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CN1973204A - 具有Ln2O3核并携带生物配体的杂交纳米粒子及其制备方法 - Google Patents

具有Ln2O3核并携带生物配体的杂交纳米粒子及其制备方法 Download PDF

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CN1973204A
CN1973204A CNA2005800065984A CN200580006598A CN1973204A CN 1973204 A CN1973204 A CN 1973204A CN A2005800065984 A CNA2005800065984 A CN A2005800065984A CN 200580006598 A CN200580006598 A CN 200580006598A CN 1973204 A CN1973204 A CN 1973204A
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rare earth
nanoparticles according
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CNA2005800065984A
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P·佩里亚
C·路易斯
C·马凯特
R·巴齐
S·鲁
O·蒂里门特
G·勒度
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Institut National des Sciences Appliquees de Lyon
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Lyon
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Abstract

本发明涉及杂交纳米粒子，该纳米粒子包括：－纳米球，平均直径为2至9nm，至少90％的重量由Ln2O3组成，其中Ln代表稀土元素，任选掺杂有稀土元素、锕族元素、稀上元素的混合物或稀土元素和锕族元素的混合物，其中至少 50％的金属离子是稀土元素离子，－纳米球层，该涂层主要由官能化的聚硅氧烷组成，平均厚度为0.5至10nm，优选大于2nm且不大于10nm，和－至少一个通过共价键接枝到聚硅氧烷涂层的生物配体，以及它们的制备方法。

Description

具有Ln2O3核并携带生物配体 的杂交纳米粒子及其制备方法
本发明涉及用于生物系统检测、跟踪和量化的探针的技术领域。更具体地讲，本发明的主题涉及一种新的、杂交探针粒子及其制备方法，该探针粒子的核由平均直径小于10nm的包含镧系元素倍半氧化物的纳米粒子组成，其上固定有探针分子。
使用与生物系统中用于检测(识别)或跟踪被称为靶的特定物质的标记物有关的探针是医学诊断领域和生物研究领域中的常用技术。所述探针在流式细胞计量、组织学、免疫学检定或荧光显微镜术特别有用，可用于生物物质和非生物物质的研究。
常用的标记系统例如可以是碘、磷和其它物质(如过氧化酶或碱性磷酸酯酶)的放射性同位素，它们的检测需要特定的底物。在大多数情况下，标记物与被测物质之间的选择性偶联可以通过单个官能分子或多个官能分子的组合获得。为了确定无疑地鉴别待测的目标物质，结合选择性是必需的。确保这种偶联的反应是已知的，例如在《Bioconjugate Techniques》，G.T.Hermanson，Academic Press1996或《Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity.A PracticalGuide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis》，第2版，W.T.Masoned.，Academic Press，1999中所描述的。
荧光有机染料非常频繁地用于标记。包括荧光素、德州红(Texas Red)或Cy5，它们可以选择性地连接到用作探针的确定的生物或有机物质上。在标记探针被外源激发后，最常用的是电磁源，探针发射的荧光证明了与探针结合的目标生物或有机物质的存在。
现有技术的荧光有机染料的一个主要缺点的根源在于它们的低化学稳定性：它们在存在酸或自由基(radicals)的情况下，在仅仅几百万个光吸收和发射循环之后就发生降解，甚至分解。此外，在大多数应用中，它们对入射光的稳定性也不足。此外，荧光有机燃料会对生物环境也具有光毒性。
荧光有机染料还具有在广谱范围内发射以及被波长非常窄的波谱范围的辐射激发的缺点。因此，通过发射谱带的重叠同时识别每个都用不同的荧光染料标记的几个物质(也被称为复用)将变得很难，并且限制了不同标记的物质的计数。而且，不同染料的有效激发需要几个光源，通常是激光，或者当将白光用作激发源时，需要使用包括一系列滤光器的复合光学组件。
