CZ104397A3 - Způsob pěstování střevních bakterií se zvýšenými antigenními vlastnostmi a vakcina s obsahem těchto bakterií - Google Patents

Description

Způsob⁷pěstování střevních bakterií se zvýšenými antigenními vlastnostmi a vakcina s obsahem těchto bakterií

Oblast techniky t

ř

Vynález se týká způsobu pěstování střevních bakterií Á se zvýšenými antigenními vlastnostmi a vakciny, která tyto

-----------------------------------bakterie obsahuje .-------- ------- — -------—------------;------------------------------Dosavadní stav techniky

Je známo, že u bakterií, pěstovaných in vitro při použití běžných živných prostředí a podmínek dochází k expresi vlastností, které jsou odlišné od vlastností těchto bakterií v jejich přirozeném prostředí. Z tohoto důvodu nemusí být vhodné použití pathogenních bakterií, pěstovaných in vitro, pro výrobu vakciny. Avšak v případě, že by bylo mož- ^J né definovat podmínky, při nichž dochází ke zvýšení exprese vlastností, které se týkají virulence nebo tvorby antigenů včetně povrchových antigenů, pak by bylo možno rychle identifikovat nové důležité produkty, například nové antigeny pro vakciny, nové cílové struktury pro antibiotika a nové vlastnosti bakterií pro diagnostické použití.

. ·

Ά Bylo identifikováno několik faktorů, které mohou ovliv^—' nit expresi determinant virulence u bakterií (Mekalanos J.J. ,

J. Bacteriol., 174, 1-7, 1992). Byl například.popsán vztah mezi množstvím železa a virulencí bakterií, zvláště Shigella v publikaci Payne, Mol. Microbiol., 3, 1301 - 1306, 1989, Neisseria v publikaci Payne a Finkelstein, J. Clin. Microbiol., 6, 293 - 297, 1977 a Pasteurella v publikaci Gilmour a další, Vaccine, 9, 137 - 140, 1991.

• · r · ··

- 2 Další složky prostředí, které mohou ovlivnit expresi determinant virulence u bakterií v rostlinách i živočišném organismu jsou fenolové sloučeniny, monosacharidy, aminokyseliny, dále teplota, osmotický tlak, a různé ionty podle Mekalanos, J. Bacteriol., 174, 1-7, 1992.

Pathogenní bakterie, které se dostávají do živočišného hostitele střevem, to znamená perorální cestou, se setkávají s řadou složek v prostředí hostitele a s řadou podmínek, které mohou ovlivnit jejich fyziologii a tím i expresi faktorů virulence. Jde například o žluč, žlučové kyseliny a jejich soli, pH v žaludku, plyny (ve střevě je vysoký obsah C0₂ a nízký obsah 0₂), osmotický tlak a řada dalších dosud nedefinovaných faktorů. Invazivní střevní pathogenní bakterie musí syntetizovat bílkoviny k tomu, aby mohly žít v novém prostředí podle Headley a Payne, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 87, 4179 - 4183, 1990. Bakterie však mohou optimálně produkovat invazivní faktory pouze jako reakci na signály z prostředí, tyto signály se však in vitro obvykle nevyskytují. Tato hypotéza je podporována současným poznáním, že antiserum, vytvořené proti běžným způsobem pěstovanému C. jejuni mělo pouze malý účinek při blokování růstu tohoto organismu in vitro podle Konkel a další, J. Infect. Dis., 168, 948 až 954, 1993. Při imunizaci králíků extraktem z Camylobacter, který byl pěstován v přítomnosti vrstvy epitheliálních buněk, v níž dochází ke zvýšení invazivnosti organismu však došlo k produkci antisera, které výrazně bránilo internalizaci těchto bakterií.

V poslední době byly vyvíjeny snahy identifikovat základní faktory pro virulenci bakterií ve střevech. Například u Campylobacter, kmen 81-176 dochází při pěstování v tenkém střevě králíka k expresi bílkovin, k níž nedochází za pěstování in vitro v běžných laboratorních podmínkách podle Panigrahi a další, Infect. Immun., 60, 4938 - 4944, <

- 3 ·· ·· ·· ·· ·· ·<·

1992. Při pěstování Campylobacter v přítomnosti vrstvy buněk INT 407 bylo možno pozorovat syntézu bílkovin, které nebyly pozorovány při pěstování týchž bakterií v nepřítomnosti epitheliálních buněk podle Konkel a další, J. Infect. Dis., 168, 948 - 954, 1993. Mimoto byly tyto změny časově spojeny se zvýšenou invazivností C. jejuni. Při pěstování avirulentního kmene C. jejuni po nitrožilní aplikaci a průchodem přes sestavu chorioallantoických obalů kuřecího embrya, bylo možno pozorovat další změny-buněčné morfologie, ztrátu bičíku, expresi nové bílkoviny na povrchu membrány a změnu uhlohydrátů na povrchu buněk podle Field a další,

J. Med. Microbiol., 38, 293 - 300, 1993.

Je známo, že přítomnost některých složek střevního prostředí, například žlučových kyselin nebo jejich solí může způsobit inhibici růstu některých bakterií a také ovlivnit jejich virulenci.

Pope a Payne, 93rd A. Soc. Microbiol., B-147, 1993 popisují pěstování Shigella flexneri v tekutém živném prostředí s obsahem chenodeoxycholátu sodného, při němž došlo k 3 až 5-násobnému zvýšení infektivity pro vrstvy buněk HeLa. Bylo však popsáno, že tento účinek nebylo možno pozorovat v případě použití S. flexneri v přítomnosti jiných solí žlučových kyselin a smáčedel včetně cholátů, glykocholátů, taurodeoxycholátu, látek ze skupiny CHAPS, digitoninu a Tritonu X100 a sodných solí těchto látek. Živné prostředí s obsahem chenodeoxycholátu však také nemělo žádný účinek na invazivnost E. coli nebo jiných avirulentních kmenů Shigella.

Syntézu nových bílkovin je u S. flexneri možno vyvolat také změnami pH, teploty a iontového složení živného prostředí podle Mekalanos, J. Bacteriol., 174, 1-7, 1992.

• ·

- 4 V mezinárodní patentové přihlášce č. WO 93/22423, zveřejněné 11. listopadu 1993 se popisuje způsob pěstování bakterií v přítomnosti lipidů, například fosfatidylserinu a způsob izolace bílkovin, k jejichž expresi dochází při pěstování bakterií v přítomnosti fosfotidylserinu. Nedochází však ke zvýšení virulence nebo antigenních vlastností.

V současné době dosud nejsou k dispozici vakciny pro— ti řadě střevních p athogenů, jako j sou Campy1obacter a--------Shigella, avšak z epidemiologického hlediska by takové vakciny byly velmi žádoucí. Shigellosy se endemicky vyskytují na celém světě a v rozvojových zemích způsobují přibližně 10 % z pěti milionů ročných úmrtí kojenců na průjmy. Campylobacter byl teprve před krátkým časem identifikován jako pathogenní bakterie, nyní je však již zřejmé, že jde o jednu z nejčastějších příčin vzniku průjmů v rozvojových i jiných zemích. Ročně dochází k onemocnění 400 až 500 milionů lidí a pouze ve Spojených státech k onemocnění více než 2 milionů lidí.

Shigellosa je důsledek bakteriální invaze do sliznice tlustého střeva. Tato invaze je spojována s přítomností plasmidu, který je možno prokázat ve všech invazivních izolátech podle Sansonetti a další, Infect. Immun., 35, 852 až 860, 1982. Fragment tohoto plasmidu obsahuje geny pro invazivní antigen plasmidu, Ipa, a to Ipa A, -B, -C a -D. Bílkoviny Ipa B, —C a -D jsou nezbytné pro invazi mikroorganismu podle Baudry a další, J. Gen. Microbiol. , 133, 3403 až 3413, 1987.

Bílkoviny Ipa jsou logickými kandidáty na výrobu vakciny, přestože jejich ochranný účinek nebyl dosud zcela potvrzen. Ipa B a Ipa C jsou imunodominantní bílkoviny podle

Hale a další, Infect. Immun., 50, 620 - 629, 1985. Mimoto je bílkovina Ipa B o velikosti, odpovídající molekulové hmotnosti 62 000 vysoce konzervována v celé čeledí Shigella.

Jde o invasin, který napomáhá vstupu mikroorganismu do bu něk a rozrušení fagocytární vakuoly, spojené s membránou podle High a další, EMBO J., 11, 1991 '- 1999, 1992. Delší trvání onemocnění, které je možno pozorovat u dětí s ne____________________ dostatečnou výživou, které nemají protilátky ze _slizni.ce proti bílkovinám Ipa podporují názor, že slizniční protilátky proti Ipa mohou omezit rozšíření i závažnost infekce.

Přesto že byla u různých živočichů i u člověka zkoušena řada látek, u nichž se předpokládalo, že by bylo možno je využít pro výrobu vakcíny, nepodařilo se ještě žádnou takovou látku nalézt. Navzdory potenciálnímu významu bílkovin Ipa pro virulenci byly zkoušeny především antigeny typu lipopolysacharidů, nesoucí determinanty, specifické pro jednotlivé šerotypy. Byly rovněž provedeny pokusy vyvinout parenterálně podávanou vakcinu s obsahem konjugátu polysacharidu a bílkoviny, nebylo však dosaženo dostatečné ochrany podle Robbins a další, Rev. Inf. Dis., 13, 362 - 365, 1991. Podobným způsobem podaná vakcína s obsahem ribosomů vyvolala imunitu ve sliznici, avšak její ochranný účinek dosud nebyl prokázán podle Levenson a další, Arch. Allergy Appl. Immunol., 87, 25-31, 1988.

. . Pathogenese infekcí, způsobených Campylobacter není ještě tak dobře objasněna, jako je tomu v případě infekcí Shigella. Na základě studií in vitro na invazi podle Konkel a další, J. Infect. Dis., 168, 948 - 954, 1993 a histopathologických zkoušek podle Russell a další, J. Infect. Dis.,

168, 210 - 215, 1993 je možno se domnívat, že také v tomto případě je místem napadení tračník. Tento závěr odpovídá pozorování, že průjem, vyvolaný Campylobacter může být • · · 1 · velmi závažný a může při něm docházet k přítomnosti krve ve stolici. Tyto projevy mohou být spojeny s přítomností , -í bílkoviny flagellin s molekulovou hmotností 62 000. V poslední době se uvádí, že přítomnost bičíku je nezbytná pro průnik Campylobacter do souvislé vrstvy epitheliálních buněk podle Grant a další, Inféct. Immun., 61, 1764 až 1771, 1993.

__________ _____.___________________Pro Campylobacter dosud nebyly prokázány specifické ochranně antigeny. V tomto směru jsou slibné bílkoviny s nízkou molekulovou hmotností 28 000 až 31 000, bílkoviny PEB a immunodominantní bílkovina bičíku podle Pavlovskis a další, Infect. Immun., 59, 2259 - 2264, 1992, Blaser a Gotschilch, J. Bio. Chem., 265, 14529 - 14535, 1990. Důležitost bílkoviny bičíků vyplývá z její nezbytnosti pro kolonizaci střeva a ze zkřížené ochrany proti infekci v oblasti podskupin Lior podle Pavlovskis a další, Infert. Immun., 59, 2259 - 2264, 1992. Je však možné, že bude nezbytné, aby vakcina na bázi bílkoviny z bičíku Campylobacter obsahovala bílkovinný antigen z 8 až 10 klinicky nejčastějších seroskupin Lior.

Vynález si tedy klade za úkol 1) stanovit podmínky in vitro pro takové pěstování bakterií, při němž dojde k optimální indukci nebo zvýšení invazivity a/nebo ke vzniku ur_? čitých vlastností buněk, 2) pozměnit invazivitu nebo buW něčné vlastnosti včetně povrchových vlastností se změnami v profilu antigenů, 3) zvýšit virulenci těchto organismů na malých zvířatech jako modelech a 4) získat antisera proti organismům se zvýšenou invazivitou nebo pozměněnými vlastnostmi tak, aby tato antisera byla účinnější při neutralizaci živých organismů in vitro i in vivo než antisera, připravená proti běžně pěstovaným bakteriím.

• ί · · · · 9 · 9 · · · * ·

Žádná ze svrchu uvedených citací nepřispívá k řešení uvedených úkolů, zejména neřeší problémy, spojené s^přípravou vakciny, obsahující bakterie se zvýšenou antigenitou.

Podstata vynálezu

Vynález navrhuje pěstování pathogenních střevních bakterií za definovaných podmínek, zejména v přítomnosti určitých složek tak, aby došlo ke zvýšení faktorů^YFirúTehde^á jiných antigenů, s výhodou imunogenních.

Podle vynálezu se uvedené bakterie pěstují za podmínek, které napodobují podmínky, jimž jsou mikroorganismy vystaveny in vivo. Tímto způsobem je možno vypěstovat pathogenní střevní bakterie s některými změnami fenotypu, například se zvýšeným množstvím bílkovin, s novými bílkovinami nebo zvýšeným množstvím určitých bílkovin, se změněným nebo zvýšeným množstvím povrchových uhlohydrátů, se změnami v povrchových lipopolysacharidech, se zvýšenou schopností adhese, zvýšenou invazivností a/nebo zvýšeným průnikem do buněk. Způsoby, které jsou vynálezem navrhovány, jsou vhodné k provádění v průmyslovém měřítku.

Získané bakterie se zvýšenou antigenitou je možno.využít pro výrobu ochranných vakcin, například inaktivovaných vakcin s obsahem neporušených buněk nebo vakcin, obsahujících různé podjednotky. Mikroorganismy je možno využít také k diagnostickým účelům, například k produkci protilátek a detekci pathogenních střevních bakterií nebo k produkci antibiotik. Mimoto je možno použít protilátky, vyvolané aplikací střevních bakterií podle vynálezu, pro pasivní imunizaci.

• · ·

Podstatu vynálezu tedy tvoří způsob pěstování střevních bakterií ze skupiny Camphylobacter sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterorř' coccus sp. a Escherichia coli se zvýšenými antigenními vlastnostmi, postup spočívá v tom, že se střevní bakterie '·’ pěstují in vitro při kombinaci podmínek, které zahrnují:

---------------------__a) 0,05 _%--až_3—%_žluči nebo 0,025__%__až_0_,„6__%_n_ejménějed-________ né žlučové kyseliny nebo její soli při teplotě v rozmezí 30 až 42 °C do určité růstové fáze, jako časné log fáze, do rozmezí časné log a stacionární fáze nebo do stacionární fáze na vzduchu nebo za mikroaerofilních podmínek, například 5 až 20 ΟΟ^ a 80 až 95 % vzduchu, 5 až 20 % COg a 80 až 95 % dusíku nebo 5 až 10 % 0^, 10 až 20 % C0£ a 70 až 85 % N₂, popřípadě v přítomnosti dvojvazného kationtového chelatačního činidla, například 0 až 100 mikromol, s výhodou 25 mikromol BAPTA/AM, 0 až 10 mM EGTA a 0 až 100 mikroM EGTA/AM nebo

b) pěstování stejně jako v případě a) s tím rozdílem, že se pěstování provádí v přítomnosti dvojvazného kationtového chelatačního činidla v množství 1,0 až 100 mikroM, s výhodou 25 mikroM BAPTA/A, 0,5 až 10 mM EGTA nebo 1 až 100 mikroM EGTA/AM, avšak bez žluči, žlučových kyselin nebo solí žlučových kyselin.

π*

... Při provádění způsobu podle vynálezu se koncentrace jednotlivých žlučových kyselin nebo jejich solí mohou pohybovat v rozemzí 0,025 až 0,6 %, s výhodou 0,05 až 0,5 %, ještě výhodněji 0,05 až 0,2 % a zvláště 0,05 až 0,1 %. Výhodné jsou zejména postupy, při nichž živné prostředí obsahuje jako žlučovou kyselinu nebo její sůl deoxycholát nebo glykocholát.

Součást podstaty vynálezu tvoří také střevní bakterie ze skupiny Camphylobacter sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. a Escherichia coli, pěstované in vitro při kombinaci podmínek, při níž dochází ke zvýšení antigenních vlastností, a to

a) v přítomnosti 0,05 až 3 % žluči nebo 0,025 až 0,6 % nejméně jedné žlučové kyseliny nebo její soli při tep-------lotě 30 až 42 °C do růstu přibližně v časné log fázi, mezi časnou log fází a stacionární fází nebo do stacionární fáze na vzduchu nebo za mikroaerofilních podmínek, například při použití směsi 5 až 20 % CC^, s 80 až 95 % vzduchu nebo 5 až 20 % COg s 80 až 95 % dusíku nebo 5 až 10 % 0^ s 10 až 20 % CO2 a 70 až 85 % , popřípadě v přítomnosti dvojvazného kationtu jako chelatačního činidla, například 0 až 100 mikroM, s výhodou 25 mikroM BAPTA/AM, 0 až 10 mM EGTA a 0 až 100 mikroM EGTA/AM nebo

b) za stejných podmínek jako v případě a) s tím rozdílem, že se užije dvojvazný kation jako chelatační činidlo, například 1,0 až 100 mikroM, s výhodou 25 mikroM BAPTA/AM, 0,5 až 10 mM EGTA nebo 1,0 až 100 mikroM EGTA/AM a postup se provádí bez přítomnosti žluči, žlučových kyselin nebo jejich solí.

Součást podstaty vynálezu tvoří také vakcína, která obsahuje neporušené střevní bakterie nebo jejich složky, ze skupiny Campylobacter sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. a Escherichia coli nebo imunogenní fragment nebo derivát těchto materiálů se zvýšenými antigenními vlastnostmi a popřípadě farmaceutický nosič nebo ředidlo.

ββ «9 9 C e« φ « ··· · · « 9999 9

Ve výhodném provedení obsahuje vakcina celé, inaktivované střevní bakterie se zvýšenou antigenitou. V dalším výhodném provedení může vakcina obsahovat ještě pomocný prostředek.

V této souvislosti je nutno uvést také protilátky, například antisera, čištěné protilátky IgG nebo IgA, fragment Fab a podobně, které jsou schopné specificky se vázat na nejme ňě^jehňu^arrtrgenn i ~ ďeťerminant u^—stře vn±chb akt eri-£ -podle-vynálezu. Takové polyklonální a monoklonální protilátky je možno využít jako reakční činidla při imunologických zkouškách na detekci střevních bakterií u živočichů nebo v odebraném vzorku biologického materiálu. Polyklonální a monoklonální protilátky podle vynálezu je také možno využít jako pasivní očkovací materiály k ochraně proti infekcím, které jsou vyvolány střevními bakteriemi.

