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CN1391613A - 制备共轭亚油酸的方法 - Google Patents

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CN1391613A
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M·维维斯勒卡
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Abstract

本发明涉及通过发酵由亚油酸制备共轭亚油酸，具体地说是其顺－9，反－11异构体的方法。本发明也涉及用该方法制备的产品。

Description

制备共轭亚油酸的方法
发明领域
本发明涉及制备共轭亚油酸的方法。具体地说，描述了一种通过发酵由亚油酸制备共轭亚油酸，具体地说是其顺-9，反-11异构体的方法。
发明背景
CLA是对各种共轭亚油酸异构体的统称，其中只有两种异构体(顺-9，反-11异构体，即bovinic acid，和反-10，顺-12异构体)被发现具有生物活性。合成生产的市售CLA制品通常含有所有各种CLA异构体且仅有40％的c9，t11异构体，而牛奶中含有80％的c9、t11-18：2异构体。
几项研究已经报道了在动物脂肪中含有一种脂肪酸，其抑制试验动物的癌症，影响生长因子并可以控制生物体中脂肪组织的量。Michael Pariza在研究汉堡包牛肉时发现其含有一种脂肪酸，通过化验确定为共轭亚油酸(CLA)。在动物检测中发现，与参照组相比，喂以含CLA饮食的动物组减少了乳腺癌、胃癌和结肠癌的发生数量(Pariza，M.W.，Loretz，L.J.，Storkson，J.M.和Holland，N.C.，油炸绞细牛肉中突变形成的突变物和调节物，癌症研究(副刊)，1983，43：2444-2446和Pariza，M.W.和Hargraves，W.A.，牛肉起源的突变形成突变物通过7，12二甲基苯并蒽抑制小鼠表皮肿瘤的起始，癌症发生学，1985，6：591-593)。而且在人细胞组织培养中，CLA也有抑制癌细胞发育的能力。虽然其作用机制仍然未知，但是已经发现CLA在肿瘤发生的各个阶段及对许多生长因子都有影响，并且也有可能对致癌物质在肝脏中的代谢有影响。这也表明CLA会扮演抗氧化剂的角色(Ip，C.，Chin，S.F.，Scimeca，J.A.和Pariza，M.W.，通过亚油酸共轭二烯酸衍生物预防乳腺癌，癌症研究，1991，51：6118-6124)，从而此化合物会保护细胞膜免受自由基的不利影响。对此化合物降低胆固醇的效果也有研究并发现其并不象降胆固醇药物那样减少高密度脂蛋白的量(Lee，K.N.，Kritchevsky，D.和Pariza，M.W.，兔子中的共轭亚油酸和动脉硬化症，动脉硬化，1994，108：19-25)。CLA也可能对减肥者有利，因为已经发现此化合物可以剥离脂肪组织(Park等，以共轭亚油酸饲养及撤除共轭亚油酸后，小鼠身体组成的改变，脂质，1999，34：243-248)。
反过来，已有报道说非共轭亚油酸有不利的影响，例如对乳癌的刺激作用。非共轭亚油酸的抗菌效用也是公认的。
CLA可以通过化学的方法或通过酶的异构化作用生产。天然的CLA，如在反刍动物的瘤胃中，可由多聚不饱和脂肪酸形成(通过溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)的生物活性产生)并因此分泌到奶和肉中，这是所发现的最好的CLA的来源。
已经发现从食物中获得的CLA量在过去的十年间已有明显的下降。通过饮食分析计算，在70年代每天平均的饮食含有大约0.45g的CLA。由于牛奶和奶产品使用的下降，现今平均每天的CLA摄入量为0.25g。从公众健康的角度来看，在食物中增加天然的CLA是非常重要的，因为，例如据研究，使CLA摄入加倍可以减少癌症的危险。
几项研究已经对牛奶，具体说是所有作为CLA来源食物的重要性进行了报道。例如，根据芬兰流行病学调查(Knekt等，口头陈述)，牛奶的使用减少了乳癌的危险。当前，奶脂中CLA的浓度季节性地随喂养质量的不同而有相当大的变化(2.4到28.1mg/g脂肪)。
