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CN1304363C - N－甲基－高半胱氨酸及其应用以及制备方法 - Google Patents

N－甲基－高半胱氨酸及其应用以及制备方法 Download PDF

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CN1304363C CNB028228235A CN02822823A CN1304363C CN 1304363 C CN1304363 C CN 1304363C CN B028228235 A CNB028228235 A CN B028228235A CN 02822823 A CN02822823 A CN 02822823A CN 1304363 C CN1304363 C CN 1304363C
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Abstract

本发明涉及N-甲基-高半胱氨酸的合成及其应用。

Description

N-甲基-高半胱氨酸及其应用以及制备方法
技术领域
本发明涉及权利要求中表征的主题，即、通式I和II的N-甲基-高半胱氨酸及其应用和制备方法。
背景技术
N-甲基-氨基酸在合成化学中是有用的中间产物。主要的药物化学都非常频繁地使用此等成分，这是因为许多高效力和选择性的药物都包含N-甲基-氨基酸。
旋光性N-甲基-氨基酸都天然地为单个化合物(例如N-甲基-色氨酸；Liebigs Ann.Chem.1935，520，31-34)，但也发现作为许多天然生物活性物质中的组分，如多拉司他汀(G.R.Pettit等人，J.Org.Chem.1990，55，2989-2990；Tetrahedron 1993，41，9151-9170)或者didemnins(K.L.Rinehart等人，J.Nat.Prod.1988，51，1-21；J Am.Chem.Soc.1987，109，6846-6848；J.Am.Chem.Soc.1995，117，3734-3748)。其他例子是jasplakinolide(J.Org.Chem.1991，56，5196-5202)以及其他细胞毒性肽(J.Org.Chem.，1989，54，617-627；Tetrahedron 1995，51，10653-10662；J.Org.Chem.1989，54，736-738)。具有免疫抑制活性的环孢菌素也包含N-甲基-氨基酸(例如参见：R.M.Wenger，Helv.Chim Acta 1983，66，2672-2702；S.L.Schreiber等人，Tetrahedron Lett.1988，29，6577-6580)。N-甲基-氨基酸还具有神经药物活性(J.C.Watkins，J.Med.Pharm.Chem.1962，5，1187-1199)。
另一方面，在药物研究中通常利用在生物活性肽中加入N-甲基-氨基酸，以研究构象和生物活性(例如参见：J.Org.Chem.1981，46，3436-3440；Int.J.Pept.Protein Res.1995，46，47-55；Int.J.Pept.Protein Res.1986，27，617-632)。H.Kessler，Angew. Chem.1982，94，509-520，以及G.R.Marshall等人，Ann.Rep.Med.Chem.1978，13，227-238提供了对肽构象研究以及生物活性研究的综述。
