CN1962665B - 大麻药中抗肿瘤活性组分大麻药黄酮a的提取方法 - Google Patents
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Abstract
药用植物大麻药中具有明显抗肿瘤活性化合物大麻药黄酮A(dolichninA)的提取方法。包括(1)药材提取：乙醇热提取2～3次，合并提取液，减压浓缩至浸膏；(2)粗提物制备：大孔树脂吸附，乙醇洗脱，合并近似组分，蒸出乙醇(3)所得粗提物的高速逆流色谱分离纯化，由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水构成固定相、流动相的溶剂体系，色谱仪柱中充满固定相，柱子转动后将流动相泵入柱内，进样。根据检测谱图接收目标成份，经一步洗脱得到高纯度的产物。工艺合理有效，特别、简便、快速。同时，经过分析测试，确定其化学结构式，证明是从未见过报道的全新化合物。另外，为抗肿瘤药物提供一个具有良好应用前景的新品种。
Description
技术领域
本发明属于物质的分离技术领域，涉及包含以吸附剂处理液体的分离方法，具体为以树脂为吸附剂、以移动溶剂为吸附剂取代被置换的液体的方法来分离固体物中的有效成分。同时，还涉及抗肿瘤活性药物。
背景技术
癌症是严重危害人民生命健康的重大疾病，世界上每年有600多万人死于恶性肿瘤。目前临床上使用的治疗药物主要是传统的细胞毒类化学合成抗肿瘤药物，虽然部分药物抗肿瘤作用明显，但毒副作用大，选择性较差，容易产生耐药性。中医药学是一门积淀中华民族几千年来防病治病的实践经验结晶，具有鲜明的理论体系，又能体现辨证论治和个体化治疗时代特征的生命科学。中医能辨西医不明之症，中药能治西药难治、不治之症。因此抗肿瘤中药的研究越来越收到国内外医药界的重视和青睐。
大麻药为豆科植物镰果扁豆[Dolichos tenuicaulis(Baker)Craibs]的根，分布于贵州和云南等地，具有消肿止痛、解毒排脓和抗肿瘤等功效。有关大麻药化学成分和药理活性的研究报道较少[田成国，等.中草药通讯，1977，(2)：8～12.黄厚聘，等.中国药理学报，1983，(4)：286～288.]，因此医药界急切希望得到该植物有效成分，并对其化学结构、药理、药性和在抗肿瘤的作用有所了解，然而至今未见提取其中有效成分和记载其化学结构的报道。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种从民族药用植物大麻药中提取、分离、纯化其具有明显抗肿瘤活性的组分的方法，分析、测试并确定其化学结构，并测定其抗肿瘤的活性。
本发明的实施方案包括：药材提取、粗提物制备及粗提物的分离纯化三道工序：工序(1)采用一定浓度的乙醇提取药材获取提取物，工序(2)采用大孔吸附树脂层析得到粗提物，工序(3)采用高速逆流色谱法对粗提物进行分离纯化，它包括配制构成固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进入制备好的粗提物样品，根据检测图谱接收目标组分。具体方法是：
1.药材提取
取大麻药适当粉碎后，用6～8倍量的75％～95％乙醇热提取2～3次，每次1.0～2.0h，合并提取液，减压浓缩至浸膏。粉碎的药材以粒径为0.5～20.0mm为宜。热提取时以回流状态下提取效果为好。
2.粗提物制备，
取一定量预处理好的弱极性大孔吸附树脂装到层析柱中，用水反复冲洗后将全方提取物浸膏(树脂与药材用量比为0.5～1∶1)，吸附完全后，用大量水充分洗去糖分和无机盐等杂质，再依次用3～5倍药材量的30％～50％乙醇洗脱，4～6倍药材量的75％～95％乙醇洗脱，接收相应的乙醇洗脱流份，以此为进一步分离纯化样品提供原料。其中最好使用3～4倍药材量40～50％乙醇和4～5倍药材量85～95％乙醇溶液洗脱，洗脱液分成若干份，将其中组分相近数份合并，减压蒸馏并回收乙醇后真空干燥得目标成分。大孔树脂以包括1300、D101或AB-8在
内的品种为好。在操作中对吸附完全后用大量水充分洗去糖分和无机盐等杂质的标志是洗脱水无色，用水量大约为药材量的6～7倍。实践中乙醇洗脱液接取时分成35～45等份，取中间第3～10份合并减压蒸除乙醇效果为好。
