CS17291A2 - Recombinantly prepared blood factors, method of stated blood factors expression and also recombinants of virus of vaccine that is used in stated process - Google Patents
Recombinantly prepared blood factors, method of stated blood factors expression and also recombinants of virus of vaccine that is used in stated process Download PDFInfo
- Publication number
- CS17291A2 CS17291A2 CS91172A CS17291A CS17291A2 CS 17291 A2 CS17291 A2 CS 17291A2 CS 91172 A CS91172 A CS 91172A CS 17291 A CS17291 A CS 17291A CS 17291 A2 CS17291 A2 CS 17291A2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- plasmid
- vaccinia virus
- promoter
- factor
- cells
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 60
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 47
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 12
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims abstract description 59
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 95
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 77
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 72
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims description 68
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 67
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 55
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 26
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 19
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 claims description 17
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 claims description 16
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 12
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 claims description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 11
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 claims description 11
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 claims description 11
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 claims description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 7
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 5
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 4
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 3
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 3
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 claims description 3
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 claims description 3
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 claims description 3
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims description 3
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 claims description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 claims description 2
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 claims description 2
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 claims description 2
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 claims description 2
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 2
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 claims description 2
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 claims description 2
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- -1 FactorIX Proteins 0.000 claims 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 claims 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 claims 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 claims 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 19
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 9
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 7
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 7
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 229940039715 human prothrombin Drugs 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 101000651439 Homo sapiens Prothrombin Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 4
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 3
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 3
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 2
- 101000658547 Escherichia coli (strain K12) Type I restriction enzyme EcoKI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 2
- 101000658546 Escherichia coli Type I restriction enzyme EcoEI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 2
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 101150106093 gpt gene Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229940079938 nitrocellulose Drugs 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 1
- 101100243401 Caenorhabditis elegans pept-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010080379 Fibrin Tissue Adhesive Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 101500025568 Homo sapiens Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 1
- ABSPRNADVQNDOU-UHFFFAOYSA-N Menaquinone 1 Natural products C1=CC=C2C(=O)C(CC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 ABSPRNADVQNDOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000713102 Mus musculus C-C motif chemokine 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000819999 Nymphes Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100038124 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108010027570 Xanthine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 108091005606 gamma-carboxylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 229940100689 human protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000019175 phylloquinone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011772 phylloquinone Substances 0.000 description 1
- MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N phylloquinone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N 0.000 description 1
- 229960001898 phytomenadione Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Auxiliary Devices For Machine Tools (AREA)
- Gear Processing (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
- 1 - i 5( "WT/Vz— j > O( Cj ··<Ϊ Cl -'· í t: c?Xhv, : Γ- í'· i C5 rcΛ. S-
Rekombinantně připravované krevní faktory, postup 'exprese- <·uvedených krevních faktorů a také rekombinanty viru vakcíniepoužívané v uvedeném postupu
Oblast techniky
Tento vynález·se týká rekombinantně připravovaných krev-ních faktorů, zvláště krevních srážecích faktorů závislých navitaminu K, rekombinantů viru vakcínie (neštovic) a způsobuexprese uvedených krevních faktorů. Tento vynález popisujezvláště přípravu rekombinantního protrombinu a trombinu ataké meziproduktů, které jsou tvořeny různými mechanismy o—pracovávání na cestě od protrombinu k různým variantám trom-binu.
Dosavadní stav techniky
Existuje velká potřeba vysoce vyčištěných krevních fak-torů, jako je například Faktor VIII, Faktor II, von Willebran-dův faktor a plasminogen, které nejsou znečištěny jakýmkolivinfekčním nebo toxickým materiálem. Genetické inženýrství na-bízí způsob přípravy takových profylaktických nebo terapeutic-ky významných proteinů v poměrně vysokých výtěžcích a za ne-přítomnosti patogenních virů, jako jsou například viry HIVnebo hepatitidy. Eukaryotické expresní systémy poskytují dal-ší výhodu v tom, že nesou na proteinovém zbytku post-tran-slační modifikace, takže se získávají glykoproteiny, kteréjsou do vysokého stupně srovnatelné nebo jsou identické slátkami produkovanými tělem člověka. V různých rekombinantních systémech bylo expresí připra-veno několik na vitaminu K závislých lidských srážecích fak-torů. Byla popsána exprese lidského srážecího faktoru IX vbuňkách jater a v myších fibroblastech (H. de la Salle a spol.:Nátuře 316« 268 až 270 (1985) a D. S.Auson a spol.: Nátu-ře 515» 685 až 685 (1985).), v buňkách ledvin mláňat křečka(S. Busby a spol.: Nátuře 516, 271 až 273 (1985)·) a v buňkách vaječníků čínského křečka (buňky CHO) (N. J. Jorgensen a spol.!Cell 48, 185 až 191 (198?)·). Z těchto'studií je známo, žepouze některé typy buněk, jako jsou například buněčné linie -odvozené od jater a ledvin, mají účinné karboxylační systémy.Díle bylo zjištěno, že nadexprese faktoru ΙΣ v buňkách CHO .amplifikaeí genu má obvykle za důsledek zvýšené hladiny pro-teinového antigenu, avšak specifická aktivita d.rasticky klesá.Rovněž opracování (procese) z pre-proteinu do maturované formynení dostatečná (A· Balland a spol.í Eur. J· Biochem.’ 172. 565 až 572 (1988).).
Jiný na vitaminu K závislý faktor, lidský protein C, bylzískán expresí v lidském 295 embryonálním ledvinovém buněčnémsystému. V tomto systému bylo dosaženo vysoké úrovně expreseplně karboxylovaného proteinu C (J. D. Walls a spol. í Gene 81.159 až 149 (1989)·)· Nezdá se však, že by buněčná linie 259byla vhodná pro práci ve velkém měřítku a pro fermentaci. '
Rekombinační studie byly prováděny také s protrombinem.
Na vitaminu K závislý srážecí faktor protrombin je plazmovýglykoprotein s molekulovou hmotou asi 72 000. Tento protein,který se syntetizuje v játrech, je obsažen v posledních stup-ních srážení krve. Před sekrecí podléhá několika post—tran-slačním modifikacím^ jako je například glykosylace, na vitaminu ,K závislá karboxylace prvních 10 zbytků kyseliny glutamové naaminovém konci a štěpení pre— a propeptidů. Klonování genupro lidský protrombin a jeho doplňkové DNA (8. J. P. Degen:Biochemistry 26, 6165 až 6177 (1987)·) otevřelo možnost stu-dií exprese v příslušných buněčných systémech. Pokud jde ocDNA protrombinu plné délky včetně oblasti signálního peptidůa pro-sekvence (.kódující prepro-protrombin), lze odkázat naMacGilliv^ray R. Ϊ. A.;, Irwin D. M., Guinto R. E, a Stone J. C.: “Recombinant genetic approaches to functional mappingof thrombin”, Annals of the New York Academy of Sciences485. 75 až 79 (1987). K expresi aktivního lidského protrom-binu dochází v'buňkách CHO (vaječníky čínského křečka) a v - 3 - buňkách BHK (ledvin mladat křečka) (M. J. Jorgensen a spol·: J. Biol. Chem. 262, 6729 až 6734- (1987)*)· Jestliže expreseprotrombinu v buňkách CHO se zeýši ámplifikaci genu, získajíse vysoké hladiny exprese. Avšak jenom 60 % materiálu je do·*statečně karboxylováno. Exprese protrombinu. v buňkách BHK po-skytuje aktivní protrombin. Hladiny exprese jsou však poměrněnízké.
Vektorové systémy založené na viru vakcínia jsou známy,například M. Mackett a spol. v "DNA cloning: A pracical ap-proach”, D. M. Glover (red·), IHL Press, Oxford, str. 191 až211 (1985). V evropském patentu 243 029 je popsán rekombinant—ňí virus vakcínia pro expresi proteinu HIV env.
Virus vakcínia vyvinul svojevlastní transkripční regulač-ní sekvence, které jsou rozeznávány virem kodovanou BNA-poly-merasou vbalenou (pakážovanou) do infekční virové Částice.
Navíc má virus vakcínia velký genom (185 ooo párů nukleotidůdvojvláknové DNA), se kterým nelze pracovat technikami klo·-nování in vitro. Inserce cizí DNA do genomu víru vakcínialže tedy dosáhnout pouze in vivo využitím principu obvyklého(íogní rekombinace. Prokázalo se, že virus vakcínia je užiteč-ným prostředkem pro studie expresu genu v savčích buňkách. Me-zi výhody patří zachování neinfekčnosti, široký rozsah hosti-telů, velká kapacita DNA» přesná syntéza, správné svinutí,opracování a transport proteinů,
Rekombinantní vir vakcínia poskytuje tedy rychlé pro-středky pro testování buněčných linií, které jsou schopny pro-vádět přesné post-translační modifikace. Ve srovnání s přísluš-nými hostitelskými buňkami také účinně sekretují žádaný protein.To je zvláště důležité, jestliže uvažujeme o expresi rozsáhlemodifikovaných sekrečních proteinů, jako jsou na vitaminu Kzávislé srážecí faktory.