现有技术曾经提出可以使用荧光有机染料。作为第一任选方案，可以使用含有镧族金属离子作为荧光标记物的金属络合物(鳌合配位体)(专利US4637988和US5891656)。这些系统的主要优点是被激发的物体具有较长的寿命，可能达到几个毫秒，认为实验具有时间分辨力。但是，发光在水介质中的高度稀释(淬火)妨碍了这些镧系鳌合物的使用。由于生物介质通常具有非常高的含水量，所以这极大地限制了鳌合物的应用领域。因此人们进行了从生物介质中分离被测物质并将其放入无水环境中的尝试(I.Hemmil，Scand.J.Clin.Lab.Invest.48，1988，389-400页)；但是，由于标记点上的数据在分离步骤中丢失，因此使得它们不能进行免疫组织化学测试。在专利US4282382和US4259313中指出，可以将捕获了镧系鳌合物的聚合物粒子(乳胶)用作荧光标记。
现有技术中提出的另一种任选方案包括标记探针，该探针可以结合到具有固有发光粒子的被测目标上。具体而言，半导体材料的纳米粒子已经是认真研究过的对象。专利US5990479以及以WO00/17642和WO00/29617公开的国际专利申请示出了属于II-VI或III-V族元素的荧光半导体纳米晶体和那些在某些条件下由来自周期表的第4主族的元素组成的纳米晶体，可以将其用作生物系统的荧光标记物。由于被称为《量子尺寸效应(quantum size effect)的现象，所以荧光半导体纳米晶体的发射波长由其尺寸决定。因此，通过使这些纳米晶体的尺寸发生变化，可以将广谱范围从可见光覆盖到近红外区。它们作为生物标记物的使用由Warren C.W.Chan，Shuming Nie，Science，281，2016-2018，1998和MarcelBruchez Jr，Mario Moronne，Peter Gin，Shimon Weiss，A.Paul Alivisatos，Science，281，2013-2016，1998描述。具有适当确定的发射波长即低尺寸分散的半导体纳米晶体的制备在操作条件和合成过程中需要高度准确的精度和完善的控制。因此生产它们非常困难。将由这些半导体晶体提供的宽范围颜色仅有几个埃(即几个原子层)的尺寸改变。溶液中的合成方法几乎不能达到这样高的精度。此外，在纳米晶体的表面上观察到的电子空穴对的再结合将量子产量限制到很低的值。
为了回避这个问题，人们提出了一种核/壳结构：这需要用具有更宽间隙的半导体材料(ZnS，CdS)层单独地涂覆荧光半导体纳米晶体。而且，通过荧光半导体纳米晶体选择标记的生物分子需要形成由胺基团(环氧和羧酸)官能化的聚硅氧烷层。这些形成生物分子的定位点。因此，这些纳米晶体的制备至少需要三个合成步骤，前两步非常精密，因此很难应用到工业规模。
不管希望的结果如何，通过掺杂发光离子(稀土元素)使得氧化物纳米粒子发光进行标记仍然不是非常普及。其主要缺点在于它的低量子产量，这需要使用激光激发存在于晶体阵中的发光离子。而且，当在水介质中直接使用这些粒子时，其发光性能被显著破坏。
特别值得一提的是US2003/0180780，在该专利申请中描述了涂有硅烷的金属氧化物纳米粒子，可以将该硅烷用作目标生物分子的标记试剂。其中给出的唯一的例子涉及涂有从3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)获得的非常薄的硅烷层的Eu2O3纳米粒子，这些纳米粒子的平均直径为100-200nm。
对生物应用来说，人们希望使用其胶状悬浮体具有更好的稳定性的更小尺寸的纳米粒子，并且它们的组分具有更好的《隐密性(furtivity)》或《分子性(molecularity》。使用更小尺寸的纳米粒子进行标记可以提高生物功能的靶向率。
在本文中，本发明提供用于生物标记的杂交探针纳米粒子，该杂交探针纳米粒子具有足够小的尺寸，并且特别是对外部水介质的侵袭具有提高的稳定性。
因此，本发明的主题是杂交纳米粒子，该杂交纳米粒子包括：
-纳米球，其平均直径为2至9nm，其至少90％的重量由Ln2O3组成，其中Ln代表稀土元素，任选掺杂有稀土元素或锕族元素、稀土元素的混合物或稀土元素和锕族元素的混合物，其中至少50％的金属离子是稀土元素离子，
-纳米球涂层，主要由官能化的聚硅氧烷细成，平均厚度为0.5至10nm、优选大于2nm且不大于10nm，和
-至少一个通过共价键接枝到聚硅氧烷涂层的生物配体，。
具体而言，使用掺杂稀土元素的Ln2O3倍半氧化物的纳米粒子是特别有利的，因为它们具有极窄的发射光线和通过用不同的阳离子掺杂获得不同发射光线的可能性。
此外，通过存在于纳米球核中的稀土元素离子(极好的光稳定性、长寿命的激发态)使纳米粒子发光的使用和涂层表面里和/或上的发光分子的使用使得可以进行时间分辨检测，特别是当将高效工具用于光学成像时，例如时间分辨发光显微术。
而且，如果这些纳米粒子包含具有所需磁特性的镧族元素例如钆，那么可以将它们用作MRI造影剂或治疗系统中，该治疗系统例如能够在纳米粒子与外部施加的交流磁场的相互作用后破坏目标细胞，产生过高热。
另外，如果这些纳米粒子包含具有与高能反应偶合的广泛中子捕获能力的元素例如157Gd或235U，那么可以基于中子捕获将它们用于治疗(例如针对癌症)。
上述纳米粒子的胶状悬浮液也形成本发明的一部分。
本发明的另外的主题是一种制备上述限定的杂交纳米粒子的方法，任选以胶状悬浮液的形式，所述方法包括下面的步骤：
a)制备纳米球的胶状悬浮液，该纳米球的平均直径为2至9nm，至少90wt％由Ln2O3组成，其中Ln代表稀土元素，任选掺杂有稀土元素或锕族元素、稀土元素的混合物或稀土元素和锕族元素的混合物，其中至少50％的金属离子是稀土元素离子，
