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CN1468251B - 一种用于均相检测核酸的特异性双链探针及其实施方法 - Google Patents

一种用于均相检测核酸的特异性双链探针及其实施方法 Download PDF

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CN1468251B CN018170129A CN01817012A CN1468251B CN 1468251 B CN1468251 B CN 1468251B CN 018170129 A CN018170129 A CN 018170129A CN 01817012 A CN01817012 A CN 01817012A CN 1468251 B CN1468251 B CN 1468251B
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Abstract

核酸检测探针包括一对互补的荧光剂/淬灭剂标记的寡核苷酸。其中一条比另一条短，都可以在杂交反应和扩增反应的实时检测中检测单链及双链靶序列。等长的双链探针可以用于PCR扩增反应的实时检测中。

Description

一种用于均相检测核酸的特异性双链探针及其实施方法
技术领域
本发明涉及一种用于核酸的均相特异性检测的新式探针，包括核酸的实时检测。
背景技术
传统的对核酸的特异性检测方法要求将杂交与未杂交的探针分离出来，而新的均相检测方法则取消了分离步骤，并且速度更快，简单并容易定量。已有多种核酸扩增技术被发明并且可以在2-3小时内扩增特异的核酸序列至几百万倍。然而，主要的凝胶电泳分析方法极大的妨碍了其在临床上的广泛应用。近来，均相检测与这些扩增技术的结合，特别是聚合酶链式反应(PCR)，极大的提高了核酸的基础诊断。因此定量实时PCR检测技术变得越来越广泛。
当前实时荧光PCR检测技术可以分为探针型和非探针型。探针型检测技术使用荧光探针，例如：5’-核酸外切酶技术(TaqMan探针)、分子信标、荧光能量转移探针、蝎子引物、点亮探针等。非探针型检测技术则使用荧光染色，例如SYBR GREEN1，以显示反应。非探针型检测技术尽管简单，但因其无法识别非特异扩增而在实际应用中受到很大限制。相对而言，探针型检测技术由于有第二识别步骤而更加可靠。但是，如前所述的这些目前的探针普遍存在设计及制造上复杂且价格昂贵等缺点。并且当前探针的另一个缺点在于其有限的特异性。即使是被称为最精确之一的分子信标，在一些具体实施中也不得不改进以识别单核苷突变。
本发明涉及用一种对核酸检测的均相特异性探针和新式探针。该探针在基本概念上与当前的探针不同。其设计简单、易于准备、便宜、非常精确，而且可以与当前任何核酸扩增技术相结合。
根据本发明的双链探针检测技术是基于寡核苷酸之间的杂交，竞争性反应超过当前探针使用的直接杂交。该探针不仅可以取得比当前探针更简单的方式，而且拥有比当前探针更多的优点。
发明概要
本发明涉及一种为核酸检测及其应用而特别设计的探针。该探针特别用于检测一种均相形式的核酸。该探针由两条被标记的不同长度的互补的寡核苷酸组成：其中一条上标记荧光供体，另一条标记淬灭剂或者荧光受体。在合适的条件下，探针是双链的。当探针链与靶杂交时，荧光强度发生改变。该探针在室温下可以识别与其完全匹配的靶序列，但与包含一个单个碱基突变的“靶序列”不发生反应。根据本发明的探针可以被用于实时核酸扩增检测技术。
根据本发明的探针可以由DNA，RAN，或者由二者共同组成。其可以由非自然核苷及非自然核苷链组成。其3’端可以被封闭以使之不能延伸。当我们提及探针的“寡核苷酸”时，包括前述部分。
本发明还涉及双链探针技术的应用。用于杂交检测单链靶序列的前述探针，检测双链靶的技术，如典型的PCR扩增，也可以包括有同样长度的互补寡核苷酸的双链探针。
附图说明
图1、双链探针及其反应原理的示意图。
图2、双链探针在PCR检测时处于变性及退火阶段的反应原理示意说明。
图3、与靶完全匹配及单核苷突变的双链探针的反应机制。
图4、双链探针实时PCR检测。从上至下，模板被连续10倍稀释，直至最后样品水。
图5、在实时PCR使用单核苷突变检测用于同样的反应管中，一双链探针与野生型靶互补，第二双链探针与突变靶互补。
发明内容
双链探针构成
依据本发明的双链探针由一对互补的不同长度的寡核苷酸构成。其中一条链标记荧光剂，而另一条标记淬灭剂。在少数的特定的具体实施中，淬灭剂可以由一种荧光剂的荧光受体代替。双链探针在不同的条件下可以有不同的形态，并反应在荧光的变化上。当在稳定的双链结构中自身杂交时，荧光剂及淬灭剂，或者荧光供体及受体，十分靠近。荧光剂或者供体被淬灭剂或者受体淬灭，在荧光剂或者供体的荧光发射波长内探针没有荧光。当在变性的条件下，比如在酸性，碱性或者高温溶液中，探针的双链分离，荧光剂(或者荧光供体)发出荧光。在杂交溶液中存在靶序列时，较长的探针可以自发地与靶杂交，双链探针分离，荧光剂(或者荧光供体)发出荧光。
双链探针与靶自发地发生反应
