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CN1327003C - 利用补料分批发酵法通过Phaffia rhodozyma制备虾青素 - Google Patents

利用补料分批发酵法通过Phaffia rhodozyma制备虾青素 Download PDF

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CN1327003C CNB038230135A CN03823013A CN1327003C CN 1327003 C CN1327003 C CN 1327003C CN B038230135 A CNB038230135 A CN B038230135A CN 03823013 A CN03823013 A CN 03823013A CN 1327003 C CN1327003 C CN 1327003C
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Abstract

公开了利用Phaffia rhodozyma的虾青素发酵法，包括以下步骤：(a)在生长期，根据Phaffia rhodozyma细胞的比生长速率(μ)加入含有葡萄糖或蔗糖的营养培养基，和(b)在虾青素生产期，根据虾青素生产速率补充营养培养基，同时在整个发酵期中保持发酵培养液中的葡萄糖浓度为接近0g/L。

Description

利用补料分批发酵法通过Phaffia rhodozyma制备虾青素
本发明提供利用补料分批发酵系统，根据细胞生长、碳源消耗和类胡萝卜素产生采用新的补料方法由Phaffia rhodozyma(P.rhodozyma)进行高产量虾青素生产的方法。
已知为一种类胡萝卜素的虾青素是叶黄素，其通常作为海洋环境中的红色或橙色色素而被发现。由于这种色素被认为是诸如鲑鱼、甲壳类和鳟鱼等不能重新合成β-胡萝卜素的海洋动物的特征性颜色，需要将虾青素加入所述动物的饮食中以使得它们具有吸引消费者的适当颜色。这种类胡萝卜素也可用于使其它动物的肉体或产物和诸如禽肉和蛋，各种乳制品，小吃等的其它食物着色。只有一些微生物合成虾青素，其中酵母菌P.rhodozyma由于其高虾青素含量而是可能用于商业化生产的候选菌。P.rhodozyma已知为产类胡萝卜素(carotenogenic)的酵母菌，其特异性产生虾青素。与另一种产胡萝卜素的酵母菌Rhodotorula spec不同，P.rhodozyma可发酵一些糖类例如D-葡萄糖。这对于工业应用是重要的特征。在最近的分类学研究中，揭示了P.rhodozyma的有性周期(sexual Cycle)并将其远距离刺激变性的状态命名为Xanthophyllomyces dendrorhous。
然而，P.rhodozyma的天然分离株产生的虾青素很少(通常为100-300份/百万(ppm))，使得它们不能作为水产养殖的实用型或经济型色素源。如果Phaffia菌株可以是经济上可行的饲料添加剂而用于使水产养殖动物着色或用于其它任何可能的食物(动物或其它)，那么必须研发过量产生虾青素的菌株。天然存在的“野生型”Phaffia的突变体已经在文献中有所描述，据称其产生的虾青素水平高于野生型酵母菌。据报道这些菌株产生的虾青素水平在具体的条件高于野生型分离株。
除了需要研发适合用于类胡萝卜素的商业化生产的P.rhodozyma菌株以外，还需要研发能在大的发酵罐中最大化类胡萝卜素生产的P.rhodozyma培养方法。
本发明提供了通过Phaffia菌株高产量产生虾青素的方法，包括根据细胞生长、碳源消耗和类胡萝卜素产生、以补料分批的模式应用新的营养培养基补料方法。具体地，通过基于碳源消耗应用新的营养培养基补料方法，可缩短发酵期并可明显提高虾青素产量。
