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CN1646699A - 确定病人相关的龋齿的风险 - Google Patents

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CN1646699A CN02805302.8A CN02805302A CN1646699A CN 1646699 A CN1646699 A CN 1646699A CN 02805302 A CN02805302 A CN 02805302A CN 1646699 A CN1646699 A CN 1646699A
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Abstract

本发明涉及通过确定唾液中乳酸和/或乳酸盐来确定病人相关的龋齿的风险的方法，以及用于局部明确确定病人相关的龋齿的风险的方法。

Description

确定病人相关的龋齿的风险
本发明涉及适于通过测定乳酸和/或乳酸盐来确定病人相关的龋齿的风险的试验。
已有技术
龋齿是传染性疾病。最常提到的病原有机体包括链球菌spp.和乳酸杆菌。其中，导致龋齿的微生物具有相同点，即它们吸收并发酵糖类，例如食物中的糖类，以及分泌酸作为新陈代谢最终产物的。
原则上，必需区分唾液中由微生物引起的酸释放和牙斑中的酸释放，这是因为牙齿的龋齿损伤按照推理是附着在牙齿表面的微生物形成的酸所导致的，在下文中也称为牙斑。在牙齿表面处环境的局部酸化导致羟基磷灰石溶解，并因此在化学上导致龋齿损伤的形成。
牙斑酸化的速度及其酸化的强烈程度取决于唾液的缓冲能力、牙斑液的缓冲能力、微生物的生长(Coogan，M.M.，Motlekar，H.B.Journal of the Dentalassociation of South Africa 51，823-827(1996))以及在牙斑中的扩散过程(Dawes，C.，Dibdin，G.H.Journal Dental Research 65，89-94(1986))等。
这种生理学、微生物学和化学因素复杂的相互影响引起牙斑中潜伏的龋齿。这些因素以患者之间各不相同地存在。
现代牙科学的一个目的是将患者区分为各种的风险人群。在龋齿损伤出现之前，早期认识到龋齿的风险是有利的。
由于为了达到诊断的目的，必须获得大量的个人样品并进行分析，因此不可能使用牙斑分析来确定病人患上龋齿的风险，使之在实践中为人所接受。这种试验费力且太昂贵，其操作太复杂。
作为牙斑试验的替换方法，可以通过测试唾液来尝试确定病人患上龋齿的风险。因此，假设唾液中链球菌突变异种和/或乳酸杆菌的可计量的量和牙斑中链球菌突变异种和/或乳酸杆菌的量相关，因此就可以使用唾液试验来推断龋齿对患者的风险。
可以使用各种方法来测定唾液中导致龋齿的微生物，如链球菌突变异种和/或乳酸杆菌。
1.通常将样品在合适的培养基介质中孵化若干天之后，来测定导致龋齿的微生物，这是因为最初存在的微生物量并不足以直接获得结果。在持续几小时到几天的时间内繁殖所述微生物之后，计算集落形成单位(CFU)，并推断样品中存在的微生物数目(Kneist，S.；Klein，C.；Rupf，S.；Eschrich，K.Quintessenz(1999)50-33-43)。
其缺点是：唾液中引起龋齿的微生物数量和龋齿风险之间的关联并不是太满意，这是因为关键在于其新陈代谢活性，而不是微生物的数量。而且，样品的孵化会导致形成病原微生物培养基，它必须采取合适的预防措施，来使实践中的风险最小。需要特殊的排放。除了那些缺点之外，所述要求达到微生物诊断的孵化方法昂贵，且很费时。
免疫学方法是确定唾液中导致龋齿微生物的另一途径。在这种情况下，使用针对待测定微生物表面结构的单克隆或多克隆抗体。
