CN1980693B

CN1980693B - 牙龈卟啉菌疫苗

Info

Publication number: CN1980693B
Application number: CN2005800154545A
Authority: CN
Inventors: 史小菊; 迈克尔·安东尼·柯蒂斯
Original assignee: Individual
Current assignee: Zhenjiang Luzhou Oasis Biological Technology Co ltd
Priority date: 2004-05-19
Filing date: 2005-05-19
Publication date: 2011-11-09
Anticipated expiration: 2025-05-19
Also published as: CN1980693A; US8313749B2; WO2005112992A1; US20080057006A1; GB2428042A; GB2428042B; GB0622742D0; GB0411150D0

Abstract

本发明提供的疫苗其成分以ragB基因位点的核酸序列为基础用作预防和治疗牙龈卟啉菌引起的感染。核酸序列以及核酸编码的蛋白质序列，蛋白质引导生成的抗体在医学上的应用以及检测标本中牙龈卟啉菌的试剂盒也包括在本发明的范围内。

Description

牙龈卟啉菌疫苗

本发明有关一种疫苗，它是由所有可能的牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB等位基因产物组成的复合物，疫苗用于预防和治疗由牙龈卟啉菌引起的牙周病。

牙周病是口腔支持牙齿的软组织和固定组织处于感染状况下的一种炎症。炎症发展是由于牙龈菌斑内的微生物侵袭而引起。牙龈卟啉菌是目前被公认的牙周病的主要病原体，该细菌与成人牙周病的病原有特别关联(2)(10)(14)(17)(26)(36)(39)(45)。

牙周病菌斑中微生物的分析揭示了一个具有非常复杂的生物种属的牙周微环境。然而，近年来，利用DNA：DNA核查数据的集落分析以及美国BostonForsyth基因研究所的Socransky和他的同事们的努力，通过对16,000多例大型临床标本的各种临床实例的调查，发现破坏性牙周病与三种微生物有密切关联：牙龈卟啉菌，齿垢密螺旋体，福氏拟杆菌(9)(16)(46)(47)(49)。

牙龈卟啉菌W83型基因组序列测定已完成(33)。但是，分析牙龈卟啉菌的遗传特征揭示该菌的自然群体中具有广泛的同种异型性(3)(12)(15)(23)(25)(28)(30)(35)(37)(56)。国际上，利用牙龈卟啉菌的表面和外部抗原作为疫苗的研究已经在一些实验室中开展。包括半胱氨酸蛋白酶(附着酶)，荚膜多糖，和菌毛。然而，这些研究目前还不能解决菌种不同的问题，运用单一疫苗策略还不能针对等位基因或不同糖基化造成的转录后的差异(7)。

目前牙周病治疗依赖局部清除病灶，抗生素，和外科手术。

在英国，大约占总人口的10-15％的人群有程度不一的破坏性牙周病。疾病的普遍性可以从治疗的财力花费上反映出来，英国国家健康系统(NHS)估算英格兰和威尔士2001-2002期间约花费2.3亿英磅(实用牙医年度报告01-02)。这些费用仅仅是国家健康系统牙内科医生用于急性牙周病的治疗，所以不包括特殊治疗，不包括随诊和住院服务以及私人诊治。与牙周治疗相关的X-线检查，各项详细检查费用，假牙，支架，拔牙等也不包括在此估算中。所以NHS实际上每年在英格兰和威尔士用于牙周病的费用可能超出5亿英磅。而且不包括住院服务以及私人诊治服务。伴随着人类寿命的延长，年长而又健全的牙齿可通过关注口腔健康而达到，这将促进治疗措施的发展，也预示着公众健康支出会进一步增加。

目前有更多的证据可以说明牙周组织持续性革兰氏阴性细菌感染，亦即牙周病的特征，可能对受感染的个体的全身健康产生严重危害。虽然许多问题仍在科学界的争论之中，但是牙周病正在成为与心血管疾病和孕妇发生早产及生产低体重儿相关的一个显著的危险因子。

牙周病是人类常见的口腔疾病而且在现行的医药市场占据主要地位。在美国，40％的成人患致少是轻中度的牙周病，据报道1999年度美国用于牙周病防治的费用是143亿美元。

牙周病发展有许多不同阶段，控制病变可应用多种方法。但是目前的消毒和手术疗法并不理想。有效地控制牙菌斑可预防和控制牙龈病变和牙周病。机械性菌斑控制，如刷牙是第一道防御性措施，但是这取决于刷牙的质量，与个体性格，社会，文化因素有关。

化学方法控制菌斑包括使用抗微生物制剂，如三氯生消毒剂，氯己定，次氯酸钠，它们可通过不同途径自行使用。最常见的是口腔漱洗液方式。这种方法控制菌斑需要有规律地使用，相对花费较大，且只能局限于牙龈和浅表组织。

抗生素治疗牙周病包括使用甲硝唑，氯林霉素，环丙沙星。广泛使用这些药物成分预防细菌性疾病是不现实的，因为这不仅会诱发抗药菌株出现，而且对人体有毒副作用，还可能引发二次感染。

其他目前正在研发的针对细菌介导的口腔疾病的治疗方法，包括使用抗体，它能特异性结合到引起龋齿的主要病原体变形链球菌上，这种抗体专门供牙医或病人用于有规律地局部预防接种。临床前动物试验已显示了抗菌和防龋作用。

多种免疫改良方法已经被借鉴和运用到控制口腔细菌感染方面。这些包括使用源自小鼠单克隆抗体IgG的人源化sIgA抗体被动免疫方法(1)(6)(27)，使用靶细菌的关键抗原免疫非人类灵长目动物(11)(21)(24)(51)，使用多肽相对应于靶抗原的关键功能部位(22)(31)(50)，表达重组蛋白在口腔常居菌中传送靶细菌的抗原(42)。由此可见，在此领域里，有广阔的发展空间，这些方法可以被借鉴应用到RagB抗原的免疫应答。

目前，还没有针对牙龈卟啉菌的不同菌株的疫苗或产品上市或处在研发中用以预防牙周病.