本发明涉及通过Phaffia菌株高产量产生虾青素的发酵方法，所述方法根据细胞生长、碳源消耗和类胡萝卜素产生在补料分批发酵系统中应用新的营养培养基补料方法。
已知通过P.rhodozyma生产类胡萝卜素是常见的非生长(non-growth)相关的模式发酵(type fermentation)。认为在生长期获得较高的细胞产量与消耗的碳源之比(Yx/s)，并在生产期获得较低的Yx/s。本发明提供了新的补料(feeding)策略，其包括结合碳源浓度控制的指数补料方法和基于碳源消耗率的补料方法，以在Yx/s较高的生长期极大提高细胞生长，并在生产期调节细胞生长并将葡萄糖有效地转化为类胡萝卜素。
本发明涉及通过P.rhodozyma菌株利用补料分批发酵系统高产量产生虾青素的发酵方法。具体地，构建了基于细胞生长、碳源消耗和类胡萝卜素产生的新的补料方法。
Phaffia菌株通过从斜面转移到含有50ml营养培养基的500ml的Erlenmeyer烧瓶进行增殖，其中所述细胞在充分通气的条件下在20-22℃于震摇下培养3天。将这样的种培养基转移到含有100ml营养培养基的500ml Erlenmeyer烧瓶中，并在充分通气的条件下在20-22℃于涡旋震摇器上培养2天。这些细胞培养物的等分试样随后用来接种到培养罐中。
将种培养基转移到含有1.75L营养培养基的5L培养罐中。所述培养物在20-22℃分批生长直到获得1g/L的酵母干物质含量。此后，开始提供糖溶液并在20-22℃进行补料分批发酵。
所述营养培养基基本上含有葡萄糖或蔗糖作为碳源以及补充了可同化形式的各种维生素和矿物质的氮源。这些维生素和矿物质的常见形式为：硫酸铵，磷酸钾，硫酸镁，硫酸锌，硫酸铁铵，硫酸铜，肌醇，盐酸吡哆醇，硫铵，泛酸钙，生物素等。包括葡萄糖和酵母提取物在内的这些物质的组合和浓度可根据需要改变。如果需要，可将抗泡剂和/或其它添加物掺入培养基或与其一同使用。在补料分批发酵中加入发酵罐的培养基含有多糖如葡萄糖或蔗糖。
所述营养培养基含有聚合物形式的葡萄糖，蔗糖和其它多糖，糖蜜和玉米糖浆，甘油和其它多元醇，羧酸来作为能量源。同时，所述营养培养基还含有酵母提取物，肉提取物，蛋白胨，酪蛋白，玉米浸液(steep liquor)，尿素，氨基酸，硝酸盐，铵盐等作为营养源。
含有营养培养基的发酵罐经高压灭菌。工作体积不受限，且可以在小规模到工业大规模进行发酵。所述培养基的pH通常保持在4.5-7.0，温度为15-24℃。所述培养基通常和过滤灭菌后的空气一同喷出，并被持续搅拌。所述菌株在NH4OH溶液和/或NaOH溶液控制pH为4.5-7.0的发酵罐中增殖。温度可设定在15-24℃并通过搅拌和气流控制DO为10％-90％。
1.常见补料方法：用于营养培养基的常见补料方法公开于美国专利6,015,684。在生长期，含有葡萄糖或蔗糖的补料培养基被加入主发酵罐中以使酵母菌细胞的比生长速率μ达到0.01-0.10h-1。且所述补料速率逐渐增加以便使营养物质和乙醇不在培养液中累积。获得所需的酵母固体以后和营养源开始累积以前，将生长期的补料速率降低到最大补料速率的50％。在降低营养物质源补料的这一阶段，即生产期，所述酵母细胞继续产生虾青素，但细胞数目的增加受限。发酵通常持续4-9天，并定期取样用于分析细胞生长和虾青素生产。
可计算比葡萄糖消耗率(q)和比生长率(μ)。在q和μ的关系中，μ随q增加而增加。斜率μ/q表示细胞产量与消耗的葡萄糖之比，如等式(1)所示。
μ/q＝{(1/X).(dX/dt)}/{(1/X).(dS/dt)}＝dX/dS＝Yx/s    (1)
X：细胞浓度(g-干细胞/L)
S：碳源浓度(g/L)
