CZ103197A3 - Peptides modulating activity of anti-idiotype t cells and pharmaceutical preparations containing thereof and being usable in diagnostics and diabetes mellitus treatment - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se obecně týká sekvencí pepCfdŮ a zpflsobfl jejich použití, přičemž tyto sekvence modulují aktivitu anti-idiotypových Ť buněk. Aktivita zkoumaných anti-idiotypových T buněk se týká schopností těchto T buněk rozpoznávat T buňky anti-p277. Peptidy předkládaného vynálezu tak obsahují důležitý nástroj ve snaze diagnostikovat, zabraňovat, zmírňovat nebo léčit nemoc

Související s inzulín-dependentním diabetem mellitěm (IDDM).

Dosavadní stav techniky

Diabetes mellitus I. typu, nebo IDĎM, je autoimunní choroba způsobená T buňkami, které napadají a ničí buňky .produkující - inzulín,-—lokalizované' v ostrůvcích pankreatu (23). Autoimunní proces vrcholící IDDM začíná a prégreduje bez příznaků. Nemoc se klinicky projeví pouze tehdy, když kumulativní ztráta p-buněk přesáhne kapacitu reziduálňích p-buňěk kkrýt potřebu inzulínu. Vskutku se předpokládá, že kolaps glukózové homeostázy a klinický IDDM nastane pouze tehdy, když je imunitním systémem inaktívováno 80 . až 9Q&

p-buněk. Takže pacienti, u kterých je rozpoznáno Onemocnění IDDM, jsou v pokročilém stádiu autoimunní destrukce svých . β-buněk. .1 fNavíc diagnóza'·, počínájícího.preklinického diabetů detekc í; _ř imuno l óg i ckých J- markérů * auto i mun i ty řif buněk se. může provádět · až i«ροτ. vy puknutí auto imunn ího; procesu..Proto 'léčba požadu je n na lézt ‘ bezpečný,í/,»špecifický/a ‘/účinný; způsob ,V jak zastavít^l áůtoimnňní/^focěs .qkterýiije j iž ýf behů.i - H t.itýjxwd ' f v* íPředkladateléctohoto vynálezu zkoumali:, ji^;ž; předtím> tuto otázku· ‘studiem spontánní ho l /diabetů- vyvíjej íč í ho ř se 11Γ myší

Ϊ kmene i NOD, který > je i považován’; za věrný, model1 idškěho vI DDM _;<23-25) .» U; HOD myší sé vyví jí;,· přibližně vajednom měsíciτ věků !

inzul itida \která začíná jákó^ mírnýttrřirtf i Ltrát V7y okol í Ostrůvků a progreduje dóívážného zánětu ;uvnitř rostrůvků:

U samic naší kolonie : začala < ve --věku tří i měsíců hyperglykémie, která svědčí pro inzulínovou nedostatečnost.

Ve věku šest měsíců se téměř u všech samic NOD myší vyvinul vážný diabetes a při nepřítomnosti léčby inzulínem většina zemřela. Samci NOD myší mají nižší výskyt nemoci z ne zcela známých důvodů.· .ByloT prokázáno, že diabetes NOD myší je způsoben autoimunníminT«buňkami (26). „ . II-1 idských· pacientů*s *IDDM stejně jako u NOD myší byla

-detekována -T buněčná-c-reakt-ivit-a a^- auVoprot FlatKy úa různě antigeny <27) a nenííjasné, zda primární .příčinou nemoci je imunita na každý jednotlivý ž možných cílových antigenů. Za otázkou příčiny se skrývá otázka léčby.

Bylo dokázáno, že, se může zabránit autoimunnímu procesu u NOD myší. jestliže se myš ; předtím, než se projeví diabetes, podrobí různým ošetřením.jako jé restrikční dieta, virové infekce nebo nespecifická stimulace imunitního systému· (24).vtU predtabetických NOD myší je také možno

Autoimunní T ant i-1d i otypovým i anti-idiotypové T předejít diabetů navozením imunologické tolerance antigenen dekarboxy1ážou glutamové kyseliny (GADj <28. 29).

Anti-idiotypové T buňky jsou T buňky, které rozpoznávají peptidý pocházející z antigenových receptorň jiných T buněk <6>- Předpokládá še, že anti-idiotypové T buňky jsou zapojeny do řízení aktivit těch í buněk, u kterých rozpoznávají peptidy receptoru T buňky <TGR>.

buňky mohou být podrobeny regulaci

T buňkami^ bylý detekovány buňky. které následovaly úmyslnou vakeihaci hlodavců T buňkami v modelu experimentální autoimunní encefalomyelitidy CEAE> <6) nebo u lidí trpících sclerosis multíplex CMS) s autoimunními T buňkami <7).

Evropská patentová přihláška 261 648 vyjevuje použití aktivovaných Ť buněk specifických pro autoimunní nemoc k léčení této nemoci. Aby še zlepšila imunogeníčnost T buněk, jsou tyto T buňky nejprve tlakově ošetřeny, podrobeny zesítujícímu chemickému činidlu a/nebo ošetřeny činidlem rozrušujícím cytoskelet. Jako vakcína proti autoimunní nemoci, pro kterou je T buňka specifická, může být použita buď celá takto ošetřená buňka nebo její část.

Ve známé proceduře ha potlačení autoimunníčh T buněk je subjekt imunizován vzorkem oslabených nebo avirulenthích T buněk konkrétní autoimunní specifičnosti či jejích fragmenty nebo frakcemi. Subjekt odpovídá aktivací regulačních T buněk alespoň dvou typů= anti-ergotypové

T buňky. které rozpoznávají markéry aktivace T buněk a anti-idiotypové T buňky. které rozpoznávají receptory vlastních antigenfl přítomné na patogenních autoimunních T buňkách- Očkování T u experimentálních zvířat účinné pro navození remise zjištěné nemoci stejně jako.pro prevenci endogenních buňkou je permanentu í nemoci- Bylo vyjeveno použití peptidových sekvencí β řetězce T buněčného receptoru k očkování krys proti experimentální autoimunní encefalomyel itidě (30, 31)., což podporuje závěr, že receptor autoimunních T buněk může sám poskytnout cílový epitop pro regulační T buňky.

V předkládaném vynálezu se prokazuje, že spontánní rozvoj diabetů diabetů u KOD myší je regulován anti-regulační šiti, ve které anti-idiotypové T buňky jsou specifické pro peptid VDJ TCR autoimunní T buňky obecně· exprimóvaný u myší neobézniho diabetického kmene (NOD) (1).

Funkční úloha hsp60 a peptidu p277 u ÍDDM

Laboratoř předkladatelů vynalezu jiz uřive prokázala, že epitop heat shock proteinu (protein teplotního šoku) o velikosti 60 KDa (hšp60) je cíl autóímunního útoku u-diabetů- mel litu I-' typu, který še spontánně vyvíjí u myšího kmene NOĎ (2). Tento protein byl dříve pojmenován hsp65, ale nym se ve svetle přesnější informace o molekulové hmotnosti označuje jako hsp60, ale při každém označení jsou proteiny totožné. Naše laboratoř již dříve identifikovala peptidový fragment lidské sekvence hsp60 pojmenovaný peptid p277 (sekvence identifikačního čísla 5), který obsahuje cílový epitop pro T buňky, které zprostředkovávají diabetes (3, publikace PCT WO 90/10449)5

Naše laboratoř také izolovala klon T buněk, pojmenovaný klon C9, který rozpoznává peptid p277 a může vyvolat diabetes (35. Peptid p277 a T buňky klonu C9.mají funkční úlohu v řízení diabetů'- vakcinace NOD myší oslabenými T buňkami C9 nebo peptidem p277 může zabránit nebo dokonce zvrátit diabetes <45. Obě tyto léčebné vakcinace aktivují ant i-i d i ótýpové regu1áčn í T buňky.

Podstata vynálezu

Zjistilo se, že klon C9 exprimúje β řetězec Ť buněčného receptorů <TCR>, který nese idiotop definovaný svou peptidovou sekvencí VDJ. U identických nebo podobných sekvencí VDJ bylo prokázáno, že jsou sdíleny dalšími diabetógenními T buňkami přítomnými u myších kmenů NOD a dalších.

Podle předkládaného vynálezu je vyjeven peptid, který má alespoň 7 a výhodně 7 až 24 aminokyselinových zbytků obsahujících oblast VDJ vzorce,

----------------------- V-DJ ------- - ..........

ve kterém “V zahrnuje dipeptidovou sekvenci ň-S, D zahrnuje dipeptidovou sekvencí LG a J zahrnuje tripeptidovou sekvenci N-Q-D, symboly psané kurzívou představují standardní jednopísmennou zkratku pro odpovídající aminokyselinu. D oblast má výhodně 2 až 5 aminokyselinových zbytků.

Ve specifických ztělesněních předkládaného vynálezu peptid obsahuje segment V“, který zahrnuje tripeptidOvou sekvencí A-S-S. V dalších ztělesněních peptid obsahuje segment D, kLerý zahrnuje třipeptídovou sekvenci L-G-G, třipeptídovou sekvenci R-L-G nebo pentapeptidovou sekvenci

L-G-L-G-Ά (zbytky 4 až 8 sekvence identifikačního čísla 45.

V dalším ztělesnění předkládaného vynálezu se poskytuje peptid, který má alespoň 7 ,a výhodně 8 áš 24 aminokyselinových zbytků ve vzorci, gen Víi-D-JíJ, ve kterém segment Víl obsahuje od 1 do 10 aminokyselinových zbytků

C-koncové části proteinu kódovaného genem Vf3, výhodně lidským génem Vp, ve kterém poslední tři C-koncové aminokyselinové zbytky zahrnují dipeptidovou sekvenci Λ-S, p“ oblast má celkem 2 až 5 aminokyselinových zbytků obsahujících dipeptidovou sekvenci L-G a segment Jp obsahuje od 1 do 10 aminokyselinových zbytků N-koncové částí proteinu kódovaného genem Jp, výhodně lidským genem Jp.

Specifické peptidy obsahují, ale nejsou tím omezeny, výhodně do 24 aminokyselinových zbytků, které zahrnují sekvence A-S-S-L-G-G-ft-Q~D (zbytky 47 až 55 sekvence identifikačního čísla 15, Ά-S-R-L-G-N-Q-D (sekvence

-identifikačního čísla 35, A-S-Š-L-G-L-G-A^N-Q-D (sekvence identifikačního čísla 45 a A-S-S-L-G-A-N-Q-D (sekvence identifikačního čísla 165.

Předkládaný vynález také týká určitých konstruktů DNŮ, které kódují peptidy. včetně oligonukleotidů, které obsahují pólynukleotldovou sekvencí komplementární k alespoň části výše zmíněných sekvencí DNA. Stejně tak se předpokládají farmaceutické přípravky obsahující tyto peptidy, včetně přípravků použitelných jako vakcíny nebo jako činidla pro

Ί detekci přítomnosti ariti-idiotypových T buněk zapojených do rozpoznávání Ť buněk anti-p277.

Předkládaný vynález je takě zaměřen na korijugátý obsahující peptidy a další molekulu, včetně druhého peptidů, polypeptidů nebo malé organické molekuly.

Jak je zmíněno dříve, důležitým cílem vynálezu je vyjevení způsobu modulace aktivity anti-idiotypóvých T buněk u jedince potencuie vynálezu, buněk.

Například aktivita ánti-idiotypových T buněk se když se jedinci podává určité množství peptidů které účinně zvýší aktivitu ariti-idiotypových

Peptidy předkládaného vynálezu inohou být také použity k aktivaci T buněk in vitro, výhodně aut.ologních T buněk, které mohou být pak opětně podávány pacientovi, aby napadly T buňky způsobující nemoc.

Další cíle předkládaného vynálezu budou odborníkovi zřejmé ve světle detailního popisu poskytnutého níže, včetně¹ preferovaných ztělesnění vynálezu.