Podstata vynálezu Předmětem tohoto vynálezu je získáni expresního systému pro krevní faktory, zvláště pro na vitaminu K závislé krávnísrážecí faktory, jako je například protrombiň a varianty trom-binu, které jsou vylepšeny proti dosud známým expresním sys-témům v tom, že nabízejí vysokou post-translační kapacitu a,díky stabilizovaným rekombinantům, velice reprodukovatelnépodmínky exprese.
Dalším předmětem tohoto vynálezu je získání rekombinant-ně připravených krevních faktorů nebo jejich derivátů, kterémají vysoký poměr biologicky aktivní formy k antigenní formě.
Shora uvedený předmět vynálezu se vyřeší rekomhinantněpřipravenými krevními faktory, které mají poměr biologickyaktivní formy k antigenní formě alespoň asi 5θ s výhodouv rozmezí od 60 % do 90 %, a nejvýhodneji v rozmezí od 70do 80 %« Z těchto krevních faktorů, které mohou obsahovat úplnounebo částečnou aminokyselinovou sekvenci proteinu nebo jehpderivátů vzniklých náhradou, delecí nebo insercí alespoň jed-né aminokyseliny, se lze zmínit o faktoru V, faktoru VII, faktoru XII, faktoru XIII, von Willebrandově faktoru, plasmi-hi// nogenu a ná vitamifK závislých krevních faktorech, jako je na-příklad faktor VII., faktor IX, faktor X, protein G, protein Sa zvláště protrombiň a také jeho varianty.
Tento vynález zahrnuje také insertní plasmidy a rekom-binanty viru vakcínia nutné pro expresi žádaných glykoproteinů
Bylo také navrženo používat jiné rekombiantní viry neš-tovic, například vir drůbežích neštovic.
Insertní plasmidy obsahují sekvenci cizí cDNA kódujícížádaný krevní faktor a alespoň jeden replikon, alespoň jedenselekční markér, násobná klonovací místa, alespoň jeden gpňmo-tor a DNA sekvence z viru vakcínia, které sousedí s promotorema cizí DNA sekvencí. Λ,ίίώ,: - 5 - Výběr virových rekombinantnů nebo buněk se usnadní pou-žitím selekčního markéru» Fxprese tohoto markéru je výhodnáza kontroly silného, stále aktivního promotoru, například P 7·5z viru vakcínie. Příkladem vhodného selekčního markéru je gengpt, který kóduje xanthin-guanin-fgjoforibosylovou transferasu. V kultuře savčích buněk za přítomnosti mykofenolové kyselinyporoste pouze rekombinantní virus, který nese gen gpt (F. G.Falkner a B. Moss: J. Virol. 62, 1849 až 1854 (1988)»). I když je jednou z nejdůležitejších věcí, aby cizí genbyl získáván expresí za kontroly promotoru viru vakcínie,je stejně důležité, aby promotor viru vakcínie, např. promo-tor kravských neštovic (vakcínie), byl v bezprostředním sou-sedství k sekvenci cizího genu, který má být expresí připra-ven. Na četných příkladech bylo ukázáno, že nepřeložené kó-dující oblasti, které jsou umístěny mezi promotor viru vak-cínie a sekvenci cizího genu, který má být připraven expresí,vedou ke snížení hladiny exprese. Zvláštní péče by měla býtvěnována tomu, aby 3'—konec promotoru a 5 -sekvence cizíhogenu byly seřazeny v patřičné čtecí fázi, Čímž se lze vyhnoutnepotřebným oblastem nepřekládaných kodonů. Jednou z možnostíjak toho dosáhnout je vybrat příslušné restrikční místo a mo-difikovat 5'—konec sekvence cizího genu (možná včetně pre-nebo prepro-šekvence) přidáním nebo deleci kodonů tak, aby sevytvořilo identické restrikční místo. Překrytím 5'—koncepromotoru s 5'-koncem cizího genu umožňuje žádoucí uspořádání.
Velikou důležitost má výběr příslušného promotoru v ex-presním systému viru vakcínie. Pro expresi proteinu se ob-vykle používají virové promotory aktivní v pozdní fázi neboaktivní v časné a pozdní fázi infekčního cyklu. Mohou se po-užívat také syntetické promotory pozdní nebo časné a pozdnífáze.
Zvláště výhodný promotor viru vakcínie je pozdní 11K—pro-motor. Tento promotor obsahuje funkčně zachovaný důležitý sek-venční prvek, který se překrývá s transkripčními a translač- 6 nimi iniciačními místy ( viz B. Moss a spol. í Ann. Rev. Im-munol. 2» 305-324 (1987).}· Aby se dosáhlo efektivní exprese,autoři tohoto vynálezu se'rozhodli neměnit oblast. Proto vnásledujícím příkladu cDNA protrombinu byla klonována do při-rozeně se vyskytujícího místa EcoRI bezprostředně po směruvlákna iniciačního kodonu polypeptidu 11K, jak je to uvedenona obrázku 3·
Jak je popsáno později v experimentální části, přesné na-pojení promotoru s oblastí kódující protrombin bylo získánozavedením nového místa EcoRI prostřednictvím oligonukteotidém řízené mutagenese po směru vlákna iniciačního kodonu genu pro-trombinu. Zvolená strategie vede k zavedení dvou dalších ami-nokyselin (Asn a Ser) do signálního peptidu (viz obr. 3). Je-likož signál místa štěpení je umístěn o asi 40 aminokyselindále, tato mutace neinterferuje s přesným opracováním a sesekrecí maturovaného polypeptidového řetězce.
Vzhledem ke skutečnosti, že DNA viru vakcínie je trans-kribována do cytoplasmy, nelze využít aparát střihu hostitel-ské buňky. Při konstrukci virového rekombinantnu se tedy musípoužít bezintronová DNA nebo cDNA. Pro efektivní expresi asekreci je výhodné, aby tato DNA obsahovala také signální sek-vence.
Pro některé účely může být žádoucí vložit do rekombinant-ního viru pouze část sekvence nebo pozměněnou sekvenci ze sek-vence cizí DNA, která má být expresí připravena. Tímto způso-bem se získávají deriváty nebo mutanty nebo aktivované formykrevních faktorů.
Insertní plasmidy dále obsahují lemující sekvence DNAviru vakcínia, které mohou odpovídat genu thymidin-kinašy ne-bo sekvencím hemaglutininu a nebo jakékoliv nepodstatné ob-lasti v DNA viru vakcínie. - 7 -
Vhodným vektorem otevřené Čtecí fáze pro insercí cizícDNA je pTKgpt-oFls, jak popisuje F. G. Falkner a B. Moss: J. Virol. 62, 1849 až 1854 (1988).
Pomocí tohoto vektoru otevřené čtecí fáze se připravíinsertní plasmid pTKgpt-PTHBa a pTKgpt—pTHBb (obr. 1 a 2).Podobným způsobem jak bylo shora popsáno pro^trombin můžebýt vložen do plasmidu pTKgpt-oFLs do těsné blízkosti promoto-ru Pil jakýkoliv jiný žádoucí cizí gen kódující krevní faktor.Š takovými insertními plasmidy se rekombinanty vir vakcíniezískávají in vivo homologní rekombinací se standardním viremvakcínie. Rekombinanty viru vakcínie popsané v experimentálníčásti pro expresi trotrombinu jsou vPTHBa a vPTHBb (obrázky1 a 2) a také vPT6/2, vTKemc—PT2, vHA—PTa a.vHA-PTb',· kterébudou popsány níže. Těmito inokulaČními viry se potom infektuje kulturasavčích buněk, načež se testuje na schopnost exprese žáda-ného glykoproteinu»’
Pokud jde o buňky savčího hostitele, jsou výhodnými buň-kami buňky jater a ledvin, jelikož nabízejí nejvhodnějšípost-tránslační modifikace. Bylo by však možné ukázat, ženejvýhodnějšími hostitelskými buňkami jsou buňky Věro, CV1,BSC1 a BHK, pokud se bere v úvahu úroveň exprese a post—tran-slační modifikace.
Jinými užitečnými hostitelskými buňkami jsou buňky RK15,Tyto buňky nevylučují žádný protein do supernatantu, ale majíschopnost expresí poskytovat protein ve velkých množstvích. V takovém případě se buňky musí rozbít, aby se protein isolo-val. V tomto případě je tedy výhodné, aby se exprese žádanéhoproteinu prováděla bez jakékoliv signální sekvence.
Postup přípravy žádaných rekombinantních krevních fakto-rů se s výhodou provádí v přítomnosti vitaminu K, aby se zís-kaly proteiny s vysokou biologickou účinností.
Dalšího vylepšení expresního systému lze dosáhnout tím,že se pozoruje fáze buněk v době, když se infektují. Bylo pro-kázáno, že se nejlepší výsledky získají tehdy, když buňky předinfektováním dosáhnou konfluence.
Pokud jde o množství rekombinantů viru vakcínia nutnýchpro infektování hostitelských buněk, toto množství leží v roz-mezí od 0,1 do 20 pfu (plak tvořících jednotek),, nej výhodně jiv rozmezí od 0,1 do 1 pfu.? Vyšší množství virových rekombinan—tů použitých pro infektování neposkytuje dále zvýšené hladinyexprese. Expresní hladiny lze dále zvýšit použitím systémů o -vysoké hustotě, jako jsou například kultury na mikronosičíchnebo systémy s dutými vlákny.