相比部分1中的孵化方法，这些免疫学方法更加专一、更快且更廉价，但是就可重复性来说具有明显的缺点(Kneist，S.；Klein，C.；Rupf，S.；Eschrich，K.Quintessenz(1999)50-33-43)。例如，唾液不仅包含活的微生物，而且还包含显著量死去的微生物。在患者之间，死的和活的微生物之间的比率各不相同。事实是抗体并不能区分活的微生物和死的微生物，这意味着当推断所评价的微生物现有的致病潜力时存在不可预测的偏差范围(Aass，A.M.；Preus，H.R.Zambon，J.J.，Gjermo，P.Scand J.Dent Res(1994)102，355-360)。而且，唾液中引起龋齿的微生物的数量和龋齿的风险之间的关联并不能令人满意，这是因为关键在于其新陈代谢的活性，而不是微生物的量，这一点在这种情况下也是存在的。
具有最高灵敏度的方法是以聚合酶链反应(PCR)技术为基础。可以以高特异性程度探测微量的微生物。所述PCR技术费时，复杂、昂贵且不易掌握(Rupf，S.，Kneist S.，Merte，K.，Eschrich，K.Eur.J.Oral.Sci(1990)107，75-81)。在这种情况下，也必须作出不能区分活的和死的微生物的保留。而且，唾液中引起龋齿的微生物量和龋齿风险之间的关联的另一保留并不能令人满意，这是因为关键在于其新陈代谢的活性，而不是微生物的量，这一点在这种情况下也是存在的。
所有为了确定龋齿的风险而测定唾液中引起龋齿的微生物量的方法存在严重的缺点，即不能获得所需的发现-病人患上龋齿的风险-这是因为不能从唾液中存在的引起龋齿的微生物的量来推断牙斑中龋齿潜在可能性。
由于患者之间唾液的组成各不相同，并对存在微生物的新陈代谢能力有影响(Minah，G.E.McEnery，M.C.，Flores，J.A.Archivs Oral Biol.(1986)31，633-638)，因此推荐除了测定引起龋齿的微生物的量以外，也要研究由糖产生的患者唾液的酸化作用。pH的降低是由于微生物的酸释放，且看作是唾液中微生物的新陈代谢活性的量度。但是，所观察的唾液pH值降低取决于患者唾液的缓冲能力的水平。因此，建议为了确定病人患上龋齿的风险，唾液的缓冲能力也应和引起龋齿的微生物量和唾液中pH的测量结合起来考虑。
但是，临床经验显示，即使结合了链球菌突变异种/乳酸杆菌的量、pH测定和缓冲能力，也不能提供龋齿和患者有关风险的可靠发现(Kleinfelder andKirchner“Die diagnostische Sicherheit biologischer Speicheltests zurBestimmung des individullen Kariesrisiko”[“用于龋齿个体风险确定的生物学唾液试验的诊断可靠性”]Dtsch.Zahnarztliche Zeitschrift(1993)48，646-648)。
说明书US-A-3,332,743和EP-A-0097904叙述了从唾液中微生物的新陈代谢活性来推断病人患上龋齿的风险的另一尝试。观察唾液将刃天青还原成试卤灵的能力，所述微生物的新陈代谢活性认为和试卤灵形成的速度有关。从试卤灵形成的速度可以推断出病人患上龋齿的风险。刃天青还原成试卤灵是由微生物脱氢酶引起的。不仅是链球菌突变异种和乳酸杆菌具有能将刃天青还原成试卤灵的脱氢酶。因此，使用刃天青/试卤灵试验作为用于微生物生存能力的一般试验，因此并不是专门用于通过酸释放引起口腔环境酸化的龋齿的病原体，并不能用于确定病人患上龋齿的风险。
如文献中所述的，用于确定引起龋齿的微生物的新陈代谢活性的另一可能性是酸释放，例如蚁酸、乙酸、丙酸和乳酸；所述微生物会损害牙齿的坚硬物质。哪一种酸和损害牙齿坚硬物质密切相关取决于例如营养物的供应。若存在足够的葡萄糖，优先的是链球菌分泌出乳酸，但是当葡萄糖的供应受限制时，优先形成乙酸、丙酸和蚁酸。