3.分离纯化
应用高速逆流色谱分离纯化，它包括步骤：配制构成固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进样，根据检测谱图接收目标成分，所用溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成，其用量比为1∶1.8～2.2∶1.8～2.2∶1。
4.分离物的纯度检测与结构鉴定
采用高效液相色谱法对分离所得组分进行纯度检测(峰面积归一化法)纯度大于98.0％，挥干溶剂后进行MS、1H NMR和13C NMR分析，根据所得数据进行结构确认。其化学结构为：
其化学名称为：(2S)-5，2′，6′-三羟基-3
，8-二异戊烯基-2
，2
-二甲基吡喃-[5，6
：6，7]-2 ″″′，4″″′-环己二烯-1′″″-酮-[2′″″，3′″″：3′，4′]-二氢黄酮。属于黄酮类化合物(以下简称大麻药黄酮A dolichnin A)。
5.所得化合物的抗肿瘤活性试验
采用MTT法考察了所得化合物体外对5种人肿瘤细胞株(BEL-7402、SGC-7901、MCF-7、HT-29和A498)的生长抑制作用。结果该化合物对所选5种人肿瘤细胞株的半数抑制浓度均小于4.5μg/ml。
同时也进行了该化合物对小鼠体内S180移植性肉瘤生长的抑制作用试验。
建立小鼠体内S180移植性肉瘤模型，腹腔注射该化合物，并与阳性对照药环磷酰胺对照，计算该化合物的抑瘤率，同时观察该化合物对小鼠的免疫系统和白细胞的影响。结果表明在腹腔注射给药10mg/kg时，该化合物的抑瘤率达到了61％以上。
本发明对从药用植物中提取、分离、纯化大麻药黄酮I的工艺合理有效，特别是采用高速逆流色谱对中药粗提物进行分离纯化简便、快速，同时也避免了样品损失。克服了传统制备方法操作繁琐、分离周期长等缺点，并具有制备量大、分离效率高、产品纯度好、简便易行等优点。同时，经过分析测试，确定其化学结构式，证明这是一个未见报道的新化合物。另外，也为抗肿瘤药物提供一个具有良好应用前景的新品种。
附图说明
图1为大孔吸附树脂层析物的半制备型高速逆流色谱(HSCCC)的色谱图(色谱峰I为大麻药黄酮A)
图2为大孔吸附树脂粗提物及分离部分的高效液相色谱(HPLC)的色谱图(图2A为粗提物的HPLC色谱图，图2B为制备流份纯度检测HPLC色谱图)
图3为化合物大麻药黄酮A的质谱和紫外图。
图4为大麻药黄酮A体内抗S180肉瘤试验各给药组肉瘤的病理切片
下面结合具体实施例及附图对本发明进一步说明。
具体实施方式
实施例1：
化合物大麻药黄酮A(dolichnin A)的提取和结构鉴定。其步骤为：
1.称取大麻药粗粉5.0kg，粒径0.8～20.0mm，用8倍量80％乙醇回流提取两次，每次1.5h，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏约2000ml。
2.称取4000g D101大孔吸附树脂，用95％乙醇浸泡过夜后，再用水浸泡过夜后加到层析柱上(10.0×120cm)，用大量水反复冲洗。将全方提取物加到树脂上端，打开活塞，流速为25ml/min，上样完成后，关闭活塞，静止吸附约1小时，接着用6倍药材量的水(30L)冲洗树脂至洗脱液几乎无色为止，接着用3倍药材量的40％乙醇(15L)洗脱，再用4倍药材量的85％乙醇(20L)洗脱，每1000ml为一接收流份，合并其中的5～9流份，减压回收乙醇后真空干燥，得浅黄色粉末，以此为进一步分离纯化用样品。
3.应用高速逆流色谱(深圳同田生化有限公司)分离纯化大孔吸附树脂所接收流份。
溶剂体系及用量体积比为正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶2∶2∶1，逆流色谱柱体积为300ml，上样量400mg，转速850rpm，上相为固定相，下相为流动相，流速1.8ml/min，固定相保留率58.5％，检测波长280nm，在此情况下记录的色谱图见图1。