T buňky zapojené do áiitoimunních nemocí jsou charakterizovány genetickými’ prvky ' použitými pro tvorbu jejich autoimunitních T buněčných receptorů <TCR) (T diferenciačních znaků). V předkládaném vynálezu byly sekvenovány a a 0 řetězce TCR exprimovaného klonem C9 izolovaným z “panenské predíabetické NOD myši. Klon C9 specificky reaguje s definovaným peptidovým epitopem <p277) molekuly ”heat shock proteinu“ o hmotnosti 60 kDfl (hsp60). Klon C9 je funkční u diabetů NOĎ: aktivované buňky C9 mohou adoptivně přenést diabetes riěbo, jsou-li oslabeny, mohou být

-j

C9 použity k vakcinaci. HOD myší proti diabetů (3). Je zde ukázáno. že řetězec TORp C9 se skládá z variabilního (V) genůvého segmentu Vpl2 a ze spojovacího (J) genového segmentu Jp2.5. Sekvence Vpl2 a Jp2-5 byly publikovány a jsou známy. (32, 33). Sekvence celého segmentu VDJ TCRp klonu C9 odpovídá sekvenci identifikačního čísla 1, včetně

L-G-G:segmentu D.

Sekvence VDJ řetězce TCRp C9 je éxprimováňa u všech našich HOD myší. Tato sekvence VDJ byla detekována ve věku dvou týdnfl v brzlíku a v jednom měsíci věku ve slezině.

Sekvence VDJ byla také nalezena v ostrůvkových infiltrátech při -inzulitidě- Navíc sekvence VDJ podobná C9 byla izolována z T anti-p277 buněk pocházejících z myší kmene C57BL/6 s diabetem navozeným aktivní imunizací peptidem p277. Je zajímavé, že sekvence VDJ podobná C9 může být éxprimováňa ve spojení s odlišnými genovými segmenty Vp. Publikovaná sekvence NOD diabetogenního T buněčného klonu, neznámé specifičnosti, nezávisle izolovaného v Japonsku, ukazuje řetězec p, který se liší od p řetězce klonu C9 pouze dvěma aminokysěl-inámi (15). Byl také nalezen diabetický lidský

T buněčný klon, který nese podobný motiv VDJ (21, 22). Tak se sekvence spojující oblasti VDJp C9 zdá být společným prvkem pro áutoimunní TCR, který je spojen jak se spontánním diabetem HOD myší a lidí, tak s indukovaným diabetem myší

C57BL/6.

U myší kmene NOD se spontánně vyvíjí áutoimunní inzulitida ve věku jednoho měsíce, která progreduje několik měsíců později do zjevného inzulín-dependentního diabetů mellitu CIDDM) Cl). Přítomní vynálezci objevili a publikovali dříve, ze regulace autoimunního IDDM může být ovlivněna dvěma faktory^ imunitou T buněk k peptidu p277 heat shočk proteinu o velikosti 60 kDa Chsp60) C2) a antí-idiotypovymi T buňkámi, které rozpoznávají T buňky anti-p277 (3). Zjevnému IDDM u NOD myší předchází spontánní

T buněčná aktivita na peptid p277 odpovídající pozici 437 až

460 sekvence lidského hsp60, T buněčné klony reaktivní ha p277, jako je klon C9, mohou adoptivně přenášet hyperglykémii a Časnou inzulitidu, a vakčinace peptiděm p277 Samotným může zabránit <3) nebo dokonce zvrátit IDDM

C4). Ošetření peptidem p277 se vyznačovalo potlačením imunity anti-p277. Tak se T buněčná imunita ná p277 zdá být funkčně zapojena do diabetů NOD.

Funkce imunity p277 u. myšího diabetů byla rozšířena pokusy ukazujícími, že u samců myší nediabetického kmene

C57BL/6 může být vyvolána inzúlitida a hyperglykemie· imunizací p277 konjugovaněm s proteinovým nosičem jako je

OVA nebo BSA C5). Bylo nalezeno, že T buněčné linie -anti-p277 ' adoptivně přenášejí diabetes na panenské myši

C57BL/6S Ohledem na regulací NOD diabetů anti-idiotypovými T buňkami vnímavými na T buňky C9 anti-p277 jsme shledal i, žě klon C9, je-li oslaben, může být použit pro vakcinaci NOD myší proti IDDM C3). Protože regulační účinky vakcinace T buňkami se vztahují k TCR očkujících T buněk C6, 7), byl přítomný výzkum namířen na TCR prototypového T buněčného klonu anti-p277 G9, aby se určila sekvence jeho řetězců

a a β a prozkoumá1a	se	distribuce TCR C9	v	různých
T buněčných populacích	NOD	myší. Charakteristická	sekvence
VDJ β řetězce TCR C9	by l a	také studována u I	buněk myší
C57.BL/6 vnímavých k	P277	a byla srovnána	s	dalšími

publikovanými sekvencemi TCR.

Tyto výzkumy vedly k určení sekvence VDJ genového

Segmentu β řetězce TCR C9, tj. sekvence identifikačního čísla 1- Bylo určeno, že hOnapeptid zahrnující tři aminokyseliny C-koncové části segmentu V, tři zbytky segmentu D a tři aminokyseliny N-koncové částí segmentu

J (zbytky 47 až 55 sekvence identifikačního čísla 11.

obsahuje imunogenní část řetězce TCR<3 C9. Ukázalo se, že tento peptid způsobuje podstatné potlačení diabetů v modelu NOD myší- Může být také použit pro časnou diagnózu tDDM a pro sledování Ošetření IDDM peptidem p277.

U několika dalších klonů, které také rozpoznávaly peptid p277 lidského hspGO, byly diabetogenní a mohly by.se použít k vakcinaci NOD myší proti rozvíjejícímu se diabetů, byla také studována oblast VDJ. Bylo nalezeno, že tyto klony ‘majíSekvenciVDJ totožnou s klonem C9. Jiná buněčná linie, linie N4, která není ani diabetogenní ani neočkúje proti diabetů, má sekvenci, která še liší od sekvence pepti.du CD9, ve které jsou odlišné 2 ze 3 peptidů oblasti D (Leu-Trp-Thr proti Leu-Gly-Glyl.

Nedávno byla publikována sekvence VDJ dalšího klonu

NOD, 4-l-E;2 (151, u tohoto klonu bylo zveřejněno, že přenáší inzulitidu na traňsgenní nedlabetický kmen NOD mysí

1-E⁺. Tak se předpokládá, že oblast VDJ řetězce TCR<3 tohoto klonu bude také schopná aktivovat T buňky, které rozpoznávají autoimunní T buňku- Sekvence hlášená pro tento řetězec TCRp postrádá jeden serin na C-koňcové části segmentu V, má tentýž trípeptid na K-koncové části segmentu

J a ma trípeptid Arg-Leu-Gly jako segment D. Tak, tato sekvence sdílí dipeptid Leu-Gly v segmentu D řetězce TCR<3

C9 a sdílí dipeptid Ala-Ser C-koncově části segmentu

V s řetězcem TCŘíS C9.

Oblasti VDJ T buněčných linií ánti-p277 pocházejících ze splenoCytů diabetických myší G57BL/6 byly také studovány ve světle faktu, ze tyto buněčné linie mohou adoptivně přenést inžulitídu a hyperglykěmii. Jak lze vidět z tabulky.3, C-koncová část segmentu J jsou stejné jako

Leu-Gly-Leu-Gly-Ala (zbytky 4 čísla 43. Protože tento klon očekává se. že peptid sekvence identifikačního čísla 4 roflše být použit stejným způsobem jako peptid zbytků 47 až 55 sekvence identifikačního čísla 1. Dále, jak se opakuje ďipěptid Léu-Gly, se předpokládá, že syntetizovaný segment D LeuGly-Ala bude působit stejně jakú sekvence C9, ve které je segment D Leu-Gly-Gly. Nonapeptidová. sekvence identifikačního čísla 16 je také účinná podle předkládaného vynáIezu.

Ve světle toho, Co bylo určeno jako sekvence oblasti VDJ klonů, o kterých.se ví, že jsou diabétogenní ve srovnání s těmi, které nejsou, preferované ztělesnění předkládaného vynálezu je peptid, který má minimálně sedm segmentu V a N-koncova cast pro C9, zatímco segment D je až 8 sekvence identifikačního rozpoznává autoimunní T buňky, aminokyselinových zbytků vzorce V-D-J, ve kterém V zahrnuje dipeptid Λ-S, D zahrnuje dipeptidovou sekvenci

L~G a J“ zahrnuje tripeptidovúu sekvenci tÍ-Q-Ό- Oblast D má výhodně 2 až 5 aminokyselin- Výhodně je tripéptid segmentu V zahrnující dipeptid A-S přímo sousední se segmentem

D a tripéptid N-Q-O segmentu J je přímo sousední se segmentem D.

Peptid předkládaného vynálezu může mít až 24 aminokyselin- Výhodně každá další aminokyselina segmentu V odpovídá Sekvenci genového segmentu V@12 (32) a. každý další peptid v segmentu J odpovídá segmentu JřJ2.5 (33).

Krone preferovaných peptidových zbytků diskutovaných výše, sekvence, které těmto podstatnou částí odpovídají a ze kterých je jedna nebo více aminokyselin odstraněna, přidána nebo nahrazena jinými aminokyselinami, jsou v předkládaném vynáleze zahrnuty, pokud mají schopnost křížově imunologicky reagovat s původním peptiděm tak, že takto aktivované

T buňky rozpoznávají a potlačují autoimunní T buňky anti-p277.

- - -- -flby se-dosáhlo podstatně Shody š takovým peptidem, musí být změny sekvence kteréhokoliv z preferovaných peptidů předkládaného vynálezu relativně male. Tak mohou být snadno syntetizovány peptidy podstatnou částí odpovídající vyjevovaným peptidům předkládaného vynálezu a prozkoumávána jejich příslušná bioaktivita. Nejvhodnější pokus, který se dá použít k prozkoumávání biologické aktivity vákcíny pro potlačení diabetů, je aktuálně testovat konstrukt vakcinací

NGD myší a určit, zda tato vakciňace účinně inhibuje nemoc, jak je zde popsáno s ohledem na pokus, jehož výsledky jsou ukázány na obr. .7. Ve světle faktu, že kritická oblast je relativně krátká, by nebyl zbytečně velký pokuš tvořit drobné substituce, adice a delece a prozkoumávat příslušnou biologickou aktivitu produktu, obzvláště ve světle informace o motivu, která múze být vyčtena z. tabulky 3.

Kromě zde diskutovaných peptidfl mohou být také použitý jejich soli a funkční deriváty, které mají schopnost křížově imunologicky reagovat s uvedenými peptidy.

Užívaný termín soli“ se vztahuje jak k solím karboxylových skupin tak ke kyselým adičním solím aminoskupin proteinové molekuly. Soli karboxylove ákupiny se mohou tvořit prostředky v oboru známými a zahrnují anorganické soli, například soli sodné, vápenné, amonné, železa nebo zinku apod., a soli organických baží tvořené například š aminy, jako je trietanolaiíiin, arginin nebo lysin, piperidin, prokain apod. Kyselé přídatné soli zahrnují například soli minerálních kyselin jako je například kyselina solná nebo sírová a soli organických kyselin jako je například kyselina octová nebo štavelová.

Užívaný termín funkční deriváty pokrývá deriváty, které mohou být připraveny prostředky známými v oboru z funkčních skupin, které se vyskytují jako postranní řetězce na zbytcích nebo N- či C-koncových částech, a jsou zahrnuty do vynálezu pokud zůstávají farmaceuticky přijatelné, tj. neničí aktivitu proteinu, nepropůjčují toxické vlastnosti přípravkům, které je obsahují, nepříznivý vliv na jejich antigenní vlaštnosti.

a nemají

Tyto deriváty zahrnují například alifatické estery karboxylových skupin, amidy karboxylových skupin reakcí se čpavkem nebo s primárními Či sekundárními aminy, N-ačylové deriváty volných aminoskupin aminokyselinových žbytkfl tvořených s acylovými skupinami (např. alkanoylové nebo karbocyklické ařoylově skupiny) nebo O-acylové deriváty volné hydroxylově skupiny (například serylové nebo threonylové zbytky) tvořené s acylóvými skupinami.