目前治疗牙周病，至少在美国，主要是依赖高尖端技术和私人诊所市场。所以，有必要制作疫苗，价格便宜，容易接种(通过一系列商品，比如牙膏、漱口液)，和被广大民众所接受，而且重要的是疫苗治疗是有效地针对所有常见的病原体。

本发明提供了一个解决同种异型性问题的方法，即组合所有主要的牙龈卟啉菌RagB成分形成有效的疫苗，它们将被用着阻止牙龈卟啉菌感染和不同牙龈卟啉菌菌株感染而引起的牙周病。

按照本发明的第一款，疫苗由列于图5中的QMLragB 1518 bp，ThairagB1506 bp，W50ragB 1506bp和381ragB 1518 bp的核苷酸序列或其片断组成。

图1显示了rag等位基因QML的核酸序列(rag 3)，图2显示了rag等位基因Thai的核酸序列(rag 2)，图3显示了rag等位基因W50的核酸序列(rag1)和图4显示了rag等位基因381的核酸序列(rag4)。

图5中的QMLragB 1518bp核苷酸序列是图1 QML核苷酸序列(6173bp)中的序号从595到2112的反向互补的序列部分；ThairagB1506bp核苷酸序列是图2 Thai rag核苷酸序列(7361bp)中的5231-6736序列部分；W50ragB 1506bp核苷酸序列是图3 W50 rag核苷酸序列(8346bp)中的5417-6922序列部分；381ragB 1518bp核苷酸序列是图4 381核苷酸序列(7227bp)中的4077-5594序列部分。

核酸分子可能是图5中的QMLragB 1518 bp，ThairagB 1506 bp，W50ragB1506bp和381ragB 1518 bp的核酸序列的结合序列。比如，核酸序列可能由图5中的QMLragB 1518 bp和ThairagB 1506 bp的核酸序列，或者由列于图5中的QMLragB 1518 bp，ThairagB 1506bp，W50ragB 1506bp和381ragB 1518 bp的核苷酸序列或其片断组成。

按照本发明制作的疫苗成分可以采纳任何常用的接种方式，比如口腔、吸入、静脉注射或肌肉注射。

疫苗可制成其它可接受的药物剂型或需要时稀释。

一个有效的疫苗必须是能够诱发机体的特定部位对某种微生物抗原产生长期的免疫力，预防疾病在高危人群中发生。可行性表现在疫苗必须是安全、合理价格和容易储存及接种。

一部分有效的疫苗是由弱毒株也即含重要的抗原，但本身无毒的活的微生物制成；另一些疫苗可能由具有潜在毒性作用的细菌或病毒组成，但它们被灭活或减毒了；相当一部分疫苗由纯化的大分子组成，它们可以是蛋白质或糖蛋白；另外一些免疫学方法依赖于使用DNA、RNA等。

本发明期望制成的疫苗是以活菌作为传输系统，目的是希望既有利于口腔接种，又可产生对牙龈卟啉菌的免疫应答。可能的候选载体是，枯草芽孢杆菌孢子(8)(18)，格登链球菌(44)(41)，支气管炎博德特菌(48)。

如果疫苗是由纯化的抗原构成，本发明的疫苗必要时也可能含佐剂成分。任何医药部门认可的佐剂都有可能根据需要而被选择，例如，铝盐，细菌细胞壁片断(比如，弗氏佐剂)，灭活细菌，细菌多糖，细菌热休克蛋白，细菌DNA或者皂苷碱佐剂分子。此外，与一种或多种细胞因子合用也可作为佐剂。

当疫苗是建立在特定的核酸序列的基础上，比如DNA序列，核酸分子可被包裹在金属微粒上，通过弹道枪技术，穿过皮肤进入肌下。另外核酸可以与脂质体融为一体，和/或形成载体。这些载体可编码其他因子，如GM-CSF。

图1，2，3和4的核酸序列显示了牙龈卟啉菌rag基因位点的DNA序列，牙龈卟啉菌rag位点由ragB(编码免疫源区域的55kDa蛋白)和其上游的同转录的ragA(编码115kDa外膜蛋白)组成。RagB具有脂蛋白信号系统的结构模式，是牙龈卟啉菌的一个重要外膜蛋白。

用作疫苗的序列片断可按照它们的DNA序列的同源性选择，也可使用全基因。通常18个碱基对可生成6个氨基酸序列。

所以，本发明的主题之一是提供一种疫苗，它含有所有可能的RagB抗原(牙龈卟啉菌的外膜蛋白)，能使机体防御各种牙龈卟啉菌亚型的感染。此疫苗可能由四种已知的描述在本专利内容中的牙龈卟啉菌病原菌株的抗原序列组成，包括W50，QMUL，Thai和381菌株。

本发明的优化方案里，疫苗是由图5中的QMLragB 1518 bp，ThairagB1506bp，W50ragB 1506bp和381ragB 1518 bp的序列组成，它们以任何合适的形式组合和/或定向，也可以是核酸片断。

本发明所涉及的核酸包括DNA(基因组DNA和cDNA，或反义DNA)，和RNA，除非申请中特别注明。

本发明的核酸序列也包括那些与其同源或互补的序列。两个核酸序列的鉴定百分比是通过优化列对两个序列而决定的(例如，空隙被引进是指第一个序列与其他序列的最佳配对允许范围)，比较氨基酸残基或核酸序列在相应位置。“最佳配对”是比较两个序列结果呈现最高鉴定百分比的方法。鉴定百分比是由所比较序列中的相同的氨基酸残基或核苷酸数量而决定的(相当于，鉴定百分比＝相同的序列数/总序列数X100)。

两个序列的鉴定百分比可通过专业人士熟悉的数学形式来表达。Karlin和Altschul在1990年提出比较两个序列的数学表达法就是一个例子，1993年年他们对表达法做了改良。Altschul等人的NBLAST和XBLAST软件(4)就包含了这样的算法。BLAST核苷酸查寻可以通过NBLAST软件执行，得分＝100，序列长＝12可获得与发明中的核酸分子同源的核苷酸顺序。如欲获得含空隙的比较模式，可使用Altschul等人描述的Gapped BLAST方法。此外，PSI-Blast方法可被用作执行广泛搜索，此法可测出分子间的不同关系。在使用BLAST，Gapped BLAST和PSI-Blast搜索工具时，每个软件(如，NBLAST)的各项指标能预先设置。见www.ncbi.nlm.nih.gov。

序列比较的另一个数学表达法由Myers和Miller描述，ALIGN软件(型号2.0)也使用了数学表达法，是GCG序列配对软件包的一部分。在此领域中其他有关序列分析的数字法工具包括Torellis和Robotti描述的ADVANCE和ADAM法；Pearson and Lipman描述的FASTA法。在FASTA方法中，ktup的设置是控制调节，可协调搜索的敏感度和速度。

一个核酸序列如互补于本发明中所提及的核酸序列，那么它们可在严格的条件下发生杂交。或者说一个核酸序列同源于本发明中所提及的核酸序列，它们也可在严格的条件下发生杂交，但是衰变的遗传密码或寡核苷酸必须特异性与发明序列配对。核酸序列包括由核苷组成的寡核苷酸以及多聚核苷酸。如果核酸序列以发明序列中的片断为基础，该片断可能至少是由一个基因上的10个连续的核苷酸，或者说是由20，30，40或50核苷酸组成的寡核苷酸。

杂交的严格条件可以被描述成低盐浓度或高温条件。例如：严格条件可被定义为65℃在0.5M NaHPO₄，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA的缓冲液中杂交DNA到固相支持物上，洗涤用0.1xSSC/0.1％SDS(Ausubel et aleds.″Current Protocols in Molecular Biology″1，page 2.10.3，published by GreenPublishing Associates，Inc.and John Wiley&Sons，Inc.，New York，(1989))在68℃条件下。在某些情况下，根据需要条件可降低。在目前的常用的杂交技术中，改良的杂交条件可以是42℃用0.2xSSC/0.1％SDS(Ausubel et al(1989)supra)。杂交也可在更严格的条件下，通过增加甲酰胺的量以破坏核酸双倍体的杂交。所以，特定的杂交条件可改良，选择有利条件获得最佳效果。一般来说，当杂交温度是42℃时，探针在50％甲酰胺存在条件下，可使靶DNA与95％to 100％的同源序列与杂交，37℃时可使90％-95％同源序列杂交，32℃时可使70％-90％同源序列杂交。