不同长度的链的双链探针可以与溶液中单链寡核苷酸发生反应。在这种反应中，双链探针中的短链可以被靶寡核苷酸序列置换形成一种热力学更稳定的复式结构。双链探针分离的结果引起荧光的产生。在该反应中，双链探针的简单设计的实施方案有能力在室温下可以将完全匹配的靶从单核苷突变的靶中检测出来。其非常高的特异性基于在与探针本身的双链结构比探针和靶形成的结构更稳定。双链探针比单链探针更优越，因为单链探针能量是不稳定，并即使靶序列存在突变时其可以与其他单链多核苷酸杂交。分子信标比线性探针更特异是因其稳定的茎环结构可以减少较不稳定的突变反应。然而，分子信标的识别部分—环，仍然是单链，如果茎不够长或者环序列太长的话，其仍留有突变杂交的空间。近来的一份报告反应当分子信标与NASBA(一种著名的等温核酸扩增技术)结合时不能直接用于单核苷的区别。
根据图1，双链探针1由互补的不同长度的寡核苷酸2、3组成。较长的链，在本例中为正链2，用荧光剂4标记，较短的负链3用淬灭剂5标记。该探针不发荧光因为荧光剂与淬灭剂紧密靠近。在靶6存在时，负链3被靶置换，并远离荧光剂4，从而发出荧光。如果荧光剂4与淬灭剂相互交换，可以得知荧光同样也会产生。
双链探针与核酸扩增的结合使用
如上所述，根据本发明的双链探针可以与单链靶自发反应。我们发现，其也可以被用于检测在实时反应中新产生的单链扩增产物。在典型PCR周期中包括高温变性、低温退火及造温延伸。双链探针在变性(或者溶化)阶段因高温变性并产生荧光。在退火阶段，如果没有靶存在，探针的双链将处于双链结构，因此将不产生荧光。但是，当靶存在时，两个探针将与靶杂交，因此将产生荧光。在延伸阶段，探针链从靶上解离，通过对PCR阶段的每次退火步骤的测量，在实时状态中扩增产物可以被检测。
在退火阶段，如果靶不存在，该探针将自身退火并不发出荧光。可是，当靶存在时，该探针的有荧光标记的链，即所说的正链，从负链分离，与靶杂交，并发出荧光。当温度升高时(72℃)，引物可以延伸，双链探针与靶分离不影响链的延伸，通过在每个周期的退火阶段测量荧光的亮度，PCR反应在实时状态被检测。
根据图2所示一种双链探针21和双链扩增产物30，在媒介PCR周期中二者都存在于PCR扩增反应中。探针21包括链22，由荧光剂24标记，以及互补的链23，由淬灭剂25标记。标记可以被标于链的平端的终端，如图所述，链22、23是同等长度的，他们可以但不是必须用在实时PCR。扩增产物30包括互补的链31、32，在高温变性时，探针的链22、23相分离，扩增产物的链31、32也同样分离。当温度低于退火温度时(为PCR引物退火)，探针链22、23退火或者和其互补的扩增产物的靶的链杂交。荧光剂24不被淬灭剂淬灭，而发出荧光。
双链探针的设计方法
双链的相对长度：在大多数情况下，探针的双链长度不同，一般的，对于PCR，较长的链比较短的链长1-5的基本长度，对于等温等位基因，两条链的长度差为2-10个基本长度，最佳为2-7。根据本发明的一部分具体实施方案的技术中，如用于RNA检测的双链探针或者用于实时PCR的双链探针，其正负靶链与探针链分别杂交，两个链可以是同等长度。
双链探针的标记位置：荧光剂与淬灭剂均可标记在终端或者中部。在具体实施中，它们也可以被标记在互补的双链的终端。特别的，荧光剂与淬灭剂可被标记在探针的平端。在一些情况下，特别是当探针被荧光剂能量供体或者受体标记时，其标记的位置可以根据最佳能量传送调整。一些特定的但不是有限的具体实施中，荧光能量供体与受体都标记在探针双链的终端，其中一个链一般用加磷的基团封闭。
双链探针的最合适的结构：双链探针可以与普通的核酸扩增(特别是PCR)结合使用，在实时和反应完成后可以与被测量的扩增产物相结合。对于实时检测，荧光剂在退火温度时被测量。当前可利用的实时扩增/检测仪器和可使用的双链探针包括：AppliedBiosystems(ABI)公司的Mode17700及Model5700，Bio-Rad公司的IQ Cycler，Hoffmann-La Roche公司的LightCycler以及Corbett Research公司的Rotor-Gene2000等等。
双链探针的积极效果
设计简单方便：在设计双链探针时其对整个反应体系没有太多的要求。与当前双染料标记探针或者相邻杂交探针相比，其设计本身十分简单。根据本发明探针可以由任何熟悉通常探针设计的人来设计。
制备简单：标记过程仅是单一染色修饰，包括在对双链探针的链的准备过程中，其可以被任何无需附加技术设备的DNA合成实现。纯化仅需一步。这比其他需要多步修饰及纯化，并且产率低，价格贵的双修饰探针先进。
高特异性：分子信标已经证明，结构限制型探针特异性比通常的线性探针高。双链探针是在概念上是一种结构限制型探针。仅当释放的能量大于双链探针的产生的能量时，该探针可以与靶杂交。如果靶发生突变时，该双链探针保持能量稳定性的，其可以保持自身的双链状态而不发生任何反应。
具体实施例
实施例1：双链探针与靶自发的发生自发反应
10mM Tris-HCI(Ph8.0)中的0.80μM的两探针50μL，内含1.5mM MgCl2，保持在25℃，由Varian公司的荧光分析器Eclipse随时测量。在25℃时测定荧光强度2分钟。然后加入二倍摩尔浓度(16μM的5μL溶液)的靶寡核苷酸，每隔15秒记录荧光剂的荧光信号。探针两个链的核苷序列为5’FAM-ACGAACCTCAAACAGACACCAT-3’(长链)和5’-TGTCTGTTTGAGGTTGCT-dabcyl-3’(短链)。与长链互补的靶的序列为：5’-CCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-3’，靶包含的单核苷置换(突变的靶)序列是5’-CCATGGTGTCTGTTTCAGGTTGCT-3’，其中下划线处证明该核苷被置换。
