CN1661359B - 一种核酸等温扩增定量检测方法 - Google Patents

Abstract

一种核酸等温扩增定量检测技术，本发明采用逆转录酶和RNA聚合酶把等温扩增与TaqMan荧光探针检测结合，在同一反应体系中实现对RNA样本的等温扩增和检测用荧光信号的积累，可对微量的核酸样品进行定性定量检测。与现有技术相比，具有以下优点：(1)等温扩增降低非特异性扩增几率；(2)定量检测、结果稳定；(3)检测速度快、特异性好、灵敏度高；(4)设备简单、成本低；(5)操作简便，易于推广。本发明适用于实验研究、临床检测、食品安全检测、药物筛选、生物战剂检测等领域中的核酸检测。

Description

一种核酸等温扩增定量检测方法

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及核酸扩增检测技术的改进。 

背景技术

在核酸检测过程中，多数情况下样品中的核酸含量较低，为了使检测达到一定的灵敏度和准确度，需要对样品中的待检核酸片段进行有效扩增。1985年聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)技术的诞生大大推动了核酸检测技术乃至整个分子生物学技术的发展，并日渐成为核酸检测技术中的重要手段，也同时成为现代分子生物学技术的基础。随后，又衍生出诸如逆转录酶-聚合酶链反应(Reverse Transcriptase-PCR，简称RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链反应(Real TimeFluorescent Quantified PCR)等一系列核酸扩增检测方法，可分别用于DNA样品和RNA样品的扩增及定性定量检测。由于扩增过程的误差往往直接影响到核酸检测的结果，因此，后续的扩增子(即核酸扩增反应中的扩增产物)检测过程就显得尤为重要。目前，大多数核酸检测方法都是“基因扩增+扩增子检测”的操作模式，较为传统的“PCR+电泳”检测方法目前还被广泛应用。由于PCR方法在实际应用中易引起非特异性扩增，实验前后也容易受到环境中其他外源核酸的污染，因此常造成实验结果的假阳性或假阴性现象，这样使得该技术的实际应用尤其是临床检测受到很大的局限性。实时荧光定量PCR虽然在技术上有了很大的改进，检测反应也达到了定量化，但其昂贵的设备及高成本的检测，阻碍了大规模的推广使用。 

1991年Compton提出了基于核酸序列的扩增技术(Nucleic AcidSequence Based Amplification，简称NASBA)(Nature，350(6313)：91-2，1991)，为基因扩增技术提出了新的概念。该技术是以RNA分子的逆转录-转录为技术主线，无需进行类似于PCR过程的温度循环，通过单向等温扩增，短时间内形成相当于原RNA拷贝数近百万倍的RNA扩增子。但扩增子常采用电泳、探针杂交、点杂交等方法来完成定性检测。此外，Gen-Probe公司也开发出与核酸扩增原理类似的转录介导的扩增技术(Transcription Mediated Amplification，简称TMA)(Journal ofClinical Microbiology，35(3)，676-8，1997)，其与NASBA的核酸扩增方法相同，而TMA的扩增结果是通过杂交保护测定(HybridizationProtection Assay，简称HPA)技术进行定性检测。目前Gen-Probe公司利用此技术开发了沙眼衣原体和结核杆菌检测试剂盒。无论是NASBA技术还是TMA技术，都在方法上采用单向等温扩增，改善了PCR技术中的非特异性扩增难题，提高了反应速率，而且反应过程保持等温，无需依赖PCR热循环仪，仅用普通加热器或水浴即可，这样能降低检测成本。但就目前的发展趋势来看，NASBA与TMA尚无法达到定量检测程度，同时TMA方法中所需的实验材料，尤其是反应中的酶混合物需特殊处理，属非开放型专用试剂，检测成本相对较高。此外，NASBA技术中所使用的禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶必须是特定生产商生产，且须在-70℃储存，使用中效期较短，因此操作条件较为苛刻，技术推广亦受到限制。 