此外，用相应的N-甲基化合物取代肽中的氨基酸也被用于增加肽配体的活性或选择性(例如参见：J.Med.Chem.1994，37，769-780；Int.J.Pept.Protein Res.1995，46，47-55)。与非甲基化的肽键相比，N-甲基-肽键在蛋白水解方面经常表现出更高的稳定性，这可导致口服利用度增加以及作用的延长(R.H.Mazur等人，J.Med.Chem.1980，23，758-763)。对于通过加入N-甲基-氨基酸或者通过其他改性来设计肽，可参见W.F.Degrado，Adv.Protein Chem.1988，39，51-124，以及J.Rizo，L.M.Gierasch，Annu.Rev.Biochem 1993，61，387-418。对于有关肽模拟物(peptidomimetics)的综述，可参见A.Giannis等人，Angew.Chem.1993，105，1303-1326以及J.Gante，Angew.Chem.1994，106，1780-1802。
在WO 01/44177中描述了一种在环6分生部分序列中包含N-甲基-高半胱氨酸的肽。与金属离子结合序列的结合是通过高半胱氨酸中的硫原子进行的。通过螯合放射性核素如99mTc或186Re，在癌症的诊断和治疗中作为放射诊断剂或放射治疗剂的应用是可能的(参见US 6,056,940，US 6,022,857，US 6,017,509)。
在WO 01/44177中，肽的合成是在一步一步的合成过程中通过N-甲基化来完成的(例如参见：J.Am.Chem.Soc.1997，119，2301-2302)。C端连接在固相上的4分生肽与氨基酸N-Fmoc-S-三苯甲基高半胱氨酸(Fmoc＝9H-芴-9-基甲基氧基羰基)反应，后者可在3个步骤中由蛋氨酸得到(J.Med.Chem.1996，39，1361-1371)，以形成5分生肽。在脱除保护基后，高半胱氨酸的端氨基与2-硝基苯磺酰氯反应以形成磺酰胺。接着用MTBD(1，3，4，6，7，8-六氢-1-甲基-2H-嘧啶并[1，2-a]嘧啶)进行甲基化，并随后用2-巯基乙醇脱除磺酰基。然后进一步增加肽序列。但是，该合成法具有反应不完全并需要额外纯制肽的缺陷。
产生包含N-甲基-氨基酸的肽序列通常通过部分序列与Fmoc-保护的N-甲基-氨基酸反应来实现(例如参见：J.Med.Chem.1996，39，1361-1371)。因此，WO 01/44177中的肽序列所需要的氨基酸N-Fmoc-N-甲基-S-三苯甲基高半胱氨酸不能预先制备。
在文献中有许多用于制备N-甲基-氨基酸的方法，通常由相应的非甲基化氨基酸起始，这些非甲基化氨基酸可大量地以手性天然物质市售得到。
根据E.Fischer首先合成非外消旋的N-甲基-氨基酸。在此情况下，氨基酸的N-甲苯磺酰基衍生物用氢氧化钠溶液和碘甲烷进行甲基化。之后，用沸腾的盐酸脱除甲苯磺酰基(Ann.Chem.1913，398，96-125；Ber.dtchem.Ges.1915，48，360-378)。描述到，用该方法可进行部分的外消旋化(A.H.Cook等人，J.Chem.Soc.1949，1022-1028)。
Fischer的另一个方法是2-溴羧酸与甲基胺的反应(Ber dt.chem.Ges.1916，49，1355-1366；对于应用可参考A.H.Cook等人，J.Chem.Soc.1949，1022-1028)。在此情况下，也可产生部分外消旋化的产物(参见：P.Quitt等人，Helv.Chim Acta 1963，46，327-333)。我们用2-溴-4-甲基sulfanyl-丁酸与甲基胺的反应证实了该论断。在该文献中描述了通过以下方法制备N-甲基-L-蛋氨酸：对D-蛋氨酸进行重氮化，随后在保留中用溴化物替换，然后在转化中用甲基胺替换(N.Izumiya，A.Nagamatsu，Kyushu.Mem.Med.Sci.1953，4，1-16)。未测定产物的对映体纯度。我们可证实，即使如其所述在温和条件下使用Ellman的重氮化法(Synthesis1999，583-585)，反应顺序仅形成75％的对映体过量。因此，该方法不适合于制备对映体纯的N-甲基-高半胱氨酸。
