CN1666099A

CN1666099A - 分子探测器装置

Info

Publication number: CN1666099A
Application number: CN03816280.6A
Authority: CN
Inventors: 理查德·吉尔伯特; 周晓峰; 布赖恩·P·艾伦
Original assignee: e2v Technologies Ltd
Current assignee: e2v Biosensors Ltd
Priority date: 2002-07-10
Filing date: 2003-07-09
Publication date: 2005-09-07
Also published as: AU2003260677A1; EP1552282A1; AU2003260677C1; WO2004008120A1; US20070030481A1; AU2003260677B2; JP2005532563A

Abstract

一种用于探测分析物分子，特别是蛋白质的存在的探测器组件，协同使用表面增强拉曼散射(SERS)和表面等离子体子共振(SPR)。用于SERS的激励激光从位于导电表面附近的报告染料散射，其中该报告染料附着有分析物分子。同时，以临界角向导电表面提供第二激光。该第二激光在分析物区域内产生一个场从而提高拉曼散射效应。

Description

分子探测器装置

技术领域

本发明涉及分子探测器，用于分子探测器的载架(carrier)，更特别地，涉及由载架和探测器组成的使用表面增强拉曼散射的分子探测器组件。

背景技术

目前已经有许多用于探测分析物分子的活动和存在的技术。其中一种技术利用拉曼散射(RS)效应。入射到分子上的光线被散射，作为能量转移的结果，散射光的频率以及波长发生偏移。导致该非弹性散射的过程被称作拉曼效应。频率偏移对于分析物分子是唯一的。然而，RS效应非常微弱，因此已经熟知利用优选地使用胶体的技术来增强该效应。位于金属表面，例如银、金、铜或者其它该类金属，数埃距离内的分析物分子能够通过各种机制从金属表面转移能量。这被称作表面增强拉曼散射(SERS)，并能够用传统的分光探测器加以测量。

我们对如下问题进行了评估，也就是即使使用了表面增强拉曼散射(SERS)，拉曼散射效应与通常的散射相比也只能提供少量的拉曼散射辐射(信噪比非常低)。

发明内容

本发明由权利要求限定，并请参考之。本发明的实施例利用表面增强拉曼散射(SERS)探测位于该表面附近区域内的分析物的存在，用第一激光源照射该区域，并用第二激光照射某个表面以形成一个场从而进一步增强该SERS效应。由第二激光在该区域内产生的场用于增强拉曼散射效应。

入射到该表面上的第二激光还优选地用于表面等离子体共振探测(SPR)，从而能够同时使用SERS和SPR两种探测技术。因此，SPR激光在提供SPR功能的同时，还能够增强SERS效应。

附图说明

现在，通过参考附图说明本发明的实施例，但只是作为实例，其中：

图1显示了拉曼散射的能级；

图2显示了使用表面增强拉曼散射原理的探测器的示意图；

图3显示了使用表面等离子体共振原理的探测器的示意图；

图4显示了根据本发明组合使用表面增强拉曼散射和表面等离子体共振原理的探测器的示意图；

图5显示了根据本发明第一优选实施例的由分析物载架和探测器共同组成的探测器组件；

图6显示了根据本发明第二实施例的分析物载架；和

图7显示了根据本发明第三实施例的分析物载架。

具体实施方式

本文说明的实施例协同利用表面增强拉曼光谱(SERS)和表面等离子体子共振(SPR)。我们意识到，这些技术能够共同利用SPR激光入射辐射，以便增强SERS效应。本实施例包括两个主要部件：分析物载架，其提供用于支持待分析分子的分析物区域；和探测器，其向载架上的分析物区域提供激光辐射，并具有传感器以探测从分析物区域接收的辐射。分析物载架与探测器共同形成探测器组件。

探测器本身能够由各种形式的激光源和传感器构成，如下文所述。适合于探测器的分析物载架的实施例能够采取各种形式。优选实施例是微流芯片(microfluidic chip)，但是其他的实施例也可以包括被适当修改的微量滴定板(microtiter plate)或者棱镜装置，如下文所述。因此，分析物载架被称作“芯片上实验室”。在说明实施例之前，首先作为背景知识先说明SERS和SPR效应。