Součást podstaty vynálezu tvoří rovněž způsoby, které jsou prováděny in vitro a jimiž je možno zjistit potenciální antimikrobiální látky, postupuje se tak, že se střevní bakterie se zvýšenými antigenními vlastnostmi ze skupiny Camphylobacter sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., -Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clóstridium sp., Enterococcus sp., a Escherichia coli uvedou do styku s potentiální antimikrobiální látkou a zjistí se baktericidní nebo bakteriostatické účinky.

Obdobným způsobem je možno in vitro prokázat také produkci protilátek hostitelem nebo je možno prokázat přítomnost střevních bakterií v organismu živočicha nebo ve vzorku biologického materiálu, který byl tomuto živočichu odebrán. Postupuje se tak, že se živočich nebo biologický vzorek uvede do styku se střevními bakteriemi se zvýšenými antigenními • 9 • 9

9

- 11 vlastnostmi ze skupiny Campylobacter sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. a Escherichia coli, s antigeny těchto bakterií nebo s protilátkami proti těmto bakteriím a sleduje se případná interakce mezi antigenem a protilátkou.

_{K uvec}}_ené_mu účelu je možno připravit diagnostický ba----líček pro detekci produkce protilátek proti střevním bakteriím hostitelem nebo pro detekci přítomnosti střevních bakterií, tento balíček obsahuje střevní bakterie se zvýšenými antigenními vlastnostmi ze skupiny Campylobacter sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shugella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. a Escherichia coli nebo pro detekci protilátek proti těmto bakteriím, mimoto může balíček obsahovat další běžné základní složky.

Výhodnými střevními bakteriemi pro toto použití jsou zejména Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Shigella boydii, Helicobacter pylori, Helicobacter felis, Fastrosirillum hominus, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus.Bacteroides fragilis, Clostridium difficile, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, a Enterococcus faecalis. Výhodnými typy Eschetichia coli jsou zejména entrotoxické, enterohemorrhagické, enteroinvasivní, enteropathogenické a další kmeny.

·· • 9 • ·

- 12 Vynález je částečně založen na překvapujícím zjištění, že střevní bakterie podle vynálezu se zvýšenou antigenitou vyvolávají imunitní odpověď, která je zkřížena proti širší škále kmenů nebo serotypů téže bakteriální čeledi než je tomu v případě, že tytéž střevní bakterie byly pěstovány za běžných podmínek. V některých případech bylo prokázáno, že imunitní odpověď, vyvolaná těmito bakteriemi je alespoň z části ochranou také proti odlišné čeledi střevních bakterií.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. ΙΑ, 1B a 1C je graficky znázorněn výsledek vysokotlaké kapalinové chromatografie, provedené s monosacharidy, extrahovanými z hydrolyzátů C. Jejuni 81-176. Na obr.

1A jsou znázorněny standardy: fukosa Fuc, N-acetylgalaktosamin GalNac, N-acetylglukosamin GlcNac, galaktosa Gal, glukosa Glc a mannosa Man. Na obr. 1B jsou znázorněny výsledky s použitím extraktu běžně pěstovaných bakterií BHI. Na obr.

1C jsou znázorněny výsledky, získané při použití extraktu z bakterií, pěstovaných způsobem podle vynálezu, DOC.

Na obr. 2 jsou znázorněny výsledky, získané elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným, SDS-PAGE. Je znázorněno srovnání bílkovin z neporušených buněk ve sloupcích 1, 2 a 3 nebo povrchových extraktů ve sloupcích 5 a 6, tyto materiály byly získány z C. jejuni 81-176 při běžném pěstování BHI nebo při pěstování způsobem podle vynálezu (0,8 % žlučových kyselin Oxgall, 0X nebo 0,1 % deoxycholátu, DOC.

Na obr. 3 jsou znázorněny výsledky analýzy western blot, které uvádějí srovnání bílkovin, vázaných na IgA fretky po infekci neporušenými buňkami C. jejuni 81-176. Neporušené buňky uvedeného kmene, pěstované běžným způsobem jsou označeny ·· ·· » · · «

- 13 1, buňky téhož kmene, pěstované podle vynálezu v přítomnosti 0,8 % žlučových kyselin Oxgall jsou označeny 2 nebo v přítomnosti 0,1 % deoxycholátu jsou označeny 3, při použití povrchových extraktů téhož kmene je vzorek, získaný při běžném pěstování označen 4 a při pěstování v přítomnosti 0,1 % deoxycholátu je označen 5.

Na obr. 4 jsou znázorněny výsledky, získané metodou westerm biot a ukazující srovnání mezi bílkovinami,—které— jsou vázány na monoklonální protilátku 72c z neporušených buněk C. jejuni 81-176, specifickou pro flagellin. Při pěstování podle vynálezu je vzorek označen 3, při běžném pěstování je označen 2 a při pěstování ve fermentoru způsobem podle vynálezu je označen 1.

Na obr. 5 je znázorněn výsledek SDS-PAGE. Bylo provedeno srovnání lipopolysacharidů LPS z běžně pěstovaných neporušených buněk S. flexneri 2457T ve sloupci 1 nebo při pěstování způsobem podle vynálezu v přítomnosti 0,1 % deoxy cholátu ve sloupci 2.

Na obr. 6 je graficky znázorněno zvýšení zkřížené reaktivity C. jejuni při pěstování způsobem podle vynálezu.

C. jejuni 81-176 byl pěstován běžným způsobem nebo způsobem podle vynálezu, zejména jak je popsáno v příkladu 5, DOC. Kmen byl užit k vyvolání tvorby antibiotik. Graf znázorňuje aglutinační účinnost dvou typů protilátek (anti-C. jejuni 81-176 při pěstování v BHI a anti-C. jejuni 81-176 při pěstování DOC) proti různým serotypům C. jejuni. Podrobnosti pokusů jsou popsány v příkladu 32, oddíl 9.

Na obr. 7A, 7B a 7C je graficky znázorněna účinnost vakciny, která obsahuje inaktivované neporušené buňky C. jejuni 81-176 při ochraně myší proti infekci živými buňkami téhož kmene při jejich podání na nosní sliznici. Vakcinace ** ·· ·* ·· ·* ·· • ·· · · « · ~· * · · 0 ··· ·· · · ··· ·······♦ ··· · · ······ ··· ···* ·· ·* ···· »· 99

- 14 myší byla uskutečněna při použití následujících materiálů: fyziologický roztok s fosfátovým pufrem (PBS, plná čára),

PBS s pomocným prostředkem LT (přerušovaná čára), neporušené buňky uvedeného kmene, inaktivované formaldehydem a izolované podle příkladu 5 bez pomocného prostředku (CWC, plná čára s prázdnými kroužky) nebo tytéž buňky s pomocným prostředkem LT (CWC + adjuvant, plná čára s plnými kroužky). Účinnost vakciny byla sledována kolonizací střev. Na obr. 7A je znázorněn~ výsledek vakcinace při použití tří perorálních— dávek, bylo užito vždy 10 inaktivovaných bakterii na jednu dávku. Na obr. 7B je znázorněn výsledek při použití tří perorálních dávek, vždy 10 inaktivovaných bakterii na jednu dávku. Na obr. 7C je uveden výsledek, získaný při použití z 9 tri peroralnich dávek, vždy 10 inaktivovaných bakterii na jednu dávku, průběh vakcinace je podrobně popsán v příkladu 34, oddíl 11.

Na obr. 8A, 8B a 8C je graficky znázorněna účinnost vakciny, obsahující inaktivované neporušené buňky C. jejuni 81-176 při ochraně myší proti perorální infekci živými buňkami kmene C. jejuni 81-176. Myši byly očkovány stejným způsobem jak bylo popsáno u obr. 7A, 7B a 7C. Účinnost vakciny byla prokazována na základě kolonizace střev. Na obr. 8A je uveden výsledek vakcinace třemi perorálními dávkami, bylo 5 , užito vždy 10 inaktivovaných bakterii v jedne dávce. Na obr. 8B je uveden výsledek vakcinace třemi perorálními dávkami, bylo užito vždy 10 inaktivovaných bakterií v jedné dávce. Na obr. 8C je uveden výsledek vakcinace třemi perorálními dávkami, bylo užito vždy 10 inaktivovaných bakterií v jedné dávce. Provedení vakcinace je podrobně popsáno v příkladu 34, oddíl 9.

Na obr. 9 je graficky znázorněn výsledek způsobu pěstování kultury Shigella flexnei 2457T na invazivnost těchto bakterií. Uvedený kmen byl pěstován běžným způsobem v BHI • · ·

• e β · · · · · ···· • · · 9 9 9 9 · · · · 9

9··99· 9«· «999 99 99 9999 99 99

- 15 nebo způsobem podle vynálezu, a to způsobem podle příkladu 9, DOC-EL, to znamená při oddělení buněk v časné log fázi kultury, nebo rovněž způsobem podle příkladu 9, avšak při oddělení buněk až v pozdní log fázi, DOC-LL. Podrobnosti pokusu jsou uvedeny v příkladu 35, oddíl 12.

Na obr. 10 je graficky znázorněno zvýšení invazivnosti buněk Shigella při jejich pěstování způsobem podle vynálezu.

S. sonnei a S . dysenteriae 3818 byly pěstovány běžným způso-------bem v BHI nebo způsobem podle vynálezu podle příkladu 9. V grafu je uvedena invazivnost takto pěstovaných buněk Sigella proti buňkám INT-407. Podrobnosti jsou popsány v příkladu 35, oddíl 12.

Na obr. 11 je graficky znázorněno zvýšení zkřížené imunologické reaktivity mikroorganismu Shigella při jeho pěstování způsobem podle vynálezu. Pro vyvolání tvorby protilátek byl použit kmen S. flexneri 2457T, pěstovaný způsobem podle vynálezu podle příkladu 9. V grafu je srovnávána agglutinační účinnost protilátek, produkovaných proti S. flexneri, S. sonnei, S. dysenteriae a S. boydii při pěstování běžným způsobem BHI nebo při pěstování způsobem podle vynálezu podle příkladu 9. Podrobnosti pěstování jsou uvedeny v příkladu 36, oddíl 12.

Na obr. 12 je graficky znázorněn vliv koncentrace žluči a růstové fáze na uchycení buněk Helicobacter pylori NB3-2. Kmen byl pěstován v živném prostředí, které obsahovalo 0 %, 0,025 %, 0,05 % nebo 0,1 % žluči a buněčný materiál byl izolován po 8, 10, 12 a 18 hodinách po naočkování.

Je znázorněna invazivnost uvedených buněk proti buňkám INT-407. Podrobnosti pokusu jsou uvedeny v příkladu 38, oddíl 14.

Na obr. 13 je graficky znázorněn vliv koncentrace žluči a růstové fáze na přilnutí buněk kmene Helicobacter • · · ' · · · · · · · · · « • · · · · -· · · · «··· ·· ·· ··»· ·· ··

- 16 pylori Gl-4. Mikroorganismus byl pěstován v živném prostředí, obsahujícím 0 %, 0,1 % nebo 0,2 % žluči a buněčný materiál byl izolován po 6, 8, 10, 12, 14 a 16 hodinách po naočkování. V grafu je znázorněna invazivnost takto získaných buněk proti buňkám INT-407. Podrobnosti pokusu jsou uvedeny v příkladu 38, oddíl 15.

Způsob podle vynálezu tedy spočívá v pěstování střev- nich bakterií in vitro v přítomnosti kombinace podmínek,-----které byly zvoleny tak, aby byla vyvolána nebo zvýšena exprese antigenu a/nebo faktorů pro virulencí.

Pod pojmem střevní bakterie se v průběhu přihlášky rozumí bakterie, které je obvykle možno nalézt v žaludeční ajstřevni soustavě živočichů a také jakákoliv bakterie, která může vyvolat infekci v žalučení a střevní soustavě živočichů. Může jíto grampositivní i gram-negativní bakterie.

Pod pojmem podmínky se rozumí řada faktorů, které jsou spojeny s přírodním prostředím střevních bakterií in vivo nebo při jejich pěstování. Jde tedy například o přítomnost žluči, žlučových kyselin nebo solí nebo biologických prekursorů těchto látek, například cholesterolu, dále o hodnotu pH, mikroaerofilní podmínky, hodnoty osmotického tlaku a také o dobu, po níž jsou bakterie izolovány, to znamená o růstovou fázi v okamžiku izolace.

Pod pojmem antigeny se rozumí běžné antigeny, například makromolekuly, vytvářející morfologii buněk nebo jejich pohyblivost, bílkoviny, zvláště povrchové bílkoviny, různé lipopolysacharidy a uhlohydráty. S výhodou běží o imunogenní antigen,

Pod pojmem imunogenita se rozumí schopnost vyvolání tvorby protilátek u živočicha po jeho styku s neporušenými • · • ·

- 17 bakteriemi, vypěstovanými způsobem podle vynálezu nebo s fragmenty těchto bakterií.

Pod pojmem zvýšená antigenita se rozumí skutečnost, že střevní bakterie, vypěstované způsobem podle vynálezu mají vyšší koncentraci některých imunogenních antigenů a/nebo nových imunogenních antigenů ve srovnání se stejnými bakteriemi, pěstovanými za běžných podmínek.

Pod pojmem běžný se rozumí v průběhu přihlášky skutečnosti nebo podmínky, které jsou známé z dosavadního stavu techniky.

Pod pojmem mikroaerofilní podmínky se v průběhu přihlášky rozumí anaerobní podmínky nebo pěstování při zvýšené koncentraci oxidu uhličitého, například při použití směsí 5 až 20 % oxidu uhličitého a 80 až 95 % vzduchu, 5 až 20 % oxidu uhličitého a 80 až 95 % dusíku nebo 5 až 10 % kyselíku, 10 až 20 % oxidu uhličitého a 70 až 85 % dusíku.

Pod pojmem virulence se v průběhu přihlášky rozumí schopnost střevních bakterií napadnout hostitele, to znamená přilnout k jeho buňkám a/nebo proniknout do těchto buněk a/nebo přežívat v hostiteli a/nebo vyvolat v hostiteli pathologický stav.

Pod pojmem zkřížená ochrana se rozumí schopnost bakteriálního kmene nebo serotypů vyvolat imunitní odpověď celých buněk nebo jiné části organismu a tím předejít nebo zmírnit infekci téhož hostitele odlišným bakteriálním kmenem, serotypem a podobně téhož rodu bakterií.

Pod pojmem zkřížená reaktivita se v průběhu přihlášky rozumí schopnost jednoho bakteriálního kmene nebo serotypů • · ·

- 18 vyvolat humurální imunitní odpověď, to znamená tvorbu protilátek, reagujících zkříženě i s odlišným bakteriálním kmenem nebo serotypem téhož rodu. Jev zkřížené reaktivity prokazuje schopnost bakterií vyvolat zkříženou imunitní odpověď.

Pod pojmem hostitel se v průběhu přihlášky rozumí celý živočich nebo skupina živočišných buněk v kultuře in vitro. Pod pojmem živočich se v průběhu přihlášky rozumí

------například všichni tep-l-ok-revn-í-^ž-ivočichové-,—jako—savc_i.-.a______________ ptáci, například kuře, krocan, kachna a podobně.

Ve vakcině podle vynálezu může být střevní bakterií živá nebo inaktivovaná bakterie. Mimoto může vakcina obsahovat pomocný prostředek, například alum, emulzi typu olej ve vodě, tepelně labilní toxin z enterotoxigenní E. coli,

LT, jeho netoxigenní formy, například mLT a/nebo podjednotky této látky,, dále BCG nebo,Freundův pomocný prostředek a mimoto ještě farmaceutický-nosič, kterým může být například fyziologický roztok, roztok dextrosy nebo jiné vodné roztoky. Farmaceutické nosiče jsou souhrnně popsány v publikaci Remingtons Pharmaceuticyl Sciences, Mack Publishing Company. Vakcinou může být i tak zvaná pasivní vakcina, která obsahuje protilátky, schopné se specificky vázat na pathogenní nebo infekční organismy, proti nimž má být organismus chráněn.

Pod pojmem inaktivovaná bakterie se v průběhu přihlášky rozumí střevní bakterie, neschopná infekce a/nebo kolonizace, může jít o zeslabenou nebo usmrcenou bakterii. Zeslabené bakterie se mohou množit, avšak nemohou vyvolat infekci nebo onemocnění. Inaktivací bakterií je možno uskutečnit běžnými postupy, například chemicky s použitím formaldehydu nebo fyzikálně, například působením tepla, ultrazvuku nebo záření, výsledkem je bakterie, neschopná se množit a/nebo vyvolat infekci a/nebo způsobit onemocnění.

• · *· • ·

- 19 Pod pojmem účinné množství se v případě vakciny rozumí takové množství střevních bakterií nebo jejich imunogenních fragmentů, které může vyvolat imunitní odpověď. Potřebné množství bude záviset na antigenitě bakterie, jejího fragmentu nebo derivátu, na subjektu, který má být očkován a na jeho hmotnosti a může být stanoveno běžným způsobem. Ve výhodném provedení vynálezu vyvolá toto účinné množství vakciny zvýšení titru antibakteriálních proti------------------látek na alespoň dvojnásobek titru před očkováním. Ve vý---—

11 hodném provedeni se k očkování užije přibližně 10 az 10 ,

10 s výhodou 10 až 10 bakterií. S výhodou vakcina obsahuje inaktivované neporušené bakterie.

Pod pojmem účinné množství v případě pasivní vakciny se rozumí množství protilátky, které zabrání vzniku bakteriálního onemocnění nebo infekce nebo způsobí jeho mírnější průběh. Použité množství bude záviset na typu a titru protilátky a také na typu a hmotnosti očkovaného subjektu a může být stanoveno běžným způsobem.

Vakcinu podle vynálezu je možno podávat místně a/nebo systemicky jakýmkoliv známým způsobem, například nitrožilně, podkožně, nitrosvalově, do pochvy, intraperitoneálně, do nosu, perorálně nebo na jinou sliznici.

Vakcinu je možno podávat ve vhodném netoxickém farmaceutickém nosiči, který může být zpracován na formu mikrokapslí a/nebo na formu implantátu, z nějž se vakcina postupně uvolňuje.

Vakciny se s výhodou podávají několikrát v různých intervalech k udržení koncentrace protilátek.