非常常用的方法是根据Benoiton用氢化钠和碘甲烷在THF或DMF中直接进行甲基化(Can.J.Chem.1973，51，1915-1919.Can.J.Chem.1977，55，906-910)。该方法是标准地用于制备Z-和Boc-保护的N-甲基-氨基酸(例如参见：Tetrahedron 1995，51，10653-10662，D.L.Boger等人，J.Am.Chem.Soc.1999，121，6197-6205，H.Waldmann等人，Chem.Eur.J.1999，5，227-236)。Boc-保护的蛋氨酸酰胺与甲基化试剂如碘甲烷的反应在我们的情况下导致硫原子的甲基化并形成锍离子(参见：S.J.F.Macdonald等人，J.Med.Chem.1999，64，5166-5175)。因此，该方法不能用于制备N-甲基-高半胱氨酸。
有许多方法由氨基酸酯起始制备N-甲基-氨基酸。这些方法包括用硼烷选择性还原N-甲酰基氨基酸酯(Tetrahedron Lett.1982，23，3315-3318，J.Org.Chem.1991，56，5196-5202)以及氨基酸酯的Schiff碱与硫酸二甲酯或三氟甲磺酸甲酯(triflate)的反应并随后水解(M.J.O′Donnell等人，Tetrahedron Lett.1984，25，3651-3654)。但是，皂化氨基酸酯以形成氨基酸时，会发生部分外消旋化(S.T.Cheung，N.L.Benoiton，Can.J.Chem，1977，55，906-910)。因此，这些方法也是不合适的。
氨基酸也可在还原性烷基化反应中与醛反应。中间形成的Schiff碱在氢和催化剂存在下原位进行还原(R.E.Bowman等人J.Chem.Soc.1950，1342-1345 and 1346-1349)或者用硼氢化钠进行还原(K.A.Schellenberg，J.Org.Chem.1963，28，3259-3261)。该方法可在溶液(例如参见：J.Org.Chem.1996，61，3849-3862；J.Org Chem.1995，60，6776-6784)以及固相(例如参见：J.Org.Chem.1996，61，6720-6722，Tetrahedron Lett.1997，38，4943-4946，Bioorg Med.Chem.Lett.1995，5，47-50)中进行。根据该方法，二肽和三肽已根据Bowman(J.Chem.Soc.1950，1349-1351)进行全甲基化。根据该方法，用甲醛进行选择性的单甲基化是不可能的，而是产生未甲基化、单甲基化和二甲基化氨基酸的混合物，该混合物不能被分离(Quitt等人，Helv.Chim Acta 1963，46，327-333；还参见R.E.Bowman，H.H.Stroud，J.Chem.Soc.1950，1342-1345)。
在合成Fmoc保护的N-甲基-氨基酸时，Freidinger的方法(J.Org.Chem.1983，48，77-81)是最常用的。该方法由两个步骤组成：在第一步中，通过氨基酸与甲醛的反应形成噁唑烷酮，然后在第二步中在酸性条件下用三乙基硅烷还原为N-甲基化合物。在Friedinger法中，Fmoc-L-蛋氨酸与甲醛反应形成噁唑烷酮的产率为88％，但用三乙基硅烷还原为Fmoc-N-甲基-L-蛋氨酸的反应即使在5天后仍未完全，而且产率仅为22％(J.Org.Chem.1983，48，77-81)。
发明内容
因此，本发明的目的是提供可用于形成包含N-甲基化高半胱氨酸的肽序列并避免在固相上进行N-甲基化的化合物及其制备方法。
本发明的目的是通过通式I的N-甲基-高半胱氨酸来实现的，该化合物可以是对映体纯的和外消旋的：
Figure C0282282300091