b)将所需量的烷氧基硅烷和交联试剂的混合物添加到胶状悬浮液以在该粒子表面上形成涂层，该涂层主要由通过至少一种活性基团官能化的聚硅氧烷组成，平均厚度为0.5至10nm、优选大于2nm且不大于10nm，和
c)用化学方法通过与存在于涂层表面上的活性基团偶合将至少一种生物配体接枝到该涂层上，
d)任选分离和干燥所获得的杂交纳米粒子。
下面参照附图的描述提供了对本发明主题的更好的理解。当它们不互相排斥时，可以将下面描述的不同变型组合。
附图1是依据下面的实施例4获得的涂有3.5nm厚的层的8nm的Gd2O3:Tb3+粒子的高分辨率传输电子显微术视图。
附图2是依据下面的实施例4获得的涂有3.5nm厚的聚硅氧烷层的8nm的Gd2O3:Tb3+粒子的长度方向测量的EDX光谱分析(偶合到HRTEM)。
附图3给出了在涂上3.5nm的聚硅氧烷层(实施例4)之后的8nm粒子的尺寸测量结果。
附图4给出了原始粒子(透析胶体，5.7nm)和涂上8.0nm的聚硅氧烷层(实施例3)之后的尺寸测量的比较结果。
附图5给出了原始粒子(透析胶体，3.5nm)和涂上5.0nm的聚硅氧烷层(实施例1)之后的尺寸测量的比较结果。
附图6给出了原始粒子(透析胶体，3.5nm)和涂上通过8.0nm的荧光素官能化的聚硅氧烷层(实施例6)之后的尺寸测量的比较结果。
附图7示出了用柱色谱法获得的不同组分，如实施例6中涂有由荧光素官能化的聚硅氧烷的、在230nm激发的胶体的发射光谱。
附图8示出了纳米粒子的荧为性，该纳米粒子具有涂有通过荧光素和低聚核苷酸链官能化的聚硅氧烷的氧化钆核，这些纳米粒子通过与互补的低聚核苷酸链的杂交(实施例9)固定在生物芯片上。
附图9示出了对应于附图7示出的柱色谱的组分2、并且在荧光素降解之后在540nm激发的胶体的发射光谱。
附图10给出了5.7nm的原始透析胶体的粒子和那些涂有8.0nm的聚硅氧烷层(实施例3)的粒子之间的发光测量的比较结果。
附图11给出了3.5nm的原始透析胶体的粒子和那些涂有5.0nm的聚硅氧烷层(实施例1)的粒子之间的发光测量的比较结果。
附图12给出了3.5nm的原始透析胶体的粒子和那些涂有8.0nm的聚硅氧烷层(实施例2)的粒子之间的发光测量的比较结果。
附图13示出了在乙醇中透析和在用0.2M的HCI酸化的水中分散，如实施例5中涂有聚硅氧烷、在230nm激发的胶体的发射光谱。
附图14示出了涂有5.0nm的聚硅氧烷层(实施例1)的Gd2O3:Tb3+(5％)(直径3.5nm)粒子的激发光谱。
在本文中，使用的术语具有下面的定义。
稀土元素包括钪、钇和镧系元素，它们是Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu。在本发明中，稀土元素优选选自钇和镧系元素。
锕系元素是Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No和Lw。
纳米球的平均直径或中径称为d50，定义为这样的直径，即50％的纳米球的直径小于该直径，并且由激光扩散技术(光子相关光谱法)确定。
将Ln2O3倍半氧化物掺杂稀土元素或锕系元素，如果是后者，那么其存在的比例不大于金属离子的25％。超过这个值，它就变成混合物。
本发明涉及一种用于生物应用的探针，基本上包括由涂层包围的纳米球核，该涂层也称作环，通过至少一个生物配体和任选的其它有机分子的共价键实现接枝。纳米球基本上是纳米尺寸的球形无机荧光核。更精确地讲，这种球核由Ln2O3组成，其中Ln代表纯稀土元素，或者掺杂有稀土元素、锕系元素或其组合，或者稀土元素的混合物，或者稀土元素和锕系元素的混合物，其中至少50％的金属阳离子是稀土金属阳离子。这种纳米球核的平均直径为2至9nm范围。至少90％重量的纳米球由Ln2O3组成，如上所定义的，其余部分可能由相应的氢氧化物组成。
涂层是围绕纳米球的中间层，生物配体通过共阶键结合到该涂层上。该涂层主要由官能化的聚硅氧烷组成，并平均厚度为0.5到10nm，优选大于2nm。这种涂层的功能至少有但不限制于三个方面：它必须确保保护(密封)核不受外部环境的影响；它必须充当生物配体连接到其上的接枝点；它必须提高无机核的光学性能，通过在可见波长从UV-吸收环向核重发射传递能量。
形成本发明的纳米粒子的球形核的纳米球的类型可以根据目标应用进行选择，并且优选由至少80％重量的任意掺杂的稀土元素的倍半氧化物组成。优选地，将这个纳米球掺杂或共同掺杂，即用至少两种不同类型的元素掺杂。
最好纳米球由至少80％重量的、优选至少90％重量的Y2O3或Gd2O3组成，优选Gd2O3。
当需要常规发光时，可以用Eu、Tb、Er、Nd、Yb、Tm类型的镧系元素掺杂纳米球，其量为纳米球金属阳离子的0.1至25％。当需要在红外线区发光时，可以用Nd或Yb类型的镧系元素掺杂纳米球。当需要antistokes发光时，则可以采用Er类型的镧系元素掺杂纳米球。
如前所述，在组合检测(复用)时，可以用至少两种不同的占纳米球金属阳离子0.1到25％的镧系元素掺杂纳米球，这些镧系元素中的至少之一选自Eu和Tb。
而且，为了便于检测，特别是在磁共振成像(MRI)领域或治疗领域，除了具有发光性能之外，纳米球最好还应当具有磁性能。因此，纳米球最好含有选自Gd、Nd的具有磁性的稀土元素阳离子，对医学成象应用来说，其量为所有存在于核中的金属阳离子的10％，对高温应用来说为50％。
依据另一个有利的变型，纳米球的金属阳离子的0.01至50％、优选0.1至10％是选自Ac、Th、Pa、Np、U、Pu的锕系元素阳离子。用所述的放射性原子核掺杂纳米球特别可用于核反应相关治疗中。