目前，实验室研究及临床检测中所使用的核酸定量扩增检测方法主要以实时定量PCR为主，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个反应进程，最后通过标准曲线进行定量分析。其荧光检测模式分为TaqMan荧光探针、TaqMan MGB荧光探针[在荧光探针分子3′端连接非荧光淬灭剂及MGB基团(Minor Groove Binder)，亦称为MGB探针]、SYBR Green荧光染料、分子信标(Molecular Beacon)探针和荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，简称FRET)探针等。实时荧光定量PCR方法虽然灵敏度和准确度较高，但检测成本相对昂贵，检测过程也需依赖特殊设备。所以该技术在操作方法和检测成本上都存在局限性，不适于作为常规技术推广。在核酸检测技术领域，目前还未见有集扩增与定量双重功能为一体且成本低廉的相关技术的报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种核酸等温扩增定量检测方法(QuantitativeDetection with Isothermal Amplification，简称QDIA)，它是把核酸的等温扩增与扩增子的定性定量检测结合起来，使核酸样品在一个反应体系中完成扩增与检测。该技术具有简便、快速、灵敏的优点，能克服已有技术中成本高、操作费时费力、特异性低等不足。 

本发明的核酸等温扩增定量检测方法包括样品处理步骤及核酸等温扩增定量检测步骤。所采用的样品处理步骤，是从待检样品中得到RNA样本，无论样品来自组织、细胞还是微生物病原体，最终都是要获得其RNA样本；组织、细胞或微生物病原体样品可采取RNA抽提技术获得RNA样本；若是DNA样品，则可通过转录反应得到RNA样本。本发明的特征在于，RNA样本的等温扩增定量检测，是采用逆转录酶和RNA聚合酶把等温扩增与TaqMan荧光探针检测结合，在对RNA样本等温扩增的同时实现检测用荧光信号的积累，且整个过程在同一反应体系中完成。所述的逆转录酶为MMLV逆转录酶。所述等温扩增定量检测的具体操作为：将待检RNA样本置入反应检测液，在58-75℃条件下5-40分钟，以打开RNA的二级结构，随后转入35-45℃条件下反应1-2小时，再于荧光检测仪中检测反应产物并读数，通过标准样品荧光信号的标准曲线，推导出所检测RNA样本的量，完成RNA样本的定量检测过程；其反应检测液由引物、TaqMan荧光探针、反应缓冲液以及酶混合液组成。 

本发明所述的反应缓冲液各组分的终浓度为：25-60mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0-9.0)，30-90mM KCl，10-20mM MgCl₂，0.5-5mM脱氧核苷三磷酸(dNTPs)，1-10mM核苷三磷酸(NTPs)，4-20mM二硫苏糖醇(DTT)，10-20％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)；所述的引物终浓度为：带有RNA酶启动子识别序列的引物(简称引物1)和第二链cDNA合成引物(简称引物2)各0.1-1μM；所述的酶混合液各组分在25μL反应液中的量为：4-75U逆转录酶，8-3000U RNA聚合酶，0.05-0.3U核糖核酸酶H(RNase H)，10-50U RNA酶抑制剂(RNasin Inhibitor)和0.05-5μg小牛血清白蛋白(BSA)；所述的TaqMan荧光探针终浓度为50-200nM。所述的TaqMan荧光探针可选用TaqMan探针或是TaqMan MGB探针，其探针上的荧光基团可根据荧光检测设备或实际需求而定。另外，加入反应体系中的TaqMan荧光探针可以针对RNA模板的序列设计，还可以根据cRNA扩增子的序列设计。当然，为了提高检测反应的特异性和灵敏度，也可同时将上述两种不同碱基序列的探针都加入检测反应体系，只需在探针设计时将两种探针的序列位置错开即可，防止它们在同一体系中互补而形成二聚体。两种探针若同时使用，其5’端荧光标记基团在必要时也可彼此不同，以便在检测时相互区分。对于反应中所添加的逆转录酶，视其种类及需要的反应程度不同而加入不同的活力单位(用U表示)。对于RNA扩增中另一种关键酶--RNA聚合酶，其加入量也可视具体情况而定：一般来说，若是RNA样本量较小，RNA分子长度较短，对cRNA合成效率要求也不高，可使用活力单位较少的RNA聚合酶，每个反应加入100U以下RNA的聚合酶即可；若是RNA样本量较大，RNA分子长度较长，对cRNA合成效率要求较高，可使用活力单位较大的RNA聚合酶，甚至在一个反应体系中可使用高浓度高活力单位的RNA聚合酶，如1000-3000U RNA聚合酶/反应。 

本发明的特征还在于，所述的等温扩增定量检测的具体操作还可以是：将待检RNA样本置入反应检测液，在60-70℃条件下5-20分钟，以打开RNA的二级结构，随后转入38-42℃条件下反应1-2小时，再于荧光检测仪中检测反应产物并读数，通过标准样品荧光信号的标准曲线，推导出所检测RNA样本的量，完成RNA样本的定量检测过程。 