其中X1代表硫保护基，而X2代表氢原子或者代表氮保护基。X1优选代表苄基(Bn)、4-甲氧基苄基(Mob)、二苯基甲基、二(4-甲氧基苯基)甲基、4，4′-二甲氧基三苯基甲基(DMT)、三苯基甲基(三苯甲基)、甲氧基甲基(MOM)、9H-芴-9-基甲基或叔丁基硫化物(T.W.Greene，P.G.M.Wuts，有机合成中的保护基，第2版，J.Wiley & Sons，New York1991)，优选代表苄基(Bn)、4-甲氧基苄基(Mob)、二苯基甲基、二(4-甲氧基苯基)甲基、4，4′-二甲氧基三苯基甲基(DMT)或三苯基甲基(三苯甲基)，特别优选为三苯基甲基(三苯甲基)，而X2在是保护基时优选代表9H-芴-9-基甲基氧基羰基(Fmoc)、2，7-二溴-9H-芴-9-基甲基氧基羰基、叔丁基氧基羰基(Boc)、苄基氧基羰基(Cbz或Z)、三氟乙酰基、2，2，2-三氯乙基氧基羰基(Troc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氧基羰基(Teoc)或2-三甲基甲硅烷基乙基磺酰基(T.W.Greene，P.G.M.Wuts，见上)，优选代表叔丁基氧基羰基(Boc)、苄基氧基羰基(Cbz或Z)或9H-芴-9-基甲基氧基羰基(Fmoc)，特别优选代表9H-芴-9-基甲基氧基羰基(Fmoc)。
根据本发明之通式I化合物的制备如下进行：在还原剂存在下用酸使根据文献方法(Ben-Ishai，J.Am.Chem.Soc.1957，79，5736-5738；M.A.Blaskovich，M.Kahn，Synthesis 1998，379-380；G.V.Reddy等人，Synth.Commun.1999，29，4071-4077)由蛋氨酸制得的(见实施例1)式II噁唑烷酮开环，
以形成式III的N-甲基蛋氨酸，
然后按照本领域已知的方法引入硫保护基和任选的氮保护基(参见：T.W.Greene，P.G.M.Wuts，同上)。优选使用烷基硅烷作为还原剂，更优选三乙基硅烷。所述酸优选使用三氟乙酸、五氟丙酸、三氟甲磺酸或甲磺酸，更优选三氟乙酸。反应优选在氯化溶剂、二噁烷、THF、二甲氧基乙烷中进行，优选在二氯甲烷或氯仿中。反应进行的温度为-2℃至+100℃，优选为0-40℃。反应时间为5分钟-10小时，优选0.5-2小时。得到N-甲基蛋氨酸的产率为70-95％。
根据本领域技术人员已知的方法(参见：M.Gooodman(编辑)，Houben-Weyl，第E22卷，Synthesis of Peptide and Peptidomimetics.Thieme，2001)，可用通式I的化合物制备包含N-甲基-高半胱氨酸的肽以及肽中间体，优选用于制备Fmoc-(N-CH3)Hcy(Trt)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-OH、环- Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-(N-CH3)Hcy 以及环- Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-(N-CH3)Hcy (CH2CO-B-Dap-Phe(4-NH2)-Cys-Thr-Ser)。
实施例1
a)叔丁基-(S)-4-[2-(甲基sulfanyl)乙基]]-5-氧代噁唑烷酮-3-羧酸酯100g的N-(叔氧基羰基)-L-蛋氨酸(0.4mol)、100g的低聚甲醛(3.3mol)、200g的无水硫酸镁(1.7mol)和4g的对甲苯磺酸(0.02mol)在1L甲苯中的混合物加热3小时至90℃。冷却至20℃，然后向其中添加800ml的饱和碳酸氢钠溶液，同时用冷却冰。过滤，残留物用400ml的乙酸乙酯洗涤。有机相用300ml的水萃取，在硫酸钠上干燥，然后真空蒸发至干。粗产物溶解在150ml的己烷/乙酸乙酯1∶3中，然后在硅胶上过滤，并用500ml的己烷/乙酸乙酯1∶3重新洗涤。真空蒸发至干，得到85.3g(0.33mmol，理论值的83％)黄色油。
计算值：C 50.56  H 7.33  N 5.36  S 12.27
实测值：C 50.38  H 7.24  N 5.43  S 12.10
IR：2980，2920，1800，1715，1390，1170，1050