核酸序列用于本发明各不同方面的例证公布于此。需要强调是，图5中的QMLragB 1518bp和ThairagB 1506bp的序列，或者是图5中的QMLragB1518bp，ThairagB 1506bp，W50ragB 1506bp和381ragB 1518bp或其片断的结合序列。互补或者同源序列可能是75％，80％，85％，90％，95％，99％类似于这样的顺序。

肽序列可以象前面所描述的那样，但它扩展到这里所述的后续的同源性多肽和多聚肽。术语“多聚肽”包括单肽和蛋白质，除非文中特别指出。

这些多肽包括相似体，同源体，同种异构体，独特体，衍生物，融合蛋白和具有相似结构的蛋白或者是相关联的多肽，它们的涵义都在此定义。

这里所用的术语“同功异质体”是指一个肽链，它具有与本发明的核酸序列编码的多肽相似或具同样的功能但与本发明的氨基酸序列和结构并不必须是相似或相同。通常如果一肽链的氨基酸序列相似于发明肽链，它至少要满足以下条件之一：(a)肽链的氨基酸序列至少有30％(亦或至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，)完全相同于本发明的肽链氨基酸序列；(b)核酸序列编码的肽链能与本发明的核酸序列编码的肽链序列中的至少5个氨基酸残基(更佳情况，至少10个氨基酸残基，至少15个氨基酸残基，至少20个氨基酸残基，至少25个氨基酸残基，至少40个氨基酸残基，至少50个氨基酸残基，至少60个氨基酸残基，至少70个氨基酸残基，至少80个氨基酸残基，至少90个氨基酸残基，至少100个氨基酸残基，至少125个氨基酸残基，或至少150个氨基酸残基)在严格的条件下杂交；或者(c)核酸编码的肽链至少30％(更佳情况，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，)相同于本发明的核酸序列编码的肽链。

这里所用的，肽链“相似结构”，是指本发明的肽链与某一肽链有相似的二级、三级、四级结构，肽链结构可由目前启用的技术如X-线结晶图像，核酸共振，结晶体电镜等方法决定。

这里所用的术语“融合蛋白”是指肽链由以下二部分组成，(1)本发明的肽链的氨基酸序列及其片断，相关的肽链或其片断，(2)异源性肽链的氨基酸序列(相当于不是本发明的肽链序列)。

这里所用的术语“同源体”是指由氨基酸序列组成的肽链相似于本发明的蛋白质，但功能并不一定相似或相同。

这里所用的术语“同种异构体”是指一肽链，(i)氨基酸序列与本发明的蛋白质相似，而且(ii)功能相似或相同。

这里所用的术语“相关肽链”是指本发明的肽链的同源体、同功异质体、独特体或同种异构体，或任何结合形式的关系。

这里所用的术语“衍生物”是指某一多肽由本发明的肽链氨基酸序列组成，但是其氨基酸序列因残基替代，缺失或者增加而改变，衍生肽与本发明的肽链功能相似或相同。

这里所用的术语“片断”指氨基酸序列形成的肽链至少由5-6氨基酸残基(更佳情况，至少10个氨基酸残基，至少15个氨基酸残基，至少20个氨基酸残基，至少25个氨基酸残基，至少40个氨基酸残基，至少50个氨基酸残基，至少60个氨基酸残基，至少70个氨基酸残基，至少80个氨基酸残基，至少90个氨基酸残基，至少100个氨基酸残基)构成。核酸序列的片断可相应地被定义。

这里所用的术语“独特型”是指同一基因编码的不同肽链，但是它们的等电点或/和分子量不同。这些独特型能通过它们的氨基酸组成(例如：插入片断或限制性蛋白溶解性能)而区分。此外，也可通过转录后分化的改良而区分(例如：糖基化、乙酸化、磷酸化)，这里所描述的独特型也是指某一蛋白质，它只存在单个型，也就是说，不能表达成几种不同类型。

技术人员知道，不同氨基酸可能有相似的性能，蛋白质中的一个或多个氨基酸通常可被其他氨基酸替代而不排除其原有活性。比如，甘氨酸，丙氨酸，结氨酸，亮氨酸和异亮氨酸通常就可以被互相替代(氨基酸有脂肪酸侧链)，在这些可能的替代物中，甘氨酸和丙氨酸可相互替代(因为它们具相关的短侧链)，结氨酸，亮氨酸和异亮氨酸可相互替代(因为它们都具有大的疏水脂肪酸侧链)。其他常见的氨基酸相互替代的例子有：苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸(氨基酸有苯基侧链)，赖氨酸，丝氨酸，组氨酸(氨基酸有碱性侧链)；天冬氨酸和谷氨酸盐(氨基酸有酸性侧链)，天门冬氨酸和谷氨酸(氨基酸有氨基侧链)半胱氨酸和蛋氨酸(氨基酸有巯基侧链)。这种自然替代物通常称为”保守”或”半保守”氨基酸替代。

氨基酸删除或插入可能与特定发明的多肽序列中的氨基酸的序列相关连。例如，氨基酸如果没有有效的生物学活性或免疫原性，或者说至少没有排除这些活性，都可能被删除。氨基酸插入到与特定发明相关的多肽氨基酸的序列中同样可能发生。这些方法可能改变特定发明的多肽特性，(例如，帮助鉴定纯化或表达)。与重组来源的特定发明的多肽序列相关的氨基酸改变可通过合适的技术而达到，例如，使用位点突变。

按本发明的要求构建的核酸，可被插入到合适的表达载体上，载体的核酸序列已在前文中叙述。术语“载体”或“表达载体”通常是指核酸载体，它们可以是RNA，DNA或cDNA。

术语“表达载体”可能包括染色质，游离染色质和病毒衍生的载体。例如，载体可以从细菌的质粒，噬菌体，转座子，酵母菌游离染色质，插入物，酵母菌染色质衍生而来，也可从病毒衍生而来，比如，棒状病毒，婴幼儿病毒，如SV40，牛痘病毒，腺病毒，禽水痘病毒，伪病毒和逆转录病毒；载体也可以来自组合体，比如，质粒和噬菌体遗传成分结合形成的粘性质粒和噬菌粒。通常，任何载体如适于在宿主内维持生存，准备或表达核酸编码的多肽都可被用着表达载体。载体可被构建在细菌质粒基础上，例如，细菌质粒pUC18。

重组表达载体将包括，例如，复制起点，启动位点，这通常由高度表达基因衍生而来用于指导上述结构序列转录方向，和一个选择性标记以允许含载体的细胞的分离。

表达载体可能由复制原点，一个合适的启动子和/或扩增子，还有必须的核糖体结合点，聚合区，片段供体和接受位点，转录终止序列，以及表达所必须的5’-端非转录序列。本发明期望的表达载体可能不要求扩增子的成分。表达载体可含选择性的标记如抗生素抵抗，这样能使重组质粒扩增。