已发现肠道内有益微生物可以形成CLA。具体说来，对瘤胃中的溶纤维丁酸弧菌及其异构酶已有研究。然而该菌极端厌氧，以致于不可能在工业规模上生产CLA，因为该菌株要求的完全厌氧的条件很难到达并且是不经济的(美国专利5,856,149，Pariza等)。
疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)被发现也可以产生CLA，但该致病菌也产生一种还原酶，从而将CLA进一步还原成其它的脂肪酸(Verhulst等，系统应用微生物，1987，9：12-15)。
一些丙酸菌也能够将亚油酸转化成其共轭的顺-9，反-11形式，这也是公知的。
而且，游离亚油酸到CLA的转化比甘油三酯形式的脂肪酸到CLA的转化更有效，这是公知的。然而，即使在相对低的浓度下，游离的亚油酸对丙酸菌的生长也有抑制作用，从而阻碍了共轭亚油酸，具体来说是其顺-9，反-11形式的大量生产。
美国专利5,856,149(Pariza和Yang)公开了一种用路式乳杆菌(Lactobacillus reuterii)的一个菌株(优选路式乳杆菌PYR8)通过非共轭不饱和(9和12位的双键)脂肪酸的转化产生顺-9，反-11脂肪酸的方法。该公开文本描述了产CLA菌株的分离并指出分离得到的45个菌株中只有4个具有所需的亚油酸异构酶活性，因此它们能够由亚油酸产生CLA。研究人员观察到，产生的CLA量与细胞数量成正比，并推测此亚油酸异构酶是在细胞生长中无功能意义的累积酶。该公开文本没有叙述亚油酸在细菌生长中的抑制作用，因此接下来也就没有提出任何方法来解决这个问题。
在“通过奶制品发酵剂培养物生产共轭亚油酸(应用微生物杂志，1998年85期95-102页)”的文章中，J.Jiang、L.Bjorck和R.Fonden提出丙酸细菌可以将亚油酸转化成CLA。Jiang等人在观察到成熟干酪比其它乳制品含有更高水平的CLA这一现象之后，研究了19种不同的发酵剂细菌将加到生长培养基上的亚油酸转化成CLA的能力。他们研究了7个乳杆菌菌株、4个乳球菌菌株、2个链球菌菌株和6个丙酸细菌在MRS、牛奶和乳酸钠培养基中由亚油酸产生CLA的能力。另外，通过在去污剂Tween 80的水溶液向MRS液体培养基中添加亚油酸的方法对不同浓度的亚油酸进行了研究。所研究的细菌中只观察到几个丙酸细菌具有生物转化活性，6个菌株中的3个，即费氏丙酸杆菌费氏亚种PFF(Propionibacteriumfreudenreichii ssp.freudenreichii PFF)和PFF6及费氏丙酸杆菌谢氏亚种PFS(P.freudenreichii ssp.shermanii PFS)表现出活性。用菌株PFF6由原始浓度为750μg/ml的亚油酸获得了最高的CLA产量，265μg/ml。产生的CLA中有70％-90％是有生物活性的c9，t11异构体。没有发现乳杆菌、乳球菌或链球菌可以产生CLA。
因此，用Jiang等人描述的技术，最好的丙酸细菌，PFF6菌株，仅能够将加入的亚油酸中的35％转化成为CLA。这些研究人员观察到丙酸细菌的CLA生产与它们对游离亚油酸的耐受性正向相关。因此，该研究也证实了这样一个公认的事实：亚油酸具有抗菌作用，其抑制细菌的生长。此公开文本指出：该抗菌脂肪酸的作用可由使用表面活性剂，例如去污剂，如Tween80，或蛋白质而消弱。然而，沿这些线路的研究并未被进行，并且此公开文本也没对可能的、有用的技术进行描述。
J.Jiang，L.Bjorck和R.Fonden的国际公开99/29886，部分基于上述文章提出的研究结果。该申请涉及利用在食品应用上有用的特定细菌，在体外生产CLA。除费氏丙酸杆菌费氏亚种和费氏丙酸杆菌谢氏亚种以外，适合的细菌还包括短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)。按此公开文本所述，发酵可以在有乳化剂，如Tween 80和卵磷脂存在的条件下进行。然而，在该公开文本的实施例中并没有描述乳化剂的使用，而且所报道的最好的结果与上面的公开文本一样：使用菌株PFF6由原始浓度为750μg/ml的亚油酸得到246.4μg/ml生物活性的c9、t11异构体。因此其产率小于33％。