Peptidy	podle	předkládaného vynálezu	je možné
terapeuti cky	použít	jako	vakcínu pro	léčbu IDDM
a počátečního	IDDM.	Jsou-li podávány s	příslušným
imunogenním	adjuvans,	jako	je olej, takže	jsou schopny
navodit imunogenní	odpověď,	vzrostou T	buňky, které
potlačují autoimunní	T buňky	anti-p277. Prokáže-li se, že

pacient jě již v prekliiiickýčh počátečních stadiích IDDM, in jekce peptidu podle předkládaného, vynálezu může vyvolat potlačení autóimunity, a tak zastavit autoimunní proces před

-tím, než nastane významně trvalé poškození. Vakcinace peptidem podle předkládaného vynálezu může být také použita jaktr léčebný ' prostředek pro zastavění áútóimiiriňíhó pročešu dokonce i. když je již daleko pokročilý, jak bylo nedávno ukázáno v naší laboratoři vzhledem k léčbě ŇOD myší peptidem p277 (4).

Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutický přípravek k prevencí nebo léčbě IDDM obsahující farmaceuticky přijatelný nosič a jako aktivní hlavní látku účinné množství peptidu podle předkládaného vynálezu, jeho sfll nebo funkční derivát. Farmaceuticky přijatelný nosič je výhodně olejové vehikulum jako je emulze minerálního oleje známá jako nekompletní Freudovo. adjuvans (IFA). Avšak IFA, rovněž jako kompletní Freudovo adjuvaňs (CFA, přípravek minerálního óleje obsahující různá množství usmrcených organismů Mykobaktéria) nejsou žádoucí pro,použití v lidské medicíně, protože minerální olej není metaboliZovatelny a nemůže být tělem odbourán. Nedávno bylo nalezeno, že určité tukové emulze, které se dlouhodobě používaly pro nitrožilní výživu pacientů, se mohou také chovat jako vehikulum peptidové léčby při použití peptidů předkládaného vynálezu. Jako dva příklady takových emulzí jsou komerčně dostupné tukové emulze známé jako Iritralipid a LipófundinIntralipiď je registrovaná obchodní značka Kabi Pharmacia, Švédsko, pro tukovou emulzi pro intravenózní výživu, popsaná v patentu U.S. č 3 .169 094. Lipofundin je registrovaná obchodní značka B. Braun Mélsungen, Německo. Obě obsahují jako tuk sojový olej (100 nebo 200 g v 1 OOOml destilované vody- 10¾ nebo 20¾}. Jako emulgátory jsou v Intralipidu použity fosfolipidy vaječného žloutku (12 g/1 destilované vody}^- a v ' Lipof und i nu lecitiny vaječného žloutku (12 g/1 destilované vody}. Isotonicita vyplývá z přidání glycerolu (25-g/1) v obou, Intralipidu i Lipofundinu.

Kromě použití peptidů předkládaného vynálezu jako vakcíny při přímém podávání, mohou být peptidy předkládaného vynálezu použity také k aktivaci autologních T buněk pacienta s IDDM nebo počátečním IDDM. Autologní T buňky se získají od pacienta s IDDM, který bude léčen, výhodně separací z periferní krve. Tyto T buňky jsou poté aktivovány in vitro kontaktem s peptidem podle předkládaného vynálezu prostředky odborníkovi známými- Aby sé potlačily autoimunní

T buňky, podají se poté připravené specifické a aktivované T buňky témuž pacientovi, od kterého byly původně získány.

Předkládaný vynález také zahrnuje přípravek z takových specifických a aktivovaných T -buněk- Podávání těchto T buněk provádí pasivní imunizaci proti autoimunrtím T buňkám, a tím potlačuje autoimunní proces. Není nezbytné získat kompletní vyléčení IDDM, aby byl předkládaný vynález užitečný- Pokud

Se dosáhne určitého potlačení áutoimunního procesu, mají léčebné přípravky a způsoby předkládaného vynálezu praktickou využitelnost.

Peptidy předkládaného vynálezu jsou také užitečné pro Časnou diagnózu diabetů, výhodně v préklinickém stádiu nebo krátce po klinické diagnóze. jakož i pro určení stádia nemoci a pro sledování průběhu imunologické léčby IDDM a zejména léčby p277. Jestliže sérum zmíněného pacienta obsahuje T buňky, které proliferují nebo jinak projevují svou imunologickou funkci, jako expresí cytokinů při kontaktu^- s peptidem předkládáněKo vynálezů, ” je to žnák existence nemoci. Ják je vidět na obr. 4, ánti-idiotypové protilátky jsou přítomné v největších množstvích v časrtých stádiích nemoci. Miňoto kvantitativní nebo semi-kvantitativní analýza počtu takových T buněk u pacienta koreluje s účinností potlačující léčby. Čím větší množství těchto T buněk, tím lepší průběh léčby. Tak, jestliže se množství takových protilátek v průběhu času zvyšuje, léčba sé stává účinnou. Jestliže se množství snižuje, léčba není i r účinná a měla by být pozměněna tak. aby se dosáhlo zvýšeného množství těchto T buněk.

Proto předkládaný vynález dále zahrnuje způsoby diagnózy a určování stádia IDDM a monitorování průběhu léčby IDDM.

Přehled obrázků

Obr. 1- Použití TCR genu Vp v klonu C9 určované metodou PCR. Dráhy 1 až 19, devatenáct různých amplifikačních reakcí pro Vp s oligonukleótidovým primerem (očkem) Cp. Dráha označená s.m.: velikostní standard fx/Háe III, Gel byl hybridizován s vnitřní o1igonukleotidovou sondou Cp. a. proto je použit velikostní standard. Dva pozitivní pásy pro Vp2 a Vpl2 indikují výskyt těchto segmentů u klonu C9.

Obr. 2. Výskyt sekvencí homologních k přestavbě C9 VDJ určované metodou PCR v různých T buněčných liniích za použití specifického o1igonukleotidového primeru C9 VDJ.

První čtyři dráhy ukazují výsledky linií NOD, linie C9 (dráha 1), C7 (2). N4 <3J.a....anti-ovalbumi-nová^- (anti-OVft) linie (4). Další dráhy ukazují linie C57BL/6 antirp277 získané po různém počtu stimulačních cyklů^: 1 stimulace (dráha 5). 2 Stimulace (dráha 6), 5 stimulací, dvě různé linie (dráha 7 a 81 a 6 stimulací (dráha 9) a linie C57BL/6 anti-OVft. (dráha 10). Za povšimnutí stojí, ze chybí signál od linií NOD a C57BL/6 anti-OVft (dráhy 4 a 10) a není ani od první stimulace anti-p277 linie C57BL/6 (dráha 5). Slabý signál získaný od příbuzného klonu N4- (dráha 3) dokazuje přesnost testuObr. 3A a B- Výskyt sekvencí homologníčh k presmyku C9

VDJ v amplifikacích metodou PCR linií C57BL/6 anti-p277. Byla provedena amplif ikáce panelu V{3, jak je popsáno v obr. 1, se vzorky cDNA linií C57BL/6 anti-p277 po dvou stimulacích (obr. 3A) a po 6 stimulacích (obr.3B).

Hybridizace v gelu byla provedená se specifickou ol igonukleotidovoU sondou C9 VDJ.

Obr. 4A a R. Spontánní anti-idiotypové odpovědi u panenských samic (tj. zvířat, na kterých nebyly dosud prováděny .žádné pokusy a nepřišla dosud do styku s daným antigenem) (obr. 4A) a samců (obr. 4B) NOD myší. U panenských samic a samců NOD myší byly měřeny T buněčné odpovědi na hspGO (idiotypová) a ha klon C9 (anti-idiotypová). Deset samic a deset samců NOD myší bylo analyzováno ve věku 4. 6, 8, 10. 13 a 21 týdnů a jejich sleziny byly podrobeny testu proliterace T buněk.

U slezinných buněk (hustot 200 000 buněk /0.2 cc v jamkách mikrotítráěních destiček) byly testovány proliferační odpovědi bud^ná lidský hspGÓ (5 pg/ml) riebo klon C9 (20 000 buněk/jamka ozářených 5 000 rad). Proliferační odpověď byla měřena přidáním 3H-tymidinu do tkáňově kultury po dobu posledních 16 hodin ze 72 hodinové stimulace. Inkorporováný 3H-tymidiň se měřil ha počítači β Částic a vypočítával se stimulační index (SI) jako e.p.m. inkorpórace v přítomnosti antigertu/c-p.m. inkorporace v nepřítomnosti antigenu. Jednotltvé myši se testovaly odděleně a pro každý časový bod se vypočítával prflměr±směrodatná odchylka (SD).

Obr. 5A a B. Imunizace klonem C9 nebo C9VDJ-flageliňem zesiluje anti-idiotypové odpovědi.

Obr. 5A^ Sanice myší NOD, staré 9 týdnů, byly intraperitoneáliíě imunizovány buď buňkami klonu C9 nebo T buněčnou linií anti-OVA v množství 5xl0⁶ aktivovaných T buněk v 0,1 ml PBS. Devět dnů později byly vyňaty sleziny pro test proliferace, jak je popsáno u Obr. 4. Antigeny použité v testu proliferace byly klon C9, klon N4, linie anti-OVA, všechny T buňky o hustotě 20 0007jamku byly ozářeny 5 000 rad, syntetické peptidy C9VDJ ASSLGGNQDTQY (Zbytky 47 až 58 sekvence identifikačního čísla 1) a N4VDJ

ASSLVTNQDTQY (sekvence identifikačního čísla 2) v množství jjg/ml.

Obr. 5B = Samice myší NOD, staré 9 týdnů, byly intraperltoneálně imunizovány buď 100 pg C9VDJ-flagelinu nebo pouze flagelinem v 0,1 ml PBS. Test proliferace byl proveden jako v obr. 5A.

Obr. 6. Imunizace s G9VDJ konjugovaným buď s flagelinem nebo s OVA vyvolává antl-idiotypóvé odpovědi- 9 týdnů staré samice myší kmenů BALB/č nebo NOD byly intraperltoneálně

Imunizovány flagelinem, C9VDJ-flagelinem nebo G9VDJ-0VA, 5 myší ve skupině a 10Ó pg antigenu na myš. C9VDJ-flagelin a flagelin byly injikovány v 0,1 ml PBS a C9VDJ-0VA byl iňjikován v emulzi s 0,1 ml IFA. Devět dnů později bylý vyňaty sleziny a byly testovány na proliferaci jak je popsáno v legendě k obr. 4. Proliferační odpovědi, se testovaly proti syntetickým peptidům C9VDJ ASSLGGNQDTQY (zbytky 47 až 58 sekvence identifikačního čísla l)a N4VDJ

ASSLWTNQDTQY (sekvence identifikačního čísla 2) v množství pg/ml Obr. 7A a B. Ochrana před diabetem ariti-idiotypovými

T buňkami.

Obr. 7A^; Šest týdnů staré samice NOD myší byly intraperitoneál.ně očkovány 100 ug samotného G9VDJ-flagelinu v PBS či ponechány běz ošetření, 10 myší ve skupině. U diabetů se sledovaly hyperglykémie od věku 2 a půl měsíce a dále, za hyperglykemii považůvaly hladiny cukru v krvi přesahující 11,1 inmol/lOfar. 7B. Deset samic NOD myší starých 5 týdnů bylo intraperitoneálně naočkováno ozářenými (5 000 rad) buňkami klonu C9, 5xl0⁶ aktivovaných T buněk v 0,1 ml PBS. Dva týdny později byly sleziny vyňaty a splenočyty sloučeny. Deset neošetřených panenských samicí NOD myší stejného věku bylo také analyzováno a jejich Splenočyty byly také sloučeny. Splenocyty myší naočkovaných C9 byly Stimulovány protiozářenému klonu C9, 8xl0⁶ splenocytů a 0,8xl0⁶ ozářených buněk klonu C9 na ml. Splenočyty z panenských NOD myší byly stimulovány proti ozářeným T lymfoblastům NOD samic vybřanýin pomočí Confl. Po 48 hodinách stimulace byly aktivované T buňky odděleny od inaktivovaných centrifugací ria.přístroj i Lymphoprep CNycomed, Norsko), dvakrát prcimyty v PBS a intraperitoneálně injikovány, 107 buněk na myš, 6 týdnů starým samicím NOD myší. Každá skupina se skládala z 10 myší a 10 myší bylo ponecháno bez ošetření. Vývoj diabetů se sledoval jako v obr. 7A.

