CN1418111A

CN1418111A - 新型配体及其制备方法

Info

Publication number: CN1418111A
Application number: CN01805651A
Authority: CN
Inventors: C·W·李
Original assignee: National University of Singapore
Current assignee: National University of Singapore
Priority date: 2000-01-28
Filing date: 2001-01-26
Publication date: 2003-05-14
Also published as: EP1289561A2; WO2001054731A2; AU3402001A; CA2398435A1; WO2001054731A3; AU2001234020B2; JP2003529560A; KR20020082218A; AU2001234020C1; IL150890A0; MY140005A; SG148022A1; MY137705A

Abstract

本发明公开了一种用于修饰母配体的方法，该方法通过下列步骤来进行：使所述的母配体和与该母配体所结合的靶受体的部分反应的缀合剂连接，使得在所述缀合剂与所述受体部分之间可形成共价键。本发明还公开了使用本发明的修饰配体检测受体和/或对其进行定量的组合物、探针和方法。

Description

新型配体及其制备方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2000年1月28日提交的顺序号为US 60/178,756的美国临时专利申请的优先权，将该文献的全部内容引入本文作为参考。

技术领域

本发明总的来说涉及配体-受体相互作用。本发明特别涉及与其关连受体不可逆结合的修饰配体并涉及这类配体的制备方法。本发明的新型配体特别具有用于研究蛋白质功能和作为更有效地抑制或刺激关连受体功能的药物(在健康保健、农业和环境应用中)的用途。

背景技术

药物受体是在与特异性配体结合后产生药理作用的胞内或膜结合蛋白。在这方面，药物受体具有(a)通过形成配体-受体复合物而检测配体信号和(b)传导并翻译信号而产生药理作用的双重功能。

药物可以取代内源性生理学配体与受体发生相互作用。正象配体-受体相互作用一样，这类药物-受体相互作用的先决条件是形成药物-受体复合物。与在与受体结合后刺激产生作用(受体介导的作用)的生理学配体相反，可以将药物分类成(a)激动剂或与受体结合后刺激产生作用的药物和(b)拮抗剂或与受体结合后不会刺激产生作用的药物。

对药物-受体结合而言，几种类型的分子相互作用是可能的，包括离子键、氢键和通过范德华力产生的疏水键。大部分受体相互作用同时涉及几种类型的结合。离子键对药物-受体相互作用的初始阶段而言是重要的，因为这些键具有最大或最长的范围。在最初的相互作用后，发生包括偶极-偶极键、氢键和疏水键在内的微调。尽管所有这些相互作用也使药物分子固定在受体的活性部位上，但是这种结合是可逆的，因为相互作用的力极弱。由此任何药物的药理功效通常受到其自身在血浆中的浓度的影响，因为血药浓度的降低会增加药物分子与其受体的分离。

已知几种药剂以不可逆或假不可逆的方式抑制酶且抑制作用的精确机制使抑制谱和抑制期限方面产生了细微的差异。

乙酰胆碱酯酶的许多抑制剂与这种酶发生共价反应而形成酰基酶，酰基酶比与天然底物乙酰胆碱形成的乙酰基酶的脱酰作用更为缓慢。乙酰基酶通过攻击底物上活性部位的丝氨酸而快速形成。通过四面体中间体将酰基转移到所述酶上。这种乙酰基酶快速水解，其半衰期为10μsec。这些快速酰化和脱酰化步骤产生的更新率为10⁵个底物分子/酶分子/秒。诸如毒扁豆碱和新斯的明这样的胆碱酯酶抑制剂形成甲氨基氨基甲酰基酶和二甲氨基氨基甲酰基酶，它们具有几分钟的脱酰半衰期。因此，通过给该酶提供另一种底物，可以在氨基甲酰基化剂的催化循环过程中排除对乙酰胆碱的催化。乙酰氧基和氨基甲酰氧基酯底物的相应酰化步骤的动力学常数没有显著差异；因此，氨基甲酰基酶缀合物的较长保留时间是有利抑制的重要因素。

几种其它的酶也是通过抑制剂的共价结合抑制的，从而产生不可逆性。肼类(苯乙肼、异卡波肼代谢物)和炔试剂(帕吉林)被单胺氧化酶氧化成反应中间体。这些中间体攻击酶上结合的黄素辅因子。已经将这类试剂称作自杀底物，因为催化激活它们需要的酶正好是它们使之失活的酶。因此，所述的失活过程是以机理为基础的。目前存在许多这类底物的实例，通过酶激活它们对该酶或结合的辅因子产生共价修饰。通常该过程通过使所述酶与其底物缀合或结合、随后邻基攻击而发生。几种自杀底物的靶物具有治疗意义。它们包括：具有抗菌设计的青霉素酶和丙氨酸消旋酶；用作抗癫痫药的GABA转氨酶抑制剂；分别控制白三烯和前列腺素生物合成的脂氧化酶和环加氧酶抑制剂；阻断雌激素形成的芳香酶抑制剂；作为杀寄生虫药的鸟氨酸脱羧酶抑制剂；和控制儿茶酚胺生物合成的多巴胺β-羟化酶抑制剂。许多自杀底物用作抗代谢物且是潜在的抗肿瘤药。这些抑制剂的功效不仅取决于其与那些内源性底物相比的相对离解常数或Km值，而且取决于自杀底物的代谢与失活事件之间的动力学竞争作用。

奥美拉唑(PRILOSEC)是另一种为临床应用而公开的众所周知的不可逆的结合药物。这种药物通过结合仅存在于壁细胞端膜中的H⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶来抑制胃酸分泌。奥美拉唑特别用于患高胃泌素血症的患者且可能在那些H₂拮抗剂不能充分控制其消化性溃疡病的患者中是有价值的。奥美拉唑在取代的苯并咪唑与吡啶环之间的桥上含有亚硫酰基。在中性pH下，这种药物是化学上稳定的、脂溶性的、没有抑制活性的弱碱。这种中性弱碱从血液中达到壁细胞并扩散入分泌性小管，其中药物成为质子化的且由此被俘获。质子化药物重排成次磺酸和次磺酰胺。次磺酰胺与跨膜H⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶胞外(腔)域中关键部位上的硫氢基发生共价相互作用。由此必须将奥美拉唑看作需要活化才有效的前体药物。

尽管现有几种以不可逆方式结合其靶物的药剂，但是目前仍然缺乏合理设计以不可逆方式结合靶受体的配体的可利用方法。

发明公开

本发明至少部分来源于如下令人意外的发现，即通过使缀合剂与以可逆方式结合靶受体的母配体连接，由此产生的修饰配体能够以不可逆方式结合所述的靶受体，其中所述的缀合剂与所述靶受体的部分发生反应，使得在所述缀合剂与所述部分之间可形成共价键。

因此，本发明的一个方面提供了一种用于修饰母配体的方法，该方法包括下列步骤：使所述的母配体和与所述母配体所结合的靶受体的部分反应的缀合剂连接，使得在所述缀合剂与所述部分之间可形成共价键。

合适的情况是所述缀合剂与所述母配体通过一种间隔基连接。

优选所述间隔基与所述母配体共价结合。

优选所述间隔基与所述缀合剂共价结合。

适当地所述间隔基是选自烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、氧代烷基、杂氧代烷基、链烯基、杂链烯基、芳烷基、杂芳烷基、芳基和杂芳基的基团或提供间隔基功能的任何其它分子构象。间隔基臂的长度适当选自约0-约20的范围。

优选所述的间隔基是在生理条件下不可水解的基团。

优选所述的缀合剂选自硫氢基特异性缀合剂、氨基特异性缀合剂、羧基特异性缀合剂、酪氨酸特异性缀合剂、精氨酸特异性缀合剂、组氨酸特异性缀合剂、甲硫氨酸特异性缀合剂、色氨酸特异性缀合剂和丝氨酸特异性缀合剂。

硫氢基特异性缀合剂可以选自N-顺丁烯二酰亚胺、N-顺丁烯二酰亚胺衍生物和包括、但不限于5，5′-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)、4，4′-二硫代二吡啶、甲基-3-硝基-2-吡啶基二硫化物和甲基-2-吡啶基二硫化物在内的二硫化物试剂。

氨基特异性缀合剂可以选自烷基化剂和酰化剂，其中所述的烷基化剂包括、但不限于α-卤代乙酰基化合物、芳基卤类、醛类和酮类；而所述的酰化剂包括、但不限于异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯类、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、对硝基苯基酯、酰基氯和磺酰氯。

羧基特异性缀合剂可以选自碳二亚胺类和包括、但不限于重氮基乙酸酯类和重氮基乙酰胺类的羧基酯化试剂。

酪氨酸特异性缀合剂可以选自重氮化衍生物，它们包括、但不限于联苯胺和双重氮化3，3′-二甲基联苯胺。

精氨酸特异性缀合剂可以选自1，2-二羰基试剂，它们包括、但不限于乙二醛、苯基乙二醛、2，3-丁二酮和1，2-环己二酮。

组氨酸特异性缀合剂适当地选自烷基化剂和酰化剂，其中所述的烷基化剂包括、但不限于α-卤代乙酰基化合物、芳基卤类、醛类和酮类；而所述的酰化剂包括、但不限于二乙基焦碳酸酯、乙氧基甲酸酐、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯类、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、对硝基苯基酯、酰基氯和磺酰氯。

甲硫氨酸特异性缀合剂可以选自包括、但不限于α-卤代乙酰基化合物、芳基卤类、醛类和酮类的烷基化剂。

色氨酸特异性缀合剂可以选自N-溴琥珀酰亚胺、2-羟基-5-硝基苄基溴和对硝基苯基亚磺酰基氯。

丝氨酸特异性缀合剂可以选自二异丙基氟磷酸酯和包括、但不限于苯基甲基磺酰基氟的芳基磺酰基氟类。

母配体可以是任何天然或非天然的配体，但优选它是生物活性配体，包括已知药物和天然出现的或合成的药物候选化合物。

本发明的另一个方面提供了一种通过以上大体描述的方法生产的修饰配体。

本发明的另一个方面提供了一种具有下列一般通式的修饰配体：

L-R₁-A (I)

其中L是母配体；

其中A是与所述母配体所结合的靶受体的部分有反应性的缀合剂，以致在所述缀合剂与所述部分之间可形成共价键；且

R₁是可选择的间隔基，它优选包含选自烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、氧代烷基、杂氧代烷基、链烯基、杂链烯基、芳烷基、杂芳烷基、芳基和杂芳基的不可水解的基团。

在一个优选的实施方案中，所述的修饰配体与es核苷转运蛋白和/或核苷/核苷酸/核苷碱基(nucleobase)敏感性蛋白发生相互作用，其中所述的修饰配体具有选自下组的一般通式：

其中A是N-顺丁烯二酰亚胺、2-吡啶基联硫基或卤素；X是NH、S或O；Y是H、卤素、NH₂或O；Z是H、卤素或CH₃；R₁是包含优选在生理条件下不可水解的基团的间隔基；R₂是H、β-D-核糖、β-D-2-脱氧核糖或它们的5′-一磷酸、5′二磷酸和5′三磷酸。

合适的情况是所述的修饰配体抑制所述的es核苷转运蛋白和/或核苷/核苷酸/核苷碱基敏感性蛋白且具有选自下列的通式：

其中R₄是4-[N-甲基]环己烷羧酸酯、N-[间苯甲酸酯]、4-[对苯基]丁酸酯、N-[γ-丁酸酯]、N-[α-乙酸酯]或N-[ε-己酸酯]；

其中R₅是4-羰基-α-甲基-α-甲苯、6-[α-甲基-α-甲苯甲酰氨基(tuloamido)]-己酸酯、N-[3-丙酸酯]或6-[3′-丙酰氨基]己酸酯；

和

其中R₅是4-羰基-α-甲基-α-甲苯、6-[α-甲基-α-甲苯甲酰氨基(tuloamido)]-己酸酯、N-[3-丙酸酯]或6-[3′-丙酰氨基]己酸酯。

在另一个实施方案中，可以使用与5-羟色胺受体结合的修饰配体。

在另一个方面中，本发明涉及一种包括以上大体描述的修饰配体以及药物上可接受的载体的组合物。

本发明在另一个方面中提供了一种治疗或预防与靶受体相关的疾病的方法，所述的方法包括对需要这类治疗的患者给予治疗有效剂量的以上大体描述的组合物。

本发明的另一个方面提供了一种检测测试样品中靶受体存在的方法，该方法包括下列步骤：使所述样品与以上大体描述的修饰配体接触，其中所述的修饰配体结合所述的靶受体；和检测所述接触的样品中是否存在包含所述修饰配体和所述受体的复合物。