Vakciny podle vynálezu je možno použít spolu s baktericidními nebo bakteriostatickými látkami.

• · · · 9 . · 9 9 99 • 9 9 9 9 9 9 * · · · · 9

Λ 9 · 9 9 9 9 9 9

9 9 99 9 9 99 9 9 9 9 9 9

- 20 Protilátky podle vynálezu je možno získat jakýmikoliv běžnými postupy, tak jak jsou například uvedeny v souhrnné publikaci Antibodies A Laboratory Manual, E. Harlow, D. Lané, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Obvykle se imunizuje živočich, například myš, krysa, morče, křeček nebo králík celými buňkami, jejich imunogenními fragmenty nebo deriváty bakterií se zvýšenou antigenitou podle vynálezu, popřípadě při použití pomocného prostředku nebo jakéhokoliv pro__středku, který zvýší imunogenní účinnost, imunizace se uskuteční v pravidelných intervalech. Sérum pokusných zvířat se pak analyzuje na přítomnost požadované protilátky běžným způsobem. Sérum nebo krev uvedených zvířat je pak možno využít jako zdroj polyklonálních protilátek.

V případě monoklonálních protilátek se zvířata imunizují stejně jako svrchu. Jakmile je dosaženo přijatelného titru protilátek, živočich se,usmrtí a asepticky se vyjme slezina. Slezinné buňky se uvedou do styku se specificky zvolenou nesmrtelnou buněčnou linií myelomu, a směs buněk se pak vystaví působení činidla, které vyvolává fúzi buněk, jako polyethylenglykolu a podobně. Za těchto podmínek dochází k náhodné fúzi a výsledkem postupu je směs buněk, u nichž došlo k fúzi a jednotlivých buněk obou použitých typů. Buněčné linie myelomů se specificky volí tak, aby při použití selekčního živného prostředí, například HAT, které obsahuje hypoxanthin, aminopterin a thymidin, byly jedinými buňkami, které v kultuře z výsledné směsi přežívají, byly hybridní buňky, vytvořené z buněk imunizovaného dárce a buněk myelomu. Buněčný materiál se zředí a pěstuje na selekčních prostředích. Živné prostředí se analyzuje na přítomnost protilátky se specifičností proti původnímu zvolenému antigenu. Ty kultury, které obsahují požadovanou protilátku se pak klonují postupným ředěním tak dlouho, až je původem buněčné, kultury jediná buňka. Protilátky je pak možno použít k pasivní vakcinaci proti infekci střevními bakteriemi.

• · « *>

- 21 Detekce protilátek nebo bakterii v hostiteli zahrnuje imunologické postupy. Tyto postupy jsou známé, jde například o radioimunologické zkoušky RIA, zkoušky z adsorpčním činidlem, vázaným na enzymy, jako ELISA, fluorescenční zkoušky včetně polarizační fluorescence FPIA.

Diagnostický balíček bude obsahovat všechna základní reakční činidla, nezbytná pro provedení požadovaných imunologických zkoušek. Může jít o komerčně dodávaný výrobek,_______ obsahující lahvičky nebo jiné zásobníky s reakčními činidly. Jde například o střevní bakterie a/nebo monoklonální nebo polyklonální protilátku podle vynálezu, mimoto jsou obsaženy běžné složky, nezbytné pro provádění reakce. Tyto složky jsou běžné pro řadu obdobných balíčků a jsou uváděny v řadě publikací, například v Antibodies A Laboratory Mannual, E. Harlow, D. Lané, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Běžnou součástí těchto balíčků jsou například mikrotitrační plotny, pufry pro udržení požadované hodnoty pH ve zkoumaném vzorku, například tris, HEPES a podobně, dále může balíček obsahovat konjugovanou druhou protilátku, například IgG proti myším tkáním, konjugovanou s peroxidázou nebo jakoukoliv jinou protilátku proti tkáním živočicha, z nějž byla získána první protilátka, a další běžná reakční činidla.

Při provádění způsobu podle vynálezu se střevní bakterie pěstují ve vhodném základním živném prostředí, například v běžně dodávaném bujónu s extraktem z mozku a srdce, BHI, dále je možno použít bujón Luria, LB, agar s obsahem ovčí krve, SBA, bujón Brucella, Meuller-Hintonův bujón, bujón s extraktem peptonu z hovězího masa a podobně, současně prostředí obsahuje 0,06 % až 3 % žluči nebo 0,025 až 0,6 % nejméně jedné žlučové kyseliny nebo její soli nebo biologie^ ké prekurzory těchto látek, například cholesterol, bakterie se pěstují při teplotě 30 až 42 °C do časné log fáze, do rozmezí mezi časnou log fází a stacionární fází nebo až do • · · ·

- 22 stacionární fáze na vzduchu nebo za mikroaerofilních podmínek, například v přítomnosti směsi 5 až 20 % oxidu uhličitého a 80 až 95 % vzduchu nebo 5 až 20 % oxidu uhličitého a 80 až 95 % dusíku nebo 5 až 10 % kyslíku, 10 až 20 % oxidu uhličitého a 70 až 85 % dusíku a popřípadě v přítomnosti dvojvazného kationtu jako chelatačního činidla, například v přítomnosti 0 až 100 mikroM, s výhodou 25 mikroM BAPTA/AM (jde o 2-(ethylendioxy)dianilin-N,N,N^>,N-tetraoctovou kyše linu ve formě acetyloxyesteru, Molecular Probes, Eugene, 0R), 0 až 10 mM EGTA (jde o ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraoctovou kyselinu, Sigma Chemical Co., St. Louis, M0), nebo 0 až 100 mikroM EGTA/AM (jde o ethylenbis(oxyethylennitrilo) tetraoctovou kyselinu ve formě acetoxymethylesteru, Molecular Probes, Eugene, OR), výsledná kombinace podmínek a složek živného prostředí vede k produkci střevních bakterií se zvýšenou antigenitou.

Podle dalšího, provedení způsobu podle vynálezu se střevní bakterie pěstují svrchu uvedeným způsobem v přítomnosti dvojvazného kationtu jako chelatačního činidla, například v přítomnosti 1,0 až 100 mikroM, s výhodou 25 mikroM BAPTA/AM, 0,5 až 10 mM EGTA nebo 1,0 až 100 mikroM EGTA/AM, avšak bez žluči, žlučových kyselin nebo jejich solí.

Žluč nebo žlučové kyseliny a jejich soli pro použití při provádění způsobu podle vynálezu zahrnují jakoukoliv přírodní složku žluči, vylučovanou játry a obvykle koncentrovanou ve žlučníku a také syntetické žlučové kyseliny, které se běžně dodávají například pod názvem OXGALL (Difco Laboratories, Detroit, Michigan), dále může jít o hovězí žluč (Sigma Chemicals, St. lOuis, Missouri) nebo jiný běžně dodávaný prostředek s obsahem kyseliny žlučové, deoxycholové, taurocholové a glykocholové. Výhodný je zejména deoxycholát DOC, běžně dodávaná žlučová kyselina, přítomná • · • «

- 23 in vivo v distálním tenkém střevě a v těch místech tračníku, která jsou kolonizována střevními bakteriemi. Výhodný je také glykocholát GC.

Způsobem podle vynálezu je možno připravit kultury střevních bakterií ze skupiny Campylobacter sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Becteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Shigella sp., Clostridium sp.,Enterococcus sp., a Escherichia coli jako zmražené zásobní kultury způsobem, který se v oboru běžně užívá a pak se tyto zásobní kultury ukládají při teplotě -80 °C až do použití. Například zásobní kulturu Campylobacter jejuni je možno připravit tak že se organismus pěstuje na sojovém agaru s tryptikázou, obsahujícím 5 % defibrinovaných ovčích červených krvinek, SBA, při teplotě 37 °C ve směsi 5 % kyslíku, 10 % oxidu uhličitého a 85 % dusíku.(mikroaerofilní podmínky, MC) po dobu 20 hodin. Zásobní kultury Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Helicobacter pylori a Shigella flexneri je možno připravit pěstováním organismu v bujónu s extraktem z mozku a srdce, BHI. Bakterie je možno před zmrazením izolovat jakýmkoliv známým způsobem, například filtrací, bakterie se pak znovu uvedou do suspenze v BHI s obsahem 30 % glycerolu. Kultury pro analytické pokusy nebo produkční kultury je možno připravit známými postupy, například pěstováním organismu na prostředí BHI s obsahem 1,5 % agaru při teplotě 37 °C za podmínek MC nebo za atmosférických podmínek, pak se jediná kolonie přenese do bujónu a organismus se pěstuje způsobem podle vnyálezu. Bakterie je možno izolovat známými postupy, například odstředěním.

Podle výhodného provedení se Campylobacter sp., s výhodou jejuni nebo coli a zvláště jejuni, kmen 81-176 pro zvýšení antigenity pěstuje v základním prostředí, s výhodou v bujónu BHI, který navíc obsahuje přibližně 0,1 % DOC nebo • ·

- 24 přibližně 0,8 % žluči při teplotě 37 °C a při použití směsi 10 až 20 % oxidu uhličitého a 80 až 90 % vzduchu, buněčný materiál se oddělí, jakmile kultura dosáhne pozdní log fázi až stacionární fázi, typicky přibližně 20 hodin po naočkování kultury.

Podle dalších výhodných provedení je možno pěstovat Shigella sp~. , s výhodou flexneri nebo dysenteriae a zvláště ___flexneri, kmen 2457T, se zvýšenou antigenitou tak, že se _ užije základní živné prostředí, s výhodou bujón BHI, který navíc obsahuje přibližně 0,1 % DOC nebo přibližně 0,8 % žluči při teplotě 37 °C na vzduchu , buněčný materiál se izoluje po dosažení časné log fáze, typicky 30 minut po naočkování, takže může jít o časnou nebo o střední log fázi.

Podle dalšího výhodného provedení se Helicobacter pylori, s výhodou kmen ATCC 49503, NB3-2 nebo Gl-4 se zvýšenou antigenitou získá pěstováním v základním živném prostředí, s výhodou bujónu BHI, který navíc obsahuje přibližně 0,05 až 0,2 % žluči nebo přibližně 0,05 % glykocholátu GC při teplotě 37 °C ve směsi 5 až 20 % oxidu uhličitého a 80 až 95 % vzduchu nebo ve směsi 10 % oxidu uhličitého, 5 % kyslíku a 85 % dusíku, buněčný materiál se oddělí, jakmile kultura dosáhne log fáze nebo stacionární fáze, podle zvláště výhodného provedení po dosažení log fáze.

Střevní bakterie, pěstované způsobem podle vynálezu mají pozměněnou morfologii a/nebo pohyblivósVbuňěk a/nebo produkují určité nové bílkoviny, lipopolysacharidy a/nebo uhlohydráty a/nebo produkují tyto makromolekuly v jiných množstvích ve srovnání s kulturami, pěstovanými pouze v základním živném prostředí. Je možno snadno identifikovat optimální podmínky, které zvyšují výtěžek buněk i jejich antigenitu. Při využití těchto podmínek je pak možno indenti• ·

- 25 fikovat antigeny, jejichž produkce je spojena s virulencí bakterií a je při pěstování způsobem podle vynálezu zvýšena.

Změny motility a větší morfologické změny je možno pozorovat mikroskopicky, popřípadě po zbarvení bakterií. Další jemnější morfologické změny, které by mohly být vyvolány pěstováním bakterií způsobem podle vynálezu je možno prokázat elektronovým nebo fluorescenčním mikroskopem.

Morfologie a tvorba slizu při pěstování střevních bakterií způsobem podle vynálezu podporují předpoklad, že může dojít k expresi pouzdra a/nebo jiných povrchových vrstev.

Aby bylo možno prokázat produkci pouzdra, je možno fenolem extrahovat povrchové složky bakterií, například bílkoviny, uhlohydráty nebo lipopolysacharidy. Uhlohydráty je zvláště dobře možno prokázat při použití vysokotlaké kapalinové chromatografie HPLC.

Bílkoviny zevní membrány střevních bakterií, pěstovaných způsobem podle vynálezu je možno analyzovat při použití elektroforézy na polyakrylamidovém gelu s obsahem dodecylsulfátu sodného, SDS-PAGE a srovnávat jejich množství s množstvím, produkovaným v organismech, pěstovaných za obvyklých podmínek. SDS-PAGE se obvykle provádí k vyhodnocení změn v buněčných i extrahovaných bílkovinách bakterií v důsledku změněných podmínek. Tímto způsobem je možno získat kvalitativní i kvantitativní informaci o povrchových změnách, spojených se zvýšením invazivnosti nebo antigenity.

Imunogenní potenciál nově vytvořených nebo pozměněných bílkovinných antigenů je možno identifikovat metodou Western blot. Imunogenita nově vytvořených nebo pozměněných bakteriálních bílkovin, identifikovaných při provádění SDS-PAGE může být vyhodnocena tímtéž způsobem. Je při tom možnopoužít jakýkoliv zdroj protilátek, například sérum z uzdravu• · ·· ·· '··

- 26 vujících se a tedy imunních králíků nebo fretek, výhodné je zejména získat protilátky ze zvířat, infikovaných perorálně živými organismy, pěstovanými běžným způsobem nebo způsobem podle vynálezu. Dalším zdrojem protilátek může být sliz ze střevní sliznice, který je zdrojem protilátky IgA, ,!· dále polyklonální antisera nebo monoklonální protilátky, například se zkříženou reaktivitou proti flagellinu C. jejuni, a* všechny tyto protilátky je pak možno použít pro výzkum jed___________________not 1 i výc h b akteriální cr. an ti genů,_________________________________________

Zvýšená produkce některých bakteriálních antigenů je spojena se zlepšením některých vlastností, spojených s virulencí. Jde například o schopnost přilnout k lidským střevním epitheliálním buňkám a pronikat do těchto buněk, dochází také ke změnám vazby červeni Kongo. Tato zkouška je běžně přijímanou zkouškou, na jejímž základě je možno předpovídat virulenci a. byla. popsána, v publikacích Andrews a další,

Infect. Immun., 60, 3287 až 3295, 1992 a Yoder, Avian Dis.,

33, 502 až 505, 1989. Vazba červeni Kongo prokazuje schopnost vázat hemin a tato schopnost je v souladu s virulenci bakterií. Mimoto je schopnost této vazby spojena také se schopností bakterií pronikat do epitheliálních buněk.

Bylo již prokázáno, že většina běžně pěstovaných sero*·-« typů C. jejuni Lior nevyvolává zkříženou reaktivitu. Na základě této informace by bylo zapotřehí připravit a podávat větší počet vakcin nebo vyrobit kombinovanou vakcinu, aby bylo možno dosáhnout obecnější ochrany proti baktériím čeledi Campylobacter. V případě, že se užije Campylobacter, pěstovaný způsobem podle vynálezu, který má zvýšenou antigenitu, je možno dosáhnout zkřížené imunity proti většímu počtu serotypů Lior nebo při použití běžně pěstovaných kmenů. Obdobně také bakterie z čeledi Shigella se zvýšenou antigeni, tou, pěstované způsobem podle vynálezu, vyvolává zkříženou • ·

- 27 imunitu proti řadě kmenů. Tyto ochranné vlastnosti kmenů, pěstovaných způsobem podle vynálezu je možno prokázat aglutinačními zkouškami a zkouškami s vakcinami podle vynálezu, které budou dále popsány.

Zvýšená antigenita střevních bakterií, pěstovaných způsobem podle vynálezu je v korelaci se zvýšenou virulencí, jak je možno prokázat na modelech malých živočichů.

_________Pro průkaz změněných vlastností Campylobacter je možno použít některá domácí zvířata. Častým modelem pro průkaz imunizační účinnosti je průjem o dospělých králíků, tak zvaný Ritardův model podle publikace Caldwell a další, Infect. Immun., 42, 1176 až 1182, 1983. Na tomto modelu je také možno prokazovat spojení serotypů Lior se zkříženou ochranou. Tento model však prokazuje spíše odolnost proti kolonizaci než odolnost proti vzniku onemocnění. Model, prováděný na fretce; a popsaný v publikaci Bell a další, Infect. Immun.,

58, 1848 až 1852, 1990 je pravděpodobně vhodnější vzhledem k tomu, že u zvířete dochází ke vzniku obdobných příznaků onemocnění Campylobacter jako u člověka. V poslední době se jako model využívá také myš, postup je popsán v publikaci Bagar, Infection and Immunity, 63, 3731 až3735, 1995. V tomto případě se nejprve zvíře imunizuje a pak se u imunizovaných myší vyvolá pokusná infekce živými bakteriemi Campylobacter, podanými na nosní sliznici nebo perorálně. Pak se sleduje kolonizace střev analýzou Campylobacter ve výkalech.

U čeledi Shigella byla pokusná infekce myší nosní sliznici popsána v publikaci Mallett a další, Vaccine, 11, 190 až 196, 1993. Tímto způsobem je možno zjistit virulenci a účinnost vakciny. V případě Helicobacter pylori se obvykle užívá model na kolonizaci žaludku při použití Helicobacter felis podle publikace Chem a další, Lancet, 339, 1120 až 1121,

1992. Uvedeným způsobem je možno vyhodnotit antigenitu tohoto mikroorganismu. .

« · ·· ·· • · · ·

- 28 Kromě uvedených živočišných modelů, typicky užívaných pro hodnocení invazivity a virulence střevních bakterií je možno užít pro zkoušky vakcin i další živočišné modely.

Střevní bakterie se zvýšenou antigenitou, získané způsobem podle vynálezu je možno použít k výrobě vakcin, které obsahují usmrcené neporušené buňky nebo jejich fragmenty. Tyto vakciny se pak podávají živočichům, u nichž dochází ke tvorbě protilátek. Podle množství vytvořených protilátek je možno usuzovat na ochranný potenciál vakciny pro pokusné živočichy. Při zvýšení tvorby antigenu nebo při indukci jejich tvorby v bakteriích dochází k získání buněk, při jejichž použití je možno připravit účinnější typy vakcin.

Vakciny podle, vynálezu je možno použít k očkování a k vyvolání imunitní... odpovědi organismu. Tímto způsobem je možno chránit živočichy proti infekci. Je také možno připravit kombinované vakciny například spojením buněk Shigella a Campylobacter nebo jejich frakcí do jediné vakciny.