具体的操作步骤是：按上述溶剂体积比配制溶剂体系，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，分取上下相，上相为固定相，下相为流动相。先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成份，结果分离得到1个部分，即流份“I”。
对该部分进行高效液相分析表明“I”为单一色谱峰，峰纯度为98.6％。
HPLC分析条件：色谱柱Lichrospher C18(150mm×4.6i.d.，5μm)，流动相为CH3CN∶H2O∶HAC＝60∶40∶2，流速1.0ml/min，检测波长280mn，在此条件下大孔吸附树脂层析物及HSCCC分离部分色谱图见图2。峰1为大麻药黄酮A。
结构鉴定：对分离得到的大麻药黄酮A在Varian INOVA-500型核磁共振仪和Varian MAT-212型质谱仪上，进行1H NMR、13C NMR和MS分析，所得数据如下。
白色粉末，mp213～214℃，[α]D 25-120(c.0.80，CH3OH)，UVλmax(nm，MeOH)：340，294，220nm(见图3)；ESI-MSm/z：583.2[M-H]-(见图3)。HR-ESI-MSm/z：583.2148(calcd.583.2142)，分子式为C36H40O74。13C NMR和1H NMR数据见下表1。
表1 所得化合物的13C NMR和1H NMR数据
| Position | δc | δH | Position | δc | δH |
| 2 | 71.3 | 5.81dd(14.0，4.0) | 3″ | 129.8 | - |
| 3 | 39.4 | 2.47dd(17.0，4.0)3.91dd(17.0，14.0) | 4″ | 18.5 | 1.57s |
| 4 | 198.1 | - | 5″ | 24.8 | 1.42s |
| 5 | 157.1 | 12.27brs | 2 |
77.6 | - |
| 6 | 103.5 | - | 3 | 139.1 | - |
| 7 | 159.4 | - | 4 | 112.5 | 6.15brs |
| 8 | 104.6 | - | 2 |
25.8 26.4 | 1.36s 1.38s |
| 9 | 157.2 | - | 1″″ | 28.2 | 3.17d(7.0) |
| 10 | 102.1 | - | 2″″ | 122.6 | 5.38brs |
| 1′ | 114.2 | - | 3″″ | 130.2 | - |
| 2′ | 159.4 | - | 4″″ | 18.8 | 1.50s |
| 3′ | 107.5 | - | 5″″ | 25.6 | 1.64s |
| 4′ | 138.7 | - | 1″″′ | 199.4 | - |
| 5′ | 104.3 | 6.87brs | 4″″′ | 119.3 | 6.11d(10.0) |
| 6′ | 160.5 | - | 5″″′ | 131.6 | 6.35d(10.0) |
| 1″ | 21.5 | 3.13d(8.0) | 6″″′ | 45.8 | - |
| 2″ | 122.8 | 5.14m | 6″″′-Me×2 | 21.4 23.7 | 1.41s 1.47s |
实施例2：
1.称取大麻药粗粉5.0kg，粒径0.5～20.0mm，用6倍量90％乙醇回流提取两次，每次2h，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏约2000ml。
2.称取5000g AB-8大孔吸附树脂，用95％乙醇浸泡过夜后，再用水浸泡过夜后加到层析柱上(10.0×120cm)，用大量水反复冲洗。将全方提取物加到树脂上端，打开活塞，流速为25ml/min，上样完成后，关闭活塞，静止吸附约1小时，接着用6倍药材量的水(30L)冲洗树脂至洗脱液几乎无色为止，接着用4倍药材量的50％乙醇(20L)洗脱，再用5倍药材量的95％乙醇(25L)洗脱，每2500ml为一接收流份，合并其中的3～7流份，减压回收乙醇后真空干燥，得浅黄色粉末，以此为进一步分离纯化用样品。
