CN1453361A - 一种抗癌靶向可调控基因－病毒的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域。本发明提供了一种抗癌靶向可调控基因－病毒的构建方法。本发明构建了携带有反式作用元件(trans－activator，TA)表达盒以及抗癌基因表达盒的无肠腺病毒或AAV。这两个表达盒结构相对独立、功能直接相关，使得目的基因的表达受hTERT控制仅限于肿瘤细胞并受小分子药物RU486的诱导，需要时打开，不需要时关闭，这样既避免了外源基因产物对正常组织的伤害，也实现了外源基因的长久表达(至少一年以上)。克服了传统的腺病毒载体靶向性差、目的基因表达不受控制以及表达时间短等缺点。本发明构建的无肠腺病毒载体，可以开发出有效的治疗肿瘤的抗癌新药。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种抗癌靶向可调控基因-病毒的构建方法。
背景技术：
基因治疗是近十多年兴起的一种生物高技术方案，在整个基因治疗方案中肿瘤基因治疗方案占60％以上，基因治疗被认为是人类最终征服肿瘤的希望。目前作为基因治疗的载体分为病毒和非病毒型两大类，病毒载体包括：腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、和疱疹病毒等；非病毒载体包括：裸露DNA、脂质体和其它物质包裹的DNA。病毒载体介导的基因治疗在近年得到迅速发展，其中在肿瘤的基因治疗中较为常用的还是腺病毒载体，这是因为腺病毒可感染多种类型的细胞，包括分裂期细胞和非分裂期细胞，它可以被大规模的培养并获得高滴度的病毒纯品。
野生型腺病毒是一种双链DNA病毒，基因组长度约36kb，分早期和晚期转录区。其早期转录区包含E1-E4基因，编码病毒的调节蛋白；晚期转录区分L1-L5区，编码病毒结构蛋白。目前对人腺病毒2型(adenovirus type2，Ad2)以及人腺病毒5型(Ad5)的研究背景最为清楚，腺病毒载体则以Ad2和Ad5为基础构建而成。重组腺病毒最大包装容量为野生型基因组±5％，即插入外源基因的长度为2kb左右，要插入大片段的外源基因就必须缺失一段腺病毒的基因组成分，缺失太多也不行，那就要补充一些核苷酸片段。
第一代腺病毒载体：缺失腺病毒基因组的E1区(有时还包括E1与E3区同时缺失)而构建的载体。E1区位于腺病毒基因组1.0-10.6mu处，为病毒复制必需区。缺失E1区的腺病毒只能在有E1区基因产物表达的细胞(如293细胞或其它类似细胞)内复制，因此这样的载体也叫复制缺陷型载体。E1区缺失长度可达3.2kb，E3区也可缺失，缺失长度可达3.1kb。E3区基因是病毒复制的非必需基因，缺失E3区的腺病毒载体仍有复制能力。目前使用的第一代腺病毒载体大多是E1与E3区同时缺失，携带外源基因的容量可达8.3kb。第一代腺病毒载体的基因转移和表达效率很高，但是第一代腺病毒携带外源基因表达的同时也表达一定水平的病毒本身的蛋白，容易引起宿主细胞对病毒蛋白的免疫反应，病毒被清除，外源基因的表达会受到限制，此时用腺病毒载体再次感染时，已经形成的免疫应答会很快地将其清除，使得病毒携带的外源基因无法表达。为了延长腺病毒介导的外源基因表达时间，就必须开发出新的腺病毒载体。
第二代腺病毒载体：腺病毒的免疫原性主要产生于病毒表达的晚期蛋白，而晚期蛋白的表达在很大程度上受早期基因产物的控制，因此第二代腺病毒载体是在第一代腺病毒载体的基础上又将E2和E4基因进行改造或缺失，削弱早期基因的功能以减少晚期蛋白的表达量。第二代腺病毒为E1、E3缺失同时伴有E2或E4区缺失，因此外源基因的插入量可大到14kb。第二代腺病毒载体虽然在一定程度上降低了自身的免疫原性，但是病毒的复制能力比第一代腺病毒减低了很多，同时载体的免疫原性仍然无法完全消除，而且由于第二代腺病毒的制备方法各不相同、不统一等等，第二代腺病毒还不如第一代腺病毒那样为科学家所青睐，故较少使用。
