CN1637012A - Rna提取方法、rna提取试剂及生物材料的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从含有RNA的生物材料，以安全、迅速、简便的操作，提取高纯度RNA、进行分析的方法。本发明涉及，在含有游离状态RNA的生物材料上，添加确定浓度的促溶剂和确定浓度的有机溶剂、混合，使核酸结合性固相接触混合液，洗净结合有RNA的核酸结合性固相，从结合有RNA的核酸结合性固相洗提RNA。此外还涉及通过逆转录聚合酶链式反应(RT－PCR)等分析所得的RNA。

Description

RNA提取方法、RNA提取试剂及生物材料的分析方法

技术领域

本发明涉及从含有RNA的生物材料的RNA提取及含有RNA的生物材料的分析方法。

背景技术

DNA是担负生物体全部基因信息的物质，RNA是以DNA的基因信息为基础、扮演与生物体蛋白质合成有关的重要角色的物质。近年，通过DNA分析，多数生物种的基因序列信息已清楚。随后，通过RNA分析阐明基因功能的重要性不断增加，从生物材料分离RNA的操作变得不可或缺。RNA的分析方法主要有逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、RNA印迹(Northernblot)等。

在这些分析方法中，为得到良好的分析结果，需要使用高纯度的RNA。尤其在RT-PCR中，RNA和DNA混合存在的情况下，RNA分析难以进行。因此，在从生物材料提取RNA时，希望将RNA从混杂在细胞中的DNA、蛋白质、脂质、糖等中以高精度分离。

RNA的一般提取方法有AGPC法。AGPC法包括，(1)用硫氰酸胍溶液溶解生物材料，依次添加酸性缓冲液、苯酚溶液、氯仿溶液与混合，(2)离心分离，分离得到含RNA的水相、含变性蛋白质和不溶化DNA的有机溶剂相和水相中间层，(3)在含RNA的水相中添加乙醇或异丙醇，(4)离心分离不溶化RNA，选择性使之沉淀。

不使用苯酚、氯仿等剧毒物，无须进行乙醇沉淀或异丙醇沉淀等比较长时间操作的核酸提取方法包括，在促溶剂存在下，利用核酸同二氧化硅结合的性质，从琼脂糖凝胶中回收核酸的方法，以及使用促溶剂和二氧化硅微粒，从生物材料中提取核酸的方法。但是，这些方法，对RNA和DNA无选择性，提取的核酸是RNA和DNA的混合物。因此，RNA分析时，存在需要进行除去提取核酸所含DNA的操作的情况。主要通过DNA分解酶的作用去除DNA，接着，必要时需进行除去酶的操作。DNA去除操作中，通过DNA分解酶，一般需要1小时左右的作用时间。此外，在去除酶时，主要需要进行苯酚·氯仿提取、乙醇沉淀等复杂操作，也会发生RNA损失。

在促溶剂和有机溶剂存在下，利用RNA和二氧化硅结合的性质，存在有选择性提取RNA的方法(下述专利文献1)。此方法，通过在促溶剂中添加乙醇、异丙醇等极性有机溶剂，控制DNA/RNA和二氧化硅结合性质的差异，选择性地使RNA结合在二氧化硅上。但是，在此方法中，RNA的选择性也不充分，有必要进行除去提取的核酸中混杂的DNA的操作。

【专利文献1】特开2002-187897号公报

发明内容

本发明的目的是，提供从含有RNA的生物材料，通过安全、迅速、简单的操作，选择性地提取高纯度RNA、进行分析的方法。

发明者们在确定浓度的促溶剂和确定浓度的有机溶剂存在下，发现RNA以极高选择性和二氧化硅结合，确立了本发明的RNA选择性提取·分析方法。

本发明关于，混合确定浓度的促溶剂和确定浓度的有机溶剂，使核酸结合性固相接触混合液，洗净结合RNA的核酸结合性固相，从结合RNA的核酸结合性固相洗提RNA。此外，通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析得到的RNA。

通过本发明，可提取极高纯度的RNA。此外，由于提取产物几乎不含DNA，因此，即使不进行损失RNA的DNA去除操作，也可使用作为DNA中灵敏的RNA分析方法的RT-PCR等，可高精度地分析生物试料。