3.应用高速逆流色谱(深圳同田生化有限公司)分离纯化大孔吸附树脂所接收流份。
溶剂体系及用量体积比为正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶2.2∶2.2∶1，逆流色谱柱体积为300ml，上样量400mg，转速900rpm，上相为固定相，下相为流动相，流速1.6ml/min，固定相保留率61.3％，检测波长280nm。
具体的操作步骤同实施例1，对分离所得流份进行HPLC分析和结构分析，分析结果均同实施例1。
实施例3：
化合物大麻药黄酮A的体内、体外抗肿瘤实验
选择5种人肿瘤细胞株，BEL-7402、SGC-7901、MCF-7、HT-29和A498在含10％小牛血清的RPMI-1640培养液、37℃、5％CO2培养箱生长至细胞旺盛，经0.25％胰酶加0.02％EDTA消化，制成细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔微量培养板中(细胞浓度为5×105个/ml)，给药组分别加入不同浓度的化合物，对照组加入相应的溶剂，给药后培养72小时，按MTT法用酶标仪在550nm波长处测定吸光度(A)值，计算化合物的抑制率，由抑制率和样品浓度绘制相应的抑制曲线，再计算出半数抑制浓度(IC50)。该化合物对各肿瘤细胞株的IC50值见下表2。
表2大麻药黄酮A对5种人肿瘤细胞株的IC50值
取本室自己传代呈对数生长期的S180小鼠腹水，用生理盐水稀释成2×107/ml，取0.2ml接种于小鼠右腋皮下。小鼠接种后第二天灌胃给药，空白组给予生理盐水0.2ml，阳性对照组给腹腔注射CTX0.2ml(20mg/kg)，各治疗组分别给予化合物化合物大麻药黄酮A2.5mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg注射用油溶解后腹腔注射给药)，连续10天，于次日处死。小鼠处死前眼眶取血，并作白细胞(WBC)计数，之后行脱臼处死小鼠。
剥取肉瘤组织同时取小鼠脾脏和胸腺，称重后按照下式计算抑瘤率，并计算脾指数和胸腺指数。小鼠服用CTX后，被毛疏松，精神较差，饮水饮食减少，与对照组相比体重增加缓慢，但对肿瘤的抑瘤作用十分突出，抑瘤率高于61％。腹腔注射该化合物后的小鼠饮食良好，行动自如，体重与模型组相比无显著性差异，肿瘤生成时间延后，瘤块生长缓慢。所得结果表明本工艺制备得到的化合物具有很强的抑制小鼠体内S180肉瘤生长的作用，与对照组相比有显著性差异(P＜0.01)。同时，该化合物与CTX配伍给药后，能明显见降低小鼠脾指数的升高和胸腺指数的降低，高剂量时的作用尤为显著(P＜0.01)。白细胞计数表明该制备物能明显升高由CTX所造成的小鼠白细胞降低(P＜0.01)。
同时，我们也对小鼠S180肉瘤进行了常规石蜡切片和显微分析，如图4所示。由图可知模型组肿瘤细胞生长旺盛，各给药组肿瘤细胞都有不同程度的死亡，尤其是CTX和给药高剂量组，肿瘤细胞死亡比例较大，病理切片表明CTX和该化合物都能杀死一定量的肿瘤细胞，从而抑制肉瘤的生长，与上述实验所得数据一致，具体见表3、4和5。
表3大麻药黄酮A对S180肉瘤的抑制作用(mean±S)
注：与模型组相比ΔP＜0.05；与模型组相比ΔΔP＜0.01；与CTX组相比#P＜0.05
表4大麻药黄酮A与CTX配伍对移植性小鼠S180肉瘤生长的抑制作用(mean±S)
| 组别 | 剂量 | 动物数(只) | 体重(g) | 肉瘤重(g) | 抑瘤率(％) |
| 模型组 | NS0.2ml/只 | 11 | 32.4±3.1 | 2.14±0.53 | - |
| CTX | 10mg/kg | 10 | 26.1±2.2 | 1.29±0.32ΔΔ | 39.7 |
| 化合物 | 1.0mg/kg+10mg/kgCTX | 10 | 29.6±2.1 | 1.28±0.46Δ | 40.2 |
| 化合物 | 2.5mg/kg+10mg/kgCTX | 9 | 30.6±2.6 | 0.96±0.38ΔΔ | 55.1 |