本发明的另一个方面提供了一种对测试样品中存在的靶受体进行定量的方法，该方法包括下列步骤：使所述样品与以上大体描述的修饰配体接触，其中所述修饰配体结合所述靶受体；测定所述接触的样品中包含所述修饰配体和所述靶受体的复合物的浓度；和建立所述测定的复合物浓度与所述样品中所述受体浓度的关系。

本发明的另一个方面提供了一种检测细胞或细胞膜上靶受体的存在的方法，该方法包括下列步骤：使含有所述细胞或细胞膜的样品与以上大体描述的修饰配体接触，其中所述的修饰配体结合所述的靶受体；和检测所述接触的样品中是否存在包含所述修饰配体和所述细胞或细胞膜的复合物。

本发明的另一个方面提供了一种对细胞或细胞膜上存在的靶受体进行定量的方法，该方法包括下列步骤：使含有所述细胞或细胞膜的样品与以上大体描绘的修饰配体接触，其中所述修饰配体结合所述靶受体；测定所述接触的样品中包含所述修饰配体和所述细胞或细胞膜的复合物的浓度；和建立所述测定的复合物浓度与所述细胞或细胞膜上存在的所述受体的浓度的关系。

在另一个方面中，本发明涉及与靶受体共价结合的探针，所述的探针包含以上大体描绘的修饰配体，该修饰配体带有与之连接的报道分子。

在一个实施方案中，所述的探针包含与以上大体描绘的es核苷转运蛋白和/或核苷/核苷酸/核苷碱基敏感性蛋白发生相互作用的修饰配体。

在该方面中，所述的细胞优选是动物细胞、更优选哺乳动物细胞且更优选人体细胞。另一方面，所述细胞可以是植物细胞或微生物细胞。所述的微生物细胞包括、但不限于来源于细菌、病毒或真菌的细胞。

本发明还包括以上大体描述的修饰配体和探针特别是在研究、治疗和预防与其相应靶受体相关的疾病中的用途。

在一个实施方案中，提供了一种用于修饰母配体的方法，该方法包括下列步骤：使所述的母配体和与所述母配体所结合的靶受体的部分反应的缀合剂连接，其中当所述母配体与所述受体结合时，在所述缀合剂与所述部分之间形成共价键。

在一种优选的实施方案中，所述的缀合剂位于配体上促进和/或允许与靶受体的部分形成共价键的位置。在另一个优选的实施方案中，所述配体所结合的受体是与生物活性相关的活性部位。例如，所述受体是细胞表面受体。在一个实施方案中，修饰配体与受体的结合与靶受体改变的活性相关。

在另一个优选的实施方案中，母配体和/或受体是天然出现的。在另一个实施方案中，修饰配体并非交联剂。在另一个实施方案中，修饰配体可选地不包含诸如光标记这样的光反应基团。在另一个实施方案中，所述的修饰配体不包含标记。在另一个实施方案中，所述配体所结合的受体不是诸如RNA或DNA的核酸。在另一个实施方案中，缀合剂不与核酸的部分结合且可选地结合氨基酸残基。

在一个实施方案中，提供了一种用于修饰母配体的方法，该方法包括下列步骤：使所述的母配体和与所述母配体所结合的靶受体的部分反应的缀合剂连接，其中当所述母配体与所述受体结合时，在所述缀合剂与所述部分之间形成共价键；且其中所述的母配体与核苷转运蛋白特异性结合。

在另一个实施方案中，提供了一种用于修饰母配体的方法，该方法包括下列步骤：使所述的母配体和与所述母配体所结合的靶受体的硫氢基反应的硫氢基特异性缀合剂连接，其中当所述母配体与所述受体结合时，在所述缀合剂与所述硫氢基之间形成共价键；且其中所述的母配体与5-羟色胺受体特异性结合。

在一个实施方案中，提供了具有下列通式的修饰配体：

L-R₁-A (I)

其中L是与包括核苷转运蛋白的靶受体特异性结合的母配体；

其中A是与所述母配体所结合的靶受体的部分反应的缀合剂，以致当所述母配体与所述受体结合时，在所述缀合剂与所述部分之间形成共价键；且R₁是可选择的间隔基。

在另一个实施方案中，提供了具有下列通式的修饰配体：

L-R₁-A (I)

其中L是与靶5-羟色胺受体特异性结合的母配体；

其中A是与所述母配体所结合的所述靶受体的硫氢基反应的缀合剂，以致当所述母配体与所述受体结合时，在所述缀合剂与所述受体的所述硫氢基之间形成共价键；且R₁是可选择的间隔基。

将本文所涉及的所有专利、专利申请、公开出版物和公开的专利申请的全部公开内容引入本文作为参考。

附图简述

参照下面的附图描述以优选实施方案为例的本发明，其中：

附图1表示NEM对鼠骨髓瘤SP2/0-Ag14细胞中³H-尿苷的平衡转运的抑制作用。

附图2表示NEM对鼠骨髓瘤SP2/0-Ag14细胞中³H-NBMPR的平衡结合动力学的影响。

附图3表示合成CrMCC的一般反应流程。

附图4表示CrMCC的形成速率。

附图5表示CrMCC和NBMPR的光吸收分布。

附图6表示人HL-60白血病前髓细胞质膜中CrMCC、胞苷和SMCC对³H-NBMPR结合的抑制作用。

附图7表示CrMCC对³H-NBMPR与人HL-60白血病前髓细胞质膜结合的动力学的影响。

附图8表示CrMCC、胞苷和SMCC对HL-60细胞生长的影响。

附图9表示³H-CrMCC结合人HL-60白血病前髓细胞质膜的时间过程。

附图10表示³H-CrMCC与³H-胞苷从人HL-60白血病前髓细胞质膜的结合部位上的分离。

附图11表示³H-CrMCC结合人HL-60白血病前髓细胞质膜的浓度依赖性。

附图12表示pH对人HL-60白血病前髓细胞质膜中³H-CrMCC从其结合部位上分离的影响。

附图13表示对³H-CrMCC结合人HL-60白血病前髓细胞质膜的抑制作用。

附图14表示硫氢基活性³H-胞苷类似物与人HL-60白血病前髓细胞质膜的共价结合。

附图15表示人HL-60白血病前髓细胞质膜蛋白的反相色谱的UV吸收分布。

附图16表示人HL-60白血病前髓细胞质膜蛋白的反相色谱的放射性分布。

附图17表示硫氢基活性³H-腺苷类似物与人HL-60白血病前髓细胞质膜的共价结合。

附图18表示不同5-HT类似物对³H-5-HT结合鼠脑膜的抑制作用。

附图19a表示LBT3001(1-[2-(5-羟基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-吡咯-2，5-二酮))的化学结构。

附图19b表示合成LBT3001的反应流程。

附图20a表示LBT3002(4-(2，5-二氧代-2，5-氢-吡咯-1-基)-N-[2-(5-羟基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-丁酰胺)的化学结构。

附图20b表示合成LBT3002的反应流程。

附图21a表示LBT3004(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-N-[2-(5-羟基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-丙酰胺)的化学结构。

附图21b表示合成LBT3004的反应流程。

附图22a表示LBT3005(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基-甲基)-环己烷羧酸[2-(5-羟基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-酰胺)的化学结构。

附图22b表示合成LBT3005的反应流程。

附图23表示可以被修饰成包括缀合剂的典型配体的结构。

发明详述1.定义

除非另有说明，本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在实施和测试本发明中可以使用与本文所述的那些方法和物质相似或等同的任何方法和物质，但是所描述的是优选的方法和物质。为了本发明的目的，将下列术语定义如下。

文章中使用的“一种”指的是一种或一种以上(即至少一种)的该词的语法对象。例如，“一种成分”指的是一种成分或一种以上的成分。

所谓“结合”指的是缀合剂与配体以一定方式直接或间接的结合，以致可阻止正常生理条件下缀合剂与配体分离。因此，本文所用的术语“结合”在其范围内包括分别在缀合剂与配体之间或在插入的间隔基与缀合剂和配体之间形成的一种以上的离子键、氢键、范德华力、共价键或其组合，使得在正常生理条件下阻止了所述缀合剂与所述配体分离。

在本说明书中，除非上下文要求，术语“包含”理解为是指包括声明的步骤或成分或步骤组或成分组，但不排除任何其它步骤或成分或步骤组或成分组。

所谓“缀合剂”指的是与结合修饰配体所来源的母配体的受体的部分反应的修饰配体的部分，其中在所述缀合剂与受体部分之间可形成共价键。在这方面，所述的缀合剂自身或在有辅助缀合剂存在的情况下足以有利于与所述的受体部分共价偶联。所述的辅助偶联剂可以是催化所述缀合剂与所述受体部分之间形成共价键的酶或导致所述缀合剂与所述受体部分之间形成共价键的活化剂。

所谓“分离的”指的是这样的物质，其基本上或实质上不含通常在其天然状态时与其一起出现的成分。

本文所用的术语“配体”指的是结合靶受体、与其发生相互作用或否则与其连接的药剂。当靶受体以其天然构象的形式出现或当靶受体部分或全部解折叠或变性时，这种药剂可以结合靶受体。根据本发明，配体并非限于结合例如受体的激素结合部位这样的靶受体识别功能区的药剂。在实施本发明的过程中，配体还可以是结合靶受体的任意表面或内部序列或构象结构域的药剂。优选所述的配体是包括药物在内的影响生理功能的分子。所述配体还可以是内源性配体。

所谓“获自”指的是一种例如包含受体的提取物这样的样品分离自或来源于诸如合适的细胞或组织来源这样的特定来源，其中所述的细胞或组织来源包括人、动物、植物或微生物来源的细胞或组织。

本文所用的术语“患者”指的是任何生物体，其需要使用本发明的方法治疗或预防与受体相关的疾病。然而，可以理解的是“患者”并不意味着存在症状。患者由此可以包括微生物、植物或动物。优选所述的患者是人或其它哺乳动物且包括需要使用本发明方法检查或治疗的任何个体。属于本发明范围内的合适的哺乳动物包括、但不限于灵长类、家畜动物(例如绵羊、母牛、马、驴、猪)、实验室用试验动物(例如家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、陪伴动物(例如猫、狗)和被猎获的野生动物(例如狐狸、鹿、澳洲野犬)。

所谓“药物上可接受的载体”指的是可以安全地用于局部或全身给药的固体或液体填充剂、稀释剂或包囊物质。

本文所用的术语“药物上可接受的盐”指的是一般通过使游离碱与适宜有机酸或无机酸反应制备的本发明修饰配体的无毒性的盐。有代表性的盐包括下列盐：乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸钾、柠檬酸盐、二盐酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰阿散酸盐、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、hydrabamine、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、8-氯茶碱盐(teoclate)、甲苯磺酸盐、三乙碘化物、戊酸盐。

本文所用的术语“受体”指的是包括对一种或多种配体具有特异性的分子或一簇分子在内的结构，其中配体与受体的结合、相互作用或否则连接影响、改变受体的功能或使其失效。所述受体优选、但并不唯一地是蛋白质。有代表性的受体包括、但不限于：胰岛素受体、表皮生长因子受体、γ-氨基丁酸受体、烟碱性乙酰胆碱受体、5-羟色胺受体、α-和β-肾上腺素受体、多巴胺受体、组胺受体、前列腺素类受体、腺苷受体、环核苷酸受体、谷氨酸盐受体、细胞因子受体、心房肽受体和前列腺素受体。所述受体可以包括：转运蛋白，诸如葡萄糖、氨基酸转运蛋白、钠质子交换器、氯化物-碳酸氢盐交换器、钠泵、钙泵、质子泵；通道，诸如钠通道、钾通道、钙通道和氯离子通道；酶，诸如氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。然而，可以理解的是并非要求受体是蛋白质且受体例如可以包括核酸，其中本发明的缀合剂可以靶向腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶上发现的氨基。另一方面，该受体可以是带有可被缀合剂靶向的一个或多个羧基和/或一个或多个氨基的碳水化合物(例如含有氨基的碳水化合物，诸如氨基苯基苷类)或脂类(例如存在于某些磷脂的磷酸头部基团上)。