图3表示对完全互补的靶(线41)和突变的靶(线42)的实时荧光信号(F)观测。可以发现荧光强度上升了20倍以上。如果在靶中有一个单核苷突变，将不会产生荧光信号。
实施例2：人的β珠蛋白双链探针实时PCR检测
为测试作为在PCR技术中实时扩增产物的检测器的双链探针的有效性，PCR模板为一系列稀释样品。每50μL反应包括5μL系列稀释的模板，0.2μM的双链探针，每个引物0.4μM，2.0单位的Taq酶，每daTP200μM，50mM KCI，2.0mM MgCl2，以及10mMTris-HCI(pH8.3)。经94℃，5分钟变性，用荧光扩增仪(Rotor-Gene2000，CorbettResearch)，在封闭的试管中执行扩增40个循环(95℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟)。荧光数据在退火阶段被采集。提取的原始DNA模板10倍稀释。水作为对比样品。双链探针包括一个与扩增产物互补的核酸序列。简单来说，探针与靶互补，然而，熟悉扩增及检测的人们将通过我们所说的“靶”了解到在本案中是完整的单链靶及其互补物，二者都是PCR扩增产物的上游及下游。扩增人β珠蛋白基因(GenBank codeHuMMB5E，-195~＝73)，扩增片段长268bp。其引物分别为5’-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3’及5’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3’，探针的靶序列被置于扩增产物的中部，探针正链与负链分别为5’-FAM-AGCAACCTTCAAACAGACACCATGG-P04-3’及5’-GGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-dabcyl-3’。
在PCR扩增时荧光(F)实时检测测量了40个循环，其结果如图4所示。初始的靶浓度在稀释物最浓时的线51持续降低至最稀时的线54。线55说明无靶(水)的对比。
与引物相同的浓度下，双链探针可以很快与靶反应。没有靶时，探针片段很快地互相结合并淬灭其自身的荧光。因此，它们可以用于实时核酸检测技术。用于检测人类β珠蛋白的PCR技术中，我们选择一个熔化温度(Tm)接近于引物的20核苷的负链，和一个为了取得一个探针—靶杂交的熔点高于10℃的24核苷的正链。我们称该探针为“24/20探针”。在退火阶段，该探针在靶不存在时自身退火不发出荧光。但是，在靶存在时，探针的正链与负链分离，与靶杂交，并发出荧光。当温度上升致使引物可以延伸时(72℃)，探针的双链与靶相分离并不影响链的延伸。
不同长度的11个双链探针(22/22至22/17及20/20至20/16)都被研究，即使双链是等长的，它们在实时PCR中均工作良好。这些发现证明了对于实时PCR，双链探针的设计具有很强的适应性。
实施例3：实时PCR突变检测
为论证本发明的探针与实时PCR在单核苷突变检测中的效用，我们准备了两个模板，一个是从人β珠蛋白基因中提取的模板(靶)DNA，另一个通过单核苷突变的。我们同样准备了一个与“野生型”靶互补的双链探针和一个与“突变型”靶互补的双链探针。我们设计的用于Taq DNA聚合酶的探针在探针一靶杂交时熔点比典型的PCR退火温度(大约50℃)高约10℃，比特定延伸温度(大约72℃)低约10℃。该探针均为24/20探针(阳极链长为24核苷，比阴极链长4个核苷)。一探针与标有FAM的野生型的靶互补，另一探针与标有Texas Red的突变异种的靶互补。均有dabcyl淬灭剂。均由探针限制延伸物封闭。因为有不同的荧光光谱，每个荧光剂可以被区别检测。在存在的两个双链探针中我们做了4个PCR反应。4个反应的扩增的靶不同，分别为：无(阴性)靶序列，仅为野生型靶(Wild)，仅为突变型靶(Mutant)，以及野生型与突变型靶均有(Wild+Mutant)的反应。
探针的正链特异于人β-珠蛋白基因的野生型序列，其是一个24-mer的序列：FAM-5’-AGCAACCTCAAACAGACACCATGG-3’-P03，而探针的负链是一个20-mer的序列：5’-ATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-3-dabcyl。特异于突发型版本的β珠蛋白的探针的两个链是：TexasRed-5’-AGCAACCTGAAACAGACACCATGG-3’-P03及5’-ATGGTGTCTGTTTCAGGTTGCT-3’-dabcyl。每个探针的两条链在将它们加入反应混合前都被互相退火。与野生型及突变型的β-珠蛋白相应的DNA模板通过生物体外的突变形成方式准备。用于实时PCR的引物为5’-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3’及5’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3’。每50个微升反应包括5000模板拷贝，0.4微升引物，每个探针的0.2微升正链及0.24微升负链，随同PCR所要求的的4.0mM MgCl2和其他组分。在一个荧光热周期中执行94℃温育反应混合物5分钟，再经过30秒95℃，50℃60秒，72℃1分钟，40循环。荧光在退火阶段被监测。图5显示了实时荧光PCR循环数据的结果。相对于野生型靶的探针发出的荧光被实心圆环表示(黑点)，相对于突变异种靶的探针发出的荧光被空心的圆环表示。