2.与C/N比相关的指数补料方法：当补料速率在生长期呈线性增长时，q高于临界点，如实施例1所述，且Yx/s为0.200-0.500。另一方面，当补料速率在生产期直线降低时，Yx/s低于0.200。此外，在该阶段虾青素生产增加并获得最大生产速率。已知通过P.rhodozyma产生虾青素是常见的非生长相关的模式发酵。在生长期获得较高的Yx/s，在生产期获得较低的Yx/s。因此，为了在具有较高Yx/s的生长期极大提高细胞生长，可在生长期采用指数补料方法。
此外，在生产期为了限制细胞生长并将葡萄糖有效地转化成虾青素，可在生产期控制葡萄糖浓度。
当在生长期采用指数补料法时，μ可设定为0.01-0.1小时-1。生长期的补料速率(F)通过以下等式(2)表示：
F＝(q.Vo.Xo.eμt)/(SF-S)    (2)
Vo：初始体积(L)
Xo：初始细胞浓度(g-干细胞/L)
SF：补料培养基中的碳源浓度(g/L)
S：培养液中的碳源浓度(g/L)
此外，基于常见的补料分批发酵法(对照方法)的结果的NH4OH加入量和葡萄糖消耗之间的关系适用于培养液中的葡萄糖浓度控制。葡萄糖浓度控制的意思是基于NH4OH加入量(用于保持pH)的、用于控制葡萄糖浓度的pH-start法。在生产期，葡萄糖浓度可控制在0-70g/L，优选控制在0-10g/L。
例如，通过利用0g/L葡萄糖控制，终虾青素浓度可高于对照方法中的终虾青素浓度。最大虾青素生产率可以比对照方法高30.0％以上。如实施例3所述，当使用葡萄糖0g/L控制时，生产期的C/N比例比葡萄糖2.0g/L控制高1.08倍，这是由于葡萄糖0g/L控制中的NH4OH加入量低于葡萄糖2.0g/L控制中的NH4OH加入量。已知生产期增加补料培养基的C/N比可使虾青素产量比使用同样量葡萄糖进行批发酵时高1.5倍。因此，认为利用葡萄糖0g/L控制所得虾青素产量高于利用葡萄糖2.0g/L控制所得的虾青素产量。
此外，利用NaOH溶液作为生产期的pH控制试剂是通过利用葡萄糖0g/L控制的指数补料法生产虾青素的有效方法，这是由于生产期的C/N比可以提高。通过使用NaOH溶液作为生产期的pH控制试剂来提高生产期的C/N比，平均虾青素生产率比使用NH4OH溶液时高10.0％以上。利用葡萄糖0g/L控制、使用NaOH溶液作为pH控制试剂的指数补料法与对照方法相比可将总发酵期缩短26.0％以上。所述利用葡萄糖0g/L控制的指数补料法与对照方法相比可使虾青素平均生产率提高至少13.0％。
3.修饰的指数补料法：为了提高总虾青素产量并利用指数补料法较高的虾青素平均生产率，可通过增加葡萄糖的补料量改进所述指数补料法，并将补料期延长10-50％。这样延长补料期导致通过增加虾青素补料分批发酵中的葡萄糖补料量而得到“修饰的指数补料方法”。
在所述修饰的指数补料法中，在生长期使用指数补料法直到发酵中期。此后，使生产期的补料速率保持在生长期最大补料速率的10-100％。通过利用实施例5所述的修饰的指数补料法，其终虾青素浓度比通过对照方法所得的浓度高5.8％，且总虾青素产量比对照方法所得的虾青素产量高至少29.0％。所述修饰的指数补料法可使干细胞中的虾青素含量比对照方法所得的含量提高5.60％以上。
4.培养液中葡萄糖浓度对虾青素生产的影响：在修饰的指数补料法中，葡萄糖在发酵中期累积于培养液中。已知葡萄糖在培养液中累积减少虾青素生产，尤其是相对于碳源的虾青素产量(例如葡萄糖，蔗糖等)。估计乙醇的形成由Crabtree效应诱导并降低虾青素产量。从最大葡萄糖累计率和平均比虾青素生产速率(p)之间的关系来看，当葡萄糖开始在培养液中累积时，p逐渐降低到无葡萄糖累积期的平均比虾青素生产速率的71.0％。