本说明书中使用的所谓“报道分子”指的是通过其化学性质产生使检测包括配体及其关连受体的复合物成为可能的可分析鉴定信号的分子。术语“报道分子”还扩展至诸如在乳胶殊上的红细胞等这样的细胞凝集或凝集抑制的使用。

本文所用的术语″样品″指的是可以含有本发明靶受体的任何合适的样品。可以提取、不进行处理、处理、稀释或浓缩来自任何合适来源的样品且该样品可以含有一种或多种细胞和/或细胞膜。该样品可以包含完整的细胞、变性的细胞、细胞膜或其部分。另一方面，该样品可以含有分离的受体。合适的是该样品可以包含获自组织活检的细胞。另一方面，该样品可以包含已经在体外培养的细胞或细胞系。

本文所用的术语“间隔基”指的是在空间上使缀合剂与配体分离的化学连接物、聚合物、肽等。优选地，对所述的间隔基进行选择，使得它不会干扰修饰配体与受体的结合。

就治疗与受体相关的疾病而言，所谓“治疗有效量”指的是对需要这类治疗的患者作为单一剂量或作为一系列剂量的部分给予的可有效治疗该疾病的用量。这种有效量可以根据所治疗的个体的健康和身体情况、所治疗的个体的分类群、组合物的配制、对医疗情况的评价和其它相关因素的不同而改变。预计该用量属于可以通过常规试验测定的相对较宽的范围。2.修饰配体

本发明至少部分来源于如下令人意外的发现，即缀合剂可以与母配体连接而形成与(所述母配体以可逆方式结合的)靶受体以不可逆方式结合的修饰配体。所述修饰配体与所述受体的不可逆结合是通过所述缀合剂与所述受体上存在的部分之间形成共价键来实现的，所述受体上存在的部分优选是一种或多种功能性氨基酸侧链基团(本文有时称作“官能团”)。共价键通过所述修饰配体与所述受体连接、随后通过缀合剂对邻近活性官能团攻击而形成。这种修饰配体与受体的不可逆相互作用产生对受体功能的永久抑制作用(就拮抗剂而言)或刺激作用(就兴奋剂而言)。受体的正常功能或活性仅在新受体合成后恢复。

可以修饰的母配体包括与es核苷转运蛋白和/或核苷/核苷酸/核苷碱基敏感性蛋白发生相互作用的配体。两种形式的核苷转运蛋白基于其对NBMPR(硝基苄基硫代肌苷)产生的抑制作用的敏感性来分类。参见Griffith等，《生物化学和生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)，第1286卷，153-181页(1996)。将对NBMPR敏感的转运蛋白组命名为es(平衡敏感性)并将非敏感性组命名为ei(平衡非敏感性)。在一个实施方案中，提供对es与ei受体具有不同结合特性的化合物。提供选择性和不可逆地与es受体结合的化合物。es受体的表达与细胞的癌发生状态正相关。

在可以用于共价结合的es核苷转运蛋白上的大量活性功能性氨基酸侧链中，半胱氨酸残基中的硫氢基可能是在药理和生物学方面最重要的。有关硫氢基试剂对哺乳动物细胞中核苷转运的作用的早期研究已经证实在各种培养的细胞中产生了对尿苷吸收的显著抑制作用(Plagemann &Richey(1974)，《生物化学和生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)，第344卷，263-305页；Plagemann等(1978)，《细胞生理学杂志》(J.Cell.Physiol.)，第97卷，49-72页；Plagemann & Wohlhueter(1980)，《最新膜转运概论》(Curr.Top.Membr.Transp.)，第14卷，225-230页；Belt(1983)，《生物化学和生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)，第110卷，417-423页；Belt(1983)，《分子药理学》(Mol.Pharmacol.)，第24卷，479-484页)。然而，大部分早期研究涉及总核苷吸收且几乎没有区分es和ei转运系统对硫氢基试剂的敏感性差异的尝试。此外，所用的硫氢基试剂主要属于有机汞化合物，证实它们可以在低至200μM的浓度下干扰血浆结构(Belt & Noel(1985)，《生化杂志》(Biochem.J.)，第232卷，681-688页)。

还可以修饰与5-羟色胺(5-羟基色胺或5-HT)受体结合的配体。5-HT受体包括许多受体亚型(Peroutka，S.J.，《CNS药物》(CNS Drugs)，(1995)，第4卷(增刊1)，18-28页)。除属于离子通道的5-HT₃受体外(Derkash，V等，《自然》(Nature)，(1989)，第339卷，706-709页)，其它5-HT受体属于7次跨膜G蛋白偶联受体大家族。5-HT作用的临床意义在下列情况中显现，例如：神经病、CNS病、精神病和情绪疾病，包括偏头痛、焦虑、抑郁症、精神分裂症、强迫观念与行为病症、精神病、攻击行为、敌视、饮食疾病、胃肠疾病、高血压、睡眠-醒觉循环中昼夜节律的维持、性欲活动、强迫行为、发烧、呕吐以及心血管和运动机能。靶向5-HT受体的药物由此具有广泛的临床应用。与5-HT受体结合的配体可以通过例如与心血管系统、血小板、胃肠道和脑结合而产生作用(Erspamer，V.，编辑，“5-羟基色胺和相关吲哚烷基胺类”-《药理学实验手册》(Handbuch der Expermentellen Pharmakologie)，第19卷，Springer-Verlag，Berlin，(1996)，132-181页)。

因此，例如，可以如本文公开的修饰配体5-HT。可以修饰的其它配体包括本领域中公知的5-HT前体以及5-HT受体兴奋剂和拮抗剂。实例包括：已经用作抗抑郁药的前体5-羟基色氨酸；用作安定药和抗高血压药的5-HT_1A-兴奋剂；用于偏头痛的选择性5-HT₁受体兴奋剂舒马普坦；用于偏头痛预防和类癌肿瘤综合征的5-HT₂-拮抗剂，诸如美西麦角；用于降低高血压患者血压的5-HT₂拮抗剂，诸如酮色林(ketaserin)；和用于治疗抑制细胞和放射诱发的呕吐的选择性5-HT₃-拮抗剂。(Beasley，C.M.，等，《精神药理学》(Psychopharmacology)，(1992)，第107卷，1-10页；Bolden-Watson，C.，和Richelson，E.，《生命科学》(Life Sciences)，(1993)，第52卷，1023-1029页；Koe，B.K，J.《临床精神病学》(Clin.Psychiatry)，(1990)，第51卷，13-17页)。

可以修饰的5-羟色胺结合配体包括：那些为诸如焦虑这样的CNS疾病研发的配体，诸如苯并二氮类；或5-HT_1A兴奋剂，诸如丁螺环酮、吉哌隆、伊沙匹隆和氟辛克生。作为抗焦虑药，它们具有超过苯并二氮类的优势，因为它们不具有苯并二氮类的镇静和药物依赖倾向(Barrett，JE.和Vanover，KE.，《精神药理学》(Psychopharmacology)，(1993)，第112卷，第1-12页)。其它5-羟色胺结合配体包括：那些诸如SSRIs这样为治疗抑郁症研发的配体，例如氟西汀。还证实SSRIs具有治疗食欲过盛和强迫观念与行为疾病的作用且还可以用于治疗肥胖、恐慌病症、经前期综合征、糖尿病性神经病、慢性疼痛和阿尔茨海默病的某些认知方面。属于对5-HT₂受体相对有效的拮抗剂的其它有用的抗抑郁药包括三环抗抑郁药，诸如曲唑酮和萘法唑酮(Cowen，P.J.和Anderson.I.M.，“5-羟基色胺在精神病学上的应用”(“5-Hydroxytryptamine in Psychiatry”)(Sandler，M，Coppen，A.，& Harnett，S.编辑)，Oxford University Press，New York，(1991))。配体包括为治疗精神分裂症研发的化合物，包括抗精神病药氯氮平、利培酮和奥氮平(Weil-Malherbe，H.，“5-羟色胺和精神分裂症”(Serotonin and schizophrenia.)，参见《中枢神经系统》(The CentralNervous System.)第3卷-《健康与疾病中的5-羟色胺》(Serotonin inHealth and Disease)，Essman，W.B.，编辑，Spectrum Publications，Inc.，New York，(1978)，第231-291页)。可以使用与治疗饮食疾病相关的配体，诸如SSRIs和芬氟拉明。芬氟拉明可以用于治疗其它疾病，诸如孤独症、经前期综合征、季节性情感病症和注意力缺乏病症。可以使用与缓解胃肠道疾病相关的配体，诸如昂丹司琼和格拉司琼，它们用于治疗与癌症化疗相关的放射诱发的呕吐并用于改善在从常规麻醉恢复过程中出现的恶心和呕吐。其它配体包括甲氧氯普胺和西沙必利。可以使用诸如L-色氨酸这样用于控制睡眠-醒觉循环的配体或非选择性5-HT兴奋剂或诸如利坦色林这样的5-HT拮抗剂(就综述而言，参见Wauquier，A.和Dugovic，C.，《纽约科学院年鉴》(Ann N.Y.Acad.Sci.)，(1990)，第600卷，第447-459页)。其它配体包括用作抗高血压药的5-HT₂受体拮抗剂etanserin。2.1.与蛋白质结构反应性相关的考虑

肽类和蛋白质由通过形成的肽(酰胺)键彼此聚合的氨基酸构成。肽键聚合物形成多肽结构的主链。自然界中发现存在20种常用氨基酸，它们各自含有确定的具有特定化学结构的侧链、电荷、氢键性能、亲水性(或疏水性)和反应性。所述的侧链不参与肽的形成且由此可以自由与其环境发生相互作用和反应。

氨基酸可以根据其侧链特征作类型划分。用于共价缀合目的的最有意义的氨基酸是含有易接近的可离子化侧链的氨基酸，诸如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。甲硫氨酸和色氨酸也含有可离子化侧链，不过，它们不易接近，因为它们通常深埋在受体的分子结构内部，这是由于其疏水性质所导致的。

天冬氨酸和谷氨酸含有具有离子化特性的羧酸基团。可以通过使用酰胺键形成剂或通过活性酯或反应性羰基中间体衍生蛋白质中的羧酸基团。

赖氨酸、精氨酸和组氨酸具有含可离子化的胺的侧链。这些含有胺的侧链一般暴露在蛋白质的表面上且可以被轻易衍生化。这些残基可以发生的最重要的反应是烷基化和酰化。

半胱氨酸是唯一含有硫氢基的氨基酸。蛋白质半胱氨酸基团的最重要的反应是与另一半胱氨酸分子形成二硫交联键。半胱氨酸的硫氢基和胱氨酸二硫化物(称作胱氨酸残基)可以发生各种反应，包括烷基化成稳定的硫醚衍生物、酰化成相对不稳定的硫酯类和许多氧化和还原反应。半胱氨酸和胱氨酸基团是相对疏水的且通常在蛋白质的核心部分发现。没有变形剂或“驱动剂”存在通常难以接近大蛋白质的硫氢基。尽管如此，这类位阻确实使硫氢基在选择性方面处于前沿。因此，为了不使用变形剂而接近深入位于配体结合部位的反应性硫氢基官能团，就要利用受体的生理配体或药物以指导本文所述的缀合剂定向进入受体的内部结构。可能的情况是靶向于硫氢基的不可逆结合药物具有水平低于任何其它官能团的非特异性结合，在临床术语上称作“较少的副作用”。

酪氨酸含有酚侧链。尽管该氨基酸仅仅微溶于水，但是酚基的可离子化的性质有时使得它出现在蛋白质的亲水区-通常位于表面或接近表面的位置上。因此，不同于半胱氨酸残基，酪氨酸的衍生几乎不需要进一步打开蛋白质结构的变形剂来进行。可以特异性地靶向酪氨酸以便通过酰化酪氨酸酚盐的阴离子来进行修饰。