相对于阴性样本，野生型探针(曲线71)，及突变型探针(曲线72)，均没有发出荧光(F)。结果显示仅当模板包括在反应中相应荧光强度的增加。当两个靶均在样本中时，野生型探针(曲线73)，及变异探针(曲线74)，荧光强度显著增加。但是，对于野生型靶，荧光强度显著增强来自于野生型探针(曲线75)，而不是突变异种型探针(曲线76)。相反，对于突变型靶，荧光强度显著增强来自于突变型探针(曲线78)，而不是野生型探针(曲线77)。结果显示仅仅是匹配的探针可以产生正确的信号。野生模板与突变异种模板的100％完全检测。这证明了根据本发明的探针通过一个单核苷区分了靶。当无模板时无信号被发现，当有两个模板时，两个信号均被发现。
我们还研究了在双链探针中温度“窗口“，可以被用于分离单核苷突变。已有的研究显示分子信标有一个比线性探针大的窗口，因此，较好分离。虽然如此，分子信标的窗口在低温时还没有足够大到可以分离，这解释了报告的分子信标在分离等温扩增中的等位基因的失败的原因。我们发现根据本发明的双链探针有更大的窗口，可以相信使它们可以适合于等温扩增反应中的区分。

Claims (20)

1.一种针对预先选择的核酸靶序列的双链核酸杂交探针，包括：
一个第一寡核苷酸，其包括一个与所述的靶序列完全互补的第一序列；
一个第二寡核苷酸，其包括一个与所述的第一序列互补的第二序列，但比所述的第一序列短10个核苷以内；
一个荧光剂标记在所述第一和第二寡核苷酸的其中一个上，以及
第二标记从淬灭剂和荧光受体组成的基团中产生，并附在所述第一或者第二寡聚核苷酸的另一条上，使得当所述寡核苷酸被互相杂交时所述荧光标记物可以发生相互作用。
2.根据权利要求1所述的一种双链探针，其特征在于，第一和第二寡核苷酸杂交产生一个双链平端，所述荧光剂标记与所述第二标记均附在所述平端上。
3.根据权利要求1或2所述的一种双链探针，其特征在于，所述第一和第二寡核苷酸有一个被封闭的3’端，使其不能被聚合酶延伸。
4.根据权利要求1所述的一种双链探针，其特征在于，第一和第二寡核苷酸至少有一个由至少包括一个非自然的核苷或者至少一个非自然的核苷链。
5.根据权利要求1所述的一种双链探针，其特征在于，所述的第二寡核苷酸比所述的第一寡核苷酸短1～5个核苷。
6.根据权利要求1所述的一种双链探针，其特征在于，所述的第二寡核苷酸比所述的第一寡核苷酸短2～7个核苷。
7.根据权利要求6所述的一种双链探针，其特征在于，所述的第一和第二寡核苷酸杂交产生一个双链平端，所述的荧光剂标记及所述的第二标记均被标记在该平端上。
8.一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其中靶扩增产物采用荧光标记杂交探针检测，包括使用一种双链核酸杂交探针对所述靶序列进行杂交检测，其中所述的双链核酸杂交探针包括：
一个第一寡核苷酸，其包括一个与所述的靶序列完全互补的第一序列；
一个第二寡核苷酸，其包括一个与所述的第一序列互补的第二序列，但比所述的第一序列短10个核苷以内；
一个荧光剂标记在所述第一和第二寡核苷酸的其中一个上，以及
第二标记从淬灭剂和荧光受体组成的基团中产生，并附在所述第一或者第二寡聚核苷酸的另一条上，使得当所述寡核苷酸被互相杂交时所述荧光标记物可以发生相互作用。
9.根据权利要求8所述的一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其特征在于，所述第一和第二寡核苷酸杂交产生一个双链平端，所述荧光标记及所述第二标记均被标记在该平端上。
10.根据权利要求8或9所述的一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其特征在于，所述第一及第二寡核苷酸有一被封闭的3’端，使其不能被聚合酶延伸。
11.根据权利要求8所述的一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其特征在于，所述第一及第二寡核苷酸至少有一个包括至少一个非自然的核苷或者至少一个非自然的核苷链。
12.一种实时核酸扩增及检测方法，其中含有至少一个碱基不同的等位基因的至少两个靶序列，每个等位基因靶序列的扩增产物都可以被与其互补的荧光标记杂交探针检测到，其改进在于，每个杂交探针对于等位基因靶序列都是双链核酸杂交探针，包括：
一个第一寡核苷酸，其包括一个与所述的靶序列完全互补的第一序列；
一个第二寡核苷酸，其包括一个与所述的第一序列互补的第二序列，但比所述的第一序列短10个核苷以内；
一个荧光剂标记在所述第一和第二寡核苷酸的其中一个上，以及
一个淬灭剂附在所述第一或者第二寡聚核苷酸的另一条上，使得当所述寡核苷酸被互相杂交时所述荧光标记物可以发生相互作用，和