介导表达载体到宿主细胞的过程可能通过磷酸钙转化，DEAE-葡聚糖介导的转化，微注射，阳离子脂质介导的转化，电击转导，擦痕点样法，弹道诱导，以及其他的转染方法。这些方法在很多实验室手册中都有描述，如Sambrook等所著的Mo1ecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。

本发明在某些特殊情况下，载体可供特异性表达，这些特异性表达可被诱导表达或只表达在特定类型的细胞，或两者兼顾。载体的特异性表达可被那些容易改变的环境因子，比如温度，营养附加剂赖，缺氧和/或存在细胞因子或其他生物活性因子诱导。特别期望的是那些载体，它们可通过改变化学物质的水平而诱导表达，比如，化学添加剂如抗生素。各种不同的合适载体可用于本发明，包括使用连续性的和可诱导表达，载体可用于原核和真核宿主细胞，这些是该领域专业人员通常使用的方法。

启动子序列可以是任何合适的已知启动子，例如人类巨细胞病毒(CMV)启动子，CMV介导前启动子，HSV胸腺密啶酶启动子，早和迟SV40启动子或是逆转录病毒LTR的启动子，如劳斯肉瘤病毒(“RSV”)，和金属硫蛋白启动子，如小鼠金属硫蛋白-I启动子。启动子序列可以由保持启动子活性的最小序列组成(相当于TATA不含增加子成分)。例如，最少序列的CMV启动(mCMV)。期望启动子是哺乳动物基因的启动子，能在弱碱性条件下发挥功能，不需要增强子成分。

本发明的DNA可以是单股或双股核酸组成，单股DNA可以是编码的正链，也可以是非编码或者反向链。用于治疗，核酸序列以各种可能的表达形式出现在各主题中。

载体终止序列可能是酰化核苷酸，它可编码多聚酰信号，典型的多聚酰信号在治疗部位是可识别的，比如，在人类治疗中，相对应的病毒序列，SV40病毒。其它已知的终止序列也可应用。

期望的多聚酰信号是一个RNA转录双向终止子。终止信号可以是猿猴病毒40(SV40)的多聚酰信号。例如，SV40后续聚(A)。此外，终止序列可以是牛生长激素的多聚酰信号。该系统结合CMV启动子可诱导最高水平的表达(54)。

按照本发明的第二款，它提供了疫苗的成份是由核酸分子编码的多肽组成，核酸序列列于图5中的QMLragB 1518bp，ThairagB 1506bp，W50ragB1506bp和381ragB 1518bp，或其片段。

这些序列的片段可根据它们的抗原决定簇来选择，全序列也可被使用，通常六个氨基酸已合适决定一个表型。

按照本发明的第三款，它提供的核酸序列列于图5中的QMLragB 1518bp，ThairagB 1506bp，W50ragB 1506bp和381ragB 1518bp用于医学。

按照本发明的第四款，它提供的核酸序列编码的多肽用于医学，核酸序列列于图5中的QMLragB 1518bp，ThairagB 1506bp，W50ragB 1506bp和381ragB 1518bp。

按照本发明的第五款，它提供的核酸序列列于图5中的QMLragB 1518bp，ThairagB 1506bp，W50ragB 1506bp和381ragB 1518bp用于医学治疗和预防牙周病。

按照本发明的第六款，它提供的的核酸序列编码的多肽用于医学治疗和预防牙周病，核酸序列列于图5中的QMLragB 1518bp，ThairagB 1506bp，W50ragB 1506bp和381ragB 1518bp。

按照本发明的第七款，它提供的核酸序列列于图5中的QMLragB 1518bp，ThairagB 1506bp，W50ragB 1506bp和381ragB 1518bp用于医学治疗和预防由牙龈卟啉菌感染而引起的牙周病。

按照本发明的第八款，它提供的的核酸序列编码的多肽用于医学治疗和预防由牙龈卟啉菌感染而引起的牙周病，核酸序列列于图5中的QMLragB1518bp，ThairagB 1506bp，W50ragB 1506bp和381ragB 1518bp。

使用本发明相应的款项，是指导治疗和预防由牙龈卟啉菌感染而引起的疾病，所以也扩大到针对这些状况和疾病的治疗的方法学，这些方法包括以上所描述的本发明的疫苗的接种途径等。

作为方法的一部分，它可以便捷地决定哪一株牙龈卟啉菌是感染的病原体，从而可选择针对特异性RagB组的疫苗。通过治疗前的诊断步骤，如果四种不同菌株能被鉴定出来，这将是一个更有效和便利的方法，用于治疗带有特异性感染源的病人急性感染。

按照本发明的第十一款，它提供了一个口腔保健品成份，是由疫苗以及其描述在上面的相应的款项组成。

这些口腔保健品，可以是但不局限于糊类(如牙膏)，潄口液，树脂类(例如，无糖口香糖)。

疫苗的成分也可被包裹在口腔保健器械上，如牙线或牙带等。

按照发明的第十二款，本项目提供了针对核酸编码的多肽的抗体，核酸序列列于图5中的QMLragB 1518bp，ThairagB 1506bp，W50ragB 1506bp和381ragB 1518bp。抗体可以是多克隆或单克隆的。

所以本发明所涉及的抗体还包括其在医学，以及治疗和预防牙周病，或者是由牙龈卟啉菌感染而引起的牙周病方面的应用。治疗方法正如在上述内容中所描述的那样，包括这些抗体的施治途径，它也是免疫疗法中治疗和预防这些疾病的一个部分。

本发明的核酸序列也可以应用于筛选临床标本中牙龈卟啉菌。本发明额外提供了一个诊断试剂盒用于检测临床标本中牙龈卟啉菌，试剂盒中包括特殊设计的引物，用于DNA扩增过程，也即多聚酶链式反应(PCR)。在检测标本中牙龈卟啉菌或诊断病变部位的感染时，该试剂盒应该提供使用说明书和方法。此外，本发明的抗体可作为诊断病人标本中牙龈卟啉菌的基础。检测抗原可借鉴其他任何合适的检验抗原-抗体结合的方法，如ELISA，放射免疫试验等。

本发明的疫苗组成还提供了新颖的和有效的结合治疗方案用于防治牙周病或牙龈卟啉菌感染。这些治疗方法可分别，持续或联合用于病变部位，本发明的疫苗可结合其它药物联合运用。如抗生素或抗微生物制剂。

合适的抗生素包括，甲硝唑，盐酸克林霉素，环丙沙星，但不限制于这些。合适的抗微生物制剂包括，三氯生，洗必泰，次氯酸钠但不限制于这些。

本发明所列的第二款和随后的款项的特征是第一款项的适当的修正。

下面将描述本发明的进一步例证，这些包括前景预测，但它们并不局限于本发明，在例证和图解后附参考文献。

图解描述在许多图中：

图1显示rag等位基因QML(rag3)的核酸序列。

图2显示rag等位基因Thai(rag2)的核酸序列。

图3显示rag等位基因W50(rag1)的核酸序列。

图4显示rag等位基因381(rag4)的核酸序列。

图5显示ragB等位基因核酸序列的列队比较。

图6显示RagB等位基因氨基酸序列的列队比较。

图7显示牙龈卟啉菌rag基因位点图表及引物细节。为rag基因位点所设计的引物是：正向引物(orf2 6586-6606)5’-CAAAGTCCTGCCACGAGTAGC-3’；反向引物(orfC 388-408)5’-CGTTTTCTCGCCACTTTCGTC-3’。

