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CN211814384U - 用于核酸测序的装置 - Google Patents

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CN211814384U
CN211814384U CN201922326915.2U CN201922326915U CN211814384U CN 211814384 U CN211814384 U CN 211814384U CN 201922326915 U CN201922326915 U CN 201922326915U CN 211814384 U CN211814384 U CN 211814384U
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迈克尔·约翰·埃里克斯塔德
埃里克·比利亚雷亚尔
威什纳维·巴拉克尔什南
齐妮娅·阿帕里西奥
阿诺德·奥利芬特
丽贝卡·麦金利
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Omni Europe And America
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Abstract

本实用新型提供了一种用于核酸测序的装置，包括：(a)与流动池接触的载物台，其中，流动池包括至少一个检测通道，其中，检测通道用于容纳核酸阵列；(b)检测器，所述检测器被配置为观察检测通道中的核酸阵列；(c)多个贮存器，所述贮存器中存储有用于对核酸阵列进行测序的试剂；(d)多个流体输送通道，其中，所述流体输送通道将多个贮存器流体连接至流动池的检测通道；(e)第一加热器，所述第一加热器将热量传递到多个流体输送通道；以及(f)第二加热器，所述第二加热器将热量传递到流动池的检测通道。

Description

用于核酸测序的装置
相关申请的交叉引用
本申请是基于并且要求2018年12月20日提交的美国临时申请号62/782,565的权益，将其通过引用并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及化学和生物分析物的检测，并且对核酸测序具有特定的适用性。
背景技术
模板核酸链的准确序列确定对于分子诊断很重要。从已知位置的替代物中鉴定单个核苷酸碱基可以用作分析单个核苷酸多态性(即“SNP”)的基础。SNP又可以用于确定个体的表型，例如对疾病的易感性或具有期望性状的倾向。检测患者的遗传变异可以表明某些药物治疗患者的功效或在用某些药物治疗患者时出现不良副作用的风险。
市售的核酸测序平台极大地增加了我们对可操作性状的遗传基础的了解。测序生物化学和检测硬件的改进仍在继续。然而，尽管在研究实验室中广泛使用，但是当前可用的测序平台的成本抑制了在临床中采用测序。同样，测序平台在时间范围内提供符合患者和治疗他们的医生的期望的诊断或预后答案方面相对较慢。
实用新型内容
本公开提供了一种用于执行分析程序例如确定核酸序列的装置。该装置包括：(a)载物台，所述载物台被配置为支撑流动池；(b)检测器，所述检测器被配置成当流动池由载物台支撑时观察流动池的检测通道；(c)多个流体输送通道，其中每个流体输送通道均将贮存器流体连接至流动池的检测通道；以及(d)第一加热器，所述第一加热器被配置为加热多个流体输送通道。
本公开还提供了一种用于核酸测序的装置，包括：(a)与流动池接触的载物台，其中，流动池包括至少一个检测通道，其中，检测通道用于容纳核酸阵列；(b)检测器，所述检测器被配置为观察检测通道中的核酸阵列；(c)多个贮存器，所述贮存器中存储有用于对核酸阵列进行测序的试剂；(d)多个流体输送通道，其中，所述流体输送通道将多个贮存器流体连接至流动池的检测通道；(e)第一加热器，所述第一加热器将热量传递到多个流体输送通道；以及(f)第二加热器，所述第二加热器将热量传递到流动池的检测通道。
附图说明
图1示出了具有多个用于加热流体管的凹槽的铝热导体。
图2示出了示例性核酸测序系统的框图。
图3示出了基于1层热模型流动池中水温与位置的关系图。
图4示出了基于1层热模型在流动池中启动水流期间和之后的各个时间点，流动池中的水温与位置的关系图。
图5示出了基于三层热模型流动池中水温与位置的关系图。
图6示出了基于3层热模型在流动池中启动水流期间和之后的各个时间点，流动池中的水温与位置的关系图。
图7示出了用于评估进入流动池之前的预热流体的热性能的测试装置。
图8A示出了从评估进入流动池之前的流体的热特性而获得的表格结果；图8B示出了从评估进入流动池之前的流体的热性质获得的结果的曲线图。
图9示出了用于评估流经流动池时预热流体的热性能的测试装置。
图10A示出了从评估流过流动池的流体的热性质获得的表格结果；图10B示出了从评估流过流动池的流体的热性质获得的结果的曲线图。
图11示出了核酸测序装置的几个部件的组件的立体图。
图12示出了路由歧管、吸管阵列、旋转阀和传导加热器的俯视图。
图13示出了路由歧管、吸管阵列、旋转阀和传导加热器的仰视图。
图14A示出了核酸测序系统和流动池之间的流体连接的立体图；图14B示出了相同的立体图，但是连接器被断开。
图15示出了测序装置1000的主视图，并且包括阴影线的箭头指示热传导的方向。
具体实施方式
许多分析程序对温度敏感。在这种情况下，温度波动不超过典型实验室周围环境所经历的波动，会对从分析程序中获得的结果产生不利影响。对于使用生物成分(例如酶)的分析，与典型实验室的环境温度相比，可以提高最佳温度。例如，哺乳动物中存在的许多酶在哺乳动物的体温或体温附近(即约36℃至40℃)具有最佳活性。许多有用的酶(例如聚合酶)都来自嗜热菌，或经过改造可在更高的温度下运行。此类酶可用于温度在50℃至80℃之间的分析过程中。从这些升高的范围到典型实验室的环境温度的温度变化可能导致重要分析过程(例如临床诊断或预后测试)中使用的试剂活性发生重大变化。因此，重要的是调节分析装置的温度以获得高质量的结果。
对于某些分析装置而言，一个相互矛盾的问题是试剂在装置的工作温度下的不稳定性。在许多情况下，希望甚至需要在使用前在降低的温度下存储试剂。例如，在高温下使用的嗜热性聚合酶或其他试剂可以在室温(约25℃)或更低的温度下保存，以最大程度地减少灭活。然后可以在进行分析过程的反应容器中加热试剂。
对于某些分析过程，可以将处于较低温度的试剂添加到处于高温的容器中，并使试剂达到平衡，直到试剂达到高温。实际上，有各种各样的加热装置和反应容器可用于相对快速地加热反应混合物，例如，用于聚合酶链反应(PCR)的Peltier加热器。但是，加热试剂会花费时间，并且延长孵育时间对分析过程的影响可能是有害的。
进行包括多个试剂更换的过程的装置提出了一组独特的挑战。核酸测序过程提供了一个示例。许多测序过程是循环进行的，使得当检测序列中的每个核苷酸时，试剂会从容器中释放出来。此外，每个循环通常包括多个不同的子步骤，每个子步骤涉及将不同的试剂输送到容器。尽管测序反应通常在升高的温度下发生，但许多测序试剂在升高的温度下不稳定，因此在贮存器中测序试剂保持在较低的温度。市售的测序平台利用加热载物台来支撑发生测序反应的流动池或其他容器，这已被证明可以提供令人满意的结果。
本公开至少部分地基于以下观察：存储测序试剂的贮存器与加热的流动池之间的温差会对核酸测序结果产生不利影响，在该流动池中，测序试剂必须平衡至不同的温度才能进行反应或检测。这种不利影响包括，例如，在试剂平衡到流动池温度的时间段内，由于发生副反应或测序反应不完全而导致碱基错误；由于流动的流体试剂升温不一致(例如，流动池中靠近流体入口的区域的温度与最靠近出口的区域的温度不同)，在流动池的不同位置观察到的结果不一致；由于在与加热器接触的流动池表面上的试剂与位于远离流动池表面的流动池内部空间中的相同类型的试剂之间出现的温度梯度，会导致异常结果。
因此，本公开提供了可以减少测序时间，降低测序成本，减少试剂体积并且还提供相关优点的流体系统和方法。例如，提供一种用于执行分析程序，例如确定核酸序列的装置。该装置包括(a)载物台，所述载物台被配置为支撑流动池；(b)检测器，所述检测器被配置成当流动池由载物台支撑时观察流动池的检测通道；(c)多个流体输送通道，其中每个流体输送通道均将贮存器流体连接至流动池的检测通道；以及(d)第一加热器，所述第一加热器被配置为加热多个流体输送通道。
本公开的装置可利用流动池。如本文所用，“流动池”是包括一个或多个将流体引导至检测区域的通道的反应室。检测区域可以在功能上耦合至检测器，使得可以观察到在通道中发生的反应。例如，流动池可包含栓接到表面的引发的模板核酸分子，在其上反复施加核苷酸和辅助试剂并洗去。流动池可以包括透明材料，该透明材料允许在发生期望的反应之后使样品成像。例如，流动池可以包括载有检测通道的玻璃或塑料载玻片，通过该检测通道可以泵送聚合酶、dNTP和其他流体成分。通道内的玻璃或塑料可以用一个或多个待测序的引发的模板核酸分子修饰。可以放置外部成像系统以在检测通道中的检测区域或检测通道中的表面上检测分子。示例性的流动池、它们的制造及使用方法在美国专利申请16/141,896(对应的美国专利申请公开号为2019/0055598 A1)、美国专利申请公开号2010/0111768 A1或2012/0270305 A1或WO 05/065814中被描述，将其每一个通过引用并入本文。
在本文的装置中，流动池可包括固体支持物，一种或多种目标分析物或试剂附着于该固体支持物。一种特别有用的固体支持物是具有一系列位点的固体支持物。如本文所用，术语“阵列”是指附着于一个或多个固体支持物上的分子群，从而可以将一个位点的分子与其他位点的分子区分开。阵列可以包括不同的分子，每个分子位于固体支持物的不同可寻址位点。或者，阵列可以包含单独的固体支持物，每个固体支持物充当带有不同分子的位点，其中可以根据固体支持物在其上附着的表面上的位置，或根据固体支持物在液体例如流体流中的位置来识别不同的分子。阵列的分子可以是例如核苷酸、核酸引物、核酸模板、引发的核酸模板或核酸酶，例如聚合酶、连接酶、核酸外切酶或其组合。
如本文所用，当提及阵列时，术语“位点”是指阵列中存在特定分子的位置。一个位点只能包含一个分子，也可以包含几个相同物种的分子(即这些分子的集合)。或者，位点可包括一群不同物种的分子(例如，一群具有不同模板序列的三元复合物)。阵列的位点通常是离散的。离散的位点可以是连续的，也可以在彼此之间具有间隙。可用于本文的阵列可具有例如小于100微米、50微米、10微米、5微米、1微米或0.5微米的位点。替代地或另外，阵列可以具有被至少0.5微米、1微米、5微米、10微米、50微米或100微米分开的位点。位点的面积可以均小于1平方毫米、500平方微米、100平方微米、25平方微米、1平方微米或更小。
如本文所用，术语“固体支持物”是指不溶于水性液体的刚性基质。基质可以是无孔的或多孔的。基质可以任选地能够吸收液体(例如由于孔隙)，但是通常将具有足够的刚性，以使基质在吸收液体时基本上不溶胀，并且在通过干燥除去液体时基本上不收缩。无孔固体支持物通常对于液体或气体是不可渗透的。示例性固体支持物包括但不限于玻璃和改性或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯TM、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、ZeonorTM、二氧化硅或二氧化硅基材料，包括硅和改性硅、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物。