当光线从分子散射时，大多数光子被弹性散射。散射光子的大多数具有与入射光子相同的能量(从而具有相同的频率和波长)。然而，有少量的(10⁷个光子中有大约1个)散射光线的频率与入射光子不同，通常比入射光子低，如图1所示。当散射光子损失能量到分子上时，其波长比入射光子长(称作斯托克散射)。相反，当它获得能量时，其波长变短(称作反斯托克散射)。

导致该非弹性散射的过程被称作拉曼效应，以C.V.Raman爵士命名，他于1928年发现该现象。随着能量从光子转移到分子，其通常作为热量散失掉，分子的振动、转动或者电子能量发生改变。热能也可以被转移给散射光子，从而减小其波长。在经典理论(classical terms)中，该相互作用可以看作分子电场的扰动，其不仅取决于分子的特殊化学结构，而且取决于它精确的构型和环境。入射光子与拉曼散射光子之间的能量差等于散射分子的振动状态能，以量子化的能值引发散射光子。散射光的强度对能量(波长)差的曲线图称作拉曼光谱[RS]。图1显示了不同能量状态的解析。

图2显示的是，为什么从距离金属表面数十纳米距离内的化合物或者离子的拉曼散射会比在溶液中大10³-10⁶倍。表面增强拉曼散射(SERS)在银上最强，但在金和铜上也同样容易观察到。最近的研究已经显示，多种过度元素也能够提供有用的SERS增强作用。SERS效应主要是由于分子与金属表面附近的电磁场之间的能量转移引起的，该电磁场由金属中的电子产生。这里不需要说明利用SERS增强拉曼散射的精确机制，并且分析物分子与金属中电子的各种模型，例如图像耦合(coupling of an image)，对于本领域技术人员而言是熟知的。实际上，金属层6中的电子向分子提供能量，借此增强拉曼效应。

特殊分子的存在利用SERS通过检测散射辐射的波长而加以探测，散射辐射如散射波束4所示。散射不是定向的，因此传感器(未显示)可以位于任何适当的位置捕获散射辐射，测量散射辐射的波长以及能量变化。能量变化与分子状态的能带隙有关，因此能够确定特殊分子的存在。典型地，待分析的分子10与报告分子8键合以便进行分析。

用于测量分子存在的另一种技术称作表面等离子体子(surfaceplasmon)共振(SPR)，如图3所示。激励激光波束12的电矢量包括金属层16表面上的偶极子。来自正极化电荷的回复力使该激励以共振频率振荡电磁场。在瑞利极限下，共振主要由金属层16表面上的自由电子(“等离子体子”(plasmon))密度、金属的介电常数及其环境决定，其中金属层16表面上的自由电子密度确定所谓的“等离子体波长”。

吸附在层16表面上或者附近的分析物中的分子经受异常大的电磁场，其中垂直于表面的振动模式被最大强化。这就是表面等离子体子共振(SPR)效应，其实现了金属层16中的等离子体子与表面附近的分子8之间的跨空间(through-space)能量转移。然后可以用传统的分光探测器(未显示)测量散射光子。

SPR的强度取决于许多因素，包括入射光的波长和金属表面的形态，因为入射光的波长应当使其能量与金属等离子体波长的能量相匹配。SPR能够用胶体金属粒子或者金属薄膜实现。对于5μm的银粒子，等离子体波长为大约382nm，但是对于更大的椭圆体银粒子，等离子体波长可以高达600nm。对于铜和金粒子，等离子体波长达到650nm的红光，这两种金属在350-1000nm的波长区域内显示SERS。表面等离子体共振激励的最佳形态是小粒子(＜100nm)或者金属薄膜(接近50nm)上的原子粗糙表面(atomically rough surface)。

如图3所示，对于SPR，使平面偏振光的激励激光波束12以接近临界角的角度照射金属表面16。该临界角由金属的折射系数决定。SPR效应产生渐逝波(evanescent wave)17和电磁场，该电磁场从金属表面延伸大约400nm。该场与分析物分子之间的能量转移导致层16的有效折射系数改变，使得临界角改变，从而使折射光14改变，其能够用传统的分光设备加以探测。