所述反应缓冲液各组分的终浓度还可为：30-50mM Tris-HCl(pH8.0 9.0)，42-84mM KCl，10-15mM MgCl₂，1-4mM dNTPs，2-8mM NTPs，5-10mM二硫苏糖醇(DTT)，10-15％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)；所述的酶混合液各组分在25μL反应液中的量可以为：40-60U Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶，10-2000U T7 RNA聚合酶或10-2000U SP6RNA聚合酶或10-50U T3 RNA聚合酶，0.1-0.2U核糖核酸酶H(RNase H)，15-45U RNA酶抑制剂(RNasin Inhibitor)和0.1-3μg小牛血清白蛋白(BSA)；所述的TaqMan荧光探针终浓度为80-150nM。 

本发明是一种新的核酸扩增检测方法，是将核酸等温扩增与TaqMan荧光探针检测有机地结合，形成等温扩增与定量检测于一体的高效检测方法，可对微量的核酸样品进行定性定量的检测。相对于PCR扩增技术，本发明不再需要升降温度的往复循环，整个扩增检测过程保持恒温；这样降低了在“变性-退火-延伸”温度循环中引起的非特异性扩增几率；同时扩增过程由于恒温，省去了热循环仪，检测成本也随之降低。本发明检测过程虽采用了与PCR的TaqMan荧光探针检测相类似的原理，但具体方法已有改进，本反应中荧光信号的积累是通过逆转录酶参与的逆转录过程来完成，且为等温反应，从而加快了反应速率并保证了扩增体系的特异性。本发明中荧光信号的检测只需普通的荧光检测仪，无需依赖实时定量PCR扩增仪，在降低检测成本的同时，简化了操作步骤。本发明的优点在于： 

(1)简便的反应体系。通过逆转录酶将等温扩增反应与定量检测反应连接起来，“一酶两用”，等温扩增环节与定量检测环节交互进行，在核酸等温扩增的同时，实现TaqMan荧光探针定量检测中荧光信号的积累，整个反应在一个体系中完成。 

(2)等温高效的扩增体系。本发明是基于逆转录-再转录原理的核酸等温扩增技术，在提供相应的RNA或DNA模板、逆转录酶、RNA聚合酶以及逆转录引物的条件下，按照一个RNA模板一次逆转录反应形成一个DNA模板，然后一个DNA模板通过一次转录反应可生成100-1000个拷贝的RNA 扩增子来计算，在恒定温度下反应1-2小时，能得到初始RNA样本量10⁶ -10¹⁸倍的cRNA扩增子，相对于PCR技术而言，无需重复“变性-退火-延伸”的热循环过程。一来降低检测仪器的成本，二来大大提高了扩增反应的效率，同时又减少了反应中不必要的非特异性扩增产物污染。 

(3)定量检测。本发明采用在逆转录反应中进行荧光探针定量检测的技术，通过实时定量的荧光强度读数，以及RNA样本数量与cRNA扩增子数量之间的线性关系，达到对待测样品定量检测的目的。与TaqMan荧光探针检测技术一样，保留了寡核苷酸荧光探针与引物对靶物进行高特异性鉴别和实时定量的特性，但本发明无论从检测时间还时检测成本上都比现有TaqMan荧光探针技术要有优势。 

(4)检测速度快。本发明的核酸检测技术，将扩增与检测两个反应过程相融合，并在同一反应体系中完成，整个过程没有升降温循环，且具有比DNA聚合反应更快速的RNA转录反应体系，节省时间；同时将TaqMan荧光探针与逆转录反应结合，实现定量检测，对cRNA扩增子的检测更为便捷、快速、灵敏。 

(5)检测灵敏度高。采用本发明技术，RNA样本可在1-2小时内实现10⁶ -10¹⁸倍的扩增量，对于微量的RNA样品来说，可大大提高检测的灵敏度。最小可对10ng的RNA分子进行定量检测。 

(6)检测设备简单。本发明相对现有核酸定性定量检测技术比较，使用普通的恒温水浴和荧光检测仪就可满足，便于应用，易于推广。 

本发明是从RNA样本的等温扩增技术出发，利用RNA逆转录-转录循环简便、等温、快速、灵敏的特点，大大提高了核酸的检测效率，并有针对性地改进了传统PCR技术中温度往复循环、依赖特殊设备、实验结果不稳定等缺陷。更重要的是，在逆转录体系中引入了荧光探针检测技术，使得在简便的实验条件下，对核酸样品进行定量检测成为可能。这将使本发明成为普通分子生物学实验和临床检验中常规的、高灵敏度的、低成本、低能耗的核酸检测方法。本发明适用于各种RNA、DNA样品的定性定量检测，可广泛应用于实验研究、临床检测、食品安全检测、药物筛选、生物战剂检测等领域中与核酸检测相关的环节。由于本发明对仪器设备的依赖性较低，因此在实地检测应用中会有很大优势。 