另一个有利的变型涉及杂交纳米粒子，其中至少0.1％的纳米球的金属阳离子是放射性同位素，其半衰期小于1000年，或者其中至少1％、优选至少5％的纳米球的金属阳离子是同位素，该同位素具有偶合高反应能量的广泛中子捕获能力(例如157Gd，235U)。所述的纳米粒子对基于核分裂反应的治疗系统例如用于癌细胞的破坏是非常重要的。
优选地，纳米球由至少90wt.％的任意掺杂的镧倍半氧化物细成。本发明的杂交纳米粒子是特别优选的，其纳米球由掺杂有Tb或Eu的至少90wt.％的Gd2O3组成。Gd3+是阳离子，其具有强的顺磁性，并且能够作为发光Eu和Tb阳离子的基质。
稀土元素的倍半氧化物的纳米球，特别是钆倍半氧化物易于在水介质中水解。为了防止倍半氧化物转换为氢氧化物，它涂有主要由官能化的聚硅氧烷组成的保护层。该层必须足够厚以确保这种保护作用：它的平均厚度为0.5到10nm，并且优选大于1nm。涂层最好至少占纳米粒子总体积的20％，优选占纳米粒子总体积的25至75％。通过激光粒子尺寸测量方法(光子相关光谱法)测量该厚度。对单独的纳米粒子来说，也可以通过传输电子显微镜术测量纳米球的直径和层的厚度。
最好该涂层能够保护氧化核的发光性能和/或使得能够对球核进行能量转移，通过聚硅氧烷的环吸收能量，并转移给球核，这提高了它的发光度。如果通过氧桥将5至75％、优选30％至50％的聚硅氧烷层的硅原子中的每一个都连接到其它四个硅原子上，这细成本发明的优选变型，则将特别确保这种功能。因此，依据本发明的一个优选变型，将官能化的聚硅氧烷涂层中的25至95％、优选50至70％的硅原子共价连接到碳原子，并由此将其官能化。
而且，可以依据所希望获得的优先效果选择这种官能化的聚硅氧烷层的密度。特别是，优选密度为1.6至2.4、优选1.8至2.1的层，以便进一步提高对球核不受羟基化影响的保护，并保持它的发光性。对MRI或高热症应用来说，优选小于2的密度的涂覆。
这种官能化的聚硅氧烷层还使得可以通过至少一个生物配体和任意的其它有机分子或聚合物的共价键连接进行接枝。具体而言，除一个或多个生物配体或配体之外，还将10-100000个特别是选自若丹明或荧光素衍生物的发光有机分子接枝在涂层的表面上和/或内，这样可以使得进行时间分辨检测。对发光有机分子来说，激发态的持续时间是几个毫微秒，而对镧倍半氧化物的纳米粒子来说，是一个微秒级。
依据本发明的一个变型，通过共阶键将1-1000个、优选1-100个生物配体的分子接枝到官能化的聚硅氧烷层上。依据本发明的另一个变型，小于10％重量的纳米粒子包括接枝到中间层的两个以上的生物配体的分子。
生物配体指这样一种化合物，该化合物具有至少一个能够使其与目标生物靶分子反应的识别部位。接枝的生物配体例如是核苷酸、糖类、维生素、激素、维生素H、抗生蛋白链菌素或其他用作生物媒介的有机分子。
除了生物配体之外，也可以将发光分子或配合分子接枝到官能化的聚硅氧烷层上。也可以将有机磷酸盐、季胺类的极性或带电分子接枝到中间层上。另一种可能性是将分子量小于5000g/mol、优选小于1000的水溶性聚合物分子例如聚乙二醇或葡聚糖接枝到聚硅氧烷层。
本发明还涉及一种制备如上所定义的、任选为胶状悬浮形式的杂交纳米粒子的方法。这种方法包括不同的步骤，如下详述。
该方法的第一步在于获得大量平均直径在2和9nm之间的结晶纳米球，该结晶纳米球具有低的多分散性并且容易再分散，即不形成团块。本发明的方法包括直接制备等分散的(isodispersed)胶态分散体。等分散的分散体指这样的分散体，即在光子相关光谱法中测量的尺寸分布非常接近，即例如90％以上的分散体粒子的直径为平均直径d50值±20％。直径分布越窄，系统变得越等分散或单分散。
利用多元醇方法制备这些纳米粒子。这种《多元醇(polyol)》方法包括在将多元醇的温度升至130℃到250℃时固体的直接沉淀。首先将金属前体(precursor)溶解在多元醇(例如二甘醇)中，在任选添加试剂后，将该溶液升至150℃以上。多元醇用作稳定剂，其限制了粒子的生长并且使粉末凝聚成团降为最小。
采用这种方法，已经合成了不同的亚微氧化粉末，值得一提的是CeO2、掺杂Ce3+的LaPO4(C.Feldmann，Advanced Materials，13(2003)101)和Eu3+掺杂的Y2O3(C.Feldmann，J.Merikhi，Journal of Materials Science，38(2003)1731-1735)。本发明中所采用的纳米球例如是通过Journal of luminescence，102-103(2003)445-450和Journal of Colloid and Interface Science，doi：10.1016/j.jcis.2003.10.031中描述的《多元醇》方法获得的。不受所列的限制，所采用的前体可以是氯化物、硝酸盐或醋酸盐。因此可以获得更高的g/l浓度。有利地，获得每升溶剂包含100mg和100g之间的纳米球的胶状悬浮液。
