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CN1230993A - 制备血小板生成素多肽的表达载体、细胞和方法 - Google Patents

制备血小板生成素多肽的表达载体、细胞和方法 Download PDF

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CN1230993A
CN1230993A CN97197984A CN97197984A CN1230993A CN 1230993 A CN1230993 A CN 1230993A CN 97197984 A CN97197984 A CN 97197984A CN 97197984 A CN97197984 A CN 97197984A CN 1230993 A CN1230993 A CN 1230993A
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CN
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CN97197984A
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M·伊拉尼
G·R·莫里森－尼尔森
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Zymogenetics Inc
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Zymogenetics Inc
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Abstract

本发明公开了血小板生成素多肽及生产此多肽的载体、细胞和方法。这些多肽的特征在于包含C－X－B的氨基酸主链,其中C是人血小板生成素细胞因子结构域多肽;X是肽键或含1或2个氨基酸残基的接头,限制条件是X单独或与C或B结合时不提供双碱性氨基酸对;而B是包含SEQ ID NO:3的残基1至y的多肽,其中y是从5至18的整数,并且至B中至多35%的氨基酸残基可分别被其它氨基酸残基替代。这些多肽在刺激体内和体外造血细胞增殖或发育的方法中有用。

Description

制备血小板生成素多肽的表达载体、细胞和方法
发明背景
血细胞生成是骨髓中多能干细胞发育和分化成血细胞的过程。此过程涉及多肽生长因子(细胞因子)复杂的相互作用，其中多肽生长因子通过靶细胞上的膜结合受体起作用。细胞因子作用对通常种系特异和/或阶段特异的特殊细胞因子产生应答，导致细胞增殖和分化。来自干细胞的单细胞类型如血小板的发育需要以适当顺序起作用的细胞因子的复杂协调作用。
已知的细胞因子包括白细胞介素，如IL-1,IL-2,IL-3,IL-6,IL-8等；及集落刺激因子，如G-CSF,M-CSF,GM-CSF，红细胞生成素(EPO)等。通常，白细胞介素作为免疫和炎症反应的介质。集落刺激因子刺激骨髓源细胞增殖，激活成熟的白细胞，并形成宿主对炎症、感染和免疫攻击应答的不可缺少的部分。
各种细胞因子已开发为治疗试剂。例如，刺激红细胞发育的红细胞生成素已用于治疗肾衰竭引起的贫血症。几种集落刺激因子已用于与癌症化疗结合加速恢复病人免疫系统。白细胞介素-2,α-白细胞介素和C-白细胞介素用于某些癌症的治疗。刺激巨核细胞生成和血小板生成的活性物质已在血小板生成的动物体液中得到鉴定并在文献中称为“血小板生成素”(近期由Mcdonald，实验血液学16:201-205,1988和McDonald，美国儿童血液肿瘤学杂志14:8-21,1992综述)。纯化和鉴定此活性物质的工作导致与细胞Mpl受体结合并刺激巨核细胞生成和血小板生成的蛋白的克隆。见de Sauvage等，自然369:533-538,1994；Lok等，自然369:565-568,1994；Kaushansky等，自然369:568-571,1994；Wendling等，自然369:571-574,1994；Bartley等，细胞77:1117-1124,1994；和WIPO公开WO 95/21920。此Mpl受体结合细胞因子称作血小板生成素。
氨基酸序列分析表明成熟的人TPO是从SEQ ID NO:2的氨基酸残基1(Ser)延伸至氨基酸残基332(Gly)。TPO容易受蛋白水解并已以异源或降解形式得到分离(de Sauvage等，自然369:533-538,1994；Bartley等，细胞77:1117-1124,1994)。已发现25kD的小分子类型在体外有活性(Bartley等，ibid)，并有报道重组的153个氨基酸(deSauvage等，ibid)和174个氨基酸(Bartley等，ibid)的人TPO多肽在体外有活性，编码353个氨基酸(Bartley等，ibid)初始翻译产物的全长人cDNA的表达产物也在体外有活性。
本领域需要大量高效生产血小板生成素的方法；也需要在真核微生物如酵母中生产血小板生成素的方法；进一步需要有效生产低分子量形式的血小板生成素的方法，低分子量形式的血小板生成素与全长分子相比更不易受蛋白水解。本发明满足这些要求并具有其它相关的优势。
发明概述
一方面，本发明提供能在真核宿主细胞中复制的表达载体。载体包括以下可操作连接的元件：(a)转录启动子；(b)编码分泌前导肽的第1段DNA片段；(c)编码含C-X-B的血小板生成素(TPO)多肽的第2段DNA片段，其中C是人血小板生成素细胞因子结构域多肽；X是肽键或含1或2个氨基酸残基的接头，限制条件是X单独或与C或B结合时不提供双碱性氨基酸对；而B是包含SEQ ID NO:3的残基1至y的多肽，其中y是从5至18的整数并且B中至多35％的氨基酸残基可分别被其它氨基酸残基替代；及(d)转录终止子。在发明的一个实施方案中，表达载体可在酵母中复制。在另一个实施方案中，分泌前导肽是酿酒酵母的α因子分泌前导肽。在另一个实施方案中，B不包括Arg-Arg二肽。在其它实施方案中，B的第4位残基是Thr或Asp；y至少是10并且B的第10个残基是Arg或Glu；以及y至少是14并且B的第14个残基是Val或Ala。在另一个实施方案中，y至少是14,B的第4个残基是Thr或Asp,B的第10个残基是Arg或Glu，并且B的第14个残基是Val或ala。在其它实施方案中，X是肽键或单个氨基酸残基。
发明的另一方面提供了包含如上公开的表达载体的培养真核细胞，其中细胞合成并分泌TPO多肽。在优选实施方案中细胞是酵母细胞。
发明的第三方面，提供以含C-X-B氨基酸主链为特征的血小板生成素多肽，其中C是人血小板生成素细胞因子结构域多肽；x是肽键或含1或2个氨基酸残基的接头，限制条件是x单独或与C或B结合时不提供双碱性氨基酸对；而B是包含SEQ ID NO:3的残基1至y的多肽，其中y是从5至18的整数，并且其中B中至多35％的残基可分别被其它氨基酸残基替代。
