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CN1324367A - 环状前塞波素衍生肽及其应用 - Google Patents

环状前塞波素衍生肽及其应用 Download PDF

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CN1324367A
CN1324367A CN99812627A CN99812627A CN1324367A CN 1324367 A CN1324367 A CN 1324367A CN 99812627 A CN99812627 A CN 99812627A CN 99812627 A CN99812627 A CN 99812627A CN 1324367 A CN1324367 A CN 1324367A
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peptide
acid
hydrophobic amino
seq
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CN99812627A
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戴维·E·赖特
约翰·S·奥布赖恩
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Myelos Corp
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Abstract

来源于前塞波素(prosaposin)的活性区的环状神经营养和镇痛肽,其具有如下共有序列:X1X2X3NNX4TX5X6X7X8,其中X1是一种疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸);X2是一种疏水氨基酸;X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸;N是天冬酰胺;X4是任意氨基酸;T是苏氨酸;X5是谷氨酸或天冬氨酸;X6是任意氨基酸;X7是一种疏水氨基酸;X8是一种疏水氨基酸。所述肽用于促进神经突生长,防止细胞死亡,促进成髓鞘,治疗神经退化疾病,以及治疗和预防神经痛。

Description

环状前塞波素衍生肽及其应用
                    发明领域
本发明涉及神经营养和镇痛肽。更具体地说，本发明涉及来源于具有神经营养和镇痛作用的塞波素(saposin)C的活性区的环状肽。
                    发明背景
神经营养因子是能够影响神经元细胞群的存活、目标神经分布和/或功能的蛋白质或肽(Barde，神经(Neuron)2:1525-1534,1989)。神经营养因子在体外和体内的功效已有很多文献论述过。例如，神经生长因子(NGF)是一种前脑胆碱能、外周和感觉神经元的营养因子(Hefti等，Neurobiol Aging,10:515-533,1989)，能够逆转自然发生的、以及机械外伤对外周神经引起的损伤(Rich等，神经细胞学杂志(J.Neurocytol.)16:261-268,1987)。来源于脑的神经营养因子(BDNF)是外周感觉神经元、黑质多巴胺能神经元、中枢胆碱能神经元和视网膜神经中枢的营养因子(Henderson等，Restor.Neurol.Neurosci.5:15-28,1993)。BDNF显示能够防止体内或体外自然发生的细胞死亡(Hofer等，自然，331:262-262,1988)。睫状神经营养因子(CNTF)促进体外鸡胚睫状神经中枢的生存，支持培养的交感神经感觉神经元和脊髓运动神经元的存活(Ip等，J.Physiol.Paris 85:122-130,1991)。脱髓鞘是很多中枢神经系统(CNS)疾病的常见缺陷，在多发性硬化(MS)中最为普遍存在。MS，一种可能导致完全无行为能力的慢性疾病，特征在于髓磷脂鞘的损伤，而保持轴突大部分完整。目前对于MS没有有效的治疗方法。其它涉及脱髓鞘的中枢神经系统疾病包括急性扩散性脑脊髓炎、肌萎缩性脊髓侧索硬化、急性出血性脑白质营养不良、进行性多病灶脑白质炎、异染性脑白质营养不良、和肾上腺性脑白质营养不良。外周神经系统(PNS)也会遭受脱髓鞘化，例如Guillain-Barre综合症中发生的脱髓鞘(疾病的病理学基础(Pathologic Basis of Disease),Robbins等编，W.B.Saunders,Philadelphia,1979,pp.1578-1582)。
外周神经损伤和外周神经病，例如由于糖尿病或化疗引起的那些，包括最常见的外周神经系统疾病。目前对外周神经系统疾病的治疗仅限于治疗症状，却不能治疗病因。
神经痛由神经损伤引起，例如神经紧缩或压迫以及脊髓的外伤性损伤，并通常持续很长时间或为慢性。大多数神经损伤还导致神经瘤的形成，其中异常神经再生导致产生疼痛。另外，当肿瘤的生长压迫邻近神经、脑或脊髓，产生癌症-相关神经痛。神经痛也与包括糖尿病和酒精中毒在内的疾病有关。在大多数情况下，神经痛对目前的药物有抗药性。这些药物还存在严重的副作用。US专利申请序列号08/611307提供了缓解或防止神经痛的方法，即给个体施用有效量的前塞波素(prosaposin)的活性片段。