Takto připravené proteinové materiály lze isolovat zbuněčného supernatantu nebo z buněk jakoukoliv vhodnou těch*·nikou známou odborníkům. Potom se vyčistí obvyklými způsobypoužívanými v chemii proteinů.
Rekombinanty viru vakcínie mají významnou výhodu protirekombinantním systémům známým z odborné literatury v tom,že umožňují rychlé analyzování buněčných linií na efektiv-nost sekrece a správné post-translační modifikace. Tímtozpůsobem lze snadno zjistit, které buněčné linie jsou schop-ny sekretovat velká množství aktivního proteinu, zatímco· jinémohou akumulovat velká množství ve své cytoplasmě, a kterébuněčné linie poskytují nejaktivnější proteiny díky jejichsprávné post-translační modifikaci. Je tedy užitečné, aby sepřed zkonstruováním transformované buněčné linie, analyzovalyrůzné buněčné typy na žádoucí funkce studiemi infekcí rekom-binahtů viru vakcínie.
Rekombinantně produkovaný lidský protrombin, kterýneobsahuje viry nesené krví, jako je např. HIV nebo virushepatitidy NANB, je možné použít pro léčení některých poruch,koagulačního systému (lidský trombin připravený z protrombinu),jako je například septický šok. Lidský trombin a/nebo synergická Μ· Μ směs lidský trombin - trombomodulin a protein C jsou považo-vány za užitečná léčiva při antikoagulační terapii a při sep—tickém šoku»
Další aplikací je použití trombinu připraveného z lidské-ho rekombinantního protrombinu ve fibrinovém utěsňovacím pro-středku místo běžně používaného hovězího trombinu. Tak fibri-nový utěsňovací pr<?bředek je široce používán v některýchoblastech chirurgie. Náhradou hovězího trombinu lidským trom—binem lze snížit risiko jistých virových infekcí a také něk-terých alergických reakcí.
Tento vynález je dále ilustrován obrázky 1 až 7.
Obrázek 1 ukazuje konstrukci insertního vektorupTKgpt-PTHBa viru vakcínie. Tento insertní plasmid byl použitpro in vivo rekombinace vedoucí ke zkonstruování rekombi—nantního viru pTHBa. Význam zkratek je následující: pTHBznamená sekvence protrombinu, tetr znamená gen tetracykli—nové resistence, ssDNá znamená jednovláknovou LNA, tk znamenásekvence thymidin-kinssy viru vakcínie, gpt znamená gen xan-thin-guanin-fosforibosyl—transferasy E. coli, Pil znamenápromotor hlavního pozdního polypeptidu 11K viru vakcínie, P 7.5 znamená promotor polypeptidu o molekulové hmotě 7500viru vakcínie a MGS znamená násobná klonovací místa. Šipkyukazují směry transkripce.
Obrázek 2 znamená konstrukci insertního vektorupTKgpt-PTHBb viru vakcínie. Tento insertní plasmid byl po-užit pro zkonstruování virového rekombinantnu vPTHBb viruvakčínie·' Zkratky znamenají stejně jako shora uvedeno v pří-kladu 1.
Obrázek 5 ukazuje napojení kódující oblasti protrombinus pozdním promotorem Pil (pil WT) viru vakcínie. Kódujícíoblast lidského protrombinu v rekombinantech vPTHBa avPTHBb viru vakcínie je napojena přesně za iniciační kodontranslace polypeptidu 11 K. Díky inserci nového místa ště-pení restrikční endonukleasou EcoRI oligonukleotidem řízenoumutagenesí obsahuje signální peptid protrombinu dvě další Μ 10 — aminokyseliny (Asn a Ser). V rekombinantnu vPTHBb byly odstra-něny také póly (A)-konec (60 A-zbytky přítomné v cLNA a v re—kombinantnu vPTHBa) a oligo(C)~prodloužení zbytku se 14ato-my uhlíku insercí druhého místa EcoRI a následujcím štěpením.
Obrázek 4 je konstrukční schéma insertních plasmidúpHAgpt—oFa a pHAgpt-oFb viru vakcínie. HA znamená hernaglu—tinin. Další zkratky lze odvodit z předcházejících obrázků.
Pro restrikční endonukleasy byly použity obvyklé zkratky»
Pro další vysvětlení viz také příklad 3»
Obrázek 5 ukazuje konstrukční schéma insertních plasmidúpHAgpt—PTa a pHAgpt-PTb viru vakcínie. Pro další vysvětlenízkratek viz předchozí obrázky.
Obrázek 6 ukazuje konstrukční schéma pTKemc-PT2 viruvakcínie. Amr znamená gen rezistence na ampicilin,encznamená vedoucí (leader) sekvenci sekvence viru encefalomyo—karditidy, T7P znamená sekvenci polymerasy T7. Pro vysvětlenídalších zkratek viz předcházející obrázky a příklad 4.
Obrázek 7 udává srovnání hladin exprese indukovanýchrůznými virovými rekombinanty, které expresí v buňkách Věroposkytují protrombin: V pokusu byly buňky hostitele infek-továny 1 pfu na buňku příslušným virovým rekombinantem. (vpřípadě vektorů založených na T7 1 pfu viru poskytujícíhopolymerasu T7 a viru promotoru T7 cílového genu) a nechányrůst v mediu bez sera za přítomnosti vitaminu £1. Supernatan-ty byly isolovány po sedmdesáti dvou hodinách. Biologickéaktivity byly stanoveny jak popsáno v příkladu 1. V následující části jsou popsány pokusy přípravyinsertních plasmidú viru vakcínie, virových rekombinantů,exprese krevního srážecího faktoru protrombinu a pokusyoptimalizace této exprese. Následující pokusy slouží jakodalší ilustrace tohoto vynálezu bez toho, aby tento vynálezomezovaly. 11 Příklady provedení vynálezu. Příklad 1 Příprava rekombinantů viru vakcínie (W) vPTHBa a vPTHBb aexprese protrombinu 1, Konstrukce insertních plasmidú viru vakcínie a) Konstrukce pTKgpt-PTHBa
Podfragmenfc Pstl o 1600 nukleotidech cDNA protrombinu(vyštěpený z plasmidú pIIH15, jak popsal R. T. A** MacGilli-vray, D· M. Irwin, R. E* Guinto a J. 0» Stone v "Recombinantgenetic approaches to functional mápping of thrombin”, Annalsof the New York Academy of Sciences 485, 75 až 79 (1987).),byl klonován do jednovláknového fága M13mpl8* Místo EcoRIbylo zavedeno oligonukleotidem řízenou mutagenesí použitímpostupu mutagenese na gji^adě fosforothionátu (Amersham·, Inc·)·Pro mutagenesí byl použit nukleotid oPTl (5*to'Í'CG GAC GTG G&CGGA ATT CAT AGT GTG TCA-3") (místo EcoRI je podtrženo).Oligonukleotid oPT2 (5'-CŤG TGC ACA AGG CTA CAG -5') je nmí-stěn asi 60 párů nukleotidů po směru vlákna a slouží jako se*-kvenční primer pro kontrolu mutace· Nový fragment EcoRI-Pstlbyl pak klonován do otevřené čtecí fáze expresního vektorupTKgpt—oFis, který byl popsán F. G. Falknerem a B. Mossem vJ· Virol. 62, 1849 až 1854 (1988). Pro zkompletování kódujícíoblasti protrombinu se podfřagment Pstl o 400 nukleotidechcDNA protrombinu klonuje do jednoduchého místa Pstl mezipro-duktového plasmidú pTKgpt—PTHB1. Získá se tak plasmidpTKgpt-PTHBa. Konstrukce tohoto insertního plasmidú je sche-maticky znázorněna na obrázku 1. b) Konstrukce pTKgpt-PTHBb
V tomto případě se podfřagment Pstl o 400 nukleotidechcDNA protrombinu (vy štěpený z plIHlJ a obsahující signálnía pro—sekvence) klonuje do Ml5mpl8· Místo EcoRI se zavedeoligonukleotidem řízenou mutagenesí 70 párů nukleotidů posměru vlákna přerušovacího kodonu (stop kodonu). mutagenesíbyl použit oligonukleotid oPT3 (5*—GTT TCT AAA ACT AGA ATT - 12 CGC AAT AAA AGT-y.). Oligonukleotid 0PT5 (5'-áTT GTG GGC TCCTGG A-3'), umístěný asi 60 párů nukleotidů po směru vláknamutace, sloužil jako sekvenční primer pro kontrolu mutace.Modifikovaný fragment Pstl o 400 nukleotidech byl klonovándo jediného místa Pstl meziproduktového plasmidu pTKgpt-PTHBl(viz shora popsanou konstrukci pTKgpt-PTHBa)· FragmentEcoRI o 2000 nukleotidech obsahující cDNA' protrómbinu bezpóly(4)-sekvence byl klonován do jediného místa EcoRIpTKgpt-oFls. Získá se tak plasmid pTKgpt-PTEBb· Konstrukcetohoto plasmidu je schematicky znázorněna na obrázku 2. V obou shora popsaných fiasmidech je oblast kódující pro-trombin přesně napojena za iniciační kodon polyj^tidu 11 K*Schéma, jak získat toto přesné napojení, je uvedeno na obrázku5. Jak lze odvodit z obrázku ý, strategie vybraná pro zavede-ní nového místa ExoRI oligonukleotidem řízenou mutagenesívedla k inkorporaci dvou dalších aminokyselin (4sn a Ser)do signálního peptidu protrombinu. Jelikož místo štěpenísignálního pept^idu je umístěno asi 40 aminokyselin odtud,tato mutace pravděpodobně neinterferúje se správným opracová-ním a sekrecí maturovaného polypeptidového řetězce. Z obrázku 3 lze dále odvodit, že v pTKgpt-PTHBb poly(A)-konec cDNA protrombinu a G/C sekvence o 14 párech nukleotidůse odstraní zavedením druhého místa EcoRI na 3*-konec, genuprotrombinu s následujícím štěpením, zatímco v pTKgpt-PTHBaje póly(Λ)-konec a G/C sekvence o 14 párech nukleotidů ještěpřítomná· 2. Konstrukce řekombinantů vPTHBa a vPTHBb viru vakcínie. Při in vivo rekombinaci byl použit' postup popsaný MuMacketem a spol-· (v ”The construction and characterization ofvaccinia virus recombinant expressing foreign genes", D. M.Glover (red.) v "DNA cloningí A practical approach"; IRL Press,Oxford (1985), strany 191 až 211.) s následujícími modifi- .kacemi:'5.10 buněk CV1 (konfluentní monovrstvy) bylo infek-továno 0,2 pfu/bunku standardním typem viru vakcínie. Dvě - 13 - hodiny po infekci se k buňkám přidá 1 ml kalcinovaného DNADNA precipitátu (sestávající z 5/uS nadšroubovicové plasmido-vé DNA pTKgpt-PTHBa, nebo pTKgpt-PTHBb, 1 ^ug standardníDNA viru neštovic a 14 ^ug nastříhané sledí spermální DNA).