因此，提供一种新的、具有更高产率的生产共轭亚油酸的方法仍是十分必要的。在要求尽可能多的使用游离的亚油酸作为CLA起始物的时候，所要解决的最基本问题就是怎样最小化或避免游离亚油酸的抗菌作用。
发明简述
本发明的目的是提供一种新的、具有高产率的生产共轭亚油酸的方法。
本发明的目的也是提供新的产品，其通过利用本发明的方法进行生产并且含有大量的CLA。
发明详述
本发明基于这样一种想法，即游离亚油酸对细菌生长的抑制作用通过向培养基中添加某种形式的亚油酸而减弱，该种形式的亚油酸不明显抑制细菌的生长，但在这些细菌的培养过程中是可用的。
依本发明，已经发现，当亚油酸作为胶束混合物加到反应液体培养基中时，其对细菌生长的抑制作用明显低于任何其它形式的亚油酸。通过添加适当大小的去污剂，可使亚油酸在培养条件下保持胶束状态。这也部分地减弱了亚油酸对细菌生长的抑制作用。胶束状亚油酸的使用及胶束在培养过程中的稳定性也使明显提高CLA的产量成为可能。
通过使用胶束化的亚油酸作为发酵的起始材料及通过选择适当的亚油酸与去污剂的比例，有可能使亚油酸到CLA的转化达到90％以上且形成的CLA的97％以上将分泌到培养基中。因此依本发明所述，发展了一种将大量亚油酸制备成某种形式的方法，其使细菌能够有效地将亚油酸转化成CLA，具体说是c9，t11异构体，而不受亚油酸对生长的抑制作用。
因此本发明涉及一种用微生物从亚油酸制备CLA的方法，该方法的特征为作为起始物使用的亚油酸以胶束的形式加到反应液体培养基中。
此胶束含有适当比例的游离的亚油酸和表面活性剂。
本发明也涉及由本发明方法生产的产品和其就此应用或在功能食品和保健品生产中的应用。
胶束化作用可以简单方法进行，即将亚油酸和一种成胶去污剂以适当比例在碱性条件下混合。这种制备方法既不需要特定的条件也不需要特殊的设备。其简单、廉价并且也易于大规模操作。
游离亚油酸被用来进行依本发明所述的胶束化作用。游离亚油酸可以买到。也可以从植物油(如红花油、玉米油或葵花油)中通过已知的方法(参考如Christie，W.W.，气相色谱与脂质-实用指南，第二版，1989，The Oily Press，Ayr，苏格兰)水解脂肪酸(不进行皂化)制备游离亚油酸。
考虑到纯的游离亚油酸是十分昂贵的这一点，该方法通常为一种经济的替代方法。由于化学残留物的影响，合成制备的亚油酸在食品使用上并不总是适合的。
红花油是优选的亚油酸来源。其亚油酸的含量高达78％，并且由此得到的游离亚油酸制品比买的游离亚油酸要便宜上百倍。
从本发明的角度来看，表面化学剂的选择不是一个关键的参数，例如在微生物领域广泛使用的聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(polyoxyethylenesorbitane esters，Tween制品)(几个生产商，例如Fluka和Sigma)和PEG 20失水山梨糖醇油酸酯Kotilen-0/1 VL(by Dr.W.Kolb AG)都适用于此目的。几种其它的表面活性剂也是适用的。
以上述方法制备的胶束化亚油酸到CLA的转化可通过发酵有效进行。发酵时，可以使用任何能够将亚油酸转化成CLA的细菌，例如出现在上述背景领域中的细菌。然而，发酵优选以食品级的细菌进行，尤其是丙酸菌。适合的菌株包括，例如，费氏丙酸杆菌种的菌株，尤其是属于费氏丙酸杆菌费氏亚种和费氏丙酸杆菌谢氏亚种的菌株。
通过向培养基中添加一定量的表面活性剂，即去污剂，消除培养基的影响，稳定胶束亚油酸。
上述物质，例如Tween和Kotilen，可被用作表面活性剂。优选的表面活性剂浓度根据添加的胶状亚油酸的量和所使培养基的不同而变。通常使用的去污剂为0.5％到1.5％，优选1％。因此，胶束化的亚油酸被加到发酵液体培养基中作为生产CLA的起始物。
本发明的新技术可以向发酵液体培养基中添加高达至少1,000μg/ml培养基的亚油酸，而不使细菌的生长发生明显的改变或转化效率的下降。因此，用这种技术进行的生物转化比用已知技术的生物转化要好很多，即至少80％的亚油酸转化成CLA，并且至少75％的此种CLA是最有生物活性的异构体。