前塞波素(prosaposin)是四种需要糖鞘脂被溶酶体水解酶水解的小热稳定糖蛋白的前体(Kishimoto等，脂类研究杂志(J.Lipid Res.)33:1255-1267,1992)。前塞波素(prosaposin)在溶酶体中被蛋白水解加工成塞波素(saposin)A、B、C和D(O’Brien等，FASEB J.,5:301-308,1991)。US5571787和已公开的PCT申请WO95/03821公开前塞波素(prosaposin)、塞波素(saposin)C刺激神经突生长，促进增强的成髓鞘作用。另外，US5571787、US5696080、US5714459和公开的PCT申请WO95/03821公开了由人塞波素(saposin)C的8-29位氨基酸构成的22-肽(CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL；SEQ ID NO:1)刺激神经突生长。这些参考文献还公开了一种包含在塞波素(saposin)C活性22-肽(由Y取代V)中的18-肽(YKEVTKLIDNNKTEKEIL；SEQ ID NO:2)也能促进神经突生长，并能够穿过血脑屏障。O’Brien等(FASEB J.9:681-685,1995)表明该22-肽刺激胆碱乙酰基转移酶活性，防止神经细胞死亡。该活性、促神经突生长的片段位于塞波素(saposin)C氨基末端区的线形12-聚体序列(LIDNNKTEKEIL；SEQ IDNO:3)(O’Brien等，FASEB J.9:681-685,1994)。Liepinsh等(天然结构生物学(Nature Struct.Biol.)4:793-795)阐述可以由一种环状肽模拟NK-细胞溶解酶的神经营养活性肽片段(残基17-30)的环形构象。
肽体内治疗应用的主要障碍是它们易于受蛋白水解而降解。本发明提供了对蛋白水解导致的降解有很好抗性并能够穿过血脑屏障的环状前塞波素(prosaposin)肽模拟物。
                    发明概述
本发明的一个实施方式是一种环状神经营养和镇痛肽，其具有约11到25个氨基酸，包括序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8，其中X1是一种疏水氨基酸(丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。该肽优选具有SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种装于隔片密封小瓶中的含有上述肽的组合物，其与控释材料一起配制成冻干形式、脂质体形式、为适于局部给药的剂型或单元剂型。
本发明的另一个实施方式是诱导哺乳动物成髓鞘或抑制脱髓鞘的方法，包括给存在脱髓鞘的哺乳动物施用一种药物有效脱髓鞘抑制量的环状肽，其具有约11到25个氨基酸，并包括序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8，其中X1是一种疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。在该优选实施方式的一个方面，脱髓鞘是由多发性硬化、缺血性损伤或外伤引起的。优选给药部位为静脉内、肌内、真皮内、皮下、颅内、脑脊液内或局部施用。该肽有利地在药物可接受载体中施用。在该优选实施方式的另一方面，该肽包封于薄层状结构中。该肽优选具有SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。在该优选实施方式的另一方面，哺乳动物是人。
本发明还提供了抑制神经退化或促进神经组织中神经突生长的方法，包括使神经退化抑制有效量的环状肽接触对该退化易感的神经组织，所述环状肽具有约11到25个氨基酸，并包括序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8，其中X1是一种疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。该肽优选具有SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。优选给药部位为静脉内、肌内、真皮内、皮下、颅内、脑脊液内或局部。该肽有利地在药物可接受载体中施用。在该优选实施方式的另一方面，该肽包封于薄层状结构中。哺乳动物优选是人。
本发明的再一个实施方式是治疗有必要接受治疗的哺乳动物神经痛的方法，包括给患神经痛的哺乳动物施用抑制神经退化有效量的环状肽，其中所述肽具有约11到25个氨基酸，并包括序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8，其中X1是一种疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。优选给药部位为静脉内、肌内、真皮内、皮下、颅内、脑脊液内或局部。该肽优选具有SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。该肽有利地在药物可接受载体中施用。在该优选实施方式的另一方面，该肽包封于薄层状结构中。哺乳动物优选是人。