图8显示rag基因位点PCR扩增和HaeIII酶切结果。图8(a)显示rag基因位点长度区别；图8(b)显示酶切图谱区别。

图9显示病人标本中发现的主要四组rag基因位点序列比较结果。

图10显示代表四个不同的ragB等位基因菌株细胞溶解物与牙龈卟啉菌W50 RagB抗体的Western blot反应结果。“A”显示blot与抗牙龈卟啉菌W50型重组RagB单克隆抗体(1B15/31)的反应。“B”显示blot与抗牙龈卟啉菌W50型重组RagB多克隆抗体(02NH)的反应；在RagB四个不同组中没有交叉反应被观察到。

图11显示四个不同的ragB等位基因图表及引物设计(每组有其特异性引物)

图12显示复合PCR检测ragB等位基因的结果。对每个牙龈卟啉菌独特型而言只有一条特异性条带。

图13，13(a)显示构建牙龈卟啉菌W50ragA基因突变的图片；图13(b)显示ragA作为探针的Southern blot结果；图13(c)显示检测ragA基因突变所用的PCR结果，引物选自ragA。

图14显示ragA基因突变株(JMA1)在SDS-PAGE和Western blot中特征。12.5％SDS-PAGE和Western blot被用于分析牙龈卟啉菌W50和其突变菌株。图14(a)显示考马司亮蓝的染色的结果(ragA基因突变株失去分子量为115kDa和55kDa的蛋白条带)；图14(b)显示blots与抗RagB的抗体的反应。ragA基因突变株丧失RagB。

图15显示在小鼠动物模型中牙龈卟啉菌和ragA基因突变株的毒性研究结果。

图16显示构建ragB基因进入到表达载体(His6-RagB-pNY34)的简图。在大肠杆菌XL1Blue中，RagB去除了起始端的可能的信号肽序列，在tac启动子的控制和IPTG诱导下与His6片段融合生成。预期的重组蛋白分子量为55.7kDa。

图17显示提纯牙龈卟啉菌重组RagB的过程。重组蛋白在Ni-NTA柱中洗脱。

图18显示动物对重组RagB的免疫应答。抗体滴度用ELISA(平板用1∶12800稀释的重组RagB蛋白包裹)方法测出。小鼠用重组W50型RagB蛋白免疫，免疫应答被检测。针对重组RagB的特异性抗体被测出达到非常高的水平。

图19以溃疡面为依据，显示小鼠对牙龈卟啉菌W50攻击产生的免疫保护作用。

图20以存活时间为依据，显示免疫保护作用。在一定剂量下，牙龈卟啉菌W50攻击动物后，免疫小鼠存活时间长于非免疫小鼠。

例证1：牙龈卟啉菌rag基因位点的同种异型性。

材料和方法：

菌种和培养条件

细菌生长在含5％去纤维马血的Fastidious厌氧琼脂(FAA)平板上，或者是含5μg/ml氯化血红素的脑心浸液(BHI)肉汤中，放置在37℃厌氧培养箱(Don Whitley Scientific)中，含80％氮气，10％氢气，10％二氧化碳。

共168个牙龈卟啉菌菌株从发明者实验室的收藏中被调出检查，它们包括许多由发明者的同仁们慷慨赠与的。所有菌株都源自人类，多数是从牙周病人的标本中分离出，它们源自15个国家。这些菌株都是经由菌种特异性16S rRNA基因引物所完成的PCR而被确认的牙龈卟啉菌。

DNA改良

按照厂家的说明书，使用Puregene DNA分离试剂盒试剂(Flowgen)，全部基因组DNA从对数增长期的细菌中被分离出来。简述如下，1毫升隔液BHI培养物被溶解在600μl细胞溶解液中，80℃，5分钟。细胞溶解物在37℃条件下用3μl RNaseA酶处理1小时。利用异硫氰酸胍去除蛋白质，DNA在100％异丙醇和70％乙醇中沉淀和洗涤清洁，纯化的DNA被溶解在50μlTE缓冲液中(10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)。

使用Qiagen公司的凝胶提取试剂盒提纯DNA去除引物，各种酶和其他试剂。简述如下，在PB高盐缓冲液中DNA被结合到硅胶支架的离子交换树脂上，DNA用PE缓冲液洗涤两次后，用50μl TE缓冲液洗脱。

PCR产物限制性酶切反应使用Amersham医药公司或New England生物实验公司生产的酶和缓冲液来完成。反应在37℃条件下至少培养2小时。DNA电泳在0.8％琼脂糖凝胶Tris-Borate-EDTA(0.09M Tris-borate，0.002MEDTAA)缓冲液中完成。凝胶用溴化乙锭染色后，UV灯下观察，拍攝图像。

针对牙龈卟啉菌的特异性引物的设计：

16s rRNA，

正向引物：5’-AGG CAG CTT GCC ATA CTG CG-3’

反向引物：5’-ACT GTT AGC AAC TAC CGA TGT-3’

rag locus，

正向引物：5’-CAAAGTCCTGCCACGAGTAGC-3’

反向引物：5’-CGTTTTCTCGCCACTTTCGTC-3’

rag1(W50)，

正向引物：5’-CGC GAC CCC GAA GGA AAA GAT T-3’

反向引物：5’-CAC GGC TCA CAT AAA GAA CGC T-3’

rag2(Thai)，

正向引物：5’-GCT TTG CCG CTT GTG ACT TGG-3’

反向引物：5’-CCA CCG TCA CCG TTC ACC TTG-3’

rag3(QML)，

正向引物：5’-CCG GAA GAT AAG GCC AAG AAA GA-3’

反向引物：5’-ACG CCA ATT CGC CAA AGC T-3’

rag4(381)，

正向引物：5’-CCG GAT GGA AGT GAT GAA CAG A-3’

反向引物：5’-CGC GGT AAA CCT CAG CAA ATT-3’

多聚酶链式反应(PCR)

所有扩增反应均在PCR循环仪中完成。标准PCR反应使用0.5μg引物，0.5μl基因组DNA模板，加入到ABgene公司生产的含1.5mM MgCl₂的PCR备齐混合液中(高级生物技术)，在50μl总量中进行。扩增较长产物可用PCR备齐混合液2(高级生物技术)。PCR标准程序包括25个循环，每个循环包括95℃1分钟变性，50℃1分钟粘结，72℃1-3分钟延长。对于长PCR产物反应，前10个循环，52℃1分钟粘结，68℃延长6分钟40秒，后15个循环60℃结合，68℃延长7分钟。