例如在低于200℃的温度、在极性溶剂如二甘醇(DEG)型的多元醇中进行倍半氧化物纳米球的合成，该溶剂的强溶剂化能力使得能够控制粒子的尺寸。将形成纳米球的不同的金属倍半氧化物例如稀土元素的氯化物RECl3(RE:Gd，Y)和镧系氯化物Ln’Cl3(Ln’:Eu、Tb、Er、Nd、Yb、Tm)或锕系元素硝酸盐(U)分散在二甘醇中。金属离子的总浓度优选为0.1-0.5M，并且稀土元素氯化物RECl3(RE:Gd，Y)和镧系氯化物Ln’Cl3(Ln’:Eu、Tb、Er、Nd、Yb、Tm)或锕系元素硝酸盐(U)的相对量取决于所希望的掺杂水平或所希望的混合类型。搅拌之后，优选添加1ml的氢氧化钠水溶液，并且在硅油浴中将混合物加热到140℃一个小时。当存在的化合物完全溶解时，该溶液在强烈搅拌下升温到180℃四个小时。得到分散在DEG中的纳米球的胶状溶液，其可以稳定几个月。不管掺杂剂(稀土元素或锕系元素)的量是多少，纳米尺寸的粒子均呈单相固态溶液形式。可以调整离子的浓度和水解的速率(所添加的水量与金属离子量的比值)从而控制尺寸。已发现OH-的浓度必须尽可能池低，以便防止形成氢氧化物沉淀。相对于稀土元素阳离子的摩尔数，添加一个相当量的NaOH似乎是一种很好的折衷方法；低的量会导致低产量(小于30％的镧系元素氧化物)，而高的量则会形成氢氧化物的不可逆沉淀。
因此，在特别优选的方式中，在方法的步骤a)中，在形成所需的倍半氧化物所需的最少量的水和任选的碱例如0.01和1mol/l溶剂的NaOH存在下，通过在极性溶剂中、特别是在乙二醇型的多元醇中溶解稀土元素和/或锕系元素前体，然后加热到130-250℃，来制备每升溶剂包含100mg-100g的纳米球的胶状悬浮液。
通过去除残留的可溶盐和部分多元醇(例如通过减压蒸发或通过改变溶剂，例如通过色层分离或透析)并控制溶液中水存在的量，可以任选提纯和/或浓缩所获得的纳米球的胶状悬浮液。
在本发明中，将Ln2O3的纳米球涂覆使其变强的分子层，维持与倍半氧化物的表面和与有机分子(荧光剂、分散剂......)和/或与其连接的生物配体之间的相互作用。而且，当将纳米球分散在水介质中时，该层保证了对纳米球的保护，这是由于通常观察到纳米球溶解，和/或当将这些纳米球分散在水中时发光强度降低。由于这个原因，使用网状组织形成剂而非调节剂(其使得在纳米球的周围不能形成交联层)。网状组织形成剂是化合物，其除了与稀土元素的倍半氧化物的表面形成结合之外，还能够在它们之间反应(通过在最靠近的相邻元素之间的缩合反应)，以便形成捕获纳米球的真正的网状组织。这些化合物通常是式为RxSI(OR’)y的烷氧基硅烷，其中y＝2，3；x＝4-y，选择R以便固定活性有机分子。为了获得密集的、坚固的网状组织，将RxSI(OR’)y与交联试剂例如原硅酸四乙酯(TEOS)混和。聚硅氧烷层也称为涂层或环，可以特别通过选自氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)、缩水甘油基氧基丙基三乙氧基甲硅烷(GPTES)、巯基丙基三乙氧基甲硅烷(MPTES)和异氰酸根丙基三乙氧基甲硅烷(IPTES)的三烷氧基硅烷的混合物的水解缩合获得，在如前获得的Ln2O3倍半氧化物的纳米球中的存在下使用交联试剂如TEOS。通过控制所添加的交联试剂、最常见为TEOS的量来控制Si/C的比值。所添加的烷氧基硅烷/交联试剂的量取决于分散在溶液中的纳米球的数量，它们的大小(因此为它们的表面积)和吸收分子所占据的面积。优选存在三甲胺类型的碱，优选在0.01和0.1mol/l之间。三烷氧基硅烷的使用使得可以将活性基团添加到涂层上，这使得活性分子(生物配体、荧光团)可以粘附。因此，为了进行这种偶合，聚硅氧烷层中一些烷氧基硅烷类型的前体应当携带活性基团例如羧基、胺基、醛基或环氧基。这些前体的水解缩合得到聚硅氧烷的官能化层，其能够与待接枝的生物配体或任何其它有机分子或聚合物反应。TEOS确保了形成的聚硅氧烷的交联，其中单独结合到氧原子(交联节点)即仅从TEOS衍生的硅原子的数量为5-75％，优选30-50％。
通常通过对乙醇、水或等体积乙醇/水的混合物透析从胶状溶液提取未吸收的分子和次级产物。
在本发明不受限制的前提下，可以详述一种形成聚硅氧烷涂层的方法，优选以四个阶段实施。第一阶段包括添加分散在包含nAPTES(1)mol的APTES的DEG溶液中5mlLn2O3的纳米球，使得4＜100×nAPTES(1)/(nAPTES(1)+nAPTES(2)+nTEOS)＜16。在搅拌至少20分钟后，添加3nAPTES(1)mol的水，将该水稀释在包含0.1M的三乙胺(Et3N)的DEG中(第二阶段)。在添加到前面的nAPTES(2)＝5nAPTES(1)mol的APTES和nTEOSmol的TEOS的混合物之前，将溶液搅拌一个小时(第三阶段)，使得5＜100×nTEOS/(nApTES(1)+nAPTES(2)+nTEOS)＜75。最后，20分钟后，将在包含0.1M的三乙胺(Et3N)的DEG中稀释的(15nAPTES(21+4nTEOS)mol的水添加到混合物中。然后在20℃＜T＜40℃将该混合物搅拌48小时。
除了生物配体之外，官能化的聚硅氧烷涂层也可以实现特别是衍生自荧光素和若丹明的发光有机分子的共价键接枝。可以通过至少两种不同的方式实施这些荧光团的官能化。第一种方式包括在水解反应之前通过这些荧光团修饰烷氧基硅烷的分子。例如，通过APTES的胺官能团和FTIC的异硫氰酸酯官能团之间的反应预先将在上述第一或第二阶段中添加的5至30％的烷氧基硅烷分子、特别是APTES偶合到荧光素异硫氰酸酯(FTIC)上。然后将这样修饰的聚硅氧烷前体添加到烷氧基硅烷和TEOS的混合物中，以便形成涂层环。第二种方法包括在形成聚硅氧烷层之后，通过由荧光团携带的活性基团和那些存在于聚硅氧烷层中的活性基团之间的缩合接枝该荧光团。