本发明还提供了一种用于诱导哺乳动物成髓鞘或抑制脱髓鞘的环状肽，其具有约11到25个氨基酸，并包括序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8，其中X1是一种疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。该肽优选具有SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。
本发明的另一个实施方式是一种用于抑制神经退化或促进神经突生长的环状肽，其具有约11到25个氨基酸，并包括序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8，其中X1是一种疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。该肽优选具有SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种用于治疗神经痛的环状肽，其具有约11到25个氨基酸，并包括序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8，其中X1是一种疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。该肽优选具有SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。
              优选实施方式的详细描述
本发明提供了来源于塞波素(saposin)C的环状肽，其具有约11到25个氨基酸，并包括共同序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8(SEQ ID NO:4)，其中X1是一种疏水氨基酸(丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。在一个优选实施方式中，该肽具有如下序列：环-[LLDNNKTEKLY](SEQ ID NO:5)或环-[LIDNNATEEIL](SEQ ID NO:6)。由于它们的被约束的结构，这些环状前塞波素(prosaposin)肽模拟物对酶降解明显具有更强的抗性，并能够比相应的线形肽更大程度地穿过血脑屏障。本发明的环状肽与序列为TXLIDNNATEEILY(其中X是D-丙氨酸)的已知高活性线形前塞波素(prosaposin)肽模拟物(“prosaptide”)(SEQ ID NO:7)相比对刺激神经突生长同样有效或比其更有效(实施例1)。而且，本发明的环状肽对于防止体外神经细胞死亡比prosaptide更有效(实施例2)。这些环状肽无游离氨基和羧基末端。因此，它们在体内对从氨基-和羧基-末端降解肽的氨基肽酶和羧基肽酶的降解具有更好的抗性。
来源于塞波素(saposin)C、包括活性11-聚体区的环状肽(SEQ INNO:4)和其神经营养类似物具有促进外周和中枢神经系统在中毒、外伤、缺血、退化和遗传损伤后功能恢复的用途。另外，这些肽刺激成髓鞘，对抗脱髓鞘疾病的作用。这些肽刺激哺乳动物优选人的神经组织中神经元的生长，促进成髓鞘，促进神经保护和防止程序性细胞死亡。本发明的肽还能够用于治疗各种神经疾病，包括但不限于，运动的、感觉的、外周的、紫杉醇诱导的和糖尿病性神经疾病。本文提到的神经疾病是外周神经系统中的功能紊乱或病理性改变，其临床特征在于感觉或运动神经元异常。该肽还用作镇痛剂，尤其用于治疗哺乳动物优选人的神经痛，该神经痛能在外伤后持续数天或数月，通常持续很长时间或为慢性。
天然前塞波素(prosaposin)序列中的第二个天冬酰胺残基(相应于SEQ ID NO:4中的第二个“N”)已知为N-乙酰氨基葡萄糖糖苷化的，其可以为蛋白水解提供某种程度的抗性。通过标准方法(即，Merrifield合成)，用各种碳水化合物，优选葡萄糖，对即时非-天然塞波素(saposin)C-来源肽中该天冬酰胺残基的合成修饰也在本发明的范围内。
本发明的一个实施方式是一种促进神经突生长或增强分化的或未分化神经细胞成髓鞘作用的方法，即给细胞施用有效促神经突生长或促髓鞘形成量的来源于塞波素(saposin)C的包括SEQ ID NO:4所示活性环状11-聚体区的肽。
本发明的来源于塞波素(saposin)C的环状肽类似物可以通过如下修饰区别于塞波素(saposin)C序列或SEQ IN NO:4-6，例如，取代一个或多个赖氨酸和/或精氨酸残基；取代一个或多个酪氨酸和/或苯丙氨酸残基；删除一个或多个苯丙氨酸残基和/或保守取代该肽中的一个或多个氨基酸。赖氨酸/精氨酸和酪氨酸/苯丙氨酸残基的取代或删除将分别降低肽对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶降解的易感性。本发明的环状神经营养和髓鞘营养肽序列优选具有高至约50个氨基酸；更优选高至约30个氨基酸；最优选约11到25个氨基酸，并且其中包括SEQ INNO:4所示的序列。