附图及其说明 

附图1为本发明核酸等温扩增定量检测方法机理的示意图。 

图中(1)样品处理，得到检测所需的RNA样本。 

(2)建立QDIA反应体系，带有RNA聚合酶启动子识别序列的引物1及TaqMan荧光探针与RNA模板退火结合，此在58-75℃完成。 

(3)在逆转录酶作用下合成cDNA第一链，同时TaqMan荧光探针5′端荧光基团在逆转录酶5′-3′外切酶活性作用下被切下，游离于液相反应体系中，发射荧光；其cDNA第一链的合成继续。 

(4)用RNase H处理RNA-DNA杂合体中的RNA单链。 

(5)引物2与cDNA第一链杂交结合。 

(6)在逆转录酶作用下合成cDNA第二链。 

(7)在RNA聚合酶作用下，以带有RNA聚合酶启动子识别序列的cDNA双链为模板，等温扩增得到大量cRNA。 

(8)引物2与cRNA单链杂交结合，开始QDIA反应循环。 

(9)在逆转录酶作用下合成cDNA第一链。 

(10)用RNase H处理RNA-DNA杂合体中的RNA单链。 

(11)引物1及TaqMan荧光探针与cDNA单链杂交结合。 

(12)TaqMan荧光探针5′端荧光基团在逆转录酶5′-3′外切酶活性作用下被切下，游离于液相反应体系中，发射荧光；同时继续合成cDNA第二链。 

(13)通过荧光检测仪读取体系中的荧光强度。 

(14)在RNA聚合酶作用下，以带有RNA聚合酶启动子识别序列的cDNA。 

以下结合附图就本发明技术机理作详细说明。 

本发明包括有两个反应步骤，即样品处理、等温扩增定量检测。 

(一)样品处理(如图中(1)所示)。此步骤是从待检样品中分离出核酸分子，最终获得RNA样本。本发明通过对RNA靶分子的检测，提出基因检测技术的新思路，而对RNA扩增子的检测也最能体现本发明的技术优势。从样品中释放RNA分子，可采取RNA抽提技术，最常见的是用Trizol试剂一步法提取(美国专利：No.5,346,994)，这种方法相对高效、快捷、重复性高。另外，也可采取酶裂解法及加热法。若是需要提取mRNA，可直接采用美国Invitrogen公司生产的FastTrack mRNA提取试剂盒，简便易行。总之，从样品细胞中有效地释放出RNA分子即可。在此得到的RNA样本数量相对较少，而且RNA很容易降解，不便于直接检测，因此需要通过扩增途径才可达到需要的检测灵敏度。若是DNA样品，可通过在DNA序列上添加RNA聚合酶启动子序列，结合转录过程，得到RNA样本。具体的方法是在94-98℃将DNA样品变性，然后转至55-65℃，使预先加入体系的带有RNA聚合酶启动子序列的上游引物与不带有RNA聚合酶启动子序列的下游引物结合，接着在Taq DNA聚合酶参与下进行延伸反应，从而得到5′端带有RNA聚合酶启动子序列的DNA样品。随后，在相应的RNA聚合酶存在下，进行转录反应，得到特异性的待检RNA样本。(此过程中所使用的RNA聚合酶应与后续过程中所使用的RNA聚合酶相区分，以免在体系中相互污染，影响检测结果。如：在等温扩增定量检测反应体系中选用T7 RNA聚合酶，则在该RNA样品制备过程中选用SP6 RNA聚合酶或其他合适的RNA聚合酶)。 

(二)等温扩增定量检测(如图中(2)-(14)所示)。包括RNA靶分子的逆转录环节(2)-(6)、RNA等温扩增环节(7)和定量检测环节(8)-(14)。逆转录环节是将得到的RNA样本进行特异的逆转录，为下一步的等温扩增提供有效的 特异模板。在检测样品中特定基因区段或基因位点之初，通过选择特异性的寡核苷酸引物对，确定待测的基因区段或基因位点。由于本发明是依照转录原理，因此，特异引物(位于RNA样本基因方向下游)在其5′末端需连接依赖于DNA的RNA聚合酶所识别的启动子序列；这样，通过逆转录得到的双链cDNA的基因下游方向将会带上启动子序列。另外，鉴于逆转录引物在后期定量检测中的作用，在引物设计时需考虑引物的退火温度与定量检测中所需TaqMan荧光探针退火温度之间的关系。 