必须能够得到用于探针/目标偶合反应的生物配体，并且由此可以通过与存在的活性基团之间的常规偶合用化学方法接枝到聚硅氧烷层上，任选在次之前进行活化步骤。确保偶合的反应是已知的，并且例如在《Bioconjugate Techniques(生物连接技术)》，G.T.Hermanson，Academic Press，1996或《Fluorescent andLuminescent Probes for Biological Activity.A Practical Guide to Technology forQuantitative Real-Time Analysis(用于生物活性的荧光和发光探针，定量实时分析技术的应用指南)》，第2版，W.T.Mason ed.，Academic Press，1999中所描述的。例如，通过添加生物配体的水溶液实施偶合，其量至少大于涂层上接枝点(相应于活性基团)的数量。如果用胺基官能化聚硅氧烷层，那么可以接枝至少携带一种-COOH官能团的生物分子。但是，必须预先用EDC和MHS的混合物活化生物分子的-COOH官能团。
在接枝生物配体之后，通过透析或柱色谱法去除额外的次级产物。仅当纳米粒子用荧光素的衍生物官能化时才使用后一种技术。为了防止由于重复的接枝和提纯步骤导致的变性，优选最后实施生物配体的接枝。
本发明的纳米粒子具有不同的用途。特别是可以将它们用于检测生物分子(生物芯片)、生物底物(MRI成像)的靶向、细胞或实体瘤的治疗性破坏(过高热、中子俘获)。
下面给出的实施例仅仅用于说明本发明而非用于限制本发明。
实施例1：
通过在20ml体积的二甘醇中溶解50g.l-1量的钆和铽氯化物制务掺杂5％Tb3的Gd2O3的胶体。通过HRTEM确定并通过激光粒子尺寸测量方法测量的最终粒子的尺寸是3.5nm。在二甘醇中加热(40℃)和搅拌的情况下，将胶体透析24小时。二甘醇本身的体积/透析的胶体的体积比为20。
通过溶液-凝胶(sol-gel)方法在这些粒子周围形成厚度为5.0nm的官能化聚硅氧烷层。在包含5.0ml透析的胶体(4.53.1019粒子.l-1)的溶液中，将下面的物质溶解：28.4g.l-1的氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTS)、17.6g.l-1的原硅酸四乙酯(TEOS)和13.2ml的每升0.1M三乙胺的水溶液。
在40℃的油浴中在搅拌下实施该反应。它包括几个步骤：
在t＝0h，添加相应于APTS总量的16％的m1
在t＝0.33h，通过添加10％的总水体积水解APTS
在t＝1.33h，添加相应于剩余的APTS的m2和TEOS总量
在t＝2.33h，添加90％的剩余水体积
在t＝50.33h，结束合成。
实施例2：
在与实施例1相同的条件下制备掺杂5％Tb3+的Gd2O3的胶体。
通过溶液-凝胶方法在这些粒子的周围形成厚度为8.0nm的官能化的聚硅氧烷层。在包含5.0ml透析的胶体(4.53.1019粒子.l-1)的溶液中，将下面的物质溶解：86.4g.l-1的APTS、54.2g.l-1的TEOS和40ml的每升0.1M三乙胺的水溶液。
在与实施例1相同的条件下通过溶液-凝胶方法实施涂层反应。
实施例3：
在与实施例1相同的条件下制备掺杂5％Tb3+的Gd2O3的胶体，相应于3.5nm的尺寸。通过将适当量的钆和铽氯化物添加到预先获得的胶体中获得5.7nm尺寸的并且具有相同组成的粒子。
通过溶液-凝胶方法在这些粒子周围形成8nm厚的官能化的聚硅氧烷层。在包含5.0ml透析的胶体(5.66.1018粒子.l-1)的溶液中，将下面的物质溶解：58.1g.l-1的APTS、36.4g.l-1的TEOS和28.4ml的每升0.1M三乙胺的水溶液。
在与实施例1相同的条件下通过溶液-凝胶方法实施涂层反应。
实施例4：
在与实施例3相同的条件下制备掺杂5％Tb3+的Gd2O3的胶体，相应于5.7nm的尺寸。通过将适当量的钆和铽氯化物添加到预先获得的胶体中获得具有8nm尺寸和相同组成的粒子。
通过溶液-凝胶方法在这些粒子周围形成3.5nm厚的官能化的聚硅氧烷层。在包含5.0ml透析的胶体(5.65.1018粒子.l-1)的溶液中，将下面的物质溶解：20.6g.l-1的APTS、13.0g.l-1的TEOS和10ml的每升0.1M三乙胺的水溶液。
在与实施例1相同的条件下通过溶液-凝胶方法实施涂层反应。
实施例5：
在与实施例1相同的条件下制备掺杂5％Tb3+的Gd2O3的胶体。
通过溶液-凝胶方法在这些粒子周围形成5.0nm厚的官能化的聚硅氧烷层。在包含2.5ml透析的胶体(4.53.1019粒子.l-1)和2.5ml自身的二甘醇的溶液中，将下面的物质溶解：28.4g.l-1的APTS、17.6g.l-1的TEOS和13.2ml的每升0.1M三乙胺的水溶液13.2ml。
在与实施例1相同的条件下通过溶液-凝胶方法实施涂层反应。
实施例6：
在与实施例1相同的条件下制备掺杂5％Tb3+的Gd2O3的胶体。
通过溶液-凝胶方法在这些粒子周围形成8nm厚的官能化的聚硅氧烷层。在包含2.5ml透析的胶体(2.26.1019粒子.l-1)和2.5ml自身的二甘醇的溶液中，将下面的物质溶解：9.4g.l-1的APTS、6.4g.l-1的TEOS和4.4ml的每升0.1M三乙胺的水溶液。