专利说明书US-A-4,351,899和US-A-4,254,222说明了用于生物体液，尤其是血液中乳酸的酶测定方法。由于脱氢酶引起的乳酸酶还原，除丙酮酸盐以外形成了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。NADH随后使用氧化还原指示剂，宜为-+生物和吩嗪衍生物来确定。将这种方法移植到唾液可以成为用于测定龋齿微生物新陈代谢活性，并因此确定龋齿风险的快速简单的方法。但是在那些说明书中所述的方法不能用在唾液的情况，这是因为在唾液中存在的副反应严重歪曲了氧化还原反应所产生的信号。即使没有加入检测反应所需的脱氢酶，所述氧化还原指示剂被唾液组分和NAD还原，并产生不是由唾液中乳酸盐存在所引起的信号。
问题
因此，本发明的问题是提供能评估目前病人患上龋齿的风险的方法，在所述方法中，避免了已有技术中已知的缺点。
解决方案
令人惊奇地发现，龋齿风险增大的患者可以通过本发明方法所用的试验来进行确定。
综合这种试验和例如DE-A-19926728中所述的那些诊断性的牙齿印模也在本发明的范围内。通过那种方式，不管他们在唾液中或舌头上出现龋齿风险的事实，可以区分那些其牙齿上没有会导致龋齿风险的牙斑的患者和那些确实具有实际风险的患者。
而且，本发明的优点在于可以清晰地确定患者中龋齿的风险，确定合适的定向的药物处理，并避免过度和过轻的治疗。
再者，本发明的优点是使用唾液试验，可以确定在开始治疗时，例如在学校和幼儿园中团队预防时是否需要进行进一步的研究，例如诊断性的牙齿印模。而且，其优点是可以简单地监控治疗的过程。
表述“龋齿的风险”在本发明中可以理解为患龋齿的患者基本风险，以及取决于天数和饮食习惯的风险。为了确定受口腔菌丛基本组成控制的基本风险，在使用本发明方法之前，患者应进行简单的清洁处理，如漱口和/或牙齿清洁，宜为牙齿清洁。当确定取决于天数和饮食习惯的风险时，并不是必须进行清洁处理，但是本发明方法的优选实施方案仍然要进行。
说明书中，表述“包含”和“包括”是指非排他性的列举。
本发明所用的唾液试验是如下令人惊奇的发现为基础的：为了符合合适的预防条件，乳酸的形成明显适于作为用于确定主要的病人相关的龋齿的风险的微生物新陈代谢活性的测量方法，并可以通过乳酸的量化和半量化来确定。
在本发明中，表述“乳酸盐”被认为是L(+)-乳酸盐，而表述“乳酸盐脱氢酶(LDH)认为是L(+)-乳酸盐脱氢酶。
为了检测乳酸，原则上可以包括产生可检测信号的化学、生物化学或者物理学反应。
令人惊奇的是，发现氧化还原抑制剂和唾液组分之间不适宜的副反应可以通过保持乳酸盐脱氢酶、唾液和抑制剂即丙酮酸盐之间的量比率来抑制。这一发现令人惊奇的原因是丙酮酸盐是已知的乳酸脱氢酶抑制剂(见例如Williams，R.A.，Uritani，I.，J.Biochem.1193-1201(1977))。对本领域的那些技术人员来说，与技术讲解相反，为了能将非特异性的唾液的副反应抑制在可以通过乳酸盐脱氢酶和氧化还原抑制剂对乳酸进行酶测定的范围内，测量酶(在这个情况中是乳酸盐脱氢酶)必须在抑制剂存在下使用。这是一个不可预见的解决方法。表述“丙酮酸盐”认为是丙酮酸或其盐，尤其是其Na或K盐。
为了借助乳酸盐脱氢酶来酶测定唾液中的乳酸，必须保持唾液和乳酸盐脱氢酶之间合适的量比率，所述脱氢酶可以从例如细菌宜为乳酸杆菌、链球菌或者葡萄球菌，从动物宜为猪、牛类、鸡或者兔子，从植物或者从人类组织如胎盘中获得。每0.1ml唾液应使用0.001-100单位的乳酸盐脱氢酶，宜为0.01-10单位乳酸盐脱氢酶，更好是0.05-1单位乳酸盐脱氢酶。
此外，丙酮酸盐的浓度应为0.001-5微摩尔每0.1ml唾液，宜为0.01-2.5微摩尔每0.1ml唾液，更好是0.01-1微摩尔每0.1ml唾液。