逆转录环节(如图中(2)-(6)所示)中包括cDNA双链的合成、TaqMan荧光探针的参入与荧光信号的积累。在已有技术中通过逆转录过程得到cDNA双链需要经历cDNA第一链和第二链两个合成步骤，第一步往往通过逆转录酶完成，接着在DNA聚合酶I、RNase H(有时在长片段cDNA逆转录过程中还用到DNA连接酶)的参与下完成第二步。本发明的方法将这两个步骤合并为一步完成，并且参入TaqMan荧光探针的定量检测。在此过程中，所采用的逆转录酶具有依赖RNA的DNA聚合酶活性，可在寡核苷酸引物存在下，以单链RNA作为模板合成第一链cDNA片段。在cDNA第一链合成之初，特异性TaqMan荧光探针就已与引物1一起结合于模板RNA之上，在逆转录酶作用下，一边合成cDNA第一链，一边通过逆转录酶的5′→3′外切酶活性，使得TaqMan探针5′端的荧光基团被切下，游离于溶液当中进行荧光信号积累，这是第一轮定量检测的荧光信号积累。接着，当另一条寡核苷酸引物与cDNA第一链退火后，这种逆转录酶以cDNA第一链作为模板，进行引物延伸，从而合成cDNA第二链。因此，整个cDNA双链合成过程是在一个反应体系中完成，只需逆转录酶一种酶催化，无需DNA聚合酶参与。此步反应中的逆转录酶是反应中关键酶，它决定了RNA扩增子能否得到高效的扩增；同时，该酶与现有的TMA和NASBA技术中所使用的逆转录酶不相同，它在反应中同时具有对RNA样本进行逆转录和积累荧光信号的双重作用。具体过程是，在合成第一链cDNA时以单链RNA样本 为模板，体系中的引物1为第一链cDNA逆转录引物，利用逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶活性，合成第一链cDNA；接下来在引物2和核糖核酸酶H参与下，利用逆转录酶依赖DNA的DNA聚合酶活性，合成第二链cDNA。这样，所合成的双链cDNA的一端将会带上RNA聚合酶启动子序列。通过从单链RNA到双链cDNA的逆转录过程，得到带有RNA聚合酶启动子识别序列的双链cDNA，从而为后续RNA等温扩增过程提供模板。 

在RNA等温扩增环节中(如图中(7)所示)，本发明利用已合成的带有RNA聚合酶启动子识别序列的双链cDNA作为模板，在RNA聚合酶的参与下，通过转录方式，大量合成与初始RNA模板互补的RNA扩增子(complementary RNA，简称cRNA)。这是一个单向、等温的核酸快速扩增过程。 

定量检测环节(如图中(8)-(14)所示)。本发明通过等温扩增得到大量的cRNA扩增子之后，在体系中的逆转录酶和引物1及引物2参与下，cRNA扩增子又会重复合成cDNA双链。由于cRNA与检测体系中起始RNA样本为互补关系，因此，在新一轮的cDNA合成过程中，第一链cDNA将以cRNA单链为模板，通过引物2的延伸而合成，第二链cDNA将以新合成的第一链cDNA为模板，通过引物1的延伸而合成。在这种情况下，反应体系中的TaqMan探针在与新合成的cDNA第一链杂交后，会在cDNA第二链合成的过程中被具有5′→3′外切酶活性的逆转录酶所作用，使得TaqMan探针5′端的荧光基团被切下，游离于溶液当中，其荧光信号随着反应的循环增加，进而积累到可被荧光检测仪读数，然后通过标准RNA样品量与其经过QDIA反应得到的荧光信号之间的线性关系，推导出所测RNA样本的量，完成RNA样品定量检测过程。反之，若探针与新合成的cDNA未完全杂交，探针上的荧光基团也不会被逆转录酶分解，溶液中也就没有荧光信号读出。 

TaqMan荧光探针主要在RNA逆转录为双链cDNA的过程中与cDNA单链杂交并参与荧光信号的积累(如图中(2)-(4)和(11)-(13)所示)。当然，加入 反应体系中的TaqMan荧光探针可以针对RNA模板的序列设计，在图中(2)-(4)和(11)-(13)与cDNA单链杂交并通过逆转录酶产生检测用荧光信号的积累；也可以根据cRNA扩增子的序列设计，在图中(5)-(6)和(9)-(10)中与cDNA单链杂交并通过逆转录酶产生检测用荧光信号的积累。为了提高检测反应的特异性和灵敏度，也可同时将两种探针都加入检测体系，只需在探针设计时将两种探针的序列位置错开即可，防止它们在同一体系中互补而形成二聚体。此外，两种探针若同时使用，其5’荧光标记基团在必要时也可彼此不同，以便在检测时相互区分。 