所述双链探针中的每个荧光标记都可被识别检测。
13.根据权利要求12所述的一种实时核酸扩增及检测方法，其特征在于，所述第一和第二寡核苷酸杂交产生一个双链平端，所述荧光标记及所述淬灭剂均被标记在该平端上。
14.根据权利要求12或13所述的一种实时核酸扩增及检测方法，其特征在于，所述第一及第二寡核苷酸有一被封闭的3’端，使其不能被聚合酶延伸。
15.根据权利要求12所述的一种实时核酸扩增及检测方法，其特征在于，第一和第二寡核苷酸至少有一个由至少包括一个非自然的核苷或者至少一个非自然的核苷链。
16.一种针对预先选择的核酸靶序列的双链核酸杂交探针，由以下成分组成：一个第一寡核苷酸，其包括一个与所述的靶序列完全互补的第一序列；一个第二寡核苷酸，其包括一个与所述的第一序列互补的第二序列，但比所述的第一序列短10个核苷以内；一个荧光剂标记，在所述第一和第二寡核苷酸的其中一个上；以及一第二标记，从淬灭剂和荧光受体组成的基团中产生，并附在所述第一或者第二寡聚核苷酸的另一条上，使得当所述寡核苷酸被互相杂交时所述荧光标记物可以发生相互作用。
17.根据权利要求16所述的一种双链探针，其特征在于，所述第一和第二寡核苷酸有一个被封闭的3’端，使其不能被聚合酶延伸。
18.根据权利要求17所述的一种双链探针，其特征在于，所述的第二寡核苷酸比第一寡核苷酸短1～5个核苷。
19.根据权利要求18所述的一种双链探针，适合于在含引物延伸的PCR扩增反应检测所述的预先选择的靶序列，其特征在于，所述的探针在所述的引物延伸期间从所述靶序列中脱离。
20.根据权利要求17所述的一种双链探针，其特征在于，所述的第二寡核苷酸比所述的第一寡核苷酸短2～7个核苷。
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Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1348096A (zh) * 2000-10-10 2002-05-08 栾国彦 一种均相特异性检测核酸的探针及应用方法
US9261460B2 (en) * 2002-03-12 2016-02-16 Enzo Life Sciences, Inc. Real-time nucleic acid detection processes and compositions
CN1294276C (zh) * 2003-07-22 2007-01-10 厦门大学 检测核酸的等长双链特异性探针
AU2004261850A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-10 The Circle For The Promotion Of Science And Engineering Partially double stranded nucleic acid molecule
CA2548205C (en) 2003-12-03 2017-06-27 Abbott Laboratories Double stranded linear nucleic acid probe and uses thereof
BRPI0508100A (pt) * 2004-02-28 2007-07-17 Chang Ning J Wang complexos de ácido nucléico bem como processo para detecção e sistema multifásico
DE102004026494A1 (de) * 2004-05-27 2005-12-22 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Hochselektiver Nachweis von DNA-Molekülen mit gemischten PNA-DNA-Systemen
EP1753774B1 (en) * 2004-06-02 2008-09-10 ASM Scientific, Inc. 2"-nitrobenzyl-modified ribonucleotides
GB0419325D0 (en) * 2004-09-01 2004-09-29 Perkinelmer Ltd A method of analysing a sample including fluorescent labels and apparatus therefor
GB0510979D0 (en) 2005-05-28 2005-07-06 Kbiosciences Ltd Detection system for PCR assay
US11001881B2 (en) 2006-08-24 2021-05-11 California Institute Of Technology Methods for detecting analytes
WO2007143669A2 (en) 2006-06-05 2007-12-13 California Institute Of Technology Real time micro arrays