葡萄糖在培养液中的累积抑制了每个单位的细胞生产虾青素的能力。因此，为了提高虾青素产量，需要构建新的补料方法以使得没有葡萄糖累积于发酵液中。此外，为了尽量多地补充葡萄糖溶液，我们发现了基于葡萄糖消耗率的、源自指数补料法的新的补料方法。
5.葡萄糖消耗速率(GCR)补料法：GCR补料法基于补料分批发酵法中的葡萄糖消耗速率(GCR)。实际总葡萄糖消耗图谱可源自指数葡萄糖补料图谱，例如实施例7所示。
根据该补料速率图谱，可研究GCR补料法的效果。在GCR补料法中，培养液中的葡萄糖浓度保持在约0g/L。尽管营养培养基的体积相同，GCR补料法的最终总虾青素产量比使用指数补料法时高至少8.0％。GCR补料法的平均虾青素生产率比指数补料法高7.0％以上。
这些结果显示，GCR补料法比指数补料法更有效地提高虾青素生产。在GCR补料法中，葡萄糖的补料量可增加并且补料期可延长。
6.最大(Max)GCR补料法：此外，为了提高葡萄糖补料量并不使葡萄糖在发酵中累积，可通过研究补料图谱的影响构建基于最大葡萄糖消耗速率的新GCR补料法(最大GCR补料法)，所述图谱结合了GCR补料和以生产期中GCR补料法的最大补料速率进行的恒速补料。
葡萄糖在培养液中的累积影响虾青素产量，所述产量相对于使用的葡萄糖而言低于使用对照方法时的产量。如果采用新的GCR补料法以避免葡萄糖在发酵培养液中的累积，认为可明显提高虾青素产量。为了研究最大GCR补料法，计算了基于结合了GCR补料和恒速补料的、如实施例8中所述的补料法的葡萄糖消耗速率以及基于葡萄糖消耗速率的补料速率图谱。在实施例9中，最大葡萄糖补料速率图谱通过结合GCR补料和恒速补料的实施例8所示的补料法计算。
最大葡萄糖补料速率图谱可根据各种营养培养基或发酵条件的组合变化。首先，可根据最大葡萄糖补料速率图谱采用利用NH4OH和NaOH溶液控制pH的最大GCR补料法。最大GCR补料法的总虾青素产量比对照方法的产量提高了至少4.0％。所得最大虾青素生产速率比利用对照方法时高20％以上。
然而，该方法有时使葡萄糖在培养液中累积。因此，为避免葡萄糖在培养液中的累积，可采用仅利用NH4OH溶液控制pH的最大GCR补料法。通过利用该方法，葡萄糖在培养液中的浓度可在整个发酵期中保持为0g/L。这种方法的终虾青素产量可比对照方法高12％以上。
利用这种最大GCR补料法，虾青素产量与所用葡萄糖的比例比对照方法增加了至少4.0％。所得平均虾青素生产速率可比对照方法高至少21％以上。此外，仅利用NH4OH溶液控制pH的最大GCR补料法可缩短发酵期(相对于对照方法发酵期至少缩短11％)并增加虾青素产率。
本发明通过以下实施例说明：
实施例1：用于虾青素生产的P.rhodozyma ATCC96594突变菌株的常见培养
1.种子培养物制备：用P.rhodozyma ATCC96594突变菌株作为种子菌株。Phaffia菌株通过从斜面转移到含有50ml YM培养基的500mlErlenmeyer烧瓶中增殖，其中细胞在充分通气的条件下在震摇下于20-22℃培养3天。将该种子培养物转移到含有100mlYM培养基的500mlErlenmeyer烧瓶中，并在涡旋摇床上在充分通气的条件下于20-22℃保温2天。
2.用于虾青素生产的补料分批发酵法：将200ml培养基转移到含有1.75L营养培养基的5L的发酵罐中。使培养基在20-22℃批生长直到获得1g/L的酵母干物质含量。随后，开始提供糖溶液并在20-22℃进行补料分批发酵法。
所述营养培养基的组分如下：20g/L的糖蜜，0.6g/L的硫酸二铵，0.8g/L的磷酸氢二铵和0.125g/L硫酸镁，将它们和适量的水(5L增殖发酵罐中含1.75L水)一起在发酵罐中煮沸30分钟。在补料分批发酵中补充到培养罐中的培养基含有716.0g/L的葡萄糖或蔗糖。所有化学物质都是食物级的。所述糖蜜是来自Midwest agriculture，US的甜菜糖(beet sugar)糖蜜。