发酵以已知方法进行。选择培养基和发酵条件以满足所用菌株的需要，从而提供最佳的CLA产量。在本发明公开以后，对于本领域技术人员而言，适当发酵参数的选择就是很明显的事了。
因此，使用胶束化的亚油酸就有可能通过消除亚油酸的生长抑制影响生产与细菌生长关联的CLA了。CLA也可以与为其它目的而进行的细胞生产同时产生。该方法的一个特殊特征为CLA可在细胞培养后产生或单独使用休眠(即非生长)细胞产生，其中CLA既可以在营养培养基中产生也可以在缓冲液中产生。不需要在缓冲液中单独添加去污剂以稳定亚油酸去污剂胶束。如果需要，也可以利用所用细菌在生产过程中直接在所生产的(食品)产品中产生CLA。
发酵中形成并分泌到胞外的CLA可通过先有技术进行分离，并且如果需要的话，可通过已知方法得到高纯度的CLA产品。或者，含CLA和细菌细胞的发酵液可就此使用，或者可对此CLA和细菌细胞进行浓缩或干燥。
获得的含CLA的产品可就此作为保健品使用。此产品也可在功能食品和类似产品的生产中使用。
在本文件中，术语食品泛指所有可食用的产品，其可以是固状、胶状或液状，并且既包括即食产品也包括将本发明产品加到与消耗相关的产品中作为该产品的添加剂或组成成份的产品。例如食品可以是乳品工业、肉类加工业、食品加工业、饮料工业、面包业和糖果业的产品。典型的产品包括乳制品，如酸奶酪、凝乳、凝乳酪、酸奶、酪乳和其它发酵的乳饮料，未成熟干酪和成熟干酪，填馅等。饮料，如乳清饮料、水果饮料和啤酒为另一个重要的组。
首选的实施方案有冻干制品，如含CLA的胶囊和丙酸细菌粉末，及由于丙酸细菌活力而增加了其CLA含量的发酵奶制品。
下面，我们将通过实施例对本发明进行更详细的描述。这些实施例仅为例证本发明，并不对其范围进行任何的限制。
参考实施例1
胶束化作用对细菌生长和CLA生成的影响
为证明本发明方法的效果，我们进行了对比试验，研究了在含游离亚油酸、游离亚油酸和去污剂、及实施例1的胶束化亚油酸和去污剂的培养基上，丙酸细菌的生长和丙酸细菌CLA的生成。以没有添加物的相同培养基(生长阳性对照)和仅加有去污剂的培养基作为对照。
为进行检测，首选在MRS液体培养基上对丙酸菌菌株费氏丙酸杆菌谢氏亚种JS(PJS)，DSM 7067和费氏丙酸杆菌费氏亚种131(P131)进行培养。在MRS液体培养基中添加
1)没有添加物
2)600μg/ml的亚油酸
3)从含5mg/ml亚油酸的贮存液中添加600μg/ml的亚油酸及添加1％在水溶液中的Tween 80制剂(Tween终含量为0.2％)
4)  添加0.9％的Kotilen和600μg/ml实施例1的胶束化亚油酸
5)仅添加0.9％的Kotilen(无亚油酸)
菌株PJS也在含5％乳清透过物(whey permeate)(valio Oy)、2％酪素水解物(Valio Oy)和1％酵母抽提物(LabM)的乳清基础培养基进行培养，其中按上述1到5进行添加。
每个菌株在培养基中30℃、72小时培养两次，然后新鲜培养液1％接种每个检测液体培养基。待测培养液用Klett仪测定培养液的细胞密度，30℃监测4天。培养期末(96h)，形成的CLA量用气相色谱进行测定，包括检测c9，t11异构体单独的量及其与其它异构体一起的量。
脂肪酸分析按M.Suutari，K.Liukkonen和S.Laakso在文章“酵母的温度适应性：脂肪酸的作用”(微生物遗传学杂志1990，136：1469-1474)中的方法进行，稍有修改。对培养基取样以进行分析，细胞以离心进行分离(5,000g，15分钟)。上清以0.2μm滤器进行过滤，取样0.2到0.5ml。细胞团用自来水洗涤。上清样和洗涤过的细胞被冻干。
冻干样品中加入1ml皂化剂：溶于49％甲醇的3.7M的NaOH。样品以氮气处理，混匀并在密闭管中于100℃水浴温浴30分钟，期间混匀一次。样品冷至室温，然后加入4ml甲基化试剂：溶于48％甲醇中的3.3M的HCL溶液。样品以氮气处理，混匀，样品管在80℃水浴温浴10分钟，然后对其进行冷却。向样品中添加1.5ml正己烷/甲基叔丁醚溶液(1∶1)，充分振荡10分钟以抽提脂肪酸的甲酯。下层水相以巴斯德移液器移出。向样品中加入3ml 0.3M NaOH溶液并充分振荡5分钟以洗涤有机相。对样品进行离心(5,000g，20分钟)并用巴斯德移液器回收有机层。样品以硫酸钠干燥并以氮气处理。