US7972786B2 (en) * 2006-07-07 2011-07-05 Brandeis University Detection and analysis of influenza virus
US11525156B2 (en) 2006-07-28 2022-12-13 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
WO2008014485A2 (en) 2006-07-28 2008-01-31 California Institute Of Technology Multiplex q-pcr arrays
US11560588B2 (en) 2006-08-24 2023-01-24 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
EP1911852B1 (en) * 2006-10-12 2009-07-29 Bio-Rad Pasteur Double-stranded probes for the fluorescent detection of nucleic acids
JP5013604B2 (ja) * 2007-07-24 2012-08-29 株式会社スギヨ 海藻ペーストの製造方法及びその方法によって得られた海藻ペースト
WO2010130877A2 (en) * 2009-05-12 2010-11-18 Abacus Diagnostica Oy Method for detecting nucleic acids
CN101845498B (zh) * 2010-04-29 2013-05-08 厦门艾德生物医药科技有限公司 一种用于核酸特异识别检测的探针
DE102010025161A1 (de) * 2010-06-25 2011-12-29 Qiagen Gmbh Verfahren zum Nachweis von Ribonukleinsäuren
US20120052502A1 (en) * 2010-08-30 2012-03-01 Samsung Techwin Co., Ltd. Real-time pcr detection using stabilized probes
CN103328654B (zh) 2010-10-27 2017-07-11 哈佛学院院长等 立足点引物双链体的组合物及其使用方法
WO2012151328A2 (en) 2011-05-02 2012-11-08 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequestration of dynamic nucleic acid circuits
CN108342453A (zh) 2011-05-09 2018-07-31 富鲁达公司 基于探针的核酸检测
US9644231B2 (en) 2011-05-09 2017-05-09 Fluidigm Corporation Nucleic acid detection using probes
DE102011078342A1 (de) * 2011-06-29 2013-01-03 Aj Innuscreen Gmbh Rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von spezifischen Nukleinsäuren in Echtzeit
CN103975061A (zh) 2011-10-31 2014-08-06 荣研化学株式会社 靶核酸的检测方法
JP2015524670A (ja) * 2012-08-16 2015-08-27 エヌブイエス テクノロジーズ，インコーポレイティド アッセイ方法及び系
CN105378160B (zh) 2013-08-12 2018-04-17 伯乐生命医学产品有限公司 具有碱基配对的寡聚体的扩增报告子
JP5928906B2 (ja) * 2013-08-27 2016-06-01 横河電機株式会社 核酸配列計測方法、核酸配列計測用デバイス、核酸配列計測用デバイスの製造方法および核酸配列計測装置
EP3084051B1 (en) * 2013-12-16 2020-01-01 William Marsh Rice University Fine-tuned ultraspecific nucleic acid hybridization probes
US9441268B2 (en) * 2014-11-26 2016-09-13 Roche Molecular Systems, Inc. Detecting single nucleotide polymorphism using overlapping hydrolysis probes
CN108026580A (zh) * 2015-03-19 2018-05-11 康代思锐公司 用于核酸检测的被编码的双链探针及其用途
US9708647B2 (en) 2015-03-23 2017-07-18 Insilixa, Inc. Multiplexed analysis of nucleic acid hybridization thermodynamics using integrated arrays