总之，蛋白质分子可以含有多达9个易于在侧链上衍生的氨基酸。这9个氨基酸残基含有对于修饰反应具有足够反应性的8个主要官能团。它们是精氨酸的胍基、谷氨酸和天冬氨酸各自的γ-和β-羧基、半胱氨酸的硫氢基、组氨酸的咪唑基、赖氨酸的ε-氨基、甲硫氨酸的硫醚部分、色氨酸的吲哚基和酪氨酸的酚羟基。由于甲硫氨酸和色氨酸一般隐蔽在蛋白质的内部且由此不会受到溶于溶剂的缀合物的影响，所以它们在完整蛋白质中仅表现出一定选择的反应性。其它可离子化的基团通常暴露在蛋白质表面上或可以在变形剂或“驱动剂”的帮助下接近。它们由此是缀合用的便利靶物。然而，在蛋白质上可以用于标记的大量反应性氨基酸功能性侧链中，半胱氨酸残基的硫氢基可能在药理学和生物学方面是最重要的。已经报导在大部分大分子中，存在至少一个拷贝的位于或接近于靶大分子的配体结合部位的反应性硫氢基。已经证实硫氢基还原剂对这种反应性硫氢基官能团的破坏可影响许多大分子的功能性。2.2.允许缀合的受体部分

带有作为活性种类的硫醇盐离子的硫氢基部分是蛋白质中最具反应性的官能团。由于具有约8.6的pKa，所以预计硫醇的反应性随pH的增加(朝向和高于其pKa)而增加。

在修饰母配体的过程中，有利的是利用存在的这种高反应性硫氢基，它一般接近位于或位于受体的配体结合基团上。可以对药物或生理学配体进行化学修饰以便包括与硫醇基团反应的速度超过与任何其它反应性官能团的反应速度的缀合剂。在这种修饰药物与其受体结合时，这种指向硫氢基的缀合物会攻击位于其可达到的邻近范围内的任意硫氢基；这导致药物与其受体共价结合。

除硫氢基外，在氨基酸侧链上还存在其它可以以化学方式修饰的高反应性官能团。与这些官能团反应的缀合物如下所述。2.3.缀合剂 2.3.1.硫氢基特异性缀合剂

N-顺丁烯二酰亚胺衍生物。顺丁烯二酰亚胺类被认为尤其是在低于7的pH下对硫氢基具有相当的特异性，在所述pH下其它亲核物质质子化。在酸性和接近中性的溶液中，与简单硫醇类的反应速率快于与相应的简单胺类的反应速率约100-倍。尽管该速率随pH而增加，但是与氨基的反应在高pH下也变得明显。其它主要的竞争反应是顺丁烯二酰亚胺类水解成马来酰胺酸类。然而，在pH7下，在20℃下的0.1M磷酸钠缓冲液中水解的表观速率仅为3.2×10^-4分钟^-1，这一速率过慢而不会干扰与硫氢基的反应。分解率仅在高于中性的pH下变得明显。硫醇与顺丁烯二酰亚胺类进行迈克尔加成反应仅造成在双键上进行加成。所得硫醚键极为稳定且在生理条件下不能裂解。

二硫化物试剂。二硫键互换在硫氢基与二硫化物反应时发生。某些最常用的二硫化物试剂是5，5′-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)、4，4′-二硫代二吡啶、甲基-3-硝基-2-吡啶基二硫化物和甲基-2-吡啶基二硫化物。所形成的蛋白质二硫键易于在有诸如2-巯基乙醇或二硫苏糖醇这样的游离硫醇存在情况下逆转。将蛋白质二硫键还原成其原始的硫氢基这一过程使得蛋白质恢复了其功能。因此，这种类型的不可逆结合药物为遇到诸如超剂量给药、反应过度等这样的各种治疗并发症提供了额外的安全机制。2.3.2.氨基特异性缀合剂

氨基是蛋白质中另一种强亲核物质。然而，由于其在蛋白质中的丰富性和遍在性且铵离子的pKa相对较高，所以与氨基反应的大部分试剂也可以与其它官能团反应。因此，它可能不是本发明修饰配体的理想靶物，除非药物结合部位缺少关键的半胱氨酸残基。尽管如此，但是许多稳定的酰化产物仍然且仅使用氨基形成。胺类最常见的反应是烷基化和酰化反应。可以引入配体结构的某些重要烷基化剂是：α-卤代乙酰基化合物(例如卤代乙酸酯、卤代乙酰胺类)、N-顺丁烯二酰亚胺衍生物、芳基卤(例如二硝基氟苯、三硝基苯磺酸酯)、醛类(例如戊二醛、甲醛)和酮类(例如磷酸吡哆醛)。酰化剂包括、但不限于异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯类、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、对硝基苯基酯、酰基氯和磺酰氯。2.3.3.羧基特异性缀合剂

羧基的最重要化学修饰反应应用以碳化二亚胺为介体的方法。由于使用了蛋白质，所以该反应的最佳pH约为难以在大多数生理条件下达到的5。还可以将诸如重氮乙酸酯类和重氮乙酰胺类这样的其它试剂用于使羧基酯化。与碳化二亚胺类相似，这些试剂在弱酸性条件下以高特异性与蛋白质中的羧基反应。2.3.4.酪氨酸特异性缀合剂

蛋白质中的酪氨酸、组氨酸和其它芳香残基富含电子。这些残基在芳香环上进行亲电取代反应。用于与蛋白质中酪氨酸和组氨酸反应的有用的亲电子试剂是重氮化合物。诸如赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸和精氨酸残基这样的其它蛋白质成分反应极慢，使得可以将重氮试剂看作是酪氨酸选择性的。重氮鎓离子甚至在中性pH下一般也不稳定且与蛋白质的最大反应一般在碱性pH下实现。酪氨酸酚盐离子还类似于氨基与酰化剂反应。然而，一般认为酪氨酰基具有较低的反应性。这并不是因为酚盐离子具有较低的亲核性所导致的，而是因为酪氨酸残基通常隐蔽在蛋白质内，由此一般因其疏水性而不易反应。2.3.5.精氨酸特异性缀合剂

精氨酸残基的胍基部分主要与1，2-二羰基试剂发生反应。常用的连位二酮类包括乙二醛、苯基乙二醛、2-3-丁二酮和1，2-环己烷二酮。2.3.6组氨酸特异性缀合剂

尽管较早已经指出许多烷基化剂与组氨酸的咪唑基部分反应，但是这些反应的速率一般低于其它亲核物质。甚至使用α-卤代乙酸酯，N-羧基甲基化的反应一般也比与硫氢基的反应缓慢。然而，当将这类反应性α-卤代羰基引入亲合标记(例如对甲苯磺酰基苯丙氨酸氯甲基酮、对甲苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮)时，可以实现特异性反应。除α-卤代乙酰基外，其它烷基化剂对组氨酸并不具有同样的反应性。使用酰化剂，组氨酸形成一般不稳定且可以进行自发水解的酰化产物。常用于修饰组氨酸的最重要酰化剂是二乙基焦碳酸酯或乙氧基甲酸酐。酰化的咪唑在碱性pH下发生可逆反应，从而使组氨酸复原。在中性pH下可以与羟基胺完成极快的脱酰反应。2.3.7.甲硫氨酸特异性缀合剂

甲硫氨酸的主要化学修饰反应是烷基化。因为甲硫氨酸通常位于蛋白质的疏水性内部，所以它倾向于提供高度选择性。仅有与配体偶联的烷基化剂易于接近这些隐蔽的甲硫氨酸残基。2.3.8.色氨酸特异性缀合剂

色氨酸残基因其疏水性而一般隐蔽在蛋白质内部。可以使用N-溴琥珀酰亚胺和2-羟基-5-硝基苄基溴修饰色氨酸残基。已经将不同试剂即对硝基苯基亚磺酰氯用于修饰吲哚基部分。该反应对色氨酸和半胱氨酸残基具有选择性。2.3.9.丝氨酸特异性缀合剂

已经发现诸如二异丙基氟磷酸酯、苯基甲基-磺酰基氟和其它芳基磺酰基氟这样的许多反应试剂与丝氨酸活性部位反应。因强竞争性水解反应，使用这类试剂时应留心。2.4.本发明修饰配体的设计

可以用酶催化修饰配体与受体之间形成共价键、可以用活化剂使修饰配体与受体之间形成共价键或通过缀合剂自身促进修饰配体与受体之间形成共价键。优选与位于或接近于受体的配体结合部位的官能团形成共价键。这一策略因它可确保高度特异性而是有利的。

不可逆结合配体的设计取决于配体与受体的化学、生物和分子特性。在每种情况中，引入配体化学结构的缀合剂可以不同且可能需要一定的构象。一般来说，所述的配体优选包括允许连接缀合剂或能够修饰以含有这类基团，但不会影响所述配体与其受体结合和引起生物活性的官能团。在这方面，修饰配体并不需要具有与母配体相同的生物活性(例如它可能不需要在体内通过某些代谢或分解代谢步骤而被激活)。

对于缀合剂的选择和构象，所考虑的某些条件和需求如下：

1.确定针对例如氨基、硫氢基、羧基、胍基、咪唑基和其它氨基酸侧链这样的受体特定官能团的反应特异性，对于缀合剂的选择这是必需的。选择依赖于受体上待与药物分子连接的任何官能团的可利用性。修饰配体的不可逆结合缀合剂必须对该官能团具有特异性。

2.缀合剂的疏水性和亲水性。疏水环境中的受体可能需要疏水配体以达到该受体。例如，带有亲水性缀合剂的修饰配体可能不能够接近位于深埋在受体疏水核芯内部的相应官能团。

3.缀合剂的可裂解性。在某些情况下需要分离与受体结合的修饰配体。例如，如果修饰的是毒性药物(相应于母配体而言)，那么必须设置安全机制以便预先防止如超剂量给药的情况。在这种情况中，如果出现并发症，那么可裂解缀合剂的应用能够使缀合作用逆转。可以将许多可裂解的键用于该目的。它们包括二硫键、脒、汞基、连位乙二醇、偶氮、砜、酯和硫酯键。在这方面，缀合剂本身是可裂解的；或如果该缀合剂通过间隔基与修饰配体连接，那么所述的间隔基可以是可裂解的。在这方面，所述的间隔基可以选自下列物质组成的组：(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基联硫基)丙酸酯、琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基联硫基)甲苯、3-(2-吡啶基联硫基)丙酰肼、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(disuccinimidyltartarate)、N-[4-(对叠氮基苯基偶氮)-苯甲酰基(benzyol)]-3-氨基己基-N′-氧基琥珀酰亚胺酯、4-4′-二氟-3，3′-二硝基苯基-砜、3-(4-叠氮基-2-硝基苯甲酰基硒基)丙酸、2-甲基马来酐。

4.缀合剂的大小和几何学。修饰配体上存在的缀合剂必须允许该配体与受体结合。在修饰配体与受体结合时，该缀合剂必须紧接所述受体部分，从而产生缀合作用。可能需要本文所定义的间隔基以使所述的缀合剂紧接所述的受体部分。在这类情况中所述间隔基的长度取决于缀合剂达到与受体部分邻近的有效缀合位置所需的距离。结合分子模拟使用X射线晶体学、核磁共振等进行的受体结构分析可能有助于鉴定缀合的受体部分以及选择和设计配体化学结构上的缀合剂。所述的受体部分可以存在于受体的配体结合部位上。优选地，该受体部份存在于受体的配体结合部位外。在不受任何理论限制的情况下，可能的情况是后一种手段可能是有利的，因为其更为可能防止在与修饰配体结合时受体功能的破坏。以此为基础，可以修饰母体兴奋剂，使得它与其关连受体交联而由此导致对受体功能的持续刺激(“受体开启”)。另一方面，可以修饰母体拮抗剂，使得它与其关连受体交联而由此导致对受体功能的持续抑制(“受体关闭”)。3.组合物