具体实施方式

实施例1：细菌rRNA样品的QDIA检测方法 

以下介绍通过本发明来鉴别细菌，以铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(亦称绿脓杆菌)的检测为例。将含有绿脓杆菌的临床标本处理得到细菌悬液，或直接从绿脓杆菌培养物得到菌悬液；加入细菌裂解液释放细菌RNA(细菌裂解液中将会有大量的细菌rRNA)，或是按107细菌细胞/mL Trizol的量进行细菌RNA抽提，得到RNA样品。配制13μL反应体系缓冲液[40mM Tris-HCl(pH8.5)，42mM KCl，15mM MgCl₂，1mM dNTPs，2mM NTPs，10mM DTT，15％(v/v)DMSO]。首先在缓冲液中加入0.2μM绿脓杆菌23S rRNA引物1(带有T7 RNA聚合酶启动子识别序列)、0.2μM绿脓杆菌23S rRNA引物2、100nM TaqMan荧光探针(此探针针对绿脓杆菌23S rRNA序列设计，在其5’末端标记FAM荧光基团，起到报告基团作用，当然也可以是其他荧光基团；3’末端标记TAMRA淬灭荧光基团，起到淬灭荧光基团作用)和2μL RNA样本液，混匀后置于65℃作用15分钟，然后将反应管置于40℃水浴，加入酶混合液(包括50U MMLV逆转录酶，40UT7 RNA聚合酶，0.2U RNase H，20U RNasin Inhibitor和2.6μg BSA，补足反应体系至25μL)，混匀反应液，孵育2小时。冰浴终止反应后将反应物置于荧光检测仪中，根据所用报告基团选取适当滤光片，检测荧光强 度。如果反应管中的荧光强度与空白对照的比值达到一定数值(如5倍以上)，则可确定特异性荧光探针与RNA等温扩增产物进行了特异性杂交，证明了绿脓杆菌的存在。同时，根据RNA模板阳性对照经过同样反应条件得到的荧光强度与RNA标准量之间的标准曲线，可推导出样品中绿脓杆菌初始的RNA样本量，从而完成绿脓杆菌的定量检测。 

通过检测细菌16S或23SrRNA来鉴别细菌已是一种十分常见的方法，但已有技术是采用PCR方法检测细菌rDNA为主。本发明采用细菌23SrRNA保守区段扩增与特异性探针结合的方法，定量检测细菌。检测中所使用的引物对是针对细菌23SrRNA保守区段设计的引物2和带有RNA聚合酶启动子识别序列的引物1。从RNA的检测入手，通过本发明方法鉴定细菌，尤其是从临床样本中检测细菌，将具有很大的实际意义。样品中的细菌在不增菌以前，数量很低，不宜检测。细菌中的RNA拷贝数要比基因组DNA大，因此对RNA进行检测，在第一步就增加了检出几率，同时又结合等温扩增，将RNA量增加，然后用定量手段检测。本发明同样可应用于临床中对其他一些病原微生物的快速检测，比如结核杆菌、梅毒螺旋体等等。此外，在食品安全检测中，还可对大肠杆菌、李斯特杆菌、沙门氏杆菌、病毒及其他非细胞型微生物等常见病原体进行定量检测。 

实施例2：真核细胞mRNA样品的QDIA检测方法 

以下介绍通过本发明来对人癌症特定基因对应的mRNA量进行检测。用美国Invitrogen公司生产的FastTrack mRNA提取试剂盒从人HeLa细胞悬液中提取mRNA样本。配制25μL反应体系混合液(其包括13μL反应缓冲液[50mM Tris-HCl(pH8.3)，80mM KCl，12mM MgCl₂，2mM dNTPs，4mM NTPs，6mM DTT，10％(v/v)DMSO]，引物1和引物2各250nM，TaqMan荧光探针120nM[此探针针对人癌症相关基因设计，在其5’末端标记VIC荧光基团，起到报告基团作用，当然也可以是其他荧光基团，3’末端标记NFQ-MGB基团(非荧光淬灭剂与MGB基团的复合物)]，3μL RNA样本液， 酶混合液[3μg BSA，40U MMLV逆转录酶，2000U T7 RNA聚合酶，0.1U RNaseH，15U RNasin Inhibitor])。将反应体系在62℃作用10分钟，然后转入42℃水浴孵育1小时，然后将反应物置于荧光检测仪中，根据所用报告基团选取适当滤光片，检测荧光强度。方法与例1相同，推导出样品中人HeLa细胞初始的RNA样品量，从而完成人癌症基因mRNA的定量检测。 