第三代腺病毒载体为无肠腺病毒载体(gutless adenovirus，简称GL-Adv)，它缺失了腺病毒基因组的所有编码区，仅保留有腺病毒的反向末端重复序列(ITR)、病毒包装信号(ψ)。因为腺病毒本身所有的编码区基因已全部被除去，病毒失去了包装能力，为了达到其有效包装长度，还需装入一些无关的DNA序列(如intron)，当再加上外源目的基因后，使病毒基因组的总长度不小于30kb，但又不能超过38kb。由于第三代腺病毒载体完全消除了免疫原性，又可使外源基因能得到长期表达，这些特点使得无肠腺病毒成为了基因治疗的最好载体之一。
但是，第三代腺病毒由于缺失了基因组的所有编码区，病毒本身不能复制，产生子代病毒粒子必须是在特殊的包装细胞内、并有辅助病毒的参与才能完成。目前用于无肠腺病毒包装的细胞系是293Cre4，它是在普通的293细胞系中转入Cre重组酶基因，使该细胞系能稳定表达重组酶。Cre重组酶能识别大小为34bp的loxP序列，如果某基因或某一DNA片段的两端各有一loxP序列，在有Cre重组酶存在的情况下，由于loxP序列会发生同源重组，该基因或DNA片段被剪切下来，如图2所示。
用于无肠腺病毒包装的辅助病毒是helper virus H14，该病毒与第一代腺病毒基本一致，所不同的是在其基因组的包装信号(ψ)两端各加一拷贝的loxP序列，当病毒感染293Cre4细胞时，细胞内的Cre重组酶会将包装信号(ψ)切掉，辅助病毒不能包装，但当有无肠腺病毒同时感染时，辅助病毒所产生的晚期蛋白可用于无肠腺病毒的包装，而辅助病毒因为本身的包装信号被切掉，不能被包装成病毒。
第一代腺病毒由于有一定的抗原性，进入机体后易被血清中抗体所清除，病毒在体内存留时间仅能维持1-2个月。为了达到外源基因长期表达的效果，我们使用了第三代腺病毒载体。
发明内容：
本发明地目的就在于克服肿瘤基因治疗中所使用的第一代腺病毒载体具有免疫原性强的缺点，取而代之以无免疫原性的无肠腺病毒或免疫原性极小的AAV载体，使无肠腺病毒或AAV载体不受机体免疫系统的攻击，进而使所携带的外源基因能长久有效地在肿瘤中表达。
腺相关病毒(Adeno-associated Virus，AAV)是免疫原性极小、可以长期使用而不会失活的载体，但是过去制备不过关，得不到高滴度的AAV，现已过关，可以用于临床，因此，在本发明中，AAV可与无肠腺病毒平行使用，作为我们下面两个表达盒的载体：
如图1所示，第一个表达盒为反式作用元件(trans-activator，TA)表达盒，在本发明中称之为表达盒-1；第二个表达盒为抗癌基因表达盒，在本发明中称表达盒-2。本发明所采用的技术方案就是在无肠腺病毒或AAV载体上装入表达盒-1及表达盒-2。
表达盒-1的构成是：(1)肿瘤组织特异性启动子；(2)反式作用元件(trans-activator，TA)，TA的构成依次是：源于酵母的GAL4因子DNA结合片段、突变的孕酮受体基因片段、核因子NF-kB的p65亚基基因片段以及终止信号。
表达盒-1有如下特点：使用肿瘤组织特异性启动子控制该表达盒的表达，使该表达盒的TA特异性地在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞内不表达。本发明所使用的肿瘤组织特异性启动子可以是下述的任何一种：
端粒酶逆转录酶催化亚基基因启动子。
甲胎蛋白(AFP)启动子。
癌胚抗原(CEA)启动子。
前列腺特异性抗原启动子。
乳腺癌组织特异性启动子。
受肿瘤组织特异性启动子控制的反式作用元件TA表达盒由来源于酵母的GAL4因子DNA结合片段、突变的孕酮受体基因片段、核因子NF-kB的p65亚基基因片段及终止信号组成。表达出的TA是一个嵌和体蛋白，其中的GAL4结合片段可以结合17mer x4序列，突变的孕酮受体片段不会结合内源性的正常配体，但是可以结合RU486(或mifepristone)，结合RU486以后，孕酮受体片段构象发生改变，使得整体嵌和体蛋白具备与GAL4启动子17mer x4序列结合的特点，进而启动转录的活性。而未与RU486结合的孕酮受体构象不发生改变，整体嵌和体蛋白不具备转录激活作用。因此，反式作用元件(TA)活性的发挥受双重因素的调控：在转录与翻译水平上受肿瘤组织特异性启动子的调控，在功能发挥上又受小分子药物RU486的调控。