1单位乳酸盐脱氢酶应认为是每毫克蛋白质每分钟转化1微摩尔丙酮酸盐。
作为例子，本发明可以使用以下所述的氧化还原指示剂：亚甲基蓝、氯化5-氰基-2，3-二甲苯基-四唑鎓(CTC)、氯化2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓(INT)、8-二甲氨基-2，3-苯并吩噁嗪(Meldola’s蓝)、1-甲氧基-吩嗪甲基硫酸盐(MPMS)、5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4，5-二甲基噻唑基)-3-(4-磺基苯基)-四唑鎓(MTS)、溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓(MTT)、氯化3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-联苯基)-二[2-(4-硝基苯基-5-苯基)]-2H-四唑鎓(NBT)、硝基-四唑鎓紫罗兰(NTV)、吩嗪甲基硫酸盐(PMS)、3’-[1-[(苯基氨基)羰基]-3，4-四唑鎓]二(4-甲氧基-6-硝基)-苯磺酸钠(XTT)、吩嗪乙基硫酸盐(PES、WST-1)。
优选Meldola’s蓝、PES、PMS、MTS、MTT和XTT；尤其优选PES、PMS、MTS和MTT。
在试验混合物中氧化还原指示剂的浓度为0.001-10mmol/l，宜为0.01-5mmol/l，更加宜为0.05-2mmol/l。
根据需要，在试验中所述氧化还原指示剂可以以固体形式使用，例如，粉末、颗粒或者片剂。
本发明中，宜以非限制和非抑制量使用NAD，例如，以整个试验混合物计，其量例如为0.01-10mmol/l，宜为0.05-5mmol/l，更加宜为0.1-1mmol/l。
根据需要，在试验中NAD可以以固体形式使用，例如，粉末、颗粒或者片剂。
来自细菌、动物和植物的乳酸盐脱氢酶具有在4.0-10.0之间的最佳pH。根据所用的乳酸盐脱氢酶，必须使用具有不同pH值的合适缓冲溶液。合适的缓冲物质如下所述：
·磷酸盐，例如磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、焦磷酸盐；
·碳酸盐，例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾；
·乙酸/乙酸盐；柠檬酸/柠檬酸盐、二乙基巴比妥酸、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸(Glygly)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基-乙基磺酸(ACES)、N-(2-乙酰氨基)亚氨基双乙酸盐(ADA)、N，N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙基磺酸(BES)、N，N-二(2-羟乙基)甘氨酸(BICINE)、2，2-二(羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)、2-(环己基氨基)乙基磺酸(CHES)、2-[4-(2-羟乙基-1-哌嗪)]乙基磺酸(HEPES)、3-[4-(2-羟乙基-1-哌嗪基)]-丙基磺酸(HEPPS)、2-吗啉代乙基磺酸(MES)、3-吗啉代丙基磺酸(MOPS)、哌嗪-1，4-二(2-乙基磺酸)(PIPES)、N-[三(羟甲基)-甲基]-2-氨基乙基磺酸(TES)、N-三(羟甲基)-甲基]甘氨酸(TRICINE)。
优选磷酸缓冲剂、Tris缓冲剂、Glygly缓冲剂和乙酸/乙酸盐缓冲剂。