本方法可应用于真核细胞基因表达量的研究。检测对象为真核细胞mRNA，所选用的引物为随机引物和带有RNA聚合酶启动子识别序列的Oligo-dT，然后结合针对特定基因所设计的TaqMan荧光探针，对该基因对应的mRNA量进行检测，从而达到基因表达量检测的目的。本实例中采用高浓度T7 RNA聚合酶目的有二：一来提高cRNA产量，二来提高荧光探针检测效率。 

实施例3：DNA样品的QDIA检测方法 

当DNA样品需要采用本发明方法进行检测时，需从待测样品中分离出DNA。分离的方法可采用加热、酶解或化学抽提的方法。将DNA样品与上游引物(带有SP6 RNA聚合酶启动子识别序列)和下游引物混合，在95℃使DNA双链变性，然后在65℃使引物与DNA退火，并在Taq DNA聚合酶参与下进行链延伸反应，从而得到上游带有SP6 RNA聚合酶启动子识别序列的DNA双链，在SP6 RNA聚合酶作用下形成正链RNA，这便得到后续等温扩增的RNA样本。预先配制50μL反应体系混合液，其包括32mM Tris-HCl(pH8.5)，50mM KCl，10mM MgCl₂，3mM dNTPs，6mM NTPs，8mM DTT，6％(v/v)DMSO，引物1和引物2各0.3μM，TaqMan荧光探针A 80nM(此探针针对人癌症相关基因设计，在其5’末端标记TET荧光基团，起到报告基团作用，3’末端标记DABCYL基团，起到淬灭荧光基团作用)，TaqMan荧光探针B75nM(此探针针对人癌症相关基因设计，在其5’末端标记ROX荧光基团，3’末端标记DABCYL基团)，RNA样本液2μL，酶混合液(1μg BSA，60U MMLV逆转录酶，50U T3 RNA聚合酶，0.2U RNase H，40U RNasin Inhibitor)。将不含酶混合液的反应体系在68℃作用5分钟，然后转入41℃水浴孵育1.5小时，然后将反应物置于荧光检测仪中，根据所用报告基团选取适当的滤光片，检测荧光强度。方法与例1相同，推导出样品中待的RNA样本量，然后通过DNA样品转录为RNA过程中两种核酸之间的数量关系，可推算出待测的DNA样品数量。 

本方法针对DNA样品进行QDIA检测的情况而设计，与实例1、2中所不同的是，在QDIA检测之前，有一步用RNA聚合酶启动子序列对DNA进行修饰的过程，接着通过转录作用，将DNA样品转化为RNA样品。所使用的QDIA引物可针对核酸样品来源而选择。此外，采用两个荧光探针同时进行特异性定量检测，探针A针对RNA模板序列设计，探针B针对cRNA扩增子序列设计，两探针在5’端的荧光标记基团不同，检测结果中的荧光信号可彼此区分。 

实施例4：组织中RNA样品的QDIA检测方法 

以下将介绍通过QDIA方法来对动物组织中相应RNA进行检测。在小鼠组织中按50-100mg/ml比例加入TRIZOL试剂进行处理，按照TRIZOL试剂盒说明，释放细胞中的总RNA，得到检测中所需的RNA样本。配制25μL反应体系混合液(其包括13μL反应缓冲液[55mM Tris-HCl(pH8.6)，70mM KCl，12mM MgCl₂，4mM dNTPs，8mM NTPs，5mM DTT，15％(v/v)DMSO]，引物1和引物2各0.6μM，TaqMan荧光探针120nM[此探针针对小鼠相关基因设计，在其5’末端标记VIC荧光基团，起到报告基团作用，当然也可以是其他荧光基团，3’末端标记NFQ-MGB基团(非荧光淬灭剂与MGB基团的复合物)]，1.5μL RNA样本液，酶混合液[38U禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶，1000U SP6 RNA聚合酶，0.15U RNase H，28U RNasin Inhibitor，0.5μg BSA])。将反应体系在58℃作用20分钟，然后转入38℃水浴孵育2小时，然后将反应物置于荧光检测仪中，根据所用报告基团选取适当滤光片，检测荧光强度。方法与例1相同，推导出样品中人HeLa细胞初始 的RNA样品量，从而完成人癌症基因mRNA的定量检测。 