本发明考虑应用的对这些肽序列的其它改变包括小的插入、缺失和取代。例如，考虑进行保守氨基酸取代。该取代是，例如，在其侧链的化学性质相互关联的一组氨基酸中进行的取代。氨基酸分组包括碱性电荷氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；酸性电荷氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；非-极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)；无电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)；和芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)。具体地说，通常认为一种由异亮氨酸或缬氨酸对亮氨酸、或谷氨酸对天冬氨酸、或丝氨酸对苏氨酸的单独取代构成的保守氨基酸取代、或由结构相关氨基酸对一种氨基酸的类似保守取代将不会明显影响肽的性质。能够对包括SEQ ID NO:4的来源于塞波素(saposin)C-的环状序列进行修饰，以获得各种目的，例如增强活性和稳定性。也可以存在所述通用序列之外的其它氨基酸，包括天然塞波素(saposin)C序列、这些天然序列的保守取代、或非相关肽序列，以实现多种目的，例如增强的结合力、疏水性、亲水性等。除活性神经营养区之外的序列对于活性通常不是必须的。因此，在大多数情况下，除去这些序列的相同性，目标肽将具有活性。另外，任意所述肽可以用本文所述的方案筛选该活性。
所述环状肽刺激神经突生长、防止神经细胞死亡、促进成髓鞘、缓解神经痛、和治疗感觉神经疾病的任何一种能力可以容易地由本领域技术人员应用实施例1-9描述的方案确定。分析这些肽促进成髓鞘和抑制脱髓鞘能力的方法在下面的实施例3和4中阐述。
本发明的肽在细胞生长培养基中的神经营养活性的常用最小量通常至少约5ng/ml。可以考虑用该量或高于该量的本发明的环状合成肽进行体外应用。这些肽的用量通常在0.1μg/ml至约10μg/ml浓度范围内。可以按照实施例1确定任意特定组织的有效量。
可以直接将本发明的肽施用给细胞在体外或离体处理神经细胞。这可以如下进行，例如，在适合特定细胞类型的生长培养基中培养细胞，然后将肽加入培养基。当在体内，通常在脊椎动物体内，优选哺乳动物体内处理细胞时，可以通过一种方法施用组合物。更优选，直接将赋予肽所需局部浓度的足够量组合物注射到血液或组织中。在缺乏赖氨酸和精氨酸残基的肽中，蛋白水解导致的降解减少了。较小的肽(即20-聚体或更小)将最容易穿过血脑屏障，进入中枢神经系统，治疗CNS疾病(参见，Banks等，肽(Peptides),13:1289-1294,1992)。
本发明的肽还可以应用常规酸-催化酯化作用用脂肪酸酯化，以形成肽脂肪酸酯。或者，合成程序中添加的最后一个的氨基酸自身就是一种商业提供的酯化氨基酸，这即可免去酯化反应的必要。考虑用于形成肽酯的脂肪酸包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸。
本发明的肽还可以通过在合成程序中加入商业提供的乙酰化赖氨酸、精氨酸或天冬氨酸残基进行乙酰化。这些修饰肽保留了母体化合物的活性。该修饰由于增强了疏水性而有利于促进肽穿过血脑屏障的能力。
对于治疗神经疾病，还可以将足够赋予所需局部浓度量的神经营养素直接颅内注射或注射到脑脊液中。在这两种情况下，使用药物可接受的可注射载体。该载体包括，例如，磷酸盐缓冲的盐水和Ringer’s溶液。或者，可以通过直接局部注射或通过系统给药将组合物施用到外周神经组织。各种常规给药方式都可以考虑，包括静脉内、脑脊液内、肌内、真皮内、皮下、颅内、鼻内、硬膜外、局部和口服。对于镇痛剂的应用，优选通过直接肌内或静脉内注射给药。
本发明的肽组合物可以以单剂量形式包装和给药，例如一种剂量等于施用给患者的日剂量的可注射组合物或局部制剂或作为一种控释组合物。一种装有在PBS中的或冻干形式的日剂量活性成分的隔片密封小瓶是单位剂型的一个例子。用于治疗神经疾病、脱髓鞘或作为一般性镇痛剂或用于治疗神经痛的本发明肽的近似日系统剂量基于脊椎动物体重在约0.01至约10000μg/kg范围内。更优选，日系统剂量在约0.1至1000μg/kg之间。最优选，日系统剂量在约10至100μg/kg之间。因此，对于典型体重70kg的人，剂量可以在每日约0.7至700000μg之间；更优选在每日约7至70000μg之间；最优选在每日约700至7000μg之间。局部给药材料的日剂量将大约少一个数量级。口服给药也可以考虑。
在本发明的一个优选实施方式中，通过将神经营养肽移植到体内，将其局部施用给神经细胞。例如，本发明特别考虑应用聚乳酸、聚半乳酸、再生胶原、多层脂质体和其它一些常规储存制剂。灌注泵、骨架捕获系统和透皮传送装置的组合也可以考虑。还可以在肽移植前，将其包封于US5529914所述的聚乙二醇仿形涂层中。
本发明的神经营养肽还可以包封于胶束或脂质体。脂质体包封技术是公知的。通过应用能够结合目标组织的受体、配体或抗体，脂质体可以靶向特定组织，例如神经组织。这些制剂的制备是本领域众所周知的(Radin等，Meth.Enzymol.,98:613-618,1983)。