发明的第四方面，提供生产TPO多肽的方法，包括培养用如上公开的表达载体转染或转化的真核宿主细胞，载体中已连接的第1段和第2段DNA片段由宿主细胞表达以合成TPO多肽，以及回收TPO多肽。
发明的第五方面，公开了一种增加哺乳动物中血小板数的方法，包括给哺乳动物施用与药学上可接受的载体结合的如上公开的TPO多肽。
在参考以下详细描述后，将会明白本发明的这些或其它方面。发明详述
在详细描述本发明前，先定义此处所用的某些术语：
术语“等位变异”在此用来指通过突变产生的基因变换形式，或由突变基因编码的变化的多肽。基因突变可以是缄默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码有变化的氨基酸序列的多肽。
“表达载体”是包含编码目的多肽的片段的线状或环状DNA分子，其中编码片段与用于转录的其它片段可操作地连接。这样的片段包括启动子和终止子序列。表达载体也可以包含1个或多个复制起点，1个或多个选择标记，增强子，多腺苷酸化信号等。表达载体通常源自质粒或病毒DNA，或者可能包含上述两者的元件。术语“可操作地连接”是指为了预期目的将片段排列使之协调作用，例如转录从启动子处开始并经过编码片段到终止子。表达载体可以在宿主生物中独立复制或通过整合入宿主基因组复制。
术语“特征在于”是用来指特征或元件的限制条件。例如，多肽特征在于，已给序列的氨基酸主链包含所列举的氨基酸序列但也包含其它的氨基酸残基。而且此多肽还可以包含糖链或其它翻译后修饰。
“分泌前导肽”是指导和帮助蛋白经过宿主细胞分泌途径传递的多肽。分泌前导肽有时也称为前序列。分泌前导肽特征是疏水氨基酸核心并通常(但不是唯一地)在新合成蛋白的氨基末端。分泌前导肽经常在分泌期间的1次或多次切割事件中从成熟蛋白上切除。这些分泌前导肽包含加工位点，使分泌前导肽经过分泌途径时可以从成熟蛋白上切除。
“启动子”是RNA聚合酶结合和mRNA合成起始位置的基因部分。
“血小板生成素”(或“TPO”)是蛋白质，其特征在于，能特异结合相同种系的Mpl受体并刺激体内血小板生成。在正常试验动物中，在开始每日用药后的10日内，TPO能提高血小板水平100％或更多。全长TPO包含氨基末端细胞因子结构域和羧基末端(“C-末端”)结构域。参考SEQ ID NO:2，细胞因子结构域位于第7个和第151个半胱氨基酸残基间。
术语“血小板生成素多肽”包括含全长血小板生成素分子和其生物活性部分，生物活性部分是表现完整分子定性生物活性(受体结合和体内刺激血小板生成)的血小板生成素的片段。
SEQ ID NO:1表示编码全长人血小板生成素的代表性cDNA。本领域技术人员将认识到SEQ ID NO:1的DNA和其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)代表人TPO基因的单个等位基因并预期存在等位变异。SEQ ID NO:1的等位变异可以通过从由不同个体制备的细胞，组织或核酸中克隆并对所得克隆进行测序得到。
如此处所用，术语“血小板生成素细胞因子结构域多肽”是指这种核心多肽(残基7-151或SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:2的等位变异的相应区域)，可以进一步包括短的N-末端(如SEQ ID NO:2的残基1-6)和/或C-末端(例如，SEQ ID NO:2的残基152)延伸，这种延伸不破坏分子必需的生物活性。在这些延伸中允许相当多的序列变异。人TPO的C末端结构域是从SEQ ID NO:2的残基155(Ala)延伸至残基332(Gly)。此结构域包含潜在的O-和N-连接的糖基化位点。可以完全或部分删除此结构域而不完全丧失生物活性。这两个结构域由Arg-Arg二肽(SEQ ID NO:2的残基153至154)分开。虽然推测此二肽是TPO成熟期间切割的加工位点(例如de Sauvage等，ibid)，但是本发明受让人开展的研究表明在此位点不发生明显的切割。
如此处所用，词组“血小板生成素C-末端结构域的一部分”包括TPOC-末端结构域的1个氨基酸到包括完整TPO C-末端结构域的氨基酸。通常，C-末端结构域的一部分是天然存在的TPO C-末端结构域的连续片段，含有相应完整TPO C-末端结构域的第1个氨基酸残基为其第1个(氨基末端)氨基酸残基(例如，对应于SEQ ID NO:2的残基155的氨基酸残基)。本发明所用的C-末端结构域的部分优选长度为5至18个氨基酸残基，更优选地长度为至少9个残基，最优选地长度为14至18个残基。
本发明提供制备血小板生成素多肽的改良方法，以及方法中有用的表达载体和细胞。本发明部分基于以下发现：TPO多肽中某些氨基酸变化引起真核宿主细胞的分泌增加。在本发明中，通过缺失或替代天然分子中使细胞因子结构域与C末端结构域分开的Arg-Arg二肽来提高TPO多肽的分泌。虽然如文献中所推测的，TPO多肽没有在这个Arg-Arg二肽处切割(如，de Sauvage等，ibid)，但是发现此二肽抑制分泌。所以本发明提供TPO多肽，其特征在于消除细胞因子结构域紧接的C末端的双碱性氨基酸对。因此这些TPO多肽特征在于C-X-B结构，其中C是人血小板生成素细胞因子结构域多肽，X是肽键或含1或2个氨基酸残基的接头，而B来自血小板生成素C-末端结构域的一部分，限制条件是X单独或与C或B一起不形成一对碱性氨基酸残基。
因此在本发明的蛋白中，不存在野生型血小板生成素的细胞因子和C-末端结构域的连接处存在的双碱性序列(例如SEQ ID NO:2的残基153和154)。优选地，在分子的其它位置也不存在这种双碱性序列，尤其在B中。
本发明的TPO多肽最常见地包含天然存在的人TPO细胞因子结构域氨基酸序列，并且此序列通过肽键与哺乳动物(优选地人)血小板生成素的C-末端结构域的一部分相连。在本发明的优选实施方案中，B包含起始于C-末端结构域的氨基末端残基的C-末端结构域的5至18个连续残基，其中B中多达35％的氨基酸残基可以分别被其它氨基酸残基替代。TPO细胞因子结构域也可包含1到约15个，优选地不超过10个，更优选地不超过7个的氨基酸替代。氨基酸替代发生在非关键氨基酸残基处，即那些残基替代不严重影响分子生物活性的残基。鉴定非关键氨基酸残基的方法在本领域内已知，并且包括丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244:1081-1085，1989；Bass等，美国国家科学院院报88:4498-4502,1991)，其中在分子的每个残基处导入单个丙氨酸突变，并测定所得突变分子的生物活性。如Reidhaar-Olson和Sauer(科学241:53-57,1988)或Bowie和Sauer(美国国家科学院院报86:2152-2156,1989)所公开的，可以评估多个氨基酸替代对蛋白活性的影响。简要地，这些作者公开了以下方法：在多肽中同时随机试验2个或多个位点并筛选有功能的多肽，然后对诱变的多肽进行序列测定以确定每个位点处可允许的替代范围。其它可以使用的方法包括噬菌体显示(例如，Lowman等，生物化学30:10832-10837,1991；Ladner等，美国专利号5,223,409；Huse,WIPO公开WO 92/06204)和区域指导的诱变(Derbyshire等，基因46:145,1986；Ner等，DNA 7:127,1988)。除了测试诱变多肽的生物活性外，还可将编码多肽的表达载体转化入培养细胞以检测突变对多肽分泌的影响。