Obr. 8. Proliferace T buněčné linie ariti-C9 nevyžaduje

APC (Antigen Presenting Cell - buňka prezentující antigen). T buněčná linie anti-C9 vznikla ze splenocytfl panenských 6 týdnů starých samic NOD myší, jak popsáno výše (3), po opakovaných stimulacích ozářenými T buňkami klonu C9. T buněčná linie anti-OVA pochází od samic NOD myší podněcovaných OVA in vivo. PrOliferační odpovědi těchto linií byly testovány ve 4. stimulaci linie anti-C9 a v 17.

stimulaci linie anti-OVA, 50 000 buněk na jamku. Linie anti-C9 se testovala proti aktivovaným a ozářeným (5 Ó00 rad) buňkám klonu C9, 50 000 na jamku, a linie anti-OVA se testovala proti OVA (Sigma) 10 pg na jamku. APČ byly ozářené (3 000 řad) splenočytý samců NOD myší, 200 000 na jamku. Pro. ujištění, že buňky linie anti-C9 nebo klonu C9 použité v proliferaci nejsou kontaminovány APC, jsmé tyto buňky používali jako APC pro linii anti-OVA. Test proliferace se prováděl jak popsáno pro splenočyty v obr.4.

Obr. 9. Ošetření peptidem p277 vyvolává anti-C9 odpověď. Samice NOĎ myší, staré 12 týdnů, byly subkutánně imunizovány p277 nebo p278 v IFA, 100 pg na myš, či ponechány běž“ošetření7 10 myší ve skupině. Ve 2 nebo 5 týdnech po ošetření bylo 5 myší z každé skupiny analyzováno, jejich sleziny vyňaty a jednotlivě testovány na proliferaci s 5 pg/ml C9VDJ peptidu, ják je popsáno u obr. 4.

Popis tabulek

Tabulka 1. Sekvence aminokyselin vybraných linií NOD a C57BL/6. Jsou označeny odlišné segmenty Vp a J0. Odlišnosti aminokyselinové a nukleotidové sekvence od C9 VDJ přesmyku jsou vyznačeny tučnými písmeny. Sekvence klonu NOD

4.

4-1-E.-2 jé převzata z Nakano a kol. (151.

Tabulka 2. Tkáňová distribuce G9 VDJ a VJ u NOD myší různého veku detekovaná metodou PCR se specifickými oligonukleotidovými prímeřy.

nd=neděláno

Tabulka 3. Anti“idiotypové odpovědi anti-C9 jsou restriktivní v obou třídách hlavního histokompatibilního systémů, MHC I a II (MHC - Major HistocompatiBi1 ity Complex - hlavní histokompatibi lni systéml. Pět -samic NOD myší starých 6 týdnů bylo intraperitoneálně naočkováno buňkami klonu C9, 5xlO^G. Devět dnů později byly vyňaty sleziny a splenocyty sloučeny. Zjišťovala se proliferacní odpověď splenocytů buď na ozářeně buňky (5 000 radí klonu C9, 20 000 na jamku, nebo na peptid C9VDJ, 5 pg/ml. Ža účelem určit restrikci MHC se přidaly, monoklonální protilátky specifické pró haplotýpy tříd I a II, IgG purifikováný 2 mM .amonium sulfátem. Byly použity následující protilátky^ anti-I-A: MKD6, anti-K^c-^; K9-18-10 a anti-D^b= 28-14-8.

Procento inhibice se určovalo podle vzorce100 x C.l-SI v přítomnosti proti látky/SI bez protilátkyl.

Příklady provedení vynálezu

Materiál a metody

Zvírátá

N0D/L^: myši Se chovaly v našem zvěřinci ve Weizraann

Institute of Science. Základ pro chov byl dar od Dr. E. H.

Leitera. Myši C57BL/6 a BALB/c byly získány z Jackson

Laboratories, Bar Harbor, ME, USA.

Aňtigeny

OVA byl zakoupen od Sigma Chemical Co., St. Louis, MQ, USA. Rekombinantní lidský hsp60 byl laskavě poskytnut Dr. Ruurd van der Zee z Univerzity Utrecht. Syntetický peptid p277 VL6GGCALLRCIPALDSLTPANED (sekvence identifikačního číslá ' 53. byl syntetizován standardní chemií Fmoc, purifikován na HPLC reverzní fázovou chromatografií za použití kolony CM12 (Merck, FRO3. Sekvence byla potvrzena analýzou aminokyselin. Peptid p277 byl konjugován s OVA pomočí l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl3karbodiimidu (EDC,

Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA3, jak popsáno v (83.

ImuniZáce

Samci myší kmene C57BL/6 staří 6 až 8 týdnů byli injikováni s.c. 50 ug konjugatu p277-0VA emulgovaném v ΪΕΑ (Difco, Detroit, MI, USA3 v celkovém Objemu 0,2 ml. Myším byla odebírána krev 2, 3 a 4 týdny po imunizaci a hladina 'glukózy v “krvi šě vyšetřovala na přístrojí Beckman Glucose

Analyzer II (Beckman, Palo Alto, CA, USA3- Hýperg.lykémie byla definována jako koncentrace plazmatiCké glukózy vyšší než 11,1 mmol/1 měřená v 10 hodin v podmínkách, kdy krysy nehladověly. Tato koncentrace glukózy byla vybrána jako hranice hypergiykémíe, protože byla větší než 3 směrodatné odchylky (SD3 od průměrně koncentrace plazmatické glukózy měřené u 200 neošetřených nediabetických myší (53.

T buněčné linie

T buněčné linie a klony HOD získané z prediabétických NOD slezin byly in vitro vybírány podle své odpovědi na rekombínantní hsp60, jak popsáno (3 5- T buněčný klon NOD anti-OVA byl laskavě poskytnut Dr. Anně Cooke, Cambridge, Anglie. T buněčné linie anti-p277 a anti-OVA byly připraveny drénáží lyinfatických uzlin C57BL/6 myší 9. den po imunizaci, jak je popsána dříve <35. Ukázalí jsme, že hyperglykéiíiie může být adoptivně přenesena klonem Č9 a dalšími ánti-p277 T buněčnými klony NOD myší (35 a T buněčnými liniemi artti-p277 myší C57BL/6 <55.

Příprava RNA a cDNA

Buněčné 1inie

Po třídenní aktivaci inkubací s p277, jak je popsáno <35, byly sebrány T lymfoblasty a odděleny od buněčných úlomků a doplňkových.buněk na fikolovém gradientu, promyty PBS a pěstovány po 2 další dny v živném médiu obsahujícím

10^ růstový faktor pro T buňky, ják popsáno v <35, aby še zajistilo, že tkáňové kultury obsahují pouze živé T buňky.

Poté byly T buňky sebrány, promyty PBS a rychle zmrazený v tekutém dusíku. Každý vzorek byl homogenizován a celková

RNA byla izolována pomocí soupravy RNAzol (Cinna/Biotecx,

Friendsvood, TX, USA5- Přibližně 5 pg celkové RNA bylo přepsáno do prvního vlákna cDNA ve 20 pl reakci pomocí soupravy ná cDNA (Invitrogen, San Diego, CA, USA5 za použití oligo. dT jako primeru25

Slezina a břzlík

Sleziny a brzlíky byly odňaty myším NOD/L- samicím a samcům a samcům myší C57BL/6 a okamžitě zmrazený v tekutém dusíku. RNA a cDNA byly připraveny jak popsáno výše.

Ostrůvky pankreatu

Ostrůvky pankreatu metodou dle Gotoha injíkóváná kolagenáza, éxcidován pankreas.

v třěpací vodní lázni v tkáň důkladně prámyta z natráveniny za použití v tekutém dusíku. RNA samic NOD myší byly připraveny (9). Stručně, do žlučóvodu byla poté byl žlučovod podvázán a byl

Provedla šě digesce kolagenážou

37°C po 30 až 45 minut a poté byla

PBS. Ostrůvky byly ručně sebrány disekujícího mikroskopu a zmraženy a cDNA byly připraveny jak uvedeno vyse.

Amplifikace PCR

Panel V(S

Tři μΐ připravené cDNA Byly přidány do reakční směsi Obsahující pufr PCR; 1 μΜ směs dNTP, 1 μΜ primer CfS (Operon

Technologies, Alameda, CA, USA) a 2 U/ml Táq polymerázy (USB, Cleveland, OH, USA). Tato směs byla rozdělena do 19 reákčních zkumavek, každá z nich obsahovala odlišný V<5-spětíif ický olígónukleotidový přiměř, získaný Od Operon

Technologies (Alameda, CA, USA). Konečná koncentrace příměru byla 1 μΜ. Amplifikace se prováděla v termocykleřu DNA (Perkin Elmer) po 30 cyklů. Profil cyklu byl^: denaturace v 94°C po dobu 60 s, nasednutí primerů (annealing) v 55°C po dobu 60 s a prodlužování (elongation) v 72°C po dobu 60 s.

Osm pl každé amplifikační reakce se rozdělilo elektroforézou v 2.% agarózovém gelu (FMC, Rocklánd, ME, OSA), obarvilo etidium bromidem (Sigma Chemical Co. , Sť. Louis, MO, OSA) a pozorovalo v ÚV světle. Hybridizace v gelu (10) se prováděla po dobu jedné hodiny s oligonukleotidovou sondou specifickou pro Cp značenou³²P _o koncentraci 0,5 pmól/mlAmplif ikované produkty se sekvenovaly přímo podle Casanova a kol. (11) se soupravou Sequanasé™ verze II (OSBl.

Specifický oligonukleotid C9 VDJp

C9 VDJp-specifický oligonukleotid a další oligonukleotidy byly syntetizovány v Department of Molecular

Biology and Genetid Engineeřing, Hadassah Hospital, Mount

Scopus, Jerusalem, Israel- Sekvence G9 VDJp-specifického oligonukleotidu byla: 5'-TTAGGGGGTAACCAÁGAC-3' (báze 10 až sekvence identifikačního čísla 6). Jeden μΐ cĎNA každého testovaného vzorku byl vložen do reakční směsi obsahující jako primery oligonukleotid C9 VDJp a oligonukleotid Cp a byl analyzován jak uvedeno výše- Vyšší specifičnosti bylo dosaženo zvýšením teploty nasednutí příměrů na 65°C. Jako sonda pro hybridizace v gelu s panelem Vp amplifikovaným PCR byl použit C9 VDJp-specifický oligonukleotid .značený ³²P, jak popsáno v (10).

Amplifikace C9 V<ť «1 jedňovláknové cDNA z C9 bylo opatřeno jednovláknovým koncem pomocí dGTP za použití koncové transferázy (TdT) za podmínek doporučených výrobcem (Boehriňger Mannheim, SŘŇ) a 100 mM dGTP v celkovém objemu 50 μΐ po dobu 30 min. Deset pl této reakce bylo vloženo do ukotvené (anehored) reakce PCR podle Acha-Orbea a kol. (12). Sekvence prvního oligonukleotidového příměru PCR C« (Gal) bylá: 5’-TGGCGTTGGTCTCTŤTGAAG-3’ (sekvence identifikačního čísla 7) a sekvence Oligonukleotidového primem (C<z2) použitého pro druhou hnízdovou (nested) amplifikací PCR byla-- 5’-CGGCACATTGAŤTTGGGAGTC-3' (sekvence identifikačního čísla 8). Amplifikáční produkt byl detekován o1igonukleotidovou sondou (Ca3>- 5*-ACACAGCAGGTTCTGGGŤŤC-3‘ (sekvence identifikačního čísla 9) klonovanou do plaZmidu pBluescript SK(+) (Strátagěne) a sěkvenován podle návodu pro uživatele soupravy Seguanase™ verze II.