脂肪酸的甲酯用连有火焰电离检测器(FID)和自动取样仪(HewlettPackard 7673A)的气相色谱(Hewlett Packard 5890 series 11，宾州，美国)进行分析。在此分析中使用了一个毛细管柱(HP-FFAP，25m×0.2m×0.3μm)。样品以分流注射(分流比1∶20；隔膜洗率1到2ml/min)进样。柱子的入口压为150kPa，载气(氦气)在柱中的流速约为1ml/min。补气(空气)的流速为30ml/min，进入检测器的氢气的流速为40ml/min。进样温度和检测器温度为250℃。烘箱温度为70到200℃。温度以每分钟25摄氏度的速度上升。结果以与气相色谱相连的惠普化学工作站软件(HPChemstation software)处理并输出。
样品中的脂肪酸通过与已知标准脂肪酸的滞留时间进行比较得以鉴定。一种Sigma的制剂被用来鉴定共轭亚油酸，此制剂为CLA的正，反-9，11和-10，12异构体混合物。为对脂肪酸进行量化，使用C19∶0脂肪酸甲酯(十九烷酸甲酯，Sigma)作为内标。
细菌的生长结果列于表1.1。
表1.1
PJS和P131菌株在含亚油酸(LA)的MRS培养基中的生长
  PJS     0h     24h     48h     72h   96h
  1)对照2)LA3)LA+去污剂4)LA(胶束)+去污剂5)去污剂     27840111     3884493635     1809668125185     32510694252340   415110120370430
  P131
  1)对照2)LA3)LA+去污剂4)LA(胶束)+去污剂5)去污剂     8805510     3790602022     122977471104     27010795160244   425115114270410
从结果来看，与对照相比，本身浓度为600μg/ml的亚油酸或由含1％Tween水溶液的贮液添加的亚油酸对两个菌株的生长都有抑制作用。按照本发明，使用相应量的胶束化亚油酸减弱了亚油酸对生长的抑制作用，其菌株几乎与对照以相同的方式生长。
PJS和P131菌株在MRS基础液体培养基中形成的CLA的量列于表1.2，PJS菌株在乳清基础培养基中的相应结果列于表1.3。
表1.2
PJS和P131菌株在含亚油酸(LA)的MRS培养基中形成的CLA
PJS   总CLAμg/ml培养物   CLA(c9，t11)μg/ml培养物   CLA产率％  c9，t11异构体占总CLA的比例(％)
 1)对照2)LA3)LA+0.2％去污剂4)LA(胶束)+0.9％去污剂5)0.9％去污剂     39195279680247     913522749064     -3247100-     2469817326
 P131
 1)对照2)LA3)LA+0.2％去污剂4)LH(胶束)+0.9％去污剂5)0.9％去污剂     416678308232     11162613463     -111351-     2625344427
表1.3
PJS菌株在含亚油酸(LA)的乳清透过培养基中形成的CLA
PJS 总CLAμg/ml培养物  CLA(c9，t11)μg/ml培养物  CLA产率％ c9，t11异构体占总CLA的比例(％)
 1)对照2)LA3)LA+0.2％去污剂4)LA(胶束)+0.9％去污剂     161353440     --13420     --273     --2596
从结果来看，按本发明进行的胶束化作用几乎可以使100％的亚油酸转化成CLA，其中75％以上为优选的c9，t11 CLA异构体。如果亚油酸就此加入的话，则仅有32％被转化成CLA；如果加入1％去污剂溶液中的亚油酸的话，则仅有47％被转化成CLA。因此，考虑到最小化亚油酸对细菌生长的抑制作用和最大化由亚油酸产生的CLA，按照本发明进行的胶束化作用取得了相当好的结果。
实施例1
亚油酸胶束的制备
