CN1226018C - 用于免疫测定的口腔收集 - Google Patents

Abstract

一种从口腔中收集免疫球蛋白和其它被测物用于免疫和其它试验的方法。使用一种吸附垫片收集具有高浓度免疫球蛋白或其它被测物的试样。可对该试样使用作为病人疾病检测工具的基本免疫试验技术。

Description

用于免疫测定的口腔收集

本发明涉及免疫试验领域。具体地说，本发明披露一种用于分析免疫球蛋白和来自粘膜渗出液的其他物质的体系。

由于血液和唾液的免疫球蛋白之间的关联，以及存在唾液特有的分泌性IgA，所以已经对唾液进行抗原-抗体试验，以评价这类试验作为检测疾病的工具的价值。

从唾液腺中收集唾液因下列因素而复杂化：分泌量少、腺体的各种不同解剖分布和流体粘度较高。绝大多数收集技术涉及使用毛细管、吸入微量吸管、在石蜡上咀嚼或吸入注射器。然而，这些方法的局限性在于：唾液的粘度使得用这些技术难以回收无泡材料。已提出了其他的收集方法以消除或至少减少样品中气泡的数量。在这类方法中包括，通过用海绵或柔性的渗透性膜填料直接吸收而收集口中的唾液。在吸收后，通过离心或者通过挤压吸收材料而从吸收材料中分离出唾液。然而，吸收一般是通过将棉花、尼龙或聚酯用作吸收材料而实现的。这些材料会非特异地结合蛋白质，这造成免疫球蛋白的回收率很低。

唾液样品的测试技术还未全面开发。除了收集方面的问题外，用已知方法收集的样品通常含有约0.01-0.1％在血清中发现的免疫球蛋白。因为唾液中免疫球蛋白含量的大大下降，所以在筛选患病病人时需要使用更精确的抗原-抗体分析方法。Parry等人在“筛选旅行者是否有甲肝病毒抗体的合理程序(Rational Programme for Screening Travellers for Antibodies to Hepatitis AVirus)”，(The Lancet，1988年6月25日)中讨论了这些方法，并发现为了避免在其他灵敏度较低的方法中的假信号，优选更准确的IgG捕获放射性免疫测定(GACRIA)试验。当然，较灵敏的测试程序通常需要增加时间和费用以获得试验结果。

口腔的免疫系统不仅与身体的全身免疫系统发生作用，而且还有其自身中心化的抗原-抗体应答中心。在口腔中发现了口腔外淋巴结和口腔内淋巴样聚集体。口腔外淋巴结与口粘膜、龈和牙齿的引流有关。然而，对口腔内淋巴样组织的功能所知甚少。

口腔外淋巴结包括毛细淋巴管的精细网络，这些毛细淋巴管位于口、上颚、颊、唇、齿龈和牙齿齿髓的浅层。毛细淋巴管与更大的、来自舌肌肉和其他结构的网络深处的淋巴管相连。抗原可以直接通过毛细管而进入口腔淋巴系统，或者由吞噬细胞输送达到。一旦位于网络中，抗原便可诱导免疫应答。

属于口腔内淋巴样组织的一般是4种不同的组织聚集体：(a)扁桃腺，(b)分散的粘膜下淋巴样聚集体，(c)唾液腺淋巴样组织，和(d)齿龈淋巴样组织。

扁桃腺(上颚的和舌的)主要产生B细胞和T细胞，它们主要位于淋巴细胞和浆细胞的帽中。抗原典型地通过不同的上皮区域而进入扁桃腺，其中抗原与T细胞和B细胞接触从而刺激免疫应答。已发现，在扁桃腺中形成的抗体主要类型是IgG，随后依次为IgA、IgM、IgD和IgE。

对分散的粘膜下淋巴样细胞还没有广泛研究。这些细胞团与扁桃腺组织在组织学上是类似的。

已发现，主唾液腺(腮腺，下颌下的以及舌下的)和次唾液腺两者都含有淋巴细胞和浆细胞。绝大多数浆细胞分泌IgA和某些IgG或IgM。在唾液腺中合成的IgA具有二聚体结构。这种类型的IgA被称为分泌性IgA(sIgA)，它是唾液中主要的免疫球蛋白组份。

在齿龈淋巴样组织中发现了T细胞和B细胞。在临床上齿龈组织正常的个体中，T细胞居多。在感染期，如在患龈炎时，发现B细胞居多。

还在齿龈淋巴样组织中发现浆细胞。这些细胞簇一般靠近血管而且主要产生IgG。也制造较少的IgA和IgM。更重要的是，Brandtzaeg等人在“人体唾液：临床化学和微生物学(Human Saliva：Clinical Chemistry andMicrobiology)”(Jorma O.Tenovuo编辑)中表明，来自齿龈组织分泌处的免疫球蛋白与血液中发现的免疫球蛋白直接相关。