Specifický nukleotid C9 VJa

Specifický oiigonukleótid C9 VJ« o sekvenci

5’-ATGAGAGGGCCTAATŤAC-3' (sekvence identifikačního čísla

10) byl syntetizován a použit jako přiměř Spolu s primerem

Cúc2 v amplifikací PCR různých linií, jak je popsáno pro amplifikací C9 VDJťJ.

Výs1edky

Nukleotidová sekvence TCR C9

Aby se určila nukleotidová sekvence řetězců a á 0 TCR

C9, byla z mRNA izolované z klonu C9 připravena CDNA. Amplifíkace PCR byla prováděna za použití ol igonukleoti dového primeru C<3 pro konstantní oblast a každého z 20 specif ických oligonukleotidových přiměřil V<3.

Z 19 různých ampllf.ikačních reakcí V(í byly viditelné pouze amplifikáční produkty PCR V£2 a VťS12 (Obr. 1). Po přímém sekvenování obou produktů PCR byl V<S2 shledán neproduktiyním Cmimočtecí rámec). Náopak VÍJ12 byl v rámci a tedy produktivní Ctabulka 1).

Vzhledem k většímu počtu á variabilitě oblasti V řetězce a je testování pomocí podobné panelové amplifikace neproveditelné. Proto, abychom mohli sékvenóvat řetězec a, jsme použili ukotvené PGR-s cDNA opatřenou jednovláknovým koncem pomocí dGTP používající oligonukleotidových příměrů pro konstantní oblast. Nalezlo se, že sekvence VJa C9 je

MRGPNV (sekvence identifikačního Čísla 11), V« je B1ÍB C13) a j« je 16 (14).

Používání TCR v jiných T buněčných liniích NOD

Studovali jsme další T buněčně linie pocházející' z téhož poolu lymfoéytů NOD, které dali vzniknout klonu C9.

Linie C7, NI a N26, které rozpoznávají peptid p277 lidského hsp60 byly diabetogénní a mohly očkovat NOD myši proti rozvíjejícímu se diabetů C3). Také jsme studovali linii N4<

která reaguje na hsp65 H. tub&rculosis. ale ne na lidský hspóO, a není ani diabetogenní ani neočkuje proti diabetů

C3) a nepříbuzné linii anti-OVA.

Protože oblasti CDR3 řetězců a a (i TCR mohou každá přispět k idiotopu, připravili jsme specifické oligonukleótidové sondy založené na oblastech VJa a VDJD klonu C9- Za použití priineru pro konstantní oblast a a olígonukleotidového primerů VJa isme získali produkt PCR pouze pro T buněčnou linii anti-p277. Výsledkem použití olígonukleotidových primerů pro konstantní oblast β řetězce a o1ígonukleotidových příměrů VDJp byl pozitivní signál PCR pro všechny T buněčné linie anti-p277. Avšak pro linii N4 mohl být detekován slabý amplifikační pás Cobr. 2, dráha

35. Linie anti-OVA pocházející z myší NOD nebo C57BL/6 byly negativní (obr. 2, dráhy 4 a i05.

Pro další analýzu amplifikaeí PCR jsme použili panel 19 olígonukleotidových primerů νβ-specjfických a pro konstantní oblast řetězce β. Ve všech T buněčných liniích NOD anti-p277 jsme, mezi jiným, nalezli produkt amplifikace νβ12, který byl sekvenován a shledán identickým s νβ C9.

Amplifikace cDNA pocházející z buněčné linie N4 vedla ke vzniku produktu PCR νβΐί, mezi jiným. Sekvenování produktu odhalilo oblast VDJp podobnou VD-Τβ C9 až na odlišnost ve 3 bp (párech baží5, jak lze vidět v tabulce 1. Za povšimnuti stojí, že velmi podobné sekvence VDJ C9 a N4 byly výsledky přestavby 2 různých genů νβ. Menší rozdíl v sekvenci VDJ C9 ______,_____a—N4~mel- -za- -následek^- nápadně' oďlTšxiě“ ampl ifikace PCR (obr25, které dokazují užitečnost příměru PCR jako prostředku pro prozkoumávání idiotopu C9 a příbuzných sekvencí.

Tabulka 1 také Obsahuje řetězec β sekvence VDJ klonu

NOD, 4-1-E-2, publikovaný Nakano a kol. <155- Bylo zveřejněno, že tento klon přenesl inzulitidu na transgennf diabetů prostý kmen 1-E⁺ NOD myší. Avšak jeho specifický antigen oznámen nebyl. Za povšimnutí stojí, že 4-Γ-Ε.2, podobně jako C9, exprimúje geny νβΐ2 Je2.5 a má sekvenci VĎJ podobnou teze z kmene C9 = C9-ASSLGGNQD (zbytky 47 až 55 (sekvence identifikačního čísla 1), 4-1-E.2-ASRLGNQD (sekvence identifikačního čísla 3).

Distribuce sekvencí C9 VDJp a VJa v tkáních NOD

V naší kolonii NOD je inžulitida poprvé patrná kolem veku 1 měsíce- Intenzita inžulitidy se zvyšuje a 0 buňky produkující inzulín jsou zničeny- U samic myší se začíná vyvíjet manifestní hyperglykémie ve 3 měsících věku a v 6 _s. -s měsících veku jsou nevyhnutelně všechny samice myší klinicky nemocné a nejsou-li léčeny inzulínem, umírají- U samců myší se progrese inžulitidy zpožďuje a manifestní IDDM se vyvíjí u pouhých 50¾. Abychom viděli-, Zda přítomnost přestavby C9

VDJfJ může korelovat s progresí autoimunní nemoci, připravili jsme cDNA ze slezin a brzTíků 0,5, 1, 2, 3 a 4 měsíce starých NOD myší, orgány 5 inysí v každé věkové skupině byly sloučeny. U samic NOD starých 1 a 2 měsíce se studovaly ostrůvky. Vzorky cDNA se amplifikovaly PCR za použití primerů VDJíí nebo VJ« a odpovídajícího primeru pro konstantní Oblast. Všechny reakce PCR za použití primeru VJa byly negativní, ale PCR s primerem VDJ0 poskytlo produkt jak u samic tak i u samců NOD myší. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2- Vzorky připravené z brzlíku byly pozitivní jak u samců tak i samic v každém věku. Ve slezinách byla přestavba C9 patrná od věku 1 měsíce u samic a od 2 měsíců u samců. V Zanícených ostrůvcích byl také detekován VDJfiZdá še tedy, že sonda C9 VDJ(3 detekuje idiótyp sdílený jednotlivými NOD myšmi. Progrese specifického signálu C9

VDJp z brzlíku do sleziny zřejmě koreluje s progresí nemoci. Využití TCR β v T buněčných liniích anti-p277 kmene C57BL/6

Protože p277 hraje roli v diabetů NOD myší, testovali jsme, zda imunizace proti t,ómuto peptidu navozuje nemoc u myší, které nejsou náchylné k diabetů, a zjistili jsme, že p277 konjugováný s proteinovým nosičem může navodit hyperglykémii, inzulitidu a autoprotilátky proti inzulínu u myší C57BL/6 (5). Proto jsme založili T buněčné linie anti-p277 pocházející ze splenocytfl diabetických myší

C57BL/6, které byly imunizovány.. p277/0VA. Linie se propagovaly v jamkách mikrotitračních destiček a opakovaně se stimulovaly p277 v přítomnosti ozářených autologních splenocytfl. Výsledné T buněčné linie mohly adoptivně přenášet inzulitidu a hyperglykémii, ale kontrolní T buněčná linie anti-OVA nemohla (5).

Analyzovali jsme výskyt V0 u linií anti-p277 po 1, 2, 5 a 6 stimulacích . s p277. Po každé stimulaci byly vzorky z několika jamek sloučeny pro analýzu a další kultivaci. Jak je popsáno výše, připravila se cDNA a použila se pro panelovou amplifikaci Vp. První dvě stimulace vedly pozitivní amplifikaci pro prakticky všechny primery Vp. Dva různé vzorky projevovaly po páté stimulaci restriktivnější použití Vp = 1, 2, 6. 7, 9a 19 pro první vzorek a 1, 14,

15, 16, a 18 pro druhý. Po šesté stimulaci byl nalezen restriktivní amplifikační soubor^: 3,5, 7,8 a 11. Žádný konkrétní Vp nebyl spójen s rozpoznáváním p277.

Na cDNA vzorků z různých stimulací se prováděla amplifikace PCR s oligonukleotidovými příměry pro oblast Č9

VDJfi a C(š. Obr. 2 ukazuje pozitivní amplífikaci ve všech kromě první stimulace (dráha 59. Abychom zjistili, která z amplifikačí V@ obsahovala přestavbu VDJíJ podobnou C9, hýbridizovali jsme druhý a šestý stimulační panel PCR s oligonukleotidovou sondou C9 VDJ&. Jak lze vidět na obr.

3A, Vfi6, 8, 11 á 16 hybřidizovaiy se sondou v druhé stimulaci, ale v seste stimulaci (obr. 3B) byly pozitivní pouze Vfi8 a 11. Amplifikační produkt V(36 z druhé stimulace byl klonován a shledalo se, že jeho sekvence VDJ má určitou podobnost s C9 VDJjS (tabulka 1). Rovněž se získalo šest dalších, ale nepříbuzných sekvencí VDJfs (není ukázáno). Také jsme prozkoumávali buňky brzl měsíce starých samců myší kmene oligonukleotidového primeru C9 pozitivní brzlík a slezina, pozitivní pouze brz-líkku a sleziny panenských 2

C57BL/6 a BALB/c za použití

VDJíS- U myší C57BL/6 byly avšak u myší BALB/c byl

Ověření sondy VDJ PCR

V této studii byly určeny sekvence RNA kódující řetězce a a β TCR diabetogenního klonu NOD C9 á k detekci sekvencí

TCR příbuzných sekvencím C9 u různých T buněčných populací byly použity sondy VJ« a VDJ(i. Specifičnost primeru C9 VDJ0 byla prokázána hybridizací tohoto oligonukleotidů s produkty amplífikace PCR řetězce β za použití primerů V0 a C(šSpolehlivost PCR používající jako přiměř oligonukleotid C9 VDJ@ byla potvrzena vyšetřením sekvencí TCR: klon N4, který se liší vě 3 bp (2 aminokyseliny) od primeru C9 VDJ£, poskytl pouze slabý produkt PCR (obr. 2), zatímco linie

C57BL/6 anti-p277, která obsahovala klon, jež se také lišil v 3 bp (tabulka 1), poskytla výraznější signál PCR. Avšak nehomologní nukleotidy z klonu B6 Sídlí blíže k 5* konci sekvence primerů C9, než 3 bp nehomologního nukleotidu N4

VDJ0, což má za následek možnou účinnější amplifikaci za střingéhtních podmínek. Tak můžeme uzavřít, že· naše C9 vĎJfí byla sonda přijatelná pro detekci sekvencí těsně se blížícím k sekvenci C9.