可以对B中相对于天然存在的TPO序列的氨基酸替代进行设计以保留或增强这部分分子对分泌的有益影响。优选的替代包括用不带电荷的残基替代带电荷的残基。其它优选的替代包括用丙氨酸替代缬氨酸(SEQ IDNO:2的第168个残基)，用谷氨酸替代精氨酸(SEQ ID NO:2的第164个残基)，以及用天冬氨酸替代苏氨酸(SEQ ID NO:2的第158个残基)。这些替代可以单独或以任意结合形式形成。优选与相应天然存在的序列相比替代不超过25％的B中残基。SEQ ID NO:4至SEQ IDNO:7表示典型的C末端结构域序列。
不受理论所限，Thr-Thr二肽可以提供O连接糖链的附着位点。因此在本发明的一个实施方案中，B包含一个Thr-Thr二肽。在特别优选的实施方案中，B的N末端5个氨基酸残基是Ala-Pro-Pro-Thr-Thr(SEQ ID NO:8)。
通过增加N连接糖类附加位点(Asn-X-Ser/Thr)可以进一步提高分泌水平。然而，这样的序列的存在可能在某些宿主细胞(如酿酒酵母)中导致不需要的高糖基化。
本领域技术人员将认识到某些氨基酸的替代可能是宿主细胞特异性的。所以应优选在用于合成多肽的宿主细胞类型中检测这种替代的影响。
本发明的在真核宿主细胞中可以复制的表达载体包含转录启动子和转录终止子，它们与如上所述的编码分泌肽的第一段DNA片段及编码TPO多肽的第二段DNA片段可操作地连接。因而第二段DNA片段编码含C-X-B的TPO多肽，其中C,X和B是如上所定义的。在发明的优选实施方案中，B是含SEQ ID NO:3的残基1至y的多肽，其中y是从5至18的整数并且其中B中至多35％，优选不超过25％的所述残基可分别被其它氨基酸残基替代。
“编码含C-X-B的TPO多肽的DNA片段”是指包含重复元件的新生多肽的阅读方向是从氨基末端至羧基末端。于是术语“编码”用来指DNA片段转录和翻译的直接产物。本领域技术人员应当理解这种多肽可经过翻译后加工，其中可向其添加附加组分如糖链。这种翻译后修饰的精确性质可由合成多肽的宿主细胞类型部分决定。
如WIPO公开WO 95/21920所公开的，可以克隆小鼠和人TPODNAs，在此全文引用此公开文件作为参考。将含小鼠TPO DNA序列的质粒pZGmpl-1081按照Budapest条约条款于1994年2月14日保存在美国典型培养物保藏中心，12301 Parklaw Drive,Rockville,MD并得到保藏号69566。含人TPO cDNA的质粒pZGmpl-124已作为大肠杆菌DH10b转化子于1994年5月4日保存在美国典型培养物保藏中心，保藏号为69615。这些小鼠和人cDNAs可用作探针以分离其它编码TPO的DNAs，包括基因组DNAs，等位变异和来自其它种的DNAs。
用于本发明的合适宿主细胞包括任何可以经操作表达异源DNA、可培养生长并具有分泌途径的真核细胞类型。
为了指导TPO多肽进入宿主细胞的分泌途径，将编码分泌前导肽的DNA序列与编码TPO多肽的DNA序列结合使用。分泌前导肽可以是TPO的前导肽或其它分泌蛋白如组织型血纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA)或酿酒酵母接合外激素α-因子的前导肽。当使用异源分泌前导肽与TPO多肽结合时，相应DNA片段分别连接在正确的阅读框架中，使连接的片段编码融合蛋白。典型地在分泌前导肽和TPO多肽的连接处加入蛋白水解切割位点以便在分泌期间将分泌前导肽从TPO多肽上切除。然而，本领域技术人员会认识到可以回收融合蛋白并随后进行加工以释放出TPO多肽。
酵母细胞，尤其是酵母属的细胞是本发明优选的宿主。酵母细胞长期用于人类消费产品的生产并且培养费相对不高。已公开了用外源DNA转化酵母细胞并从中生产重组蛋白的方法，见例如，Kawasaki，美国专利号4,599,311；Kawasaki等，美国专利号4,931,373；Brake，美国专利号4,870,008；Welch等，美国专利号5,037,743；和Murray等，美国专利号4,845,075，在此引用作为参考。转化的细胞通过由选择标记确定的表现型来筛选，选择标记通常是抗药性或在缺少特定营养(如亮氨酸)时的生存能力。用于酵母的优选载体系统是如Kauasaki等(美国专利号4,931,373)公开的POTI载体系统，该载体系统通过在含葡萄糖培养基上的生长情况来筛选转化细胞。用于酵母的适当启动子和终止子包括来自糖酵解酶基因的启动子和终止子(见，如Kawasaki，美国专利号4,599,311；Kingsman等，美国专利号4,615,974；和Bitter，美国专利号4,977,092，在此引用作为参考)和乙醇脱氢酶基因的启动子和终止子。另见美国专利号4,990,446；5,063,154；5,139,936和4,661,454，在此引用作为参考。在本领域中已知用于其它酵母的转化系统，其它酵母包括多形汉逊酵母，粟酒裂殖酵母，乳酸克鲁维酵母，脆壁克鲁维酵母，玉蜀黍黑粉菌，巴斯德毕赤酵母，季也蒙毕赤酵母和麦芽糖假丝酵母。见例如Gleeson等，微生物遗传学杂志132:3459-3465,1986；Cregg，美国专利号4,882,279；和Stroman等，美国专利号4,879,231。
应优选使用选来高水平分泌TPO多肽的宿主菌株。通过常规方法如紫外线照射或使用如甲基磺酸乙酯或亚硝基胍的化学诱变对基因型适于发酵和蛋白合成的亲本株进行诱变。用常规检测方法如滤膜菌落法检测来筛选存活细胞的蛋白分泌水平。在滤膜菌落分析法中用硝酸纤维素滤膜覆盖细胞，随后在蛋白质印迹分析中用抗体对菌落进行探测。也可以使用其它检测如活性检测。
其它真菌细胞也适于作宿主细胞。例如，根据Mcknight等，美国专利号4,935,349的方法可以利用曲霉属细胞，在此引用作为参考。Sumino等，美国专利号5,162,228中公开了转化Acremoniumchrysogenum的方法，在此引用作为参考。Lambowitz，美国专利号4,486,533中公开了转化脉孢菌属细胞的方法，在此引用作为参考。