根据所述检测反应，要求pH值在1-12之间。所述缓冲剂的浓度根据需要可以为0.001-5.0mol/l，宜为0.01-1.0mol/l，最好为0.1-0.5mol/l。
根据需要，在所述试验中使用限定量的固体形式如粉末或者片剂形式的缓冲物质来实现对反应溶液的pH调节。按需要，缓冲物质也可以以液体形式用于所述试验中。
缓冲物质、氧化还原指示剂、NAD和乳酸盐脱氢酶以及其它生产助剂可以作为固体形式的混合或者作为固体和液体形式的混合形式，例如作为1mg-20g、宜为10mg-10g、更好是50mg-5g、更加适宜是100mg-1g的粉末，或者呈片剂形式，例如1-20片，宜为2-10片，更好是3-5片加入。所述片剂的重量例如可以为1mg-2g、宜为10mg-1.5g、很好是100mg-1g。
生产助剂认为是例如来自草药化学的助剂，例如葡聚糖、糖、氧化铝、玻璃、石英、纤维素衍生物、腊、脂肪和盐。
也可以将缓冲物质、氧化还原指示剂、NAD和乳酸盐脱氢酶以液体状加入唾液样品中，若它们为液体时，可以直接加入其中，或者预先溶解在溶剂如水、乙醇或者丙醇中。可以使用0.001-20ml、宜为0.01-10ml、很适宜的是0.1-1ml的体积。
在例如限定时间间隔为0.01-60分钟、宜为0.1-30分钟，更好是1-10分钟之后评估所述可检测的信号，或者终止待测代谢产物形成和/或可检测信号产生的情况下，以平行连续工艺进行检测乳酸的形成和可检测信号的产生。
为了终止的目的，可以考虑例如停止反应试剂如抑制剂(例如磷酸盐)或者突然改变pH，例如通过盐酸或氢氧化钠溶液来抑制的例子；或者加入蛋白酶类或表面活性剂。
在例如限定时间间隔为0.01-60分钟、宜为0.1-30分钟，更好是1-10分钟之后终止乳酸形成的情况下，所述乳酸的形成也可以在独立孵化步骤中进行。
为了终止的目的，可以考虑例如停止加入反应试剂(如上所述)、或者将样品的温度加热至50-100℃，或者停止加入反应试剂和升高温度相结合。
为了终止微生物形成乳酸，可以使用各种方法，例如
·用高能光如UV进行照射
·放射性处理
·热处理
·pH变化，例如通过加入酸或碱
·加入表面活性剂
·加入抑制剂，如重金属盐、烷化剂
·加入杀死微生物的物质，例如溶菌酶、三氯生、洗必太、滔罗定(taurolidine)
·除去所研究唾液样品中的微生物，例如使用消毒滤网的超滤、微滤或者离心分离或者两种或多种方法的组合。
为了进行本发明的试验，例如将0.001-20ml、宜为0.01-10ml，更好为0.1-1ml的唾液转移到反应容器中。通常，所用唾液的量必须至少足够用于获得及为产生信号的添加剂的结果的可检测的信号，来进行乳酸盐测定。
有利的是，也可以将来自口腔区域的微生物通过机械作用转移到唾液中，然后将唾液样品转移到反应容器中。例如，使用合适的器具如压舌板或者刮刀从其上释放舌头的舌层，仅在此后取出所述样品。
也可以将借助合适取样器具从口腔合适位置获得的微生物样本，而不是直接的唾液样本，并对该样本而不是唾液进行本发明的基本方法。在这种情况下，优选从0.01-25cm2，宜为0.1-10cm2，更好是1-5cm2的舌头区域借助棉签、药签或者其它吸收材料和器具取出舌头上的舌层(coating)。通常，所述舌头涂层必须从舌头区域上取出，其量必须至少足够用于获得作为产生信号的添加剂的结果的可检测的信号，来进行乳酸盐测定。
有利的是，为了使患者有关的患者唾液中的可检测信号标准化，往唾液中加入最大可能形成乳酸的物质，例如糖、宜为蔗糖和葡萄糖。这些物质可以以固体或液体的形式或者固体和液体的混合形式加入。
在唾液取样或者取出舌头舌层之前，例如可以用糖溶液如含糖量为0.1-70％，宜为1-50％，更好是5-30％的葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖和麦芽糖水溶液漱口。