在总体积为5L并具有顶部驱动系统和温度、pH、DO(溶解的氧)以及消耗气体监测器的D型发酵罐(Able，Tokyo，Japan)中进行发酵。初始工作体积和补料体积分别为1.75L和2.0L。所述菌株在发酵罐中在pH5.5的条件下进行增殖，其中pH通过12.5w/v％NH4OH溶液和NaOH溶液来控制。温度控制在20-22℃且DO通过搅拌和通气控制在10％-90％饱和。在生长期，含有葡萄糖或蔗糖的补料培养基被加入主发酵罐中，以使酵母细胞的比生长率μ达到：0.04-0.05h-1。逐渐增加补料速率以避免营养物质和乙醇在培养液中累积。
获得所需的酵母固体以后、营养源累积以前，将生长期补料速率降到最大补料速率的50％。在减少营养源补料期间，即生长期，酵母细胞继续产生虾青素，但细胞数目的增长被限制。例如，在生长期，补料速率直线降低到最大补料速率的约50％并持续约100小时。
实施例2：细胞生长期和虾青素生产期的补料策略
在实施例1所述的常见虾青素补料分批发酵法中，可计算比葡萄糖消耗速率(q)和比生长速率(H)并通过图显示。当q和μ分别为0.085小时-1和0.017小时-1时，图线的斜率剧烈改变，且临界点(q，H)＝(0.085，0.017)。斜率μ/q细胞产量与消耗的葡萄糖之比(Yx/s)，如上述等式(1)所示。
当生长期补料速率直线上升时，μ高于0.085小时-1，且Yx/s为0.213-0.405。另一方面，当补料速率在生产期直线下降时，Yx/s低于0.201。此外，在此期间虾青素产量增加并达到最大生产速率。已知通过P.rhodozyma生产虾青素是常见的非-生长相关的模式发酵。
在生长期获得较高的Yx/s，在生产期获得较低的Yx/s。因此，为在具有较高Yx/s的生长期极大提高细胞生长，并在生产期限制细胞生长和有效将葡萄糖转化为虾青素，将生长期指数补料法和生产期葡萄糖浓度控制用作虾青素补料分批发酵法的补料策略。
实施例3：与C/N比对虾青素补料分批发酵的影响有关的指数补料法
当在生长期采用指数补料时，μ设定在0.04小时-1。补料速率(F)在生长期通过上述等式(2)表示。
在本研究中，q，Vo，Xo，SF和S分别设定为0.08262小时-1，1.75L，9.92g-干细胞/L，716.0g/L和0g/L。因此，生长期的F根据以下等式(3)计算，F＝(0.08262·1.75·9.92·e004t)/(716.0-0)＝0.002003·e004t    (3)
此外，根据实施例1的结果研究NH4OH加入量和葡萄糖消耗量之间的关系。获得了NH4OH加入量和葡萄糖消耗量之间两种线性关系(I和II)，且发酵开始后80小时引入临界点(NH4OH加入量，葡萄糖消耗量)＝(3.95，13.1)。在生长期，图线的斜率较陡(I)，在生产期，斜率较温和(II)。因此为了在生产期将葡萄糖控制为0g/L，采用来自斜率II的NH4OH加入量(用于保持pH)的培养基补料法，即用于控制葡萄糖浓度的pH-自动调节法。通过如实施例1的方式在5L的发酵罐中将生产期的葡萄糖浓度控制在0和2.0g/L。此外，葡萄糖2.0g/L控制由即时葡萄糖控制器(the on-line biochemical℃ontroller BF-410：Able，Tokyo，Japan)操作以便探索从发酵开始后C/N比对虾青素生产的影响。
将这两个条件与实施例1中所述的常见补料法(对照方法)比较。三个条件之间发酵活性的比较显示于表1中。葡萄糖0g/L控制中的终虾青素浓度比对照法高6.60％。葡萄糖2.0g/L控制中的终虾青素浓度比对照方法中的低13.5％。
葡萄糖0g/L控制的最大虾青素生产速率比对照方法的高32.9％。