为了消除或大大减少在唾液的抗原-抗体分析中所固有的问题，我们早先提出了一种方法，它在将高渗溶液作为漱洗液的协助下从口腔中收集免疫球蛋白。参见EP 0418 739A1。我们还在以前提出了，在口腔中使用收集垫片(已用高渗溶液处理过)吸收免疫球蛋白以供免疫测试。参见WO 91/13355。

我们发现一种未经处理的垫片可用于收集足量的用于免疫试验的口腔免疫球蛋白。使用该垫片形成的免疫球蛋白的产量大于所需求的，并且它可与基本的抗体-抗原试验技术结合在一起作为疾病检测工具。我们还发现本发明可用于收集用于试验的非免疫球蛋白的物质。事实上，已经成功地用本发明收集了分子量约为176(可铁宁)-950,000(IgM)的物质。使用本发明收集时对分子的大小无限制。如果分子能穿过毛细管壁和其它口腔组织，它就能被本发明所收集。该垫片不经咀嚼就能与口腔粘膜接触。

图1是一个储存垫片容器实例的纵向剖面图；

图2是显示垫片和支架的图1实例的纵向剖面图；

图3是另一个适用于本发明的拧去盖子的容器的实例的立体图；

图4是图3容器的俯视图；

图5是图4容器沿图4线5-5的纵向截面图；

图6是用于图3所示容器的盖子的立体图；

图7是图6盖子的俯视图；

图8是盖子沿图7线8-8的横截面图。

本发明涉及收集口腔免疫球蛋白用于免疫试验并收集其它物质用于试验。使用一种垫片收集具有高浓度免疫球蛋白或其它物质的试样。高水平口腔免疫球蛋白被认为是每毫升总Ig超过50μg的浓度。可对试样使用基本的试验技术，这种技术可用作病人疾病的检测工具或用作某些异体物质的检测工具。

通过使用本发明已经成功地收集的代表性分子有：

被测物                      分子量

可铁宁                       176

葡萄糖                       180

茶碱                         180

可卡因                       303

β2-微球蛋白                 11,818

乙型肝炎表面抗原             24,000

β-人绒毛膜促性腺激素        37,900

IgG--人抗体                  150,000

总IgG(未注明抗原)

HIV-1

甲型肝炎

乙型肝炎

麻疹

梅毒非螺旋体抗原

IgA--人抗体                  160,000

总IgA(未注明抗原)

IgM-人抗体                   950,000

总IgM(未注明抗原)

甲型肝炎

乙型肝炎

为了将在收集的试样中的降解减至最低程度，可在使用本发明高渗溶液后的储存垫片的容器中装入防腐剂。这种防腐剂可抑制会破坏抗体分子的蛋白水解酶的活性。作为防腐剂的化合物包括抗细菌剂、抗真菌剂、细菌抑制剂、真菌抑制剂以及酶抑制剂。在一个较好的实例中，使用苯甲酸，山梨酸或它们的盐作为抗真菌剂。就细菌抑制剂而言，高浓度的盐和能将高渗溶液保持在低pH值的化合物是较好的。这种盐包括乙基汞硫代水杨酸钠(或硫柳汞)、乙酸苯汞，硝酸苯汞和叠氮钠。其它较好的防腐剂包括常用于医药和漱口药中的防腐剂。其例子包括乙醇和葡糖酸洗必泰。另一类较好的抗微生物剂是可用作局部杀菌药或用于漱口药中的净化剂。其例子是氯化苯甲烃铵。这种防腐剂的较好用量约为0.01-0.2重量％。

在本发明中，使用一垫片从口腔中吸附粘膜分泌物。该垫片由能有效地置入口腔中的吸附材料制成。可使用一种塑料或碳水化合物材料(如纤维素)作为吸附材料，但较好的是一种较厚的有吸附能力的棉花纸。一种较厚的有吸附能力的棉花纸的例子是由位于Keene，New Hampshire的Schleicher and Schuell生产的#300产品。该垫片最好是非泡沫状或海绵状的，尽管泡沫或海绵也可以使用。

由于许多制备垫片的材料会非专一性地结合蛋白。因此，某些免疫球蛋白会不需要地结合在垫片上，需要使用阻断剂阻断蛋白结合在垫片上。由于血液本身含有阻断剂(即人体血清白蛋白)，所以在收集血液试样时通常不存在非专一性结合的问题。