RS和SPR都是有力的工具，被常规地用于跟踪分子的相互作用或者对极低浓度的分子进行定量。

本发明实施例的工作原理如图4所示。该实施例的关键特征是，通过用附加的入射激光源增强用于探测分子存在的SERS效应，优选地，该附加入射激光源也用于SPR探测。这两种探测系统能够独立地工作，对同一分析物样品进行分离的或者同步的测量。两种效应协同地发挥作用，选择性地增强表面等离子体与分析物分子之间的相互作用。

先前参考图2和3说明的特征在图4中用相同的数字指代。第一激光源，SERS激励激光波束2，入射到受体分子10上，其典型地是键合在位于导电金属表面16上的报告分子8的抗体。分析物分子典型地是蛋白质。当分析物分子键合于受体分子上时，受体分子的位置转移并接近表面，借此显示SERS散射增强作用。如上所述，以已知的方式发生SERS散射，并通过传感器探测散射辐射4。同时，第二激光源，SPR激光波束12，入射到金属表面16上。第二激光波束与表面等离子体耦合，其进一步产生电磁场，该电磁场与待分析分子的振动能量状态耦合。

分子系统与等离子体场之间能量转移的效率取决于分子的振动能量状态与表面等离子体的量子能量状态之间的匹配。前者由分子结构和环境决定，后者由激励激光的波长和金属粒子层的成分及几何形状决定。因此，如果SPR波束12的激励波长改变(例如，通过使用可调激光器)或者金属层16的成分和厚度改变，则SPR效应能够被选择性地优化，从而使来自特殊分析物分子的SERS信号最大化。其优点是，能够显著提高给定分子的SERS信号强度(实现更灵敏的探测)，和能够调节区域20内的SPR电磁场从而选择性地增强来自复杂生物混合物中特殊成分的信号。因为组合探测器利用人工的SPR场增强来自分析物分子的发射荧光，所以我们将该技术命名为表面等离子体辅助拉曼光谱(SPARS)。有效地，第二激光用于向由第一激光产生的激励补充能量。

本发明的优选实施例在所谓的芯片上实验室中应用上述的新技术。在该装置中，提供一种(一次性)分析物载架，向其添加含有待分析分子的溶液。然后将该载架插入到探测器中用于探测拉曼散射辐射和任意的SPR辐射，其中探测器由两个激光器(一个用于SERS，一个用于SPR激励)和一个传感器装置构成。

现在说明分析物载架的实施例，并说明整个载架和探测器组件。

分析物载架的优选实施例如图5所示，且呈微流芯片的形式。在基片11上形成具有通道22的通道层13，其中基片11由对所选波长的辐射透明的适当塑料、玻璃或者其他合适的材料构成。溶液中的分析物沿着箭头所示的方向引入到通道中。在通道的区域17处形成导电或者半导体层16。该层优选地是铜、铝、银或者特别地金中的一种。如前所述，金层可以是粒子尺寸为80nm的胶体，所选择的金属胶体的粒子尺寸提供合适的等离子体波长，如前面已经说明的。

芯片的主要用途是探测蛋白质。对于该应用，在金表面16上提供报告染料以及能够模拟靶蛋白一部分的肽或者类似片段，该金表面上具有附着了抗体或者类似受体的连接分子(linking molecule)。报告染料最初通过键合于抗体或者受体分子上的受体位点与表面保持隔离。一旦和靶蛋白键合，报告物便会移位并进入影响金属表面渐逝场的区域20。报告染料根据待分析的蛋白质加以选择。报告分子提供SERS散射，并被SPR激光增强。

插入了分析物载架芯片的探测器由SERS激光器28构成，向金层16表面区域17处的分析物和报告分子提供波束2。SERS激光器28提供一辐射，选择其波长使其与报告分子的能带隙相匹配并且在分子与分子之间均不相同。因此为了提供柔性探测器(flexible detector)，SERS激光器优选地可以调节。因为SERS散射4不是定向的，所以用于散射辐射的传感器26能够位于任何的位置。然而，该传感器优选地不与SERS激光器相对，以避免直接从激光器辐射到传感器。