当使用葡萄糖0g/L控制时，生产期的C/N比例比利用葡萄糖2.0g/L控制时高1.08倍，这是由于葡萄糖0g/L控制中的NH4OH加入量小于葡萄糖2.0g/L控制的NH4OH加入量。通过增加生产期补料培养基的C/N比，利用葡萄糖0g/L控制产生的虾青素多于利用葡萄糖2.0g/L控制产生的虾青素。
表1：利用5L发酵罐进行虾青素补料分批发酵法的发酵活性
状态 常用补料方法(对照)  葡萄糖0g/L控制  葡萄糖2.0g/L控制
终ASTA浓度 100  106.6  86.5
最大ASTA产率 100  132.9  85.5
ASTA：虾青素；数据用相对值表示
实施例4：用于虾青素补料分批发酵的新的指数补料法和葡萄糖浓度控制
此外，C/N比对具有葡萄糖0g/L控制的指数补料法的影响通过利用NaOH溶液作为pH控制试剂在5L的发酵罐中研究。以与实施例1相同的方式进行发酵。对于指数补料法，葡萄糖0g/L控制在生产期通过补料法进行，其中补料速率呈直线从22.61下降到17.63g-补料溶液/小时。通过在生产期使用NaOH溶液控制pH以降低生产期的C/N比，平均虾青素产率比使用NH4OH溶液时高13.5％。
表2显示实施例1中所述常见补料法(对照方法)与指数补料法之间的比较，后者在以补料分批模式进行虾青素生产时通过使用NaOH溶液控制生产期pH。指数补料法中的总发酵期比对照方法短41小时。发酵开始后175小时，通过指数补料法所得的虾青素浓度比对照方法所得的虾青素浓度高5.7％。指数补料法中虾青素平均生产率比对照方法中高13.9％。
表2：在以补料分批模式进行虾青素生产时通过使用NaOH溶液控制生产期pH的指数补料法
状态 常见补料法(对照)  使用NaOH溶液控制pH的指数补料法
第175小时的终ASTA浓度 100  105.7
平均ASTA生产率 100  113.9
ASTA：虾青素；所示数据为相对值
实施例5：用于虾青素补料分批发酵的修饰的指数补料法
为增加总虾青素产量并利用指数补料法较高的虾青素平均生产率，通过增加葡萄糖补料量并将补料期从117个小时延长到156个小时来改进指数补料法。研究了这种通过在虾青素补料分批发酵中增加葡萄糖补料量来延长补料期的方法即“修饰的指数补料法”的效果。在所述修饰的指数补料法中，生产期的补料速率从发酵开始直到第186.5小时(从发酵补料开始第156小时)一直保持在19.7g/hr。
表3显示了实施例1中所述的常见补料法(对照方法)和修饰的指数补料法之间的比较。
修饰的指数补料法所得的终虾青素浓度比对照方法所得的终虾青素浓度高5.8％。通过修饰的指数补料法所得的总虾青素产量比对照方法高29.3％。尽管利用修饰的指数补料法时葡萄糖在第98-192小时在培养液中累积，补充的葡萄糖在发酵终点都被完全消耗。修饰的指数补料法中干细胞中的虾青素含量比对照方法中的高5.60％。
表3：修饰的指数补料法对以补料分批模式进行的虾青素生产的影响
状态 常见补料法(对照)  修饰的指数补料法
终ASTA浓度 100  105.8
ASTA总量 100  129.3
干细胞中ASTA含量 100  105.6
ASTA：虾青素；所示数据为相对值
实施例6：培养液中的葡萄糖浓对虾青素补料分批发酵的影响
如实施例5中所述，通过利用指数补料法使葡萄糖在培养液中累积。总虾青素生产和产量低于通过实施例1中所述对照方法进行的生产。由于Crabtree效应可诱导乙醇，虾青素产量降低。因此，研究了最大葡萄糖累积速率和平均比虾青素生产速率(p)之间的关系。
当葡萄糖开始在培养液中累积时，p逐渐降低到没有葡萄糖累积时的平均比虾青素生产速率的71.0％。这些结果显示葡萄糖在培养液中的累积抑制了单位量细胞产生虾青素的能力。估计Crabtree效应诱导乙醇形成且虾青素产量降低。