NMR(CDCl3)：1.5(9H)，2.1(3H)，2.15-2.35(2H)，2.5-2.68(2H)，4.33(1H)，5.21(1H)，5.48(1H)
MS(EI)：m/z 261，205，188，116，100，57
b)N-甲基-L-蛋氨酸
在0℃下将45ml的三氟乙酸和40ml的三乙基硅烷(0.25mol)滴加至19.4g叔丁基-(S)-4-[2-(甲基sulfanyl)乙基]]-5-氧代噁唑烷酮-3-羧酸酯(0.074mol)在65ml二氯甲烷中的溶液内。再搅拌1小时，同时用冷却冰，然后在20℃下再1小时。反应溶液真空蒸发至干。残留物用100ml的二氯甲烷溶解3次，并重新蒸发至干。残留物溶解在100ml的水中，并用50ml的MTBE萃取3次。含水相真空蒸发至干。残留物重新用50ml的乙醇溶解3次，并重新蒸发至干。残留物与150ml的MTBE混合，然后在20℃下搅拌2小时。过滤，并用50ml的MTBE重新洗涤。干燥后，得到9.6g(0.059mol，理论值的80％)的无色固体。
实测值：C 44.15  H 8.03  N 8.58  S 19.64
计算值：C 44.01  H 7.83  N 8.72  S 19.80
IR：3440，3010，2920，2830，2420，1735，1675，1580，1205，1140，800，720
NMR(DMSO)：2.01-2.08(5H)，2.5-2.65(5H)，3.74-3.78(1H)
MS(FAB)：m/z 164
CD(水)：200nm，Δε 1.64
c)N-甲基-S-三苯甲基-L-高半胱氨酸
引入7.5g(0.046mol)的N-甲基-L-蛋氨酸，并在MeOH/干冰冷却下冷凝200ml的氨。在-35℃，于1小时的时间内分批添加5.2g(0.23mol)的钠，然后再搅拌2小时。分批添加9.7g(0.18mol)的氯化铵，撤除冷却，用氮气排出氨过夜。添加14.0g(0.054mol)的三苯基甲醇。在用冰冷却下，添加50ml的二氯甲烷和90ml的三氟乙酸。在室温下再搅拌1小时，然后蒸发至干。残留物悬浮在200ml水中，并用氢氧化钠溶液使pH为13。再搅拌1小时后，抽滤，并将固体悬浮在500ml的水中。添加柠檬酸，由此将pH调节为4。添加600ml的MTBE，并搅拌30分钟。抽滤，并分别用100ml的MTBE洗涤2次。残留物与100ml的二氯甲烷混合，添加20ml的乙醇，然后滴加500ml的MTBE。再搅拌1小时，抽滤并用MTBE洗涤。干燥后，得到12.6g(0.032mol，理论值的70％)的无色固体。
计算值：C 73.62  H 6.44  N 3.58  S 8.19
实测值：C 73.40  H 6.30  N 3.71  S 8.02
IR：3440，3055，2850，2400，1615，1485，1445，1395，740，700
NMR(CDCl3)：1.28-1.62(2H)，2.12(3H)，2.25-2.45(2H)，2.84-2.92(1H)，7.12-7.41(15H)
MS(EI)：m/z 243，165
d)N-(9H-芴-9-基甲基氧基羰基)-N-甲基-S-三苯甲基-L-高半胱氨酸
将16.6g(0.042mol)的N-甲基-S-三苯甲基-L-高半胱氨酸悬浮在90ml的水和100ml的THF中，然后添加12.58g(0.12mol)的碳酸钠。在10℃下，滴加14.88g(0.044mol)芴基甲基琥珀酰亚胺基碳酸酯在50mlTHF中的溶液，然后再搅拌3小时。接着与80ml的水和130ml的乙酸乙酯混合，搅拌10分钟，然后用柠檬酸使pH为4。有机相分别用100ml的水洗涤2次，并用100ml的食盐溶液洗涤1次。含水相随后用100ml的乙酸乙酯重新萃取。在旋转蒸发器中蒸发浓缩合并的有机相，与260ml的乙酸乙酯混合，然后在旋转蒸发器中蒸发浓缩得到29.2g的泡沫，其用二氯甲烷/丙酮6∶4进行色谱纯制。得到22.4g(0.036mol，理论值的86％)的产物。