本发明还包括组合物，它包含本文所述的修饰配体以及药物上可接受的载体。

本发明还涉及一种与靶受体相关的疾病的治疗或预防方法，该方法包括对需要这类治疗的患者给予治疗有效剂量的如上文所概述的组合物。

随特定给药途径的不同，可以使用本领域中众所周知的各种药物上可接受的载体。这些载体可以选自糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇类、藻酸、磷酸缓冲溶液、乳化剂、等渗盐溶液和不含致热原的水。

可以使用任何合适的给药途径给患者提供本发明的组合物。例如，可以使用口服、直肠、非肠道、舌下、口含、静脉内、关节内、肌内、真皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、经皮等给药途径。

剂型包括片剂、分散体、混悬剂、注射剂、溶液、糖浆剂、锭剂、胶囊剂、栓剂、气雾剂、经皮贴剂等。这些剂型还可以包括为特别用于该目的而设计的注射或植入的控释装置或为还以这种方式起作用而改进的其它形式的植入物。可以通过给所述修饰配体进行例如疏水性聚合物包衣而使修饰配体受控释放，所述的疏水性聚合物包括丙烯酸树脂类、蜡类、高级脂肪醇类、聚乳酸和聚乙醇酸类以及诸如羟丙基甲基纤维素这样的某些纤维素衍生物。此外，可以通过使用其它聚合物基质、脂质体和/或微球体实现控释。

可以将适合于口服或非肠道给药的组合物制成每个均含有预定量的一种或多种本发明免疫原性剂的诸如胶囊、药袋或片剂这样的分散单位、制成粉剂或颗粒剂或制成含水液体、非水液体形式的溶液或混悬液、水包油型乳剂或油包水型液体乳剂。可以通过任何制药方法来制备这类组合物，不过，所有方法均包括使一种或多种如上所述的修饰配体与构成一种或多种必要组分的载体联合的步骤。一般来说，通过使本发明的修饰配体与液体载体或细粒固体载体或它们两者均匀和紧密混合且然后如果必要使产物形成所需的外观来制备组合物。

正如本领域中所公知的，所述的修饰配体可以是药物上可接受的盐形式。

可以以与所述剂量配制相适合的方式和以治疗上有效的用量给予上述组合物。在这方面，对患者给予的修饰配体的剂量应随时间的过去足以在患者体内产生有益反应，诸如改善疾病情况。所给予的修饰配体的量取决于受治疗者，包括年龄、性别、体重及其一般健康情况。在这方面，修饰配体的精确给药量取决于医务人员的判断。在确定治疗或预防与靶受体相关的疾病中待给予的修饰配体的有效量的过程中，临床医师可以评估疾病的进展情况。

在任何情况下，本领域技术人员可以容易地确定本发明修饰配体的合适剂量。这类剂量可以是在纳克至毫克数量级的本发明修饰配体。4.靶受体和含有靶受体的细胞或细胞膜的检测

本发明还涉及一种检测测试样品中靶受体存在的方法。该方法包括下列步骤：使所述样品与部分2中所述的修饰配体接触，其中所述的修饰配体结合所述的靶受体；和检测接触样品中是否存在包含所述修饰配体和所述受体的复合物。

本发明还包括一种对测试样品中存在的靶受体进行定量的方法。该方法包括下列步骤：使所述样品与以上大体描述的修饰配体接触，其中所述的修饰配体结合所述的靶受体；测定接触样品中包含所述修饰配体和所述受体的复合物的浓度；和建立所测定的复合物浓度与所述样品中所述受体浓度之间的关系。

本发明还提供了一种检测细胞或细胞膜上靶受体存在的方法。该方法包括下列步骤：使含有所述细胞或细胞膜的样品与以上大体描绘的修饰配体接触，其中所述的修饰配体结合所述的靶受体；和检测接触样品中是否存在包含所述修饰配体和所述细胞或细胞膜的复合物。

本发明还包括一种对细胞或细胞膜上存在的靶受体进行定量的方法。该方法包括下列步骤：使含有所述细胞或细胞膜的样品与以上大体描述的修饰配体接触，其中所述的修饰配体结合所述的靶受体；然后测定接触样品中包含所述修饰配体和所述细胞或细胞膜的复合物的浓度；和建立所测定的复合物浓度与存在于所述细胞或细胞膜上的受体浓度之间的关系。

可以将修饰配体用作鉴定受体分子上实际药物口袋或药物结合区域的工具。由于这些修饰配体与其靶物的结合是不可逆的，所以可以使用诸如应用质谱的肽指纹法这样的各种技术来鉴定受体上与药物发生相互作用的实际部位。可以将该信息用于鉴定与该特定药物口袋结合的分子。

可以使用用于测定复合物形成的任何合适的技术。例如，可以将连接有报道分子(本文中有时称作“探针”)的本发明修饰配体用于本领域中已知的任何合适的测定法以便检测配体-受体相互作用和/或对其进行定量。例如，在这方面，可以使用闪烁计数、放射自显影、荧光自显影、流式细胞术、UV光谱法、荧光光谱法、化学发光成象、荧光显微镜检术、共聚焦显微镜检术、电子显微镜术等。

报道分子可以与包括缀合剂和间隔基(如果包括的话)的修饰配体的任何合适部分连接。优选对报道分子与修饰配体的连接进行选择，使得该报道分子不会干扰修饰配体与受体的结合。

可以理解的是与抗原结合分子连接的报道分子可以包括如下情况：

报道分子与修饰配体直接连接；

报道分子与修饰配体间接连接；即报道分子与随后结合修饰配体的另一种检测试剂连接；和

与修饰配体的随后反应产物连接。

所述的报道分子可以选自：色原、发色团、催化剂、酶、荧光染料、化学发光分子、诸如铕(Eu34)这样的镧系元素离子、放射性同位素、自旋标记物和直观标记物。

就直观标记物而言，可以应用胶态金属或非金属粒子、染料颗粒、酶或底物、有机聚合物、乳胶颗粒、脂质体或含有产生信号的物质的其它小泡等。

适合用作报道分子的大量酶公开在美国专利说明书U.S.4,366,241、U.S.4,843,000和U.S.4,849,338中。用于本发明的合适的酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶等。可以单独使用这些酶或将它们与溶液形式的第二种酶联用。

合适的荧光染料包括、但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、R-藻红蛋白(RPE)和德克萨斯红。其它典型的荧光染料包括那些Dower等(国际申请WO 93/06121)公开的荧光染料。还可以参考美国专利U.S.5,573,909(Singer等)、U.S.5,326,692(Brinkley等)中所述的荧光染料。另一方面，可以参考美国专利U.S.5,227,487、5,274,113、5,405,975、5,433,896、5,442,045、5,451,663、5,453,517、5,459,276、5,516,864、5,648,270和5,723,218中所述的荧光染料。

优选所述的报道分子是诸如³H、¹²⁵I、¹⁴C、³²P、³³P和³⁵S这样的放射性同位素。5.应用

治疗。优选是不可逆结合药物的本发明的修饰配体具有实质上超过常规可逆结合药物的优点。首先，在药物从血浆中消失后与剂量相关的抑制作用或刺激作用可以持续长时间。换句话说，药物的作用可能维持的时间比根据其血浆消除半衰期所预计的时间长。其次，由于较长的持续药物作用，所以可以以较低的频率和以较低的剂量给予这些不可逆结合药物。这将不良副作用减少到了最低限度并防止了因药物本身或其代谢物诱发的毒性累积。第三，由于不可逆拮抗剂与其受体的结合是永久的，所以阻断受体应答不再是竞争性抑制机制。这种不可逆拮抗作用防止了任何浓度的兴奋剂对指定受体产生最大作用。此外，如果赋予修饰配体高度放射性，那么可以将它用作特异性杀伤带有关连受体的细胞的治疗剂或可以将它用于成象。

诊断。这种配体修饰技术的另一种应用是进一步阐明可以靶向以缓解各种复杂生理过程中的机能障碍的不同受体亚群。更重要的是，此修饰药物使得我们可以开发/鉴定在某些受体方面“有缺陷”的动物模型，而无需经过长期、繁琐和复杂的遗传物质操作。因此，可以研究并分析“现实”情况中不同受体的复杂生理机制和功能。此外，还可以研究各种不同受体如何互连和受到彼此功能的影响。这类动物模型的利用还能够使研究人员预测并揭示出多种药物通过同时阻断所关注的多个受体群的治疗结果。因此，可以将本发明用于描绘出存在于细胞上以及组织、器官或系统中的不同受体的分布。可以将这类受体分布有利地用于发现新药物靶物、预测药物的可能副作用并确定不同细胞之间彼此如何通讯、其健康状态和它们是否对某些外部刺激(例如药物)产生反应。

现在参照下列非限制性实施例来描述本发明。

实施例

实施例1：

N-乙基顺丁烯二酰亚胺对鼠骨髓瘤SP2/0-Agl4细胞中平衡核苷转运蛋白的作用

将典型的N-顺丁烯二酰亚胺衍生物用作对硫氢基具有有利的特异性的硫氢基试剂，从而仅与蛋白质上某些易接近的硫氢基反应、使得能够产生特异性抑制作用且因该化合物不带电荷的性质而可良好地渗透入细胞。N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)是能够与蛋白质中的反应性硫氢基形成稳定的硫酯类的最小顺丁烯二酰亚胺试剂。es和ei核苷转运蛋白系统对NEM的敏感性已得到证实。将各种不同的细胞系用于证实核苷转运蛋白系统对NEM的敏感性是一种一般现象且并不限于一定细胞或组织类型。

对es核苷转运蛋白系统的前期研究(Paterson等(1977)，《分子药理学》(Mol.Pharmacol.)，第13卷，第114页；Gati等(1983)，《分子药理学》(Mol.Pharmacol.)，第23卷，第146-1520)提示核苷中的糖成分对核苷与es核苷转运蛋白部位结合而言是重要的。因此，在本发明中，接头部分与核苷的嘧啶/嘌呤环连接可避免对es核苷转运蛋白的有效抑制作用受到破坏，从而为该转运蛋白调节部位提供新型探针。

本发明人已经发现一组新型核苷、即胞苷4-[N-马来酰亚氨基甲基]环己烷-l-羧酸(CrMCC)及其衍生物及其类似物具有以不可逆方式抑制人体细胞es核苷转运蛋白的能力。将用于合成CrMCC或1-[[4-[(4-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-2(1H)-嘧啶酮)羰基]环己基]甲基]-1H-吡咯-2，5-二酮的直接快速合成途径列在附图3中。

为了证实es和ei核苷转运蛋白系统对NEM的敏感性，在转运试验前用0-30mM的不同浓度的NEM对不同的哺乳动物细胞系进行1分钟的处理。附图1表示鼠骨髓瘤SP2/0-Agl4细胞中³H-尿苷(终浓度为50μM)的平衡转运(在5秒摄入间隔时测定)以明显双相方式受到NEM的抑制。约60-70％的转运活性受到NEM抑制，具有0.15mM的IC₅₀值。剩余的30-40％转运活性逐步被高于3mM浓度的NEM完全破坏。由NEM产生的类似双相抑制作用还可以在带有es和ei转运系统的人HL-60和人MCF-7细胞中观察到(Lee等(1995)，《生物化学与生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)，第1268卷，第200-208页)。对仅带有es(鼠EL-4细胞)或仅带有ei(大鼠Morris 7777)转运系统的细胞而言，在NEM剂量反应实验中观察到了单相³H-尿苷转运曲线。EL-4和Morris 7777细胞的IC₅₀值分别约为0.1和1.5mM。这些结果提示在NEM剂量反应实验中观察到的总³H-尿苷转运的双相曲线是那些细胞中存在两种不同平衡核苷转运系统的反映。NEM-敏感性成分是es转运系统且NEM-非敏感性成分是ei转运系统。尽管ei转运蛋白对NEM抑制作用的敏感性较低，但是可以在较高NEM浓度下抑制ei转运蛋白或可以通过延长暴露于NEM来抑制它。这一观察结果与酶的硫氢基在其反应性上显示出显著变化的一般概念相一致，所述的反应性变化范围从无反应性，经过几个阶段的徐缓反应性到自由和即刻反应性。