实施例7：通过基于葡萄糖消耗速率(GCR补料法)的新补料法进行虾青素补料分批发酵
为增加虾青素产量，需要构建新的补料法以避免葡萄糖在培养液中累积。此外，为了尽量多地补充葡萄糖溶液，我们研究了源自指数补料法的、基于葡萄糖消耗速率的补料法。
实际总葡萄糖消耗图谱与指数葡萄糖补料图谱不同。根据这一结果，计算实际葡萄糖消耗速率图谱。
通过多次回归分析将实际葡萄糖消耗速率图谱表示为三次方程。从葡萄糖消耗速率图谱来看，实际补料速率图谱显示建立了基于葡萄糖消耗的葡萄糖补料模式。
基于该补料速率图谱，研究了GCR补料法的效果。表4显示了指数补料法和GCR补料法之间的比较。在GCR补料法中，培养液中的葡萄糖浓度保持在约0g/L。尽管起始体积均为1.75L且补料体积均为2.00L，通过GCR补料法得到的最终总虾青素产量比使用指数补料法高8.99％。此外，GCR补料法的发酵期可设定为168小时，这于指数补料法的时间相同。GCR补料法的平均虾青素生产率比利用指数补料法时高7.60％。
表4：修饰的指数补料法对以补料分批模式进行的虾青素生产的影响
状态 常见补料法(对照)  修饰的指数补料法
终ASTA浓度 100  107.6
ASTA总量 100  109.0
平均ASTA生产率 100  107.6
ASTA：虾青素；所示数据为相对值
实施例8：通过修饰的GCR补料法在虾青素补料分批发酵中提高葡萄糖补料量
在GCR补料法中，葡萄糖补料量增加且补料时间延长到156小时。表5显示修饰的GCR补料法对通过补料分批发酵进行虾青素生产的影响。
修饰的GCR补料法是这样一种方法，其结合GCR补料法并保持到葡萄糖补料开始后111小时且在111小时后相对于对照方法如实施例1所述呈线性降低的补料法。通过修饰的GCR补料法的最终总虾青素生产比对照方法高5.5％。此外，可在葡萄糖补料开始到第66小时之间采用结合GCR补料和保持GCR补料法中最大补料速率(所述最大速率在葡萄糖补料开始后第66小时达到)的恒速补料的补料图谱，即GCR补料法，且可在第66-156小时之间采用保持在GCR补料法最大补料速率即30.4g-补充溶液/小时的恒速补料。
表5还显示了结合GCR补料和恒速补料的补料法的效果。通过这种补料法产生的最终总虾青素产量比利用对照法时高19.8％，且比修饰的GCR补料法时高14％。
表5：修饰的GCR补料法对通过补料分批发酵进行虾青素生产的影响
状态 常见补料法(对照)  修饰的指数补料法  修饰的GCR+恒速补料法
ASTA总量 100  105.5  119.8
ASTA：虾青素；所示数据为相对值
实施例9：通过最大GCR补料法进行虾青素补料分批发酵
在实施例8中从第120小时起葡萄糖开始在培养液中累积，且葡萄糖浓度在发酵开始后第192小时达到81.7g/L。最后，葡萄糖浓度在发酵终点为33.6g/L。培养液中的葡萄糖累积影响虾青素产量。因此，构建了基于最大葡萄糖消耗速率的新GCR补料法(最大GCR补料法)。为研究最大GCR补料法，计算了基于实施例8中所述的、结合GCR补料和恒速补料的补料法的葡萄糖消耗速率以及基于葡萄糖消耗速率的补料速率图谱。
通过实施例8中所述结合GCR补料和恒速补料的补料法计算最大葡萄糖补料速率图谱。
通过实际葡萄糖消耗速率计算的最大补料速率在葡萄糖补料开始后66小时为28.7g/hr。66小时后，由于葡萄糖消耗速率降低，所述补料速率设定为低于19.0g/hr以便保持葡萄糖浓度为约0g/L。因此，根据最大葡萄糖补料速率图谱，采用利用NH4OH和NaOH溶液控制pH的最大GCR补料法。初始体积和补料体积分别设定为1.50L和2.25L。