其它优点是可以往唾液样品本身加入到达0.1-70％糖，1-50％糖，宜为5-30％糖饱和度的糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖和麦芽糖。
也可以在唾液取样和取出舌头舌层之前，将0.1-10g，宜为0.5-5g，更好是1-2g呈例如立方糖、粉末糖或糖片形式的糖溶解在口腔中。
为了使用棉签、药签或其它吸收材料取出舌头舌层，有利的是用包含0.1-70％糖，宜为1-50％糖，更好是5-30％糖的溶液浸泡后者，并在干燥之后再使用。
在本发明方法的其它优选实施方案中，例如用于取出舌头舌层的棉签、药签或者其它吸收材料可以包含一种或多种诊断组分，例如上文所述的蔗糖、NAD、MTP、PMS、LDH或者丙酮酸盐。其中，优选使用本文所述的NAD。
在一个特别优选的实施方案中，用于取出舌头舌层的棉签、药签或其它吸收材包含上述的至少一种糖的溶液和至少一种诊断组分，如NAD。
如DE 29714246U中所述的，实际上本发明可以例如以气泡包装的形式获得。这种表达方式允许本发明的方法以尤其简单的方式进行。
本发明也涉及使用诊断印模混合物位置特异(location-specific)确定病人相关的龋齿的风险的方法。
在这种情况下，首先通过上述本发明的方法确定病人相关的龋齿的风险，如果是正风险，使用诊断印模混合物从至少一个颚区域，例如上颚和/或下颚取出印模。
合适的诊断印模混合物是例如来自DE-A-19926728的那些，尤其是藻酸盐、聚醚、聚硅氧烷或者聚醚-聚硅氧烷基的化合物。这种化合物是可以硬化的，或者形成薄膜的载体材料，它们包含0.0001-10重量％优选量用于位置特异和物质特异口内诊断的添加剂。根据该说明书，合适的诊断添加剂是染料指示剂、抗体、酶和那些熟知诊断试验体系发展的技术人员熟悉的任何其它物质。
在完全硬化的印模材料中，这种模化合物呈现可检测信号，例如在存在龋齿增大风险的位置出现颜色。为此，选择使用促进龋齿微生物的代谢产物作为所用检测方法中的活性种类。
在这种情况下，可以使用例如预制的诊断印模混合物。但是，也可以使用其它常规的印模混合物，进行治疗的人通过加入有诊断效果的物质可以将其转化成具有诊断功能的印模混合物。
以下，通过实施例更加详细地说明本发明，但本发明并不局限于此。
实施例
应用实施例1
为了混合产生信号的溶液，使用吸液管将0.1mlNAD溶液(30mmol/l原液NAD在50mmol/lGlygly缓冲液中，pH9.0)0.1mlMTT(1.5mmol/l原液MTT在50mmol/lGlygly缓冲液中，pH9.0)、0.1ml PMS溶液(1.0mmol/l原液PMS在50mmol/lGlygly缓冲液中，pH9.0)、0.1mlLDH溶液(60单位/ml原液乳酸盐脱氢酶(LDH)在50mmol/lGlygly缓冲液中，pH9.0)和0.1ml丙酮酸盐溶液(25mmol/l原液丙酮酸盐在50mmol/lGlygly缓冲液中，pH9.0)转移到具有螺旋封盖的塑料试验管中，关闭螺旋盖并振荡5秒。
患者从嘴中收集唾液，并将至少lml唾液转移到具有螺旋封盖的5ml塑料试验管中。使用吸液管，将0.6ml转移到已经包含0.25g蔗糖的反应容器中。用螺旋盖封闭所述反应容器，并振荡5秒。
3分钟后，将产生信号的溶液加入反应容器的唾液样品中。将所述封闭的反应容器振荡5秒。3分钟后，往反应容器中加入0.4ml乙酸溶液(在水中的1mol/l原液乙酸)来终止所述可检测信号的产生。反应过程可伴随着颜色从黄到蓝的变化来跟踪。黄色表明没有龋齿风险，且蓝色越强表明龋齿的风险越高。
在入射光波长为570nm的条件下，使用体积为1ml的塑料杯在UVIKON930分光光度计中测量消光ΔE/分钟为0.957。
对比例1a
如应用实施例1所述进行对比例1a，但是没有加入丙酮酸盐。测得消光度为3.3。