为了进一步证实尿苷流量通过es转运系统减少是由于随后影响转运亲和力的NEM诱导的载体蛋白上化学修饰所导致的，且为了证实es核苷转运活性的改变可以通过³H-NBMPR结合能力改变而得到证实这一概念，对用或不用0.3mM NEM预处理1分钟的鼠骨髓瘤SP2/0-Agl4细胞检测细胞膜上高亲和性³H-NBMPR结合部位的可利用性。附图2表示³H-NBMPR结合的Kd值(根据有20μM NBTGR存在情况下测定的非特异性结合进行校正)响应NEM处理发生显著改变。接触NEM1分钟后不久，与未处理细胞的0.16±0.02nM相比，表观Kd值为1.9±0.4nM。然而，对NEM处理和未处理的细胞而言，B_max值分别为40,000±2,600和41,000±1,000个位点/细胞，这两者并无显著不同。这些结果再次证实了关键性二硫键接近或紧靠es转运系统的核苷转运/结合部位，其中与NEM形成的二硫键影响载体的转运亲和力。es转运蛋白上的关键硫氢基可能位于或紧靠但并非位于核苷转运/结合部位上的这一提示来源于30μM下的NBMPR、地拉、双嘧达莫和10mM下的尿苷不能够防止这种硫氢基受到NEM修饰的观察结果(Lee等(1995)，《生物化学与生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)，第1268卷，第200-208页)。尽管NEM作为es转运蛋白抑制剂是有效的，但是它具有毒性且应为治疗目的对其进行修饰。

实施例2

CrMCC的合成和表征

以选择性不可逆方式抑制es转运蛋白的策略是使反应基团特异性共价结合剂(顺丁烯二酰亚胺)与驱动剂连接，使得它可以将共价结合剂递送至所需靶物。最适宜的驱动剂是生理配体本身(核苷)。在其它生理核苷中选择嘧啶核苷胞苷，这是由于其“功能惰性”所导致的，由此可以将“非特异性”药物结合减少到最低限度。就使顺丁烯二酰亚胺与胞苷连接的间隔基而言，为试验性研究而选择环己烷羧酸。这种构象模拟NBMPR的化学结构(附图5b)。此外，也考虑到类似于疏水性(由环己烷产生)和稳定性(由羧酸产生)这样的其它优点。

将用于合成CrMCC或1-[[4-[(4-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-2(1H)-嘧啶酮)羰基]环己基]甲基]-1H-吡咯-2，5-二酮的直接快速合成途径列在附图3中。

在反应前分别将4-[N-马来酰亚氨基甲基]环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)和胞苷溶于无水二甲亚砜(DMSO)。当将这两种试剂在室温和避光条件下混合时，反应开始。在该混合物中SMCC∶胞苷的摩尔浓度比为0.10M∶0.15M，在该反应体系中pH为7.5-8.0。在4小时内，在该反应混合物中发现CrMCC且可以通过在HPLC(AKTA Purifier，Pharmacia)上运转的C₁₈反相柱(Resource RPC，Pharmacia)、应用300nm吸收波长将其与胞苷和SMCC分离。用100％水洗脱胞苷且用15％乙腈的水溶液洗脱CrMCC和SMCC，其中流速为1.5ml/分钟。CrMCC的疏水性大于胞苷的疏水性，但低于SMCC的疏水性。在22-24℃下SMCC与胞苷之间进行48小时反应后形成的CrMCC达到其近最大值(附图4)。使用计算机程序UNICORN(2.0版)计算峰下的面积。

用冷冻干燥法将HPLC纯化的CrMCC冻干。CrMCC的活性至少稳定3个月，条件是将它储存在-20℃下的干燥器中。通过LC-MS(Waters)测定CrMCC的分子量。简单地说，用20％乙腈的水溶液以3ml/分钟的流速从C₁₈反相柱(Resource RPC，Pharmacia)上洗脱下CrMCC。将微量质谱仪的毛细管电压设定在3.0-3.5V并将锥形电压设定在20V。N₂气流为700L/小时且电喷射为负值。质谱在全扫描操作下收集，扫描范围在1-1000m/z。通过监测质子化分子离子测定了CrMCC的分子量且它与预计的数值462.5近似。合成的CrMCC的纯度始终高于95％。

通过紫外-可见分光光度计测定CrMCC的吸收光谱。附图5A表示CrMCC吸收光谱存在两个λ_max。它们中的一个位于254nm处(类似于胞苷的λ_max)，而另一个位于300nm处(类似于SMCC的λ_max)。具有两个λ_max的CrMCC的此吸收分布与NBMPR的吸收分布极为相似(附图5B)。这一结果表明CrMCC在其化学结构上由嘧啶及环己烷环组成。随后使用NMR进行的结构研究证实了这一发现。

实施例3

CrMCC对人HL-60白血病前髓细胞质膜中 ³ H-NBMPR结合的影响

为了合成³H-CrMCC，使用放射性胞苷(³H-胞苷)。由于高浓度底物增加CrMCC的产量，所以在与SMCC反应前以100∶1的浓度比将非放射性胞苷与放射性³H-胞苷预混合(参见实施例2)。

用分级浓度的胞苷、SMCC和CrMCC将悬浮于反应缓冲液(0.13MNaCl，0.02M NaHCO₃，pH7.0)中的纯化HL-60质膜预处理5分钟，此后再暴露于³H-NBMPR(5nM)30分钟。通过膜过滤法终止该反应(Lee &Jarvis(1988)，《生化杂志》(Biochem.J.)，第249卷，第557-564页)。将附图6中所示的数据对在20μM NBTGR存在情况下测定的非特异性结合进行校正。附图6表示³H-NBMPR对HL-60未封闭质膜的特异性受到CrMCC抑制，具有10μM IC₅₀值。相反，SMCC和胞苷在抑制³H-NBMPR方面的IC₅₀值分别为100μM和＞1mM。计算的CrMCC的K_i值为1μM。

为了分析CrMCC对³H-NBMPR的结合动力学的作用，用0、10和50μM的CrMCC对纯化的HL-60质膜预处理5分钟，此后再与分级浓度的³H-NBMPR(0.2-8nM)一起保温30分钟。结果的双倒数图如附图7中所示。图中的线在横坐标上相交，表示在CrMCC存在情况下B_max的改变值和未改变的K_d值。就所示的数据而言，就分别用0、10和50μM的CrMCC预处理的膜而言，³H-NBMPR结合的表观K_d值分别为0.36±0.04、0.31±0.03和0.39±0.05nM，B_max值分别为1.56±0.05、0.59±0.01和0.30±0.01pmol/mg蛋白质。将数据对在有20M的非放射性竞争性配体硝基苄基硫代鸟苷(NBTGR)存在情况下测定的非特异性结合作校正。这些结果提示了CrMCC对³H-NBMPR结合的非竞争性抑制。这是不可逆拮抗作用的独特特征。

任何临床上可用的药物必须在其治疗剂量范围下几乎没有毒性或无毒性。使以5×10⁴个细胞/ml的起始细胞密度在含有10％FBS的RPMI培养基中以对数方式生长的HL-60细胞与分级浓度的CrMCC、胞苷和SMCC(0-100μM)接触3天。使用电子微粒分析仪(Sysmex)对细胞密度计数。附图8表示接触3天后CrMCC和胞苷在浓度高至100μM下对HL-60细胞的生长几乎没有作用或无作用。相反，母体化合物之一SMCC对HL-60细胞的毒性极高，对于细胞生长的IC₅₀值低于0.5μM。SMCC的毒性是因其与细胞上每个易接近的硫氢基发生非特异性相互作用所导致的。预计胞苷对细胞生长几乎没有或无抑制作用，因为这种核苷具有相当的″惰性″且在测试浓度范围下不会诱发核苷失衡。

实施例4

³ H-CrMCC与人HI-60白血痛前髓细胞质膜的结合

放射性CrMCC(³H-CrMCC)的利用使得研究CrMCC对es核苷转运蛋白的生化特性成为可能。进行该实验以便研究³H-CrMCC与HL-60细胞未封闭质膜结合的速率。附图9表示³H-CrMCC(30μM终浓度)与纯化HL-60质膜的结合相当缓慢。最少需要5分钟才能达到12nmoles/mgHL-60质膜蛋白的最高结合值。这种情况不同于诸如NBMPR、双嘧达莫和地拉这样的可逆拮抗剂的结合情况，已知所述可逆拮抗剂的结合是快速的且大部分在保温的第1分钟内就完成。通过膜过滤法终止附图9中的结合反应且将数据对过滤物空白进行校正。

重要的是证实³H-CrMCC与未封闭HL-60质膜的结合确实是不可逆的。将纯化的未封闭L-60质膜与30μM的³H-CrMCC一起保温10分钟。此后，将该混合物稀释20倍并将稀释的混合物置于室温下不同的时间间隔以使解离发生。附图10表示稀释20倍后³H-CrMCC几乎没有或没有从其结合部位上分离的现象至少持续了60分钟。甚至在稀释培养基中存在1mM胞苷时也不能将³H-CrMCC从其结合部位置换下来。相反，30μM的³H-胞苷与HL-60质膜的结合缓慢且在稀释时快速而完全地分离(附图10的插图)。这一发现与CrMCC对³H-NBMPR结合的非竞争性抑制作用(附图7)共同提示CrMCC与其结合部位的相互作用确实是不可逆的。通过膜过滤法终止附图10中所示的解离反应并将数据对过滤物的空白作校正。

为了测定³H-CrMCC与其结合部位结合的浓度依赖性，将纯化的未封闭HL-60质膜与分级浓度的³H-CrMCC(3-800μM)一起保温10分钟并通过膜过滤法终止该反应(附图11)。可以将该数据解析成至少两个成分，一个高亲和性成分(K_d＝23.8±2.2μM)和一个低亲和性成分(附图11的插图)。不能使用现有的³H-CrMCC浓度范围估计低亲和性成分的动力学常数。另外可能的情况是这种低亲和性成分是一种非特异性³H-CrMCC结合部位。将附图11中所示的数据对过滤物的空白作校正。

重要的是确定³H-CrMCC-受体复合物在不同pH条件中的稳定性。将纯化的未封闭HL-60质膜与30μM的³H-CrMCC一起保温5分钟。然后用不同pH值(pH0.85-7.5)的反应缓冲液将该反应混合物稀释20倍。通过膜过滤法终止该解离反应。将数据对过滤物空白作校正。附图12表示³H-CrMCC-受体复合物在生理pH下极为稳定。然而，配体-受体复合物在pH低于3.5的条件下开始分解。

使用硫氢基试剂NEM进行的早期研究提示半胱氨酸残基可能位于极接近但并不在es核苷转运蛋白的核苷转运/结合部位的位置上。因此，如果³H-CrMCC与NEM结合的相同部位结合，那么不能抑制NEM作用的底物(Lee等(1995)，《生物化学和生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)，第1286卷，200-208页)应类似地几乎对³H-CrMCC结合没有或无作用。附图13表示1mM生理核苷(例如胞苷、尿苷、腺苷和肌苷)和20μM的es核苷转运抑制剂(例如NBMPR和双嘧达莫)确实不能抑制³H-CrMCC(30μM终浓度)与HL-60质膜的结合。相反，1mM的NEM与0.5mM的CrMCC在抑制³H-CrMCC结合方面同样有效。这一发现提示NEM和CrMCC与es核苷转运蛋白上相同的硫氢基反应。