为了在口腔试样的收集中降低非专一性粘合，可在混入垫片的高渗溶液中加入阻断剂。阻断剂通常是一种可溶性蛋白，用于防止其它蛋白非专一性结合至固体表面。可作为阻断剂添加的化合物包括白蛋白和明胶，但任何水溶性的无毒性蛋白都能用作阻断剂，只要该蛋白不对抗体分子产生不利影响。较好的是使用牛明胶。一般来说，阻断剂可制成浓度约为0.01-0.2重量％的溶液。随后通过浸渍或喷雾将该溶液渗入垫片，接着干燥之。

为收集口腔物质，可借助于支架将垫片放入口腔中。垫片和支架如附图所示。垫片支架1可以是一根一端带有凹槽2的空心塑料棒。垫片3插入凹槽，利用支架可将垫片放入口腔中，最好放于牙龈底部和面颊之间。将垫片放于面颊底部和牙龈底部之间有助于吸附来自齿龈淋巴样组织的分泌物以及来自粘膜下层淋巴样组织和唾液腺淋巴样组织的分泌物。最好使垫片在牙龈和面颊之间来回摩擦约10秒钟，随后将垫片在牙龈-面颊间的位置放置约2分种收集试样。不应对垫片进行咀嚼，因为咀嚼会刺激不需要的唾液分泌。

收集试样后，将垫片储存在容器内直至进行免疫试验。一种容器图1和图2所示。要求容器拥有一个离心管作为容器外面部分，容器的里面部分具有一根内管插入离心管内。垫片置于内管中，内管中的物品由管盖固定。

图1显示的是经过改进供本发明使用的组件。容器2包括具有圆锥形下端或底部5的离心管4，底部5具有向下的圆锥形深孔6，在该深孔中积聚离心后的固体物质；还包括具有径向地向外突出的环状边缘8和位于其上端的圆柱形上面部分9的上端管或容器7以及管塞或塞子11。圆柱形部分9和管塞11获得尺寸和形状与离心管4的上面部分相同，使之与离心管的外表面对齐并使组件具有匀称的外观，不过这些特征对本发明实践并不是重要的。在容器7底部的底13中是孔17，当对整个组件进行离心时，液体通过该孔从容器7流向离心管4。容器7由任何合适的材料(如聚乙烯、玻璃等)制成。同样，管塞11可由任何合适的材料制成，如本领域中众所周知的聚乙烯。

在孔17中有一个可移动的孔塞17。孔塞可由任何合适的材料(如石蜡，塑料等)制成。在容器7中放有适量的防腐溶液21。

只要将垫片放入内管中，便在管中加入防腐溶液21。这种防腐溶液起抑制酶活性(这种酶会破坏抗体分子)作用或作为抗微生物剂。

作为防腐剂用于内管中的化合物包括抗细菌剂，抗真菌剂，细菌抑制剂，真菌抑制剂以及酶抑制剂。就抗细菌剂而言，最好使用葡糖酸洗必泰或硫柳汞。

在内管中使用的防腐溶液可含有一种或多种防腐剂。一般来说，所含有的防腐剂浓度应能限制微生物污染并对垫片中免疫球蛋白的吸附不产生不利影响。

在内管中使用的防腐溶液还可含有一种净化剂，在离心过程中它能改善抗体从垫片上的分离。Tween20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)是较好的净化剂，因为它还能防止抗体在固体表面的非专一性结合。较好的是使用包括约0.01-0.2％葡糖酸洗必泰和0.2-0.7％Tween 20的混合物。最好使用包括约0.1％葡糖酸洗必泰和0.5％Tween 20的混合物。

将防腐溶液加入内管后，将管盖插入容器以密封内含物。用这种方法可将垫片储存几天直至开始进行免疫试验。

在本实例中，如上所述使用在支架1上的垫片3。将垫片3从用户口腔中取出后，从容器7中移去管塞11并将垫片放入容器7。在容器7开口的外面将支架1折断使之向上伸出容器。随后放回管塞11。由于管塞11是空心的，它能使支架1的断裂端伸入管塞并牢固地密封容器7。最好对支架1的适当部位进行刻痕使之容易折断。当将垫片3插入容器7时，它将至少吸附部分防腐溶液21。

将垫片3储存在容器7中直至开始进行试验。在实验室中，将牢固地带有管塞11的容器7倒置，除去由石蜡或其它合适材料制成的孔塞19，并将容器7放入离心管4中。随后离心整套组件2，将所有液体(包括防腐溶液，唾液等)通过孔17抽入离心管4。接着用已知的技术进行试验。