Po 15 minutové inkubaci za teploty místnosti se přidá 9 mlmedia (DMEM, 8 % FBS s antibiotiky)· Medium bylo po 4 hodi-nách vyměněno a v inkubaci bylo pokračováno dalších 48 hodin·.Buňky byly isolovány a suspendovány v 1 ml media. Byl tak při-praven virový surový zásobní roztok. 3· Selekce rekombinantú gpt+ viru vakcínie
Pro isolaci mutantů gpt+ byl připraven plakový test bu- něk BSC1 následujícím způsobem! Konfluentní buňky BSC1 sepředinkubují v mediu selektivním pro gpt (DMEM, 2,5 % FBS,antibiotika, 25 yug/ml MPA, 250 yug/ml xanthinu a 15 /Ug/mlhypoxanthinu) 14 až 24 hodin· Pro infektování buněk BSC1 bylapoužita zředění 10 -,10 a 10 y virového zásobního roztoka(0,5 ml suspendovaných buněk bylo třikrát zrmazeno a roztáto,byl přidán stejným objem trypsinu (0,25 mg/ml), směs bylaštěpena 30 minut při 37 °θ a sonikováha 20 sekund)· Po 1,5 hinkubace při 37 °C byly buňky převrstvený mediem selektivnímna gpt obsahujícím 1 % nízkotající agarosy. Po 2 dnech inku-bace byly buňky obarveny neutrální Červení. Po inkubaci přesnoc byly plaky snadno viditelné. Plaky. byly vyčištěny způsobempopsaným P. G. Falkneremí J. Virol. 62, 1849 až 1854 (1988). 4. Testování rekombinantního viru, který expresí poskytujeprotrombin a) Infektování buněk virům
Buňky ledvin opice (buňky CV1 a Věro) byly nechány růst.v DMEM s 10 % plodového telecího sera, antibiotiky a glutami-nem. Den před dosažením konfluence se přidá vitamin K1 nakonečnou koncentraci 20 /Ug/ml (vitamin KL byl získán odfirmy Sigma, č. V-3501, skladován při + 4 °C jako zásobníroztok 5 mg/ml vethanolu). Když monovrstvy dosáhly konfluence,byly dvakrát promyty fosforečnan pufrovaným solným roztokemobsahujícím Mg^+ a Ca^+ , potom byly infektovány 0,1 až 10 pfu 14 - vyčištěného viru. Po jednohodinové adsorpci viru se přidá me-dium (DMEM) bez sera a vitamin K.
Buňky byly nechány růst dva dny. Proteiny byly vysráženyz buněčných supernatantů a analyzovány Westernovým blotováníms protilátkou proti lidskému protrombinu spojenku s aialic-kou fosfatasou jak je to dále popsáno· b) Vysrážení supernatantů buněčné kultury acetonem
Supernatanty byly odstřelovány 10 minut při 3000 x g, abyse odstranily zbytky buněk, vysráženy dvěma objemy acetonu ainkubovány 5θ minut v ledu· Po odstřelování 10 minut při8000 x g se peleta znovu rozpustí v 0,25 ml 0,01N hydroxidusodného, zahřívá se tři minuty na 70 °C a odstřeňuje se, aby.se odstranil nerozpuštěný materiál. Supernatant se zneutrali-zuje 20 /ul 1M Tris-HCl, pH 7>0, a opět se vy sráží dvěma ob-jemy acetonu. Výsledná peleta se rozpustí ve 40 yul SDD-pu-fr. Na gel se nasadí obvykle 10 yul· c) Analýza Westernovým blotováním
Postupuje se v podstatě tak, jak popsal H. Towbin a spolčí
Proč. Nati. Acad. Sci. USA 8J5, 6672 až 6676 (1979) s následu-*
jícími modifikacemi: Proteiny se oddělí na 10% SDS—polyakryl-amidovém gelu a blotují sena nitrocelulosové membráně (Amer—sham Hybond C) jednu hodinu při 200 mA v elektroforesní ‘ jed-notce Hoefer TE series Transphor Electrophoresis unit vtransferovém pufru obsahujícím 12,5 mM Tr^i, 96 mM glycinu,pH 8,5, a 10 % methanolu· Membrána se nechá nasáknout, 5 x 20minut ve Westernově pufru (WB, fosforečnanem pufrováný solnýroztok, 0,1% Tween 20) a předem se inkubují ve 20 ml WB ob-sahujícím 10 % normálního ovčího sera. Po jedné hodiněse přidá 40 yul ovčí proti-lidské protrombinové protilátky,navázané na alkalickou fosfatasu (Serotec ΑΗΡ 06A) (výsled-né zředění antisera je 1 s 500) a v inkubaci se pokračujepřes noc. Membrána se promyje 5 x 10 minut ve WB, 1 x 5 v .pufru (O,1M Tris-HCl, pH 9,5, 0,1 M ŇaOl, 5 mM MgCip alka-lické fosfatasy (AP) a pak se vyvíjejí v 10 ml pufru AP - 15 - obsahujícím 66 ^ul tetrazoliové nitromodře (NBT, 50 yug/mlv 70% dimethylformamidu) a 55 ýul 5**hrom-4—chlor-5*-andolyl—fosfátu (BGiPj 50 yug/ml v dimethylformamidu) 5 až 10 minut·
Ve všech vzorcích byl pás nového proteinu snadno viditelnýjak migruje společně s vyčištěným protrombinem (kontrola),při čemž tento pás chyběl v neinfektováných buňkách nebo ustandardních infektovaných buněk· Na základě tohoto testo-vacího stupně byly vypěstovány ve velkém měřítku a vyčištěnypositivní viry vPTHBa a vPTHBb. d) Genomová charakterizace virových rekombinantů
Aby bylo možné zkontrolovat přítomnost integrační části,genu protrombinu v rekombinantním viru, bylo provedeno štěpe··ní restrikČnimi enzymy a následující analýza Southernovýmibloty. DNA vyčištěných rekomb&ntů vPTHBa a vPTHBb se rozště1-pí působením restrikčních endonukleas HindlII a BcoBI, elek··troforesuje se na 1% agarosovém gelu a blotuje se na nitro—celulosový filtr. Filtr se nejdříve hybridizuje sondou thy-midin-kinasy (tk-s ondá) a potom sondou genu protrombinu(PTHB-sonda). '
Ve vzorcích rozštěpených působením HindlII a hybridizo-vaných tk—sondou byl Hind III J —fragment standardního viru,který obsahoval gen thymidin-kinasy, viditelný jako pás o asi5000 nukleotidech· Oba rekombinantní viry obsahovaly předví- .daný pás o asi 6000 nukleotidech a menší pás o asi 1000 nukle-otidech, který obsahoval tk—sekvence· S protrombinovou sondoubyl viditelný pouze pás se 6000 nukleotidy· Tyto získanévzorky pov/Črzují integraci cDNA protrombinu do virového ^ísta.
Ve vzorcích rozštěpených působením EcoRI a hybridizo-vaných tk-sondou byl gen thymidin-kinasy standardního virurozštěpen na dva fragmenty o asi 7θ00 a 0000 nukleotidech·.