本方法可应用于动物组织特定基因及表达量的检测分析。检测对象为动物组织中的RNA，选用的QDIA引物为随机引物和带有RNA聚合酶启动子识别序列的OlIgo-dT，然后结合针对特定基因所设计的TaqMan荧光探针，对该基因及表达量进行检测分析。 

本发明中所涉及的主要试剂说明： 

MMLV(鼠白血病病毒)逆转录酶(美国Epicentre公司生产) 

AMV(禽成髓细胞瘤病毒)逆转录酶(美国Seikagaku America公司生产) 

RNase H(核糖核酸酶H)(美国Invitrogen公司生产) 

T7 RNA聚合酶(美国Epicentre公司生产) 

SP6 RNA聚合酶(美国Epicentre公司生产) 

T3 RNA聚合酶(美国Epicentre公司生产) 

Tris-HCl缓冲液(实验室配制) 

DTT(二硫苏糖醇)(美国Epicentre公司生产) 

DMSO(二甲基亚砜)(美国Sigma公司生产) 

BSA(小牛血清白蛋白)(美国Sigma公司生产) 

dNTPs(脱氧核苷三磷酸混合液)(美国Invitrogen公司生产) 

NTPs(核苷三磷酸混合液)(美国Epicentre公司生产) 

RNasin Inhibitor(RNA酶抑制剂)(美国Amersham Pharmacia公司生产) 

TaqMan荧光探针(宝生物工程(大连)有限公司) 

引物1(带有RNA聚合酶启动子识别序列)(宝生物工程(大连)有限公司合成) 

引物2(宝生物工程(大连)有限公司合成) 

RNA标准样品(实验室自行合成) 

TRIZOL试剂(美国Invitrogen公司生产) 

FastTrack mRNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司生产) 

Taq DNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司) 

Claims (3)

1.一种核酸等温扩增定量检测方法，采用有逆转录-转录原理，其扩增检测对象是从样品中得到待检RNA样本，样品为细胞、组织或是微生物、或是已获取DNA的任一种；其特征在于，RNA样本的等温扩增定量检测，是采用逆转录酶和RNA聚合酶把等温扩增与TaqMan荧光探针检测结合，在对RNA样本等温扩增的同时实现检测用荧光信号的积累，其是在同一反应体系中完成；所述的逆转录酶为MMLV逆转录酶；所述的等温扩增定量检测的具体操作为：将待检测RNA样本置入反应检测液，在60-70℃条件下反应5-20分钟，再转入38-42℃条件下反应1-2小时，然后用荧光检测仪检测；其中反应检测液由引物、TaqMan荧光探针、反应缓冲液和酶混合液组成；

其中，所述的反应缓冲液各组分的终浓度为：25-60mM Tris-HCl，30-90mM KCl，10-20mM MgCl₂，0.5-5mM脱氧核苷三磷酸，1-10mM核苷三磷酸，4-20mM二硫苏糖醇，10-20％体积比的二甲基亚砜；所述的引物终浓度为：带有RNA酶启动子识别序列的引物1为0.1-1μM，带有第二链CDNA合成引物的引物2为0.1-1μM；所述的酶混合液各组分在25μL反应液中的量为：4-75U逆转录酶，8-3000U RNA聚合酶，0.05-0.3U核糖核酸酶H，10-50U RNA酶抑制剂和0.05-5μg小牛血清蛋白；所述的TaqMan荧光探针终浓度为50-200nM。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的反应缓冲液各组分的终浓度为：30-50mM Tris-HCl，42-84mM KCl，10-15mM MgCl₂，1-4mM脱氧核苷三磷酸，2-8mM核苷三磷酸，5-10mM二硫苏糖醇，10 --15％体积比的二甲基亚砜；所述的酶混合液各组分在25μL反应液中的量为：40-60U MMLV逆转录酶，10-2000U T7RNA聚合酶或10-2000U SP6RNA聚合酶或10-50UT3RNA聚合酶，0.1-0.2U核糖核酸酶H，15-45URNA酶抑制剂和0.1-3μg小牛血清蛋白；所述的TaqMan荧光探针终浓度为80-150nM。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的酶混合液是在RNA样本和反应缓冲液经60-70℃处理后加入，再进行38-42℃的扩增检测反应。 

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