Dále budou popsány postupy, jichž je možno využít k detekci změn povrchových antigenů a dalších vlastností bakterií, které jsou spojeny se zvýšenou invazivností. Tyto změny jsou kvalitativní i kvantitativní. Uvedenými postupy je možno prokázat, že při pěstování bakterií způsobem podle vynálezu dochází ke zvýšení invazivností a ke tvorbě antigenů, vyvolávajících odpověď imunitního systému, která pak chrání proti širší škále bakteriálních kmenů, serotypů a v některých případech i čeledí ve srovnání, s antigeny bakterií, pěstovaných běžnými postupy.

V oboru existuje řada uznávaných modelů, které byly také v tomto případě použity pro vyhodnocení vakcin.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení jeho rozsahu.

Příklady provedení vynálezu

V příkladech 1 až 21 budou uvedeny způsoby pěstování bakterií se zvýšenou antigenitou.

Příklad 1

Campylobacter jejuni kmen 81-176 se nanese bakteriologickou kličkou na agarové plotny, obsahující krev, jde o sojový agar s tryptikázou a 5 % defibrinovaných ovčích červených krvinek, pak se plotna inkubuje za mikroaerofilních podmínek v nádobách GasPak (BBL, Cockeysville, MD) 20 hodin při teplotě 37 °C. Bakterie se přenesou do lahví, které obsahují 1 litr prostředí BHI, předem uvedeného do rovnovážného stavu v atmosféře s obsahem 10 % oxidu uhličitého a 90 % vzduchu, prostředí je doplněno 0,8 % prostředku OXGALL (Difco), Detroit, MI). KUltury se pěstují 20 hodin za protře pávání při teplotě 37 °C v uzavřených lahvích v prostředí 10 % oxidu uhličitého a 90 % vzduchu, pak se buněčný materiál z kultury izoluje.

Příklad 2

Campylobacter jejuni kmen 81-176 se nanese na agarové plotny, stejné jako v příkladu 1 a plotny se inkubují v nádobách GasPak (BBL, Cockeysville, MD) za mikroaerofilních podmínek 20 hodin při 37 °C. Bakterie se pak užijí k naočkování lahví, obsahujících 1 litr prostředí BHI,. předem uvedeného do rovnovážného stavu ve směsi 10 % oxidu uhličitého a 90 % vzduchu, mimoto prostředí obsahuje 0,01 až 0,1 %

99 » 9 9 «

9 '

O · · ·9 deoxycholátu sodného, DOC. Je důležité připravit a sterilizovat DOC v autoklávu jako zásobní roztok odděleně od prostředí BHI a pak tuto látku za aseptických podmínek přidat k prostředí BHI do koncentrace 0,01 až 0,1 % těsně před naočkováním bakteriemi. Kultury se pak inkubují různě dlouhou dobu až do 20 hodin za protřepávání při teplotě 37 °C ve směsi 5 % kyslíku, 10 % oxidu uhličitého a 85 % dusíku a pak se buněčný materiál izoluje.

Příklad 3

Campylobacter jejuni, kmen 81-176 se nanese kličkou na tytéž plotny jako v příkladu 1 a inkubuje se stejným způsobem v týchž nádobách 20 hodin při 37 °C. Bakterie se pak užijí k naočkování lahví, obsahujících 1 litr bujónu Brucella, předem uvedeného do rovnovážného stavu se směsí 10 % oxidu uhličitého a 90 %. vzduchu' v přítomnosti 0,01 až 0,1 % deoxycholátu sodného. Pak se. kultury inkubují při teplotě 37 °C 20 hodin za protřepávání v přítomnosti směsi 5 % kyslíku, % oxidu uhličitého a 85 % dusíku, načež se buněčný materiál izoluje.

Příklad 4

Campylobacter jejuni, kmen 81-176 se nanese kličkou na tytéž plotny jako v příkladu 1 a inkubuje se stejným způsobem v týchž nádobách 20 hodin při teplotě 37 °C. Bakterie se pak užijí k naočkování lahví s objemem 1 litr, obsahujících Mueller-Hintonův bujón, předem uvedený do rovnovážného stavu se směsí 10 % oxidu uhličitého a 90 % vzduchu v přítomnosti 0,01 až 0,1 % deoxycholátu sodného. Kultury byly inkubovány za protřepávání 20 hodin při 37 °C v přítomnosti směsi 5 % kyslíku, 10 % oxidu uhličitého a 85 % .·, dusíku a pak byly buňky izolovány.

• · ·· · · ·

- 31 Příklad 5

Campylobacter jejuni, kmen 81-176 se nanese kličkou na tytéž plotny jako v příkladu 1 a inkubuje se stejným způsobem v týchž nádobách 20 hodin při 37 °C. Bakterie se pak užijí k naočkování lahví, obsahujících 1 litr prostředí BHI, předem uvedeného do rovnovážného stavu se směsí 10 % oxidu uhličitého a 90 % vzduchu v přítomnosti 0,1 % deoxycholátu soUnéhOT. ^KuTtury—se pak—inkubují 20hodin—za—pomaiého—mí chání při teplotě 37 °C ve směsi 10 % oxidu uhličitého a 90 % vzduchu, načež se buněčný materiál izoluje.

Příklad 6

Vibrio cholerae se nanese kličkou na agarové plotny s prostředím BHI s obsahem sojového agaru s tryptikázou s 5 % defibrinovaných ovčeích červených krvinek a kultura se inkubuje na vzduchu 20 hodin při teplotě 37 °C. Pak se kultura naočkuje do lahví, obsahujících 1 litr prostředí BHI s 0,1 % deoxycholátu sodného. Kultura se inkubuje 20 hodin za protřepávání na vzduchu při teplotě 37 °C a pak se buněčný materiál izoluje.

Příklad 7

Salmonella choleraesuis se nanese kličkou na agarové plotny s prostředím BHI a inkubuje na vzduchu 20 hodin při 37 °C. Bakterie se pak užijí k naočkování lahví, obsahujících 1 litr prostředí BHI s obsahem 0,1 % deoxycholátu sodného. Kultury se pak inkubují 20 hodin za protřepávání při teplotě 37 °C na vzduchu, načež se buněčný materiál izoluje.

• · • ·· ···· ·· ·· ···· ·'· ··

- 32 Příklad 8

Salmonella typhinurium se nanese kličkou na agarové plotny s obsahem prostředí Luria a kultura se inkubuje na vzduchu 20 hodin při 37 °C. Pak se bakterií užijí k naočkování lahví, obsahujících 1 litr prostředí BHI s 0,1 % deoxycholátu sodného. Kultury se inkubují 20 hodin za protřepávání při teplotě 37 °C v přítomnosti směsi 10 % oxidu uhličitého a 90 vzduchu. Jedna z kolonií se přenese do__ litru prostředí LB s obsahem 0,1 % DOC a pak se inkubuje v uzavřené lahvi při 37 °C za pomalého prostřepávání. Po 12 hodinách se 60 ml kultury zředí na 1 litr čerstvým předehřátým prostředím a kultura se inkubuje dalších 30 minut, načež se materiál izoluje.

Příklad 9

Shigella flexneri. 2457T se nanese kličkou na agarové plotny s červeným Kongo a plotny se inkubují na vzduchu 20 hodin při 37 °C. Jedna z červených kolonií se naočkuje do lahve s obsahem 1 litr prostředí BHI a 12 hodin se inkubuje za protřepávání. Pak se 50 ml této kultury užije k naočkování 250 ml předehřátého prostředí BHI s obsahem 0,1 % deoxycholátu sodného. Pak se kultura inkubuje za protřepávání 4 hodiny na vzduchu při 37 °C. Pak se kultura zředí na optickou hustotu Οϋθθθ přibližně 0,17 předehřátým prostředím BHI s obsahem 0,1 % DOC a inkubuje se 30 minut za protřepávání při 37 °C na vzduchu, načež se materiál izoluje.

Příklad 10

Campylobacter jejuni 81-176, 81-116 nebo HC (v BHI .s 30 % glycerolu) se nechá rychle roztát a pak se nanese na agar s ovčí krví SBA, užije se 0,1 ml materiálu na jednu plotnu. Naočkované plotny se inkubují v nádobě GasPak při

- 33 použití generátoru mikroaerofilního prostředí CampyPak Plus (BBL, Cockeysville, MD) 20 hodin při teplotě 37 °C. Bakterie se oddělí a uvedou do suspenze v 10 ml BHI. Suspenze se užije k naočkování 1 litru bujovu BHI nebo k naočkování téhož prostředí s obsahem 0,1% DOC, předem uvedeného do rovnovážného stavu se směsí 10 % oxidu uhličitého a 90 % vzduchu v lahvi s objemem 2 litry. Očkovací materiál se přidává k vyváženému živnému prostředí tak dlouho, až má optická husto----ta ODhodnotu 0,05.—Naočkovaná lahevseopětuloží do směΌέΌ ' ' -si 10 % oxidu uhličitého a 90 % vzduchu a za stálého míchání obsahu se inkubuje 20 hodin při teplotě 37 °C. Po této době se bakterie oddělí.

Příklad 11

Helicobacter pylori se užije k naočkování bujónu BHI s obsahem 4 % telecího séra. Po naočkování se lahve propláchnou směsí 5 % kyslíku,. 10 % oxidu uhličitého a 85 % dusíku a inkubují za protřepávání 22 hodin při 37 °C. Po této době se 2,5 ml kultury přenese do lahve, obsahující bujón BHI se 4 % telecího séra nebo obsahuje láhev totéž živné prostředí, navíc doplněné 0,05 % glykocholátu sodného. Lahve se opět propláchnou svrchu uvedenou mikroaerofilní směsí plynů a pak se inkubují 20 až 24 hodin při 37 °C. Pak se buněčný materiál izoluje stejně jako v předchozích příkladech.

Příklad 12

Salmonella typhimurium v prostředí LB s 30 % glycerolu se nanese kličkou na plotnu s agarem LB a pěstuje na vzruchu 18 až 20 hodin při 37 °C. Jedna z kolonií se odebere a přenese do 1 litru prostředí LB nebo do téhož prostředí s obsahem 0,1 % DOC v lahvích, které se propláchnou směsí 10 % oxidu uhličitého, 5 % kyslíku a 85 % dusíku,

9· ·· ·· ·« ·· ·· • ··

• · • · · * · ··«· • · · ·· ·· uzavřou a inkubují za protřepávání 12 hodin při teplotě 37 °C. Pak se bakterie zředí stejným prostředím na optickou hustotu ΟΏθθθ přibližně 0,17 a inkubují se za týchž podmínek až do dosažení časné log fáze, což je v typických případech 30 minut po zředění. Pak se buněčný materiál izoluje stejně jako svrchu.

Příklad 13

Salmonella typhimurium se nanese kličkou na plotnu s agarem LB a inkubuje na vzduchu 18 až 20 hodin při teplotě 37 °C. Jedna z kolonií se přenese do 1 litru prostředí LB nebo do téhož prostředí s osbahem 0,1 % DOC a pak se inkubuje na vzduchu 12 hodin při teplotě 37 °C. Pak se kultura zředí v poměru 1 : 5 tímtéž čerstvým prostředím a inkubuje další 4 hodiny za stejných podmínek. Pak se kultura zředí tímtéž čerstvým prostředím na optickou hustotu Οϋθθθ přibližně 0,17, načež/se. inkubuje za stejných podmínek až do dosažení log fáze, v typických případech ještě 30 minut po zředění. Pak se buněčný materiál oddělí.

Příklad 14

Klebsiella pneumoniae se nanese kličkou na agarovou plotnu s agarem BHI a inkubuje se na vzduchu 18 až 20 hodin při 37 °C. Jedna z kolonií se užije k naočkování 1 litru BHI nebo téhož prostředí s osbahem 0,1 % DOC a pak se kultura 12 hodin pěstuje při protřepávání na vzduchu' při teplotě 37 °C. Pak se bakterie zředí tímtéž prostředím na optickou hustotu Οϋθθθ ^s hodnotou 0,17 a pěstují ještě dalších 30 minut, načež se buněčný materiál oddělí.

·· »· > « * · • ♦ · • · · • · ·

Φ··· **» ·· ·· • · · · • · · • !· · » φ • · · ·· •••’φ ·♦ *# • · · · • * ·· ·· · · φ • · · * · Φ ·

Příklad 15

Enterobacter cloacae se nanese kličkou na plotnu s agarem BHI a inkubuje se na vzduchu 18 až 20 hodin při 37 °C. Pak se bakterie zředí tímtéž živným prostředím na optickou hustotu Οϋθθθ s hodnotou 0,17 a pěstují se ještě 30 minut, načež se oddělí jako svrchu.

Příklad 16----—---------____

Escherichia coli kmen 0157:H7 se nanese na plotny, obsahující agar s ovčí krví a pak se plotny inkubují na vzduchu 18 až 20 hodin při teplotě 37 °C. Jedna z kolonií se užije k naočkování 1 litru prostředí BHI nebo téhož prostředí s obsahem 0,1 až 0,2 % DOC, pak se kultura 12 hodin protřepává při teplotě 37 °C. Pak se bakterie zředí na optickou hustotu Οϋθθθ s hodnotou 0,17 a pěstují se ještě 30 minut, načež se oddělí.

Příklad 1.7

Enterococcus faecalis se nanese kličkou na plotnu, obsahující agar s ovčí krví a plotny se inkubují na vzduchu 18 až 20 hodin při teplotě 37 °C. Jedna z kolonií se užije k naočkováni 1 litru živného prostředí BHI nebo téhož prostředí s obsahem 0,1 % DOC, načež se kultura pěstuje 12 hodin za protřepávání při teplotě 37 °C. Bakterie se pak zředí na optickou hustotu ΟΏθθθ s hodnotou 0,17 a pěstují se ještě 30 minut, načež se bakterie izolují.

Příklad 18

Clostridium difficile v živném prostředí s obsahem mletého masa a 30 % glycerolu se nanese kličkou na plotnu s prostředím s hovězími játry pro anaerobní mikroorganismy, • · • ·

- 36 obsahujícím 1,5 % agaru a kultura se pěstuje při teplotě 37 °C za mikroearofilních podmínek v přítomnosti směsi 5 % oxidu uhličitého a 95 % dusíku. Jedna z kolonií se přenese do 1 litru modifikovaného prostředí s mletým masem nebo do téhož prostředí s obsahem 0,1 % DOC. Bakterie se dále pěstují ještě 12 hodin za mikroaerofilních podmínek při teplotě 37 °C a pak se buněčný: materiál oddělí.

P ř í k lad.19 ------_;---------—— ____

Bacteroides fragilis, uchovávaný v modifikovaném prostředí s mletým masem a 30 % glycerolu se kličkou nanese na agarovou plotnu s prostředím, modifikovaným mletým masem a pěstuje se při 37 °C za mikroaerofilních podmínek v přítomnosti směsi 5 % oxidu uhličitého a 95 % dusíku. Jedna z kolonií se přenese do 1 litru prostředí, modifikovaného mletým masem nebo do téhož prostředí s obsahem 0,1 % DOC. Bakterie se pěstují ještě 12 hodin za mikroaerofilních podmínek při teplotě 37 °C a pak se buněčný materiál oddělí.

Příklad 20

Yersinia pseudotuberculosis, uchovávaná v bujónu Luria s obsahem 30 % glycerolu se nanese kličkou na agarovou plotnu s bujónem Luria a inkubuje při teplotě 30 °C. Jedna z kolonií se přenese do 1 litru prostředí LB a inkubuje 12 hodin při teplotě 30 °C. Pak se kultura zředí v poměru 1 : 5 prostředím LB nebo tímtéž prostředím s obsahem 0,1 % DOC a inkubuje se ještě 4 hodiny při teplotě 37 °C. Pak se kultury zředí tímtéž prostředím na hustotu ΟΏθθθ s hodnotou 0,17 a inkubují dalších 30 minut, načež se buňky oddělí.

Příklad 21

Helicobacter pylori se naočkuje do bujónu BHI se 4 % telecího séra. Po naočkování se lahve propláchnou směsí • · • ·

9> · * · · · • · · · · · · • · * « * » • · « ···· · ··· · ··

- 37 5 % kyslíku, 10 % oxidu uhličitého a 85 % dusíku a pak se směs inkubuje 22 hodin za protřepávání při teplotě 37 °C.

Po této době se 2,5 ml kultury přenese do lahve, obsahující bujón BHI se 4 % telecího séra nebo totéž prostředí s 0,1 % až 0,2 % hovězí žluči. Lahve se propláchnou toutéž plynnou směsí jako svrchu a pak se inkubují 20 až 24 hodin při 37 °C Po této době se buněčný materiál oddělí.

V následujících příkiadech 22~až~20budou uvedeny-antigenní a další vlastnosti kmenů, které byly vypěstovány způsobem podle vynálezu.

Příklad 22

K pozorování motility a morfologie bakterií bylo použito mikroskopické pozorování. Při tom bylo možno povrhové vrstvy zviditelnit zbarvením pouzder pomocí nigrosinu. Po usušení na vzduchu byly vnitřní prostory buněk zbarveny krys talovou violetí. Všechna pozorování byla prováděna při použití 1000-násobného zvětšení.

Morfologie bakterií, vypěstovaných způsobem podle vynálezu (dále budou tyto bakterie označeny ENHANCED), byla pozměněna ve srovnání s bakteriemi, pěstovanými na běžném živném prostředí. Například v případě bakterií C. jejuni došlo ke shlukování a tvorbě velkých shluků buněk, kdežto běžně pěstované buňky byly většinou od sebe odděleny. Při barvení pouzdra byla zřejmá změna povrchu bakterií. Tato zrně na vedla k intensivnějšímu zbarvení pouzder nigrosinem. Bakterie zůstaly vysoce mobilní.

« ·

- 38 Příklad 23

Povrchové složky C. jejuni byly analyzovány po extrakci fenolem. Extrahován byl kmen C. jejuni 81-176, pěstovaný běžným způsobem nebo způsobem podle příkladu 2. Buněčný materiál byl ze živného prostředí oddělen odstředěním. Usazenina buněk byla 2 hodiny extrahována při teplotě místnosti 1% fenolem.' Neporušené buňky byly z extrahovaného materiálu ^odděleny odstředěním po dobu 45 minut. Supernatant s obsahem povrchových složek extrahovaných bakterií byl dialyzován přes noc proti destilované vodě. Zadržený podíl byl odstředěn 3 hodiny při teplotě 4 °C při 105 000 g. Extrahovaná usazenina byla znovu rozpuštěna v 10% chloridu sodném a materiál byl vysrážen přidáním dvou objemů chladného 95% ethanolu. Srážení bylo ještě jednou opakováno a materiál byl pak lyofilizován. Lyofilizovaný vzorek byl pro další analýzu rozpuštěn ve vodě v množství 1 mg/ml..