将外源DNA导入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等，细胞14:725,1978；Corsaro和Pearson，体细胞遗传学7:603,1981:Graham和Van der Eb，病毒学52:456,1973)，电穿孔(Neumann等，EMBO J.1:841-845,1982),DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等编辑，现代分子生物学操作方法，JohnWiley和Sons公司，NY,1987)以及阳离子脂类介导的转染(Hawley-Nelson等，焦点15:73-79,1993)，在此引用作为参考。已公开了在培养哺乳动物细胞中合成重组蛋白，见例如Levinson等，美国专利号4,713,339；Hagen等，美国专利号4,784,950；Palmiter等，美国专利号4,579,821；Mulvihill等，美国专利号5,486,471；Foster等，美国专利号5,358,932；和Mulvihill等，美国专利号5,385,831，在此引用作为参考。优选的培养哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC NO.CRL 1650),COS-7(ATCC No.CRL 1651),BHK(ATCCNo.CRL 1632),BHK570(ATCC No.CRL 10314),293(ATCC No.CRL1573；Graham等，病毒遗传学杂志36:59-72,1977)和中国仓鼠卵细胞系(例如CHO-KI；ATCC No.CCL61)。其它适当细胞系在本领域内已知并可从公共保藏单位如美国典型培养物保藏中心，Rockville,Maryland得到。通常，优选强转录启动子，例如来自SV-40或巨细胞病毒的启动子。见例如美国专利号4,956,288。其它适当启动子包括来自金属硫蛋白基因的启动子(美国专利号4,579,821和4,601,978，在此引用作为参考)和腺病毒主要晚期启动子。
通常用药物选择来筛选已插入外源DNA的培养哺乳动物细胞。这些细胞通常称作“转染子”。已在选择试剂存在的情况下培养并能将目的基因传给后代的细胞称作“稳定的转染子”。优选的选择标记是编码对抗生素新霉素有抗性的基因。在新霉素型药物如G-418等存在时进行筛选。选择系统也可用于提高目的基因表达水平，这一过程称作“扩增”。扩增通过在低水平选择试剂存在的情况下培养转染子，然后增加选择试剂量来筛选高水平合成导入基因产物的细胞来进行。优选的扩增选择标记是赋予氨甲蝶蛉抗性的二氢叶酸还原酶。也可使用其它药物抗性基因(例如，潮霉素抗性，多种药物抗性，嘌呤霉素乙酰转移酶)。
也可使用其他高等真核细胞作为宿主，包括昆虫细胞，植物细胞和鸟类细胞。Guarino等，美国专利号5,162,222；Bang等，美国专利号4,775,624；和WIPO公开WO 94/06463中公开了昆虫细胞的转化及其中外源蛋白的合成，在此引用作为参考。在Sinkar等，生物科学杂志(Bangalore)11:47-58,1987中对使用毛根土壤杆菌作为载体在植物细胞中表达基因进行了论述。
根据常规方法在含营养物和其它所选宿主细胞生长所需成分的培养基中培养转化或转染的宿主细胞。包括限定培养基和复合培养基的各种适当培养基在本领域内已知并通常包含碳源，氮源，必需氨基酸，维生素和矿物质。如果需要，培养基也包含诸如生长因子或血浆的成分。生长培养基将通过药物选择或缺少必需营养物来筛选含外源导入DNA的细胞，其中必需营养物通过表达载体带有的或共转染入宿主细胞的选择标记补充。
用本领域熟知的方法如根据蛋白质的大小、电荷、可溶性和其它特征的亲合纯化和分离来选择性回收根据本发明制备的TPO多肽。当多肽在培养的哺乳动物细胞中合成时，应优选在无血清培养基中培养细胞以限制污染蛋白的数量。收集并分级分离培养基。优选的分级分离方法包括亲和层析，比如在固相Mpl受体蛋白或其配体结合部分上的亲和层析或通过使用亲和标志(例如多聚组氨酸、P物质或其它抗体或其它特异结合剂多肽或蛋白)的亲和层析。可以在目的蛋白和亲和标志之间提供特异切割位点。也可以使用其它层析方法如阳离子交换层析、阴离子交换层析和疏水相互作用层析。
根据本发明制备的TPO多肽可以在需要增强骨髓中细胞增殖的治疗方面使用，如治疗诸如由再生障碍性贫血、骨髓再生障碍综合征、化疗或先天性血细胞减少引起的血细胞减少症时使用。TPO多肽也对提高血小板生成如治疗血小板减少症时有用。血小板减少与不同疾病和临床情况有关，这些情况可能单独或协同作用产生疾病。血小板数的减少可由例如血小板合成缺损、血小板分布异常、由于大量输血造成的稀释性丢失或血小板异常破坏引起。例如，癌症治疗中所用的化疗药物可能抑制骨髓中血小板前期细胞的发育，并且导致的血小板减少限制了化疗并使得需要输血。此外，某些恶性肿瘤会损害血小板合成和血小板分布。用于杀死恶性肿瘤细胞的辐射治疗也杀死血小板前期细胞。由药物、新生儿异源免疫或血小板输血异源免疫诱导的各种血小板自身免疫紊乱也可引起血小板减少。TPO多肽可以减少或消除输血需求，从而减少血小板自身免疫的发生。血小板的异常破坏可能源自：(1)在血管移植或受伤组织中，血小板消耗增加；或(2)与例如药物诱导的血小板减少、自发性血小板减少性紫癜(ITP)、自身免疫疾病、血液紊乱如白血病和淋巴瘤或涉及骨髓的转移性癌症相关的免疫机理。TPO的其它适应症包括再生障碍性贫血和由例如化疗或用AZT治疗HIV感染引起的药物诱导的骨髓抑制。
血小板减少表现为出血量增加如鼻口区或胃肠道粘膜出血，以及伤口、溃疡或注射部位的渗液。
对于药物用途，根据常规方法配制TPO多肽以通过非肠道的，尤其静脉或皮下途径传递。静脉施用将通过大量注射或输注在1至几个小时期间进行。通常，药物配方包含与药学上可接受的载体如盐水，缓冲盐水，5％葡萄糖水溶液等结合的TPO多肽。配方可进一步包括1种或多种赋形剂，防腐剂，助溶剂，缓冲剂，白蛋白以防止小瓶表面蛋白丢失等。此外，TPO多肽可与其它细胞因子，尤其早期作用细胞因子如干细胞因子、IL-3、IL-6、IL-11或GM-CSF结合。当使用这种结合治疗时，细胞因子可以在单个配方中结合或以分开的配方施用。配制方法在本领域内众所周知并在例如Remington药物科学，Gennaro编辑，Mack出版公司，Easton PA,1990中公开，在此引用作为参考。TPO的治疗剂量通常为每日每千克病人体重0.1微克至100微克，优选地每日0.5-50微克。精确剂量由临床医师根据可接受的标准、考虑受治疗疾病的性质和严重性及病人特征等决定。在某些情况下，如当受治疗的病人表现敏感性增高或需要延长治疗时，可将剂量范围指定为每日0.1-20微克/千克体重。剂量的确定在本领域普通技术人员水平之内。TPO多肽通常在化疗或骨髓移植后长达28天的时期内施用或直至血小板计数达到大于20,000/立方毫米，优选地大于50,000/立方毫米。更普遍地，施用TPO多肽1周左右，通常1至3天。通常，TPO多肽的治疗有效量是足以引起临床上明显增加淋巴或骨髓前期细胞增殖和/或分化的量，这将表现为成熟细胞(例如血小板或中性白细胞)循环水平的增加。因此血小板失调的治疗将持续到血小板计数达到至少20,000/立方毫米，优选地50,000/立方毫米。TPO多肽也可与其它细胞因子如IL-3,IL-6和IL-11；干细胞因子；红细胞生成素；G-CSF和GM-CSF结合施用。在结合治疗方案中，其它细胞因子的每日剂量通常是：EPO,≤150U/千克体重；GM-CSF,5-15微克/千克体重；IL-3,1-5微克/千克体重；及G-CSF,1-25微克/千克体重。例如与EPO结合治疗适用于EPO水平低的贫血症病人。