阵列具有促进多重检测的优点。例如，不同的试剂或分析物(例如细胞、核酸、蛋白质、候选小分子治疗剂等)可以通过每个不同分析物与阵列的特定位点的连接而附着于阵列。可用的示例性阵列基质包括但不限于可从Illumina，Inc.(加利福尼亚州圣地亚哥)获得的BeadChipTM阵列或诸如美国专利6,266,459、6,355,431、6,770,441、6,859,570或7,622,294，或PCT公开号WO 00/63437中所描述的阵列，将其每一个通过引用并入本文。可以使用的市售阵列的其他示例包括，例如，Affymetrix GeneChipTM阵列。根据一些实施例，也可以使用点阵列。示例性点阵列是可从Amersham Biosciences获得的CodeLinkTM阵列。另一个有用的阵列是使用喷墨打印方法(例如可从安捷伦科技公司获得的SurePrintTM技术)制造的阵列。
其他有用的阵列包括在核酸测序应用中使用的阵列。例如，包括连接的基因组片段的扩增子(通常称为簇)或用于产生此类扩增子的阵列可能特别有用。可以修改以用于本文的阵列及其制造方法的示例包括在Bentley等，Nature 456：53-59(2008)、PCT公开号WO91/06678、WO 04/018497或WO 07/123744，美国专利7,057,026、7,211,414、7,315,019、7,329,492或7,405,281，或美国专利申请公开号2008/0108082中描述的那些，将其每一个通过引用并入本文。
阵列的位点之间的距离小于100μm、50μm、10μm、5μm、1μm或0.5μm。在特定实施例中，阵列的位点的面积可以均大于约100nm2、250nm2、500nm2、1μm2、2.5μm2、5μm2、10μm2、100μm2或500μm2。替代地或附加地，阵列的位点的面积可以均小于约1mm2、500μm2、100μm2、25μm2、10μm2、5μm2、1μm2、500nm2或100nm2。实际上，位点的大小可以在选自以上示例的上限和下限之间的范围内。阵列可以具有多种密度中的任何密度的位点，包括例如至少约10个位点/cm2、100个位点/cm2、500个位点/cm2、1,000个位点/cm2、5,000个位点/cm2、10,000个位点/cm2、50,000个位点/cm2、100,000个位点/cm2、1,000,000个位点/cm2、5,000,000个位点/cm2或更高。本文阐述的装置或方法可以用于以足以区分处于上述密度的位点或位点分离的分辨率检测阵列。
尽管在本文中已经示例了关于检测附着到流动池中固体支持物的分析物的本公开的装置的几个方面，但是应当理解，分析物不必附着在固体支持物上，而可以在溶液相中在流动池中被检测到。此外，不需要使用流动池，甚至不需要将流动池配置用于光学检测。相反，可以使用本领域技术人员已知的用于执行那些检测方式的组合物和方法，将流动池配置为替代检测方式。
本装置的几种配置利用光学检测流动池中的分析物。因此，流动池可包括一个或多个通道，每个通道具有至少一个透明窗口，例如光学透明窗口。在特定实施例中，窗口对于特定光谱范围内的辐射可以是透明的，包括但不限于X射线、紫外线(UV)、可见光(VIS)、红外线(IR)、微波和无线电波辐射中的一种或多种。在某些情况下，分析物附着在窗口的内表面上。替代地或另外地，一个或多个窗口可以提供对附着有分析物的内部基质的视图。例如在美国专利申请公开号2010/0111768 A1、WO 05/065814、或美国专利申请公开号2012/0270305 A1中描述了可用于本文阐述的方法或装置的示例性流动池和流动池的物理特征，将其每一个通过引用整体并入本文。
流动池可以由具有较高导热率的材料制成，例如，以允许热量在流动池的内容物和流动池外部的加热器或冷却器之间有效地传递。因此，流动池材料的导热率可以是每米开尔文至少为1瓦特(W/(m·K)、10W/(m·K)、100W/(m·K)、1000W/(m·K)或更高。替代地，流动池材料可以具有相对较低的热导率，例如，以帮助使流动池的内容物免受由于流动池壁上的温度梯度引起的冷却或加热的影响。因此，流动池材料可以具有低于1W/(m·K)的热导率。例如，热导率可以为至多1W/(m·K)、0.1W/(m·K)、0.01W/(m·K)或更低。
流动池可以具有一个或多个检测通道。检测通道可以对大气(或其他周围环境)封闭，例如在流动池结构内部形成管或隧道。检测通道可具有多种横截面形状中的任何一种，包括例如圆形、椭圆形、三角形、正方形、矩形、多面体或其他闭合形状。检测通道的横截面在其整个长度上可以是均匀的。例如，具有圆形横截面的在整个通道长度上均匀的检测通道将具有圆柱形状，而具有圆形横截面的在通道的长度上增加或减少的检测通道将具有圆锥形或漏斗形。检测通道的横截面积可以为至少约1μm2、10μm2、100μm2、1mm2、10mm2或100mm2或更大。替代地或附加地，检测通道的横截面面积可以至多为约100mm2、10mm2、1mm2、100μm2、10μm2、1μm2或更小。流动池中检测通道的体积可以为至少约1nL、10nL、100nL、1μL、10μL、100μL、1mL、10mL或更多。替代地或附加地，流动池中的检测通道的体积最多为约10mL、1mL、100μL、10μL、1μL、100nL、10nL、1nL或更小。
在一些配置中，流动池是流体系统的固定部件，例如，需要专门的工具和/或专门的培训才能将其移除。或者，流动池可以是流体系统的可移动部件。例如，本公开的装置可以包括被配置为方便流动池的放置和移除的载物台。因此，流动池可以是专用于第一分析测试的消耗部件，然后被移除以被用于第二分析测试的第二流动池代替。
流动池中可以存在多种分析物。示例性分析物包括但不限于本文阐述或本文引用的参考文献中的分析物。特别有用的分析物参与核酸测序过程。因此，流动池可包含一种或多种核酸(例如引物、模板或引物模板)、聚合酶、聚合酶抑制剂、聚合酶辅因子、核苷酸、核酸结合蛋白、核苷酸解封闭剂等。在一些配置中，提供了流动池，该流动池包括固定在流动池内部的稳定的三元复合物，其中该稳定的三元复合物包括聚合酶、引发的模板核酸和用于模板的下一个正确的核苷酸。
可以通过包括至少一个流体输送通道的流体系统将流体试剂转移至流动池。在许多配置中，几种不同的流体试剂将被输送到流动池。因此，流体系统可包括多个流体输送通道。单个流体输送通道可专用于输送一种类型的流体试剂(例如，从单个贮存器中输送)，或者，可将单个流体输送通道配置成输送一种以上不同类型的流体试剂(例如，单个流体输送通道可输送来自两个或更多个不同贮存器的流体)。
流体输送通道可以由流体技术领域中已知的多种材料中的任何一种制成。通常，优选选择对试剂、溶剂和其他流体成分呈惰性的材料，该试剂、溶剂和其他流体成分在转移时会与该材料接触。例如，在核酸测序或其他分析方法的背景下，材料可以对本文所述或本文引用的参考文献中的流体试剂是惰性的。
在一些配置中，用于流体输送通道的材料足够多孔以允许气体通过该材料传输(例如用于脱气目的)，但不是以允许液体通过该材料传输的多孔。或者，可以选择不允许气体通过的材料。可以根据材料的能力(或无能力)选择材料，以适应特定气体的通过，例如氧气、氮气、氩气或大气中的一种或多种。
本公开的装置特别适用于小体积流体系统，例如微流体或中流体系统。在微流体系统中，通道的内径或宽度可以在约10μm至约1mm的范围内。在中流体系统中，通道的内径或宽度可以在刚好超过1mm至约10cm的范围内。如果期望的话，本公开的装置可以应用于更高体积的系统，例如大流体系统。
在特定配置中，流体输送通道将被加热或冷却。可以选择用于流体输送通道的材料，以在所使用的加热或冷却条件下具有有利的性能。感兴趣的示例性性质包括但不限于材料的化学稳定性、材料的结构完整性、材料的柔韧性、脱气的孔隙率、有限的膨胀、在经历的温度范围内的收缩等。该材料可以是刚性的或柔性的以适合特定的配置。
还可以选择用于一个或多个流体输送通道的材料以具有高的热活性，以允许热量从加热器有效地传递到流体输送通道中的流体。因此，流动池材料的导热率可以是每米开尔文至少为1瓦特(W/(m·K)、10W/(m·K)、100W/(m·K)、1000W/(m·K)或更高。替代地，流动池材料可以具有相对较低的热导率，例如，以帮助使流动池的内容物免受由于流动池壁上的温度梯度引起的冷却或加热的影响。因此，流动池材料可以具有低于1W/(m·K)的热导率。例如，热导率可以为至多1W/(m·K)、0.1W/(m·K)、0.01W/(m·K)或更低。
可用于流体输送通道的示例性材料包括但不限于硅树脂，例如SilconTM、SilbradeTM或TygonTM；含氟聚合物，例如全氟烷氧基(PFA)、TeflonTM或聚四氟乙烯(PTFE)；聚醚醚酮(PEEK)；聚醚酰亚胺
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；聚乙烯；聚丙烯；聚氨酯；尼龙；聚氯乙烯(PVC)；金属，例如铜或铝；碳纤维等。
本公开的装置可以进一步包括加热器，该加热器被配置为将热量传递到一个或多个流体输送通道。加热器可以定位成加热流体输送通道的至少一部分，该部分在流动池的上游。这样，流体输送通道中的流体在被输送到流动池之前将被加热。通常，流体将来自温度较低的贮存器。例如，储层可以将流体保持在室温(约25℃)或冷却温度(低于25℃、20℃、10℃或5℃)。可以加热流体输送通道，以使通道中的流体达到高于贮存器的温度，例如，流体输送通道的加热器的设定点至少要比贮存器中流体的温度高30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或更高。用于流体输送通道的加热器的设定点可以低于特定最大值，例如最高100℃、80℃、70℃、60℃、50℃、40℃、30℃或更低。用于流体输送通道加热器的设定点可以是介于容器的设定点和通过流体输送通道连接到容器的流动池的设定点之间的中间值。将理解的是，贮存器可以经受环境温度，或者贮存器的温度可以通过加热器或冷却器来控制。用于贮存器的加热器或冷却器可具有设定点，该设定点在本文中对于流体输送通道加热器所例示的值或范围内。
一个或多个流体输送通道可通过热导体加热，从而热量通过热源与通道之间的物理接触传递。替代地或附加地，可以通过热导体加热流动池，从而通过热源和流动池中的检测通道之间的物理接触来传递热量。热源的传导材料可以是固体、液体或凝胶。可以由其制成热导体的示例性固体材料包括但不限于石墨烯、金刚石、铝、钢、铅、铜、金、银或诸如铝合金的金属合金。可制成热导体的示例性液体材料包括但不限于：液态金属，例如汞；油；醇，例如甲醇、甘油、正丙醇或正丁醇；乙二醇等乙二醇；或水。这些液体也可以循环通过流体输送通道，以通过对流加热。可以制成热导体的示例性凝胶材料包括但不限于由环氧树脂、硅酮、氨基甲酸酯、丙烯酸酯、氧化铝、氮化硼、氧化锌或氮化铝组成的那些。也可以使用市售的导热油脂或导热凝胶。
待加热的流体输送通道可在加热器的导电材料内通过，从而通道的穿过导电材料的部分的整个外部周边与该材料接触。这样，流体输送通道形成穿过加热器的导电材料的隧道。可替代地，可以将导电材料定位成接触小于沿导电材料穿过的通道的所有侧面(或小于整个外部周边)。可以将用于将热量传导至流体输送通道的固体或凝胶材料成形为与流体输送通道所需的接触量。例如，固体或凝胶材料可以具有通道通过的凹槽，通道在之间通过的脊等。