GAL4是源于酵母的转录调控因子，与人的亲源关系相差甚远，不会识别人源的转录调控区，因此避免了反式作用元件(TA)对人体内其他基因的干扰。
表达盒-2的构成是：(1)源于酵母的GAL4上游序列(USA)17-mer，为了提高效率使用4个17-mer(17-mer x4)；(2)TATA盒；(3)位于TATA盒下游的抗癌基因；(4)终止序列。
表达盒-2具有如下特点：该表达盒中抗癌基因的表达仅受活化的反式作用元件(trans-activator，TA)所激活，源于机体内的因子不参与该表达盒的调控。
表达盒-2中可携带的抗癌基因可以是(1)肿瘤坏死因子超家族中的Trail基因；(2)抑癌基因；(3)细胞因子基因；(4)促细胞凋亡基因；(5)血管抑制基因；(6)自杀基因；(7)其他基因。
(1)肿瘤坏死因子基因：肿瘤坏死因子超家族中的一员Trail与细胞表面受体结合后，启动细胞凋亡途径，并选择性地促使肿瘤细胞凋亡。(2)抑癌基因：抑癌基因包括p53，Rb，NF1，VHL，APC。抑癌基因能够抑制肿瘤细胞的生长。(3)细胞因子基因：细胞因子具有杀伤肿瘤细胞，激活免疫细胞，增加造血功能等。它包括：白细胞介素-2、-12、-24，粒-单集落刺激因子，干扰素-α、-β、-γ。(4)促细胞凋亡基因：细胞凋亡是多细胞生物生命活动的重要途径，细胞凋亡途径的异常是机体肿瘤发生的一个重要机制。抑制了细胞凋亡，肿瘤势必要发生。促细胞凋亡基因可加速肿瘤细胞的凋亡，是基因治疗肿瘤的有效基因。促细胞凋亡基因可以是Bax、Caspase，也可以是Smac等。(5)血管抑制基因：血管抑制基因抑制肿瘤新生血管形成，可阻断肿瘤细胞的营养供应，肿瘤因营养不足而萎缩、死亡。血管抑制基因有：血管生成抑素基因(angiostatin)，血管内皮抑素基因(endostatin)。(6)自杀基因：包括大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因，单纯疱疹病毒的脱氧胸腺嘧啶核苷激酶基因，水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因。(7)其他基因：血管内皮生长因子可溶性受体flt-1基因可竞争性抑制血管内皮生长因子发挥作用。
表达盒-1受hTERT的控制，且表达出的反式作用元件无活性，需结合RU486生成二聚体以后并发生构象改变，才可结合抗癌基因盒上游序列17mer x4，从而激活抗癌基因的表达；因此抗癌基因受双重控制：一是hTERT的控制，因为hTERT控制TA的表达，即TA只能在肿瘤细胞中靶向表达而不会在正常细胞中表达；二是RU486调控，没有RU486虽有TA也不能发挥作用，因此是可调控的，需要抗癌基因表达时加入RU486，不需要时，不加RU486，即关闭了抗癌基因的表达，以减少副作用。
本发明提供了一种靶向可调控抗癌基因-病毒的构建方法，即表达抗癌基因的可调控肿瘤特异性无肠腺病毒或AAV的构建方法，主要包括以下步骤：
一、克隆质粒pRS-hTERT/Trail的构建
反式作用元件表达盒，即表达盒-1的构建：pRS-17质粒(西班牙NOVARA大学钱程教授惠赠)含有两个表达盒，分别是反式作用元件(trans-activator，TA)表达盒和抗癌基因表达盒。用限制性内切酶NotI/SalI消化质粒pAd/hTERT，回收hTERT启动子片段再插入到克隆载体pBluescript的多克隆位点，得到pBS-hTERT；用KpnI酶切pBS-hTERT，将含有hTERT启动子片段克隆到pRS-17的KpnI位点，替换出pRS-17原有的TTR启动子，得到质粒pRS-hTERT；