为制备胶束贮液，在试管中称量300mg亚油酸(顺-9，反12-十八碳二烯酸，L-1376，Sigma)，加入10ml含0.36ml失水山梨糖醇油酸酯去污剂(Kotilen 0/1或Tween 80)的无氧蒸馏水并温和振荡。在混合物中逐滴加入2N氢氧化钠溶液以使混合物刚好澄清(约0.5到0.6ml)。将溶液转入50ml容量瓶，并以无氧蒸馏水补齐至刻度，然后就得到了含6mg/ml亚油酸的胶束贮液。将溶液分成恰当的几份，以氮气将空气排出并冷冻保存。
胶束贮液也可以做的比上述的更浓或更稀。其中很重要的一点是，游离亚油酸的量和失水山梨糖醇油酸酯的量要保持与上述一样的比例。
实施例2
亚油酸和去污剂对细菌生长和CLA产生的影响
通过在150ml乳清基础生长培养基和MRS液体培养基(LabM)中培养丙酸细菌，检测亚油酸对去污剂之比的影响。乳清基础培养基含有2％的乳清透过物(Valio Oy)，0.5％的胰蛋白胨(LabM)和1％的酵母抽提物(LabM)。以上述胶束形式的贮液向培养基中添加亚油酸，使游离亚油酸在培养基中的终浓度为600μg/ml。单独向培养基中加入需要量的失水山梨糖醇油酸酯(Kotilen 0/1或Tween 80)。将培养基的pH调至6.3。将在乳清基础培养基培养的丙酸菌菌株费氏丙酸杆菌谢氏亚种JS以2％(v/v)接种量接种，30℃培养。以Klett-Summerson比色计(filtre No.66)测量培养基的浊度，以此监测细胞生长(96小时)。CLA和亚油酸以气相色谱进行检测。
结果列于表2。此处及在实施例3到4的CLA结果中所指的CLA生产是指由PJS微生物细胞形成的CLA，其由从总CLA浓度中减去培养基中源于去污剂的CLA量算出。CLA的产率计算如下：形成CLA的克数/最初LA的克数。
表2
乳清透过培养基和MRS液体培养基X)中去污剂的浓度对PJS生长和CLA生产的影响
添加到乳清透过培养液中的去污剂   ΔKlett值 CLA产率(％)
LA(对照)     34     ＜1
0.9％Kotilen(对照)     365     ＜1
LA+0.2％Kotilen     77     33
LA+0.9％Kotilen     306     65
LA+1.2％Kotilen     309     67
添加到MRS培养液中的去污剂
LA+0.1％Tween 80     56     51
LA+0.8％Tween 80     301     83
X)MRS液体培养基含有0.1％的Tween 80，随后由于0.1％添加使终浓度升至约0.2％。
亚油酸可以胶束的形式大量添加至PJS菌株的生长培养基中而不会完全抑制细胞的生长。由表2可以看出，进一步添加去污剂可以减少亚油酸的抑制作用。当培养基中的亚油酸对去污剂的比例适当时，亚油酸在培养基中的量可以上升，从而使与细胞生长相关的亚油酸到CLA的转化同低浓度亚油酸时一样有效。因此可以达到所需的工业意义量的CLA顺-9，反-11异构体。在此试验中，与浓度为600μg/ml亚油酸相当的最适去污剂含量为0.9％到1％，但更大量也可以使用。
实施例3
在调节pH的发酵中CLA的生产
在工业水平上培养丙酸菌最有效的方法是在发酵罐中培养，其中培养基的pH值可以保持在最适细胞生长的水平。通过在溶液体积为2升的发酵罐培养液中培养PJS细胞，进行了共轭亚油酸生产过程的检测。生长培养基用实施例2中的乳清透过培养基。此生长培养基分别含有400、600、1000或1400μg/ml的胶束化亚油酸和0.6％、0.9％或1.5％的Kotilen去污剂。在培养过程中，通过自动添加铵溶液使亚油酸浓度为400、600和1000μg/ml的生长培养基的pH保持在6.3，亚油酸浓度为1400μg/ml的生长培养基的pH保持在6.5。培养温度为30℃，搅拌速度为100rpm。在乳酸钠缓冲液琼脂中测定活的丙酸菌细胞浓度，将琼脂平板在30℃厌氧培养5到7天。
图1显示了在加有400μg/ml亚油酸和0.6％失水山梨糖醇油酸酯的培养基中由亚油酸形成CLA的过程。很明显，亚油酸到CLA的转化与PJS细胞的生长同时发生。
表3比较了发酵罐中CLA的生产过程，培养基中亚油酸含量为400、600和1000μg/ml的培养94小时，1400μg/ml的培养108和132小时。
表3
在调节pH的PJS细胞培养中CLA的生产