计算值：C 76.32  H 5.75  N 2.28  S 5.22
实测值：C 76.11  H 5.52  N 2.40  S 5.38
IR：3430，3060，2950，1740，1710，1175，740，700
NMR(CDCl3)：1.46-2.35(4H)，2.66-2.73(3H)，4.13-4.6(4H)，7.13-7.79(23H)
MS(FAB)：m/z 614，636
实施例2
如上所述，使用N-(叔氧基羰基)-D-蛋氨酸替代N-(叔氧基羰基)-L-蛋氨酸，可类似地得到实施例1d之标题化合物中的对映体化合物。
a)叔丁基-(R)-4-[2-(甲基sulfanyl)乙基)]-5-氧代噁唑烷酮-3-羧酸酯
计算值：C 50.56  H 7.33  N 5.36  S 12.27
实测值：C 50.30  H 7.51  N 5.50  S 12.41
IR：2980，2920，1800，1715，1390，1175，1050
NMR(CDCl3)：1.5(9H)，2.08(3H)，2.15-2.35(2H)，2.5-2.68(2H)，4.33(1H)，5.21(1H)，5.48(1H)
MS(EI)：m/z 261，205，188，116，100，57
b)N-甲基-D-蛋氨酸
计算值：C 44.15  H 8.03  N 8.58  S 19.64
实测值：C 43.98  H 7.81  N 8.70  S 19.82
IR：3430，3010，2920，2830，2420，1630，1580，1395
NMR(D2O)：2.13(3H)，2.12-2.22(2H)，2.55-2.68(2H)，2.74(3H)，3.68-3.73(1H)
MS(EI)：m/z 163，145，118，88，70，61
CD(水)：200nm，Δε 1.87
c)N-甲基-S-三苯甲基-D-高半胱氨酸
计算值：C 73.62  H 6.44  N 3.58  S 8.19
实测值：C 73.45  H 6.25  N 3.78  S 8.15
IR：3440，3055，2850，2400，1615，1485，1445，1395，740，700
NMR(CDCl3)：1.28-1.62(2H)，2.12(3H)，2.25-2.45(2H)，2.84-2.92(1H)，7.12-7.41(15H)
MS(EI)：m/z 243，165
d)N-(9H-芴-9-基甲基氧基羰基)-N-甲基-S-三苯甲基-D-高半胱氨酸
计算值：C 76.32  H 5.75  N 2.28  S 5.22
实测值：C 76.15  H 5.58  N 2.41  S 5.30
IR：3440，3055，2950，2600，1740，1705，1445，1170，740，700
NMR(CDCl3)：1.45-2.35(4H)，2.65-2.73(3H)，4.14-4.62(4H)，7.13-7.81(23H)
MS(FAB)：m/z 636，614
实施例3
N-苄基氧基羰基-N-甲基-S-三苯甲基-L-高半胱氨酸
将16.6g(0.042mol)的N-甲基-S-三苯甲基-L-高半胱氨酸(实施例1c的标题化合物)悬浮在90ml的水和100ml的THF中，然后添加12.58g(0.12mol)的碳酸钠。在10℃下，滴加10.97g(0.044mol)N-苄基氧基羰基氧基琥珀酰亚胺在50ml THF中的溶液，并在10℃下再搅拌3小时。接着与80ml的水和130ml的乙酸乙酯混合，在室温下搅拌10分钟，然后用柠檬酸使pH为4。有机相分别用100ml的水洗涤2次，并用100ml的食盐溶液洗涤1次。含水相随后用100ml的乙酸乙酯再萃取1次。合并的有机相真空蒸发至干；残留物在硅胶上进行色谱纯制(流动溶剂：二氯甲烷/丙酮6∶4)。得到22.08g(理论值的87％)固体无色泡沫状的产物。
元素分析：
计算值：C 73.12  H 5.94  N 2.66  S 6.10