以下，参考附图，说明上述及本发明的其它独创特征和效果。此外，附图专供用于说明，并不限制权利范围。

含有RNA的生物材料可以以全血、血清、痰、尿等、生物组织、培养细胞、培养细菌等生物材料或含有原精制状态的RNA的物质等为对象。

生物材料的溶解可通过乳钵、超声波、微波、匀浆器等物理方法，或表面活性剂、蛋白变性剂等化学方法，或蛋白分解酶等生化方法，以及它们的组合方法等进行。

促溶剂优选例如碘化钠、碘化钾、硫氰酸钠、硫氰酸胍、盐酸胍等。

此外，有机溶剂可以是选自脂肪族醚、脂肪族酯、脂肪族酮之中的含有2到10个碳原子的化合物的一种或两种以上组成。

脂肪族醚优选使用乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、丙二醇二甲醚、丙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、四氢呋喃、以及1.4-二氧杂环己烷。

脂肪族酯优选丙二醇单甲醚乙酯、乳酸乙酯

脂肪族酮优选使用丙酮、羟基丙酮、甲基酮。

本发明的RNA选择性提取方法基于硅和RNA选择性结合效果，此效果可以在确定浓度的促溶剂和确定浓度的有机溶剂存在下取得。

使用促溶剂硫氰酸胍、有机溶剂二乙二醇二甲醚的情况下，混合液中硫氰酸胍浓度为1.0～4.0mol/L、二乙二醇二甲醚浓度为10～30％时，高纯度RNA的回收率良好。尤其是，在混合液中硫氰酸胍浓度为1.0～4.0mol/L、二乙二醇二甲醚浓度为15～25％的情况下，得到非常高回收率的高纯度RNA。

使用促溶剂硫氰酸胍、有机溶剂乳酸乙酯的情况下，混合液中硫氰酸胍浓度为1.0～4.0mol/L、乳酸乙酯浓度为20～40％时，高纯度RNA的回收率良好。尤其是，在混合液中硫氰酸胍浓度为1.5～2.5mol/L、乳酸乙酯浓度为15～25％的情况下，得到非常高回收率的高纯度RNA。

核酸结合性固相优选例如，玻璃粒、硅粒、玻璃纤维滤纸、石英棉、或它们的粉碎物、硅藻土等、含有氧化硅的物质。

混合液和核酸结合性固相的接触，通过在容器中搅拌、混合固相和混合液的方法，或使混合液通过已固定有固相的柱子的方法进行。固相和混合液接触之后，分离固相和混合液。

结合核酸的核酸结合性固相的洗净，例如，使清洗液接触固相后，从固相分离清洗液的方法进行。洗净液用于有效除去非特异性结合物而不洗提结合于固相的核酸，优选使用浓度至少为75％的乙醇。

从核酸结合性固相洗提核酸的方法，采用使洗提液接触固相、使结合于固相的核酸向洗提液溶出后，将洗提液从固相中分离。洗提液使用已去除RNA分解酶或已进行RNA分解酶失活处理的水、低盐浓度缓冲液等。此外，通过在加热下进行洗提，可提高洗提效率。

使核酸溶出的洗提液也可直接用于逆转录聚合酶链式反应。

附图说明

图1是实施例1及实施例2中使用的核酸捕捉用尖端；

图2是实施例1提取核酸的电泳结果；

图3是实施例2提取核酸的电泳结果；

图4是比较例提取核酸的电泳结果；

图5是RT-PCR产物的电泳结果。

具体实施方式

【实施例1】

本实施例，从使用促溶剂硫氰酸胍、有机溶剂二乙二醇二甲醚的培养细胞中提取RNA。

<提取RNA>

第1工序包括，在小鼠骨髓瘤(大日本制药公司产Sp/0-Ag14)培养细胞(106个左右)的平板上，添加细胞溶解液(硫氰酸胍4mol/l、10mmol/lMES-KOH、pH6.5)600μl，用匀浆器(マィクロテック·ニチオン公司产，HANDYMICRO HOMOGENIZER)破碎细胞，使细胞内的核酸成游离状态。

第2工序包括，在含有游离状态的核酸的细胞溶解液中，添加极性有机溶剂二乙二醇二甲醚水溶液(20、40、60、80、100容量％)600μl。此时，混合液中的硫氰酸胍浓度为2mol/l、二乙二醇二甲醚浓度为10、20、30、40、50容量％。