Šegmentý CDR3 řetězců a a β TCR (VJ« a VDJ@) Se tvoří zjevně náhodnou rekombinací 3' konců genů Va a Vil s 5' konci genů Ja & DJ<1, v uvedeném poradí- Náhodnost še dále zvyšuje

N inzercemi, nukleotidy neřízenými genetickými templáty (16). Prakticky neomezená potenciální variabilita segmentů . CDR3 tvoří diverzitu repertoáru T buňky, takže odpovídá, žé segmenty CDR3, podle některých modelů struktury TCR, jsou v kontaktu s péptidovými epitopy prezentovanými vě štěrbinách molekul MHC (17). Segmenty CDR3 také vymezují nejindividuálnější charakteristiky T buněčného klonu. Tak segmenty CDR3 tvoří idiotop(y) klonu, jakož i jeho vlastní nástroj pro rozpoznávání cílového epiťopti. Segmenty CDR3 určují nejen jak klon vidí antigen, ale i jak může být viděn jako individuální buňka.

Společné motivy VDJ obecně

Segment C9 VDJ£ se zdá být význačný a společný pro jednotlivé NOD myši- Býl detekován v brzlíkú, slezině a ostrůvkových infiltrátečh různých NOD myší, jakož i v T buněčných klonech a liniích anti-p277. Naopak sekvence

C9 VJ« nebyla tak hojná a byla nedetekovatelná v T buňkách vzorků z brzlťků, slezin nebo ostrůvkových inf.i ltrátů. Pro důležitost C9 VDJfš také svědčil nález, že T buňky ariti-p277 u myší G57BL/6 obsahovaly klony s oblastmi VDJp podobnými při PCŘ a sekvenční analýze oblastem Č9, navzdory faktu, žě klony C57BL/6 používaly odlišné geny V{š (Vťs6_; 8, 16), néž jaké byly používány u NOD myší V@12. Přítomnost segmentů VDJp podobných C9 mezi T buňkami C57BL/6 anti-p277 je také pozoruhodná, protože myší C57BL/6 a NOD mají odlišné alely H-2, ačkoliv sdílejí Ď^b (1). Přítomnost jednoho motivu VDJ/3 přidruženého k různým genům. MHC má precedent v motivu společném T buňkám Levisova potkana specifickým pro myelinový bazický protein a některým T buňkám pacientů trpících sclerosis multjplex (18). Ačkoliv antigenní specifičnost lidských T buněk není známa, je na bázi společného motivu VDJp navrhováno, že epitqp by mohl být myelinový bazický proteinExprese motivu G9 VDJ u lidí

Naše detekce segmentu podobného C9 VDJ{3 u různých kmenů NOD, C57BL/6 a BALB/c myší svědčí o existenci společného motivu VĎJ. Vskutku byl zveřejněn nezávisle izolovaný kmen NOD, označený 4-1-E.2 (15), který používá V@l2 a Jp2-5 jako C9, a má oblast VĎJ (SRLGNQDTQY (sekvence identifikačního čísla 12)) podobnou oblasti C9, která se liší v oblasti“ VDJ tím, že má Ξ na místě R a další G^; (SSLGGNQDTQY (zbytky 48 až 58 sekvence identifikačního čísla 1), rozdíly jsou podtrženy. Ukázalo sé, že klon 4-1-E.2 adoptivně přenáší inzulitidu na nediábetické transgenní NOD myši 1-E⁺ (15).

Náležlo se, že klon 4-1-E-2 proliferuje v přítomnosti ostrůvků, ale antigen rozpoznávaný tímto klonem nebyl publikován. Je zajímavé, že Durinovic-Bello a její kolegové zveřejnili izolaci T buněčného klonu (K2.12) lidského původu od pacienta s diabetem s motivem TCR VDJ SRLGNQ (zbytky 2 až 7 sekvence Identifikačního čísla 3) (viz abstrakt, 21). Jelikož je motiv C9 VDJp detekovatelný v tak mnoha případech, zdá se, že dochází ke zmnožení klonů nesoucích tento motiv. Takové zmnožení může být výsledkem pozitivní selékce, nébot jak se jednou náhodně vyskytne rekombinace podobná C9 VDJC, klon nesoucí VDJ{í začne prol iterovat. Skutečně, markér C9 VDJ0 byl poprvé detekovatelný v brzlíku. později v periferii a nakónec v Ostrůvcích NOD myší během inzulitidy- Zjistilo se také, že samci NOD myší s akcelerovanou inzulitidou a diabetem mají také ve svých ostrůvcích markér C9 VDJ0 (není ukázáno). Časná pozitivní selekce motivu C9 VDJ je podpořena tím. že má relativně malý počet invertovaných nukleotidů na N-koncové části (19), pravděpodobně .pouze tři nukleotidy tta kódujících aminokyselinu L (viz tabulku 1).

Motiv C9 VDJ může být funkční a může regulovat IDDM

Bez ohledu ha to, jaký mechanismus může pozitivně Selektovat klony podobné C9 v brzlíku, je .jasné, že arit i-C9 ant 1 - i'd i otypové buňky mohou regulovat aktivitu diabétogenn-ích klonů podobných C9 v periferii: vakciriace

T buňkami C9 vede potlačení reaktivity anti-p277 a zabraňuje rozvoji diabetů u -NÓĎ.myší (3). Navíc imunizace

NOD myší peptidem C9 VDJ samotným navozuje rezistenci k rozvoji diabetů (viz níže). Přítomnost idiotopu C9 VDJp u jednotlivých NOD.myší může vysvětlit, jak je vakcfna.ce

T buňkami klonu C9 schopná úspěšně léčit téměř všechny NOD myši (35.

Podle předkládaného vynálezu je ukázáno, že anti-idiotypové T buňky specifické pro idiotyp C9 VDJ regulují IDDM u NOD myší- anti-idiotypoyá T buněčná reaktivita je přítomná u prediabétických NOD myší a spontánně se snižuje s rozvojem diabetogenního procesu, vakcihaee T buňkami proti C9 aktivuje anti-idiotypovou aktivitu a zabraňuje IDDM., anti-idiotypové T buněčné linie mohou adoptivně přenášet rezistenci k IDDM a vakciňace s idiotypovým peptidem VDJ zvyšuje anti-idiotypovou

T buněčnou reaktivitu a navozuje rezistenci k IDDM.

Anti-idiotypové T buňky mohou odpovídat ha idiotop VDJ prezentovaný na nepoškozených T buňkách C9 bez jakýchkoliv dalších buněk prezentujících antigen. Tato pozorování dokazují přirozený výskyt anti-idiotypóvých T buněk, jejich cílový epitop TCR a jejich roli v řízení autoimunního diabetů. Exprese nemoci se zdá záviset na rovnováze mezi diabetogenními T buňkami a regulačními anti-idiotýpovými T buňkami anti-Č9 VDJ-pftkáž spontánní anti-idiotypové sítě

U NOD myší v naší kolonii se vyvinula inzulitidá počínájící.v 1 měsíci věku. U všech samic progredóva1a do klinicky zjevného diabetů ve 4 měsících věku. Naopak pouze u 50¾ samců myší se vyvinul klinický diabetes, a to v 6 měsících věku. Proto jsme studovali u samic a samců NOD myší jejich T buněčné odpovědi na hsp60, vlastní cílový antigen, a na Č9, prototyp T buňky anti-hsp60. Obrázek 4 ukazuje T bůněčné proliferační odpovědi slezinných buněk zjišťované u samic a samCfi NOD myší různého stáří. Čtyři týdny staré samice (obr- 1. horní panel) hned v počátcích detékovate1né inzúlitidy neprokazovaly žádnou T buněčnou reaktivitu na hšp60, ale reagovaly na C9. S věkem se spontánní anti-idiotypová reaktivita na G9 snižovala, zatímco reaktivita podobná C9 ná hsp6Q narůstala. Po začátku klinického diabetů vymizely oba typy T buněčné reaktivity.

U samců myší (obr. 4, spodní panel) se anti-idiotypová reaktivita anti-C9 snižovala později něž u vnímavějších samic. Také reaktivita anti-hsp60 podobná C9 se zvyšovala později. V průběhu času se. anti-idiotypová reaktivita snižovala, ale nevymizela, a reaktivita anti-hsp60 zůstávala na mírné úrovni, jak polovina samců myší neonemocněla diabetem. Tyto výsledky neléčených NOD myší svědčí pro to, že rozvoj “áútoimúňn ího diabetů je negativně sdružen s anti-idiotypovými T buňkami anti-C9 a pozitivně sdružen s T buňkami anti-hsp60 (podobnými C9).

Důkaz, že sekvence VDJ je idiotyp C9

Obr. 5 dokazuje, že idiotypový peptid C9 rozpoznávaný

T buňkami antí-C9 je peptid VDJ beta řetězce TCR. Tři měsíce staré samice NOD myší byly nebo nebyly očkovány ozářenými T buňkami C9 a poté testována proliferace jejich T buněk po různých NOD stimulátorech T buněk a peptidů VDJ: C9, N4 nebo anti-ovalbumin (anti-OVA3. Klon N4, který nemůže zprostředkovat diabetes ani očkovat proti němu, byl spolu s C9 izolován z prediabetických NOĎ mýsí (3 3. N4 reaguje «

š mykobakteriálním hsp65, ale nereaguje statisticky významně s lidským nebo myším hspGO či peptidem p277 z hspóO. Nalezli jsme dříve, že se N4 a C9 liší ve 3 nukleovýčh kyselinách (2 aminokyseliny3 v řetězci β oblasti VDJ a že T linie anti-OVA exprimuje kompletně nepřibuzné řetězce ά a β TCR (tabulka 13. Prediabetické NOD myši vykazovaly T buněčnou proliferační reaktivitu na kloň C9 a na peptid C9 VDJ, bez ohledu na to, zda byly očkovány kOntřolňími T buňkami nebo byly neočkovány (obr. 5, horní panel 3. Po vakeinaci C9 bylo statisticky významné zvýšení odpovědi na peptidy C9 a C9 VDJ. Nebyla žádná odpověď na peptidy N4 nebo N4 VDJ, nebo na anti-OVA (obr. 5, horní panel 3Abychom potvrdili rovnocennost odpovědí ná intaktní buňky C9 a jejich peptid VDJ, očkovali jsme NOD myši segmentem C9 VDJ geneticky manipulovaným tak, aby byl exprimován jako součást flageliňu, a testovali jsme T buněčné odpovědi na T buňky a peptidy užívané, které jsme používali jak zmíněno výše. Dolní panel obr- 5 ukazuje, že konstrukt C9 VDJ zvyšoval specifickou odpověd· na intaktní buňky C9, jakož i na peptid C9 VDJ. Obr. 6 ukazuje, že T buněčná odpověď na peptid C9 VDJ může být zvýšena, když je peptid konjugován s ovalbuminovým nosičem (OVA3 a také u konstruktu C9 VDJ-flagelin. Proto mohou být použity různé molekuly nosiče, vyvolání anti-idiotypové odpovědi.

Za povšimnutí také Stojí, že myši BALB/c, stejně jako NOD myši, mohou odpovídat na konjugáty C9 VDJ (obr. 6). Tak odpověď na idiotyp C9 VDJ není restriktivní na NOD myši. Z tohó plyne, že peptid VĎJ řetězce (i TCR tvoří imunologickou identitu C9 rozpoznávanou anti-idíotypovými

T buňkami.

Léčba IDDM^: anti-idiotýpovými T buňkami a peptidem VDJ

Obr. 7 ukazuje, žě anti-idiotypoVé T buňky anti-C9 mohou chránit před spontánním diabetem. Nemoc účinně zmírňoval jak adoptivní přenos T buněk ánti-C9 (obr. 7, horní panel') i tak aktivní vakcinace konstruktem C9 VDJ (obr.

7, dolní panel 1.

T buňka prezentuje idlotop VDJ

T buňka C9 prezentuje svůj vlastní peptid TCR T buňkám anti-C9 přímo. V pokuse ukázaném na obr. 8 byly T buňky ahti-C9 odděleny od APC (Antigen Presentiňg Cell - buňka prezentující antigen) a purifikovaných T buněk C9, také 'oddeTěňýčh od^--_APC7 Jak T^Tiunky C9^-, tak aňt i - id i oťypové T buněčné populace anti-C9 neprojevovaly funkční standardní aktivitu APC^: tyto buňky nemohly prezentovat OVA T buňkám anti-OVA- Avšak bylo Zjištěno, že buňky C9 stimulovaly anti-idiotypové T buňky anti-C9. Vskutku přidání APC do

T buněčných tkáňových kultur nezvyšovalo, ale spíše snižovalo interakci T buněk. Tak se zdá, že T buňky anti-C9 rozpoznávají řetězec (3 epitopu VDJ C9 prezentovaný samotným klonem C9.

