejmenším jednu modifikaci, kterážto modifikace podstatně inhibuje schopnost modifikovaného faktoru VII aktivovat plazmatický faktor X nebo IX.
6. Způsob podle nároku 5,vyznačující se tím, že modifikace zahrnuje reakci faktoru VII s inhibitorem serinové proteasy.
7. Způsob podle nároku 5,vyznačuj ící se tím, že inhibitor proteasy je organofosforová sloučenina, sulfanyfluorid, halomethylketon peptidu, nebo azapeptid.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačuj ící s e tím, že inhibitor proteasy je halomethylketon peptidu vybraný z dansyl-Phe-Pro-Arg chlormethylketonu, dansyl-Glu-Gly-Arg chlormethylketonu, dansyl-Phe-Phe-Arg chlormethylketonu a Phe-Phe-Arg chlormethylketonu.
9. Způsob podle nároku 5,vyznačující setím, že modifikace faktoru VII zahrnuje alespoň jednu aminokyselinovou substituci, inzerci nebo delecí v katalytické triádě Ser, Asp a His.
10. Způsob inhibice vaskulární restenózy u jednotlivce, vyznačující se tím, že se tomuto jednotlivci podává terapeuticky účinná dávka prostředku, obsahujícího farmakologicky přijatelný faktor VII, jenž má ve svém katalytickém centru přinejmenším jednu modifikaci, kterážto modifikace podstatně inhibuje schopnost modifikovaného faktoru VII aktivovat plazmatický faktor X nebo IX.
11. Způsob podle nároku 10,vyznačujíc i se tím, že modifikace faktoru VII se vytvoří reakcí faktoru VII s inhibitorem serinové proteasy.
12. Způsob podle nároku 12,vyznačující se tím, že inhibitor proteasy je organofosforová sloučenina, sulfanyfluorid, halomethylketon peptidu, nebo azapeptid.
13. Způsob podle nároku 12,vyznačující se tím, že inhibitor proteasy je halomethylketon peptidu vybraný z dansyl-Phe-Pro-Arg chlormethylketonu, dansyl-Glu-Gly-Arg chlormethylketonu, dansyl-Phe-Phe-Arg chlormethylketonu a Phe-Phe-Arg chlormethylketonu.

14. Způsob podle nároku 10, v y z n a č u j i c i se tím, že modifikace faktoru VII zahrnuje alespoň jednu aminokyselinovou substituci, inzerci nebo deleci v katalytické triádě Ser, Asp a His. 15. Způsob podle nároku 10, v y z n a č u j í c i se tím,

že restenóza je druhotná po mechanickém poškození tepny.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že mechanické poškození je způsobeno balónkovou angioplastii, endarteroktomií, redukční atherektomií, zavedením chlopní, laserovou terapií nebo rotablací.
17. Způsob podle nároku 15, v y z že prostředek se jednotlivci mechanickým poškozením tepny.
18. Způsob podle nároku 15, vy že prostředek se jednotlivci mechanickém poškození tepny.

na ču jící se tím, podává v rámci 24 hodin před se tím, následně po dále podává
19. Způsob podle nároku 10,vyznaču jící se tím, že restenóza nastává ve vaskulárním štěpu, chlopni, bypassovém štěpu nebo orgánovém transplantátu.
20. Způsob podle nároku 19,vyznačující se tím, že prostředek se jednotlivci podává v rámci 24 hodin před zavedením štěpu, chlopně, bypassového štěpu nebo orgánového transplantátu.
21. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že prostředek se jednotlivci podává následně po zavedení štěpu, chlopně, bypassového štěpu nebo orgánového transplantátu.
22. Způsob podle nároku 10,vyznačující se tím, že prostředek se jednotlivci dále podává tkáňový aktivátor plasminogenu nebo streptokinasa.
23. Způsob léčby akutního uzavření koronární tepny u jednotlivce vyznačující se tím, že se jednotlivci podává prostředek obsahující farmaceuticky přijatelný faktor VII, jenž má ve svém katalytickém centru přinejmenším jednu modifikaci, kterážto modifikace podstatně inhibuje schopnost modifikovaného faktoru VII aktivovat plazmatický faktor X nebo IX, spolu s tkáňovým aktivátorem plasminogenu nebo streptokinasou.