图1示出了具有十二个凹槽的铝热导体。凹槽板配置为加热具有1/32英寸内径和5/32英寸外径的硅树脂管的12英寸长的部分。凹槽的形状或尺寸可被修改以容纳不同尺寸或形状的通道，包括但不限于本文阐述的形状或尺寸。一根单独的管可以穿过每个凹槽，使管外径的约180度与铝直接接触。不与金属接触的管外径的其他180度可以与周围大气接触。在类似的配置中，可以将凹槽和管安装成接触或传导地加热通道的外径(或非圆柱通道的局部周长)的至少10％、25％、50％、75％、90％、99％或以上。替代地或附加地，凹槽和管可以安装成接触或传导地加热通道的外径(或非圆柱通道的局部周长)的至多99％、90％、75％、50％、25％、10％或更少。在一些配置中，通道的整个外表面与加热器接触。
可以通过与加热元件接触来加热凹槽板。例如，可以通过四个3英寸乘3英寸的24VDC加热垫来加热图1的凹槽板。凹槽板配置允许相对较大的接触面积以进行热传导，同时允许气体通过管的其余外表面传输。这样，管中的流体可以在加热的同时脱气。通过将流体输送通道的至少一部分(例如，被加热的一部分或热源下游的一部分)放置在真空夹套或气流夹套中可以促进脱气。真空或气体流可以起到消散通过通道的多孔壁离开的气体的作用，从而将气体从流体输送通道的内部拉过多孔材料。根据质量作用定律，从通道外部的环境中除去气体可以使气体通过通道壁。
可以通过散热器或对流加热器加热一个或多个流体输送通道，从而在热源与通道之间没有直接接触的情况下传递热量。替代地或附加地，可以通过散热器或对流加热器来加热流动池，从而在热源与流动池中的检测通道之间没有物理接触的情况下传递热量。
加热流体输送通道的另一种选择是使用焦耳加热器代替加热垫。焦耳加热器可以具有一个或多个与流体输送通道接触的加热元件，例如，该元件可以平行于流体输送通道延伸。焦耳加热器的加热元件可以存在于凹槽板中，例如，形成该板的基底的一部分或限定凹槽的脊的一部分，或者可以使用该元件代替凹槽。
可以隔离流体输送通道及其加热器，以最大程度地减少热损失。例如，加热块、加热元件和流体输送通道可以被绝缘材料围绕，以防止多余的热量从预热器散发出去。这可以提供减少功率消耗并使预热器与周围部件热隔离的益处。
可以通过对流加热器加热一个或多个流体输送通道，从而热量从移动通过检测通道外壁的加热流体(即液体或气体)传递。对流加热器可以将热量从循环流体传递到与流体接触的流体输送通道的外壁。类似地，可以通过对流加热器加热流动池中的一个或多个检测通道，从而热量从移动通过检测通道外壁的加热流体(即液体或气体)传递。对流加热器可以将热量从循环流体传递到与流体接触的检测通道的外壁。用于对流加热的流体可以选自以上示例性用于传导加热的液体。多种气体中的任何一种都可以用于对流加热，包括例如惰性气体，例如氩气、氮气、氦气或氖气，混合气体例如大气，以及其他气体。
一个或多个流体输送通道可通过散热器被加热，从而热量从靠近该通道的热源传递。当通过真空(例如通过真空夹套)或通过气体(例如通过气流夹套)加热流体输送通道时，热辐射特别有用。
用于流体输送通道的加热器可以与本文阐述的装置的一个或多个其他部件热隔离。例如，流动池可以被绝缘，使得流动池的外表面不直接从用于加热流体输送通道的加热器接收热量。在这种配置中，由于由流体输送通道加热器加热的流体的进入，流动池可能会被加热，但是，除非通过间接方式(例如通过流动池内部的流体)，否则不会将热量传递到流动池的外部。用于流体输送通道的加热器可以与分析装置的其他部件热隔离，例如计算机处理器、试剂容器、检测器、电子设备等。因此，加热器和将被加热的流体输送通道可以存在于与其他部件所在的一个或多个腔室隔离的一腔室中。类似地，用于流动池的加热器可以与本文阐述的装置的一个或多个其他部件热隔离。例如，可以隔离一个或多个流体输送通道，使其不直接从用于加热流动池的加热器接收热量。
可选地，直接加热流体输送通道的加热器可以被配置为还直接加热本文阐述的装置的另一部件。例如，加热器可以被配置为直接加热流体输送通道和流动池。加热器可以通过相同的机制(例如，传导、对流或辐射)加热多个系统部件。继续前面的示例，加热器可以物理接触流体输送通道和流动池，以通过传导将热量传递给两者。例如，流体输送通道可以沿着加热的块的第一侧通过，流动池可以放置在块的第二侧，也可以将流动池放置在块的与流体输送通道相同的另一侧。或者，两个不同的部件可以通过相同的机制从同一加热器接收热量。例如，加热器可以与流体输送通道直接接触以通过传导传递热量，并且加热器可以在流动池附近以通过辐射或对流传递热量。因此，当加热时，流体输送通道的外表面(或其一部分)和流动池的外表面(或其一部分)可以存在于同一腔室内。相反，加热器可以与流动池直接接触以通过传导传递热量，并且加热器可以靠近一个或多个流体输送通道以通过辐射或对流传递热量。在一些配置中，辐射或传导热可以被传递到诸如旋转阀的阀。
加热器可以被配置成加热流体输送通道的限定的内部体积。在流体停留在输送通道中的情况下，被加热的流体的体积可以大致等于被加热的通道内部的体积。被加热的流体输送通道的内部体积可以小于、等于或大于将加热的流体将传递到的流动池中的检测通道的内部体积。例如，流体通道的内部体积可以是检测通道的体积的至少10％、50％、90％、100％，或至少比检测通道的体积大2倍、3倍、5倍、10倍或更大。替代地或附加地，流体通道的内部体积最多比检测通道的体积大10倍、5倍、3倍或2倍，或最多比检测通道的体积小100％、90％、50％、10％或更小。加热器可以配置为加热一个或多个流体输送通道的等效内部体积。可替代地，在本文阐述的方法或装置中使用的流体试剂可以关于要被加热的流体的体积而不同。因此，流体输送通道在将被加热的内部体积方面可以不同。可选地，可以加热流体输送通道的第一子集，并且可以将流体输送通道的第二子集与任何或所有专用热源基本隔离或隔开。
加热时，流体不必停在流体输送通道中。而是，可以根据加热器的设定点温度以及加热器和流体系统的其他特性来调整流体流速，以在进入流动池的检测通道时实现流体的期望温度。无论流体是静止的还是加热时流动的，该装置可以被配置为加热等于检测通道的体积至少10％、50％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或更多的流体体积。替代地或附加地，该装置可以被配置为加热等于检测通道的体积最多等于10倍、5倍、3倍、2倍、100％、90％、50％、10％或更少的流体体积。加热器可以被配置为加热一个或多个流体输送通道的等效体积。可替代地，在本文阐述的方法或装置中使用的流体试剂可以关于要被加热的流体的体积而不同。通过调整被加热的通道的内部体积、加热器的温度、流体传输通道的导热率以及流经通道加热部分的流体的流速中的一个或多个，可以达到任何一种结果。
流体输送通道的温度可以例如通过恒温器来调节。恒温器可以配置为测量加热器的加热部件(例如，凹槽板、固相块、或液槽)、一个或多个流体输送通道的表面或通过流体输送通道的加热部分的流体的温度。可以在流体输送通道的被加热的部分中或在加热部分的下游点处检测流体的温度。在一些配置中，可以使用多个温度检测器，例如，将其放置在通道的加热部分中、加热部分的出口处以及加热部分下游的一个或多个位置处。一个或多个温度检测器可以在加热部分的上游。特别有用的恒温器使用热电偶，例如K型热电偶或J型热电偶。在下面的实施例II中阐述了流体系统中的示例性温度传感器和示例性布置。这样的传感器可以在恒温器中用于调节流体输送通道加热器的温度。
可以在本公开的装置或方法中调节流体压力。压力传感器可以被配置为检测压力并提供反馈回路，以将压力调节至所需水平。压力传感器可以放置在与本文关于温度传感器所述的位置相似的位置。例如，可以将压力传感器放置在流体输送通道的下游或上游、流体输送通道加热器的下游或上游、流动池的下游或上游、试剂贮存器的下游或废液贮存器的上游。
本公开的装置可包括一个或多个贮存器。贮存器可以向大气开放，并且可以通过将一系列吸管降低到贮存器中来进行访问。贮存器可以由多种材料中的任何一种制成，包括但不限于本文关于流体输送通道、流动池或阵列所阐述的那些。贮存器通常是完全封闭的。这可以提供避免污染的优点。如果需要的话，可以对贮存器加压，例如以抑制试剂的脱气，否则将导致在下游流体组分中形成不希望的气泡。加压还可以提供将流体从贮存器驱动到流动池的优势。螺口瓶特别有用，但也可以使用其他腔室。贮存器可以永久固定在装置上，可以从较大的装置上单独放置或取出，也可以组合成可方便地一次批量放置或取出多个贮存器的射流滤筒或罐。贮存器可包含本文所述或本文引用的参考文献中所述的试剂，用于测序过程或其他分析过程。
每个贮存器可具有专用的流体输送通道。如本文所述，可以在将流体转移到流动池之前加热一个或多个流体输送通道。使用专用于特定流体试剂的流体输送通道，例如通过专用于单个容器，可以提供以下优点：最小化流动池上游的有害交叉反应，并允许对流量特性(例如流量、加热的总体积或输送到流动池的总体积)或加热特性(例如加热速率或最终温度)进行个性化控制。一个或多个贮存器可以共享流体输送通道，该流体输送通道在将流体转移到流动池之前将被加热。例如，当跨几种流体试剂使用均匀的流量特性或加热特性时，这种配置可以提供有效的流体处理。
试剂的预热可能会在常见的流体输送通道中发生。共用的流体输送通道可以例如经由歧管连接多个贮存器。这样，流体输送通道的加热可发生在歧管的下游。当可以快速实现加热时，这种配置可能很有用，在这种情况下，公共流体输送通道的加热部分可以选择直接位于流动池的上游。在替代配置中，加热不在共用的流体输送通道处发生，而是局部地位于流体系统中位于共用的流体输送通道、歧管或旋转阀上游的部分。
可以合并多个不同的流体输送通道，以便使用歧管进入流动池的检测通道。歧管可以放置在流体输送通道加热器的下游和检测通道入口的上游。从一个或多个流体输送管线到检测通道的流体流动可以通过阀来控制。在特定配置中，旋转阀可以起到选择多个流体输送通道之一的作用，以使流体流向检测通道。可以使用的其他阀包括例如球阀、隔膜阀、节流阀、蝶形阀、夹管阀、电磁阀等。
可选地，阀或歧管可以被加热。加热器可以是本文所述的关于加热流体输送通道或流动池的类型。阀或歧管加热器的设定点可以等于、高于或低于上游流体输送通道加热器的设定点。阀或歧管加热器的设定点可以等于、高于或低于下游流动池加热器的设定点。阀或歧管加热器的设定点可以在上游流体输送通道加热器的设定点和下游流动池加热器的设定点之间。这样，三个加热器可以建立随流动方向增加或随流动方向减少的温度梯度。对于特定的反应或分析过程的一个或多个步骤，可以选择配置以在流动池中达到所需的最终温度。
本公开的装置可以包括被配置为驱动流体通过流体输送通道、流动池或其他部件的泵。注射泵可能特别有用。除注射泵外，其他类型的装置也可用于驱动流体，包括例如正压或负压、蠕动泵、隔膜泵、活塞泵、齿轮泵或阿基米德螺杆。泵可以被配置成施加正的流体排量(例如，通过正压)以将流体从贮存器、流体输送通道或其他流体部件推入流动池中。或者，可以将泵配置为施加负的流体排量(例如，通过负压)，以将流体从流动池拉入其他流体部件，例如废液容器或用于回收试剂的存储处。特别有用的泵包括，例如，在本文阐述的测序平台中或本文引用的参考文献中使用的那些。