SDS-PAGE and Western blotting

SDS-PAGE按照Laemmli的方法在12％分离凝胶中完成，简述如下，样本从1.5ml的原始培养物中准备。细菌沉淀物用135μl 0.2％SDS重新悬浮，旋转协助混合；蛋白酶抑制剂leupeptin加入上述悬浮液中最终浓度100μg/ml，室温下培养10分钟。灭活的样本加等量已配制的2倍标本缓冲液，加热100℃5分钟。样本按10μl/槽加入凝胶(10μl相当于50μl原始培养物)。Western blotting在碳酸盐转移缓冲液中完成(3mM Na₂CO₃，10mM NaHCO₃，pH 9.9，20％[vol/vol]methanol)，电泳条件为电流400mA 1小时，使用硝酸纤维膜。印迹后，膜用5％牛血清蛋白封闭，然后与抗重组RagB抗体B15andO2NH培养过夜，结合到膜上的抗体通过辣根过氧化物酶偶连的抗小鼠和抗兔免疫球蛋白(Dako，德国)而测出。

DNA序列决定和核酸序列检索号码

Thai(A011/9)，QML(QM220)，和381(菌种源于ATCC33277^T)长PCR产物纯化后被送到德国MWG-生物科技公司要求使用发表文献等级测序。使用FramePlot 2.3.2互联网软件开放读框鉴定。这里纪录的核酸序列数据已获国际基因库号码AY842852(381)，AY842853(QML)and AY842854(Thai)。

小结：分析rag基因位点(图7和9)的酶切图譜发现，ragB主要出现在四种不同的组别中，从不同组而来的四种ragB的等位基因的核酸序列已被测出(图1-4)。它们的DNA和蛋白质序列有非常大的差异，相似率约60％(图5-6和8)。每组的特异性引物被设计。复合PCR技术被应用在鉴定ragB等位基因在收藏的牙龈卟啉菌中的分布。地方临床标本和国际范围内的牙龈卟啉菌收藏都被用来测试以期得到不同ragB牙龈卟啉菌菌株在临床上的分布信息。结果显示，绝大部分(97％)临床标本PCR产物特异性针对四个不同的ragB等位基因中的一个(图11-12)。而且在western blot结果中可以见到抗体针对牙龈卟啉菌W50型的RagB和其它组不同RagB的牙龈卟啉菌没有交叉反应。这些发现可以确认ragB基因可分类成四个主要序列和抗原组。

例证2：牙龈卟啉菌W50rag基因位点的致病性作用

材料和方法：

菌种，质粒和培养条件

牙龈卟啉菌W50型是本项研究中的标准菌株。牙龈卟啉菌的培养条件已在案例1中描述。质粒pVA2198携带ermF-ermAM(erm)盒的序列，详细内容已在发表的文献中描述，该质粒提供克林霉素抗性标志用于基因突变。克林霉素用量是5μg/ml。

PCR和DNA改良

为从牙龈卟啉菌W50型基因组DNA中扩增ragA所设计的引物是：正向引物5’-CGCTATTCTTCCTTTGCTTGCT-3’，反向引物5’-TTACCATCCGCATCGACTTGA-3’，PCR是在Techne′s循环器中完成，反应混合物(50μl)含引物60μM，50μg基因组DNA模板，45μl的PCR备齐混合液(ABgene，Surrey，英国)。PCR由25个循环组成，温度特征为1分钟95℃，1分钟50℃，3分钟72℃，随后7分钟72℃，1个循环。0.7％琼脂糖凝胶-TBE电泳用着扩增DNA的分析。特异性的3.0-kb ragA PCR产物用分别用SacI和PstI消化。预期的酶切片段提纯后与从质粒pVA2198DNA中酶切的erm盒片断(SacI/PstI)连接。用扩增ragA基因所用的引物扩增连接物以确认混合物中含有ragA::erm重组成分。这个方法使得ragA缺失的1.5kb片断被2.1kb erm片段取代。突变的基因比原ragA基因多600碱基对(图13)。

构建等位基因交换突变

上述重组基因结构被用来构建牙龈卟啉菌突变型JMA1(ragA::erm)。用电击的方法使重组基因转化进入易感的牙龈卟啉菌W50型。简述如下：1ml活性生长期牙龈卟啉菌培养物加入到10ml含氯化血红素和维生素K3的BHI肉汤培养液中，37℃过夜。按1∶10稀释，过夜培养物加入到30ml新鲜预温的BHI培养基继续培养6小时。4℃条件下，离心10,000(g)10分钟收获牙龈卟啉菌细胞，然后用30ml电击缓冲液(EPB；10％glycerol，1mM MgCl₂；过滤灭菌；储存在4℃)，洗涤细胞沉淀物，最后用EPB配制成600μl细胞悬液。大约200ng DNA加入到装有200μl细胞悬液的0.2cm-沟长的电击杯中，细胞在2.5千伏电位差，200Ω电阻和25μF电容条件下用Bio-Rad公司的基因脉冲仪电击。牙龈卟啉菌然后立即用BHI-氯化血红素肉汤培养液稀释(室温)，并且允许细菌在厌氧培养箱中恢复16小时。隔夜培养后，初步筛选突变株菌落在含克林霉素的血平板上，厌氧状态下培养7-10天，随着等位基因突变交换，各种突变株都被用作表型分析。

SDS-PAGE and Western blotting

提取物的准备已描述在案例1。样本在10％聚丙烯凝胶中电泳。凝胶用考马士蓝染色(图14)。检测55kD的外膜抗原RagB用单克隆抗体E38。

Southern blotting

选用德国Roche公司的Dig标记和检测系统。基因组DNA用相关的限制性内切酶消化，并且在琼脂糖凝胶中电泳。凝胶中DNA被转移到HybondN+膜上(Amersham医药公司)。膜在杂交缓冲液中65℃被预杂交1小时，然后与dig标记的探针在同样的缓冲液中杂交过夜。ragA DNA探针是通过PCR扩增得到。erm探针片断是质粒pVA2198经EcoRI和SphI酶切得到。按照厂家的说明探针用随机引物的方法标记上digoxigenin-dUTP，检测杂交结果使用免疫酶方法。

小鼠毒性模型试验

使用小鼠溃疡模型，牙龈卟啉菌W50和JMA1(ragA::erm)的毒性潜力被分析。简述如下：18小时细菌细胞BHI(含5μg/ml氯高铁血红素)培养物离心收获，再按需要用培养液制成相应浓度的悬浮液，用于接种小鼠。小鼠分组，每组8只，每只小鼠被接种100μl细菌混悬液在背部脊椎旁两侧的皮下，三种不同浓度的混悬液被使用，按每毫升1×10¹¹，5×10¹⁰and 2.5×10¹⁰ cfu分别接种不同组。动物每日被观察两次察看溃疡发展，直至8天，同时按照存活和行为计数标准分析它们的一般情况，该标准获得地方委员会和英国内政部动物实验执行委员会的认可。