表6显示利用NH4OH和NaOH溶液控制pH的最大GCR补料法对通过补料分批发酵进行虾青素生产的影响。发酵开始后第216小时，最大GCR补料法所得总虾青素产量比对照法高4.21％。
此外，在最大GCR补料法中，计算出的第95-122小时的虾青素生产速率比对照方法的速率高20.1％。然而，利用NH4OH和NaOH溶液控制pH的最大GCR补料法时培养液中的葡萄糖在发酵开始175小时后累积达19.9g/L。
利用最大GCR补料法时相对于所用葡萄糖的虾青素生产产量低于利用对照方法的所述产量，这是由于葡萄糖累积于培养液中。
随后，为了避免在培养液中累积葡萄糖，建立了利用NH4OH溶液控制pH的最大GCR补料法。
表7显示仅利用NH4OH溶液控制pH的最大GCR补料法对通过补料分批发酵法生产虾青素的影响。在表7中，利用NH4OH溶液的最大GCR补料法可在整个发酵期将培养液中葡萄糖浓度保持在0g/L。发酵开始216后，通过这种方法产生的总虾青素产量比利用对照方法高12.1％。
利用所述最大GCR补料法时相对于所用葡萄糖的虾青素生产产量比用对照方法时高4.7％。在该最大GCR补料法中，平均虾青素生产速率比对照方法的速率高21.9％。从总虾青素生产图谱来看，在生长期和虾青素生产期均仅利用NH4OH溶液控制pH的最大GCR补料法可将发酵期缩短(与对照方法相比发酵期缩短11.2％)并提高虾青素生产率。
表6：利用NH4OH和NaOH溶液控制pH的最大GCR补料法对以补料分批模式进行的虾青素生产的影响
状态 常见补料法(对照)  利用NH4OH和NaOH溶液控制pH的最大GCR补料法
ASTA总量 100  104.2
最大ASTA生产速率 100  120.1
培养液中的最大葡萄糖累积量(g/L) 0  19.9
ASTA：虾青素；所示数据为相对值
表7：利用NH4OH和NaOH溶液控制pH的最大GCR补料法对以补料分批模式进行的虾青素生产的影响
状态 常见补料法(对照)  利用NH4OH溶液控制pH的最大GCR补料法
ASTA总量 100  112.1
培养液中的最大葡萄糖累积量(g/L) 0  0
ASTA产量 100  104.7
终ASTA浓度 100  108.3
平均ASTA生产率 100  121.9
ASTA：虾青素；所示数据为相对值

Claims (8)

1.利用Phaffia rhodozyma的虾青素发酵法，包括以下步骤：
(a)在生长期，根据Phaffia rhodozyma细胞的比生长速率μ加入含有葡萄糖或蔗糖的营养培养基，和
(b)在虾青素生产期，根据虾青素生产速率补充营养培养基，
同时在整个发酵期中保持发酵培养液中的葡萄糖浓度为接近0g/L，
其中所述发酵在μ为0.01-0.10h-1的范围进行；
其中所述发酵在通气率为0.01-2.0气体体积/培养基体积/分的条件下在培养容器中进行。
2.权利要求1的发酵法，其中所述Phaffia rhodozyma是Phaffiarhodozyma ATCC96594。
3.权利要求1的发酵法，其中pH控制试剂为NH4OH溶液和/或NaOH溶液。
4.权利要求1的发酵法，其中所述发酵在4.5-7.0的pH进行。
5.权利要求1的发酵法，其中所述发酵在15-24℃的温度进行。
6.权利要求1的发酵法，其中所述发酵在10-90％的DO进行。
7.权利要求1的发酵法，其中所述营养培养基包含聚合形式的葡萄糖、蔗糖和其它多糖、糖蜜和玉米糖浆、甘油和其它多元醇、以及羧酸作为能量源，并包含酵母提取物、肉提取物、蛋白胨、酪蛋白、玉米浸液、尿素、氨基酸、硝酸盐、铵盐作为氮源。
8.权利要求1的发酵法，其中所述营养培养基中D-葡萄糖或蔗糖的浓度为10g/L-800g/L。
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