泵可以位于贮存器和流动池的上游、贮存器和流动池之间或贮存器和流动池的下游。当泵在贮存器和流动池的上游时，泵会将流体从贮存器推向流动池。如果泵位于贮存器和流动池之间，则泵将从贮存器中抽出液体并将流体推向流动池。如果泵在贮存器和流动池的下游，则泵会将流体从贮存器中拉出并流到流动池。
本公开的装置可以包括被配置为支撑流动池的载物台。该载物台可以配置为相对于装置的流体部件和/或装置的检测器部件定位流动池。可选地，载物台可以配置为移动流动池，例如，以允许通过扫描观察流动池的内容。载物台可以在笛卡尔坐标系中的x、y和z方向中的一个或多个方向上移动。为了本公开的目的，z轴将是沿着其实现聚焦变化的轴(即，沿着检测器与流动池表面之间的距离延伸的轴)，x轴将是流动池的扫描方向，y轴将与z和x轴正交。除了沿x、y和z轴的线性运动外，载物台还能够旋转流动池。围绕z轴的旋转将被称为偏航(yaw)，围绕x轴的旋转将被称为侧倾(roll)，而围绕y轴的旋转将被称为俯仰(pitch)。这些尺寸和运动在美国专利申请16/141,896的图1中示出，其以美国专利申请公开号US 2019/0055598 A1公开，将其通过引用并入本文。可以使用任何载物台，例如实验室显微镜或核酸测序平台所共有的载物台。有用载物台的示例包括在核酸测序仪的检测装置的上下文中结合在以下参考文献中的那些。
配置特别有用的载物台，例如使用美国专利申请16/141,896(其对应的美国专利公开号为US 2019/0055598 A1)中公开的装置和方法使流动池沿参考表面滑动，将其通过引用并入本文。这样的装置和方法可提供避免使用在各种平移和旋转方向上可调节的高精度致动器的益处。高精度致动器会增加扫描仪的成本和复杂性，而此类设备通常需要训练有素的技术人员进行日常维护。美国专利申请16/141,896中提出的流动池载物台通过将用于相对于检测器平移流动池的机构与用于相对于检测器旋转配准流动池的机构解耦，从而避免了此类问题。将平移与旋转配准解耦减小了本公开的检测装置和其他装置中的平移机构的公差堆栈。
美国专利申请16/141,896(其对应的美国专利公开号为US 2019/0055598 A1)中使用流动池载物台的另一优点是可更快速扫描流动池。扫描速度的提高在很大程度上取决于流动池平移装置的功能，该流动池平移装置被配置为移动小于典型载物台的质量。与移动相同距离的较大质量相比，较小质量需要较少的时间来稳定下来。例如，随着所需检测分辨率的提高，等待流动池在获取图像之前稳定下来的时间变得越来越重要，这是因为流动池的运动必须衰减到这样的程度，即被观察物体的特征所经历的平均位移要小到足以防止图像出现实质性的变形。
流动池载物台可包括参考表面、预载和扫描致动器，预加载配置为在检测事件期间促使流动池接触参考表面，参考表面与检测器形成固定的结构环，扫描致动器被配置为使流动池沿参考表面在扫描尺寸上滑动。因此，在本公开的装置中使用的检测装置可以包括：(a)具有内腔和壁的流动池，壁具有内表面和外表面，内表面接触内腔；(b)与检测器形成固定结构环的参考表面；(c)被配置成促使流动池的外表面接触参考表面上的区域的预加载；(d)扫描致动器，其被配置为使流动池在扫描尺寸中沿参考表面滑动；(e)发射器，其被配置为当流动池的外表面被预载荷推动而接触到参考表面时，将来自内表面或内腔的信号引导至检测器。
如本文所提供的，检测装置可以包括：(a)具有内腔和壁的流动池，壁具有内表面和外表面，内表面接触内腔，外表面在扫描尺寸x中具有长度l；(b)参考表面；(c)被配置成促使流动池的外表面接触参考表面上的区域的预加载，可选地，该接触区域在扫描尺寸x中的最大长度可以短于长度l；(d)扫描致动器，其配置成使流动池在扫描尺寸x中沿参考表面滑动；(e)探测器；(f)物镜，其配置成当通过预加载推动流动池的外表面接触参考表面时，将辐射从流动池引导至检测器。
本公开的装置可以包括加热器，该加热器被配置为加热由载物台支撑的流动池。加热器可以与用于加热流体输送通道的加热器分开并且独立。可替代地，并且如上所述，可以使用相同的加热器来加热流动池并加热流体输送通道。流动池加热器可以从在此示例的用于加热流体输送通道、阀或歧管的相同类型中选择。流动池加热器可以是流动池载物台的组成部分，也可以是单独的设备，放置在载物台上时将热量传递给流动池。
可选地，加热元件可以集成到流动池中。例如，流动池可以包含一个或多个热通道，加热的流体相通过该热通道流动。替代地或附加地，流动池可以包含固相加热元件，例如导线、线圈或灯丝。可选地，加热元件可以位于流动池的上游区域，例如，邻近检测通道的入口。在另一种选择中，可以沿着一个或多个检测通道的长度放置加热元件。
对于一个或多个流体输送通道，流动池加热器的设定点可以低于、等于或高于加热器的设定点。例如，流动池加热器的设定点可以具有至少约30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或更高的设定点。流动池加热器的设定点可以低于特定最大值，例如最高100℃、80℃、70℃、60℃、50℃、40℃、30℃或更低。
相对而言，流体输送通道加热器的设定点可以比流动池加热器的设定点高，例如，至少高出约5℃、10℃、20℃、30℃或50℃或更高。替代地或附加地，用于流体输送通道加热器的设定点可以比用于流动池加热器的设定点高最多约50℃、30℃、20℃、10℃或5℃。
相反，流动池加热器的设定点可以高于流体输送通道加热器的设定点，例如，至少高出约5℃、10℃、20℃、30℃或50℃或更高。替代地或附加地，流动池加热器的设定点可以比流体输送通道加热器的设定点高至多约50℃、30℃、20℃、10℃或5℃。
流动池的温度可以例如通过恒温器来调节。恒温器可以配置为测量加热器的加热组件(例如加热载物台)、流动池的一个或多个区域的表面(例如一个或多个检测通道通过或经过的区域)或通过流动池加热部分的流体的温度。可以在检测通道的加热部分中或在加热部分的下游点处检测流体的温度。在一些配置中，可以使用多个温度检测器，例如，将其放置在流动池的加热部分中，在加热部分的出口处以及在加热部分下游的一个或多个位置处。特别有用的恒温器使用热电偶，例如K型热电偶或J型热电偶。在下面的实施例II中阐述了流体系统中的示例性温度传感器和示例性布置。这样的传感器可以在恒温器中用于调节流动池加热器的温度。
本文阐述的装置可以采用光学子系统或核酸测序系统中使用的部件来检测流动池中的分析物。几种这样的检测装置被配置用于光学检测，例如荧光信号的检测。可以在这里用于检测流动池的检测设备及其部件的示例在例如美国专利申请16/141,896；美国专利申请公开号2010/0111768A1或美国专利7,329,860、8,951,781或9,193,996中描述，将其每一个通过引用并入本文。其他检测装置包括商业化用于核酸测序的检测设备，例如由IlluminaTM，Inc.(例如HiSeqTM、MiSeqTM、NextSeqTM或NovaSeqTM系统)、Life TechnologiesTM(例如ABI PRISMTM或SOLiDTM系统)、Pacific Biosciences(例如使用SMRTTM技术的系统，例如SequelTM或RS IITM系统)或Qiagen(例如GenereaderTM系统)提供的检测设备。其他有用的检测器在美国专利5,888,737、6,175,002、5,695,934、6,140,489或5,863,722；或美国专利申请公开号2007/007991 A1、2009/0247414 A1或2010/0111768；或WO2007/123744中描述，将其每一个通过引用整体并入本文。
特别有用的光学检测系统将使用具有至少0.1且至多0.9的数值孔径的物镜。可以使用浸没物镜来实现0.95以上的数值孔径，这将在下面进一步详细说明。可以将物镜配置为与检测系统配合使用，该系统可分辨表面上相距小于100μm、50μm、10μm、5μm、1μm或0.5μm的特征(例如核酸位点)。包括物镜的检测系统可以配置为分辨表面上面积小于约1mm2、500μm2、100μm2、25μm2、10μm2、5μm2、1μm2、500nm2或100nm2的特征。
在本文阐述的装置或方法中使用的光学系统可以具有至少0.1mm2、0.5mm2、1mm2、2mm2、3mm2、4mm2或更高的视场。替代地和/或附加地，视场可以被配置为至多4mm2、3mm2、2mm2、1mm2、0.5mm2、0.1mm2或更小。
在本文阐述的方法或装置中用于观察流动池的检测器不需要能够进行光学检测。例如，检测器可以是用于检测质子或焦磷酸盐的电子检测器(例如，参见美国专利申请公开号2009/0026082 A1、2009/0127589 A1、2010/0137143 A1或2010/0282617 A1，将其每一个通过引用整体并入本文，或可从马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher商购的Ion TorrentTM系统)，或者检测器可以是用于检测纳米孔(例如Oxford NanoporeTM,Oxford UK(如MinIONTM or PromethIONTM系统)商业化的纳米孔)的电子检测器，或者美国专利7,001,792；Soni&Meller,Clin.Chem.53,1996-2001(2007)；Healy,Nanomed.2,459-481(2007)或Cockroft等，J.Am.Chem.Soc.130,818-820(2008)等中阐述的那些，将其每一个通过引用并入本文。
对系统部件(例如加热器、恒温器、泵或检测器)的控制可以利用通用处理器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)或其他可编程逻辑设备、分立门或晶体管逻辑、分立硬件部件或其任何组合，旨在执行本文所述的功能。通用处理器可以是微处理器，但可替代地，处理器可以是任何常规处理器、控制器、微控制器或状态机。处理器还可以被实现为计算设备的组合，例如，DSP和微处理器、多个微处理器、与DSP核心结合的一个或多个微处理器的组合，或任何其他这样的配置。
可选地，本公开的装置可以包括计算机处理单元(CPU)，其被配置为操作本文阐述的一个或多个系统部件。相同或不同的CPU可以与系统交互以获取、存储和处理信号(例如，以本文阐述的方法检测到的信号)。在特定实施例中，CPU可用于根据信号确定存在于模板核酸中特定位置的核苷酸的身份。在某些情况下，CPU将从检测到的信号中识别出模板的核苷酸序列。
有用的CPU可以包括(例如)个人计算机系统、服务器计算机系统、瘦客户端、胖客户端、手持式或膝上型设备、多处理器系统、基于微处理器的系统、机顶盒、可编程消费电子产品、网络PC、小型计算机系统、大型计算机系统、智能手机或包括上述任何系统或设备的分布式云计算环境中的一个或多个。CPU可以包括一个或多个处理器或处理单元，可以包括RAM和非易失性存储器的存储器架构。存储器架构可以进一步包括可移动/不可移动、易失性/非易失性计算机系统存储介质。此外，存储器架构可以包括一个或多个用于读取和写入不可移动的非易失性磁性介质的读取器，例如硬盘驱动器；用于读取和写入可移动的非易失性磁盘的磁盘驱动器；和/或用于从可移动非易失性光盘(例如CD-ROM或DVD-ROM)读取或写入的光盘驱动器。CPU还可以包括各种计算机系统可读介质。这样的介质可以是云计算环境可访问的任何可用介质，例如易失性和非易失性介质以及可移动和不可移动介质。