实测值：C 72.87  H 6.08  N 2.60  S 5.98
实施例4
N-叔丁基氧基羰基-N-甲基-S-三苯甲基-L-高半胱氨酸
将16.6g(0.042mol)的N-甲基-S-三苯甲基-L-高半胱氨酸(实施例1c的标题化合物)悬浮在90ml的水和100ml的THF中，然后添加12.58g(0.12mol)的碳酸钠。在10℃下滴加9.60g(0.044mol)二叔丁基二碳酸酯在50ml THF中的溶液，并在10℃下搅拌3小时。接着与80ml的水和130ml的乙酸乙酯混合，在室温下搅拌10分钟，然后用柠檬酸使pH为4。合并的有机相分别用100ml的水洗涤2次，并用100ml的食盐溶液洗涤1次。含水相随后用100ml的乙酸乙酯再萃取1次。合并的有机相真空蒸发至干；残留物在硅胶上进行色谱纯制(流动溶剂：二氯甲烷/丙酮6∶4)。得到17.14g(理论值的83％)固体无色泡沫状的产物。
元素分析：
计算值：C 70.85  H 6.77  N 2.85  S 6.52
实测值：C 70.68  H 6.91  N 2.74  S 6.42
实施例5
a)N-甲基-S-(4，4′-二甲氧基-三苯甲基)-L-高半胱氨酸
引入7.5g(0.046mol)的N-甲基-L-蛋氨酸(实施例1b的标题化合物)，然后在MeOH/干冰冷却冷凝200ml的氨。在-35℃下于1小时的时间内分批添加5.2g(0.23mol)的钠，并继续搅拌2小时。分批添加9.7g(0.18mol)的氯化铵，撤除冷却，并用氮气排出氨过夜。添加17.3g(0.054mol)的二(4-甲氧基苯基)-苯基-甲醇(DMT)。在用冰冷却下添加50ml的二氯甲烷和90ml的三氟乙酸。在室温下搅拌1小时并蒸发至干。残留物悬浮在200ml的水中，并用氢氧化钠溶液使pH达到13。再搅拌1小时后抽滤，然后将固体悬浮在500ml的水中。添加柠檬酸，由此将pH设定为4。添加600ml的MTBE并搅拌30分钟。抽滤，并分别用100ml的MTBE洗涤2次。残留物与100ml的二氯甲烷混合，添加20ml的乙醇，然后滴加500ml的MTBE。再搅拌1小时，抽滤，并用MTBE洗涤。干燥后，得到13.92g(理论值的67％)的无色固体。
元素分析：
计算值：C 69.15  H 6.47  N 3.10  S 7.10
实测值：C 68.98  H 6.63  N 3.01  S 7.02
b)N-(9H-芴-9-基甲基氧基羰基)-N-甲基-S-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-L-高半胱氨酸
将18.97g(0.042mol)的N-甲基-S-4，4′-二甲氧基三苯甲基-L-高半胱氨酸(实施例5a的标题化合物)悬浮在90ml的水和100ml的THF中，然后添加12.58g(0.12mol)的碳酸钠。在10℃下添加14.88g(0.044mol)芴基甲基琥珀酰亚胺基碳酸酯在50ml THF中的溶液，并在10℃下再搅拌3小时。接着与80ml的水和130ml的乙酸乙酯混合，在室温下搅拌10分钟，然后用柠檬酸使pH为4。有机相分别用100ml的水洗涤2次，并用100ml的食盐溶液洗涤1次。含水相随后用100ml的乙酸乙酯再萃取1次。合并的有机相真空蒸发至干；残留物在硅胶上进行色谱纯制(流动溶剂：二氯甲烷/丙酮6∶4)。得到22.92g(理论值的81％)固体无色泡沫状的产物。
元素分析：
计算值：C 73.08  H 5.83  N 2.08  S 4.76
实测值：C 72.95  H 5.94  N 2.01  S 4.68
实施例6
Fmoc-(N-CH3)Hcy(Trt)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-ClTrt-固相