第3工序包括，如图1所示，通过在聚丙烯制尖端的顶端部分填充5mg核酸结合性固相石英棉(东芝ケミカル制B级)的核酸捕捉用尖端上，安装注射器(テルモ公司产25ml注射器)，吸引、排出含有游离状态的核酸、细胞溶解液和二乙二醇二甲醚的溶液，使核酸和固相接触、分离。

第4工序包括，通过核酸捕捉用尖端，吸引、排出清洗液(80容量％乙醇水溶液)1200μl，使固相和清洗液接触、分离，去除固相的非特异结合物。

第5工序包括，通过使用核酸捕捉用尖端，吸引、排出洗提液(DEPC处理水)100μl，使固相和洗提液接触、分离，得到含有精制核酸的洗提液。

<提取RNA的评价>

用1.25％琼脂糖凝胶(FMC公司产Reliant RNA Gel System)进行电泳、溴乙锭染色一部分洗提液后，用透射仪UV照射，照相，结果在图2中显示。例1、2显示使用二乙二醇二甲醚水溶液40容量％的情况，例3、4显示使用二乙二醇二甲醚水溶液60容量％的情况，例5、6显示使用二乙二醇二甲醚水溶液80容量％的情况，例7、8显示使用二乙二醇二甲醚水溶液100容量％的情况下的提取核酸。

通过电泳，将核酸按分子量分离，从上部开始显示基因组DNA、28SrRNA、18SrRNA、tRNA条带。如图2，显示使用二乙二醇二甲醚水溶液40容量％的时候，完全看不到基因组DNA，可以高回收率得到非常高纯度的RNA。另一方面，使用二乙二醇二甲醚水溶液60～100容量％的时候，显示在提取核酸中含有大量基因组DNA。此外，使用二乙二醇二甲醚水溶液20容量％的时候，几乎得不到提取核酸。

【实施例2】

本实施例中，从用促溶剂硫氰酸胍、有机溶剂乳酸乙酯的培养细胞提取RNA。

<提取RNA>

除第2工序外，其余以和实施例1同样的方法进行。以下，对第2工序描述。

第2工序是，在含有游离状态的核酸的细胞溶解液中，添加600μl极性有机溶剂乳酸乙酯水溶液(20、40、60、80、100容量％)。此时，混合液中的硫氰酸胍浓度为2mol/l，乳酸乙酯浓度为10、20、30、40、50容量％。

<提取RNA的评价>

采用和实施例1相同的方法，电泳结果在图3中显示。例1显示使用乳酸乙酯水溶液60容量％的情况、例2显示使用乳酸乙酯水溶液80容量％的情况、例3显示使用乳酸乙酯水溶液100容量％的情况下提取的核酸。

据此，乳酸乙酯水溶液60容量％的情况下，几乎看不到基因组DNA，可以高回收率得到非常高纯度的RNA。另一方面，乳酸乙酯水溶液80、100容量％的情况下，在提取的核酸中含有大量基因组DNA。此外，乳酸乙酯水溶液20、40容量％的情况下，几乎得不到提取的核酸。

比较例

利用RNA提取试剂盒(QIAGEN公司生产RNeasy Mini Kit)从使用促溶剂硫氰酸胍、有机溶剂乙醇的培养细胞中提取RNA。此方法基于上述专利文献1中记载的方法。

<提取RNA>

与实施例1同样地从小鼠骨髓瘤培养细胞(106个左右)的平板，使用QIAGEN公司生产的Rneasy Mini Kit，依据试剂盒中所附的操作方法，提取RNA。

<提取RNA的评价>

采用与实施例1同样的方法进行电泳的结果在图4中显示。使用RNeasyMini Kit的情况下，显示在提取的核酸中含有基因组DNA。

<使用提取核酸的RT-PCR>

将实施例1得到的提取核酸、以及比较例方法得到的提取核酸进行RT-PCR。

不进行去除DNA操作，从实施例1和比较例方法得到的提取核酸，调制2.5μg含全RNA的核酸溶液。在此核酸溶液中，加入含有逆转录酶(インビトロジエン公司生产SuperScriptII)、Oligo(dT)引物的逆转录酶，最终溶液体积为20μl，42℃下保温50分钟，通过逆转录反应，合成以mRNA为模板的cDNA。