本文中使用的处理器的存储器架构可以包括至少一个程序产品，该程序产品具有至少一个实现为可执行指令的程序模块，该可执行指令被配置为控制本文阐述的装置的一个或多个部件或执行本文阐述的方法的一个或多个部分。例如，可执行指令可以包括操作系统、一个或多个应用程序、其他程序模块和程序数据。通常，程序模块可以包括例程、程序、对象、部件、逻辑、数据结构等，其执行特定任务，例如控制硬件执行本文所述的步骤或处理由本文所述的装置或方法检测到的信号。
计算机处理器的部件可以通过内部总线耦合，该内部总线可以实现为几种类型的总线结构中的任何一种或多种，包括存储器总线或存储器控制器、外围总线、加速图形端口以及使用多种总线架构中的任何一种的处理器或本地总线。作为示例而非限制，此类架构包括工业标准架构(ISA)总线、微通道架构(MCA)总线、增强型ISA(EISA)总线、视频电子标准协会(VESA)本地总线和外围部件互连(PCI)总线。
CPU可以选择与一个或多个外部设备通信，例如键盘、定点设备(例如鼠标)、显示器，例如图形用户界面(GUI)或其他有助于用户与本文阐述的装置进行交互的设备。同样，CPU可以与其他设备通信(例如，通过网卡、调制解调器等)。这种通信可以通过I/O接口进行。此外，本文的系统的CPU可以通过合适的网络适配器与一个或多个网络通信，例如，局域网(LAN)、通用广域网(WAN)和/或公用网络(例如Internet)。
可选地，比例积分微分(PID)控制器可用于调节温度、流体流量、压力、速度和其他过程变量。可以将PID控制器配置为使用控制回路反馈机制来控制过程变量。通过更具体的示例，PID控制器可以用于控制反馈回路，该反馈回路包括在本文的装置或方法中使用的温度传感器或压力传感器。
气泡传感器也可以用于例如减轻不希望的气泡。气泡传感器配置的示例是将气泡传感器放置在旋转阀的上游，并且在检测到气泡时或在达到气泡的阈值水平时，可以激活阀门以将气泡转移到可能会对气泡产生不利影响的流动池或其他容器中。响应于检测到气泡，流体系统还可以通过增加流体上的压力，降低流体的流速，降低流体的温度或采取其他缓解步骤来去除或避免气泡来做出响应。
然而，并非所有气泡都是不需要的。实际上，当需要气泡时，本文提供的装置可以包括气泡传感器和气泡发生器。气泡传感器可用于检测和去除所需气泡特性之外的气泡。在美国专利申请16/700,422中阐述了用于所提供的装置、示例性气泡发生器、其他硬件和使用泡沫对核酸进行测序并执行其他分析程序的方法的合适的气泡，该文献以引用方式并入本文。例如，在特定配置中，气泡发生器可以被容纳在仪器连接器1110内(图14A和14B)。
本公开提供了对于进行循环反应特别有用的装置。每个循环可包括将用于反应的试剂递送至流动池，在流动池中，任选地将观察到反应或反应产物。每个循环可进一步包括使用本文阐述的装置或方法加热或冷却流体试剂或流体系统的组分。本文在进行核酸测序反应的背景下示例了本公开的装置。然而，本领域技术人员将从本文的教导中了解如何针对其他周期性反应来修改装置，例如核酸合成反应、肽测序反应、肽合成反应、组合小分子合成反应等。但是，该方法不必是循环的，而是可以以非重复的方式进行，来观察单个反应或现象，例如实时聚合酶链反应(rtPCR)、定量PCR(qPCR)、结合测定法，例如使用标记抗体检测表位、酶测定法、核酸杂交测定法、基于阵列的基因分型和RNA表达测定法等。
尤其有用的测序反应是Sequencing By BindingTM(SBBTM)反应，诸如共同拥有的美国专利申请公开号US 2017/0022553 A1、2018/0044727 A1、2018/0187245 A1或2018/0208983 A1中描述的那些，将其每一个通过引用并入本文。通常，用于确定模板核酸分子的序列的方法可以基于在指定条件下三元复合物(聚合酶、引发的核酸和同源核苷酸之间)的形成。该方法可以包括检测阶段，随后是核苷酸掺入阶段。
检测阶段可以在包含至少一个用引物引发的模板核酸分子的流动池中进行。反应混合物可包括引发的模板核酸、聚合酶和至少一种核苷酸类型。可以在核苷酸未共价添加到引物的条件下观察到聚合酶和核苷酸与引发的模板核酸分子的相互作用，使用观察到的聚合酶和核苷酸与引发的模板核酸分子的相互作用，可以鉴定每个模板核酸中的下一个碱基。引发模板、聚合酶和核苷酸之间的相互作用可以通过多种方案检测。例如，核苷酸可以包含可检测的标记。每个核苷酸相对于其他核苷酸可以具有可区分的标记。或者，一些或所有不同的核苷酸类型可以具有相同的标记，并且可以基于不同核苷酸类型向流动池的单独递送来区分核苷酸类型。在一些实施例中，可以标记聚合酶。与不同核苷酸类型相关的聚合酶可以具有独特的标记，以区分与它们相关的核苷酸类型。或者，聚合酶可以具有相似的标记，并且可以基于不同核苷酸类型向流动池的单独递送来区分不同核苷酸类型。可以通过使用本文阐述的装置或方法扫描流动池来进行检测。
在检测阶段，可以通过三元复合物稳定化来区分正确和不正确的核苷酸。各种条件和试剂都是有用的。例如，引物可包含防止核苷酸共价连接的可逆性封闭部分；和/或延伸所需的辅因子(例如二价金属离子)可能不存在；和/或可以存在抑制基于聚合酶的引物延伸的抑制性二价阳离子；和/或检测阶段中存在的聚合酶可以具有化学修饰和/或抑制引物延伸的突变；和/或核苷酸可以具有抑制掺入的化学修饰，例如去除或改变天然三磷酸部分的5’修饰。
然后可以通过在流动池中创造条件来进行延伸阶段，在该条件中可以将核苷酸添加到每个模板核酸分子上的引物上。在一些实施例中，这涉及去除在检测阶段中使用的试剂，并用有助于扩展的试剂代替它们。例如，检测试剂可以用能够延伸的聚合酶和核苷酸代替。或者，可以将一种或多种试剂添加到检测阶段反应中以产生延伸条件。例如，可以将催化二价阳离子添加到阳离子不足的检测混合物中，和/或可以去除或禁用聚合酶抑制剂，和/或可以添加可延伸的核苷酸，和/或可以加入解封闭剂以使引物延伸能力强，和/或可以添加可延伸的聚合酶。
应该理解，可以使用本公开的装置和方法来进行多种核酸测序反应中的任何一种。下文阐述了其他示例性测序方法。
可以使用综合排序(Sequencing-by-synthesis，SBS)技术。SBS通常涉及通过针对与该引物杂交的模板链的核苷酸的迭代添加来迭代地增加新生引物的酶促延伸。Bentley等，Nature 456:53-59(2008)、WO 04/018497、WO 91/06678、WO 07/123744、美国专利7,057,026、7,329,492、7,211,414、7,315,019或7,405,281，以及美国专利公开号2008/0108082 A1描述了可以容易地适于与本公开的方法或装置一起使用的示例性SBS程序、试剂和检测组分，将其每一个通过引用并入本文。从Illumina公司(加利福尼亚州圣地亚哥)商购的SBS方法也是有用的。
一些SBS实施例包括检测将核苷酸掺入延伸产物后释放的质子。例如，基于释放的质子检测的测序可以使用可从ThermoFisher(Waltham，MA)商购或在美国专利申请公开号2009/0026082 A1、2009/0127589 A1、2010/0137143 A1或2010/0282617 A1中描述的试剂和电检测器，将其每一个通过引用并入本文。
可以使用其他测序程序，例如焦磷酸测序(Ronaghi等，Analytical Biochemistry242(1),84-9(1996)、Ronaghi,Genome Res.11(1),3-11(2001)、Ronaghi等，Science 281(5375),363(1998)、美国专利6,210,891、6,258,568和6,274,320，将其每一个通过引用并入本文)。也可使用连接测序(Sequencing-by-ligation)反应，包括例如Shendure等Science 309:1728-1732(2005)、美国专利5,599,675和5,750,341中描述的那些，将其每一个通过引用并入本文。一些实施例可包括杂交测序(sequencing-by-hybridization)程序，例如，Bains等，Journal of Theoretical Biology 135(3),303-7(1988)、Drmanac等，Nature Biotechnology 16,54-58(1998)、Fodor等，Science 251(4995),767-773(1995)或WO 1989/10977中描述的那些，将其每一个通过引用并入本文。可以修改用于检测荧光共振能量转移(FRET)和/或检测零模式波导(ZMW)进行测序的技术和试剂，以用于本文所述的装置或方法中，例如Levene等，Science 299,682-686(2003)、Lundquist等，Opt.Lett.33,1026-1028(2008)、Korlach等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176-1181(2008)，或美国专利7,315,019、8,252,911或8,530,164中描述的那些，其每一个的公开内容通过引用并入本文。
待测序的核酸模板可以选择性地连接到流动池或其他容器的表面。任选地，对该分子进行单分子测序。或者，可以制备核酸的多个拷贝，并且可以对所得的集合进行测序。例如，可以使用下面进一步详细阐述的技术在表面(例如，流动池的内壁)上扩增核酸。
可以对多种不同的核酸分子(即具有多种不同序列的群体)进行测序。可选地，分子可以附接到流动池或其他容器中的表面。核酸可以附着在表面上的独特位点上，并且可以在空间上彼此区分的单个核酸分子被并行测序。或者，可以在表面上扩增核酸以产生多个表面附着的集合。集合可以在空间上将一个集合与另一个集合区分开，并可以并行排序。
本文阐述的方法可以在流动池中使用多种扩增技术中的任何一种。可以使用的示例性技术包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、多位移扩增(MDA)、桥扩增或随机引物扩增(RPA)。在特定的实施例中，可将一种或多种用于扩增的引物附着于流动池中的表面。在这样的实施例中，表面附着的引物沿着模板核酸的延伸将导致模板的拷贝附着在表面上。在固体支持物上产生一个或多个位点的方法(其中每个位点连接到特定核酸模板的多个拷贝)可以称为“聚类”方法。
在本文的方法或组合物中使用的核酸模板可以是DNA，例如基因组DNA、合成的DNA、扩增的DNA、互补的DNA(cDNA)等。也可以使用RNA，例如mRNA、核糖体RNA、tRNA等。核酸类似物也可用作本文的模板。因此，本文使用的核酸的混合物可以源自生物学来源、合成来源或扩增产物。本文使用的引物可以是DNA、RNA或其类似物。