  LA400μg/ml0.6％去污剂94h   LA600μg/ml0.9％去污剂94h   LA1000μg/ml1.5％去污剂94h   LA1400μg/ml1.5％去污剂108h   LA1400μg/ml1.5％去污剂132h
  细胞浓度(cfu/ml)   1.3×1010   1.2×1010    1.4×1010     2.4×109     1.3×1010
  CLA浓度(μg/ml)   515   886    1270     1490     1650
  CLA产率(％)   84   77    63     79     91
  胞外CLA比例(％)   98   99    98     99     99
  顺-9，反-11比例(％)   75   83    73     95     94
  顺-9，反-11比例(％)*    -     -     -     81     82
  亚油酸消耗(％)    93     94     92     90     92
*也含有源于Kotilen的CLA。
实施例4
细胞生长后期CLA的生产
通过重复实施例3的发酵实验，检测了丙酸菌在细胞生长后期产生CLA的能力，其区别在于胶束溶液中的亚油酸和失水山梨糖醇油酸酯去污剂仅在PJS细胞的快速生长末期，即培养开始51小时后，加入到液体培养基中。培养基中亚油酸浓度为600μg/ml，去污剂浓度为0.9％。添加时的细胞浓度为1.8×1010cfu/ml。此后，细胞停止生长3小时，然后缓慢地继续生长。
细胞产生的亚油酸到CLA的转化非常迅速：3小时内CLA产率为45％，6小时内为58％。与在开始时就在生长培养基中有亚油酸和去污剂的相应培养(约100小时)相比，此方法的一个优点是总的发酵周期较短(约60小时)。
实施例5
在缓冲液中非生长细菌细胞对CLA生产的用途
在乳清基础生长培养基中培养PJS细胞，30℃培养3天，离心细胞并以0.1 M磷酸钠缓冲液(pH 6.0)洗涤。在50ml 0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.8)中加入2.0g湿细胞团，细胞浓度约为3×1010cfu/ml。加入实施例1的胶束化亚油酸使缓冲液中亚油酸的浓度为600μg/ml。此溶液在6℃或30℃温浴21小时。以GC法和用分光光度计在波长235nm处进行测定的方法对CLA进行分析。
结果列于表4。所研究的每个温度下都有通过非生长PJS细胞在缓冲液中形成CLA，在30℃最有效。在营养液中的CLA生产需要添加去污剂，以保持亚油酸处在胶束状态。去污剂的优选浓度根据此溶液的起始物浓度的不同而不同。反过来，在此缓冲液中无需向反应培养液中单独加入去污剂，这甚至是有害的。
表4
CLA产率(形成CLA的克数/有非生长PJS细胞的磷酸缓冲液(pH 7.8)中LA的克数)
    CLA产率(％)
反应时间(h)     6℃     30℃
    3521     3520     202963
实施例6
红花油中CLA的生产
a)红花油的皂化
在温和条件下用抗氧化剂通过皂化作用可从红花油中释放出脂肪酸，从而防止了亚油酸的氧化。使用氢氧化钾或钠、乙醇、水和抗坏血酸进行皂化，例如以下述比例：红花油10g，KOH饱和水溶液5ml，乙醇50ml，水10ml(此量也可以更低)和抗坏血酸1g。此混合物以氮气处理并盖紧盖子。此混合物通过磁力搅拌皂化过夜。未皂化的部分用如30ml正己烷从溶液中抽提出来。为防止乳化作用，也可以在混合物中加入水。然后溶液用浓盐酸酸化(pH 2到3)。从溶液中抽提出饱和脂肪酸，例如以40ml正己烷抽提两次。在旋转蒸发器中将正己烷蒸发，将脂肪转移至有紧密螺纹盖的瓶子里并用氮气处理几分钟。然后此脂肪混合物就制备好了，在冰箱中保存以防氧化。
b)胶束的形成
按照本发明，脂肪酸胶束由从红花油制备得到的游离脂肪酸混合物通过Kotilen、水和氢氧化钠(例如按以下比例：红花油制品700mg、水30ml、Kotilen 0.75ml、2N氢氧化钠溶液1.5ml)制备得到。在混合之前，可将Kotilen和水加热至约40℃。用氮气处理过的水与Kotilen混合。将红花油制品加入此混合物，充分混匀。最后，逐滴加入氢氧化钠溶液至溶液澄清。