Obsah uhlohydrátu z extraktu byl stanoven při použití běžného postupu s použitím fenolu a kyseliny sírové, jako standard byla použita glukosa.. Obsah kyseliny uronové v extraktu byl měřen metodou podle Dische karbazolovým reakčním činidlem. Celkový obsah bílkovin ve fenolovém extraktu byl stanoven pomocí zkušebního balíčku s bicinchonovou kyselinou (Pierce Chem. Co., Rockford, IL).

Bylo možno pozorovat nepřítomnost kyseliny uronové v takto získaných extraktech. Při tom je řada bakteriálních pouzder vytvořena z polymerů této kyseliny. Bylo překvapující, že hlavní složkou povrchových extraktů C. jejuni 81-176 byla bílkovina. Celkový obsah uhlohydrátů v extraktech bakterií, které byly pěstovány způsobem podle vynálezu byl však také zvýšen ve srovnání s běžně pěstovaným buněčným materiálem.

·· «· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · • · · · · · · « • o · « · ·· «··· «,· «·

- 39 Poměr uhlohydrátů k bílkovinám v získaných extraktech je shrnut v následující tabulce 1.

Tabulka 1

Poměr uhlohydrátů k bílkovinám v extraktech povrchových částí buněk C. jejuni, pěstovaných běžným způsobem (BHI) nebo způsobem podle příkladu 2 (ENHANCED)

Doba po přidání (h) BHI ENHANCED

1	0,02	0,02
2	0,02	0,10
4	0,02	0,15
6	0,03	0,29

Jak je zřejmé z tabulky 1, existuje přímý vztah mezi přidáním DOC do živného prostředí a zvýšenou koncentrací extrahovatelných uhlohydrátů v bakteriích. Tyto uhlohydráty byly zvýšeny více než osmkrát u bakterií, pěstovaných způsobem podle vynálezu ve srovnání s bakteriemi, pěstovanými běžným způsobem. Shlukování bakteriálních buněk, pěstovaných v prostředí S obsahem DOC je pravděpodobně způsobena právě složkami extraktu povrchových částí buněk.

Po rehydraci měl extrakt, vysokou schopnost vytvářet ve vodě gelové struktury, roztok byl proto vysoce viskosní a podobal se slizu. V extraktu byly prokázány podobné vlastnosti, jaké mají glykoproteiny typu mucinu.

Aby bylo možno analyzovat jednotlivé monosacharidy, byly extrakty hydrolyzovány působením LN kyseliny trifluoroctové v uzavřených nádobkách. Vzorky byly sušeny 2 hodiny • ·

- 40 pod dusíkem a pak byly znovu uvedeny do suspenze v destilované vodě. Cukry byly odděleny pomocí HPLC při použití chromatografické matrice Dionex Corp a systém rozpouštědel obsahoval 3 % 0,5 N hydroxidu sodného a 97 % vody. K měření množství monosacharidů byla použita amperometrická detekce.

,» Jako standard byly použity fukosa, galaktosamin, glukosamin, galaktosa, glukosa a mannosa.

_________________L_____Analýza hydrolyzovaného extraktu povrchového materiálu buněk pomocí HPLC prokázala přítomnost několika monosacharidů, jak je zřejmé z obr. 1. Nebyl prokázán žádný kvalitativní rozdíl ve složení uhlohydrátů v extraktech z běžně pěstovaných bakterií nebo z bakterií, pěstovaných způsobem podle příkladu 2 . Bylo však možno pozorovat malé kvantitativní rozdíly.

Příklad 24

Bakteriální bílkoviny·· byly analyzovány při použití SDS-PAGE a metodou Western blot. Byl použit systém gelu podle publikace Lugtenberg a další, FEBS Letters, 58, 254 až 258, 1975. Jde o diskontinuální systém gelu, který je tvořen gelem s nízkým obsahem akry1amidu, typicky 4 % při pH 6,8 a gelem pro separaci s vyšším obsahem akrylamidu o pH 8,8.

Do obou gelů bylo přidáno 0,1 % SDS. Bílkoviny byly rozdělény podle své molekulové hmotnosti, užity byly gely s obsahem 8 nebo 12 % akrylamidu. Bílkoviny byly barveny stříbrem, <., stanovení molekulové hmotnosti bylo provedeno na bázi hodnot známých bílkovin, použitých jako standardů.

Bílkoviny C. jejuni byly rozděleny na SDS-PAGE a barveny stříbrem. V buněčném materiálu, pěstovaném v přítomnosti DOC bylo možno prokázat čtyři bílkoviny včetně bílkoviny s molekulovou hmotností 62 000, jak je zřejmé z obr. 2.

- 41 Příklad 25

Lipopolysacharidy S. flexneri byly analyzovány extrakcí fenolem. S. flexneri byla pěsotvána běžným způsobem nebo podle vynálezu způsobem podle příkladu 9 a buněčný materiál byl z živného prostředí oddělen odstředěním. Lipopolysacharidy LPS byly extrahovány způsobem podle publikace Westphal a Jann, R. Whistler ed. , Methods in Carbohydrate Cehmistry, sv. 57~s'trv 83, 1965^-.*^-Postup^-?spOČívá~v~tom-; že se buněčný materiál, pěstovaný v prostředí BHI nebo způsobem podle příkladu 9 odstředí a usazenina se jednou promyje PBS. Pak se buněčný materiál extrahuje 15 minut při použití 45% fenolu ve vodě při teplotě 58 °C. Extrakt se zchladí na 10 ⁰ a odstředí. Horní vodná fáze s obsahem LPS se odsaje a pak se dialyzuje proti destilované vodě. Zadržený podíl se 7 hodin odstředí při 4 °C a při 80 000 g a pak ještě třikrát vždy 3 hodiny při 105 000 g. Výsledná usazenina se lyofilizuje. Před analýzou se materiál znovu uvede do suspenze ve vodě v množství 1 mg/ml. Vzorek byl analyzován na obsah uhlohydrátů jako svrchu a mimoto elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným, SDS-PAGE, tak jak bude dále uvedeno a jak je znázorněno na obr. 5.

V bílkovinách S. flexneri nebylo možno pozorovat žádné větší rozdíly při pěstování na běžné prostředí nebo podle vynálezu a při analýze pomocí SDS-PAGE. Množství uhlohydrátů bylo v poměru k množství LPS poněkud sníženo u buněk, pěstovaných způsobem podle vynálezu. Avšak analýza pomocí SDS-PAGE, následovaná oxidací a barvením stříbrem prokázala podstatné změny ve struktuře LPS, jak je zřejmé z obr. 5. V dráze 2 gelu je možno pozorovat, že frakce 0-antigenu S. flexneri, pěstované podle vynálezu má zkrácenou délku. Tento výsledek odpovídá sníženému hmotnostnímu poměru uhlohydrátů a LPS u těchto buněk.

- 42 Výsledky tedy prokázaly kratší, pravděpodobně kratší vedlejší řetězec O-antigenu u buněk, pěstovaných způsobem podle vynálezu, což má pravděpodobně za následek vyšší hydrofobnost bakterií. Takové bakterie se dostávají snadněji do interakce s hydrofobními povrchy ve střevech.

Příklad 26

Imunogenita bílkovin byla stanovena metodou Westernblot. Bílkoviny z běžně pěstovaných bakterií a bakterií, pěstovaných způsobem podle příkladu 1 nebo 5 svrchu, byly odděleny pomocí SDS-PAGE, pak byly elektroforeticky přeneseny na membrány z nitrocelulosy nebo PVDF a blokovány standardním blokovacím činidlem s obsahem 3 % BSA, 50 mM tris o pH 8,5, 50 mM NaCl a 0,2 % TWEEN 20. Primární protilátka byla nanesena rovněž v blokovacím pufru, výsledný blot byl pak promyt a byla nanesena druhá protilátka. Po promytí byl blot vyzualizován pomocí světla nebo substrátu, schopného produkovat barevnou látku. Ke konjugaci druhé protilátky byla užita peroxidáza ze křenu nebo alkalická fosfatáza.

Na obr. 3 je znázorněn výsledek Western blot při použití králičího slizu, obsahujícího IgA a imunního proti příslušnému mikroorganismu. Je možno pozorovat, že immunodominantním antigenem byla bílkovina s molekulovou hmotností 62 000. Antigenita této bílkoviny byla vysoce zvýšena v případě pěstování v přítomnosti DOC nebo žluči. Tatáž bílkovina je rovněž převažujícím antigenem v extraktech povrchových materiálů buněk, pěstovaných v přítomnosti DOC.

Při použití myší monoklonální protilátky se zkříženou reaktivitou proti flagellinu z Campylobacter bylo možno prokázat, že svrchu uvedenou bílkovinou byl flagellin z C. jejuni, jak je zřejmé z obr. 4. Šlo o významné zjištění vzhledem k tomu, že se již řada pracovníků snažila prokázat,

- 43 že se flagellin z C. jejuni účastní pathogenese a je spojen s invasivními vlastnostmi této bakterie.

Příklad 27

Pro měření virulence bylo použito barvení červení Kongo. Stře-vní bakterie, pěstované běžným způsobem v BHI nebo způsobem podle vynálezu spolu s červení Kongo v koncentraci 0,025 % byly znovu uvedeny do suspenze v destilované vodě a 10 minut extrahovány acetonem. Buněčná drt byla usazena odstředěním a optická hustota Οϋ^θθ použitého barviva byla měřena při použití slepé zkoušky, tvořené směsí 40 % acetonu a 60 % vody. Absorbance barviva byla srovnávána s absorbancí buněk při 660 nm a vyjádřena jako poměr optických hustot 0D₄θ₈/0Dθθθ. Údaje jsou shrnuty v tabulce 2.

T a b u 1 k a 2

Vazba červeni Kongo na střevní bakterie, pěstované běžným způsobem (BHI) nebo podle vynálezu (ENHANCED) . absorbance barviva kmen

BHI ENHANCED

	C. jejuni 81-176	0,07 0,06	0,49 0,49
C.	jejuni 81-116
	S.	typhimurium SR11	0,05	0,30
	S.	flexneri 2457T	0,02	0,13
	V.	cholerae 569b	0,70	2,00

Z tabulky 2 je zřejmé, že u některých střevních bakterií, pěstovaných způsobem podle vynálezu došlo ke zvýšení vazby červeni Kongo. Tyto výsledky prokazují, že způsobem podle vynálezu je možno zvýšit virulenci a další vlastnosti bakterií, spojené se schopností vyvolat onemocnění.

- 44 Příklad 28

Byla sledována adhese bakterií na epitheliální buňky, pěstované v kultuře. Adhese bakterií byla stanovena podle publikace Galan a Curtiss, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 6383 až 6387, 1989. Buňky INT-407, Henleho buňky, ATCC CCL6 a CaCo-2, ATCC HBT37 lidských střevních buněčných linií byly pěstovány na plotnách pro tkáňové kultury s 24 vyhloubeními— při teplotě 37—°C a—prostředí s 5 oxidu—uh-l-i-č-i-téhotak dlouho, až se na 60 až 80 % vytvořila spojitá vrstva buněk. Použité prostředí závisí na zvolené buněčné linii, Eaglovo živné prostředí s 10 % fetálního séra skotu, modifikované podle Dulbecca a obsahující 50 mg/ml penicilinu G a střeptornyčinu bylo užito pro Henleho buňky, kdežto prostředí RPMI 1640 s 10 % fetálního séra skotu a 50 mg/ml penicilinu G a streptomycinu bylo užito pro pěstování buněk CaCo-2. Nejméně 3 hodiny před stanovením se živné prostředí odstraní a buněčný materiál se dvakrát promyje vyváženým Hankovým roztokem solí HBSS s obsahem hořčíku a vápníku. Vrstvy buněk se pak převrství růstovým prostředím bez obsahu antibiotik.

Pro sledování adhese se bakterie připraví následujícím způsobem. V případě pomalu rostoucích střevních bakterií například Campylobacter a Helicobacter se bakteriální kultura zředí na optickou hustotu 0D_g25 ^s hodnotou 0,1 čerstvým, předem vyváženým živným prostředím a pak se užije pro stanovení. V případě Shigella a dalších rychle rostoucích střevních bakterií se kultura zředí na hodnotu 0,17 optické hustoty 0D_g25 čerstvým, předem vyváženým prostředím a pak se užije ke zkouškám. Bakterie se přidají ke kulturám epitheliálních buněk v množství 10 bakterií na jednu buňku, aby nedošlo k nasycení. Počet bakterií se vypočítá na základě stanoveného počtu buněk na plotnách. Po styku kultury 2 hodiny v přítomnosti 5 % oxidu uhličitého v případě Campylobacter • » • «

- 45 a 30 minut v případě Shigella se nenavázané bakteire odstraní promytím HBSS a pak se vrstva buněk rozruší působením 0,1% deoxycholátu a nanese se na plotny pro stanovení míry adhese.

Vliv teploty na adhesi na buňky INT-407 v případě C. jejuni 81-176 v případě běžného pěstování nebo pěstování podle vynálezu podle příkladu 5 je shrnut v tabulce 3.

Rozdíly v adhesi několika kmenů C. jejuni při běžném pěstování nebo při pěstování způsobem podle vynálezu jsou shrnuty v tabulce 4.

Adhese v procentech je vyjádřena jako počet jednotek pro tvorbu kolonií CFU, izolovaných z vrstvy buněk a dělený počtem CFU, naočkovaným do vrstvy buněk, xlOO.

Tabulka3

Vliv teploty na adhesi běžně pěstovaných (BHI) buněk C. jejuni nebo pěstovaných podle vynálezu (ENHANCED) na buňky INT-407 adhese v % teplota _BHI ENHANCED °C 5,5 62,3 °C

5,5

11,2

- 46 Tabulka 4

Zvýšení adhese (v násobcích původní hodnoty) na INT-407 pro různé kmeny C. jejuni, pěstované běžným způsobem (BHI) nebo způsobem podle vynálezu (ENHANCED) kmen BHI ENHANCED

81-176____________

81-116

HC

1,0__ 8.4

1,0 12,5

1,0 28,2

Při zkouškách na invasivnost byly epitheliální buňky pěstovány stejně jako svrchu v případě zkoušek na adhesi.

K buněčnému materiálu byly přidány bakterie, pěstované běžným způsobem nebo způsobem podle vynálezu, bylo užito 10 bakterií na jednu buňku, aby nedošlo k nasycení. Počet bakterií byl vypočítán na základě stanovené hustoty buněk na plotnách. Po 2 hodinách infekce při koncentraci 5 % oxidu uhličitého v případě Campylobacter nebo 30 minut v případě Shigella, byly bakterie odsáty a buněčný materiál byl převrstven růstovým prostředím s obsahem gentamycinu k usmrcení všech bakterií, nacházejících se mimo buňky. Zůstaly proto pouze bakterie, které již pronikly do epitheliálních buněk. Tyto buňky byly pěstovány v případě infekce C. jejuni ještě 3 hodiny v přítomnosti oxidu uhličitého a v případě Shigella ještě 1,5 hodiny. Vrstvy buněk pak byly promyty HBSS k odstranění antibiotika a rozrušeny přidáním 0,1% deoxycholátu. Pak byly spočítány bakterie v získaném materiálu a invazivnost byla vyjádřena v procentech po srovnání počtu bakterií, odolných proti gentamycinu ve srovnání s počtem naočkovaných bakterií.

• · • ·

- 47 Invasivnost se vyjadřuje v procentech po stanovení počtu jednotek pro tvorbu kolonií CFU z vrstvy buněk po působení antibiotika, děleno počtem CFU, naočkovaných do vrstvy buněk, násobeno 100.

Účinek teploty na invasi buněk C. jejuni 81-176 při běžném pěstování nebo při pěstování podle příkladu 5 do buněk INT-407 je znázorněn v tabulce 5.

Rozdíl v invasivnosti pro buňky INT-407 pro několik kmenů C. jejuni, pěstovaných běžným způsobem nebo způsobem podle vynálezu je shrnut v tabulce 6.

Vliv DOC na adhesi a invasi do buněk INT-407 je pro buňky C. jejuni 81-176, pěstované způsobem podle vynálezu podle příkladu 5 nebo běžným způsobem uveden v tabulce 7.

Vliv DOC na adhesi a invasi do buněk INT-407 je pro buňky Shigella, pěstované běžným způsobem nebo způsobem podle příkladu 5 shrnut v tabulce 8.

Tabulka 5

Vliv teploty na invasi do buněk INT-407 pro C. jejuni 81-176 při pěstování běžným způsobem (BHI) nebo způsobem podle vynálezu (ENHANCED) teplota invasivnost v %

BHI ENHANCED

2,5

4,0

49,5

7,1 • · • · · ·· · ···· • ··· · · · ···· · • · ··· ···

- 48 Tabulka 6

Zvýšení (násobky základní hodnoty) invasivity do buněk INT-407 pro různé kmeny C. jejuni, pěstované běžným způsobem (BHI) nebo způsobem podle vynálezu (ENHANCED) kmen BHI ENHANCED ___81-176___ _____ 1,0 9,2_____

81-116 1,0 10,0

HC 1,0 26,7

T a b u 1 k a 7

Vliv koncentrace DOC na adhesi a invasi do buněk INT-407 pro C. jejuni81-176, pěstovaný běžným způsobem (BHI) nebo způsobem podle vynálezu (ENHANCED)

pěstování	adhese (%)	invase
BHI	9,3	6,3
ENHANCED, 0,025 % DOC	18,3	17,4
ENHANCED, 0,1 % DOC	52,6	37,0

Tabulka 8

Vliv DOC na invasi a adhesi S. flexneri do buněk INT-407 v procentech při běžném pěstování (BHI) nebo pěstování podle vynálezu ENHANCED • · vlastnost

BHI adhese invase

1,0

1,0

ENHANCED

140,0

94,4 a

Bylo izolováno větší množství bakterií, než bylo použito na počátku vzhledem k růstu bakterií v průběhu pokusu.

Jak je zřejmé z tabulek 4 a 6, bylo možno přidáním žluči nebo deoxycholátu do živného prostředí podstatně zvýšit adhesi a invasi do buněk INT-407 v případě několika lidských izolátů C. jejuni, 81-116, 81-176 a HC. Nejúčinnější dávka DOC byla 0,1 %, jak je zřejmé z tabulky 7. Nejvyššího účinku bylo dosaženo při teplotě 37 °C a nikoliv při teplotě 42 °C, při níž se Campylobacter obvykle pěstuje, jak je zřejmé z tabulek 3 a 5.