抗癌基因表达盒，即表达盒-2的构建：质粒pGL(西班牙NOVARA大学钱程教授惠赠)上有人5型腺病毒的末端重复序列(ITR)和包装包装信号(ψ)及两段填充序列。从pCA13-Trail中用EcoRI/BamHI切出Trail基因，克隆到中间载体pBluescript的相应位点；然后再用BamHI/XhoI切出该基因插入另一中间载体pSP72的相应位点；最后用ClaI切出Trail，插入pRS-hTERT的ClaI位点，得到克隆质粒pRS-hTERT/Trail；
二、包装质粒pGL-hTERT/Trail的构建
用限制性内切酶把克隆质粒pRS-hTERT/Trail的两个表达盒切出，连接到质粒pGL的酶切位点上，得到包装质粒pGL-hTERT/Trail；
三、病毒的包装
用限制性内切酶切割包装质粒pGL-hTERT/Trail使之线性化，与辅助病毒共转染到包装细胞293Cre4中；
四、病毒的收集纯化
挑选单克隆，鉴定后大规模培养，收集细胞培养物，经梯度离心纯化病毒。
利用本发明的方法得到的表达抗癌基因的可调控肿瘤特异性无肠腺病毒或AAV具有如下有益效果：
1、本发明提供一种携带抗癌基因的无肠腺病毒或AAV，经细胞实验证明，目的基因可以特异性地在肿瘤细胞中表达，而不在正常细胞中表达；
2、本发明提供的携带抗癌基因的无肠腺病毒或AAV，调控TA的启动子是可以更换的。根据所使用的启动子来源不同，目的基因的表达可以是在多数种类的肿瘤组织，也可仅限于某些特定的肿瘤细胞；
3、本发明提供的携带抗癌基因的无肠腺病毒或AAV，目的基因的表达是受小分子药物RU486的诱导调控，需要时打开，不需要时关闭。该无肠腺病毒无抗原性，可长期使用而不失活；
4、本发明提供了一种无肠腺病毒的构建、包装方法。该方法可用于其它基因-病毒的无肠腺病毒的构建与包装，易于掌握；
5、本发明构建的无肠腺病毒载体或AAV，能够非常方便的装入外源抗癌基因，我们称之为基因—病毒。这个载体能够构建表达多种不同抗癌基因的多种基因—病毒，为肿瘤的基因—病毒治疗提供良好的基础；
6、本发明构建的多种基因—病毒经试验证明能选择性的杀死瘤细胞，而不影响正常细胞。基因—病毒表达的抗癌基因能加强病毒的抗肿瘤效果。这种新型的基因—病毒为今后用于人类肿瘤治疗打下了良好基础；
7、本发明构建的基因病毒可以与下列之一种物质组成复合物：其它的基因—病毒，化疗药物；生物毒素；免疫抑制化合物，单克隆抗体等。
附图说明
图1为本发明的携带两个表达盒的无肠腺病毒构建过程及工作原理示意图，其中1为腺病毒基因组示意图，2为无肠腺病毒，3为携带有两个表达盒的无肠腺病毒，3.1为表达盒-1，3.2为表达盒-2，4为表达盒的作用机理；
图2为在有Cre重组酶存在的情况下，loxP序列发生同源重组的示意图，位于两段loxP之间的为ψ序列，随着loxP之间的同源重组，ψ序列被剪切下来。
具体实施方式：实施例1：克隆质粒pRS-hTERT/Trail的构建
质粒pRS-17大小为7.6kb，含有表达盒-1的TA(包括：源于酵母的GAL4因子DNA结合片段、突变的孕酮受体基因片段、核因子NF-kB的p65亚基基因片段)序列同时含有表达盒-2(17-merx4GAL4上游序列、TATA盒以及多克隆位点MSC)各组成元件的序列。质粒pRS-17上有多处常用限制性内切酶的位点，因此在进行改造时多用到单酶切克隆、平端连接以及基因在不同载体中的转换；
质粒pAd/hTERT大小为7438bp，携带有hTERT启动子，位于hTERT启动子上游的是SalI位点，位于hTERT启动子下游的是NotI和KpnI位点，KpnI位点位于NotI内侧并紧邻hTERT启动子。
以pRS-17为母本质粒，改造成克隆质粒pRS-hTERT/Trail的具体实施途径如下：