Ve vzorku vPTHBa (díky integraci genu protrombinu) se obje-vily dva převídaně fragmenty o asi 9000 a 10 000 nukleotidech. - 16
Do vPTHBb bylo zavedeno druhé místo EcoEI, které vedlo k vy-štěpení genu protrombinu po rozštěpení působením EcoEI» Vzo-rek vPTHBb tedy vykazuje fragment o 10 ooo nukleotidech (ta-ké nalezen ve vzorku vPTHBa) a fragment o 7 000 nukleotidech(také nalezen ve standardní DNA)· Sondou protrombinu byl vvPTHBa detegován očekávaný fragment o 9000 nukleotidech av případě vPTHBb vy štěpený gen protrombinu o 2000 nukleotidech·tato analýza potvrdila očekávanou integraci vzorku ve dvou re—kombinantních virech·' 5» Výběr výhodných buněčných linií sekretujících protrombin
Potenciál buňky pro jisté funkce, například pro růst,adhesi na substrátech, sekreci a postí-translačni modifikace.,se mění podle toho kterého typu buňky· Následující pokusyslouží pro testování a identifikaci buněčných linií, kteréleží v mezích hostitelů viru vakcínia, mají přijatelné cha-rakteristiky růstu a jsou schopny sekretovat aktivní na vi-taminu K závislé proteiny·
Protrombinová aktivita byla stanovena srážecím testempomocí plasmy deficitní na protrombin. Pro přípravu standardníkřivky byl použit lidský protrombin o známé koncentraci (Im-muno PII, IX, X-CPK standard)·
Pro pokusy hveděné v tabulce I se buňky infektují vPTHBa*isolují se po 48 hodinách a analyzují se elektroforesou náSDS-polyakrylamidovém gelu. Vyhodnocení se provede vzhledemke známým množstvím vyčištěného protrombinu v gelech obarve-ných Coomasie modří.
Bylo ukázáno, že vedle buněčných linií ledvin (Hep G2 aH4-11-E—Cj5) také buňky ledvin (např.. BHK a MDCK) a buňky va-jéČníků (CHO) produkují aktivní gama-kařboxylováné pro-řiny.
Na základě známých vlastností těchto buněčných linií a poža-davků na expresi biologicky aktivního protrombinu byly prostudia expresí protrombinu vybrkány buněčné linie uvedené vtabulce I» - 17 -
Tabulka I Výběr buněčných linií pro sekreci protrombinu buněčná linie zdroj 48 h intrabun· karboxyláce BSC1 ledviny, AGM(CC1 26) +++ + n.s. CV1 ledviny, AGM(CCL 70) +++ ++ ano Věro ' ledviny, AGM(CCL 81) -é++ + ano RK 13 ledviny, králík(CCL 37) + +++ n. s. 143B osteosarkom (CEL 8303) + n.s. 293 ledviny, člověk(CEL 1573) + + ano BHK-21 ledviny, křeček + ++ ano (CGL 10) + znamená viditelný pás protrombinu (asi 5θ ng) ++ znamená dobře viditelný pás protrombinu (asi 5θθ až 100 ng)+++ znamená silný pás protrombinu (více než 200 ng) - znamená žádný pás protrombinu AGM znamená africká zelená opice n.s. znamená nestanovováno Z tabulky I je možno vidět, že nejúčinněji sekretujíprotrombin buněčné linie BSC1, GV1 a Věro ledvin africkézelené opice· Buněčná linie EK13 ledvin králíka akumulujívelká množství proteinu uvnitř buněk· Sekrece a akumulaceprotrombinu byla zjištěna také u buněčných, linií 293a. BHE1ledvin, jestliže byly infektovány rekombinantním virem po-dle tohoto vynálezu·
Bekombinanty viru vakcinie podle vynálezu umožňují ry-chlé testování buněčných linií na expresi krevních faktorů,zvláště na vitaminu K závislých krevních srážecích faktorů. - 18
Na základě migrace v oblasti stejných velikostí lze předpo-kládat, že rekombinantní protrombin odvozený od buněk infek-tovaných virem vakcínie je glykosylován do podobného stupnějako protein odvozený z krve. 6· Optimalizace exprese biologicky aktivního protrombinu. jelikož shora uvedený pokus ukazuje, že hladiny protrom- binu v supernatantech infektováných buněk CV1 a Věro byly ,podstatně vyšší než u jiných takových buněčných linií a je-likož předběžné testy koagulace ukazují, že tyto superna-tanty byly biologicky vysoce aktivní, byly pro další pokusyvybrány tyto dvě buněčné linie· a) V prvním pokusu byla stanovována závislost aktivity super-natantů buněčné kultury na dávce infekce virem, který produ-kuje protrombin. Lze ukázat,, že v rozmezí od 0,1 do 20 pfuvPTHBa neby vPTHBb se hladiny protrombinu v supernatantechpo 48 hodinách nijak významně neliší· Z toho lze vyvodit, že postačující pro získání maximálního množství sekretovanéhofaktoru II jak v buňkách CV1 tak v buňkách Věro je 0,1 až 3»s výhodou 0,1 až 1 plak tvořících jednotek na buňku (pfu). b) Následující pokus se týká akumulace sekretovaného proteinu se zvyšující se dobou inkubace· Supernatanty buněk infektova-ných buněk CV1 byly studovány po 12 , 24 , 48, 60 , 72 a 96 ho- dinách od infekce. V časovém období až do'72 hodin bylo po-zorováno kontinuální zvyšování sekretovaného proteinu. Tytotesty byly doprovázeny gelovou elektroforesou a analýzouWesternovými bloty· Bylo zjištěno, že během prodloužení do-by došlo v gelech ke zvýšené sekreci také jiných proteinů·Maximum sekretovaného protrombinu se pohybuje v Časovémobdobí 60 a 72 hodin. c) Exprese protrombinu v závislosti na cyklu buňky’
Jiným podstatným parametrem, který je důležitý pro to,aby exprese v systému podle vynálezu byla efektivní, je fázebuněčného c^klu infektovaných buněk. Pro tento pokus byly 19 buňky CV1 nechány růst v přítomnosti vitaminu EL dokud nedo-sáhly konfluence nebo byly nechány růst další Jeden, dva nebotři dny před infektováním. U supernatantů byla sledována ak-tivita faktoru II v době 48 a 72 hodin po infektování.
Byl© zjištěno, že provádí-li se infektování bezprostřed-ně po tom, co buňky dosáhnou konfluence (1 den), získá se .mírná hladina aktivity. Jestliže se však'zvyšuje stáří kon-fluentní monovrstvy, lze pozorovat nepřetržité stoupání protrombinu. Maximální protrombinové aktivity se dosáhne potom, co infektované buňky CV1 dosáhly konfluence. V opakovanýchpokusech bylo ukázáno, že buňky, které jsou před infektovánímuzavřen^ ve stacionární fázi, poskytují nej lepší výsledky.
Zvýšené hladiny exprese existují zčásti proto, že existujezvýšená hustota buněk. Avšak zvýšená hustota buněk sama plněnevysvětluje celkové zvýšení exprese. 7» Výpočet hladin exprese
Bylo zjištěno, že hladiny exprese, které byly získány po-dle shora popsaných pokusů u buněk CV1 a BSC1, pokrytují až8,0 /Ug/ml protrombinového antigenu. 8. Stanovení biologické aktivity
Bylo zjištěno, že biologická aktivita rekombinantního pro-trombinu leží v oblasti 50 až'70 milíjednotek na mililitr kul-tivačního media. Získá se tak rekombinantní protrombin s po-měrem biiogicky aktivní formy k antigenní formě u buněk Věroaž 70 %, u buněk CV1 až 60 %. Příklad 2
Konstrukce rekombinantu vPT6/2 viru vakcíriie a exprese pro-trombinu Při konstruování rekombinantního vektoru viru vPT6/2se insertní plasmid pTKgpt-PTHBb uvedený.na obrázku 2 rekombinujes virem vakcínie kmen WP6/2 (Moss a spol.í“Deletion óf 9000.bp segment of the vaccinia virus genome thát encodes non-es- — 20 — sential polypeptid.es”, J. Virol. 40, 387 až 395 (1981), tentokmen viru vakcínie jé veřejně dostupný ód. NTIS.). Tento kmen .je atenuovanější (10 -krát u myšího modeluj Buller a spol.:“Decreased viruleňce of recombinant vaccinia virus expressionvectors is associated with a thymidine kinase negative phe-notype”, Nátuře 317> 813 až 815 (1985).) než obvykle používa-ný kmen B a je pró účely přípravy bezpečnějším vektorem.