Z tabulky 8 je zřejmé, že obdobné výsledky byly získány i pro Shigella flexneri, u níž bylo možno při pěstování způsobem podle vynálezu podstatně zvýšit adhesi i invasi.

Všechny údaje prokazují, že způsobem podle vynálezu je možno podstatně zvýšit invasivitu i adhesi u pathogenních střevních bakterií.

Příklad 29

K průkazu zkřížené reaktivity byla užita rychlá aglutinační zkouška na sklíčku. Kmeny C. jejuni, pěstované způsobem podle vynálezu podle příkladu 5 nebo běžným způsobem byly uvedeny do styku s IgG ze séra zvířat, imunizovaných C. jejuni 81-176 (Lior 5) po běžném pěstování nebo pěstování například podle příkladu 5.. Protilátky IgG byly ««

- 50 imobilizovány na latexových kuličkách, opatřených povlakem bílkoviny A. V případě, že existují zkříženě reaktivní epitopy mezi zkoumaným serotypem a protilátkami, vytvořenými proti serotypu Lior 5, dojde k téměř okamžité tvorbě buněčných shluků, to znamená k aglutinaci. Toto shlukování se hodnotí po krátké době v průběhu reakce při použití stupnice 0-až 3, kde 0 znamená, že není možno pozorovat shlukování a 3 znamená vysoký stupeň aglutinace. Výsledky jsou pro čtyři použité kmeny shrnuty v tabulce 9. “

V tabulce 9 je ze shrnutých výsledků pro čtyři serotypy Lior (L5, L2, L8, L21) možno usoudit na zkříženou reaktivitu s protilátkami, které byly imunizovanými živočichy produkovány po imunizaci C. jejuni 81-176 Lior serotyp L5 po pěstování způsobem podle vynálezu. Sliz, vypláchnutý ze střev králíků, infikovaných C. jejuni 81-176 a obsahující IgA reagoval s 8 z 10 hlavních klinických serotypů, to znamená lidských pathogenů C. jejuni po pěstování způsobem podle vynálezu, šlo o serotyp Lior 5, jak je také uvedeno v další tabulce 16. Výsledky prokazují, že způsobem podle vynálezu je možno podstatně zvýšit počet serotypů Lior, u nichž bude možno prokázat zkříženou reaktivitu s antisérem živočichů, kteří byli imunizovány kmenem C. jejuni, serotypem Lior 5.

Také v případě bakterií z čeledi Shigella bylo možno v případě pěstování způsobem podle vynálezu prokázat zkří-. ženou reaktivitu pro protilátky IgG z živočichů, imunizovaných kmenem Shigella flexneri 2457T, pěstovaným v přítomnosti DOC.

·· ·· ·· • · · · · ··· · · · ···· • · ··· · · · ···· · ······ ··· ···· ·· ·· ···· ·· ··

- 51 Tabulka 9

Zkřížená reaktivita serotypů Lior, pěstovaných běžným způsobem (BHI) nebo způsobem podle vynálezu (ENHANCED)

Kultura	podmínky pěstování	kuličky	reaktivita
81-176 (L5)	BHI	Anti-BHIa	1
II	II	Anti-ENHb	2
VI	ENHANCED	Anti-BHI	2
IV	II	Anti-ENH	2.5
L2	BHI	Anti-BHI	1
II	II	Anti-ENH	1.5
II	ENHANCED	Anti-BHI	0
II	II	Anti-ENH	1.5
L8	BHI	Anti-BHI	2
II	II	Anti-ENH	1
II	ENHANCED	Anti-BHI	1
II	II	Anti-ENH	2.5
L21	BHI	Anti-BHI	0
II	II	Anti-ENH	2
II	DOC	Anti-BHI	0
II	11	Anti-ENH	2
prostředí	BHI	Anti-BHI	— o
	II	Anti-ENH	0

protilátky, vyvolané kmenem 81-176 při běžném pěstování protilátky, vyvolané kmenem 81-176 při pěstování způsobem podle příkladu 5.

99 «· ·· '9 9 · 9 · · 9 9-9 9

999 9 9 9 9999 9

99*999 999

9999 99 99 9999 99 99

- 52 V příkladech 30 a 31 jsou uvedeny údaje, týkající se účinnosti vakcíny podle vynálezu.

Příklad 30

Pro výzkum pathogenese Campylobacter je možno použít modelové postupy na fretkách, kterými je možno vyhodnotit účinnost vakciny při ochraně fretek proti kolonizaci a/nebo onemocnění, U fretek totiž dochází ke vzniku několi-_ ka příznaků onemocnění, které jsou totožné s příznaky, vyvolanými tímtéž onemocněním u člověka.

samců fretek ve stáří 7 až 9 týdnů bylo imunizováno perorálně PBS (kontrola) nebo formaldehydem fixovaným kmenem C. jejuni 81-176, pěstovaným za běžných podmínek (BHI) nebo způsobem podle příkladu 5 (ENHANCED). Pak bylo odebráno sérum, aby bylo možno stanovit základní titry IgG. Všechny vakciny i PBS byly podávány spolu s pomocným prostředkem LT celkem dvakrát v intervalu jednoho týdne, to znamená ve dni 0 a 7. Po jednom týdnu, ve dni 14 bylo odebráno sérum ke stanovení titru protilátek IgG. Čtyři týdny po vakeinaci byly fretky anestetizovány směsí promazinu a ketaminu, načež jim bylo perorálně podáno 10 ml PBS s obsahem 1 x 10^x CFU C. jejuni 81-176. Pak byla zvířata denně sledována na výskyt průjmu, výskyt Campylobacter v krvi a stolici, byly sledovány změny hmotnosti, okultní krvácení a množství bílých krvinek ve stolici. Bakterie v krvi byly stanoveny odebráním 1 až 2 ml krve z jugulární žíly anestetizovariých fretek s následným pěstováním odebraného vzorku na vzduchu v sojovém bujónu s tryptikázou. Kultury pro pěstování na agarových plotnách byly odebrány 2, 5 a 7 dnů po pokusné infekci. Vzorky séra byly odebrány před imunizací, týden po druhé imunizaci a v okamžiku pokusné infekce a pak ještě týden po této infekci ke stanovení titru IgG.

·· ·· »· ·· • · · · · ·· · • · · · · · ······ · « • · · · · · ··«· ·· ·· ···· ·· «· « · · · • · ·· » · · · · • · · tr *·

- 53 Okultní krvácení bylo stanoveno ze vzorku stolice při použití prostředku Hemacult. Leukocyty byly stanoveny tak, že stolice byla nanesena na sklíčko a zbarvena methylenovou modří. Mimoto byla přítomnost Campylobacter ve stolici stanovena pěstováním nátěrů ze stolice na plotny, obsahující živné prostředí, selektivní pro Campylobacter a tvořené sojovým agarem s tryptikázou a s obsahem 5 % ovčí krve, trimethoprimu, vancomycinu, polymyxin B, cephalothinu a amphotericinu B (Reme1, Lenexa, KS). Výsledky uvedených pokusů jsou shrnuty v následujících tabulkách 10 a 11.

Tabulka 10

Ochrana fretek proti C. jejuni 81-176 očkováním vakcina positivní kolonizace onemocnění*³ o Q, dnů po infekci

PBS 6/6

BHI 0/6

ENHANCED 0/5°

1/6

2/6

0/6 počet pozitivně kolonizovaných z počtu zvířat.

Projevy: zelený sliz a vodnaté stolice.

Jedno z pokusných zvířat uhynulo před stanovením, zda došlo ke kolonizaci.

) • · φ φ • · · ► · φ * · φ

- 54 Tabulka 11

Titr IgG v séru fretek (geometrický průměr)

Φ* skupina základní hodnota týden po při pokusné týden po očkování infekci infekci

	PBS	- 6,4	4,9	6,4	1380,4
---;-----	_____ BHI	6,4	94,0	94,0	26505,3
	ENHANCED	6,8	234,4	1621,8-	5-62-34-^1-

Průměrný titr pro 5 přežávajících zvířat.

Z tabulky 10 je zřejmé, že zvířata, imunizovaná usmrcenou vakcinou s neporušenými buňkami podle vynálezu jsou chráněna proti kolonizaci i proti onemocnění. Z údajů, uvedených v tabulce 11 vyplývá, že při použití vakciny podle vynálezu je možno dosáhnout daleko vyššího titru protilátek IgG než při použití vakciny, připravené ze střevních bakterií, pěstovaných běžným způsobem (BHI).

Výsledky tedy prokazují, že při použití vakciny podle vynálezu je možno dosáhnout imunogenity (tabulka 11) a ochrany proti infekci (tabulka 10), které jsou výhodnější než po očkování pokusných zvířat bakteriemi, pěstovanými běžným způsobem. „Bakterie, jejichž antigenita byla zvýšena způsobem podle vynálezu, jsou tedy vhodné pro použití k vacinaci savců na ochranu proti infekci.

Příklad 31

U myší obvykle nedochází ke vzniku infekce Campylobacter nebo Shigella jako u fretek, avšak myší je možno ···· ·«·· ···· • · .· · · · · · · · · '· ··· · · · · · · · · • · · · β · ··· • · · · ·· ·· ···· ·· β ·

- 55 použít k průkazu odolnosti proti kolonizaci střev po perorálním podání bakterií imunizovaným zvířatům nebo k průkazu odolnosti myší proti plicnímu onemocnění při plicní infekci imunizovaných zvířat. Model infekce u myší po infekci nosní sliznicí může být použit k předpovědi účinnosti vakciny u jiných živočichů nebo u lidí. Postup byl popsán v publikaci Mallet a další, Vaccine, 11, 190 až 196, 1993.

Skupina deseti myších samic Balb/c ve stáří 16 týdnů byla perorálně imunizována při použití PBS, běžně pěstovaným C. jejuni (BHI) nebo C. jejuni, pěstovaným způsobem podle příkladu 5 (ENHANCED), použitá dávka byla 10⁷ CFU nebo 10⁹ CFU. Pak byla vyvolána pokusná infekce. Titry IgA ze střevního slizu v každé ze skupiny byly stanoveny zkouškou ELISA a jsou shrnuty v následující tabulce 12.

Tabulka 12

9

Titr IgA po peroralni imunizaci 10 nebo 10 CFU Campylobacter u myší, šlo o vakcinu s neporušenými buňkami

Imunizace tritr IgA vysoký titr (%)

PBS	23	14
ENHANCED (10?)	114	75
ENHANCED (109)	78	75
BHI (107)	40	25
BHI (109) -	32	12

Titr, získaný vymytím střev u každé skupiny myší, šlo o IgA proti C. jejuni.

Množství zvířat, u nichž konečný titr převyšuje průměr pro. zvířata, očkovaná PBS o 2 standardní odchylky.

• ·

- 56 Z tabulky 12 je zřejmé, že zvířata, imunizovaná bakteriemi, pěstovanými způsobem podle vynálezu mají vyšší titr střevních protilátek IgA než zvířata, která byla imunizována bakteriemi, pěstovanými běžným způsobem.

Příklad 32

Mechanismus zvýšení množství antigenu nebo produkce pozměněného antigenu působením DOC _________

Podle výsledků, které byly získány v průběhu různých zkoušek je možno prokázat, že deoxycholát DOC má pravděpodobně při ovlivnění antigenity střevních bakterií dvojí úči nek. Jeden z těchto účinků je patrně zprostředkován působením vápníku vzhledem k tomu, že DOC váže vápník a tím snižu je jeho koncentraci v prostředí. V případě, že se C. jejuni 81-176 pěstuje v případě chelatačního činidla BAPTA/AM, avšak bez DOC, invazivnost pro buňky INR-407 se zvýší přibližně desetkrát, jak je zřejmé z tabulky 13. V případě, že se do živného prostředí přidá pouze BAPTA/AM, nedojde ke zvýšení zkřížené reaktivity.

Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce 13, byly získá ny pěstováním C. jejuni podle příkladu 5 s tím rozdílem, že místo 0,1 °/o DOC bylo použito 25 mikroM BAPTA/AM. Zkoušky na invazivnost byly provedeny podle příkladu 28.

Tabulka 13

Invaze buněk INT-407 organismem C. jejuni, pěstovaným běžným způsobem BHI nebo s BAPTA/AM kmen BHI BAPTA/AM

C. Jejuni 81-176 3,0 36,9 • · • · • · « · · · 4 • · 4 »« · ·

- 57 Některé bakterie, jejichž antigenitu je možno zvýšit nebo pozměnit působením žluči nebo žlučových solí, například DOC, jako jsou Campylobacter, Shigella nebo Helicobacter, mají geny, které jsou homologní s geny Yersinia pro reakci na nízkou koncentraci vápníku (lcr). Je známo, že tento gen řídí virulencí Yersinia v závislosti na snížené koncentraci vápníku. Dva geny Campylobacter, které se účastní exprese flagellinu a struktur, jichž je zapotřebí pro invazi (flaA, flbA)_jsou z Části rovněž řízeny _lcr___E-ři—analýze—ohován-í—— mutant Campylobacter flaA a flbA, pěstovaných běžným způsobem nebo způsobem podle vynálezu bylo zjištěno, že invaze je závislá na koncentraci vápníku, což však neplatí pro vazbu červeni Kongo nebo pro zvýšení zkřížené reaktivity, jak je zřejmé z tabulky 14.

Výsledky z tabulky 14 byly získány při použití C. jejuni, pěstovaného za běžných podmínek nebo způsobem podle příkladu 5. Zkoušky na invazivnost byly provedeny způsobem podle příkladu 28.

Tabulka 14

Invaze buněk INT-407 mutantami C.jejuni při pěstování běžným způsobem (BHI) nebo způsobem podle vynálezu (ENHANCED) kmen BHI ENHANCED

c.	jejuni	81-176	3,5	40,8
c.	jejuni	flaA	0,05	0,05
c.	jejuni	flbA	0,01	0,04

Mutanty C. jejuni flaA a FlbA reagují na přítomnost DOC v průběhu růstu zvýšenou vazbou na červeň Kongo a vyšší

- 58 zkříženou reaktivitou v případě pěstování za přítomnosti DOC, jak je zřejmé z tabulky 15 a z obr. 6. Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce 15 a znázorněny na obr. 6, byly získány při použití C. jejuni za běžných podmínek pěstování nebo při pěstování způsobem podle vynálezu podle příkladu ř. Zkoušky na vazbu červeni Kongo, jejichž výsledky jsou uvedeny v tabulce 15, byly prováděny podle příkladu 26. Zkoušky na zkříženou reaktivitu, jejichž výsledky jsou znázorněny na obr.—6, byly^-prováděny podTe-příkladu^-29/ '

Tabulka 15

Vazba červeni Kongo mutantami C. jejuni, pěstovanými běžným způsobem (BHI) nebo způsobem podle vynálezu (ENHANCED) kmen BHI ENHANCED

c.	jejuni	81-176	0,07	1,68
c.	jejuni	flaA	0,10	1,60
c.	jejuni	flbA	0,12	0,80

Mutanta flaA není schopna vytvářet flagellin. Dvojitá mutanta flaA-flbA i mutanta flaA (C. Grant, NIH) jsou neinvazivní mutanty i po působení DOC, což prokazuje, že pro invazivnost je nezbytný flagellin. Je zajímavé, že při běžné úrovni^ zkřížené reaktivity mezi isogenickými kmeny, z nichž byly připraveny tyto mutanty a některými dalšími serotypy Lior C. jejuni (nejde o reaktivitu, vyvolanou působením DOC) není u těchto mutant možno zkříženou reaktivitu prokázat. Při působení DOC je však možno i u těchto mutant, nevytvářejících flagellin vyvolat zkříženou reaktivitu a také vazbu na červeň Kongo.

• · ··· · · · ·· ♦ · ··· · · · · · · · « ········· ···· ·· ·· ···· ·· ··

- 59 Tyto výsledky prokazují, že přítomnost DOC v živném prostředí upravuje funkce střevních bakterií, spojené s virulencí, a to jak funkce, závislé na koncentraci vápníku, například invazivnost, tak funkce, které nejsou na koncentraci vápníku závislé, například vazbu červeni Kongo. Je dále pravděpodobné, že zvýšená zkřížená reaktivita a vazba červeni Kongo, vyvolané působením DOC jsou alespoň z části nezávislé na přítomnosti fragellinu.

Příklad 33

DOC zvyšuje zkříženou reaktivitu mezi serotypy C. jejuni

Zkřížená reaktivita Campylobacter jejuni, zvýšená způsobem podle vynálezu byla sledována při použití rychlé aglutinační zkoušky na sklíčku. Při zkoušce byl použit střevní sliz imunizovaných a neimunizovaných králíků ke stanovení výsledků pěstování organismu za různých podmínek a zejména vlivu tohoto pěstování na zkříženou reaktivitu mezi heterologními kmeny Campylobacter. Králíci byli imunizováni živými organismy C. jejuji 81-176, pěstovanými běžným způsobem. Aglutinační účinnost protilátek ze slizu byla zkoumána proti 24 kmenům Campylobacter včetně 18 serotypů, pěstovaných jak běžným způsobem v prostředí BHI-YE, tak způsobem podle vynálezu podle příkladu 5.

Výsledky uvedených zkoušek prokazují, že zkřížené shlukování buněk v případě heterologních kmenů Campylobacter bylo širší a v řadě případů silnější při použití kmenů, pěstovaných způsobem podle vynálezu ve srovnání s kmeny, pěstovanými běžným způsobem. Zejména šlo o dvojnásobné zvýšení heterologní aglutinační reaktivity. Šest z 24 heterologních kmenů, pěstovaných běžným způsobem vyvolávalo aglutinaci slizu s protilátkami proti kmenu 81-176 na úrovni +: nebo vyšší, kdežto 14 z týchž 24 kmenů vyvolávalo po pěstování v přítomnosti DOC • · · · · »

- 60 aglutinaci na úrovni + nebo vyšší. Mimoto 18 z těchto kmenů mělo při běžném pěstování aglutinaci slabou (±) nebo žádnou, kdežto 11 z týchž kmenů mělo zvýšenou aglutinační odpověď při pěstování v přítomnosti DOC.