TPO多肽也是体外研究造血细胞分化和发育的有用工具，如用于阐明细胞分化机理和确定成熟细胞种系，并发现也可用作细胞培养中的增生剂。
TPO多肽也可在活体外如在自体骨髓培养中使用。简要地说，在化疗前从病人体中取出骨髓并用TPO多肽，选择性地结合1种或多种细胞因子处理。然后在化疗后将经处理的骨髓放回病人体内以便加速骨髓的恢复。此外，TPO多肽也可用于骨髓或外周血原始(PBPC)细胞的离体扩增。在化疗前，用干细胞因子(SCF)或G-CSF刺激骨髓将早期前期细胞释放入外周循环。可从外周血中收集和浓缩这些前期细胞，然后用1种或多种TPO多肽，选择性地结合1种或多种细胞因子，包括但不限于SCF,G-CSF,IL-3,GM-CSF,IL-6或IL-11在培养中处理，使之分化并增殖成高密度巨核细胞培养物，然后可在高剂量化疗后放回病人体内。
由以下非限制性实施例进一步阐述本发明。实施例实施例1
构建2个表达载体以比较SEQ ID NO:2的153-154位Arg-Arg二肽存在或缺失时酿酒酵母中截短人TPO多肽的表达。这2个载体来自质粒pDPOT(ATCC#68001；在美国专利号5,128,321中公开)。这两个载体包含含有酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI1)基因启动子(见美国专利号4,599,311，在此引入作为参考)，酿酒酵母MFα1前序列，TPO序列和酿酒酵母TPI1终止子的TPO表达盒。载体进一步包括粟酒裂殖酵母磷酸丙糖异构酶(POT)基因(允许在含葡萄糖的培养基中筛选)，用于大肠杆菌筛选的抗氨苄青霉素基因和Leu2-d选择标记。载体pD85编码从SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至残基172的野生型人TPO序列，其中用Ala替代残基168(Val)。载体pD79编码变异的TPO 1-172序列，其中删掉153和154位精氨酸残基密码子，并用丙氨酸密码子(参照SEQID NO:2的氨基酸位置)替代缬氨酸密码子(残基168)。
通过聚合酶链反应(PCR)修饰全长人TPO DNA以在5′末端加入MFα1前序列的5个密码子并在3′末端加入终止密码子。PCR使用引物ZC7623(SEQ ID NO:9)和ZC 7627(SEQ ID NO:10)进行。用Taq聚合酶和约20纳克模板DNA于94℃,1分钟；53℃,1分钟；72℃,1.5分钟进行25个循环来完成PCR。分离修饰的TPO序列为479bp HindⅢ-XbaⅠ片段并连接入已用相同酶切割的pUC18中。所得质粒命名为pHB76。
对pHB76中的TPO序列进行修饰以分别在编码细胞因子结构域的序列5′末端和3′末端导入BbeⅠ和SaIⅠ位点。PCR使用引物ZC7868(SEQ ID NO:11)和ZC7870(SEQ ID NO:12)进行。用Taq聚合酶和约20纳克模板DNA，先95℃,1分钟；68℃10分钟进行1个循环，接着95℃1分钟；68℃4分钟进行9个循环来完成PCR。回收TPO序列为482bp HindⅢ-EcoRⅠ片段并连接到用相同酶切割的pUC19中。所得质粒命名为pTPOGN2。
然后通过将来自pTPOGN2的457 bp HindⅢ-SalⅠ片段与从寡核苷酸ZC8488(SEQ ID NO:13)和ZC8489(SEQ IDNO:14)构建的合成片段以三部分连接方式和用HindⅢ+XbaⅠ消化的pUC19结合来构建变异的TPO序列。所得质粒命名为pTPOGN6。从pTPOGN6中分离编码α因子前肽最后几个残基和截短的TPO多肽的539bp HindⅢ-XbaⅠ片段。将此片段与pDPOT(经BamHⅠ切割和碱性磷酸酶处理)，包含TPI1启动子和MFα1前序列的1230bp BglⅡ-HindⅢ片段，和含TPI1终止子的680bp XbaⅠ-BamHⅠ片段以四部分连接方式连接。所得质粒命名为pD79。
通过将pDPOT(经BamHⅠ切割和碱性磷酸酶处理)，1230bp BglⅡ-HindⅢTPⅠ1-MFα1片段，编码α因子前肽的最后几个残基和截短的TPO多肽的540bp片段，和680bp XbaⅠ-BamHⅠTPⅠ1终止子片段以四部分连接方式连接来构建编码人TPO(SEQ ID NO:2)的残基1至172的对照质粒。所得质粒命名为pD85。
如Hinnen等(美国国家科学院院报75:1929-1933,1978)中公开的，必须将质粒pD79和pD85转化酿酒酵母菌株JG134(MATαΔtpil∷URA3 ura3-52leu2-Δ2pep4-Δ1[cir°])。根据它们在含葡萄糖为唯一的碳源的培养基上的生长能力来筛选转化子。
转化子在含1％酵母提取物，1％蛋白胨和5％葡萄糖的液体培养基中生长约60个小时。通过离心从培养基中分离细胞。培养基样品用TPO稀释缓冲液(补充了10％胎牛血清，2毫摩尔谷氨酰胺，1毫摩尔丙酮酸钠，50微克/毫升青霉素，50微克/毫升链霉素，100微克/毫升新霉素，0.00033％β-疏基乙醇，25毫摩尔Hepes的RPMI 1640)以1∶100稀释。
使用用编码人MPL受体的表达载体(Vigon等，美国国家科学院院报89:5640-5644,1992)转染的BaF3细胞作为靶细胞，在有丝分裂测定法中检测TPO生物活性。BaF3是来自鼠骨髓的白细胞介素-3依赖型前淋巴样细胞系(Palacios和Steinmetz，细胞41:727-734,1985；Mathey-Prevot等，分子细胞生物学6:4133-4135,1986)。在3H-胸腺嘧啶存在的情况下将细胞与受试样品一起于37℃放置16至19个小时。通过与人TPO的标准曲线比较，对掺入细胞DNA的3H-胸腺嘧啶进行定量。10U/毫升定义为在细胞分裂检测中得到最大刺激一半时的量。两个实验的结果见表1。
                    表1
      实验    质粒      TPO(单位/毫升培养基)
       1      pD85             40
              pD79             740
       2      pD85           界限以下
              pD79             160实施例2
构建一系列编码TPO多肽的质粒，其中TPO多肽包含通过肽键或Arg-Arg二肽与C-末端片段连接的人TPO细胞因子结构域(SEQ IDNO:2的残基22至152)。表2表示编码多肽的结构：Arg-Arg表示二肽存在(+)或缺失(-)；C末端片段的氨基酸序号参照SEQ ID NO:3。
                  表2
      质粒      Arg-Arg    C末端序列
      pD117       -          1-5
      pD119       -          1-9
      pD121       -          1-13
      pD123       -          1-18
      pD125       +          1-18