小结：为调查牙龈卟啉菌W50rag基因位点的毒性作用，独物型ragA突变株被建立，ragA的PCR产物体外插入Erm盒，构建物被电击转化进入细菌，该突变株既不能表达RagA，也不能表达RagB。突变株JMA1，通过PCR，Southern杂交，SDS-PAGE，and Western blotting被确认(见图13-14)。JMA1突变株被用在小鼠模型做毒性调查，各组小鼠(8只/组)按剂量每只皮下接种5×10⁹到2×10¹⁰cfu牙龈卟啉菌，接种后8天，溃疡面，体重，行为以及存活时间被记录。结果表明，当小鼠接种剂量在5×10⁹到10¹⁰ cfu牙龈卟啉菌时，以动物存活的时间为标准，ragA基因灭活造成牙龈卟啉菌毒性显著下降(见图15)，这些数据提示牙龈卟啉菌rag基因位点在细菌的致病性方面发挥重要作用。

例证3：克隆和表达牙龈卟啉菌W50ragB基因在大肠杆菌中

材料和方法：

细菌和生长条件

牙龈卟啉菌的培养条件已描述在案例1中，大肠杆菌XL-1Blue(购自Stratagene公司)生长在Luria-Bertani培养液中。

引物

用于扩增牙龈卟啉菌W50ragB基因所设计的引物为：

RagBF1：5_ATATATGAGCTCCGCGACCCCGAAGGAAAAG-3’

RagBRI：5_-TATATAGTCGACGAAAAGATA GGGGCTGCGAC-3’

斜体序列代表SacI和SalI酶切位点，被设计用于克隆位点。

PCR

PCR扩增25个循环，条件是：变性，94℃，1分钟；粘接，60℃，1分钟；延长，72℃，4分钟。

克隆ragB基因进入到融合蛋白表达质粒

1508bp，SstI-SalI酶切片断被克隆到源自pQE30的质粒pJFQ3010的相应位置(Curtis，1999)，形成新的含6个组氨酸标记的重组蛋白质粒。含氨苄青霉素钠抗性标记的重组质粒被整合到大肠杆菌XL-1 Blue中(Stratagene，Amsterdam，the Netherlands)。本计划确保了RagB N-端与6个组氨酸形成的融合蛋白在大肠杆菌XL-1 Blue中的合成，融合蛋白去除了ragB N-端可能的23个氨基酸信号序列，在tac启动子的控制和IPTG(异丙基-b-d-硫代半乳糖苷)的诱导下融合蛋白得以表达，估算的重组蛋白的分子量是55.7kDa(图16)。

提纯重组蛋白

表达构件质粒转化的大肠杆菌XL-1 Blue，在含50g/ml氨苄青霉素钠的Luria-Bertani培养液中，37℃培养过夜。离心沉淀收获细胞，细胞溶解在0.01M咪唑溶解液中(磷酸缓冲剂，8M尿素或6M盐酸胍pH8)，溶解物上清液与Ni-氨三乙酸琼脂糖微粒室温下培养1小时，装柱。第一洗涤过程用含0.02M氨三乙酸pH6.3的溶解液，洗脱过程用0.25M氨三乙酸pH5.9的溶解液(见图17)，洗脱的蛋白用0.15M盐溶液透析，过滤除菌。重组蛋白通过SDS-PAGE和考马士蓝染色被确认。重组蛋白浓度用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce公司产品)检测。重组蛋白贮藏在-20℃。

小结：以核酸序列为基础，我们成功地从牙龈卟啉菌W50和牙龈卟啉菌Thai菌株(数据未在此公布)的基因组DNA中克隆了ragB基因.ragB基因被组建到pQE表达质粒中，重组质粒被表达在大肠杆菌中XL-l Blue(Stratagene)中。纯化重组RagB，Ni-NTA金属-亲和层析柱被利用。我们发现用多聚组氨酸融合表达系统可制作足够量的蛋白用于动物实验。

例证4：宿主对牙龈卟啉菌W50 RagB的免疫应答

材料和方法：

免疫原准备

用于本项目的佐剂是氢氧化铝。新鲜配制的Al(OH)₃与重组RagB混合。简述如下，10ml的10％硫酸钾铝(AlK(SO4)₂.12H₂O)置于50-ml离心管中，振荡并缓慢滴入22.8ml0.25N NaOH，室温静置10分钟，离心(1000g)10分钟，沉淀物用蒸镏水洗涤，1mg Al(OH)₃能结合大约50-200μg的蛋白质抗原。佐剂与重组RagB培养在0.9％盐酸液中室温20分钟。离心(10,000g)10分钟。检测上清液中蛋白浓度推算出抗原结合到佐剂的量。

免疫

5周龄BALB/c小鼠从合法途径购得并安置在实验室中1周，使其适应环境。动物皮下接种100μl含25μg蛋白(RagB)和佐剂的混悬液。4周后用相同剂量和同样体积的免疫原佐剂乳化液作加强免疫。继续4周饲养，检测血液中抗体浓度。

采集血清和决定抗体滴度

采血15-50μl。37℃培养60分钟，使其完成凝血和血块收缩过程。置冰箱(4℃)过夜，离心血样本(10000g)10分钟，分离血清和血细胞。血清储存在-20℃。ELISA和Western blot被用作检测抗重组RagB和自然RagB的抗体。如果抗体滴度未达到满意的水平，进一步的加强免疫是必须的。

小结：小鼠对重组牙龈卟啉菌W50 RagB的免疫应答被检测，结果发现所有免疫的动物都产生了高滴度的抗体，抗体针对重组蛋白也针对该细菌的自然RagB蛋白(见图18)。

例证5，免疫保护调查

材料和方法，

动物：

48只BALB/c小鼠分6组，分别用重组RagB免疫接种。每组同时有同样数目的非免疫动物作年龄对照。

攻击实验：

用于毒性研究的小鼠溃疡模型已经在案例2中描述。简述如下，18小时BHI培养液中生长的(含氯化血红素5μg/ml)细菌离心沉淀后，用培养液调整细菌细胞至所需剂量。小鼠分组，每组8只，免疫和未经免疫的动物都在脊椎中部两侧皮下各接种100μl细菌混悬液。5个不同剂量的牙龈卟啉菌W50被选用，每毫升4×10¹¹，2×10¹¹，10¹⁰，5×10⁹and 2.5×10⁹cfu；单个剂量10¹⁰cfu/ml的牙龈卟啉菌Thai被选用，动物每天被检查2次直到8天。观察溃疡面发展并分析它们的一般情况根据标准化记数系统记录出现及行为。

小结：用前面已描述的同样的动物模型，动物在重组RagB免疫后的免疫保护作用被分析。结果表明，以溃疡面体积和存活时间为指标，被免疫动物对皮下攻击的同种细菌产生了免疫保护作用(见图19-20)。免疫血清学交叉反应也被测试，即牙龈卟啉菌W50型RagB免疫血清与携带另三种RagB等位基因的牙龈卟啉菌反应。依据Western blotting结果，没有发现牙龈卟啉菌W50和牙龈卟啉菌Thai有交叉反应(图10)，所以有理由相信，用牙龈卟啉菌W50重组RagB蛋白免疫动物不太可能交叉保护动物受其他牙龈卟啉菌携带不同RagB等位基因的攻击，在初步实验中，这种设想已经得到证实，用牙龈卟啉菌W50重组RagB(ragB1组)免疫的动物，不能保护动物受牙龈卟啉菌Thai(ragB2组)的攻击。数据表明，RagB是一个有前景的候选疫苗。