Podobně jako je shora popsáno v příkladu 1, byl vPT6/2používán pro expresi protrombinu. Výtěžky biologické aktivityprotrombinu v buňkách VĚRO lze odvodit z obrázku 7. Pro dalšíviz legendu u obrázku 7· Příklad 3
Plasmidy pro inserci cDNA protrombinu do hernaglutininovéhomísta viru vakcínie V rekombinantech, které expresí poskytují protrombin jakshora popsáno v příkladech 1 a 2, byla cDNA protrombinu inte-grována do virového místa thymidin-kinasý. Jelikož inaktivacevirového tk-genu atenuuje (zeslabuje) virus, lze předpokládat^že tato atenuace může vést ke snížení hladin exprese cizíchgenů, které mají být získávány expresí. Byly proto zkonstruo-vány dva virové rekombinanty, které mají do místa hernaglu-tininu viru vakcínie integrován cizí gen. 1. Konstrukce insertních plasmidů pHAgpt-oFa a pHAgpt-oFbviru vakcínie
Tento základní vektor, pHA, byl zkonstruován ligacífragmentu Hincll o 1600 nukleotidech genu hernaglutininu vak-cínie (Shida H.: “Nučleotide sequency of the vaccinia virushemagglutinen gene”, Virology 150. 451 až 562·) s velkýmvektorovým fragmentem PvuII plasmidů pTZ19R (Pharmacia, Inc0).Zdrojem HA—genu byl plasmid pVY5 (získaný od'Β» Mosse). Dojediného místa Nrul pHA se vloží kazeta genu Hpal—Dral o - 21 1700 nukleotidech plasmidu pTKgpt-oFls (Falkner F* G., MossB.i "Escherichia coli gpt gene provides dominant selectionfor vaccinia virus open reading frame expression vectors", J. Virol. 62, 1849 až 1854 (1988).). Tato kazeta sestává'zpromotoru Pil včetně násobného klonovaciho místa a genu gptřízeného promotorem P7.5 viru vakcínie. Dvě možné orientacebyly označeny pHAgpt-oFa a pRAgpt-oFb. Tyto plasmidy jsouuvedeny na obrázku 1. 2. Konstrukce insertních plasmidů pHAgpt-PTa a phágpt-PTbviru vakcínie '·
Plasmid pHAgpt*>PTa byl zkonstruován vložením fragmentuBcoEI o 2000 nukleotidech a pTKgpt-PTHBb do plasmidu pHágpt-oFalinearizóvaného působením EcoRl a zpracovaného s fosfatasou.
Podobně byl zkonstruován plasmid pHAgpt-PTb vložením u-vedeného fragmentu EcoKI o 2000 nukleotidech do plasmidupHAgpt^oFb linearizováného působením EcoKI·
Shora uvedené plasmidy, které jsou na obrázku 5> bylypoužity pro získání rekombinantních virů vRA-PTa a vRA-PTbin vivo rekombinací standardním virem vakcínie. *
Buňky Věro byly infektovány shora uvedenými rekombinant—ními viry podobným způsobem jako je popsáno v příkladu 2.Hladinu exprese protrombinu ve srovnání s jinými virovýmirekombinanty lze odvodit z obrázku 7. Příklad 4
Konstrukce rekombinantu vTKemc-PT2 viru vakcínie a jeho pou-žití pro expresi protrombinu
Pro zlepšení úrovně exprese protrombinu byl zkonstruovánnový rekombinant viru vakcínie, který je založen na velmi ,výhodném hybridním expresním viru vakcínie. V tomto systémujeden virus poskytuje expresí bakteriofágovou polymerasu T7, 22 druhý virus poskytuje expresí cílový gen (protrombin) za kon-troly promotoru T7 následovaný leader sekvencí viru encefalo-myokarditidy (EMC) (Elroy—Stein a spol.: "Cap-independenttranslation of mRNA conferred by encephalómyocyrditis virus5 'sequencs improves the performance of the vaccinia virus//bacteriophage T7 hybrid expression systém”, Proč. Nati. Acad.Sci. USA 86, 6126 až 6I3O (1989).). Tento EMC leader udělujena čepičce nezávisející translaci transkriptům T7 a tedyzvyšuje efektivitu translace. 1. Konstrukce insertního plasmidu pTKemc-PT2 viru vakcínie
Fragment EcoRI o 2000 nukleotidech plasmidu pTKgpt-pTHBb(obrázek 2) obsahující cDNA protrombinu byl vložen do jedinéhomísta EcoRI vektoru pTM3. Do výsledného plasmidu pTKemc-PTxse cDNA protrombinu vloží mimo rámec za startovací kodon ini-ciace poskytnutý vektorem pTM3« Aby se kódující oblast sprá-vně napojila na startovací kodon, provede se oligonukleoti-dem řízená mutagenese s jedno vláknovou DNA pTKemc-PTx a oli—gonukleotidem 0PT9 (5**-AGC CTC GGA CGT GCG CCA TGG TAT TATCGT-3*)· Jodnovláknbvá DNA byla získána z pTKemc-PTx transfekcíplasmidu do E. coli kmene NM 522 a superinfektováním pomoc-ným fágem Ml3 K07. Přesná primární struktura místa napojeníkolem iniciačního kodonu ve výsledném plasmidu pTKemc-PT2byla potvrzena sekvenováním s primerem oPT2 (5*~CTG TGC ACAAGG CTA CAC-2*).
Podle tohoto měření je v plasmidu pTKemc-PT2 restauro-vána přírodní sekvence protrombinu.
Rekombinantní virus vTKemc-PT2 byl tedy získán in vivorekombinačními technikami jak shora popsáno v příkladu 1 anásledující dominantní selekcí rekombinantního viru. - 21 Λ-- (.5 800 páru nukleotidů) -do M13mpl8 vložit fragment -
Pstl PTHB o 1600 nukleotidech
-isolovat jednovláknovou DNA (.9 100 párů nukleotidů) vložit fragment
Pstl PTBH o 400 nukleo- tidech
Popisy obrázků:
Obrázek 1
jedno vláknová DMA (.8 700 párů nukleo-tidů) - oligonukleotidem řízená mutagenese — testování/sekvenování vložit modifikovanýfragment o 1600 nuk-leotidech dopTKgpt-oPls (.8 600 párů nukleotidů) (7 100 párů nukleotidů)
Obrázek 2 (5 800 párů nukleotidů) - vložit fragment Pstl PTHBo 400 nukleotidech doM13mpl8
- srolovat jedno vláknovou DNA - oligonukleotidem řízená mu-tagenese - testování (7 600 párů nukleotidů) (.9 000 párů nukleotidů) ' - vložit fragment EcoRI o 2000 nukleotidech domísta EcoRI plasmidupTKgpt-oPlš (9 100 párů nukleotidů) — vložit modifikovaný fragment PTHB o 400 nuk-leotidech do místa Pstlplasmidu pTKgpt-PTHBi (8 700 párů nukleotidů)
Obrázek 3 souhlas pozdního promotoru vakcíniecDNA protrombinu
Obrázek 4
Schéma konstrukcí insertních plasmidů pHAgpt-oFa a pHAgpt-oFbviru vakcínie (4 100 nukleotidů) (7 100 nukleotidů)
Klonování fragmentu Hpal-Dral o 1700 nukleotidech z pTKgpt-oFlsdo plašmidu pHA, který b^l rozštěpen působením Nru· <5 800 nukleotidů) (5 800 nukleotidů) počátek replikace fl počátek replikace fl
Obrázek 5
Schéma konstrukcí insertních plasmidů pHAgptPta a pHAgptPTb (5 800 nukleotidů) (9 000 nukleotidů) (5 počátek replikace fl
Klonování fragmentu EcoSI o 2000nukleotidech z pTKgpt-PTHBb do .restrikčního místa EcoSI plasmi-du pHAgpt-ofa (7 800 nukleotidů) 800 nukleotidů) (9 000 nukleotidů)počátek replikačé fl
Klonování fragmentu EcoSI o2000 nukleotidech zpTKgpt-PTHBb do resifikčníhomísta EcóEI plasmidůpHAgpt-ofb (7 800 nukleotidů)
Obrázek 6
Schéma konstrukcí insertního plasmidů pTKemc-PT2 viru vakcínie(7 400 nukleotidů) (9 000 nukléótidů) počátek replikace fl
*· vložit fragment EcoSI PTHB o 2000 nukleo*·tidech do pTMJ počátek replikace fl (9 400 nukleotidů)
- připravit jednovláknovou DNA - spojit ATG leaderu emc s oblastí kódujícícDNá protrombinu počátek replikace fl (9 400 nukleotidů)
Obrázek 7
Srovnání exprese indukované virovými rekombinanty proexpresi protrombinu v buňkách VĚRO. Hodnota 100 % (45 mu/ml)odpovídá biologické aktivitě ze 72«-hodinovýchsuperňatantúbuněk VĚRO infektovaných vPTHBb % aktivity · · · · . . rekombinanty viru vakcínie
Claims (33)
- - 23 - PATENTOVÉ NÁROKY Λ v Λ$> -" x->7\. '. Λ'/ ' "> z / .¾ X •V1, Rekombinantně produkované krevní faktory a také., jeJie.ii χ· 7' deriváty získané náhradou, delecí nebo insercí alespoňjedné aminokyseliny, vyznačující se t í m,/že uvedené krevní faktory mají poměr biologicky aktivníformy k antigenní formě alespoň 5θ %·
- 2. Krevní faktory podle bodu 1, vyznačující setím, že uvedený poměr je v rozmezí od 60 do 90 %· 3· Krevní faktory podle bodu 1, vyznačující se tím, že uvedený poměr je v rozmezí 70 až 80 %«
- 4. Krevní faktor podle kteréhokoliv z bodů 1 až 3» vyzna-čující se tím, že znamená úplnou nebo částeč-nou sekvenci protrombinu.