本公开的装置可以采用聚合酶。聚合酶可以储存在贮存器中，流经流体输送通道，在其中可以任选地对其进行加热或冷却，并提供给流动池进行核酸测序反应或其他分析过程。多种聚合酶中的任何一种均可用于本文所述的方法中。除非另有说明，否则对特定聚合酶的引用，例如在整个本公开中所举例说明的那些，应理解为包括其功能性变体。聚合酶特别有用的功能包括使用现有核酸作为模板，形成三元复合物或催化核酸链的聚合。可以基于结构同源性将聚合酶分类，例如将聚合酶分类为鉴定为A、B、C、D、X、Y和RT的家族。A家族中的DNA聚合酶包括，例如，T7 DNA聚合酶、真核线粒体DNA聚合酶γ、大肠杆菌DNA Pol I、水生栖热菌Pol I和嗜热脂肪芽孢杆菌Pol I。B族的DNA聚合酶包括，例如真核DNA聚合酶α、δ和ε、DNA聚合酶ζ、T4 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶和RB69噬菌体DNA聚合酶。C家族包括例如大肠杆菌DNA聚合酶IIIα亚基。B家族古细菌DNA聚合酶包括例如Vent、Deep Vent、Pfu和9°N(例如，来自Ipswich,MA的New England BioLabs Inc.的TherminatorTM DNA聚合酶)。D家族包括例如衍生自古细菌的Euryarchaeota亚结构域的聚合酶。X家族的DNA聚合酶包括例如真核聚合酶Polβ、Polσ、Polλ和Polμ以及酿酒酵母Pol 4。Y家族的DNA聚合酶包括例如Polη、Polι、Polκ、大肠杆菌Pol IV(DINB)和大肠杆菌Pol V(UmuD'2C)。DNA聚合酶的RT(逆转录酶)家族包括例如逆转录病毒逆转录酶和真核端粒酶。示例性的RNA聚合酶包括但不限于病毒RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶；真核RNA聚合酶，例如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV和RNA聚合酶V；和古细菌RNA聚合酶。
具有固有的3’-5’校对核酸外切酶活性的聚合酶可用于本文所述方法和系统的某些应用。基本上缺乏3’-5’校对核酸外切酶活性的聚合酶也可用于某些配置，例如，在大多数测序系统和方法中。核酸外切酶活性的缺乏可以是野生型特征或由变体或工程聚合酶结构赋予的特征。例如，exo减去Klenow片段是Klenow片段的突变版本，其缺少3’-5’校对核酸外切酶活性。Klenow片段及其外切变体可用于本文阐述的方法或组合物中。
可以在本文阐述的方法或组合物中使用的聚合酶包括天然存在的聚合酶及其修饰的变体，包括但不限于突变体、重组体、融合体、遗传修饰、化学修饰、合成和类似物。用于三元复合物形成和检测的有用的聚合酶不限于具有催化聚合反应能力的聚合酶。任选地，有用的聚合酶将具有在至少一种在稳定的三元复合物的形成或检查过程中不使用的条件下催化聚合反应的能力。可用于形成稳定的三元复合物的示例性聚合酶包括例如美国专利申请2017/0314072 A1或2018/0155698 A1中列出的野生型和突变型聚合酶，其各自通过引用并入本文。
可以用于检测聚合酶的包含外源标记部分(例如，外源发光体)的聚合酶可以在一些实施例中有用。任选地，可以例如使用聚合酶的游离巯基或游离胺部分将外源标记部分化学连接至聚合酶。外源标记部分也可以通过蛋白质融合连接到聚合酶上。可以通过蛋白质融合连接的示例性标记部分包括，例如，绿色荧光蛋白(GFP)、藻胆蛋白(例如藻蓝蛋白和藻红蛋白)或GFP或藻胆蛋白的波长移位变体。
本公开的装置可采用核苷酸。核苷酸可以储存在贮存库中，流过流体输送通道，在其中可以任选地对其进行加热或冷却，并提供给流动池进行核酸测序反应或其他分析过程。根据需要，核苷酸可以是天然核苷酸、核苷酸类似物或修饰的核苷酸，以适合方法的特定应用或配置。这样的核苷酸可以存在于三元复合物中或用于本文阐述的测序方法中。
任选地，核苷酸类似物具有含氮碱基、五碳糖和磷酸基团，其中与天然核苷酸相比，核苷酸的任何部分可以被修饰、去除和/或替换。核苷酸类似物可以是不可掺入的核苷酸(即不能与引物的3’氧反应形成共价键的核苷酸)。不能掺入的此类核苷酸包括例如单磷酸和二磷酸核苷酸。在另一个示例中，核苷酸可以包含对三磷酸基团的修饰，其使得核苷酸不可掺入。不可掺入的核苷酸的示例可以在美国专利7,482,120中找到，将其通过引用并入本文。在一些实施例中，不可掺入的核苷酸可随后被修饰以变得可掺入。不可掺入的核苷酸类似物包括但不限于α-磷酸修饰的核苷酸、α-β核苷酸类似物、β-磷酸修饰的核苷酸、β-γ核苷酸类似物、γ-磷酸修饰的核苷酸或笼状核苷酸。核苷酸类似物的其他示例描述于美国专利8,071,755，将其通过引用并入本文。
在本文的方法或系统中使用的核苷酸类似物可以包括终止子，该终止子可逆地阻止随后的核苷酸在引物的3’端掺入。例如，美国专利7,544,794和美国专利8,034,923(这些专利的公开内容通过引用并入本文)描述了可逆性终止剂，其中3'-OH基团被3'-ONH2部分代替。另一种类型的可逆终止子连接到核苷酸的含氮碱基上，例如，在美国专利8,808,989中所述(其公开内容通过引用并入本文)。可类似地与本文所述方法结合使用的其他可逆终止剂包括本文其他地方引用的参考文献或美国专利7,956,171、8,071,755和9,399,798中所描述的那些(这些文献的公开内容通过引用并入本文)。例如，当存在于核苷酸的3’位置时，-O-叠氮基甲基部分特别可用作可逆终止剂。在某些实施例中，可逆过程的终止子部分可以在被称为“解封闭”的过程中从引物中去除，从而允许随后的核苷酸掺入。在可逆终止剂的背景下，本文引用的参考文献中阐述了用于去嵌段的组合物和方法。
或者，核苷酸类似物不可逆地阻止核苷酸掺入已掺入它们的引物的3’端。不可逆的核苷酸类似物包括2’，3’-二脱氧核苷酸(ddNTP，例如ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTP)。双脱氧核苷酸缺乏dNTP的3’-OH基团，否则它们会参与聚合酶介导的引物延伸。因此，3’位具有氢部分而不是天然羟基部分。不可逆终止的核苷酸可特别用于基因分型应用或其他不需要沿模板核酸进行引物延伸或顺序检测的应用。
本文例如用于参与稳定的三元复合物的核苷酸类似物不需要包括保护基团(例如可逆性终止子)，该保护基团防止在类似物已经被掺入引物中后随后在引物的3’-末端上的核苷酸掺入。是否使用具有保护基团(例如可逆性终止子)的核苷酸进行延伸步骤可以是这种情况。应该理解的是，如果需要的话，保护基团可以存在于参与稳定的三元复合物的核苷酸类似物上。
在本文中用于例如参与形成稳定的三元复合物的核苷酸可以包括外源标记。外源标记的核苷酸可以包括可逆或不可逆的终止子部分，外源标记的核苷酸可以是不可掺入的，外源标记的核苷酸可以缺少终止子部分，外源标记的核苷酸可以是可掺入的，或者外源标记的核苷酸可以是可掺入的和未终止的。当用于与非标记的聚合酶形成稳定的三元复合物时，外源标记的核苷酸可能特别有用。
或者，本文中用于例如参与形成三元复合物的核苷酸可以缺少外源标记(即该核苷酸可以是“未标记的”)。未标记的核苷酸可包括可逆或不可逆的终止子部分，未标记的核苷酸可为不可掺入的，未标记的核苷酸可缺少终止子部分，非标记的核苷酸可以是可掺入的，或者非标记的核苷酸可以是可掺入的和非终止的。当使用聚合酶上的标记物检测稳定的三元复合物或使用无标记物检测时，未标记的核苷酸可能有用。未标记的核苷酸也可用于本文所述方法的延伸步骤。将理解的是，核苷酸不存在部分或功能是指不具有此类功能或部分的核苷酸。然而，也将理解的是，在本文阐述的方法或组合物中，可以具体省略本文中针对核苷酸或其类似物所阐述的一个或多个功能或部分，或者在本领域中对于核苷酸或其类似物是已知的其他方式。
任选地，在稳定的三元复合物形成期间或之后，混合物中存在核苷酸(例如天然核苷酸或核苷酸类似物)。例如，可以存在至少1、2、3、4或更多个核苷酸类型。替代地或另外地，最多可以存在4、3、2或1个核苷酸类型。类似地，存在的一种或多种核苷酸类型可以与模板核酸中的至少1、2、3或4个碱基类型互补。替代地或另外地，存在的一种或多种核苷酸类型可以与模板核酸中的至多4、3、2或1个碱基类型互补。通过在不同核苷酸上存在不同的外源标记，可以识别出不同的碱基类型。或者，两种或多种核苷酸类型可以具有不可区分的外源标记。然而，在后一种格式中，例如美国专利申请2018/0305749 A1或美国专利9,951,385中所述的由于被分开递送至反应容器或由于提出的编码和解码方案，因此可以区分不同的核苷酸，将其每一个通过引用并入本文。
本公开的系统和方法可以在待检测的反应物或产物上采用可检测的标记。在许多情况下，标记是添加到反应物或产物(例如聚合酶，核酸或核苷酸)的外源标记。有用的外源标记的示例包括但不限于放射性标记部分、发光体部分、荧光团部分、量子点部分、生色团部分、酶部分、电磁自旋标记的部分、纳米粒子光散射部分以及本领域已知的多种其他信号产生部分中的任何一种。合适的酶部分包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。示例性的荧光团标记包括但不限于，对甲氨基酚；试卤灵；香豆素；呫吨；吖啶；荧光素；罗丹明；赤霉素；花青素；苯二醛；萘胺；氟胺；苯并二唑；二苯乙烯苷；芘；吲哚；硼聚氮杂双炔；喹唑啉酮；曙红；赤藓红；孔雀石绿；CY染料(GE Biosciences)，包括Cy3(及其衍生物)、Cy5(及其衍生物)和Cy7(及其衍生物)；DYOMICS和DYLIGHT染料(Dyomics)，包括DY-547、DY-630、DY-631、DY-632、DY-633、DY-634、DY-635、DY-647、DY-649、DY-652、DY-678、DY-680、DY-682、DY-701、DY-734、DY-752、DY-777和DY-782；荧光黄；级联蓝色；德克萨斯红；BODIPY(硼二吡咯甲烷)(分子探针)染料，包括BODIPY 630/650和BODIPY650/670；ATTO染料(Atto-Tec)，包括ATTO 390、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 610 611X、ATTO610、ATTO 635；ALEXA荧光粉包括ALEXA FLUOR 633、ALEXA FLUOR 647、ALEXA FLUOR 660、ALEXA FLUOR 700、ALEXA FLUOR 750和ALEXA FLUOR 680(分子探针)；DDAO(7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基ac啶-2-酮或其任何衍生物)(分子探针)；QUASAR染料(Biosearch)；IRDYES染料(LiCor)，包括IRDYE 700DX(NHS酯)、IRDYE 800RS(NHS酯)和IRDYE 800CW(NHS酯)；EVOBLUE染料(Evotech Biosystems)；JODA 4染料(Applied Biosystems)；HILYTE染料(AnaSpec)；MR121和MR200染料(Roche)；赫斯特染料33258和33242(Invitrogen)；FAIROAKS红(Molecular Devices)；SUNNYVALE红(Molecular Devices)；LIGHT CYCLER红(Roche)；EPOCH(Glen Research)染料，包括EPOCH REDMOND红、EPOCH YAKIMA黄、EPOCH GIGHARBOR绿；Tokyo绿(M.Kamiya,et al.,2005Angew.Chem.Int.Ed.44:5439-5441)；以及CF染料，包括CF647和CF555(Biotium)，和本领域已知的其它荧光团标记，诸如JosephR.Lakowicz(编辑)，Plenum Pub Corp，第二版(1999年7月)的“荧光光谱原理(Principlesof Fluorescence Spectroscopy)”和Richard P.Hoagland所著的《分子探针手册(Molecular Probes Handbook)》第六版所述。