用经HindⅢ和XbaⅠ消化成线型的pUC19，包含编码部分α因子分泌前导肽和部分人TPO细胞因子结构域的序列的pTPOGN2的457bpHindⅢ-SalⅠ片段(实施例1)和从寡核苷酸ZC8486(SEQ ID NO:15)和ZC8487(SEQ ID NO:16)构建的SalⅠ-XbaⅠ接头以三部分连接方式构建质粒pTPOGN8。
用以下片段以四部分连接方式构建质粒pD83:BamHⅠ-消化的，碱性磷酸酶处理的pDPOT；包含酿酒酵母TPI1启动子和α因子分泌前导肽的pHB105-4的1230bp BglⅡ-HindⅢ片段[pHB1054包含与pMVR1质粒主链中人TPO细胞因子结构域编码序列连接的酿酒酵母TPI1启动子和α因子分泌前导肽(公开在美国专利号5,155,027中)]；pTPOGN8的540bp HindⅢ-XbaⅠ片段，此片段包含一部分α-因子分泌前导肽编码序列和TPO变体的编码序列，其中TPO变体的编码序列包含在其C-末端与SEQ ID NO:17的18个残基多肽连接的细胞因子结构域；以及680bp XbaⅠ-BamHⅠ酿酒酵母TPI1终止子片段。
首先通过用表3中所示的一对寡核苷酸将包含TPI1终止子和载体序列的pD83的BglⅡ-EcoRⅠ片段插入pUC19(用SalⅠ和EcoRⅠ切割)来构建表2中所示的质粒。如表3中所示，所得质粒命名为pTPOMI1,2,3,4和5。将包含TPI1启动子，MFα1分泌前导肽，5′TPO编码区和载体序列的2个BglⅠ-SalⅠpD83片段和包含载体序列的EcoRⅠ-BglⅠ片段与来自pTPOMI1-5(包含3′TPO编码序列，TPI1终止子和载体序列)的SalⅠ-EcoRⅠ片段连接以分别构建pD117,pD119,pD121,pD123和pD125。
                 表3
质粒                寡核苷酸
pTPOMI1          ZC10086(SEQ ID NO；18)
                 ZC10087(SEQ ID NO:19)
pTPOMI2          ZC10095(SEQ ID NO:20)
                 ZC10096(SEQ ID NO:21)
pTPOMI3          ZC10120(SEQ ID NO:22)
                 ZC10121(SEQ ID NO:23)
pTPOMI4          ZC10118(SEQ ID NO:24)
                 ZC10119(SEQ ID NO:25)
pTPOMI5          ZC10108(SEQ ID NO:26)
                 ZC10109(SEQ ID NO:27)
将质粒转化到酿酒酵母JG134或M35中。M35是通过紫外线诱变过夜培养物从pD79转化的JG134衍生的。将细胞1∶1000稀释，并将50微升稀释液涂在YEPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％D-葡萄糖，0.004％腺嘌呤，0.006％亮氨酸)上。在暗室中对平板紫外照射20秒，放在不透光的盒中，并于30℃培养2天。然后将每块平板在新鲜YEPD板上复制平板，用硝酸纤维素膜覆盖并于30℃培养过夜。然后移去硝酸纤维素膜并洗掉任何粘附的酵母细胞。使用1×PBS中的5％牛奶封闭及鼠抗人TPO抗体通过标准蛋白印迹技术使硝酸纤维素膜显色。初次筛选中显示了高水平分泌的菌落通过蛋白质印迹和活性检测法进一步检测。一个命名为GN35的突变体持续产生比亲本菌株高2-4倍的活性。通过用包含原核细胞卡那霉素抗性基因和酿酒酵母TPI1基因的2微米大小质粒转化pD79得到GN35。筛选对2毫克/毫升G418有抗性的转化子并在含G418的YEPD中培养，然后在YEPGGE(0.004％腺嘌呤，0.006％L-亮氨酸，1％酵母提取物，0.4％D-半乳糖，2％蛋白胨，3％甘油，1％乙醇)中培养。然后筛选不能在葡萄糖为碳源的培养基上生长的细胞，这表明pD79上的丙糖磷酸异构酶基因丢失。加工处理的细胞命名为M35株系。转化子在含2％蛋白胨，1％酵母提取物和5％葡萄糖的液体培养基中通风条件下生长70个小时。包含质粒pD79和pD85为对照组。此外，检测质粒pHB109(单独编码人TPO细胞因子结构域)和pBJ118(编码与pD85和pD125相同的多肽)。
如实施例1所公开的，收集和检测培养基。检测结果见表4。
                表4
      宿主     质粒    TPO(ng/ml)
      JG134    pD117     26
               pD119     51
               pD121     53
               pD123     35
               pD125     3
               pD79      70
               pD85      3
               pHB109  界限以下
               pBJ118    8
      M35      pD79      180实施例3
用常规分子生物学技术构建一系列编码TPO多肽的以pDPOT为基础的质粒。每个编码的TPO多肽包含经肽键与源自人TPO C-末端结构域的C-末端片段相连的人TPO细胞因子结构域。这些多肽的C-末端片段序列见下面表5。氨基酸用常规的单字母符号表示。
             表5
质粒             C末端结构域
pD91         APPDTAVPSRTSLVLTLN
                (SEQ ID NO:5)
pD93         APPDTAVPSETSLVLTLN
                (SEQ ID NO:6)
pD95         APPTTAVPSETSLVLTLN
                (SEQ ID NO:7)
将质粒转化到菌株JG134中，并如实施例2所公开的培养转化子。如实施例1所公开的，收获和检测培养基。
结果见表6
               表6
      质粒          TPO(单位/毫升)
      pDPOT                0
      pD79                700
      pD85                100
      pD91                200
      pD93                300
      pD95                600
从上述方面，应当理解，尽管为了说明的目的，在此描述了本发明的具体实施例，但是在不离开本发明的精神和范围的情况下可以有多种修改。因此，除附加的权利要求外，本发明不受其它限制。
            序列表(1)基本信息(ⅰ)申请人：ZymoGenetics,Inc.