- 5. Krevní faktor podle kteréhokoliv z bodů 1 až 3, vyzna-čující se tím, že znamená úplnou nebo částeč-nou sekvenci na vitaminu K závislého krevního faktoruvybraného ze skupiny sestávající z faktoru VII, faktoruIX, faktoru X, proteinu C a proteinu S, 6» Krevní faktory podle kteréhokoliv z bodů 1 až 3» vy-značující se tím, že znamená úplnou nebočástečnou sekvenci faktoru V, faktoru VIII, faktoru XII,faktoru XIII, von Willebrandova faktoru nebo plasmino-genu. 7· Insertní plasmid, vyznačující se tím, že obsahuje sek-venci cizí cDNA kódující krevní faktor podle bodů 1 až6 a - alespoň jeden replikon, alespoň jeden selekční mar-kér, klonovací místa a alespoň jeden promotor, při čemžuvedený promotor a cizí cDNA je obklopena sekvencemiDNA viru vakcínie. 24
- 8. Plasmid podle bodu 7»vyznačující se ti, m,že lemující DNA sekvence odpovídají nepodstatným oblas-tem viru vakcínie·
- 9. Plasmid podle bodu 7, vyznačující se tím,že lemující DNA sekvence viru vakcínie odpovídají sek-vencím thymidin-kinasy·
- 10. Plasmid podle bodu 7»vyznačující se tím,že lemující DNA sekvence viru vakcínie odpovídají sek-vencím hemoglutininu.
- 11. Plasmid podle bodu 7,vyznačující se tím,že uvedený promotor znamená pozdní promotor viru vakcínie
- 12. Plasmid podle bodu 11,vyznačující se tím,že uvedený promotor viru vakcínie znamená pozdní 11K—pro-motor.
- 15. Plasmid podle bodu 11, vyznačující se tím,že uvedený promotor viru vakcínie znamená syntetickýpozdní promotor.14. Plasmid podle bodu 11, vyznačující se tím,že uvedený promotor viru vakcínie znamená syntetickýčasný a pozdní promotor.15. Plasmid podle kteréhokoliv z bodů 7 až 14, vy z n a č ující se t í m, že cizí DNA je vložena po směruvlákna a do bezprostřední blízkosti promotoru polypep—tidu 11K nebo jakéhokoliv promotoru podle bodů 7 až 14.
- 16. Způsob přípravy plasmidu podle kteréhokoliv z bodů 7 až 15, vyznačující se tím, že 5"-konecpromotoru viru neštovic a 5'“konec po směru vláknasekvence cizí DNA, která má být expresí získávána, jsouuvedeny do bezprostřední blízkosti tak, že 5'“konec ........ - 25 - sekvence cizí DNA je rozšířen nebo zkrácen o jednu nebovíce nukleotidů nebo kodonů, takže tvoří restrikční mís-to, které odpovídá identicky sestrojenému nebo přírodnímurestrikčnímu místu na konci promotoru viru neštovic· 17· Plasmid podle bodů 7 až 15, vyznačující setím, že sekvence cizí cDNA kóduje krevní faktorpodle bodu 1 až 6.
- 18. Plasmid podle bodu 17,vyznačující se tím,že sekvence cizí cDNA kóduje protrombin nebo jeho funk- ční ekvivalent. 19· Plasmid podle bodu 15,vyznačující se tím,že obsahuje nové místo štěpení restrikční endonukleasouEcoRI změnou signální sekvence protrombinu tak, že ob-sahuje příslušnou inserci sekvence DNA kódující dvě dal-ší aminokyseliny Asn a Ser na 5^-konci.
- 20. Plasmid podle bodu 19, vyznačující se tím, že obsahuje následující sekvenci částečný promotor-cizícDNA: TATAA ATG AAT TCC GCGCAG—- / /—TAG—XXXTTC—6QA-14C.
- 21. Plasmid podle bodu 19,vyznačující se tím,že obsahuje následující sekvenci částečný promotor—cizícDNA: TATAA ATG AAT TCC GCGCAC—/ /—TAG—GAATTC—.
- 22. Plasmid podle bodu 19,vyznačující se tím,že sekvence cizí cDNA kódující proteiny podle bodů 1 až 6 byla. klonována do otevřené čtecí fáze plasmidupTKgpt-oPls v bezprostřední blízkosti promotoru.’
- 25. Plasmid pTKgpt-PTHBa, vyznačující se tím,že má strukturu uvedenou na obrázku 1.24. Plasmid pTKgpt-PTHBb, vyznačující se t í mtže má strukturu uvedenou na obrázku 2. - 26 25 · Plasmidy pHAgpt-oFa a pHAgpt-oFb, vy zna č u j ícíse t í in, že mají strukturu uvedenou na obrázku 4. 26· Plasmidy podle bodu 25» vy zna č u j í c í s e t í m, že sekvence cizí cDNA kódující proteiny podlebodů 1 až 6 je klonována do otevřené čtecí fáze v bez-prostředním sousedství promotoru, který kontrolujeoizí DNA, jež má být expresí připravena.
- 27. Plasmidy pHAgpt-PTa a pHAgpt-PTb, vyznačujícíse t i m, že mají strukturu uvedenou na obrázku 5·
- 28. Plasmid pTKemc-PT2, vyznačující se tím,že máátrukturu uvedenou na obrázku 6.
- 29. Rekombinantní virus vakcínie, vyznačující setím, že ho lze získat in vivo homologní rekombinacístandardního vzorku viru vakcínie s plasmidem podle bodů7 až 15 a 17 až 28.
- 30. Rekombinantní viry vakcínie vPTHBa vPTHBh, vyznač u—jí c í se tím, že je lze získat in vivo homo-logní rekombinací standardního viru vakcínie s plasmidypodle bodů 23 a 24.
- 31. Rekombinantní virus vakcínie vPT6/2,, vyznačují-cí se tím, že ho lze získat in vivo homolognírekombinací kmene WR6/2 viru vakcínie s plasmidy podlebodů 7 až 15 a 17 až 28.
- 32. Rekombinantní virus vakcínie vTKemc-PT2, vyznaču-jící se tím, že ho lze získat in vivo homo-logní rekombinací standardního viru vakcínie s plasmidempodle bodu 28.
- 33. Obratlovcova buněčná kultura pro expresi krevních faktorů - 27 podle bodů 1 až 6, vyznačující se tím,že ji lze získat infektováním hostitelské buňky rekombi-nantním virem vakcínie podle bodů 29 až 32»
- 34. Buněčná kulturg podle bodu 33» vyznačujícís e t í m, že se jako hostitelská buňka používásavčí játrová nebo ledvinová buňka. 35· Buněčná kultura podle bodu 34, vyznačujícíse tím, že se jako hostitelské buňky používajíbuňky Věro, CV1, BSC1, BHK nebo REL3. '
- 36. Způsob přípravy rekombinantu krevního faktoru podle kteréhokoliv z bodů 1 až 6, vyznačující setím, že se savčí hostitelské buňky infektují rekom-binantním virem vakcínie podle bodů 29 až 32, uvedenébuňky se kultivují, expresí se získá žádaný krevní fak·*tor a tento faktor se isoluje. 37· Způsob podle bodu 36, vyznačující setím, že se jako hostitelské buňky používají buňkyVěro, CV1, BSC1, BHK nebo JSKlý.
- 38. Způsob podle bodu 37» vyznačující se t í m, že se jako hostitelské buňky používají buňkyRK13 a cizímu genu chybí signální sekvence.
- 39. Způsob podle bodu 3£, vyznačující setím, že buňky byly před infektováním ve stavu kon-fluence.
- 40. Způsob podle bodu36 at i m, že hostitelskés výhodou 0,1 až 1 pfu
- 41. Způsob podle bodu 36, 39» vyznačující sebuňky se infektují 0,1 až 20,rekombinantního viru vakcínie. vyznačující - 28 tím, že se kultivace buněk a/nebo exprese žádanéhokrevního faktoru provádí v přítomnosti vitaminu K.
- 42. Způsob podle bodu 36» vyznačující setím, že se kultivace infektovaných buněk provádí vsystému o vysoké hustotě.
- 43. Způsob podle bodu J6, vyznačující setím, že se kultivace infektovaných buněk provádí vkultuře s mikronosičem nebo v systému dutých vláken.
- 44. Způsob podle bodu $6, vyznačující s.etím, že se žádaný krevní faktor isoluje z buněknebo supernatantu.