目前还没有能够促进神经系统功能完全再生和结构完整性修复的商业提供药品。尤其对CNS更是如此。通过应用神经营养因子使外周神经再生在本发明的范围内。而且，神经营养因子在治疗与神经群或脑特定区域退化有关的神经退化疾病中具有治疗作用。帕金森氏症的主要病因是黑质多巴胺能神经元的退化。因为抗前塞波素(prosaposin)的抗体免疫组织化学染色人脑切片中黑质的多巴胺能神经元，本发明的神经营养肽可能在治疗帕金森氏症中具有治疗作用。视网膜神经疾病，一种导致老年人视力丧失的眼神经退化疾病，也可以应用本发明的肽治疗。
长期以来一直认为，为了到达脑神经群，神经营养因子必需施用到脑内，因为这些蛋白质不能穿过血脑屏障。US5571787公开了一种来源于塞波素(saposin)C的碘化神经营养18-聚体片段能够穿过血脑屏障。本发明的高到约22个氨基酸的肽也将以比较短肽更大的运输量穿过该屏障，因此能够静脉内施用。其它的神经群，例如运动神经元，也可以通过静脉注射治疗，当然直接注射到脑脊液内也可以预见作为一种可选择途径。
可以按照前面描述的方式在体内、离体或在体外治疗细胞，以促进髓鞘形成或防止脱髓鞘。导致神经纤维脱髓鞘的疾病，包括MS、急性扩散性脑白质炎、进行性多病灶脑白质炎、异染性脑白质营养不良和肾上腺性脑白质营养不良，可以通过将本发明的神经营养肽施用给感染疾病的细胞缓解或中止。也可以考虑逆转脱髓鞘病或其它神经损伤。
本发明的组合物可以用作体外研究工具，用于研究神经营养因子和鞘磷脂促进材料的效果。然而，更具体地说，它们可以直接用作实验室试剂和细胞生长培养基的成分，用于在体外促进神经细胞生长和维持。
本发明的肽应用成熟方法在固体支持物上和应用本领域公知的自动固相方案的Fmoc化学法(Traeciak等，Tetrahedron Lett.33:4557-4561,1992)在Protein Technologies Symphony肽合成仪上合成。环状肽应用TFA/水/三异丙基硅烷(95∶2.5∶2.5)从固体支持物上切下来。应用反相HPLC在C-18柱上用0.3％三氟乙酸(TFA)的乙腈液洗脱，来纯化肽。SEQ ID NO:5(肽A)和6(肽B)所示的肽的质谱分析证实已经合成了环状肽[SEQ ID NO:5:MH+1333(预期)，1333(观察)；SEQ ID NO:6:MH+1127(预期)，1127(观察)]。
下列实施例作为举例说明，不是意图限制本发明的范围。
                    实施例1
             体外刺激神经突生长
NS20Y成神经细胞瘤细胞在含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM中生长。用胰蛋白酶转移细胞，在30mm有盖培养皿的盖玻片上铺板。20-24小时后，用含0.5％FCS加各种浓度肽A、肽B或TX14(A)的2ml DMEM替换培养基。再次培养细胞24小时，然后用PBS清洗，用Bouin’s溶液(苦味酸/福尔马林/7酸15∶5∶1的饱和水溶液)固定30分钟。用PBS除去固定剂，在相差显微镜下记录神经突生长。表现等于或长于一个细胞直径的一个或多个明显定义的神经突的细胞记录为阳性。在各平皿的不同部分至少记录200个细胞，以确定神经突生长细胞的百分率，分析进行两次。
所有三种肽在NS20Y细胞中均诱导神经突生长。T1/2(ED50)，导致神经突生长增加50％的肽浓度，对于TX14(A)和肽B为1.0ng/ml。对于肽A,T1/2为0.6ng/ml。因此，肽B与TX14(A)同样有效，而肽A比TX14(A)更有效。这表明本发明的环状肽与已成型的标准“prosaptide”相比具有优良活性。
                    实施例2
               体外防止细胞死亡
如实施例1所述将NS20Y细胞铺板，在存在或缺乏TX14(A)、肽A或肽B的情况下，在0.5％胎牛血清中在玻璃盖玻片上生长2天。除去培养基，向各皿中加入0.2％锥虫蓝的PBS液。在倒置显微镜上记录兰色-染色的死亡细胞，作为总百分数，在每个平皿的四个视野记录400个细胞。两次的平均偏差为5％。TX14(A)、均降低了锥虫蓝-阳性(死亡)细胞的数目。TX14(A)防止神经细胞死亡的T1/2(ED50)为1.0ng/ml。肽A和肽B更为强效，T1/2值分别为0.6ng/ml和0.8ng/ml。这表明本发明的环状肽在援救程序细胞死亡方面，与标准线形“prosaptide”相比具有优越活性。
                    实施例3
                 离体成髓鞘分析
按照Satomi(Zool.Sci.,9:127-137,1992)制备新生鼠的小脑移植体。当新生小鼠小脑进行正常神经分化和开始形成髓鞘的过程中，观察培养中的神经突生长和成髓鞘共22天。在移植体(三个对照和三个处理移植体)制备好后的第二天加入具有约11至25个氨基酸并含有SEQ ID NO:4所示序列的环状塞波素(saposin)C-衍生肽(10μg/ml)，在亮视野显微镜下用摄影机评价神经突的生长和成髓鞘。在第八天，含有肽的培养物比对照培养物更细瘦，扩散更广泛。在第15天，肽处理培养物在移植体的外围含有一些具有长突出物的细胞，而这在未处理培养物中很难发现。在第22天，肽处理培养物与对照移植体相比在颅下脑白质中含有明显较多的成髓鞘轴突。因此，本发明的肽离体诱导分化中的小脑增强的成髓鞘作用。