对比例1b
如应用实施例1所述进行对比例1b，但是没有加入丙酮酸盐和LDH。测得消光度为0.815。
对比例1c
如应用实施例1所述进行对比例1c，但是没有加入LDH。测得消光度为0.156。
对比例1a-1c以及应用实施例1表明即使丙酮酸盐确实抑制LDH(对比例1a)，由丙酮酸盐产生的抑制作用通过增大LDH的加入量(对比例1b)过补偿，不过抑制了一种或多种未知的副反应(对比例1c)。
应用实施例2
为了混合产生信号的溶液，使用吸液管将0.1mlNAD溶液(30mmol/l原液NAD在50mmol/lGlygly缓冲液中，pH9.0)、0.1mlMTT(1.5mmol/l原液MTT在50mmol/lGlygly缓冲液中，pH9.0)、0.1ml PMS溶液(1.0mmol/l原液PMS在50mmol/lGlygly缓冲液中，pH9.0)、0.1mlLDH溶液(40单位/ml原液乳酸盐脱氢酶(LDH)在50mmol/lGlygly缓冲液中，pH9.0)和0.1ml丙酮酸盐溶液(2.5mmol/l原液丙酮酸盐在50mmol/lGlygly缓冲液中，pH9.0)转移到具有螺旋封盖的塑料试验管中，关闭螺旋盖并振荡5秒。
使用吸液管，将100微升转移到2cm×0.6cm×0.78cm的吸收药签上，并冷冻干燥。将所述干燥的药签表面对表面地粘到聚酯带(7cm×0.6cm×0.25cm)的一端。如应用实施例1第二段所述的，在反应容器中已经预先制备了唾液样品。将所述试验带上的药签完全引入唾液样品中。3分钟之后，将所述试验带药签浸渍在包含2ml终止试剂的容器中，所述终止试剂由pH为7.5的50mmol/l磷酸氢钠溶液组成。在所述试验带上药签的蓝色越强，龋齿的风险就越高。
应用实施例3
如应用实施例2第一段所述，制备产生信号的溶液。患者允许将糖溶解在嘴中，并收集嘴中的唾液。将棉签(例如，Q-Tip)伸入嘴中，并放置5秒，使其浸渍充满唾液。将所述棉签浸泡唾液的的棉絮区域浸渍在产生信号的溶液中，并留在那里3分钟。然后评价在棉签的棉絮区域中产生的蓝色。所述蓝色越强，表明龋齿的风险越高。
应用实施例4
如应用实施例2第一段所述制备试验带。患者允许将立方糖溶解在嘴中。将所述试验带放入嘴中，并将吸收药签置于舌头的中部，并进行摩擦，从舌头上获得舌层。将所述试验带的吸收药签浸渍在产生信号的溶液中，并留在那里3分钟。然后评价在药签上产生的蓝色。所述蓝色越强，表明龋齿的风险越高。
应用实施例5
如应用实施例1-4所述的，在这种成套组件中包含用于进行所述唾液试验的成分。在袋中包含20g藻酸盐，用于诊断印模。将所述藻酸盐转移到搅拌碗(250ml)中。将根据DE-A-19926728所制备的并包含0.26g甘氨酰甘氨酸、0.24g三(羟甲基)氨基甲烷、36mgNAD、0.9mg吩嗪甲基硫酸盐、3mg溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓(MTT)和1850单位的乳酸盐脱氢酶的产生信号的溶液置于容器中，借助所述溶液可以观察到因牙斑上引起龋齿的微生物所导致的乳酸释放。将所述产生信号的溶液加入藻酸盐中。并立刻用手工刮刀混合所述混合物知道均匀(约30分钟)。同时，制备所述印模混合物，患者允许将立方糖溶解在嘴中。将所述印模混合物加入印模底座中。为了取出所述印模，将所述印模底座压在上颚或者下颚上，并留在那里3分钟。将所述印模从最终取出。牙齿上携带新陈代谢活性、会引起龋齿的微生物的位置通过印模混合物上的蓝点和蓝色区域显示出来。所述蓝色越强，表明龋齿的局部风险越高。唾液试验确定的龋齿风险可以和牙齿上存在的龋齿风险进行比较。
应用实施例6