例证6：混合重组蛋白

1.根据我们免疫保护实验的结果，在免疫和攻击的实验中，重组蛋白的混合体将被用作免疫原。整个过程将类似于我们前面所介绍的方法，但是混合蛋白按1∶1∶1∶1的比例将取代单个基因重组蛋白。

2.96只小鼠分为12组，用乳化混合液免疫和加强免疫，方法如上所述。

3.最后一次加强免疫一星期后，免疫和未经免疫的动物都将皮下接种5×10⁹-2×10¹⁰cfu携带不同RagB等位基因的牙龈卟啉菌。攻击后8天，动物的溃疡面，体重，行为以及出现都将被记录。

例证7：运用基因工程技术制作表达牙龈卟啉菌RagB片段的重组格氏链球菌

1.用于扩增牙龈卟啉菌W50ragB基因所设计的特异性的引物在ragB两端含限制性酶切位点，PCR将被应用于扩增不同组ragB。

2.克隆的ragB进入插入载体pSMB55以获取转化基因融合体。重组的质粒将被用于转染格氏链球菌，转化菌将在含红霉素的平板上筛选。

3.重组细菌将通过PCR和Southern blot杂交确认，RagB的表达将通过SDS-PAGE和免疫印迹检测。阳性菌克隆将被冷冻干燥或-70℃保存。

4.实验动物(小鼠或兔)被用着检测重组格氏链球菌中RagB的免疫原性。动物皮下免疫混合于合成佐剂的10⁹链球菌活菌。免疫动物的血清用ELISA和免疫印迹的方法检测，抗原使用牙龈卟啉菌RagB。

5.测试口腔菌落附着及免疫应答，Sprague-Dawley无菌大鼠将被用着动物模型，重组格氏链球菌接种动物口腔两次(10⁹cfu)，允许24小时间隙。分析链球菌附着可用口腔试子每周采集标本。免疫应答和预防作用将被测试，方法已如前所述。

例证8：使用牙龈卟啉菌动物攻击模型调查有潜力的特异性抗体的保护作用

1.按照需要的剂量配制新鲜的细菌悬浮液(例如牙龈卟啉菌W50型，5×10⁹cfu/ml)。

2.成年小鼠(6-10周龄)被分在6组中(8只/组)，用不同标记以区分各个体。

3.第一组是阳性对照，接受牙龈卟啉菌；第二组是抗体被动转移的试验组，牙龈卟啉菌攻击前24小时接受特异性抗体。第三组与第二组相同但使用无关的Ig免疫球蛋白代替特异性抗体作为被动免疫转移的阴性对照。第四组接受被特异性抗体调理后的牙龈卟啉菌。第五组接受用无关的Ig调理的牙龈卟啉菌作为阴性对照；第六组，阴性对照，仅接受BHI肉汤。

4.上述准备好的细菌混悬液被用作接种小鼠做攻击试验。在实验动物脊柱两侧中部皮下注射0.1ml合适剂量的细菌悬液。

5.攻击后，动物每天都将被测试，观察感染的信号，并分析各个体的一般情况。

6.15天后，或在处理动物的时候，溃疡的位置和累及范围(长和宽)用卡尺测量，溃疡面积用平方厘米表示。

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Claims

1.疫苗成分由以下序列中所挑选的核酸分子组成：

i)图5中的QMLragB 1518碱基对序列，

ii)图5中的ThairagB 1506碱基对序列，或者

iii)图5中的381ragB 1518碱基对序列。

2.疫苗成分由以下序列中所挑选的核酸分子编码的多肽组成：

i)图5中的QMLragB 1518碱基对序列，

ii)图5中的ThairagB 1506碱基对序列，或者

iii)图5中的381ragB 1518碱基对序列。

3.应用于医学方面的核酸分子具以下序列中所挑选的核酸序列：

i)图5中的QMLragB 1518碱基对序列，

ii)图5中的ThairagB 1506碱基对序列，或者

iii)图5中的381ragB 1518碱基对序列。

4.应用于医学方面的多肽由以下序列中所挑选的核酸分子编码：

i)图5中的QMLragB 1518碱基对序列，

ii)图5中的ThairagB 1506碱基对序列，或者

iii)图5中的381ragB 1518碱基对序列。

5.在治疗或预防牙周病的药剂准备过程中所使用的核酸分子从以下序列中挑选：

i)图5中的QMLragB 1518碱基对序列，

ii)图5中的ThairagB 1506碱基对序列，或者

iii)图5中的381ragB 1518碱基对序列。

6.在治疗或预防牙周病的药剂准备过程中所使用的多肽由以下序列中所挑选的核酸分子编码：

i)图5中的QMLragB 1518碱基对序列，

ii)图5中的ThairagB 1506碱基对序列，或者

iii)图5中的381ragB 1518碱基对序列。

7.在治疗或预防由牙龈卟啉菌引起的感染的药剂准备过程中所使用的核酸分子从以下序列中所挑选：

i)图5中的QMLragB 1518碱基对序列，

ii)图5中的ThairagB 1506碱基对序列，或者

iii)图5中的381ragB 1518碱基对序列。

8.在治疗或预防由牙龈卟啉菌引起的感染的药剂准备过程中所使用的多肽由以下序列中所挑选的核酸分子编码：

i)图5中的QMLragB 1518碱基对序列，

ii)图5中的ThairagB 1506碱基对序列，或者

iii)图5中的381ragB 1518碱基对序列。

9.权利要求的第一款和第二款所定义的疫苗成分在制备治疗或预防由牙龈卟啉菌引起的感染的药剂中的应用。

10.权利要求的第一款和第二款所定义的疫苗成分在制备治疗或预防牙周病的药剂中的应用。

11.口腔保健品成份由权利要求的第一款和第二款所定义的疫苗成分组成。

12.针对以下序列中所挑选的核酸分子编码的多肽的抗体：

i)图5中的QMLragB 1518碱基对序列，

ii)图5中的ThairagB 1506碱基对序列，或者

iii)图5中的381ragB 1518碱基对序列。

13.权利要求的第十二款所定义的抗体在治疗和/或预防牙周病的药剂准备过程中的应用。

14.权利要求的第十二款所定义的抗体在治疗和/或预防由牙龈卟啉菌引起的感染的药剂准备过程中的应用。

15.检测标本中牙龈卟啉菌的试剂盒含权利要求的第十二款所定义的抗体。

16.检测标本中牙龈卟啉菌的试剂盒所含核酸分子引物从以下核酸序列中挑选：

i)图5中的QMLragB 1518碱基对序列，

ii)图5中的ThairagB 1506碱基对序列，或者

iii)图5中的381ragB 1518碱基对序列。

17.试剂盒由权利要求的第一款和第二款所定义疫苗成分，或者第十二款所定义的抗体以及所需的医药公司的产品组成，用于分离牙龈卟啉菌，指导由牙龈卟啉菌引起的感染或牙周病的治疗和预防。