标记可以通过接头连接至核苷酸、聚合酶或其他分子。存在于核苷酸或聚合酶中的接头可以是但不需要是可切割的。例如，接头可以对本文所述方法中使用的条件稳定，以使得接头的共价结构在本文所述方法的任何特定步骤或整个步骤中均不改变。
反应物或产物可能缺少外源标记。例如，稳定的三元复合物和所有参与稳定的三元复合物的组分(例如聚合酶、模板核酸、引物和/或同源核苷酸)可以缺少本文或本文引用和并入的参考文献中所述的一种、几种或全部外源标记。在这样的实施例中，可以基于稳定的三元复合物的固有性质，例如质量、电荷、固有光学性质等来检测三元复合物。用于检测未标记的三元复合物的示例性方法在共同拥有的美国专利申请2017/0022553 A1、PCT申请号PCT/US16/68916、或美国专利申请62/375,379或15/677,870中提出，将其每一个均通过引用并入本文。
本公开的装置可以进一步包括用于从流体输送通道或流动池吸收热量的冷却器。除本文所述的加热器外，还可以存在(或使用)一个或多个冷却器。例如，冷却器可与加热器结合使用，以实现两个方向的温度调节。冷却器可用于降低输送通道、检测通道、旋转阀或其他流体部件中的流体的温度，并且加热器可用于提高此类流体部件的温度。一些配置可以使用能够用作热源和散热器的热传递装置，例如珀耳帖装置。或者，可以存在(或使用)一个或多个冷却器，从而用冷却器代替本文所述的一个或多个加热器。可以将冷却器放置在以加热器为例的装置中，但可以进行修改以适应不同的温度影响。
因此，本公开提供了用于执行分析过程例如确定核酸序列的装置。该装置可以包括(a)载物台，所述载物台被配置为支撑流动池；(b)检测器，所述检测器被配置成当流动池由载物台支撑时观察流动池的检测通道；(c)多个流体输送通道，其中每个流体输送通道均将贮存器流体连接至流动池的检测通道；以及(d)第一冷却器，其被配置为冷却多个流体输送通道。可选地，该载物台包括第二冷却器，该第二冷却器配置为冷却由该载物台支撑的流动池。可选地，该装置可以包括恒温器，该恒温器被配置为检测多个流体输送通道中的流体输送通道的温度并且选择性地启动第一加热器和第一冷却器。作为进一步的选择，该装置可以包括第二冷却器，该第二冷却器配置为冷却由载物台支撑的流动池。该设备还可以包括恒温器，该恒温器被配置为检测流动池的温度并选择性地启动第二加热器和第二冷却器。
可以将用于预热流体试剂的装置与将混合相流体(例如流体泡沫，流体浆液或流体乳液)输送到流动池的方法和装置结合使用，例如美国专利申请16/700,422中所述，该专利申请要求62/774,998的优先权，将其每一个通过引用并入本文。可以使用本文所述的装置或方法来修改诸如美国专利申请62/774,998中所述的那些的混合相流体装置或方法，以在将所述混合相流体输送至流动池之前对其进行加热。相反，可以使用在美国专利申请16/700,422或62/774,998中提出的装置或方法，将本文提出的加热装置或方法修改为产生混合相流体。
示例1
用于核酸测序系统的热模型
本示例提供了一种热模型，该模型显示了预热流体试剂的优势，该试剂可用于Sequencing By BindingTM(SBBTM)系统。SBBTM系统被配置为用于光学检测在玻璃流动池中一系列引物核酸上形成的荧光标记的三元复合物。三元复合物由聚合酶、引发的模板核酸之一和引发的模板核酸的下一个正确核苷酸组成。
图2示出了示例性测序系统100的框图。测序试剂在室温下存储或在试剂盒160中冷却。来自包装中每个贮存器的流体试剂通过流经预热器110的流体输送通道131输送到歧管122。歧管流体输送通道132将预热的流体输送到旋转阀120，该旋转阀由加热器121加热。旋转阀120用于从歧管流体输送通道132中选择试剂，以通过共用流体输送通道133输送至流动池140。共用流体输送通道133通过入口141流体连接到检测通道143，并且流体通过出口142离开检测通道143。通常包含选择器阀的注射泵150将流体从试剂盒160中抽出通过流动池140并通过通道134和135进入废液贮存器170。
构造了一个1层热模型。1层模型假设流动池在设定的温度下开始，并且流体(水)尚未开始被流动池加热。该模型假设流动池具有无限的热容量，并提供了对在流体和注入流动池之间的温度差的影响的理解。表1中显示了模型中使用的材料的相关特性。根据这些特性计算出的特性如表2所示。计算出与流动池表面等效的热质量的水的体积为95μl。
表1
Figure BDA0002327556790000351
表2
Figure BDA0002327556790000361
图3显示了基于1层模型的流动池中水温与位置的关系图。该模型的结果表明水流过流动池时要花多长时间，前提是假设流动池在发生流动时达到温度并且流动池没有被冷试剂冷却。从1层模型的图上可以明显看出，流动池中的阵列将在流动池的前2cm处承受温度梯度。这可能会对温度敏感反应产生不利影响。
图4显示了基于1层模型在流动池中启动水流动期间和之后的各个时间点，流动池中水温与位置的关系图。水是测序试剂的良好替代，试剂通常在水性液体中提供。根据1层模型，水在约0.2秒内达到流动池温度的平衡。1层模型在较短的时间范围内是准确的(例如，在彻底孵育后直接进入流程的早期)。
使用三层热模型来评估水在流动过程中稳态下通过玻璃的传热。图5显示了基于3层模型的流动池中水温与位置的关系图。该模型假设流动和热分布处于稳定状态，然后显示了停止流动后的理论热回收率。通过忽略玻璃的热容量，热回收曲线是比考虑在流体加热时加热玻璃所需的热能更好的情况。从3层模型的图上可以明显看出，流动池中的阵列将在流动池的前6厘米处承受温度梯度。
图6显示了基于3层模型在流动池中启动水流动期间和之后的各个时间点，流动池中水温与位置的关系图。水在3层模型下评估的0.4秒时间内未完全平衡到流动池的温度。3层模型非常适合查看在孵育期间会耗尽玻璃杯中任何热量的流量。但是，此模型不包括通过流动池的与加热器近端相对的那一侧的热传导。
该模型的结果表明，室温水性试剂流入流动池将导致流动池中阵列的明显冷却(对于保持在60℃的流动池，其冷却级别为10℃左右)。结果进一步表明，重新加热流动池中的阵列可能需要花费一定的时间(大约数十秒)。结果表明，预热水性试剂将有助于改善测序结果。这种预热还可以减少在整个阵列上并随着时间的流逝实现均匀结果所需的水性试剂的时间和/或体积。
示例II
核酸测序系统的流体递送组分的热测试
该示例提供了经验测试，以确定在核酸测序平台中使用的流体递送系统的热性质。
测试在图7所示的测试装置200上进行。测试装置200包括四根流体管线231至234，它们穿过预热器210，然后连接到旋转阀220。旋转阀220将四个流体管线231至234连接到公共管线230，该公共管线230又连接到流动池(未示出)。热电偶用于测量四个位置的温度：T1检测预热器210的中间位置，T2检测通道231离开预热器210的位置，T3检测与旋转阀220的连接大约2厘米的公共管线230，T4检测到与旋转阀220的连接大约10厘米的公共管线230。使用了K型热电偶，但可以用J型热电偶代替。
预热器210和旋转阀220的设定点为60℃。在进入装置之前，水的温度为20-22℃，受到的正压力为15PSI。所有通道均由硅胶管制成，内径为0.031英寸，外径为5/32英寸(内径0.787mm/外径3.968mm)。每隔1秒从每个热电偶进行测量。
从测试装置200获得的表格结果在图8A中示出，并且相同的结果在图8B中示出。数据是从测试装置200的单个流体输送通道收集的。结果表明在稳定状态下加热预热器下游的旋转阀的影响及其对T3和T4温度的影响。结果表明，将预热器设置为60℃的温度可使流体试剂在约44℃的温度下输送至流动池。数据显示，预热器中的培养液(允许流体达到温度)被流体输送通道中向周围环境的热传递所抵消。
该测试装置用于检测阀下游不同位置的温度。修改了测试设备，以重新放置热电偶，如图9所示。具体而言，将T1放置在从加热的旋转阀220离开的位置检测公共管线230，将T2放置在流动池入口24的连接器处，将T3放置在流动池240的入口处，并将T4放置在流动池240的出口处，靠近公共管线250，离开流动池。该测试装置包括12个流体输送通道，全部抽吸20-22℃蒸馏水，并以每个脉冲x轴上显示的流速流过160μL液体。
从修改后的测试装置获得的表格结果显示在图10A中，相同的结果绘制在图10B中。使用流经测试装置200的十二个流体传输通道的流体收集数据。结果假定每种试剂在预热器中1分钟后都达到了温度(根据图8的结果，这表明在大约20秒后试剂在预热器中会加热到60℃)。结果显示了设定点的差异(60℃与70℃)，并且表明，当以快速流量运行时，热损失有所减少，这可能是因为管线中的环境空气损失的热量更少。可以对预热器和流动池之间的流体输送通道进行绝缘，以进一步减少热量损失。
示例III
核酸测序装置
本示例描述提供了一种用于核酸测序的装置，该装置包括：(a)与流动池接触的载物台，其中，流动池包括至少一个检测通道，其中，检测通道容纳有核酸阵列；(b)检测器，所述检测器被配置为观察检测通道中的核酸阵列；(c)多个贮存器，所述贮存器中存储有用于对核酸阵列进行测序的试剂；(d)多个流体输送通道，其中，所述流体输送通道将多个贮存器流体连接至流动池的检测通道；(e)第一加热器，所述第一加热器将热量传递到多个流体输送通道；以及(f)第二加热器，所述第二加热器将热量传递到流动池的检测通道。
核酸测序系统的一些部件和功能在下面进一步详细阐述。应该理解，该系统是示例性的。例如，如本文中其他地方所述，下面阐述的一个或多个部件可以省略或替换为其他部件。可以将本文阐述的其他部件添加到示例性系统，而不必替换下面示例的部件。
图11示出了核酸测序装置1000的几个部件的组件的立体图。装置1000由基座1009和框架1010支撑。框架1010的顶部中间区域配置为用户访问系统，以便将流动池1200放置在加热载物台台1950上。载物台1950提供用于将热量从加热元件传递到流动池1200的导电表面。该载物台包括与流动池表面的区域直接接触的参考表面，从而将热量传导到流动池与加热的参考表面接触的区域。流动池的其他区域不与载物台直接接触，而是通过从载物台表面通过空气间隙转移到流动池表面而被加热。通过预加载1951将流动池1200压至载物台1950。这样，流动池1200被定位成由光学检测器1900检测。流动池1200通过平移部件1955沿载物台1950进行平移，并固定在载物台1950上的参考表面上，以允许检测流动池1200内的核酸(或其他分析样品)阵列。预加载1951、扫描系统1955和光学检测器1900的部件和操作在美国专利申请好2019/0055596 A1中提出，将其通过引用并入本文。该系统还包括通风管1920和风扇1921，用于排出由光学检测器产生的热量。
在图11的视图中，路由歧管1500和流动池1200之间的流体连接已被移除，而在图14中示出。当贮存器被吸管阵列1300接合时，在图11中示出了多个贮存器1400。还示出了抽屉1402和1403，其允许用户替换贮存器中的液体。贮存器可以充满用于核酸测序过程的试剂。在核酸测序的背景下，示例性试剂包括但不限于聚合酶、核苷酸和本文其他各处或本文引用的参考文献中列出的其他试剂。任选地，核苷酸和/或聚合酶可以例如用发光体外源标记，例如本文所述或本文引用的参考文献中的那些。在图11中还可见的是传导加热器1202和传导加热器1203，其定位成如下所述加热吸管歧管。