        1201 Eastlake Avenue East
        Seattle,washington 98102
        United State of America(ⅱ)发明名称：制备血小板生成素多肽的载体、细胞和方法(ⅲ)序列数：27(ⅳ)联系地址
 (A)收信者：ZymoGenetics,Inc.
 (B)街道：1201 Eastlake Avenue East
 (C)城市：Seattle
 (D)州名：WA
 (E)国家：美国
 (F)邮政编号：98102(ⅴ)计算机可读形式
 (A)介质类型：软盘
 (B)计算机：IBM PC兼容机
 (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
 (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25(ⅵ)目前申请资料：
 (A)申请号：
 (B)递交日：
 (C)分类：(ⅶ)律师/代理人信息
 (A)名称：Parker.Gary E.
 (B)登记号：31,648
 (C)参考/著录号：95-34  (ⅶ)电信信息：
 (A)电话：206-442-6673
 (B)传真：206-442-6678(2)关于SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：1062个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅸ)特征：
 (A)名称/关键：mat-肽
 (B)位置：64..1062(ⅸ)特征：
 (A)名称/关键：sig-肽
 (B)位置：1..63(ⅸ)特征：
 (A)名称/关键：CDS
 (B)位置：1..1062(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA48Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala-21 -20                 -15                 -10AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC96Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val-5                   1               5                  10CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC144Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser
         15                  20                  25CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT192Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala
     30                  35                  40GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC GAG ATG GAG GAG ACC AAG240Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys
 45                  50                  55GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG288Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met60                  65              70                      75GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG336Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly
             80                  85                  90CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC384Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu
         95                 100                 105CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT432Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp
    110                 115                 120CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG480Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val
125                 130                 135CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC528Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala140                 145                 150                 155CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG576Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu
            160                 165                 170AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT624Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr
        175                 180                 185GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA672Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly
    190                 195                 200TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG720Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu
205                 210                 215GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA768Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly220                 225                 230                 235ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG816Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro
            240                 245                 250GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC864Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu
        255                 260                 265CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT912Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr
    270                 275                 280ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC960Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu
285                 290                 295CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC1008His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser300                 305                 310                 315CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA1056Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu
            320                 325                 330GGG TAA1062Gly(2)关于SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：353个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (D)拓扑结构：线型(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala-21 -20                 -15                 -10Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val-5                   1               5                  10Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser
         15                  20                  25Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala
     30                  35                  40Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys
 45                  50                  55Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met60                  65                  70                  75Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly
             80                  85                  90Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu
         95                 100                 105Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp
    110                 115                 120Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val
125                 130                 135Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala140                 145                 150                 155Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu
            160                 165                 170Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr
        175                 180                 185Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly
    190                 195                 200Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu
205                 210                 215Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly220                 225                 230                 235Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro
            240                 245                 250Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu
        255                 260                 265Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr
    270                 275                 280Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu
285                 290                 295His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser300                 305                 310                 315Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu
            320                 325                 330Gly(2)关于SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：178个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr1           5                       10                  15Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe
        20                  25                  20Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln
    35                  40                  45Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser
50                  55                  60Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn65                  70                  75                  80Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala
            85                  90                  95Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn
        100                 105                 110Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln
    115                 120                 125Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln
130                 135                 140Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr145                 150                 155                 160Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln
            165                 170                 175Glu Gly(2)关于SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：18个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Ala Leu Thr1               5                   10                  15Leu Asn(2)关于SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：18个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:Ala Pro Pro Asp Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr1               5                   10                  15Leu Asn(2)关于SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：18个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅱ)分子类型：肽  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:Ala Pro Pro Asp Thr Ala Val Pro Ser Glu Thr Ser Leu Val Leu Thr1               5                   10                  15Leu Asn(2)关于SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：18个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Glu Thr Ser Leu Val Leu Thr1           5                       10                  15Leu Asn(2)关于SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：5个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8Ala Pro Pro Thr Thr1               5(2)关于SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：49个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC7623(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:GCGCGCAAGC TTGGACAAGA GAAGCCCGGC TCCTCCTGCT TGTGACCTC49(2)关于SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：51个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC7627(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:GCGCGCAAGC TTCTAGACT ATCAGACGCA GAGGGTGGAC CCTCCTACAA G51(2)关于SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：40个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC7868(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:GTGTGTGAAT TCTAGACTAT CAGACGCAGA GGGTCGACCC40(2)关于SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：35个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC7870(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:GTGTGTAAGC TTGGACAAGA GAAGCCCGGC GCCTC35(2)关于SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：82个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC8488(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:TCGACCCTCT GCGTCGCCCC ACCAACCACT GCTGTTCCAT CCAGAACTTC TTTGGCTTTG60ACTTTGAACT GATAGAGATC TT82(2)关于SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：82个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC8489(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:  CTAGAAGATC TCTATCAGTT CAAAGTCAAA GCCAAAGAAG TTCTGGATGG AACAGCAGTG60GTTGGTGGGG CGACGCAGAG GG82(2)关于SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：85个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC8486(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15:TCGACCCTCT GCGTCGGAGC TCCACCAGAC GAAGCTGTTC CAGACAGAGA CGAATTGGTT60TTGGAATTGA ACTGATAGAG ATCTT85(2)关于SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：85个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC8487(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16:CTAGAAGATC TCTATCAGTT CAATTCCAAA ACCAATTCGT CTCTGTCTGG AACAGCTTCG60TCTGGTGGAG CTCCGACGCA GAGGG85(2)关于SEQ ID NO:17的信息  (ⅰ)序列特征
 (A)长度：18个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17:Ala Pro Pro Asp Glu Ala Val Pro Asp Arg Asp Glu Leu Val Leu Glu1               5                   10                  15Leu Asn(2)关于SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：37个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC10086(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18:TCGACCCTCT GCGTCGCCCC ACCAACCACT TGATAGA37(2)关于SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：37个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC10087(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19:GATCTCTATC AAGTGGTTGG TGGGGCGACG CAGAGGG37(2)关于SEQ ID NO:20的信息  (ⅰ)序列特征
 (A)长度：49个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC10095(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20:TCGACCCTCT GCGTCGCCCC ACCAACCACT GCTGTTCCAT CCTGATAGA49(2)关于SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：49个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC10096(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20:GATCTCTATC AGGATGGAAC AGCAGTGGTT GGTGGGGCGA CGCAGAGGG49(2)关于SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：61个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC10120(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22:  TCGACCCTCT GCGTCGCCCC ACCAACCACT GCTGTTCCAT CCAGAACTTC TTTGTGATAG60A61(2)关于SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：61个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC10121(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23:GATCTCTATC ACAAAGAAGT TCTGGATGGA ACAGCAGTGG TTGGTGGGGC GACGCAGAGG60G61(2)关于SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：76个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC10118(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:24:TCGACCCTCT GCGTCGCCCC ACCAACCACT GCTGTTCCAT CCAGAACTTC TTTGGTTTTG60ACTTTGAACT GATAGA76(2)关于SEQ ID NO:25的信息  (ⅰ)序列特征
 (A)长度：76个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC10119(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:25:GATCTCTATC AGTTCAAAGT CAAAACCAAA GAAGTTCTGG ATGGAACAGC AGTGGTTGGT60GGGGCGACGC AGAGGG76(2)关于SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：82个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型(ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC10108(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:26:TCGACCCTCT GCGTCAGGCG GGCCCCACCA ACCACTGCTG TTCCATCCAG AACTTCTTTG60GTTTTGACTT TGAACTGATA GA82(2)关于SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征
 (A)长度：82个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线型  (ⅶ)直接来源：
 (B)克隆：ZC10109(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:27:GATCTCTATC AGTTCAAAGT CAAAACCAAA GAAGTTCTGG ATGGAACAGC AGTGGTTGGT60GGGGCCCGCC TGACGCAGAG GG82

Claims (21)

1．在真核宿主细胞中可复制的表达载体，包含以下可操作连接的元件：
(a)转录启动子；
(b)编码分泌前导肽的第一段DNA片段；
(c)编码含C-X-B的血小板生成素(TPO)多肽的第二段DNA片段，其中C是人血小板生成素细胞因子结构域多肽；X是肽键或包含1或2个氨基酸残基的接头，限制条件是X单独或与C或B结合时不提供双碱性氨基酸对；而B是含SEQ ID NO:3的残基1至y的多肽，其中y是从5至18的整数并且其中B中至多35％的所述残基可分别被其它氨基酸残基替代；及
(d)转录终止子。
2．根据权利要求1所述的表达载体，其中所述载体可在酵母中复制。
3．根据权利要求2所述的表达载体，其中所述分泌前导肽是酿酒酵母α因子的分泌前导肽。
4．根据权利要求1所述的表达载体，其中y至少是9。
5．根据权利要求1所述的表达载体，其中B包含Thr-Thr二肽。
6．根据权利要求1所述的表达载体，其中B不包含Arg-Arg二肽。
7．根据权利要求1所述的表达载体，其中B中至多25％的所述残基分别被其它氨基酸残基替代。
8．根据权利要求1所述的表达载体，其中B的残基1至5是Ala-Pro-Pro-Thr-Thr(SEQ ID NO:8)。
9．根据权利要求1所述的表达载体，其中B的第4个残基是Thr或Asp。
10．根据权利要求1所述的表达载体，其中y至少是10并且B的第10个残基是Arg或Glu。
11．根据权利要求1所述的表达载体，其中y至少是14并且B的第14个残基是Val或Ala。
12．根据权利要求11所述的表达载体，其中B是Ala-Pro-Pro-Thr-Thr-Ala-Val-Pro-Ser-Arg-Thr-Ser-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Asn(SEQ ID NO:4)。
13．根据权利要求1所述的表达载体，其中B选自SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。
14．根据权利要求1所述的表达载体，其中X是肽键。
15．根据权利要求1所述的表达载体，其中X是单个氨基酸残基。
16．根据权利要求1所述的表达载体，其中C包含SEQ ID NO:2的残基1至152。
17．根据权利要求1所述的含表达载体的培养的真核细胞，其中所述细胞合成并分泌所述TPO多肽。
18．根据权利要求17所述的酵母细胞。
19．血小板生成素多肽，其特征是包含C-X-B氨基酸主链，其中C是人血小板生成素细胞因子结构域多肽；X是肽键或含1或2个氨基酸残基的接头，限制条件是X单独或与C或B结合时不提供双碱性氨基酸对；而B是包含SEQID NO:3的残基1至y的多肽，其中y是从5至18的整数，并且B中至多35％的所述残基可分别被其它氨基酸残基替代。
20．生产TPO多肽的方法，包括：
培养用可在宿主细胞中复制并包含以下可操作连接元件的表达载体转染或转化的宿主细胞：
(a)转录启动子；
(b)编码分泌前导肽的第一段DNA片段；
(c)编码包含C-X-B的血小板生成素的第二段DNA片段，其中C是人血小板生成素细胞因子结构域多肽；X是肽键或含1或2个氨基酸残基的接头，限制条件是X单独或与C或B结合时不提供双碱性氨基酸对；而B是含SEQ ID NO:3的残基1至y的多肽，其中y是从5至18的整数，并且B中至多35％的所述残基可分别被其它氨基酸替代；及
(d)转录终止子；
其中宿主细胞表达连接的第一段和第二段DNA片段合成TPO多肽；并且
回收TPO多肽。
21．增加哺乳动物中血小板数目的方法，包括给所述动物施用与药学上可接受的载体结合的血小板生成素多肽，此多肽的特征在于包含C-X-B的氨基酸主链，其中C是人血小板生成素细胞因子结构域多肽；X是肽键或含1或2个氨基酸残基的接头，限制条件是X单独或与C或B结合时不提供双碱性氨基酸对；而B是含SEQID NO:3的残基1至y的多肽，其中y是从5至18的整数，并且B中至多35％的所述残基可分别被其它氨基酸残基替代。
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