表达盒-1的构建：用限制性内切酶NotI/SalI消化质粒pAd/hTERT，回收hTERT启动子片段再插入到克隆载体pBluescript的多克隆位点，得到pBS-hTERT。pBluescript的多克隆位点中原有一个KpnI位点，插入hTERT启动子片段后启动子两端便各有一个KpnI位点，用KpnI酶切pBS-hTERT，将含有hTERT启动子片段克隆到pRS-17的KpnI位点，替换出pRS-17原有的TTR启动子，得到质粒pRS-hTERT。
表达盒-1的hTERT启动子活性的鉴定可采用如下方法：用荧光素酶Luciferase基因作为报告基因，使其位于hTERT启动子的控制之下，转染细胞之后，检测荧光素酶的表达，以荧光素酶表达水平的高低来确定hTERT启动子的活性情况，荧光素酶的检测参照Promega公司的产品说明书。
表达盒-2的构建：质粒pCA13-Trail中含有Trail基因，Trail基因两端分别是EcoRI和BamHI位点。从pCA13-Trail中用EcoRI/BamHI切出Trail基因，克隆到中间载体pBluescript的相应位点；然后再用BamHI/XhoI切出该基因插入另一中间载体pSP72的相应位点；最后用ClaI切出Trail，插入pRS-hTERT的ClaI位点，得到克隆质粒pRS-hTERT/Trail。
表达盒-2中除使用Trail作为抗癌基因外，其它基因也可使用。其它基因的克隆策略有所不同，但目的是一致的，即通过中间克隆使目的基因的两端都成为ClaI位点(以便插入表达盒-2启动子后的ClaI位点)，或者前端是ClaI位点后端是一平端(以便插入表达盒-2启动子后的ClaI/SwaI位点)，或者是把基因两端用Klenow聚合酶补平后插入SwaI位点。实施例2：包装质粒pGL-hTERT/Trail的构建
用于无肠腺病毒包装的质粒pGL含有人源5型腺病毒基因组两端的重复序列(ITR)和包装信号(Ψ)，同时还含有填充序列，该序列是无活性的人源次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因组的部分序列。pGL质粒大小为28.7kb，在两端重复序列(ITR)的外侧有两个限制酶Pme I的酶切位点。经Pme I酶切后，pGL质粒被线性化，露出两端ITR序列以适合病毒包装，同时也去除了pGL质粒中属于原核细胞的抗性筛选标记及复制原点序列。pGL上还有一个EagI位点。
用Not I消化pRS-hTERT/Trail，回收带有两个表达盒的DNA片段，克隆进质粒pGL的Eag I位点(NotI和EagI为同末端酶)，构建成包装质粒pGL-hTERT/Trail。实施例3：无肠腺病毒的包装
包装质粒pGL-hTERT/Trail经PmeI酶切线性化后与辅助病毒(helper virus H14)共转染包装细胞293Cre4，7至14天回收病毒。反复传代、扩增以提高病毒滴度。最终用CsCl梯度离心纯化病毒。
Helper virus H14和包装细胞293Cre4均购于加拿大(MicrobixBiosystem Inc.Toronto)。辅助病毒(helper virus H14)是改造过的第一代腺病毒载体。位于其包装序列两边各有一个loxP位点，在有Cre表达的细胞中由于发生同源重组丢失包装序列而失去自身包装能力。包装细胞293Cre4能稳定表达Cre重组酶。把线性化的pGL-hTERT/Trail与辅助病毒共转染到包装细胞，辅助病毒提供用于无肠腺病毒包装所需的全部蛋白，而自身由于缺少包装信号而不进行包装，包装质粒pGL-hTERT/Trail含有包装信号，经线性化后利用辅助病毒提供的包装蛋白而组装成无肠腺病毒。实施例4：无肠腺病毒基因表达的靶向性和可调控检测