将如WO 01/44177(实施例1，步骤1-3)中所述制得的负载于固相上的肽Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-CITrt固相用5％哌啶在1∶1 NMP/DCM(75ml)中的溶液处理10分钟，然后与20％哌啶在NMP(75ml)中的溶液反应15分钟。用NMP(3×75ml×1分钟)和DCM(3×75ml×1分钟)顺序洗涤固相。在小的固相样品上进行的茚三酮分析表明反应结束，固相用NMP(75ml)洗涤。小部分的载体树脂用HFIPA处理，并通过HPLC进行分析(见Diatide的HPLC方法1)。没有检测到Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-OH在21.7分钟处的峰，但检测到H-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-OH在12.7分钟处的峰。在一个单独的容器中，将N-α-Fmoc-N-α-甲基-S-三苯甲基-高半胱氨酸(9.20g，15mmol)、HATU试剂(5.70g，15mmol)和HOAt(2.04g，15mmol)溶解在50ml的NMP中。将DIEA(6.96ml，40mmol)添加至经保护的N-甲基高半胱氨酸的溶液中。搅拌1分钟，然后将混合物添加至固相反应物中。反应物在轻的氩气流中摇晃4小时。分离溶液，固相顺序地用NMP(3×75ml×1分钟)和DCM(3×75ml×1分钟)洗涤。在小的固相样品上进行的茚三酮分析表明反应结束。小部分的载体树脂用HFIPA处理，并通过HPLC进行分析(见Diatide的HPLC方法1)。没有检测到H-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-OH在12.7分钟处的峰，但检测到Fmoc-(N-CH3)Hcy(Trt)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Lys-(Boc)-Thr(tBu)OH在26.7分钟处的峰。

Claims (10)

1、通式I化合物：
其中：
X1代表硫保护基，以及
X2代表氢原子或氮保护基。
2、如权利要求1所述的化合物，其中X1代表苄基、4-甲氧基苄基、二苯基甲基、二(4-甲氧基苯基)甲基、4，4′-二甲氧基三苯基甲基、三苯基甲基、甲氧基甲基、9H-芴-9-基甲基或叔丁基硫化物。
3、如权利要求1所述的化合物，其中X2代表9H-芴-9-基甲基氧基羰基、2，7-二溴-9H-芴-9-基甲基氧基羰基、叔丁基氧基羰基、苄基氧基羰基、三氟乙酰基、2，2，2-三氯乙基氧基羰基、2-三甲基甲硅烷基乙基氧基羰基或2-三甲基甲硅烷基乙基磺酰基。
4制备如权利要求1所述的通式I化合物的方法，其中在酸存在下用还原剂使式II的噁唑烷酮开环，
形成式III的N-甲基蛋氨酸，
然后通过本领域已知的方法引入硫保护基以及任选的氮保护基。
5、如权利要求4所述的方法，其中使用烷基硅烷作为还原剂。
6、如权利要求4所述的方法，其中使用三氟乙酸、五氟丙酸、三氟甲基磺酸或甲磺酸作为所述的酸。
7、如权利要求1所述的通式I化合物在形成包含N-甲基-高半胱氨酸的肽以及肽中间体中的应用。
8、如权利要求1所述的通式I化合物在制备Fmoc-(N-CH3)Hcy(Trt)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-OH中的应用。
9、如权利要求1所述的通式I化合物在制备环- Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-(N-CH3)Hcy 中的应用。
10、如权利要求1所述的通式I化合物在制备环- Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-(N-CH3)Hcy (CH2CO-β-Dap-Phe(4-NH2)-Cys-Thr-Ser)中的应用。
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