在添加质量为m2的APTS之前的六个小时，后者在磁力搅拌下与1.4g.l-1的荧光素异硫氰酸酯(荧光分子)混和。随后在与实施例1相同的条件下实施涂层反应，但是将质量为m2的APTS与FTIC混合。
实施例7：低聚核苷酸的接枝
将以-COOH官能团结尾的d(T)22低聚核苷酸的100μM溶液添加到0.2MEDC和0.2M NHS的水溶液中。搅拌一个小时后，将500μl涂有官能化的聚硅氧烷层的氧化钆的纳米粒子的水溶液(依据实施例1制备并且通过透析提纯)和100μl的缓冲碳酸盐溶液(0.1M；pH11)添加到包含低聚核苷酸链的溶液中。搅拌两个小时后，该溶液发生胶凝。在通过薄膜过滤后，将凝胶再分散到200μl milli-Q水中。
实施例8
通过在20ml体积的二甘醇中溶解50g.l-1的氯化钆和硝酸铀制备掺杂1％铀的Gd2O3的胶体。通过HRTEM确定并且通过激光粒子尺寸测量方法测量的最终纳米球的尺寸是3.5nm。在二甘醇中加热(40℃)和搅拌的情况下，将胶体透析24小时。自身的二甘醇的体积/透析的胶体的体积比为20。
通过溶液-凝胶方法在这些纳米球周围形成5.0nm厚的官能化的聚硅氧烷层。在包含5.0ml透析的胶体(4.53.1019粒子.l-1)的溶液中，将下面的物质溶解：28.4g.l-1氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTS)、17.6g.l-1原硅酸四乙酯(TEOS)和13.2ml的每升0.1M三乙胺的水溶液。
在40℃的油浴中在搅拌下实施该反应。它包括几个步骤：
在t＝0h，添加相应于16％的APTS总量的m1
在t＝0.33h，通过添加10％的总水体积水解APTS
在t＝1.33h，添加相应于剩余的APTS的m2和TEOS总量
在t＝2.33h，添加90％的剩余水体积
在t＝50.33h，结束合成。
实施例9
通过在50ml体积的二甘醇(2.260g的GdCl3，6H2O，0.1273g的EuCl3，6H2O和0.1250g的TbCl3，6H2O)中溶解50g.l-1的氯化钆、氯化铽和氯化铕制备掺杂5％摩尔Tb3+和5％摩尔Eu3+的Gd2O3的胶体。在70℃添加3ml的2N NaOH的水溶液后，加热到140℃一个小时，然后在180℃四个小时，通过HRTEM确定并通过激光粒子尺寸测量方法测量的最终粒子的尺寸是3.5nm。在二甘醇中加热(40℃)和搅拌的情况下，将胶体透析24小时。自身的二甘醇的体积/透析的胶体的体积比为20。
在与实施例1相同的条件下通过溶液-凝胶方法实施涂层反应。
为了测试时间分辨检测的可能性(以及便于处理这些纳米粒子)，用有机染料(荧光素)官能化10％的氨丙基三烷氧基硅烷(附图7)。而且，其存在有利于通过色谱法提纯杂交纳米粒子，这是由于其进展可以容易地用目测观测。通过UV可见分光光度法和光子相关光谱法分析收集的组分验证了目测结果，并且可以对包含杂交纳米粒子的组分(附图7中的2和3)进行鉴定。使用填充硅胶的色谱柱进行色谱。将待提纯的样品体积固定在2.5ml，并且通过用乙醇或等体积的水-乙醇混合物缓冲的水溶液进行洗脱。可以将掺杂有Tb和涂有聚硅氧烷层的Gd2O3的纳米球用作检测生物配体(特别是低聚核苷酸)的标记物，其中10％的胺官能团结合到荧光素衍生物上。由于铽和荧光素的发光特性，所以当用探针分子官能化时，这些纳米粒子能够选择性标记生物分子，这是由于与在纳米粒子上接枝的探针之间的特异性相互作用所致，并因此可以用于检测。在这种情况下，通过将活化的-COOH与存在于聚硅氧烷网状组织中的胺官能团之一进行缩合可以将由羧酸官能团修饰的低聚核苷酸接枝到纳米粒子上，如果通过互补的低聚核苷酸(杂交)在特定点将其覆盖的话，那么这使得纳米粒子可以固定到固体载体上。在电磁激发后，荧光素发出使载体上固定点能够被识别的光信号，在该载体上固定有纳米粒子(附图8)。如果已知载体上低聚核苷酸的序列，那么可以根据支配低聚核苷酸链的杂交的碱基互补原则，推导出接枝到纳米粒子上的低聚核苷酸的序列。在荧光素被激光辐射破坏(detruction)之后，观察到Tb3+离子的发光(附图9)。涂覆倍半氧化物纳米球的官能化聚硅氧烷的网状组织与活性分子的接枝并行，使得倍半氧化物核中的掺杂剂的发光信号得以放大。对其倍半氧化物核是相同的相同数量的纳米粒子来说，当Ln2O3纳米球涂有聚硅氧烷层时，Tb3+离子的发光度与不涂覆的纳米球相比要大得多(附图10-12)。此外，聚硅氧烷层确保了对稀盐酸水溶液的足够的保护作用。由两个样品记录的光谱表明，涂有官能化的聚硅氧烷的纳米球对水的存在是不灵敏的(与不涂覆的纳米球不同)(附图13)，所述两个样品包含相同的等量纳米粒子，但是一个样品是分散在乙醇中，而另一个在0.2M的HCl中。纳米球在水介质中的稳定性和其发光特性的稳定性在生物标记光学中是必需的。这些结果证实本发明的纳米粒子、特别是钆倍半氧化物纳米球具有标记和检测生物配体的潜力，生物配体的存在可以通过下列方面证明：
-接枝到涂覆Ln2O3纳米球的聚硅氧烷层上的有机染料分子的荧光性。
-掺入纳米球中的掺杂剂发出的电磁辐射，并且其类型可以在同一纳米球之内发生改变(多次掺杂(multidoping))。
-测定包含钆倍半氧化物的纳米球的磁性、特别是顺磁性。

Claims (30)

1、杂交纳米粒子，该杂交纳米粒子包括：
-纳米球，平均直径为2至9nm，其至少90％的重量由Ln2O3组成，其中Ln代表稀土元素，任选掺杂有稀土元素或锕族元素、稀土元素的混合物或稀土元素和锕族元素的混合物，其中至少50％的金属离子是稀土元素离子，