实施例5

其它硫氢基反应性共价臂对 ³ H-胞苷分子与人HL-60白血病前髓细胞质膜结合的作用

成功地证明通过环己烷羧酸间隔与胞苷连接的硫氢基反应试剂顺丁烯二酰亚胺可有效地以不可逆方式抑制³H-NBMPR与es转运蛋白的结合。在该实验中，比较通过不同间隔基臂与相同或不同硫氢基反应试剂连接后³H-胞苷分子与HL-60质膜的结合能力，从而为用于生成不可逆es核苷转运抑制剂的间隔基的适合性提供间接的指标。因此，以化学方式修饰³H-胞苷而将不同的硫氢基反应侧臂添加到嘧啶环的6-氨基位置上。用于修饰³H-胞苷的化学物质包括间马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MBS)、4-[对马来酰亚氨基苯基]丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SMPB)、N-[γ-马来酰亚氨基丁酰氧基]琥珀酰亚胺、4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-[2-吡啶基硫代]甲苯(SMPT)、3-[2-吡啶基联硫基]丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、马来酰亚氨基乙酸N-琥珀酰亚胺酯(AMAS)和N-[ε-马来酰亚氨基己酰氧基]琥珀酰亚胺(EMCS)，此外还有4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)。将纯化的HL-60质膜与100μM的这些化学修饰的³H-胞苷类似物一起保温5分钟。通过膜过滤法终止该反应。附图14表示N-α-马来酰亚氨基乙酰酸(AMA)共价臂可促进3H-胞苷与HL-60质膜的最高不可逆结合，随后是3-[2-吡啶基联硫基]丙酸(PDP)。然而，N-ε-马来酰亚氨基己酸(EMC)、间马来酰亚氨基苯甲酸(MB)、N-γ-马来酰亚氨基丁酸(GMB)和4-[对马来酰亚氨基苯基]丁酸(MPB)作为共价臂与N-马来酰亚氨基甲基环己烷羧酸(MCC)相比具有等同的功效。相反，α-甲基-α-[2-吡啶基联硫基]甲苯碳酸(MPT)的有效性最低。附图14中的符号X代表胞苷。实施例6

人HL-60白血病前髓细胞质膜中 ³ H-CrMCC结合蛋白的鉴定

我们尝试鉴定通过³H-CrMCC标记的质膜蛋白。使³H-CrMCC(20μM)标记的溶于SDS的HL-60质膜蛋白加在FPLC(ATKA FPLC，Pharmacia)上运转的C₁₈反相柱(Resource RPC，Pharmacia)上，其中使用下列条件：柱体积(CV，3ml)；起始缓冲液A(0.05％TFA水溶液)；洗脱液B(0.065％TFA的乙腈溶液)；流速(2ml/分钟)；检测(280nm)；洗脱(3CV中的0％B，1CV中的0-5％B，5CV中的5％B，15CV中的5-100％B，冲洗用100％B)。附图15表示通过使用C₁₈反相柱的FPLC分离后HL-60质膜的一般UV(λ＝280nm)吸收分布。色谱图上的箭头表示³H-CrMCC标记的蛋白质的峰(参见附图16)。以1ml/分钟收集洗脱液并通过液体闪烁计数器测定放射性。附图16表示位于色谱图中的馏分第43-44、49-50和57-59处的至少3个主要的放射性峰。在馏分6下的尖锐放射性峰是由于³H-CrMCC的降解产物(即³H-胞苷)和³H-CrMCC与膜脂类的非特异性结合所产生的。

实施例7

来源于腺苷的不可逆结合药物的开发

鉴于使用胞苷作为引导化合物成功地产生了es转运蛋白的不可逆抑制剂，所以可以通过使共价臂与诸如腺苷这样的其它生理核苷连接而再现本发明(附图17)。按照附图3中设定的一般程序并使用实施例5中所列的化学物质对³H-腺苷进行化学修饰以便将不同硫氢基反应共价臂添加到嘌呤环的6-氨基位置上。将HL-60质膜与100μM的这些化学修饰的³H-腺苷类似物一起保温5分钟。通过膜过滤法终止该反应。附图17表示4-[对马来酰亚氨基苯基]丁酸(MPB)共价臂可促进³H-腺苷与HL-60质膜的最高不可逆结合，随后是N-α-马来酰亚氨基乙酸(AMA)。然而，3-[2-吡啶基联硫基]丙酸(PDP)、N-ε-马来酰亚氨基己酸(EMC)、间马来酰亚氨基苯甲酸(MB)和N-马来酰亚氨基甲基环己烷羧酸(MCC)作为共价臂具有等同的较低功效。相反，N-γ-马来酰亚氨基丁酸(GMB)和α-甲基-α-[2-吡啶基联硫基]甲苯碳酸(MPT)的有效性最低。

实施例8

不可逆相互作用5-HT类似物对鼠脑膜中 ³ H-5-HT结合的抑制作用

A.化合物的合成

附图19a、20a、21a和22a中所示化合物(分别为LBT3001(1-[2-(5-羟基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-吡咯-2，5-二酮)、LBT3002(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-N-[2-(5-羟基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-丁酰胺)、LBT3004(3-(2，5-代二氧-2，5-二氢-吡咯-1-基)-N-[2-(5-羟基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-丙酰胺)和LBT3005(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基甲基)-环己烷羧酸[2-(5-羟基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-酰胺)的化学结构)表现出作为不可逆结合化合物的功效且提供了属于包含缀合剂的修饰的5-HT受体结合配体的修饰配体的实例。

合成LBT3001的反应流程(附图19b)如下：在0℃下将5-羟基色胺(212.7mg，1.0mmol)溶于饱和的碳酸氢钠(25ml)溶液。在搅拌条件下加入N-乙氧基羰基马来酰亚胺(177.6mg，1.05mmol)。30分钟后，用温水浴(30℃-40℃)取代冰水浴。然后将该反应溶液在温水浴中搅拌约1小时。接着将该溶液用乙酸乙酯(3×50ml)提取。随后用去离子水(2×20ml)将乙酸乙酯层洗涤至pH接近中性为止、然后用盐水(20ml)洗涤。然后用无水MgSO₄干燥有机层。在减压条件下除去溶剂而得到黄色油状粗产物。通过快速色谱法(30％乙酸乙酯的己烷溶液)纯化而得到黄色至橙色结晶产物(187.2mg，73％)。

合成LBT3002的反应流程(附图20b)如下：将5-羟基色胺盐酸盐(42.5mg，0.2mmol)和3-马来酰亚氨基丁酸(40.3mg，0.22mmol)悬浮于1ml 2-甲氧基乙醚(DME)中。向该溶液中加入N-甲基吗啉(NMM，25μl，0.22mmol)和1，3-二环己基碳二亚胺(DCC，45.4mg，0.22mmol)。在室温下将该溶液搅拌3小时。通过直接应用梯度溶剂洗脱剂(0％-3％甲醇的二氯甲烷溶液)的快速色谱法纯化产物而得到褐色油状物(40.7mg，60％)。

合成LBT3004的反应流程(附图21b)如下：将5-羟基色胺盐酸盐(42.5mg，0.2 mmol)和3-马来酰亚氨基丙酸(37.2mg，0.22mmol)悬浮于1ml甲氧乙醚(DME)中。向该溶液中加入N-甲基吗啉(NMM，25μl，0.22mmol)和1，3-二环己基碳化二亚胺(DCC，45.4mg，0.22mmol)。在室温下将该溶液搅拌3小时。通过直接应用梯度溶剂洗脱剂(0％-1.5％-5％甲醇的二氯甲烷溶液)的快速色谱法纯化产物而得到橙色结晶(46.0mg，70％)。

合成LBT3005的反应流程(附图22b)如下：在0℃下剧烈搅拌4-氨基甲基-环己烷羧酸(2.83g，18.0mmol)的饱和NaHCO₃溶液(80ml)。一部份一部份地向该溶液中加入N-乙氧基羰基马来酰亚胺(精细粉碎的，3.05g，18.0mmol)。当添加完成时(约10分钟)，加入去离子水(80ml)并在室温下将该混合物搅拌40分钟。用1M的HCl将所得混合物调至pH1-2并用乙酸乙酯(3×80ml)提取。将有机层用去离子水(50ml)且然后用盐水(20ml)洗涤。将有机相用硫酸镁干燥并在减压条件下蒸发至得到粗产物。通过快速色谱法纯化(己烷∶乙酸乙酯∶乙酸，60∶39∶1)而得到固体产物(2.69g，63％)。将5-羟基色胺盐酸盐(42.5mg，0.2mmol)和马来酰亚氨基甲基-环己烷羧酸(52.2mg，0.22mmol)悬浮于1ml甲氧基乙醚(DME)中。向该溶液中加入N-甲基吗啉(NMM，25μl，0.22mmol)和1，3-二环己基碳化二亚胺(DCC，45.4mg，0.22mmol)。在室温下将该溶液搅拌3小时。通过直接应用梯度溶剂洗脱剂(乙酸乙酯∶己烷(1∶1)-乙酸乙酯∶己烷(3∶1))的快速色谱法纯化产物而得到淡棕色油状物(28.3mg，35.8％)。

可以使用附图19b-22b中所说明的反应流程之一以类似方式修饰诸如附图23中所示的那些其它5-HT受体结合化合物以使它们与其靶部位不可逆结合。

B.试验

附图18表示各种5-HT类似物对³H-5-HT与鼠脑膜的高亲和性结合的抑制作用。用分级浓度的LBT3001(■)、LBT3002(□)、LBT3004(o)和LBT3005(●)预处理悬浮于反应缓冲液(0.13M NaCl，0.02M NaHCO₃，pH7.0)中的纯化鼠脑膜5分钟，此后再与³H-5-HT(5nM终浓度)接触30分钟。通过膜真空过滤法终止该反应。将数据对在有1mM非放射性5-HT存在下测定的非特异性结合作校正。将结果对在没有抑制剂存在情况下测定的对照结合绘图。

附图18表示所有5-HT类似物以明显的双相方式抑制³H-5-HT与鼠脑膜的结合。

在5-HT与顺丁烯二酰亚胺分子之间不含间隔基的类似物LBT3001(1-[2-(5-羟基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-吡咯-2，5-二酮)(附图19a)有效地抑制³H-5-HT与其高和低亲和性结合部位的结合，其中IC₅₀值分别约为0.001和50μM。在间隔基上含有3个碳分子的类似物LBT3002(附图20a)抑制³H-5-HT与其高和低亲和性结合部位的结合，其中IC₅₀值分别约为0.00003和200μM。在间隔基上含有2个碳分子的类似物LBT3004(附图21a)抑制³H-5-HT与其高和低亲和性结合部位的结合，其中IC₅₀值分别约为0.2和50μM。在间隔基上含有环己烷羧酸分子的类似物LBT3005(附图22a)抑制³H-5-HT与其高和低亲和性结合部位的结合，其中IC₅₀值分别约为0.5和300μM。这些结果清楚地表明可以使用所述的技术设计不可逆结合的药物。另外，这项技术还可应用于许多小分子且可以用于进一步改善现存分子的功效。

将本文所涉及的所有公开出版物、专利和专利申请的全部公开内容引入本文作为参考。

在本说明书中，我们的目的是描述本发明的优选实施方案，而并非将本发明限定到任意一种实施方案或具体的特征集合。本领域技术人员可以理解可以根据本发明的公开内容对例举的特定实施方案进行各种修改和改变而不会脱离本发明的范围。所有这类修改和改变均包括在所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种用于修饰母配体的方法，该方法包括下列步骤：使所述的母配体和与所述母配体所结合的靶受体的部分反应的缀合剂连接，使得在所述缀合剂与所述受体部分之间可形成共价键。

2.权利要求1的方法，其中所述的缀合剂通过一种间隔基与所述母配体连接。

3.权利要求2的方法，其中所述的间隔基与所述的母配体共价连接。

4.权利要求2的方法，其中所述的间隔基与所述的缀合剂共价连接。

5.权利要求2的方法，其中所述的间隔基包含选自烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、氧代烷基、杂氧代烷基、链烯基、杂链烯基、芳烷基、杂芳烷基、芳基和杂芳基的基团。

6.权利要求4的方法，其中所述的缀合剂是硫氢基特异性缀合剂。

7.权利要求4的方法，其中所述的缀合剂选自氨基特异性缀合剂和羧基特异性缀合剂。

8.权利要求1的方法，其中所述的缀合剂选自硫氢基特异性缀合剂、氨基特异性缀合剂、羧基特异性缀合剂、酪氨酸特异性缀合剂、精氨酸特异性缀合剂、组氨酸特异性缀合剂、甲硫氨酸特异性缀合剂、色氨酸特异性缀合剂和丝氨酸特异性缀合剂。

9.权利要求8的方法，其中所述的硫氢基特异性缀合剂选自N-顺丁烯二酰亚胺和N-顺丁烯二酰亚胺衍生物。

10.权利要求9的方法，其中所述的N-顺丁烯二酰亚胺衍生物选自包括5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)、4，4′-二硫代二吡啶、甲基-3-硝基-2-吡啶基二硫化物和甲基-2-吡啶基二硫化物在内的二硫化物试剂。