                    实施例4
                  脱髓鞘的防止
防止Schwann细胞死亡与防止脱髓鞘有关。Schwann细胞含有广泛的髓磷脂鞘。向培养中的Schwann细胞加入具有约11至25个氨基酸并含有SEQ ID NO:4所示序列的环状塞波素(saposin)C-衍生肽能够以剂量依赖模式减少Schwann细胞死亡，并刺激硫酸脑苷脂，髓磷脂-特异性脂类，整合到Schwann细胞中。这表明本发明的环状肽能够防止由于Schwann细胞死亡导致的脱髓鞘。
                    实施例5
         应用肽治疗外伤缺血性CNS损伤
受到外伤损伤脊柱的人接受约100μg/ml具有约11至25个氨基酸并含有SEQ ID NO:4所示序列的环状塞波素(saposin)C-衍生肽在无菌盐水溶液中或以储库形式在脑脊髓内或直接注射，以使肽能够在损伤部位缓慢、连续地释放。由运动神经功能的获得(即，增加的四肢运动)评价状况改善。连续治疗直到不再发生进一步改善。
                    实施例6
             应用肽治疗脱髓鞘疾病
给诊断为早期MS的患者直接静脉内注射到脑脊液中剂量与实施例3相同剂量范围的具有约11至25个氨基酸并含有SEQ ID NO:4所示序列的环状塞波素(saposin)C-衍生肽。每2-5天或每周重复该剂量，观察肌肉强度、肌与骨骼的协调和成髓鞘作用(通过MRI确定)的改善。
                    实施例7
          对Chung模型大鼠神经痛的缓解
该实施例描述了对外周神经痛Chung实验模型鞘内快速浓注具有约11至25个氨基酸并含有SEQ ID NO:4所示序列的环状塞波素(saposin)C-衍生肽。各肽均为化学合成、纯化、并溶解在无菌PBS并缓冲到神经pH。按照以前Kim等(Pain,50:355,1992)描述的外科程序对雄性大鼠进行操作，以诱导一种allodynic状态。手术后两周导入脊柱插管，5天后，以0.007、0.07、和0.7μg/只鼠施用肽。然后用校准的von Frey发丝(hairs)测定压力极限。动物对施用压力反应而缩回爪子耗费的时间越长，神经痛约不严重。该肽明显增加了极限压力，表明显著地缓解神经痛。
                    实施例8
             感觉神经疾病的治疗
给小鼠施用紫杉醇，以诱导感觉神经疾病。给紫杉醇-处理小鼠施用50μg/ml、100μg/ml、或250μg/ml的具有约11至25个氨基酸并含有SEQ ID NO:4所示序列的环状塞波素(saposin)C-衍生肽。用Hargreaves感觉测试装置测量热感的丧失，作为感觉神经疾病的指标。三个剂量的肽都有效地防止或减缓紫杉醇-处理小鼠热感的丧失。因此，本发明的合成的塞波素(saposin)C-衍生肽诱导地移植感觉神经疾病。
                    实施例9
            缓解糖尿病大鼠的神经痛
该实施例描述了在糖尿病性神经疾病的大鼠模型腹膜内施用具有约11至25个氨基酸并含有SEQ ID NO:4所示序列的环状塞波素(saposin)C-衍生肽的效果。
如Calcutt等(Pain,68:293-299,1996)所述，对大鼠单次腹膜内注射链脲霉素(50mg/kg体重，临用前溶解于0.9％无菌盐水中)以融化胰腺β细胞并诱导胰岛素缺陷，使大鼠成为糖尿病。两天后，通过测量学糖水平确定链脲霉素-注射大鼠的糖尿病。按照大鼠糖尿病研究中普遍接受的非-饮食性高糖血症的定义，将血糖浓度低于15mmol/l的链脲霉素-注射动物排除于后续研究。
在第8周，分析对作为allodynia指标的有毒化学福尔马林的行为应答，研究糖尿病大鼠和对照大鼠(Calcutt等，同上，1996)。简单地说，在大鼠右前爪背表面皮下注射新鲜配制的福尔马林(50μl,0.5％的无菌盐水溶液)。该浓度的福尔马林在对照小鼠中诱导最大程度之下的行为应答，在Q和2期糖尿病大鼠中可以检测到痛觉过敏(Calcutt等，欧洲药理学杂志(Eur.J.Pharmacol.)285:189-197,1995)。将动物转移到构建成能够连续观察爪子的观察仓内。在接下来的60分钟里，由一位不知道各动物治疗组的观察者以5分钟的间隔记录1分钟内因痛畏缩的动物数。如以前对糖尿病大鼠研究时的定义，1期被定义为测定畏缩的开始(注射后的1-2和5-6分钟)；Q(静止，quiescent)期是在10-11、15-16和20-21分钟进行的测定；2期是注射后接着的全部测定(参见，例如，Malmberg等，Neurosci.Lett.,161:45-48,1993)。由各期测定点畏缩数的总和，比较各期的活性。
将糖尿病大鼠分成两组，每组四只动物，分别施用盐水或具有约11至25个氨基酸并含有SEQ ID NO:4所示序列的环状塞波素(saposin)C-衍生肽。用0.5％福尔马林处理前两小时，用盐水或200μg/kg肽腹膜内给药处理糖尿病大鼠。肽的施用完全防止了1期的异常畏缩应答，在2期改善应答达70％。因此，在疼痛的糖尿病性神经病大鼠模型中，非肠道施用肽缓解福尔马林注射导致的疼痛，并改善运动神经元功能。
                     序列表(1)总信息：