| 化合物 | 5.0mg/kg+10mg/kgCTX | 10 | 31.5±2.2 | 0.67±0.29ΔΔ | 68.7 |
注：与模型组相比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
表5 大麻药黄酮A与CTX配伍对荷瘤小鼠脾指数、胸腺指数和白细胞数的影响(mean±S)
| 组别 | 剂量 | 动物数(只) | 脾指数 | 胸腺指数 | WBC(×109/L) |
| 模型组 | NS0.2ml/只 | 11 | 9.7±1.6Δ | 3.0±0.6Δ | 9.6±0.9ΔΔ |
| CTX | 10mg/kg | 10 | 11.3±2.5 | 2.5±0.5 | 5.2±0.8 |
| 化合物 | 1.0mg/kg+10mg/kgCTX | 10 | 10.4±1.8 | 2.8±0.6 | 8.6±1.0ΔΔ |
| 化合物 | 2.5mg/kg+10mg/kgCTX | 9 | 9.3±1.6Δ | 3.0±0.4Δ | 9.8±0.9ΔΔ |
| 化合物 | 5.0mg/kg+10mg/kgCTX | 10 | 7.6±2.0Δ | 3.2±0.6Δ | 10.5±1.2ΔΔ |
注：与CTX组相比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
Claims (6)
1.大麻药中抗肿瘤活性组分大麻药黄酮A的提取方法，包括：药材提取、粗提物制备及分离纯化三步，其工艺为：
(1)采用6～8倍药材量75～95％乙醇热提取2～3次，每次1.0～2.0h，合并提取液，减压浓缩至浸膏；
(2)采用弱极性大孔吸附树脂为吸附剂进行柱层析，树脂与药材的重量比为0.5～1.1；将所得浸膏入大孔层析柱吸附，吸附后先用大量水充分洗去糖分和无机盐等杂质，再依次用3～5倍药材量30～50％乙醇和4～6倍药材量75～95％乙醇溶液洗脱，洗脱液分成若干份，将其中成分相近份合并，减压蒸馏并回收乙醇后真空干燥得目标成分；
(3)采用高速逆流色谱法对所得大孔吸附树脂层析物进行分离纯化，高速逆流色谱法中所用的两相溶剂体系及用量体积比为正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶1.8～2.2∶1.8～2.2∶1，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相，操作时先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成份。
2.根据权利要求1所述大麻药中抗肿瘤活性组分大麻药黄酮A的提取方法，其特征在于所述药材提取中的药材为经破碎粒径为0.5～20.0mm；所述热提取为回流状态下提取。
3.根据权利要求1所述大麻药中抗肿瘤活性组分大麻药黄酮A的提取方法，其特征在于所述粗提物制备中所使用大孔树脂为弱极性树脂1300、D101、AB-8中的一种。
4.根据权利要求1所述大麻药中抗肿瘤活性组分大麻药黄酮A的提取方法，其特征在于所述粗提物制备中吸附后先用大量水充分洗去糖分和无机盐等杂质为用6～7倍药材量的水冲洗树脂至洗脱液几乎无色为止。
5.根据权利要求1所述大麻药中抗肿瘤活性组分大麻药黄酮A的提取方法，其特征在于所述粗提物制备中乙醇洗脱和洗脱液的接取为使用3～4倍药材量40～50％乙醇和4～5倍药材量85～95％乙醇溶液洗脱，乙醇洗脱液接取时分成35～45等份，取中间第3～10份合并减压蒸除乙醇。
6.根据权利要求1所述大麻药中抗肿瘤活性组分大麻药黄酮A的提取方法，其特征在于所述分离纯化步骤中，溶剂体系及用量体积比为正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶2∶2∶1，逆流色谱柱体积为300ml，上样量400mg，转速850rpm，上相为固定相，下相为流动相，流速1.8ml/min，固定相保留率58.5％，检测波长280nm。
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