图11还示出了核酸测序装置1000，其还包括蠕动泵1050和1051，蠕动泵1050和1051被配置为在多个贮存器1400和仪器连接器之间(图14A和14B)的流体输送部件中的某个位置施加流体位移力(例如，正压、正位移等)，从而将流体从流体输送部件输送到流动池1200。在示例性装置1000中，泵可以被配置为在旋转阀和仪器连接器部件之间的位置处将流体位移力施加到流体输送部件，从而将流体从流体输送部件输送到流动池。
图12示出了流体连接到吸管歧管1302和吸管歧管1303的路由歧管1500的俯视图。歧管由聚醚酰亚胺
Figure BDA0002327556790000401
组成。吸管附接到吸管歧管，使得由吸管从贮存器吸取的液体通过吸管歧管通过专用通道转移到路由歧管1500。例如，吸管歧管1303包括吸管附接点1320、1321和1323，它们分别在吸管歧管1303内流体地连接到流体管线1324、1325和1326。流体管线1324、1325和1326由传导加热器1203加热。流体管线1324、1325和1326经由流体管线1521连接至路由歧管1500中的相应管线，以将试剂输送至旋转阀1560(见图13)。流体管线1521被传导加热器1204加热。因此，经由吸管附接点1320、1321和1323从贮存器吸取的流体在通往旋转阀1560的路径中被传导加热器1203和1204加热。传导加热器1202、1203和1204是具有硅树脂绝缘体的聚酰亚胺加热器(也称为Kapton加热器)。
吸管歧管1303还包括吸管附接点1310、1311和1313，它们分别在吸管歧管1303内流体地连接到流体管线1314、1315和1316。流体管线1314、1315和1316不与传导加热器直接接触。流体管线1314、1315和1316经由连接件1511连接至路由歧管1500中的相应管线，以将试剂输送至旋转阀1560。流体管线1511被传导加热器1204加热。流体管线是在UltemTM块中钻出的通道。这样，块的大部分被加热并且通道的壁将热量传递给其中的流体。图12还示出了路由歧管1500上的连接件1510，其连接到吸管歧管1302上的相应连接件，使得通过吸管吸取的流体可以被引导至旋转阀1550。吸管歧管1302中的所有吸管连接点和流体管线通过与传导加热器1202接触而被加热。
旋转阀1550和1560在图13中可见，其示出了路由歧管1500的仰视图。在图13中还可见吸管阵列1300和吸管阵列1301，其包括分别附接到吸管歧管1302和吸管歧管1303的吸管。图12还示出了出口端口1178，该出口端口将旋转阀1560(图13)的流出物连接至仪器连接器1110(图14A和14B)，流体入口端口1176将流动池1200的出口连接到废液箱，可选的气体出口端口1177将气体从压缩空气源输送到仪器连接器1110(图14A和14B)。对于旋转阀1550，存在类似的流体端口。当使用气泡发生器将气泡从贮存器引入液体试剂时，可以利用气体出口端口1177。与非泡沫液体相比，可以将生成的泡沫输送到流动池中，以提供多种优势，例如减少每单位流动池所用试剂的消耗量以及更快速地交换不同的试剂。在美国专利申请16/700,422中阐述了使用泡沫对核酸进行测序和执行其他分析程序的示例性气泡发生器、其他硬件和方法，将其通过引用并入本文。例如，在特定配置中，气泡发生器可以容纳在仪器连接器1110内(图14A和14B)。
图14A示出了核酸测序系统1000(图11)与流动池1200之间的流体连接的立体图。图14B示出了相同的立体图，但是连接器是断开的并且稍微移位了。仪器连接器1110与仪器连接端口1172接合。仪器连接端口1172包含流体入口1176(图14B)、液体出口1178(图14B)和可选的气体出口1177(图14B)。仪器连接器1110通过挠性管1191和1192流体连接至流动池连接器1180。流动池连接器1180与流动池端口1190接合。流动池连接器1180为流动池1200中的第一检测通道提供流体入口，为流动池1200中的第二检测通道提供流体出口。仪器连接器1110配置成将挠性管1191流体连接到流动池的通道入口，并且将挠性管1192连接到流动池的通道出口。仪器连接器1110可以用手与仪器连接端口1172接合，因为连接器1110具有适合互补闩锁的可压缩钩1120(图14B)。类似地，流动池连接器1180可以用手与流动池连接端口1190接合，因为连接器1180具有适合互补闩锁的可压缩钩。请注意，可以使用类似于为仪器连接端口1172到流动池端口1190举例说明的连接器，从仪器连接端口1141到流动池端口1140进行第二连接。第二连接可包括用于流动池1200中的第二检测通道的流体入口和用于流动池1200中的第一检测通道的流体出口。这样，流体将沿相反的方向流过流动池1200的两个检测通道。
图14A和14B还示出了蠕动泵1050和1051。图14A和图14B示出了蠕动泵1050，该蠕动泵1050具有与柔性管1193接触以在仪器连接器1110上游施加正压的转子。挠性管1193从仪器连接器1110的孔1130(图14A)穿过，然后越过蠕动泵1050的转子，然后进入仪器连接器1110的孔1131(图14A)。还示出了预加载1951，其推动流动池1200以接触载物台1950上的参考表面。当将流动池1200推到载物台1950时，流动池与检测光学器件1900对齐(图11)，并且流动池通过载物台1950的表面传热进行加热。
图15示出了测序装置1000的主视图，并且包括阴影线箭头，其指示热空气循环的方向。来自加热元件的热空气通过对流出口1210传递并循环进入入口1211。热对流加热旋转阀1560和1550，并通过出口1212。然后热量循环进入入口1213。热对流提供了一种可选的方式来加热流体部件，作为对图11至13所示的传导加热器的替代或补充。图15还显示了蠕动泵1050和1051、流动池1200、载物台1950、预加载1951、扫描系统1955和排气管1920。
如本示例所示，核酸测序装置可包括三个加热空间，第一空间是通过传导和/或对流加热的流体输送通道，第二空间是围绕各种流体部件(例如连接器、流体输送通道和流动池)的空气空间，第三空间是流动池载物台，通过与载物台上的参考表面直接接触并靠近载物台上的其他表面进行加热。
在整个本申请中，已经引用了各种出版物、专利和/或专利申请。这些文件的全部公开内容通过引用结合在本申请中。
术语“包括”在本文中旨在是开放式的，不仅包括所列举的元件，而且还包括任何其他元件。
如本文中所使用的，术语“每个”当用于参考项目的集合时，旨在标识该集合中的单个项目，但是不一定指代该集合中的每个项目。如果明确的披露或上下文另有明确规定，则可能会发生异常。
已经描述了多个实施例。然而，将理解，可以进行各种修改。因此，其他实施例在所附权利要求的范围内。

Claims (39)

1.一种用于核酸测序的装置，包括：
(a)与流动池接触的载物台，其中，流动池包括至少一个检测通道，其中，检测通道用于容纳核酸阵列；
(b)检测器，所述检测器被配置为观察检测通道中的核酸阵列；
(c)多个贮存器，所述贮存器中存储有用于对核酸阵列进行测序的试剂；
(d)多个流体输送通道，其中，所述流体输送通道将多个贮存器流体连接至流动池的检测通道；
(e)第一加热器，所述第一加热器将热量传递到多个流体输送通道；以及
(f)第二加热器，所述第二加热器将热量传递到流动池的检测通道。
2.如权利要求1所述的装置，其中，第一加热器包括与多个流体输送通道接触的热导体。
3.如权利要求2所述的装置，其中，第一加热器的热导体包括具有多个凹槽的表面，其中，每个流体输送通道均包括穿过多个凹槽中的一个凹槽的管。
4.如权利要求2所述的装置，其中，第一加热器的热导体包括固相块，流体输送通道穿过所述固相块。
5.如权利要求2所述的装置，其中，第一加热器的热导体包括液槽，其中，每个流体输送通道均包括穿过液槽的管。
6.如权利要求1所述的装置，其中，将第一加热器的温度设置为高于第二加热器的温度。
7.如权利要求6所述的装置，其中，第一加热器的设定点高于多个贮存器的温度。
8.如权利要求7所述的装置，其中，第二加热器的设定点高于多个贮存器的温度。
9.如权利要求1所述的装置，其中，第二加热器包括与载物台接触的热导体。
10.如权利要求1所述的装置，其中，第二加热器包括与流动池接触的热导体。
11.如权利要求1所述的装置，其中，第一加热器将热量传递到每个流体输送通道的体积至少等于检测通道的体积。
12.如权利要求1所述的装置，还包括对流加热器，所述对流加热器将热量传递到流体输送通道。
13.如权利要求12所述的装置，其中，将对流加热器的温度设置为高于第二加热器的温度。
14.如权利要求12所述的装置，其中，将对流加热器的温度设置为高于多个贮存器的温度。
15.如权利要求1所述的装置，其中，检测通道的体积至多为10ml。
16.如权利要求15所述的装置，其中，检测通道的体积至多为1ml。
17.如权利要求1所述的装置，还包括恒温器，所述恒温器被配置为检测多个流体输送通道的温度并选择性地激活第一加热器。
18.如权利要求1所述的装置，还包括恒温器，所述恒温器被配置为检测流动池的温度或检测流动池的检测通道的温度，并选择性地激活第二加热器。
19.如权利要求1所述的装置，其中，检测器包括光学检测器。
20.如权利要求19所述的装置，其中，检测通道包括光学透明窗，所述光学透明窗用于显示出核酸阵列。
21.如权利要求1所述的装置，还包括阀，所述阀被配置为控制试剂流过多个流体输送通道中的流体输送通道。
22.如权利要求21所述的装置，其中，阀包括旋转阀。
23.如权利要求21或22所述的装置，其中，阀位于流动池的上游并且位于第一加热器的下游。
24.如权利要求23所述的装置，还包括加热器，所述加热器被配置为加热阀。
25.如权利要求23所述的装置，其中，第一加热器、第二加热器或对流加热器被配置为加热阀。
26.如权利要求1所述的装置，还包括泵，所述泵被配置为将流体从贮存器移动到流动池。
27.如权利要求1所述的装置，其中，载物台包括参考表面、预加载和扫描致动器，其中，预加载被配置为促使流动池接触参考表面，其中，参考表面与检测器形成固定的结构环，其中，扫描致动器被配置为使流动池沿参考表面在扫描尺寸上滑动。
28.如权利要求27所述的装置，其中，第二加热器包括与参考表面相邻的辐射表面，其中，辐射表面被配置为不接触流动池。
29.如权利要求1所述的装置，其中，第一加热器包括对流加热器。
30.如权利要求1所述的装置，其中，流动池可从载物台上卸下。
31.如权利要求1所述的装置，其中，阵列包括至少1×103个不同的核酸。
32.如权利要求31所述的装置，其中，核酸固定在阵列中的位点上，其中，每个位点的面积均小于25平方微米。
33.如权利要求32所述的装置，其中，阵列包括至少1×103个位点。
34.如权利要求33所述的装置，其中，阵列还包括多个三元复合物，其中，每个三元复合物均包括阵列的核酸、聚合酶和用于核酸的下一个正确的核苷酸。
35.如权利要求1所述的装置，其中，检测通道的横截面积至多为100mm2。
36.如权利要求1所述的装置，其中，多个贮存器中的一个贮存器包含聚合酶。
37.如权利要求1所述的装置，其中，多个贮存器中的一个贮存器包含核苷酸。
38.如权利要求37所述的装置，其中，核苷酸包括可逆终止子部分和外源标记之一或两者。
39.如权利要求1所述的装置，其中，流体输送通道中的至少一个包括保持液体但释放气体的透气壁。
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