(ⅰ)申请人：Myelos Corporation
(ⅱ)发明名称：环状前塞波素衍生肽及其应用
(ⅲ)序列数目：6
(ⅳ)通信地址：
    (A)收信人：Knobbe,Martens,Olson&Bear
    (B)街道：620 Newport Center Drive,16th Floor
    (C)城市：Newport Beach
    (D)州：CA
    (E)国家：USA
    (F)邮编：92660
(ⅴ)计算机可读形式
    (A)介质类型：软盘
    (B)计算机IBM兼容
    (C)操作系统Windows
    (D)软件：FastSEQ for Windows Version 2.0b
(ⅵ)在先申请资料：
    (A)申请号：60/098,359
    (B)申请日：1998年8月28日
(ⅷ)律师/代理人信息：
    (A)姓名：Bartfeld,Neil S
    (B)登记号：39901
    (C)案号：MYELOS.014PR
(ⅸ)通讯号码：
    (A)电话：619-235-8550
    (B)传真：619-235-0176(2)SEQ ID NO:1的信息：
(ⅰ)序列特征
    (A)长度：21氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys1               5                  10                  15Thr Glu Lys Glu Lys
        20(2)SEQ ID NO:2的信息：
(ⅰ)序列特征
    (A)长度：18氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Tyr Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu1               5                  10                  15Ile Leu(2)SEQ ID NO:3的信息：
(ⅰ)序列特征
    (A)长度：12氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu1               5                  10(2)SEQ ID NO:4的信息：
(ⅰ)序列特征
    (A)长度：11氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅸ)特性：
    (A)名称/关键词：其它
    (B)位置：1...2
    (D)其它信息：A,L,I,V,Y,W,F或者M
    (A)名称/关键词：其它
    (B)位置：3...3
    (D)其它信息：D,E,K或者R
    (A)名称/关键词：其它
    (B)位置：6...6
    (D)其它信息：任意氨基酸
    (A)名称/关键词：其它
    (B)位置：8...8
    (D)其它信息：D或者E
    (A)名称/关键词：其它
    (B)位置：9...9
    (D)其它信息：任意氨基酸
    (A)名称/关键词：其它
    (B)位置：10...11
    (D)其它信息：A,L,I,V,Y,W,F或者M
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Xaa Xaa Xaa Asn Asn Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa1               5                  10(2)SEQ ID NO:5的信息：
(ⅰ)序列特征
    (A)长度：11氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：环状
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:Leu Leu Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Leu Tyr1               5                   10(2)SEQ ID NO:6的信息：
(ⅰ)序列特征
    (A)长度：11氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：环状
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:Leu Ile Asp Asn Asn Ala Thr Glu Glu Ile Leu1               5                   10

Claims (33)

1．一种环状肽，其具有约11到25个氨基酸，并包括序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8，其中X1是一种疏水氨基酸(亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。