- 45. Způsob podle bodu vyznačující se t í m, že se krevní faktor isoluje po 48 až 96 hodi-nách, s výhodou po 60 až 72 hodinách od'infektování. Zastupuje:
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP90101623 | 1990-01-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS17291A2 true CS17291A2 (en) | 1991-09-15 |
Family
ID=8203546
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS91172A CS17291A2 (en) | 1990-01-26 | 1991-01-25 | Recombinantly prepared blood factors, method of stated blood factors expression and also recombinants of virus of vaccine that is used in stated process |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0512011B1 (cs) |
| JP (1) | JP2549224B2 (cs) |
| AT (1) | ATE103982T1 (cs) |
| CA (1) | CA2073859A1 (cs) |
| CS (1) | CS17291A2 (cs) |
| DE (2) | DE69101634T4 (cs) |
| DK (1) | DK0512011T3 (cs) |
| ES (1) | ES2052368T3 (cs) |
| FI (1) | FI923347A0 (cs) |
| HU (1) | HUT63459A (cs) |
| NO (1) | NO922953L (cs) |
| WO (1) | WO1991011519A1 (cs) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69229390T2 (de) * | 1991-08-26 | 1999-11-11 | Immuno Ag, Wien | Direkt molekuläre Klonierung eines modifizierten Genoms eines Chordopocken-Virus |
| US5476777A (en) * | 1991-12-31 | 1995-12-19 | Zymogenetics, Inc. | Methods for producing thrombin |
| US5527692A (en) * | 1991-12-31 | 1996-06-18 | Zymogenetics, Inc. | Methods for producing thrombin |
| AU1096595A (en) * | 1993-11-12 | 1995-05-29 | Gilead Sciences, Inc. | Thrombin mutants |
| US7060484B1 (en) | 1993-11-12 | 2006-06-13 | Gilead Sciences, Inc. | Polypeptides and coagulation therapy |
| DE4430204A1 (de) * | 1994-08-26 | 1996-02-29 | Behringwerke Ag | Arzneimittel, welches als Gegenmittel für Blut-Antikoagulanzien geeignet ist und seine Verwendung |
| AT403167B (de) * | 1994-11-14 | 1997-11-25 | Immuno Ag | Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems |
| AT404357B (de) * | 1995-06-13 | 1998-11-25 | Immuno Ag | Prothrombin-derivate |
| DE59712322D1 (de) * | 1996-03-20 | 2005-06-30 | Baxter Ag | Pharmazeutisches Präparat zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen |
| US6747003B1 (en) | 1997-10-23 | 2004-06-08 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US7247708B2 (en) | 1997-10-23 | 2007-07-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| EP2319541A1 (en) | 2000-02-11 | 2011-05-11 | Bayer HealthCare LLC | Factor VII or VIIA-like conjugates |
| EP1136553A1 (en) * | 2000-03-22 | 2001-09-26 | Octagene GmbH | Production of recombinant blood clotting factors in human cell lines |
| EP1266006B1 (en) * | 2000-03-22 | 2005-12-07 | Octagene GmbH | Production of recombinant muteins of blood clotting factor viii in human cell lines |
| US7812132B2 (en) | 2000-04-28 | 2010-10-12 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US7220837B1 (en) | 2000-04-28 | 2007-05-22 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US20030211094A1 (en) | 2001-06-26 | 2003-11-13 | Nelsestuen Gary L. | High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides |
| BR0309576A (pt) | 2002-04-30 | 2005-02-09 | Maxygen Holdings Ltd | Variante de polipeptìdeo do fator vii (fvii) ou fator viia (fviia), sequência de nucleotìdeo, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, uso de uma variante, e, método para tratar um mamìfero que tenha uma doença ou um distúrbio em que a formação de coágulo é desejável |
| ES2386010T3 (es) | 2003-03-20 | 2012-08-07 | Bayer Healthcare Llc | Variantes de FVII o FVIIa |
| KR101191779B1 (ko) | 2003-06-19 | 2013-01-14 | 맥시겐 홀딩스 엘티디 | 인자 ⅶ 또는 ⅶ에이 지엘에이 도메인 변종들 |
| JP6245299B2 (ja) * | 2016-04-27 | 2017-12-13 | バクスアルタ ゲーエムベーハー | 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8508845D0 (en) * | 1985-04-04 | 1985-05-09 | Hoffmann La Roche | Vaccinia dna |
| AU8339187A (en) * | 1986-11-17 | 1988-06-16 | New England Medical Center Hospitals, Inc., The | Enhancing gamma-carboxylation of recombinant vitamin k-dependent proteins |
| WO1989012685A1 (en) * | 1987-05-18 | 1989-12-28 | Integrated Genetics, Inc. | Improved protein c molecules and method for making and activating same |
| FR2619314B1 (fr) * | 1987-08-11 | 1990-06-15 | Transgene Sa | Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant |
| DE3813093A1 (de) * | 1988-04-19 | 1989-11-09 | Immuno Ag | Rekombinantes plasmid, verfahren zum herstellen eines rekombinanten avipoxvirus, rekombinantes avipoxvirus und dessen verwendung |
| FR2638643B1 (fr) * | 1988-11-09 | 1991-04-12 | Transgene Sa | Sequence d'adn codant pour le facteur ix humain ou une proteine analogue, vecteur d'expression, cellules transformees, procede de preparation du facteur ix et produits obtenus correspondants |
-
1991
- 1991-01-24 DE DE69101634T patent/DE69101634T4/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-24 HU HU922435A patent/HUT63459A/hu unknown
- 1991-01-24 FI FI923347A patent/FI923347A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-01-24 DK DK91903050.2T patent/DK0512011T3/da active
- 1991-01-24 AT AT91903050T patent/ATE103982T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-24 ES ES91903050T patent/ES2052368T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-24 CA CA002073859A patent/CA2073859A1/en not_active Abandoned
- 1991-01-24 WO PCT/EP1991/000139 patent/WO1991011519A1/en not_active Ceased
- 1991-01-24 DE DE91903050A patent/DE69101634D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-24 EP EP91903050A patent/EP0512011B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-24 JP JP3503086A patent/JP2549224B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-25 CS CS91172A patent/CS17291A2/cs unknown
-
1992
- 1992-07-24 NO NO92922953A patent/NO922953L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU9202435D0 (en) | 1992-10-28 |
| WO1991011519A1 (en) | 1991-08-08 |
| FI923347A7 (fi) | 1992-07-23 |
| EP0512011B1 (en) | 1994-04-06 |
| DE69101634T2 (de) | 1994-08-18 |
| FI923347L (fi) | 1992-07-23 |
| NO922953D0 (no) | 1992-07-24 |
| HUT63459A (en) | 1993-08-30 |
| DK0512011T3 (da) | 1994-05-09 |
| NO922953L (no) | 1992-09-04 |
| ES2052368T3 (es) | 1994-07-01 |
| JP2549224B2 (ja) | 1996-10-30 |
| EP0512011A1 (en) | 1992-11-11 |
| DE69101634D1 (de) | 1994-05-11 |
| FI923347A0 (fi) | 1992-07-23 |
| DE69101634T4 (de) | 1994-12-01 |
| ATE103982T1 (de) | 1994-04-15 |
| CA2073859A1 (en) | 1991-07-27 |
| JPH05507401A (ja) | 1993-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CS17291A2 (en) | Recombinantly prepared blood factors, method of stated blood factors expression and also recombinants of virus of vaccine that is used in stated process | |
| CA2076839C (en) | Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome | |
| AU625584B2 (en) | Recombinant poxvirus host selection system | |
| US5225336A (en) | Recombinant poxvirus host range selection system | |
| KR101005630B1 (ko) | 수두 바이러스 게놈내로 삽입된 상동 유전자를 발현하는재조합 수두 바이러스 | |
| Tomalski et al. | A baculovirus homolog of aCu/Znsuperoxide dismutase gene | |
| Banerjea et al. | High-level synthesis of biologically active reovirus protein σ1 in a mammalian expression vector system | |
| JPH05192165A (ja) | 組換え鶏痘ウイルス | |
| JP2936201B2 (ja) | ヒト第▲ｉｘ▼因子または類似の蛋白質をコードするｄｎａ配列、発現ベクター、形質転換された細胞、第▲ｉｘ▼因子の製造方法および得られた対応する生成物 | |
| CA2094821A1 (en) | Vaccinia vectors, vaccinia genes and expression products thereof | |
| JPH0365191A (ja) | スフェロイジン単離ｄｎａおよび組み換え昆虫ポックスウィルス発現ベクター | |
| Li et al. | Expression of the M gene of vesicular stomatitis virus cloned in various vaccinia virus vectors | |
| WO1990012101A1 (en) | Vaccinia vectors, vaccinia genes and expression products thereof | |
| Mathur et al. | Expression of L protein of vesicular stomatitis virus Indiana serotype from recombinant baculovirus in insect cells: requirement of a host factor (s) for its biological activity in vitro | |
| Falkner et al. | High level expression of active human prothrombin in a vaccina virus expression system | |
| US10208101B2 (en) | Recombinant fibrinogen high-production line and method for producing same | |
| Takehara et al. | Secretion of recombinant rat annexin 5 by insect cells in a baculovirus expression system | |
| CA2515166C (en) | Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome | |
| CA2558864C (en) | Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome | |
| Himly et al. | Defective vaccinia virus as a biologically safe tool for the overproduction of recombinant human secretory proteins | |
| CA2617830C (en) | Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome | |
| SK277781B6 (en) | Peptides and polypeptides, vaccines and nucleous acid | |
| IE60641B1 (en) | Human protein s, a plasma protein regulator of hemostasis | |
| JPH02156883A (ja) | 組み換えワクチニアウイルス |