使用DE 2971246U中的水泡。用50重量％糖溶液浸渍棉签(例如，Q-Tip)。将所述棉签置于嘴中，并在舌头中部进行摩擦和旋转，从舌头上获得舌层。将棉签引入水泡(blister)的第一储液池中。通过挤压所述第二储液池，将应用实施例2第一段所制备的产生信号的溶液流入所述第一储液池中。通过旋转所述棉签，用产生信号的溶液润湿所述具有唾液样品的区域。3分钟之后从水泡中取出所述棉签。
对比例1
制备对比例1和2，来显示在专利申请US4,351,899和US4,254,222的论述不适于确定病人患上龋齿的风险。
在专利申请US4,351,899和US4,254,222的论述中，包含0.6微摩尔乳酸盐、0.6微摩尔NAD、0.03微摩尔MTT、0.02微摩尔PMS和0.6单位乳酸盐脱氢酶的0.1mlGlygly缓冲溶液pH9.0加入100微升唾液中，并进行彻底地混合。在570nm下，使用微量板读出器(来自Molecular Device)进行反应过程。测得消光度增加为0.6/分钟。在没有唾液的对照实验中，测得消光度的改变为1.1/分钟。结果：唾液抑制信号形成所需的酶乳酸盐脱氢酶至45％。
对比例2
在专利申请US4,351,899和US4,254,222的论述中，将包含0.6微摩尔乳酸盐、0.6微摩尔NAD、0.03微摩尔MTT和0.02微摩尔PMS的0.1mlGlygly缓冲溶液pH9.0加入100微升唾液中，并进行彻底地混合。在570nm下，使用微量板读出器(来自Molecular Device)进行反应过程。即使没有乳酸盐脱氢酶的存在，测得消光度增加为0.4/分钟。在存在0.3单位乳酸盐脱氢酶的比较实验中，测得消光度的改变为1.2/分钟。结果：唾液包含其本身能还原氧化还原指示剂PMS/MTT并因此歪曲测量信号50％的组分。

Claims (9)

1.在来自口腔的样品中使用乳酸和/或乳酸盐来确定病人相关的龋齿的风险的方法，其特征在于，当样品体积为0.1ml的生物液体时，加入0.001～100单位乳酸盐脱氢酶，并加入浓度为0.001-5微摩尔每0.1样品体积的丙酮酸盐，当从0.01-25cm2的口腔表面获得的生物膜时，加入0.001-100单位乳酸盐脱氢酶，其中在上述两种情况下，以整个试验混合物计，NAD的存在浓度为0.01-10mmol/l，随后测量所产生的NADH的量。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，在至少一个口腔区域中，仅在将微生物通过机械作用转移到唾液中之后取出所述样品体积。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述口腔区域是舌头。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在进行取样之前，将引起或增加乳酸和/或乳酸盐形成，或者阻止或者妨碍不利于乳酸和/或乳酸盐的物质形成的物质加入唾液中。
5.权利要求4所述的方法，其特征在于，在进行所述检测方法之前，加入至少一种缓冲溶液。
6.权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，在从口腔中取出样品体积之后，往样品中加入丙酮酸盐。
7.用于位置特异性确定病人相关的龋齿的风险的方法，其特征在于，使用上述任一项权利要求所述的方法，随后使用诊断性印模混合物取得印模，所述混合物包含形成薄膜的载体材料和诊断物质。
8.一种成套组件，所述组件包括：
·至少一个样品管，
·至少一个吸取装置，
·至少一种缓冲物质，
·其量为0.001-100单位每0.1ml样品体积的乳酸盐脱氢酶，
·以整个试验混合物计，浓度为0.01-10mM的NAD。
9.权利要求8所述的成套组件，所述组件还包括：
·浓度为0.001-5微摩尔每0.1ml样品量的丙酮酸盐。
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