Idiotop VDJ je sdružený s MHC

Abychom otestovali prvek hlavního histokompatibilního systému (MHO používaný klonem C9 při prezentaci jeho peptidu TCR anti-idiotýpovým T buňkám, používali jsme monoklonální protilátky k blokací odpovědi anti~C9- Tabulka ukazuje výsledky zvyšování odpovědi anti-C9 intaktními buňkami C9. Převážná část odpovědi ria intaktní C9 nebo na

VDJ C9 ha APC byla blokována protilátkami specifickými pro molekulu K^d MHC. Protilátky anťi IA také blokovaly odpověď, ale v menším rozsahu. Nebyla žádná proti látková inhibice molekuly D^b, ačkoliv u NOD jsou exprimovány obě molekuly Kd i Db- Tak se anti-idiotypová.T buněčná reaktivita anti-C9 zdála být restriktivní jak iia třídu MHC I pro prvek K, tak na třídu MHC II. Nález restrikce na obě třídy I i II je slučitelný s pozorováním, že po vakcinaci T buňkami u EAE se naleznou jak CD4, tak CD8 anti-idiotypové T buňky ¢6). Ϊ buňky CD4 obvykle rozpoznávají své peptidové epitopy ve štěrbinách molekul MHC třídy II a T buňky CD8 obvykle

-rozpoznáva-j-í--své - pept idové-ep i topy^_ve^—štěrbi nách^-mo leku 1^—MHC třídy I. Peptid VDJ C9, či jeho části, se zdá být sdružený s molekulami IÁ^NOD nebo K^d, ale ne s molekulou D^b.

Regulace idiotypové sítě

Výsledky žde předkládané Objasňují fenomen T buněčné regulace aUtoimunity u spontánního diabetů průkazem, že anti-idiotypové T buňky jsou přítomné bež umělé intervence, že projev nemoci je spojen se změnami v rovnováze mezi střídavě, s

Spontánní idiotypovými T buňkami a anti-ídiotypovými T buňkami, že idiotypový peptid je segment VDJ řetězce TCR a že idiotypová

T buňka prezentuje svůj vlastní idiotop regulačním antl-idiotypovým T buňkám (20). Tak existuje sít_; která pravděpodobně spojuje epitop hsp60 p277 se sdíleným idiotypovým peptidem TCŘ klonu C9 a, anti-idiotypovou regulační populací.

anti-idiotypová sít je pravděpodobně výslovně funkční v modelu diabetů typu I NOD myší.

Všechny odkazy zde citované, včetně článků v časopisech nebo souhrnů, publikovaných nebo odpovídajících americkým či zahraničním patentovým žádostem, vydaných amerických či zahraničních patentů, nebo jakéhokoliv dalšího odkazu, jsou plně zahrnuté do odkazů, včetně všech dat, tabulek, obrázků a textu předkládaného v citovaných odkazech. Navíc úplný obsah odkazů citovaných v odkazech citovaných zde je také plně zahrnut v odkazech.

Odkazy na jednotlivé kroky známých metod, kroky konvenčních metod, známé metody nebo konvenční metody, žádným-způsob em^—nepři'pouští7 že^-jakýkoΓΪv”žrěCiě H popis nebo ztělesnění předkládaného vynálezu je vyjeven, ukázán nebo navržen v příslušném Obořil.

Předcházející popis specifických ztělesnění objasnil tak plně celkovou povahu vynálezu, že jiní mohou při aplikaci znalostí oboru (včetně obsahu odkazů zde citovaných) táto specifická ztělesnění snadno modifikovat a/nebo adaptovat pro různé aplikace, a to bez přílišného experimentování a bez odklonu od celkového konceptu předkládaného vynálezu. Proto je zamýšleno, aby takovéto adaptace a modifikace bylý ve významu a rozsahu analogií vyjevených ztělesnění, založených na nauce a poučeních zde předložených. Je nutné porozumět, že frazeologie nebo terminologie jsou zde použité za účelem popisu a ne omezení, takže terminologii nebo frazeologii uváděné specifikace je nutné odborníkem interpretovat vě světle nauky a poučení zde prezentovaných, v kombinaci se znalostí odborníkaPrůmyslová využitelnost

Předkládaný vynález se týká peptidů. které jsou schopny měnit aktivitu anti-idiotypových Ť buněk tak, že rozpoznávají Ť buňky anti~p277. T buňky anti-p277 hrají důležitou roli při vzniku autoimunního onemocnění, diabetů mellitu I- typu. Proto se peptidy předkládaného vynálezu dají použít při diagnostice, prevenci a léčbě diabetů.

I

Li •ή •P e (0

Q) rH 'O w »H *SH iu

0) u- 0

ES Λ φ > C X )D «. Λ

7X- in tn
1	r\
	tn
Γ-	1
xř	τΗ
	«η	'G1	tn
	Λ H N	<*) H	xj* ri
N
rd	OJ

tn '	in	tn	m
•	*	«	4
OJ	OJ	OJ	OJ

υ	o	o	o
< rt	rt	• w	' rt
Q tn	O tn	« tn	O tn
rt	rt	m	rt
nj	o	rt	rt
o υ	O u	cx o	O O
u	υ	o	o
d	rt	rt	rt
íž m	ři rt	k; rt	% rt

Sekvence oblasti VDJ

X) ^u tn' _ tn O tn

	X)	u	rt	tn
	.tn	- d	tn	XI
	O tn	tn	O tn	pí υ
	tn	tn	tn	rt
o	tn	. tn	X)	Ol
(rt	O tn	St XJ	pí υ	P O
	rt	rt	rt	υ
z	X)	Xi	. tn	X)
	>q xj	Pí x)	pj rt	Pí υ
	X»	O		XJ
	tn	tn		tn
	to rt	to rt		co rt
	o	rt	υ	o
	tn	tn	tn	tn
>	tn rt	to rt	co rt	to rt
	o	rt	υ	υ
	υ	o	o	υ
	rf! tn	< tn	< tn	«4! tn
	OJ	rd	OJ
>	H	H	i-d	V»
			OJ
			•
			M
c			a	H
0			ri	♦
rrt	<n	xř	1	OJ
w	U		xf	H)

ΧΛ £

O	Q	Q
O	O	O
55	&

w

Pí m

oU) υ

□ •B ©

ω >

¢3 •U +J

ΙΛ ©

c

N (1)

TJ Ό Ό %) U TJ

Π fl « < , + q « β β

TJ TJ

I I t + .1 + « + β β t-ribuce VDJ a VJ klonu C9 u NOĎ myší

Φ u

•rt

B ©

ω

V) '(0 >

>c '(0

Λ

H ©

Ί3 •G

O tn

Jí

Ή i-H

N

U

J3 >

<3.

+J tn o

Jí

N . P A o

Φ □

Jí M Φ ® > XD B \y tj u ' + 1 + 1 + I + β β tj tj tJ tj *d tj β β I + · i β β β,β

11 + 1 I I + ι + ι + ι—+—I—+1—+

ÍJ οχ ?J ΪΙ «η. řJ «γ d oo.

tn o

ts tn m* φ

υ •rt _Λ

Xi dp £3

C

Η <η μ . ca ο 0 Γ' Ο Ο 0 r~ CN

C0

Λ

Jí □

Λ.

<α

Η

C

Α .43

X •Η β

*>

„ ιη Φ β . ,3·

W

Γι σ* υ

ι ►Η' +3'

CΦ· •Η· τι >φ >

Ά ΰ

>υ φ . β

Φ Λ3 Μ4,>φ· ,Η >. ι-ι 0 r\ 0· 0, Η β-τω Cl, 0 co ιη ιη ο «4 <8 <η • * · ·· 4 Γ · ώ •Μ' 0 νο t- 0 η w

Η

U. X £ >4

Ό Ή 0 >β ,α 4J τι ο >Φ ' Xi 'Φ ο * . 5

Ό· Φ -β. C _____i_ +3

-Φ Ή X □ 43 Μ 'φ •η ·—ι 3 ·Η Λ 43,£3 00 β rl β 0J BLO.·'«ΗΚΟ

Φ 4J 4J 4J 'Φ ’Ν β β tí >Ν rt flj TO

			σ'
			υ
β 0	Ο Í4	• 0*1 : υ	0
43 'Φ	3 uJ*l	Γί ·	Cl· >
Stimul	S> π Μ	φ: * )β 'Φ Ν 0	’ ’ τ ♦Α 43 0, φ

C rt

Φ

U

Φ

Ν

Η

C β

<0

Ο

Η

X ιη

CKBK EKcx:

□

X

REFERENCBS

- »

1. Klkutáni/ H. et al., The murine autoimmune diabetes model: NOD and related strains, Advánces in ImmunOl, 51:285-322 (1992) .

2. Elias, D., et al., Induction and therapy of autoimmune diabetes in the non-obese-diabetic (NOD/Lt) mouše by a 65-kDa heatshock protein, Proč Nati Acad Sci USA 87:1576-1580 (1990).

3. Eliae, D., et al. Vaccination against autoimmune mouše diabetes with a T-cell epiťope of human 65kDa heatshock protein, Próc. Nati. Acad. Sci. USA 88:30883091 (1991).

4. Eliáš, D. et al., Peptide therapy for diabetes in ŇOD mice, Lancet 343:704 (1994).

5. Elias, D., et al.·, Induction of diabetes in standard mice bý immunization to the ň277 peptide of hspGO, Accompanying-páper (1994).

6. Lider, O., et al ., Anti-idiotypic network induced by T cell vaccination against experimental autoimmune _____ericěphalomyeliťisA.-Science_239:181—<1988)_—.________.____

7. Zhaňg, J., ét al., MHC-restričted depletioň of human myelin basic protein-reactivě T cells by T cell vaccination. Science 261:1451 (1993). .

8. Bauminger, S., et .al., The use óf carbodiimiděs in the preparát ion of immunizing conjugatee, Methods Enzvmol. 70:151 (1980).

9. Gotoh, M., et al., Reproducible high yield of rat íslets by stationary in vitro digestión follOwiňg

4Tpančreatic ductal oř portál venous collagénase digestion, Transplantatlon 43:725-30 (1987), • > j

10. Scahfer, R., et al., Optimizing oligonucleotide probes for DNA fingerprinting,

BlectrophorqsiB 9:369 (1988).

11. Gasanova, J.-L., et ál., Optimal conditione for úirectly seguencing double-stranded PCR products with Secruenase. Nucl, Acids Res. 18:4028 (1990) .

12. Acha-Orbea, H., et al., Limited heterogeneity of T cell receptors from lymphocytes mediating autoimmune encephaiomyelitis allows specific immune intervention, Cell 54:263-273 (1988)13. Sherman, D.H., ét al., Molecular analysis óf antigen recognition by insulin-specific T-cell hybridomas from B6 wild-type and bml2 mutant mice, Mol and Cell Biol 7:1865 (1987).

14. Koop, B.F., et al., Organization, structure and function of 95 kb of DNA spanning the murine T-cell receptor Ca/CS region. Genetice 13:1209 (1992).

---—----15-.- Nakano—-Ντγ-ét-actT7-T-cel-l^— receptor^- Vgeriě usage of islet β cell-reactive T cells is not restricted in non-obese diabetic mice*, J Bxp Med 173:1091 (1991).

16. Epplen, J. T., et al., Maunmalian T-lymphocyte antigen receptor genes: genětic and nongenetic poteňtial to generate variability , Hum. Genet. 75:300r310 (1987) .