接着，在2μl和0.2μl逆转录反应后的溶液中，加入以不含内含子的小鼠β肌动蛋白基因片段为目的片段的PCR引物(东洋纺公司产Mouse β-actinRT-PCR Primer Set)、耐热DNA聚合酶(ァプラィドバィオシステムズ公司产AmpliTaq Gold DNA polymerase)和PCR用试剂，最终溶液体积为50μl，按照94℃·15秒、55℃·30秒、72℃·1分钟为一个循环，用热循环器(PERKINELMAR公司产GeneAmp PCR System 9600)加热循环30个循环。

此外，以不发生逆转录反应的逆转录未反应溶液2μl和0.2μl作为阴性对照，以带有PCR引物(东洋纺公司产Mouse β-actin RT-PCR Primer Set)的来自小鼠β肌动蛋白的DNA作为阳性对照，进行PCR。

PCR反应后的溶液在3％琼脂糖凝胶(FMC公司产Nusieve 3：1Agarose)上电泳，溴乙锭染色后，使用透射仪UV照射，照相，结果在图5中显示。

在图5中，例1显示以实施例1方法得到的提取核酸进行逆转录反应、从2μl逆转录反应后的溶液PCR反应后的扩增产物，例2显示以实施例1方法得到的提取核酸进行逆转录反应、从0.2μl逆转录反应后的溶液PCR反应后的扩增产物，例3显示以实施例1的方法得到的提取核酸不进行逆转录反应、从2μl该未进行逆转录反应的溶液PCR反应后的扩增产物，例4显示以实施例1方法得到的提取核酸不进行逆转录反应、从0.2μl该未进行逆转录反应的溶液PCR反应后的扩增产物。

例5显示以2μl比较例方法得到的提取核酸进行逆转录反应、逆转录反应后的溶液PCR反应后的扩增产物，例6显示以比较例方法得到的提取核酸进行逆转录反应、从0.2μl逆转录反应后的溶液PCR反应后的扩增产物，例7显示以比较例方法得到的提取核酸不进行逆转录反应、从2μl该未进行逆转录反应的溶液PCR反应后的扩增产物，例8显示以比较例方法得到的提取核酸不进行逆转录反应、从0.2μl该未进行逆转录反应的溶液PCR反应后的扩增产物。例9显示来自小鼠β肌动蛋白DNA进行PCR反应后的扩增产物，作为阳性对照。

结果显示，在例1、2、5、6、7、9中，可确认来自小鼠β肌动蛋白基因540bp扩增产物。实施例1方法得到的提取核酸不进行逆转录反应的情况下，看不到扩增产物(例3、4)，因此，逆转录反应情况下的扩增产物来自于mRNA，不用除去提取核酸中的基因组DNA，可进行RT-PCR。

另一方面，比较例方法得到的提取核酸中，使用2μl不进行逆转录反应的未进行逆转反应的溶液2μl时，得到扩增产物(例7)。这是在提取核酸中所含的、来自基因组DNA的扩增产物，使用2μl进行逆转录反应后的逆转录反应溶液得到的PCR扩增产物(例5)，变成mRNA和来自基因组DNA的扩增产物的混合物，不能进行正常的RT-PCR反应。因此，为使比较例方法得到的核酸进行RT-PCR反应，必需要除去提取核酸中的基因组DNA。

Claims (27)

1.一种RNA提取方法，其特征在于，在含有RNA的生物材料中，混合确定浓度的促溶剂、确定浓度的有机溶剂、核酸结合性固相，使RNA选择性地和固相结合，从液相中分离出结合RNA的固相，洗净固相，从固相中洗提RNA。

2.根据权利要求1所述的RNA提取方法，所述促溶剂选自碘化钠、碘化钾、硫氰酸钠、硫氰酸胍、盐酸胍中的一种或一种以上。

3.根据权利要求2所述的RNA提取方法，所述硫氰酸胍的确定浓度是1.0～4.0mol/l，此浓度是在混合有机溶剂后的混合液中的浓度。

4.根据权利要求1所述的RNA提取方法，所述有机溶剂由选自脂肪族醚、脂肪族酯、脂肪族酮中的含有2到10个碳原子数的化合物的一种或两种或两种以上组成。

5.根据权利要求4所述的RNA提取方法，所述脂肪族醚选自乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、丙二醇二甲醚、丙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、四氢呋喃、1.4-二氧杂环己烷中的一种或一种以上。