用上述类似的方法，构建带有报告基因-荧光素酶基因(也可以是其它报告基因类)的无肠腺病毒GL-hTERT/Luciferase，具体实施步骤如下：经KpnI/XbaI把Luciferase基因从pGL3-Enhancer(购自Promega公司)上切出，插入pSP72载体(购自Promega公司)的相应位点；用ClaI/PvuII将Luciferase基因切出，插入pRS-hTERT的ClaI/SwaI位点，用MluI鉴定阳性克隆，最后包装出病毒GL-hTERT/Luciferase将病毒GL-hTERT/Luciferase感染正常和肿瘤细胞，并用RU486进行诱导。检测Luciferase基因的表达，Luciferase基因表达的定量测量参照Promega公司的产品说明书。预期的结果是Luciferase基因特异性地在肿瘤细胞中表达，并且这种表达是RU486依赖性的。实施例5：AAV的使用
将携带GFP或Luciferase基因的两个表达盒装入AAV载体之中，观察表达情况，然后将GFP或Luciferase换成抗癌基因，经过包装滴度可达1012pfu/ml，观察它们对癌细胞特异性杀伤作用，而不杀伤正常细胞，然后进行动物的抗肿瘤试验，以期最后用于人的临床试用。
Claims (11)
1、一种抗癌靶向可调控基因-病毒的构建方法，其特征在于包括下列步骤：
一、克隆质粒pRS-hTERT/Trail的构建
反式作用元件表达盒，即表达盒-1的构建：用限制性内切酶消化质粒pAd/hTERT，回收hTERT启动子片段再插入到克隆载体pBluescript的多克隆位点，得到pBS-hTERT；用限制性内切酶切割pBS-hTERT，将含有hTERT启动子片段克隆到pRS-17的相应位点，替换出pRS-17原有的TTR启动子，得到质粒pRS-hTERT；
抗癌基因表达盒，即表达盒-2的构建：从pCA13-Trail中用限制性内切酶切出Trail基因，克隆到中间载体的相应位点，然后再通过基因克隆的方法插入pRS-hTERT的ClaI位点，得到克隆质粒pRS-hTERT/Trail；
二、包装质粒pGL-hTERT/Trail的构建
用限制性内切酶把克隆质粒pRS-hTERT/Trail的两个表达盒切出，连接到质粒pGL的酶切位点上，得到包装质粒pGL-hTERT/Trail；
三、病毒的包装
用限制性内切酶切割包装质粒pGL-hTERT/Trail使之线性化，与辅助病毒共转染到包装细胞293Cre4中；
四、病毒的收集纯化
挑选单克隆，鉴定后大规模培养，收集细胞培养物，经梯度离心纯化病毒。
2、如权利要求1所述的抗癌靶向可调控基因-病毒的构建方法，其特征在于表达盒-1中hTERT启动子可以用以下启动子替换：
甲胎蛋白启动子；
癌胚抗原启动子；
前列腺特异性抗原启动子；
乳腺癌组织特异性启动子。
3、如权利要求1所述的抗癌靶向可调控基因-病毒的构建方法，其特征在于表达盒-2中可携带的外源抗癌基因可以是一个或多个。
4、如权利要求3所述的抗癌靶向可调控基因-病毒的构建方法，其特征在于携带的外源基因可以是抑癌基因p53、Rb、NF1、VHL或APC。
5、如权利要求3所述的抗癌靶向可调控基因-病毒的构建方法，其特征在于表达盒-2中携带的外源基因可以是前体药物转换酶基因CD或TK。
6、如权利要求3所述的抗癌靶向可调控基因-病毒的构建方法，其特征在于表达盒-2中携带的外源基因可以是肿瘤坏死因子超家族中的TRAIL。
7、如权利要求3所述的抗癌靶向可调控基因-病毒的构建方法，其特征在于表达盒-2中携带的外源基因可以是细胞因子白细胞介素-2、-12、-24，粒-单集落刺激因子，干扰素-α、-β、-γ。
8、如权利要求3所述的抗癌靶向可调控基因-病毒的构建方法，其特征在于表达盒-2中携带的外源基因可以是促细胞凋亡基因Smac、Caspases或Bax。
9、如权利要求3所述的抗癌靶向可调控基因-病毒的构建方法，其特征在于表达盒-2中携带的外源基因可以是血管生成抑制基因血管生成抑素基因或血管内皮抑素基因。
10、利用权利要求1所述的构建方法得到的无肠腺病毒或AAV。
11、如权利要求10所述的无肠腺病毒或AAV可以与下列化合物之一组成复合物：
(1)其它基因-病毒；
(2)化疗药物；
(3)生物毒素；
(4)免疫抑制化合物，单克隆抗体。
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