US9499861B1 (en) 2015-09-10 2016-11-22 Insilixa, Inc. Methods and systems for multiplex quantitative nucleic acid amplification
CN105506126B (zh) * 2016-01-12 2019-02-26 重庆大学 具有较大张力的小环形核苷酸探针及其制备方法和应用
CN113832215B (zh) 2016-02-09 2024-02-06 荣研化学株式会社 对目标核酸进行检测的方法
WO2017155858A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Insilixa, Inc. Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension
JP6584986B2 (ja) * 2016-03-18 2019-10-02 株式会社東芝 核酸検出方法
EP3472353B1 (en) 2016-06-16 2021-08-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method of detecting salmonella typhimurium
GB201617491D0 (en) * 2016-10-14 2016-11-30 Moorlodge Biotech Ventures Limited Amplification of nucleic acids
CN107236815A (zh) * 2017-07-18 2017-10-10 江西贤聚景欣医药生物科技有限公司 用于靶核酸序列检测的多重淬灭荧光探针及方法
KR101899371B1 (ko) * 2017-07-25 2018-10-29 (주)엔바이오텍 핵산 복합체 페어, 핵산 복합체 페어를 포함하는 pcr용 키트, 및 핵산 복합체 페어를 이용한 타겟 검출 방법
JP7035972B2 (ja) * 2018-11-09 2022-03-15 横河電機株式会社 核酸配列計測用デバイス
CN109652516A (zh) * 2018-12-29 2019-04-19 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种双链寡核苷酸核酸探针的结构和用途
EP3937780A4 (en) 2019-03-14 2022-12-07 InSilixa, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR TIMED FLUORESCENCE-BASED DETECTION
CN114555829A (zh) 2019-10-02 2022-05-27 新泽西鲁特格斯州立大学 检测稀有序列变体的测定方法和试剂盒
WO2022132955A2 (en) * 2020-12-16 2022-06-23 Proof Diagnostics, Inc. Coronavirus rapid diagnostics
WO2023023673A2 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Kasa Bio, L.L.C. Compositions and methods for multiplex detection of mirna and other polynucelotides
EP4148143A1 (en) * 2021-09-13 2023-03-15 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (CSIC) Polypurine reverse hoogsteen hairpins and parallel clamps and their use as biosensors
US20230313283A1 (en) * 2022-02-28 2023-10-05 Trustees Of Boston University Isothermal nucleic acid detection assays and uses thereof
KR20250086619A (ko) 2022-10-14 2025-06-13 주식회사 씨젠 상이한 tm 값을 가지는 2개의 프로브를 이용하여 샘플 내 타겟 핵산을 검출하는 방법
EP4621068A1 (en) 2022-11-16 2025-09-24 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid by quenching-pto cleavage and extension (q-ptoce) assay

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1190838A (en) 1981-07-17 1985-07-23 Cavit Akin Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer
US4766062A (en) * 1984-05-07 1988-08-23 Allied Corporation Displacement polynucleotide assay method and polynucleotide complex reagent therefor
AU600900B2 (en) 1985-05-02 1990-08-30 Genetics Institute Inc. Process and nucleic acid construct for producing reagent complexes useful in determining target nucleotide sequences
CA1273552A (en) * 1985-12-23 1990-09-04 Michael J. Heller Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays
ATE88761T1 (de) 1986-01-10 1993-05-15 Amoco Corp Kompetitiver homogener test.
EP0601889A2 (en) 1992-12-10 1994-06-15 Maine Medical Center Research Institute Nucleic acid probes
PT728218E (pt) * 1993-11-12 2008-04-08 Phri Properties Inc Sondas de hibridação para detecção de ácidos nucleicos, troncos universais, métodos e estojos
US5925517A (en) * 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
AU693023B2 (en) 1995-05-05 1998-06-18 Applied Biosystems, Llc Methods and reagents for combined PCR amplification and hybridization probing assay
US5716784A (en) * 1996-02-05 1998-02-10 The Perkin-Elmer Corporation Fluorescence detection assay for homogeneous PCR hybridization systems
DE69734576T2 (de) * 1996-03-01 2006-08-03 E.I. Dupont De Nemours And Co., Wilmington Methode zur vervielfältigung und zum nachweis eines gewünschten nukleinsäurefragments
CA2252048C (en) * 1996-04-12 2008-03-11 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detection probes, kits and assays
US7803528B1 (en) * 1997-02-28 2010-09-28 Quest Diagnostics Incorporated Fluorescence energy transfer by competitive hybridization
WO1999049293A2 (en) * 1998-03-24 1999-09-30 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to detection complexes
GB9819417D0 (en) * 1998-09-07 1998-10-28 Secr Defence Reaction method
US6277607B1 (en) * 1999-05-24 2001-08-21 Sanjay Tyagi High specificity primers, amplification methods and kits
CN1348096A (zh) 2000-10-10 2002-05-08 栾国彦 一种均相特异性检测核酸的探针及应用方法
US6593091B2 (en) * 2001-09-24 2003-07-15 Beckman Coulter, Inc. Oligonucleotide probes for detecting nucleic acids through changes in flourescence resonance energy transfer

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CA2424856C (en) 2014-03-11

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