V tabulce 16 je shrnuta zkřížená reaktivita slizu králíka, imunizovaného proti kmenů 81-176 proti 19 heterologním serotypům Lior, šlo o 22 kmenů, pěstovaných běžným způsobem v prostředí BHI-YE nebo pěstovaných podle příkla-— du 5. I když tento pokus zahrnuje pouze některé známé serotypy Lior, výsledky prokazují, že způsobem podle vynálezu je možno vyvolat zkříženou reaktivitu mezi serotypy Lior. Tyto výsledky dále prokazují, že antigeny, vyvolané nebo zesílené působením DOC u Campylobacter jsou důležité pro sekre torickou odpověď typu IgA, spojenou s odolností proti střevním infekcím, vyvolaným Campylobacter.

Je nutno dále uvést, že kmeny serotypu Lior 8 náleží k odlišné čeledi, Campylobacter coli. Jeden ze dvou kmenů tohoto serotypu, VC167, vyvolává silnou aglutinaci 3+ slizu králíka, imunizovaného proti kmenu 81-176. Tento výsledek prokazuje, že vakcína, odvození od kmene C. jejuni, například od kmene Lior 5 nejen může zkříženě chránit proti heterologním serotypům, náležejícím k téže čeledi, avšak také proti některým kmenům jiných čeledí Campylobacter, například C. coli. Mimoto je také možno uvést, že serotypy Lior 1, 2, 4, 9 a 11 náležejí mezi ty serotypy, které ve světovém měřítku při vzniku onemocnění převažují. Pro všechny tyto serotypy bylo možno při svrchu uvedených zkouškách prokázat zkříženou reaktivitu.

• · • · ···*······· ······ ··· ’ ·«·»·· ♦ ····· ·« · ·

- 61 T a b u 1 k a 16

Aglutinace 20 serotypů Campylobacter, pěstovaných běžným způsobem (BHI-YE) nebo podle vynálezu (ENHANCED) králičím slizem, neimunním nebo imunním proti kmenu 81-176

Aglutinace⁰ ________ne imunní sliz_imunnísliz---—

kmen	Lior Serotvr	BHI-YE	ENHANCED	BHT-YE	ENHANCED
134	1	-	-	-	++
195	2	-	-	-	+
1	4	-	-	-	+++
170	5	-	-	+++	++++
81-176	5	-	-		++++
6	6	-	-	++++	+++
31-116	6	-	-	-u	++
35	7	-	-	-	+
52	8	-	-i-	+	++
VC-167	a	-		+	+++
VC-159	3	-	-	+	-
88	9	-	-		+
244	11	-	-		+++
556	17	-	-	+	-
563	13	-	-	. -	-
544	19	-		-	++
699	21	-	-	•R	++
1180	23	-	-	+	+++
1982	29	-	-	-	-
910	32	-	++	-	++ ’ .
2074	36	-	-		-
HC	36	-	+	-	+
2984	46	-	-	-	-
79171	72	—	—

i

- 62 Sliz s protilátkami proti kmenu 81-176 byl získán od králíků, infikovaných běžně pěstovanými živými bakteriemi C. jejuni 81-176.

Sliz bez protilátek byl získán z neinfikovaných králíků.

Aglutinace byla hodnocena podle stupnice negativní (-), velmi slabá (±) atd. až velmi silná (++++).

Příklad 34

Další zkoušky, potvrzující účinnost vakciny Campylobacter

Ochranný účinek neporušených buněk Campylobacter jejuni, pěstovaných způsobem podle vynálezu a fixovaných formaldehydem byl stanoven při použití modelu kolonizace myší podle publikace Baqar (Infect. and Immun., 63, 3731 až 3735, 1995).

Kmen C. jejuni 81-176 byl pěstován podle příkladu 5, buněčný materiál byl oddělen a inaktivován 0,075% formaldehydem svrchu uvedeným způsobem. Skupinám vždy pěti myších samic Balb/c ve stáří 6 až 8 týdnů byly perorálně podány tři dávky, podáno bylo vždy 0,25 ml PBS bez endotoxinu s obsahem 10 , 10 nebo 10 inaktivovaných bakterií, nebo byly podány tytéž dávky v kombinaci s 25 mikrogramy teplem inaktivovaného enterotoxinu z E. coli (LT). Dávky byly podány v intervalu 48 hodin a ihned potom byly podány v intervalu 15 minut dvě dávky 0,5 ml 5% roztoku hydrogenuhličitanu sodného o pH 8,5 k neutralizaci žaludeční kyseliny. Kontrolní zvířata byla očkována pouze při použití PBS nebo v kombinaci s pomocným prostředkem LT. Přibližně 28 dnů po podání třetí dávky byla očkovaná zvířata pokusně infikována do nosu nebo perorálně podáním přibližně 10 CFU živého,' běžně pěstovaného kmene C. jejuni 81-176. Doba do kolonizace,střev byla stanovena sledováním stolice každý den v průběhu 9 dnů. Materiál byl emulgován

- 63 ve sterilním PBS a podíly byly nanesena na plotny pro pěstování Campylobacter, obsahující agar s příměsí krve. Plotny byly inkubovány 3 až 5 dnů při teplotě 35 °C za mikroaerofilních podmínek (Campylobacter GasPak, BBL) tak, aby došlo k růstu C. jejuni. Výsledky kolonizace se vyjadřují jako procento pokusných zvířat, u nichž je možno prokázat přítomnost organismu v určitém dnu.

---Jak—je—zřejmé—z—obr?.—Ί,—všechna—zv-ířata-j—imunizovanái kontrolní, obsahovala okamžitě po pokusné infekci do nosu ve dni 1 organismy ve střevech. 80 až 100 % kontrolních zvířat obsahovalo tyto organismy i 9 dnů po infekci. Podstatně menší množství zvířat z očkované skupiny obsahovala mikroorganismy ještě devátý den. Stupeň kolonizace i doba vymizení mikroorganismů byla závislá na podaném množství vakciny.

Při podání nízkých dávek, 10 /dávka a středních dávek 10 /dávka došlo k postupnému a neúplnému vymizení mikroorganismu. Přítomnost pomocného prostředku zlepšila ochranu:v případě těchto dávek. Je překvapující, že při použití nejvyšší dávky 10 /dávka došlo v případě vakciny bez pomocného prostředku k úrovni ochrany, která byla totožná nebo ještě o něco dokonalejší než při podání téže dávky spolu s pomocným prostředkem LT.

Obdobných výsledků bylo dosaženo v případě, že byla zvířata po perorální vakcinaci infikována rovněž perorálně, jak je zřejmé z obr. 8. Tyto výsledky prokazují, že imunizace inaktivovanými bakteriemi Campylobacter, pěstovanými způsobem podle vynálezu je možno zajistit ochranu proti infekci živými bakteriemi, přičemž imunizace je účinná i při podání vakciny perorálně bez pomocného prostředku.

Byla také vyhodnocena účinnost ochrany při použití í neporušených buněk Campylobacter jejuni, pěstovaných způsobem podle vynálezu, například podle příkladu 5, buněčný meteriál byl podán intraperitoneálně IP po fixaci formaldehydem. Při těchto zkouškách byla skupina dvaceti myších sa10 9 mic Balb/c podána jediná dávka 1,3 x 10 , 2,5 x 10 ,

5,0 x 10 , 1,0 x 10 nebo 2,0 x 10 inaktivovaných bakterií C. jejuni v 0,5 ml PBS bez endotoxinu a bez pomocného prostředku. Zvířata byla pokusně infikována o 14 dnů později jedinou letální dávkou živých bakterií kmene C. jejuni 81-176, přibližně 1,0 x ΙΟ^θ CFU v PBS, prosté endotoxinu, dávka byla—po dána—xn-traperítoneálnět Zvřřata^-pak^- bylanšledována 4 dny a byla zaznamenávána úmrtnost zvířat.

Jak je zřejmé z tabulky 17, je jediná intraperitoneální dávka 5,0 x 10 inaktivovaných bakterií C. jejuni dostatečná pro vyvolání imunologické odpovědi, která chrání zvířata proti pokusné infekci živými bakteriemi C. Jejuni.

Tabulka 17

Ochrana IP podanou inaktivovanou vakcinou C. jejuni, připravenou způsobem podle vynálezu dávka úmrtnost ve dni počet

	1	2	3	4	přežívaj
1,3 x 1010	0	4	0	0	16
2,5 x 109	0	0	0	0	20
5,0 x 108	0	0	0	r 0	20
1,0 x 108	11	7	0	0	2
5,0 x 107	10	6	2	0	2
kontrola PBS	4	3	2	0	1

• ·

- 65 V následujících příkladech 35 a 36 budou uvedeny výsledky, získané při sledování zvýšení invazivnosti, vazby červeni Kongo a zkřížené reaktivity u čeledi Shigella při pšstování v přítomnosti DOC.

Příklad 35

Invazivnost bakterií čeledi Shigella, pěstovaných in vitro—je—ovlcivněna^-ze-jména^-v růstové fázi^-?^-Způsobem podle příkladu 28 byly podrobeny zkouškám na invazivnost buňky Shigella flexneri 2457T, pěstované běžným způsobem v prostředí BHI nebo způsobem podle vynálezu podle příkladu 9 v prostředí DOC-EL při odebrání buněk v časné log fázi kultury nebo rovněž podle příkladu 9, avšak při oddělení buněk až po dosažení pozdní log fáze. Výsledky, které jsou uvedeny na obr. 9 prokazují, že přítomnost DOC v živném prostředí zvyšuje invazivnost, přičemž nejvyššího zvýšení je dosaženo v průběhu časné'log fáze růstu.

Při pěstování v přítomnost DOC je možno zvýšit invazivnost i u jiných čeledí Shigella, jako S. sonnei a S. dysenteriae, jak je znázorněno na obr. 10. V případě polarizovaných epitheliálních buněk bylo možno pozorovat zvýšenou invazivnost Shigella pouze v případě, že buněčný materiál byl bakteriemi infikován basolaterálně. Toto zjištění je v souladu s postupem invaze, tak jak je pozorován in vivo.

Srovnávací zkoušky prokázaly, že invazivnost Shigella při pěstování způsobem podle vynálezu je přibližně lOx vyšší než v případě Shigella při pěstování způsobem podle publikace Pope a další, Infect. and Immun., 63, 3642 až 3648, 1995.

·· ·· ·· *· ·· • · · · · · · · · · · ········ ··«········» ······ ·· ···· ·· ·· ···· ··

- 66 Příklad 36

Shigella, pěstovaná způsobem podle vynálezu se také lépe váže na červeň Kongo. Byly provedeny zkoušky na vazbu tohoto barviva způsobem podle příkladu 26 při použití S. flexneri 2457T a S. sonnei, které byly pěstovány běžným způsobem v prostředí BHI nebo způsobem podle vynálezu podle pří kladu 9. Výsledky prokazují, že při pěstování v prostředí s obsahem DOCse zvýšípro uvedené dvě čeledi— Shi-gei-l-a— schopnost vázat červeň Kongo lOx až 20x, jak je uvedeno v tabulce 18.

Tabulka 18

Vazba červeni Kongo S. flexneri a S. sonnei po pěstování běžným způsobem (BHI) nebo podle vynálezu (ENHANCED) kmen BHI ENHANCED

Ξ. flexneri 2457T 0,04 0,44

S. sonnei 0,02 0,40

Shigella se dělí na čtyři čeledi a různé serotypy.

V případě Shigella flexneri byla po pěstování způsobem podle vynálezu zkoumána zkřížená reaktivita při použití aglutinační zkoušky z příkladu 28. Při zkoušce bylo použito antiserum imunizovaných králíků ke stanovení vlivu podmínek při pěstování na zkříženou reaktivitu různých čeledí Shigella. Králíci byli imunizováni kmenem Shigella flexneri 2457T, pěstovaným podle příkladu 9 a fixovaným formaldehydem. Aglutinační účinnost protilátek IgG z imunizovaných zvířat byla zkoumána proti všem čtyřem čeledím Shigella po pěstování v běžném pro středí BHI nebo podle vynálezu, například podle příkladu 9.

Výsledky aglutinačních zkoušek prokazují, že v případě růstu v přítomnosti DOC dochází k podstatnému zvýšení aglutinačního účinku homologní Shigella flexneri i v případě tří heterologních čeledí Shigella pro protilátky proti S. flexneri, jak je zřejmé z obr. 11.

Příklad 37 _

Účinnost vakciny Shigella

Ochranný účinek formaldehydem fixovaných neporušených buněk Shigella flexneri, pěstovaných způsobem podle vynálezu byl stanoven pomocí pokusné.infekce myší nosní sliznici způsobem podle publikace C. P. Mallett a další, Vaccine, 11,

190 až 196, 1993. Postup byl prováděn tak, že Shigella flexneri byla pěstována.a izolována způsobem podle příkladu 9 a inaktivována 0,075% formaldehydem jako v příkladu 30. Přibližně 10 inaktivováných bakterií bylo užito k vakcinaci myších samic Balb/c ve stáří 14 až 16 týdnů. Inaktivované bakterie S. flexneri byly uvedeny do suspenze ve sterilním PBS, prostém endotoxinu v koncentraci 10 /ml a 35 mikrolitů tohoto materiálu pak bylo podáno do nosu skupinám vždy po deseti lehce anestetizovaných zvířatech. V intervalech 14 dní byly takto provedeny tři imunizace.

Aby bylo možno dokázat vliv pomocných prostředků na ochranný účinek této vakciny, byly skupiny zvířat také imunizovány suspenzí, obsahující inaktivovanou vakcinu a mimoto 5 mikrogramů enterotoxinu E. coli LT, labilního při vyšší teplotě. 14 dnů po třetí imunizaci byla pokusná zvířata infiko5 vána do nosu subletální dávkou 10 CFU S. flexneri nebo S. sonnei. Bezprostředně před a 1, 2, 5 a 7 dnů po pokusné infekci byla zvířata zvážena a zaznamenána jejich střední hmotnost. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 19.

·«

- 68 Tabulka 19

Ochrana myší proti pokusné infekci živou S. flexneri nebo

S. sonnei pomocí inaktivované vakciny Shigella flexneri s obsahem neporušených buněk organismus _ očkování změna hmotnosti po infekci v % ve dnech ______1 2 5 7__

s.	flexneri	PBS vakcina	-8,1 -5,4	-18,2 - 2,9	-17,7 - 2,5	-18,3 - 1,6
		vakcina + LT	-7,0	-2,0	-1,5	-1,5
s.	sonnei	PBS	-8,1	-17,5	-9,3	-6,4
		vakcina	-6,7	-11,3	-6,5	-6,0
		vakcina + LT	-6,4	-5,2	-1,3	-2,1

Očkování bylo provedeno tak, že deset myší v každé skupině bylo imunizováno třikrát na nosní sliznici při po7 užití vakciny, obsahující 10 inaktivovaných bakterií S. flexneri, vypěstovaných podle příkladu 9.

Myši, imunizované vakcinou s obsahem inaktivované S. flexneri byly chráněny proti pokusné infekci živými bakteriemi S. flexneri. Tyto myši ztratily méně nosné hmotnosti a rychleji se zotavily ve srovnání s neočkovanými zvířaty kontrolní skupiny, kterým byl podán pouze PBS. Je překvapující, že vakcina proti S. flexneri chránila myši také proti pokusné infekci živými bakteriemi S. sonnei. Je zajímavé, že proti homolognímu kmeni S. flexneri byla stejně dobře chráněna • · ··· · · · ···· ··· · · · ·· ···· ·· ·· ···* ·· ··

- 69 pokusná zvířata, jimž byla podána vakcína bez pomocného prostředku jako zvířata, jimž byla podána vakcína, doplněná pomocným prostředkem. Vakcína proti S. flexneri poskytovala ochranu rovněž proti heterologní infekci S. sonnei. V tomto případě však přidání pomocného prostředku LT podstatně zvýšilo ochranný účinek proti infekci S. sonnei. Tyto výsledky prokazují, že vakcína, obsahující inaktivované bakterie Shigella, vypěstované způsobem podle vynálezu je účinná na uznávaném modelu infekce tímto mikroorganismem, přičemž ne-_ vyžaduje přítomnost pomocného prostředku.

Příklad 38

Faktory, které mohou ovlivnit přilnutí H. Pylori k živočišným buňkám

Lnutí H. pylori k buňkám napadeného organismu je možno zvýšit pěstováním; uvedeného organismu v přítomnosti glykocholátu nebo žluči. Buňky kmene H. pylori NB3-2 nebo Gl-4 byly přidány do bujónu BHI, obsahujícího 4 % telecího séra. Po naočkování byly lahve propláchnuty plynnou směsí s obsahem. 10 % oxidu uhličitého, 5 % kyslíku a 85 % dusíku a inkubovány 22 hodin za protřepávání při teplotě 37 °C. Po této inkubaci byla kultura zředěna v poměru 1 : 10 v lahvi, obsahující 1 litr prostředí BHI s obsahem 4 % telecího séra a různými koncentracemi hovězí žluči v rozmezí 0,025 až 0,2 %. Lahve byly propláchnuty stejnou plynnou směsí jako svrchu a inkubovány při teplotě 37 °C. Buněčný materiál byl izolován v různých časových intervalech až do 18 hodin a byla sledována přilnavost materiálu k buňkám INT-407 způsobem podle příkladu 28. Výsledky prokazují, že při pěstování spolu se žlučí se zvýší přilnavost H. pylori k uvedeným buňkám, jak je zřejmé z obr.

á 13. V případě kmene NB3-2 je možno dosáhnout nejvyšší, až 6-násobné přilnavosti v.e srovnání s běžným způsobem pěstovanými kulturami po 8 hodinách růstu, jak je zřejmé z • ·

- 70 obr. 12. V případě kmene Gl-4 je možno nejvyšší, 2 až 3-násobné přilnavosti ve srovnání s běžnou kulturou dosáhnout mezi 12 až 14 hodinami pěstování v přítomnosti 0,2 % žluči, jak je zřejmé z obr. 13. Uvedení časové intervaly odpovídají době, po které se buněčný materiál nachází v růstové log. fázi.