6.根据权利要求4所述的RNA提取方法，所述脂肪族酯是丙二醇单甲醚乙酯或乳酸乙酯。

7.根据权利要求4所述的RNA分析方法，所述脂肪族酮选自丙酮、羟基丙酮、甲基丙酮中的一种或一种以上。

8.根据权利要求5所述的RNA提取方法，所述二乙二醇二甲醚的确定浓度是10～30容量％，此浓度是在混合促溶剂后的混合液中的浓度。

9.根据权利要求6所述的RNA提取方法，所述乳酸乙酯的确定浓度是20～40容量％，此浓度是在混合促溶剂后的混合液中的浓度。

10.一种扩增生物材料的分析方法，其特征在于，在含有RNA的生物材料中，混合确定浓度的促溶剂、确定浓度的有机溶剂、核酸结合性固相，使RNA选择性地和固相结合，从液相中分离出结合RNA的固相，洗净固相，从固相中洗提RNA，逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)得到的RNA。

11.根据权利要求10所述的生物材料分析方法，所述促溶剂选自碘化钠、碘化钾、硫氰酸钠、硫氰酸胍、盐酸胍中的一种或一种以上。

12.根据权利要求11所述的生物材料分析方法，所述硫氰酸胍的确定浓度是1.0～4.0mol/l，此浓度是在混合有机溶剂后的混合液中的浓度。

13.根据权利要求10所述的生物材料分析方法，所述由有机溶剂选自脂肪族醚、脂肪族酯、脂肪族酮中的含有2到10个碳原子数的化合物的一种或两种或两种以上组成。

14.根据权利要求13所述的生物材料分析方法，所述脂肪族醚选自乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、丙二醇二甲醚、丙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、四氢呋喃、1.4-二氧杂环己烷中的一种或一种以上。

15.根据权利要求13所述的生物材料分析方法，所述脂肪族酯是丙二醇单甲醚乙酯或乳酸乙酯。

16.根据权利要求13所述的生物材料分析方法，所述脂肪族酮选自丙酮、羟基丙酮、甲基丙酮中的一种或一种以上。

17.根据权利要求14所述的生物材料分析方法，所述二乙二醇二甲醚的确定浓度是10～30容量％，此浓度是在混合促溶剂后的混合液中的浓度。

18.根据权利要求15所述的生物材料分析方法，所述乳酸乙酯的确定浓度是20～40容量％，此浓度是在混合促溶剂后的混合液中的浓度。

19.一种RNA提取用试剂，是在核酸结合性固相上选择性地结合RNA的RNA提取用试剂，含有确定浓度的促溶剂、确定浓度的有机溶剂。

20.根据权利要求19所述的RNA提取用试剂，所述促溶剂选自碘化钠、碘化钾、硫氰酸钠、硫氰酸胍、盐酸胍中的一种或一种以上。

21.根据权利要求20所述的RNA提取用试剂，所述硫氰酸胍的确定浓度是1.0～4.0mol/l。

22.根据权利要求19所述的RNA提取用试剂，所述有机溶剂由选自脂肪族醚、脂肪族酯、脂肪族酮中的含有2到10个碳原子数的化合物的一种或两种或两种以上组成。

23.根据权利要求22所述的RNA提取试剂，所述脂肪族醚选自乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、丙二醇二甲醚、丙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、四氢呋喃、1.4-二氧杂环己烷中的一种或一种以上。

24.根据权利要求22所述的RNA提取试剂，所述脂肪族酯是丙二醇单甲醚乙酯或乳酸乙酯。

25.根据权利要求22所述的RNA提取试剂，所述脂肪族酮选自丙酮、羟基丙酮、甲基丙酮中的一种或一种以上。

26.根据权利要求23所述的RNA提取试剂，所述二乙二醇二甲醚的确定浓度是10～30容量％。

27.根据权利要求24所述的RNA提取试剂，所述乳酸乙酯的确定浓度是20～40容量％。

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