相对于表面16成临界角地布置激光器27，从而提供用于SPR效应的平面偏振波束12，并布置探测器阵列24用于接收反射波束14。选择SPR激光器27的波长使其与表面等离子体子共振相匹配，而表面等离子体子共振自身被设置成与报告染料分子的能带隙相耦合。因此，优选地SPR激光器27也可调。传感器阵列24由多个传感器构成，其每一个相对于反射波束依次偏离一个微小的角度。因此，因为报告分子与来自表面16的渐逝波相互作用，所以会改变SPR折射辐射，从而能够作为折射光线角度的改变加以探测。此外，因为SPR激光器可以调节，所以SPR效应能够被如下地测量，即通过扫描激光的调谐，并注意当分析物分子附着在受体分子上时在给定探测器位置处发生折射的波长的改变。

尽管只显示了一个通道，但是芯片优选地具有多个通道，其每一个都含有位于金属层上的不同报告染料和/或报告分子。

第二实施例的分子物载架如图6所示，并由经过修改的微量滴定板构成。微量滴定板对于技术人员而言是熟知的，并包括一系列的位于基片上的井(well)，该基片典型地是塑料的。分析物样品被引入到微滴定板井中用于分析。根据本发明的实施例，每个井的底部或者侧面都被修饰成包括一个导电表面16，在导电表面上布置报告染料。然后将溶液中的分析物引入到每个井中，并将板插入到探测器中，如前面参考图5说明的。导电表面优选地是金的，典型的厚度为50-80nm，如前所述。探测器装置能够依次照射每个井，但优选地具有一探测器阵列，从而允许同时照射并探测平板中多个井中的每一个。

图7显示了芯片的第三实施例。在该装置中，由具有反射表面15和表面19的基片11有效地形成棱镜，其中表面19上安装用于外部连接的传感器。金层、激光器和传感器装置如第一实施例所述。

对于上述的任何一个“芯片上实验室”设备，都额外地有可能控制金属层16的精确成分。用各种掺杂剂原子修饰金属表面16可以提供附加的调制等离子体波长的装置，甚至可以形成电控的SPR场。

RS和SPR部件能够被物理地分离，使RS激光器和探测器布置在分析物分子的“上面”，而SPR激光器和探测器布置在它们的“下面”。选择地，两个激光器都从相同的侧面照射探测器表面。它对于芯片上实验室装置的益处是提供了模块性：探测器能够用相同基本部件的全部三种组合加以构建(仅RS、仅SPR和SPARS)。