-所述纳米球的涂层，主要由官能化的聚硅氧烷组成，平均厚度为0.5至10nm范围内，优选大于2nm且不大于10nm，和
-至少一个通过共价键接枝到聚硅氧烷涂层的生物配体。
2、如权利要求1中所述的纳米粒子，其特征在于通过氧桥将所述涂层中5至75％、优选30至50％的硅原子结合到四个其它的硅原子上。
3、如权利要求1或2所述的纳米粒子，其特征在于所述涂层的密度为1.6至2.4、优选1.8至2.1。
4、如权利要求1或2所述的纳米粒子，其特征在于所述涂层的密度小于2。
5、如权利要求1至4中任一项所述的纳米粒子，其特征在于通过共价键将10和100000个发光有机分子接枝到所述涂层。
6、如权利要求5所述的纳米粒子，其特征在于所述荧光有机分子选自若丹明或荧光素的衍生物。
7、如权利要求1至6中任一项所述的纳米粒子，其特征在于至少80％重量的纳米球由任选掺杂的稀土元素倍半氧化物组成。
8、如权利要求7所述的纳米粒子，其特征在于至少80％重量、优选至少90％重量的纳米球由Gd2O3组成。
9、如权利要求7所述的纳米粒子，其特征在于至少80％重量、优选至少90％重量的纳米球由Y2O3组成。
10、如权利要求1至9中任一项所述的纳米粒子，其特征在于所述纳米球周镧系元素Eu、Tb、Er、Nd、Yb、Tm掺杂，所述元素占金属阳离子的0.1至25％。
11、如权利要求10所述的纳米粒子，其特征在于所述纳米球用镧系元素Nd或Yb掺杂。
12、如权利要求10所述的纳米粒子，其特征在于所述纳米球用镧系元素Er掺杂。
13、如权利要求1至9中任一项所述的纳米粒子，其特征在于所述纳米球用至少两种不同的镧系元素掺杂，所述元素占金属阳离子的0.1至25％，并且所述镧系元素的至少一个选自Eu和Tb。
14、如权利要求1至7中任一项所述的纳米粒子，其特征在于10％以上的纳米球的金属阳离子是选自Gd、Nd的具有磁性的镧系元素阳离子。
15、如权利要求1至7中任一项所述的纳米粒子，其特征在于50％以上的纳米球的金属阳离子是选自Gd、Nd的具有磁性的镧系元素阳离子。
16、如权利要求1至7中任一项所述的纳米粒子，其特征在于0.01％至50％、优选0.1％至10％的纳米球的金属阳离子是选自Ac、Th、Pa、Np、U、Np、Pu的铀系元素阳离子。
17、如权利要求1至16中任一项所述的纳米粒子，其特征在于至少1％、优选至少5％的纳米球的金属阳离子具有广泛的中子捕获能力，选自例如同位素157Gd和235U。
18、如权利要求1至17中任一项所述的纳米粒子，其特征在于通过共价键将1至1000、优选1至100个生物配体分子接枝到涂层上。
19、如权利要求1至17中任一项所述的纳米粒子，其特征在于小于10％重量的纳米粒子包含两个以上接枝到涂层上的生物配体分子。
20、如权利要求1至19中任一项所述的纳米粒子，其特征在于接枝的一个生物配体或多个生物配体衍生自核苷酸、糖类、维生素、激素、维生素H、抗生蛋白链菌素或其他用作生物媒介的有机分子。
21、如权利要求1至20中任一项所述的纳米粒子，其特征在于将除所述生物配体之外的发光分子或配位分子接枝到涂层上。
22、如权利要求1至21中任一项所述的纳米粒子，其特征在于将有机磷酸盐、季胺类型的极化或带电分子接枝到涂层上。
23、如权利要求1至21中任一项所述的纳米粒子，其特征在于将分子量小于5000g/mol、优选小于1000的水溶性聚合物分子例如聚乙二醇或葡聚糖接枝到涂层上。
24、如权利要求1至23中任一项所述的杂交纳米粒子的胶状悬浮液。
25、制备如权利要求1至23中任一项所述的杂交纳米粒子的方法，任选为如权利要求24所述的胶状悬浮液的形式，其特征在于它包括以下步骤：
a)制备钠米球的胶状悬浮液，所述纳米球的平均直径为2至9nm，至少90wt％由Ln2O3组成，其中Ln代表稀土元素，任选掺杂有稀土元素或锕族元素、稀土元素的混合物或稀土元素和锕族元素的混合物，其中至少50％的金属离子是稀土元素离子，
b)将所需量的烷氧基硅烷和交联试剂的混合物添加到胶状悬浮液以在所述粒子的表面上形成涂层，所述涂层主要由用至少一种活性基团官能化的聚硅氧烷组成，其平均厚度为0.5至10nm、优选大于2nm且不大于10nm，和
c)用化学方法通过与存在于涂层表面上的活性基团偶合将至少一种生物配体接枝到所述涂层上，
d)任选分离并干燥所获得的杂交纳米粒子。
26、如权利要求25所述的制备方法，其特征在于在步骤a)中，在形成所需的倍半氧化物所需最少量的水和任选浓度为0.01-1mol/l溶剂的碱例如NaOH存在下通过在极性溶剂、特别是乙二醇型的多元醇中溶解稀土元素和/或锕系元素的前体制备每升溶剂中包含100mg-100g纳米球的胶状悬浮液，然后加热到130-250℃。
27、如权利要求26所述的方法，其特征在于稀土元素或锕系元素的前体是氯化物、醋酸盐或硝酸盐类。
28、如权利要求25至27中任一项所述的方法，其特征在于在步骤b)中，将原硅酸四乙酯(TEOS)用作交联试剂。
29、如权利要求25至28中任一项所述的方法，其特征在于将所用的烷氧基硅烷的部分分子共价结合到发光分子。
30、如权利要求25至29中任一项所述的方法，其特征在于在步骤c)之前加上通过与存在于涂覆表面上的活性基团的偶合、接枝发光分子和/或配位分子和/或极化或带电分子和/或水溶性聚合物分子的步骤。
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