c)CLA的产生
用细菌从脂肪溶液中可以产生CLA，例如用以下的方法：在例如含有2％乳清透过物、0.5％酪素水解物、0.5％酵母抽提物和0.9％ Kotilen的生长培养基中加入含有亚油酸和2％接种量的费氏丙酸杆菌谢氏亚种JS培养物(其已生长3天)。此细菌在30℃产生的CLA量(％)列于表5。
表5
CLA产率与加入亚油酸量的比例关系
时间(天)  初始亚油酸μg/ml    CLA(顺-9，反-11)产率％
    3                         600                                        954                         1500                                       86
实施例7
含干CLA的组合物的制备
在含2％乳清透过物(Valio Oy)、0.5％酪素水解物(Valio Oy)、0.5％酵母抽提物(Lab M)和0.2g按实施例1胶束化的亚油酸的乳清培养基中培养费氏丙酸杆菌谢氏亚种JS。1％新鲜细菌培养物接种此培养基，在培养期间，用pH自动调节仪将pH保持在6.5，温度保持在30℃。培养4天后，用旋转蒸发器将细胞培养物和培养基一起蒸发至原体积的1/4，并将获得的浓缩物在Heto干燥器中冻干。粉末产率为23到25g/1000ml。获得的粉末含8.056mg/g(193mg/24g粉末)CLA，即原始亚油酸的96％已被转化成CLA。总CLA中，79％是最具活性的异构体。结果列于表6。表6由PJS在生长培养基中产生的CLA
    PJS
    CLA总量mg/粉末gc9，t11-异构体，mg/g亚油酸，mg/g     8.0566.3730.609

Claims (18)

1.通过微生物方法从亚油酸制备共轭亚油酸的方法，其特征在于亚油酸以胶束的形式加到反应液体培养基中。
2.权利要求1所述方法，其特征在于该胶束也含有表面活性剂。
3.权利要求1或2所述方法，其特征在于此胶束通过游离亚油酸与表面活性剂在碱性条件下反应所形成。
4.权利要求1到3中任何一项所述的方法，其特征在于该胶束含有亚油酸和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯的混合物。
5.权利要求1到4中任何一项所述的方法，其特征在于主要制备共轭亚油酸顺-9，反-11异构体。
6.权利要求1到5中任何一项所述的方法，其特征在于用丙酸细菌进行转化。
7.权利要求6所述方法，其特征在于该丙酸细菌菌株属于费氏丙酸杆菌种，并优选其亚种费氏丙酸杆菌费氏亚种或费氏丙酸杆菌谢氏亚种。
8.权利要求7所述方法，其特征在于该丙酸细菌为费氏丙酸杆菌费氏亚种131或费氏丙酸杆菌谢氏亚种JS。
9.权利要求1到8中任何一项所述的方法，其特征在于该共轭亚油酸的制备与细菌生长同时进行。
10.权利要求1到9中任何一项所述的方法，其特征在于此转化在有表面活性剂存在的条件下进行。
11.权利要求10所述方法，其特征在于该表面活性剂为聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯，其使用浓度为0.5％到1.5％。
12.权利要求1到8中任何一项所述的方法，其特征在于该共轭亚油酸的制备在细菌培养之后进行。
13.权利要求12所述方法，其特征在于此转化用从没有添加表面活性剂的生长培养基中分离出的细胞进行。
14.权利要求1到13中任何一项所述的方法，其特征在于该共轭亚油酸的制备与食品制备相连。
15.权利要求1到13中任何一项所述的方法，其特征在于该共轭亚油酸从此反应培养液中分离出来并可能被干燥。
16.权利要求1到13中任何一项所述的方法，其特征在于该共轭亚油酸和细菌细胞被浓缩并可能被干燥。
17.权利要求16所述方法，其特征在于该亚油酸和细菌细胞被回收、浓缩和冻干。
18.通过权利要求1到17中任何一项所述方法制备的产品。
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