Claims

1.一种用于探测分析物中某种分子存在的探测器组件，包括：

一个分析物载架，其具有用于在表面的分析区域内接收分析物的导电表面；

第一激光辐射源，其用于在使用时提供被导向到分析区域以产生拉曼散射的辐射；

第一传感器，其用于探测来自第一激光辐射源的辐射从而探测分子的存在，该来自第一激光辐射源的辐射通过拉曼散射从分析区域散射；

第二激光辐射源，其用于在使用时以一定的角度向导电表面提供辐射，从而在分析区域内产生一个场；

其中第一和第二激光辐射源被设置成使得由第二激光源产生的场引起第一激光源辐射的增强的拉曼散射效应。

2.根据权利要求1的探测器组件，其中导电表面包含金属膜。

3.根据权利要求1的探测器组件，其中金属膜是铝、铜、银或者金之一。

4.根据权利要求1、2或者3中任何一个的探测器组件，其中导电表面的厚度为10-100nm的量级。

5.根据前述任何一个权利要求的探测器组件，其中在导电表面上沉积报告染料和用于选择性键合待分析分析物分子的键合分子。

6.根据权利要求5的探测器组件，其中报告染料用于在使用时使报告染料位于键合有待分析分子的分析区域内，否则位于该区域的外部。

7.根据权利要求1-6中任何一个的探测器组件，其中分析物载架包含微流芯片。

8.根据权利要求7的探测器组件，其中微流芯片包括至少一个通道，该通道的一部分上具有导电表面。

9.根据权利要求7的探测器组件，其中微流芯片包括多个通道，每个通道的至少一部分上具有导电表面，每个导电表面上沉积不同的报告染料。

10.根据权利要求1-6中任何一个的探测器组件，其中载架包含微量滴定板。

11.根据权利要求10的探测器组件，其中微量滴定板具有一个或多个井，每个井的底部具有导电表面。

12.根据权利要求1-6中任何一个的探测器组件，其中载架包含棱镜装置，该导电表面设置在棱镜的一个表面上。

13.根据前述任何一个权利要求的探测器组件，其中第二激光辐射源用于向导电表面提供平面偏振辐射。

14.根据权利要求13的探测器组件，其中第二激光辐射源用于以或者接近临界角的角度向导电表面提供辐射。

15.根据前述任何一个权利要求的探测器组件，其中导电表面具有表面等离子体波长的表面等离子体子，且第二激光辐射源被设置为提供基本上为表面等离子体子波长的辐射。

16.根据权利要求15的探测器组件，其中选择导电表面和第二辐射源的波长，使场与拉曼散射的能带隙相匹配。

17.根据权利要求14的探测器组件，其中第二激光源用于探测表面等离子体子共振，探测器组件进一步包括第二传感器，其用于探测来自第一激光源并从表面折射的辐射。

18.根据权利要求17的探测器组件，其中第二传感器由单个传感器构成，该传感器用于探测折射辐射强度的变化以探测分子的存在。

19.根据权利要求17的探测器组件，其中传感器由传感器阵列构成，用于探测被折射辐射的角度变化从而探测分子的存在。

20.一种用于探测器组件中的分析物载架，其中来自第一源的激光辐射用于通过拉曼散射探测分析物的存在，且来自第二激光辐射源的激光辐射用于产生一个场以增强拉曼散射，该载架包括：

-一个基片，其用于支持分析物并选择其光学性质使之与来自第一或者第二辐射源的激光辐射相匹配；和

-一个导电表面，其位于基片的一部分上用于接收分析物。

21.根据权利要求20的分析物载架，其中导电表面由胶体金属膜构成。

22.根据权利要求21的分析物载架，其中金属膜是铝、铜、银和金之一。

23.根据权利要求20、21或者22的分析物载架，其中导电表面的厚度为10-100nm的量级。

24.根据权利要求20-23中任何一个的分析物载架，其中导电表面上沉积有报告染料，该染料具有用于选择性键合待分析分析物分子的键合分子。

25.根据权利要求24的分析物载架，其中报告染料用于在使用时位于键合有待分析分子的分析区域内。

26.根据权利要求20-25中任何一个的分析物载架，其中分析物载架包含微流芯片。

27.根据权利要求26的分析物载架，其中微流芯片包括至少一个通道，该通道的一部分上具有导电表面。

28.根据权利要求26的分析物载架，其中微流芯片包括多个通道，每个通道的一部分上具有导电表面，每个导电表面上沉积不同的报告染料。

29.根据权利要求20-25任何一个的分析物载架，其中载架包含微量滴定板。

30.根据权利要求29的分析物载架，其中微量滴定板具有一个或多个井，每个井的底部具有导电表面。

31.根据权利要求20-25任何一个的分析物载架，其中载架包含棱镜装置，导电表面设置在该棱镜的一个表面上。

32.一种用于探测分析物载架上的分析物中某种分子存在的探测器，其中分子物载架表面具有导电表面，用于在该表面的分析区域内接收分析物，该探测器包括：

其中第一和第二激光辐射源被设置成使得第二激光源产生的场引起第一激光源辐射的增强的拉曼散射效应。

33.一种探测分析物中某种分子存在的方法，包括：

-在导电表面的分析区域上提供分析物；

-用第一激光辐射照射分析区域从而产生拉曼散射；

-探测由于拉曼散射从分析区域散射的辐射从而探测该分子的存在；

-同时用第二激光辐射以一定的角度照射导电表面从而在分析区域内产生一个场；和

-其中在分析区域内产生的场增强拉曼散射效应。