17. Chothia, C., et al., The outline structure of the T-cell ab receptor, The EMBO J 7:3745-3755 (1988).

18. Oksenberg, R. J., et al., Šelection for T-cell receptor Vp-Dp-jp gene rearrangements with specificity for a myelin basic protein peptide in brain leBions of multiple sclerosis, Nátuře 362:68-70 (1993).

» 1

19. Bngler, P<, et al., N region diversity of a transgenic substráte in fetal and adult lymphoid cells, J Exp Med 176:1399 (1992).

20. Cohen, I.R, The cognitive paradigm and the immuiíólOgical homunculUs, Ipgnunol Tóday 13 :490 (1992).

21. Durinovic-Bello, I-, ět al., HLA-DQrestricted> Islet-specific T Cell Clones of á Type I diabetic Patient: T Celí Receptor Sequence Similarities to Insulitisinducing T Cells of Nonobese Diabetic (NOD) Mice, I3th International Irrimunológy and Diabetes Workshop (1994).

22. Durinoyic-Bóllo, I., et al., HLA-DQrestricted, Islet-specific T Cell Clones of a Type I diabetic Patient: T Cell Receptor Sequence Similarities to InsulitiSinducing T Cells of Nonobese Diabetic (NOD) Mice, Diabetes, 43:1318-1325 (Nov. 1994).

23. Castano et al., Type-I Diabetes: A Chronic Autoirraiiune Diseaae of Human, Mouše, and Rat, Annu. Rev. Immunol.. 8:647-679 (1990).

24. Bowman et al., Prevention of Diabetes in the NOD Mouše: Implications for Therapeutic Interventión in Human Disease, Immunol, Today. 15(3):115-120 (1994).

25. Williams, G., IDDM: Long Honeymoon, Sweet Briding, Lancet. 343:684-685 (1994).

26. Bendelac et al., Syngeneic Transfer óf Antoimmune Diabetes from Diabetic NÓD Mice to Healthy Neonates: Requirement for both L3T4+ and Ly+-2+ T Cells, J,, EXP. Méd.. 166:823-832 (1987).

27- Elias, D., The NOD Mouše: A Model for Autoimmune Insulin-Dependent Diabetes, Autoimmune Diséase Modéla, A Guidebook. pp. 147-161 (1994).

28. Raufmán et al., Spontaneous Losa of T-cell Tolerance to Glutamic Aeid Decarboxylase in Murine InsulinDependent Diabetes, Nátuře. 366:69-72 (1993).

29. Tisch et al., Immun e Response to Glutamic Acid Decarboxylase Correlates with Insulitis in Non-Obese Diabetic Mice, Nátuře. 366:72-75 (1993).

30. Howell et al., Vaccinatión against Experimental Allergic Encephalomyelitis with T Cell Receptor Peptides, Science. 246:668-670 (1989) lerratum at Science. 247:1167 (1990)].

31. Vandenbárk et al., Immunization with a Synthetic T-Cell Receptor V-Region Peptide Protecte against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, Nátuře. 341:541544 (1989).

32. Behlke et al.·, Alternativě Splicing of Murine T-cell Řeeéptor fi- Chain Transcripts, Nátuře. 322:379-382 (1984).

33. Mallssen et ál., Mouše T Cell Antigen Receptor: S truc ture and Organization of Constant and Joining Gene SégmentB Encoding the β Polypeptide, Cell. 37:11011110 (1984).

2>

SEZNAM SEKVENCÍ (i) GENERAL INFORMATION:

li) APPLICANT:

(A) NAMH: YEDA RESEARCH AND DBVBLOPMENT CO. LTD. at the Heirmmm institute of Science (fl) STRHBT: P.O. Box 95 (C) CITY.: Rehovot (E) COUNTRY: ISRAEL (P) POSTÁL CODE (ZIP): 76100 (G) TBLEPHONB: 972-8-470617 (H) TELEFAX: 972-8-470739 (A) NAMB: COHBN, Imn R.

(B) STREET: li Hankin Street (C) CITY: Rehóvot (E) COUNTRY: ISRAEL <P) POSTÁL CODE (ŽIP): 76354 (A) NAHÉ: BLIAS, Dana (B) STREET: 57 Derech Yavne (C) CITY: Rehovot (K) COUNTRY: ISRAEL (F) POSTÁL CODE (ZIP): 76344 (ii) TITLB OF INVEŇTION: PEPTIDES AND PHARMACEUTICAL COMPOálTIONS COMPRISING TKKM (iii) NOMBBR OF SBQUENCES: 16 (iv) COMPUTER RBADABLE PORM:

(Á) MKDItJM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC ccmpatible (C) OPBRATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentlň Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 1<i3 CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 68 aminokyselin •<B) TYP: aminokyselina

-----------C:£) —T-YP- VLÁKNA :_iednoduc hé__________ (D3 TOPOLOGIE: lineární <ii3 TYP MOLEKULY- peptid

Cxi 3 POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA .1=

Ser I	Tyr Phe Arg Ser 5	Ly o	Ser	Leu Met	Glu 10	Asp Gly Gly	Ala Phe Lys 15
Asp	Arg Phe Lys Ala	Glu	Asn	Leu Asn	Ser	Ser Phe Šer	Thř Leu Lys
	20			25			30
Leu	Gin Pro Thr Glu	Pro	Lys	Asp Ser	Ala	Val Tyr Leu	Cyo Ala Ser
	35			40		45
Ser	Leu Gly Gly Asn	Gin	Asp	Thr Gin	Tyr	Phe Gly Pro	Gly Thr Arg
	50		55			60

Leu Leu Val Leu 65

S1 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA· 2^ ( i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 aminokyselin » (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA; jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (i i) TYP MOLEKULY-- peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 2=

Ala Ser Ser Leu Trp Thr Asn Gin Asp Thr Glii Tyr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 3= (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP^: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (i i) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 3=

Ala Ser Ařg Leu Gly Asn Gin Asp 1 5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 4(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP - am i nokyse1 i na (O TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 4---— Ala-Ser- -Ser-Leu-Gly-Leu-Gly-Ala-Asň-Gln-Ašp-------—--‘—

1· 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 5 ^: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 5=

Val Leu Gly Gly Gly Čys Ala Leu Leu Ařg Cys Ile Pro Ala Leu Asp 1 5 10 15

Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 6= (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

CA) DÉLKA: 27 párů baží

CB) TYP: nukleová kyselina CČ) TYP VLÁKNA: jednoduché CD) TOPOLOGIE-- lineární (i i) TYP MOLEKULY’- cDNA

Cxi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 6: GCCAGCAGTT TAGGGGGTAA CCAAGAC 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 7Ci) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

CA) DÉLKA: 20 aminokyselin

CB) TYP: aminokyselina

CC) TYP VLÁKNA: jednoduché

CD) TOPOLOGIE: lineární

Cil·) TYP MOLEKULY: peptid

Cxi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 7'Thr Gly Gly Čyě Gly Thr Thr Gly Gly Thr Cyfl Thr Cye Thr Thr Thr 1 5 10 15

Gly Ala Ála Gly 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 8Cí) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží CB) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché CD) TOPOLOGIE: lineární _____ C.i. i ) TYP- MOLEKUL cDNA— ----—---Cxi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 8: CGGCACATTG ATTTGGGAGT C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 9 =

Ci) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

CA) DÉLKA: 20 párů baží

CB) TYP: nukleová kyselina

CC) TYP VLÁKNA: jednoduché

CD) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 9: ACAČAGCAGG TTCTGGGTTC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 10(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE(A) DÉLKA· 18 párů baží (B) TYP^: nukleová kyselina (G) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 10: ATGAGAGGGC CTAATTAC 18 . (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 11= (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

- (A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (O TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 11:

Met Aig Gly Pro Asn Trp 1 5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCÍ IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (i i) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 12:

Šer Arg Leu Gly Aon Gin Anp Thr Gin Tyr _

-- -------χ--—---——-₅---- — io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

’ (A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ií) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA GCAfiGAAGCT TATGGGACAA CCCAGAC

13:

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE = (A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina sq(C) TYP VLÁKNA-- jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) ŤYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 14: GCCAGCAGAC T0GGAAACCA AGAC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA- 33 párfl baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 15: GCCAGCAGTC TGCGACTGGG GGCTAACCAA GAC 33

(.2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(Á) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA-- jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (i i) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE'- SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 16:

Ala Ser Ser Leu Gly Ala Ašn Gin Asp

Claims (12)

1. Peptid, který má alespoň 7 a výhodné Ύ až 24 aminokyselinových zbytků, podstatně odpovídající oblasti

VDJ vzorce

V-D-J, ve kterém V obsahuje má výhodně 2 až 5 dípeptidovou sekvenci sekvenci N-(jD, nebo dipeptidovou sekvenci A-S, D”, který aminokyselinových zbytků, obsahuje

L-G, a J obsahuje tripeptidovou sůl, funkční derivát nebo konjugát peptidu.

2. Peptid podle nároku 1, ve kterém (a) “V“ obsahuje tripeptidovou sekvenci A-S-S, (b) D obsahuje tripeptidovou sekvenci L-G-G, tripeptidovou sekvenci R-L-G nebo pentapeptidovou sekvenci L-G-L-G-Ά (zbytky 4 až 8 sekvence identifikačního Čísla 4), (c) dipeptidová sekvence A-S ž V“ je část tripeptidu přilehlá k D, nebo (d) tripeptidová sekvence N-Q-D z ”J je přilehlá k D.

3. Peptid podle nároku 1 nebo 2, kde V zahrnuje segment

Vp, tento segment obsahuje alespoň část C-koncové části proteinu kódovaného genem \J{& a (a) C~koncová tripeptidová sekvence segmentu V(3 obsahuje dipeptidovou sekvenci A-S, (b.) segment obsahuje od 1 do 10 aminokyselinových zbytků

C-koncové části proteinu kódovaného genem V<3, nebo (c) gen Vj3 je vybrán ze skupiny skládající se z Vp6, V<38, V/312 a V(316.

bb

4. Peptid podle nároku 1 nebo 2, kde J zahrnuje segment

JfS, tento segment obsahuje alespoň část N-koncové části z části kódované genem Jíl a (a) N-kOncová tripeptidová sekvence segmentu Jíl je N-Q-D, (b) segment obsahuje od 1 do

10 aminokyselinových Zbytků N-koncové části proteinu kódovaného genem J0,. nebo gen Jíl je

5. Peptid, který má 24 aminokyselinových zbytků zahrnujících sekvenci (a) A-S-S-L-G-G-N-Q-D (zbytky 47 až 55 sekvence identifikačního čísla 1), (b) A-S-Ft-L-G-N-Q-D (sekvence identifikačního čísla 3), (c) A-SS-L-G-L-G-A-N-Q-D (sekvence identifikačního čísla 4), nebo (d)

A-S-S-L-G-A-N-Q-I) (sekvence identifikačního čísla 16).

6. Konstrukt DNA obsahující polynukleotidovou sekvenci kódující peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 nebo jeho doplňku.

7_._____Farmaceutický—přípravek——v—y—z—n—a—č—u—j—f—c^- í~—s^—e tím, že obsahuje peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 a farmaceuticky při jatelný.nosič.

8. Činidlo vyznačující se tím, že detekuje přítomnost aňti-idiotypových T buněk zapojených do rozpoznávání T buněk anti-p277 obsahujících peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.

9. Činidlo podle nároku 8, vyznačující se t í m, že je konjugováno sfe značkou umožňující detekci.

10. Konjugát vyznačující se .tím, že obsahuje peptid podlé kteréhokoliv z nároků 1 áž 5 a další molekulu, která je polypeptid nebo malá organická mOlekula.

11. 01igonukleotid Obsahující polyriukleotidovou sekveriéi komplementární k alespoň části sekvence DNA kódující peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.

12. Způsob diagnózy nebo určování stádia IDDM nebo monitorování průběhu léčby IDDM vyznačující se t í m, že obsahuje testování T buněk ze séra testovaného subjektu na proliferaci nebo produkci cytokinfl při in vitro kontaktu s.peptidem podle kteréhokoliv nároku 1 až 5.