Příklad 39

Účinnost vakciny Helicobacter při pěstování způsobem podle vynálezu

Ochranný účinek formaldehydem fixovaných neporušených buněk Helicobacter pylori, pěstovaných způsobem podle vynálezu byl stanoven při použití modelu pro kolonizaci žaludku Helicobacter felis, popsaného v publikaci Chen a další, Lancet, 339, 1120 až 1121, 1992. Helicobacter pylori kmen Gl-4 byl pěstován:jako očkovací kultura přibližně 22 hodin při 37 °C ve směsi 10 % oxidu uhličitého a 90 % vzduchu v prostředí BHI s obsahem 4 % telecího séra. Pódii této kultury pak byl použit k naočkování lo-násobného objemu téhož prostředí s obsahem 0,1 % objemových hovězí žluči. Po 12 až 14 hodinách pěstování při 37 °C byl buněčný materiál oddělen odstředěním a znovu uveden do suspenze v 1/10 původního objemu Hankova vyváženého solného roztoku HBSS při teplotě místnosti. Pak byl buněčný materiál opět oddělen odstředěním a znovu uveden do suspenze v 1/100 původního objemu HBSS K suspenzi buněk s obsahem pufru byl přidán formaldehyd do koncentrace 0,075 % a buněčný materiál byl inaktivován míchá ním suspenze 6 hodin při teplotě místnosti s následným ochla zením na 4 °C na dobu 18 hodin.

Schopnost této vakciny chránit proti pokusné infekci byla stanovena podáním tří dávek této -inaktivované vakciny φ· ·· ·· ·· ·· ·· ···· · · · · · · · · ··· ·· · · · · · ······ ·· ··· · · · ·· · · · ··· ···· ·· ·· ···· «· ··

- 71 perorálně myším samicím Balb/c, prostým Helicobacter, ve stá ří 6 až 8 týdnů ve dnech 0, 7 a 14 nebo ve dnech 0, 7 a 21. Byly užity dávky 10 bakterií, mimoto byla použita tatáž vak cina s přídavkem pomocného prostředku LT. 14 dnů po třetím očkování byla zvířata pokusně infikována jedinou dávkou živých bakterií H. felis, bylo užito 10 CFU/dávka.

Dva týdny po pokusné infekci byla zvířata usmrcena a segmenty antra žaludku byly analyzovány na účinnost ureázý ke stanovení přítomnosti H. felis. Účinnost ureázy byla stanovena inkubací vzorků tkáně v 0,5 ml Stuartova bujónu s ure ázou (Remel) při teplotě místnosti 4 až 24 hodin. Barevná změna z čirého roztoku na červeném zbarvení v průběhu tohoto časového období se považuje za pozitivní výsledek.

Jak je zřejmé z tabulky 20, je možno podáním vakcíny s obsahem neporušených- buněk H. pylori, kmene Gl-4, pěstovaných způsobem podle vynálezu chránit živočichy proti perorál ní infekci H. felis.

Tabulka 20

Ochrana proti infekci Helicobacter vakcinou s obsahem inaktivovaných buněk H. pylori, pěstovaných podle vynálezu

Imunizační organismus počet ochrana činidlo⁵ 10⁷ CFU kolonizovaných⁰

Pokus 1

H. pylori13	H.	felis	4/13
PBS+LT	H.	felis	9/9
Pokus 2
H. pylori13	H.	felis	2/15
PBS+LT	H.	felis	10/10

*· *· ·· ·· ·· ·· • * · · · · · · f> · · · • · · · · · · · ·· • ♦ · « · · · · «·· · · ······ ··· ···· ·· 99 ···· «· ·· všechna činidla byla podána s 10 mikrogramy LT jako pomocným prostředkem ve třech perorálních dávkách v intervalech 7 dnů

Q bylo podáno 1 x 10 CFU kmene Gl-4 v objemu 0,25 ml.

je uvedeno množství kolonizovaných zvířat/množství všech pokusných- zvířat.

Výsledky těchto pokusů prokazují význam zvýšení svrchu uvedených vlastností střevních bakterií pro imunogenitu těchto bakterií in vivo.

Je zřejmé, že způsobem podle vynálezu je možno získat bakterie, schopné vyvolat ochrannou imunogenní odpověď. Tyto bakterie je tedy možno využít k očkování.

Uložení mikroorganismu

Následující mikroorganismy byly uloženy ve veřejné sbírce kultur American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, pod následujícími přírůstkovými čísly:

Mikroorganismus číslo datum uložení

Helicobacter pylori HB3-2 29. 9. 1995

Helicobacter pylori Gl-4 29. 9. 1995

Je zřejmé, že by bylo možno navrhnout ještě celou řadu různých změn, variací a modifikací, rovněž spadající do oboru vynálezu. Uvedené údaje byly zařazeny pouze pro ilustraci a rozsah vynálezu na ně nemůže být omezen.

Claims (36)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob pěstování střevních bakterií se zvýšenými antigenními vlastnostmi, vyznačující se tím, že se bakterie ze skupiny Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Gastrospirillum sp., Enterobacter sp-. , Shigella sp . , Aeromonas sp . , Vibrio sp . , Clostridium sp., Enterococcus sp., Salmonella sp. a Escherichia coli pěstují in vitro za kombinace podmínek, a to

   a) v přítomnosti 0,05 až 3 % žluči nebo 0,025 až 0,6 % nejméně jedné žlučové kyseliny nebo její soli,

   b) při teplotě 30 až 42 °C,

   c) na vzduchu nebo za mikroaerofilních podmínek, přičemž mikroaerofilní podmínky zahrnují přítomnost směsi

   i.) 5 až 20 ? 'o C0₂ a 80 až 95 % vzduchu, ii) 5 až 20 ? 'o C0₂ a 80.až 95 % dusíku nebo iii) 5 až 10 ? 6 kyslíku, 10 až 20 % C0₂ a 70 až 85

   dusíku a

   d) v přítomnosti dvojvazného kationtového chelatačního činidla ze skupiny 0 až 100 mikroM BAPTA/AM, nebo 0 až 10 mM EGTA nebo 0 až 100 mikroM EGTA/AM, do časné růstové log fáze, do rozmezí mezi časnou log fází a stacionární fází nebo do stacionární fáze.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t i m , že se jako sůl žlučové kyseliny přidává deoxycholát nebo glykocholát.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyzn ač uj i c i s e tím, že se jako střevní bakterie pěstuje Campylobacter sp.

   • 9

   - 74
4. 4. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že se jako střevní bakterie pěstuje Campylobacter jejuni nebo Campylobacter coli.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačuj íc i se tím, že se pěstuje Campylobacter jejuni ze skupiny kmenů 134, 195, 170, 81-176, 6, 81-116, 35, 52, VC-167, 88, 244, 544, 699, 1180, 910 a HC.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se pěstuje Campylobacteri jejuni kmen 81-176 za podmínek, které zahrnují:

   a) přítomnost 0,1 % deoxycholátu jako soli žlučové kyseliny nebo 0,8 % žluči,

   b) teplotu přibližně 37 °C,

   c) přítomnost směsi 10 až 20 % θθ£ a 80 až 90 % vzduchu, kultura se pěstuje až do stacionární fáze.
7. 7. Způsob podle nároku 1, vyznačujíc i se tím, že se jako střevní bakterie pěstuje Shigella sp.
8. 8. Způsob podle nároku 7,vyznačuj ící se tím, že se jako střevní bakterie pěstuje Shigella species ze skupiny flexneri, sonnei, dysenteriae a boydii.
9. 9. Způsob podle nároku 8,vyznačující se t i m , že se pěstuje Shigella flexneri nebo Shigella dysenteriae.
10. 10. Způsob podle nároku 9,vyznačuj ící se t i m , že se jako Shigella flexneri pěstuje kmen 2457T za podmínek, které zahrnují:

    • ·

    - 75 a) přítomnost 0,1 % deoxycholátu nebo 0,8 % žluči,

    b) teplotu přibližně 37 °C,

    c) pěstování na vzduchu a kultura se pěstuje do časné log fáze.
11. 11. Způsob podle nároku 1, vyznačuj i c í se Jt_í_m_._ž_e_. se jako střevní bakterie pěstuje Yersinia sp.
12. 12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím , že se jako střevní bakterie pěstuje Escherichia coli.
13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že se pěstuje enterotoxický, enterohemorrhagický, enteropathogenní nebo enteroinvasivní kmen Escherichia coli.
14. 14. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako střevní bakterie pěstuje Vibrio sp.
15. 15. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se t i m , že se jako střevní bakterie pěstuje Salmonella sp.
16. 16. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se t i m , že se jako/střevní bakterie pěstuje Bacteriodes sp.
17. 17. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako střevní bakterie pěstuje Clostridium sp.
18. 18. Způsob podle nároku 1, vyznačuj íc i se tím , že se jako střevní bakterie pěstuje Enterococcus sp.
19. 19. Způsob podle nároku 1, vyznačujíc í se t i m , že se jako střevní bakterie pěstuje Klebsiella sp.

    • · • · • · ··· * · · · · ·· • · ··· 9 · 9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9 9 9

    9999 99 99 9999 99 99

    - 76
20. 20. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že se jako střevní bakterie pěstuje Enterobacter sp.
21. 21. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t i m , že se jako střevní bakterie pěstuje Gastrospirillum sp.
22. 22. Způsob pěstování střevních bakterií se zvýšenými antigenními 'vlastnostmi, vyznačující se tím, že se bakterie ze skupiny Campylobacter sp., Yersinia sp.,_

    Bacteroides sp., Klebsiella sp., Gastrospirillum sp., Enterobacter sp.,Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp.,

    Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. a Escherichia coli pěstují in vitro za kombinace podmínek, a to

    a) v přítomnosti dvojvazného kationtového chelatačního činidla ze skupiny 1,0 až 25 mikroM BAPTA/AM, 0,5 až 10 mM EGTA, přibližně 1,0 až 100 mikroM EGTA/AM,

    b) při : tep:lotě!30 až. 42 °C a

    c) na vzduchu nebo za mikroaerofilních podmínek, přičemž mikroaerofilní podmínky zahrnují přítomnost směsi

    i) 5 až 20 9 á C0₂ a 80 až 95 % vzduchu, ii) 5 až 20 9 á C0₂ a 80 až 95 % dusíku nebo iii) 5 až 10 9 6 kyslíku, 10 až 20 % C0₂ a 70 až 85 dusíku,

    až do časné růstové log fáze, do rozmezí mezi časnou log fází a stacionární fází nebo až do stacionární fáze.
23. 23. Střevní bakterie se zvýšenými antigenními vlastnostmi ze skupiny Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Gastrospirillum sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. a Escherichia coli, získatelné pěstováním střevních bakterií in vitro za kombinace podmínek, a to

    77 a) v přítomnosti 0,05 až 3 % žluči nebo 0,025 až 0,6 % nejméně jedné žlučové kyseliny nebo její soli,

    b) při teplotě 30 až 42 °C,

    c) na vzduchu nebo za mikroaerofilních podmínek, přičemž mikroaerofilní podmínky zahrnují přítomnost směsi

    i) 5 až 20 % CO2 a 80 až 95 % vzduchu, ii) 5 až 20 % C0₂ a 80 až 95 % dusíku nebo ίΐΐ~) 5^—až10~%—kysiLkui—10 až20—%—C0₂ a—70—až—85 % dusíku a

    d) v přítomnosti dvojvazného kationtového chelatačního činidla ze skupiny 0 až 100 mikroM BAPTA/AM, nebo

    0 až 10 mM EGTA nebo 0 až 100 mikroM EGTA/AM, do časné růstové log fáze, do rozmezí mezi časnou log fází a stacionární fází nebo do stacionární fáze.
24. 24. Střevní bakterie podle nároku 23, získatelné při použití deoxycholátu nebo glykocholátu jako soli žlučových kyselin.
25. 25. Střevní bakterie podle nároku 23, Campylobacter sp.
26. 26. Střevní bakterie podle nároku 25, Campylobacter jejuni nebo Campylobacter soli ze skupiny ze skupiny
27. 27. Střevní bakterie podle nároku 26, ze skupiny kmenů Campylobacter jejuni 134, 195, 170, 81-176, 6, 81-116, 35, 52, VC-167, 88, 244, 544, 699, 1180, 910 a HC.
28. 28. Střevní bakterie podle nároku 27, Campylobacter jejuni, kmen 81-176, získatelný za kombinace podmínek, a to

    a) . přítomnost 0,1 % deoxycholátu nebo Ό,8 % žluči,

    b) teplota přibližně 37 °C, • · · · • · • · • ·

    - 78 c) přítomnost 10 až 20 % C0₂ a 80 až 90 % vzduchu, pěstováním až do stacionární fáze.
29. 29. Střevní bakterie podle nároku 23, ze skupiny Shigella sp.
30. 30. Střevní bakterie podle nároku 29, ze skupiny

    Shigella flexneri, sonnei, dysenteriae a boydli._
31. 31. Střevní bakterie podle nároku 30, ze skupiny Shigella dysenteriae.
32. 32. Střevní bakterie podle nároku 30, ze skupiny Shigella flexneri.
33. 33. Střevní*bakterie.podle nároku 32, Shigella flexneri, kmen 2457T., získáte lný: pěstováním za podmínek

    a) přítomnost 0,1 % deoxycholátu nebo 0,8 % žluči,

    b) při teplotě přibližně 37 °C,

    c) na vzduchu, až do časné log fáze.
34. 34. Střevní bakterie podle nároku 23, ze skupiny Escherichia coli.
35. 35. Střevní bakterie podle nároku 34, ze skupiny enterotoxických, enterohemorrhagických, enteropathogenních, nebo enteroinvasivních kmenů Escherichia coli.
36. 36. Střevní bakterie podle nároku 23, ze skupiny Vibrio sp.

    • ·

    37. Salmonella Střevní bakterie sp. podle nároku 23, ze skupiny 38. Střevní bakterie podle nároku 23, ze skup iny Bacteroides sp. 39. Střevní bakterie podle nároku 23, ze skupiny Clostridium i sp.

    40. Střevní bakterie podle nároku 23, ze skupiny Enterococcus sp. 41. Střevní bakterie podle nároku 23, ze skupiny Klebsiella sp. 42. Střevní bakterie podle nároku 23, ze skupiny Enterobacter sp. 43. Střevní bakterie podle nároku 23, ze skupiny

    Gastrospirillum sp.

    44. Střevní bakterie ze zvýšenými antigenními vlastnostmi ze skupiny Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Gastrospirillum sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. a Escherichia coli, získatelné pěstováním v kultuře in vitro za kombinace podmínek,

    a) v přítomnosti dvojvazného chelatačního kationtu ze skupiny 1,0 až 25 mikroM BAPTA/AM, 0,5 až 10 mM EGTA, 1,0 až 100 mikroM EGTA/AM,

    b) při teplotě v rozmezí 30 až 42 °C a

    c) na vzduchu nebo za mikroaerofilních podmínek, a to i) 5 až 20 % C0₂ a 80 až 95 % vzduchu, * · • · • · · · · · · v ···»·· ······

    - 80 ii) 5 až 20 % C0₂ a 80 až 95 % dusíku nebo iii) 5 až 10 % kyslíku, 10 až 20 % C0₂ a 70 až 85 % dusíku, do časné log fáze až stacionární fáze.

    45. Vakcina, vyznačující se tím, že obsahuje střevní bakterie podle nároku 23, 26, 28, 29, 30 nebo3 3~az7~44^nebo~imunOgenní^— fragment n eb o—derivát—tě chto— bakterií.

    46. Vakcina podle nároku 45,vyznačuj ící se t i m , že dále obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.

    47. Vakcina podle nároku 45, vyznačuj ící s e t i m , že obsahuje inaktivované střevní bakterie.

    48. Vakcina podle nároku 47, vyznačující se t i m , že obsahuje střevní bakterie, inaktivované formaldehydem.

    49. Vakcina podle nároku 45, vyznačuj ící se t i m , že je určena pro aplikaci na sliznice nebo parenterálně nebo na sliznice i parenterálně.

    50. Vakcina podle nároku 45, vyznačuj ící se t i m , že dále obsahuje pomocné činidlo.

    51. Způsob stanovení potenciálních antimikrobiálních látek, vyznačující se tím, že se se zkoumanou látkou uvede do styku střevní bakterie podle nároku 23, 26, 28, 29, 30 nebo 33 až 44 a stanoví se baktericidní nebo bakteriostatický účinek uvedené látky na tyto bakterie.

    9 99 9

    9 99 9

    - 81 52. Způsob detekce protilátek proti střevním bakteriím v živočišném nebo biologickém vzorku, odebraném z hostitele, vyznačující se tím, že se

    a) biologický vzorek uvede do styku se střevními bakteriemi podle nároku 23, 26, 28, 29, 30 nebo 33 až 44 nebo s fragmenty těchto bakterií a

    b) prokazují se protilátky na základě vazby na střevní __bakterie nebo na jejich fragmenty.

    53. Způsob detekce střevních bakterií v živočišném nebo biologickém vzorku, vyznačující se tím, že se

    a) biologický vzorek uvede do styku s protilátkou, schopnou vázat střevní bakterie podle nároku 23, 26, 28, 29, 30 nebo 33 až 44 nebo jejich fragmenty a

    b) sleduje se vazba.těchto protilátek na střevní bakterie nebo na jejich fragmenty.

    54. Diagnostický balíček pro imunologické stanovení tvorby protilátek proti střevním bakteriím hostitelem nebo pro detekci přítomnosti střevních bakterií, vyznačující se tím, že obsahuje střevní bakterie podle nároku 23, 26, 28, 29, 30 nebo 33 až 44 nebo protilátky proti těmto bakteriím a další pomocné složky, nezbytné k provedení imunologických zkoušek.

    55. Způsob produkce protilátek proti bakteriím u živočichů, vyznačující se tím, že se živočich imunizuje účinným množstvím imunogenní látky, tvořené střevními bakteriemi podle nároku 23, 26, 28, 29, 30 nebo 33 až 44, čímž dojde ke tvorbě protilátek proti střevním bakteriím, schopných vázat tyto střevní bakterie nebo jejich složky.

    • · · · _: · · ·~·

    - 82 56. Způsob stimulace imunitní odpovědi u živočicha, vyznačující se tím, že se živočichu podá účinné množství imunogenního materiálu s obsahem střevních bakterií podle nároku 23, 26, 28, 29, 30 nebo 33 až 44, přičemž vyvolaná imunitní odpověď chrání, léčí nebo zlepšuje stav živočicha v případě infekce nebo onemocnění střevními bakteriemi ze skupiny Campylobacter sp. , Yersinia sp.,_ Bacteroides sp., Klebsiella sp., Gastrospirillum sp., Enterobacter sp . ,—Saimonei-l-a—sp.—Shige-ll-a_sp_._,_Ae_romonan_sp . ,_

    Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp., a Escherichia coli .