2．权利要求1的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。
3．一种含有权利要求1的肽的组合物，其装于隔片密封的小瓶中。
4．一种含有权利要求1的肽的组合物，其用一种控释材料配制。
5．一种含有权利要求1的肽的组合物，其为冻干形式。
6．一种含有权利要求1的肽的组合物，其为脂质体形式。
7．一种含有权利要求1的肽的组合物，其为适合局部施用的剂型。
8．一种含有权利要求1的肽的组合物，其为单位剂量形式。
9．一种诱导哺乳动物成髓鞘或抑制脱髓鞘作用的方法，包括：
给遭受脱髓鞘的哺乳动物施用脱髓鞘抑制有效量的环状肽，该肽具有约11到25个氨基酸，并包括序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8，其中X1是一种疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。
10．权利要求9的方法，其中所述脱髓鞘是由于多发性硬化、缺血性损伤或外伤所致。
11．权利要求9的方法，其中所述施用选自静脉内、肌内、真皮内、皮下、颅内、脑脊液内、和局部施用。
12．权利要求9的方法，其中所述肽在药物可接受的载体中施用。
13．权利要求9的方法，其中所述肽被包封于薄层结构中。
14．权利要求9的方法，其中所述肽具有SEQ IN NO:5或6所示的序列。
15．权利要求9的方法，其中所述哺乳动物是人。
16．一种抑制神经组织中神经退化或促进神经突生长的方法，包括：
使神经退化抑制有效量的环状肽接触对该退化易感的神经组织，所述环状肽具有约11到25个氨基酸，并包括序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8，其中X1是一种疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。
17．权利要求16的方法，其中所述施用步骤选自静脉内、肌内、真皮内、皮下、颅内、脑脊液内、和局部施用。
18．权利要求16的方法，其中所述肽在药物可接受的载体中施用。
19．权利要求16的方法，其中所述肽被包封于薄层结构中。
20．权利要求16的方法，其中所述肽具有SEQ IN NO:5或6所示的序列。
21．权利要求16的方法，其中所述哺乳动物是人。
22．一种治疗需要接受该治疗的哺乳动物神经痛的方法，包括给患神经退化疾病的哺乳动物施用治疗神经痛有效量的环状肽，其中所述肽具有约11到25个氨基酸，并包括序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8，其中X1是一种疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。
23．权利要求22的方法，其中所述施用步骤选自静脉内、肌内、真皮内、皮下、颅内、脑脊液内、和局部施用。
24．权利要求22的方法，其中所述肽在药物可接受的载体中施用。
25．权利要求22的方法，其中所述肽被包封于薄层结构中。
26．权利要求22的方法，其中所述肽具有SEQ IN NO:5或6所示的序列。
27．权利要求22的方法，其中所述哺乳动物是人。
28．一种用于在哺乳动物中诱导成髓鞘或抑制脱髓鞘作用的环状肽，其具有约11到25个氨基酸，并包括序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8，其中X1是一种疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。
29．权利要求28的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO:5或6所示的序列。
30．一种用于抑制神经退化或促进神经突生长的环状肽，其具有约11到25个氨基酸，并包括序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8，其中X1是一种疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。
31．权利要求30的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO:5或6所示的序列。
32．一种用于治疗神经痛的环状肽，其具有约11到25个氨基酸，并包括序列X1X2X3NNX4TX5X6X7X8，其中X1是一种疏水氨基酸(丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或蛋氨酸)；X2是一种疏水氨基酸；X3是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；N是天冬酰胺；X4是任意氨基酸；T是苏氨酸；X5是谷氨酸或天冬氨酸；X6是任意氨基酸；X7是一种疏水氨基酸；X8是一种疏水氨基酸。
33．权利要求32的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO:5或6所示的序列。
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