11.权利要求8的方法，其中氨基特异性缀合剂选自烷基化剂和酰化剂。

12.权利要求11的方法，其中所述的烷基化剂选自α-卤代乙酰基化合物、芳基卤类、醛类和酮类。

13.权利要求11的方法，其中所述的酰化剂选自异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯类、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、对硝基苯基酯、酰基氯和磺酰氯。

14.权利要求8的方法，其中羧基特异性缀合剂选自碳二亚胺类和羧基酯化试剂。

15.权利要求14的方法，其中所述的羧基酯化试剂选自重氮基乙酸酯类和重氮基乙酰胺类。

16.权利要求8的方法，其中酪氨酸特异性缀合剂是一种重氮化衍生物。

17.权利要求16的方法，其中所述的重氮化衍生物选自联苯胺和双重氮化3，3′-二甲基联苯胺。

18.权利要求8的方法，其中精氨酸特异性缀合剂选自1，2-二羰基试剂。

19.权利要求18的方法，其中1，2-二羰基试剂选自乙二醛、苯基乙二醛、2，3-丁二酮和1，2-环己二酮。

20.权利要求8的方法，其中组氨酸特异性缀合剂选自烷基化剂和酰化剂。

21.权利要求20的方法，其中所述的烷基化剂选自α-卤代乙酰基化合物、芳基卤类、醛类和酮类。

22.权利要求20的方法，其中所述的酰化剂选自二乙基焦碳酸酯、乙氧基甲酸酐、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯类、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、对硝基苯基酯、酰基氯和磺酰氯。

23.权利要求8的方法，其中甲硫氨酸特异性缀合剂是一种烷基化剂。

24.权利要求23的方法，其中所述的烷基化剂选自α-卤代乙酰基化合物、芳基卤类、醛类和酮类。

25.权利要求8的方法，其中色氨酸特异性缀合剂选自N-溴琥珀酰亚胺、2-羟基-5-硝基苄基溴和对硝基苯基亚磺酰基氯。

26.权利要求8的方法，其中丝氨酸特异性缀合剂选自二异丙基氟磷酸酯和芳基磺酰基氟。

27.权利要求26的方法，其中丝氨酸特异性缀合剂是苯基甲基磺酰基氟。

28.通过权利要求1的方法制备的修饰配体。

29.具有下列通式的修饰配体：

L-R₁-A (I)

其中L是母配体；

其中A是与该母配体所结合的靶受体的部分反应的缀合剂，使得在所述缀合剂与所述受体部分之间可形成共价键；且

R₁是可选择的间隔基。

30.权利要求29的修饰配体，其中所述的间隔基包含选自烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、氧代烷基、杂氧代烷基、链烯基、杂链烯基、芳烷基、杂芳烷基、芳基和杂芳基的可水解基团。

31.一种包含权利要求28或权利要求29的修饰配体以及药物上可接受的载体的组合物。

32.一种治疗或预防与靶受体相关的疾病的方法，所述的方法包括对需要这类治疗的患者给予治疗有效剂量的一种组合物，其中所述组合物包含权利要求28或权利要求29的修饰配体以及药物上可接受的载体。

33.一种检测测试样品中是否存在靶受体的方法，该方法包括下列步骤：

-使所述样品与权利要求28或权利要求29的修饰配体接触，其中所述的修饰配体结合所述的靶受体，条件是所述的靶受体存在于所述测试样品中；和

-检测所述接触的样品中是否存在包含所述修饰配体和所述受体的复合物。

34.一种对测试样品中存在的靶受体进行定量的方法，该方法包括下列步骤：

-使所述样品与权利要求28或权利要求29的修饰配体接触，其中所述修饰配体结合所述靶受体，条件是所述的靶受体存在于所述测试样品中；

-测定所述接触的样品中包含所述修饰配体和所述受体的复合物的浓度；和

-建立所述测定的复合物浓度与所述样品中所述受体的浓度的关系。

35.一种检测细胞或细胞膜上是否存在靶受体的方法，该方法包括下列步骤：

-使含有所述细胞或细胞膜的样品与权利要求28或权利要求29的修饰配体接触，其中所述的修饰配体结合所述的靶受体，条件是所述的靶受体存在于所述细胞或细胞膜中；和

-检测所述接触的样品中是否存在包含所述修饰配体和所述细胞或细胞膜的复合物。

36.一种对细胞或细胞膜上存在的靶受体进行定量的方法，该方法包括下列步骤：

-使含有所述细胞或细胞膜的样品与权利要求18或权利要求19的修饰配体接触，其中所述修饰配体结合所述靶受体，条件是所述的靶受体存在于所述细胞或细胞膜上；

-测定所述接触的样品中包含所述修饰配体和所述细胞或细胞膜的复合物的浓度；和

-建立所述测定的复合物浓度与所述细胞或细胞膜上存在的所述受体浓度的关系。

37.共价结合靶受体的探针，所述探针包含与报道分子相连的权利要求28或权利要求29的修饰配体。

38.权利要求37的探针，它包含权利要求30的修饰配体。

39.权利要求28或权利要求29的修饰配体或权利要求37所述的探针在与靶受体相关的疾病的研究、治疗和预防中的用途。

40.权利要求28或权利要求29的修饰配体或权利要求37的探针在研究靶受体功能中的用途。

41.一种用于修饰母配体的方法，该方法包括下列步骤：使所述的母配体和与所述母配体所结合的靶受体的部分反应的缀合剂连接，其中当所述母配体与所述受体结合时，在所述缀合剂与所述部分之间形成共价键，且其中所述的母配体与核苷转运蛋白特异性结合。

42.权利要求41的方法，其中所述的缀合剂与所述的母配体通过一种间隔基连接。

43.权利要求42的方法，其中所述的间隔基包含选自烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、氧代烷基、杂氧代烷基、链烯基、杂链烯基、芳烷基、杂芳烷基、芳基和杂芳基的基团。

44.权利要求41的方法，其中所述的缀合剂选自硫氢基特异性缀合剂、氨基特异性缀合剂、羧基特异性缀合剂、酪氨酸特异性缀合剂、精氨酸特异性缀合剂、组氨酸特异性缀合剂、甲硫氨酸特异性缀合剂、色氨酸特异性缀合剂和丝氨酸特异性缀合剂。

45.权利要求41的方法，其中所述的缀合剂是选自N-顺丁烯二酰亚胺和N-顺丁烯二酰亚胺衍生物的硫氢基特异性缀合剂。

46.权利要求45的方法，其中所述的N-顺丁烯二酰亚胺衍生物选自包括5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)、4，4′-二硫代二吡啶、甲基-3-硝基-2-吡啶基二硫化物和甲基-2-吡啶基二硫化物在内的二硫化物试剂。

47.权利要求41的方法，其中所述的缀合剂选自烷基化剂和酰化剂。

48.一种用于修饰母配体的方法，该方法包括下列步骤：使所述的母配体和与所述母配体所结合的靶受体的硫氢基反应的硫氢基特异性缀合剂连接，其中当所述母配体与所述受体结合时，在所述缀合剂与所述硫氢基之间形成共价键，且其中所述的母配体与5-羟色胺受体特异性结合。

49.通过权利要求41的方法制备的修饰配体。

50.通过权利要求48的方法制备的修饰配体。

51.具有下列通式的修饰配体：

L-R₁-A (I)

其中L是与包括核苷转运蛋白的靶受体特异性结合的母配体；

其中A是与所述母配体所结合的靶受体的部分反应的缀合剂，使得当所述母配体与所述受体结合时，在所述缀合剂与所述部分之间形成共价键；和

R₁是可选择的间隔基。

52.权利要求51的修饰配体，其中所述的间隔基包含选自烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、氧代烷基、杂氧代烷基、链烯基、杂链烯基、芳烷基、杂芳烷基、芳基和杂芳基的不可水解基团。

53.权利要求51的修饰配体，其中所述的缀合剂是硫氢基特异性缀合剂。

54.权利要求52的修饰配体，其中硫氢基特异性缀合剂选自N-顺丁烯二酰亚胺和N-顺丁烯二酰亚胺衍生物。

55.权利要求51的修饰配体，其中所述的母配体与核苷转运蛋白特异性结合。

56.权利要求51的修饰配体，它与es核苷转运蛋白和/或核苷/核苷酸/核核苷碱基敏感性蛋白发生相互作用，其中所述的修饰配体具有选自下列的通式：

其中A是N-顺丁烯二酰亚胺、2-吡啶基联硫基或卤素；

X是NH、S或O；

Y是H、卤素、NH₂或O；

Z是H、卤素或CH₃；

R₁是任选包含优选在生理条件下不可水解的基团的间隔基；且

R₂是H、β-D-核糖、β-D-2-脱氧核糖或它们的5′一磷酸、5′二磷酸和5′三磷酸。

57.权利要求51所述的修饰配体，它具有选自下列的通式：

其中R₅是4-羰基-α-甲基-α-甲苯、6-[α-甲基-α-甲苯甲酰氨基]-己酸酯、N-[3-丙酸酯]或6-[3′-丙酰氨基]己酸酯；

和

其中R₅是4-羰基-α-甲基-α-甲苯、6-[α-甲基-α-甲苯甲酰氨基]-己酸酯、N-[3-丙酸酯]或6-[3′-丙酰氨基]己酸酯。

58.具有下列通式的修饰配体：

L-R₁-A (1)

其中L是与靶5-羟色胺受体特异性结合的母配体；

其中A是与所述母配体所结合的所述靶受体的硫氢基反应的缀合剂，使得当所述母配体结合所述受体时，在所述缀合剂与所述硫氢基之间形成共价键；且

R₁是可选择的间隔基。

59.权利要求58的修饰配体，其中所述的母配体包括5-羟色胺或其前体或其类似物。

60.权利要求58的修饰配体，其中该修饰配体具有选自下列的结构：LBT3001(1-[2-(5-羟基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-吡咯-2，5-二酮)

LBT3002(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-N-[2-(5-羟基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-丁酰胺)

(插入原文第58页倒数第1行结构式)LBT3004(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-N-[2-(5-羟基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-丙酰胺)；和LBT3005(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基甲基)-环己烷羧酸[2-(5-羟基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-酰胺)

61.一种包含权利要求51的修饰配体和药物上可接受的载体的组合物。

62.一种包含权利要求58的修饰配体和药物上可接受的载体的组合物。

63.一种检测测试样品中是否存在靶受体的方法，该方法包括下列步骤：

使所述样品与权利要求51的修饰配体接触，其中所述的修饰配体结合所述的靶受体，条件是所述的靶受体存在于所述测试样品中；和

检测所述接触的样品中是否存在包含所述修饰配体与所述受体的复合物。

64.一种对测试样品中存在的靶受体进行定量的方法，该方法包括下列步骤：

使所述样品与权利要求51的修饰配体接触，其中所述的修饰配体结合所述的靶受体，条件是所述的靶受体存在于所述的测试样品中；

测定所述接触的样品中包含所述修饰配体和所述受体的复合物的浓度；和

建立所述测定的复合物浓度与所述样品中所述受体的浓度的关系。

65.一种检测测试样品中是否存在靶受体的方法，该方法包括下列步骤：

使所述样品与权利要求58的修饰配体接触，其中所述的修饰配体结合所述的靶受体，条件是所述的靶受体存在于所述测试样品中；和

66.一种对测试样品中存在的靶受体进行定量的方法，该方法包括下列步骤：

使所述样品与权利要求58的修饰配体接触，其中所述的修饰配体结合所述的靶受体，条件是所述的靶受体存在于所述的测试样品中；

67.一种与靶受体共价结合的探针，所述的探针包含权利要求51的修饰配体，该修饰配体带有与之连接的报道分子。

68.权利要求51的修饰配体或权利要求67的探针在研究靶受体功能中的用途。

69.一种与靶受体共价结合的探针，所述的探针包含权利要求58所述的修饰配体，该修饰配体带有与之连接的报道分子。

70.权利要求58的修饰配体或权利要求69的探针在研究靶受体功能中的用途。