为简化使用垫片收集体系收集并分析口腔试样，可使用一种成套组件。该成套组件包括垫片和用于收集和制备分析用口腔试样的全套工具的组合物。成套组件的一个较好实例包括经处理的垫片3和垫片支架1；具有管塞11的容器7和储存防腐剂21。还可任选地包括离心管4。

本发明另一个储存收集物质用于随后试验的容器包括一个适合于可移动管塞密封的开口上端和一个带有使容器内外相通的孔的底端，在储存物质时该孔选择为脆弱的乳头状突起所密封，或者不密封以抽去收集的物质用于随后试验。为了使用者的舒适和安全，脆弱的乳头状突起的末端是展开的，最好是球状的。开口的上端最好用带螺纹的“孔塞密封”盖密封。此外，向中央孔倾斜的容器底部有许多竖立的丝网以防止前面No.641,739专利申请所述的垫片搁置在容器的底部并防止底部孔的阻塞。

选择容器的尺寸使之能插入15ml标准锥形离心管。从而能在乳头状突起折断后能将小瓶中的包含物离心至离心管内。

容器中将装有一定体积(约0.5-2.0ml)的防腐液体。当将垫片放入容器中，防腐液被吸入该垫片。由于带防腐液的容器将储存高达一年而防腐液的体积没有明显的减少，所以水透过率必须是低的。容器由任何合适的塑料(如聚乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、聚丙烯、EPC(乙烯-丙烯共聚物)等)制成。由于聚碳酸酯过度的“呼吸”，即使水分逃逸，所以它是最差的。较好的材料是聚丙烯。

参见图3和4，本实例的容器(标为数字10)包括细长的身体部分12。尽管身体部分12从上端至底部15最好稍具锥形，但是它通常是圆柱体的。上端16是敞开的并具有螺纹18与盖子适配。

乳头状突起20向下伸出底部15。底部15最好由外向中央以角度α稍微倾斜。角度α最好约20°。在底部15内侧中央是一个凹陷22，它最好是“V”形的并最好形成约88.5°的角度。凹陷22使乳头状突起20的根部变脆，从而当施加足够的压力时它容易被折断。在乳头状突起20的末端形成球24，以便更容易并更安全地折断脆弱的乳头状突起20。为了防止插入容器10中的垫片搁置底部15由乳头状突起20产生的孔中，将许多竖立的丝网26置于底部15上。较好的是放置4层丝网26。

现在让我们来看图5，6和7，所显示的是用于密封容器10上端16开口的盖子(用数字28标记)。盖28的形状常称为“孔塞密封”盖。盖28带有内螺纹30与容器上的螺纹18相匹配。环凹陷32产生以环凹陷32混合外壁36的内侧为界的环区域34。从而使容器壁与环区域34适配并产生较好的密封。在盖28的外侧表面上是如38所示的隆起以便于盖的除去和替换。

容器10的使用方法相同于上面参照图1和2所述容器的使用方法。下面实施例显示本发明垫片的有效性。

实施例1

唾液和粘膜渗出液中IgG的比较

本研究的目的在于比较唾液和粘膜渗出液中的IgG水平。

从10个实验对象中收集口腔试样。通过咀嚼“吸附体”(Sarstedt Salivette^TM组合件的一部分，用棉花棒作为吸附体)直至棉花棒为唾液所饱和从实验对象收集唾液。随后约4小时后，通过用WO 91/13355所述的处理垫片收集口腔液体从实验对象收集粘膜渗出液。收集唾液或渗出液后，将液体离心出棉花棒和处理垫片。用酶免疫测定分析口腔试样所存在的IgG抗体。

表1列出了棉花棒和处理垫片的IgG收集水平。

表1

实验对象编号	唾液IgG(μg/ml)	渗出液IgG(μg/ml)
			1	1.6	38.3
2	3.2	60.3
			3	0.7	21.0
4	1.8	48.5
			5	2.4	135
6	4.9	86.7
			7	1.1	72.3
8	1.3	31.1
			9	3.0	63.1
10	4.1	37.5
			平均IgG	2.4	59.4

通过咀嚼Sarstedt Salivette^TM组合件的“吸附体”收集的唾液试样的IgG抗体含量比WO 91/13355的处理垫片收集的试样的IgG抗体含量低约25倍。

实施例2

进行WO 91/13355的处理垫片和本发明未处理垫片的比较试验。

对每个志愿受试者使用4块垫片收集口腔试样，其中两块是处理的，两块是未处理的。每次收集(两块同样的垫片同时收集)持续2分钟。首次收集后用自来水清洗受试者的口腔并至少间隔1.5小时进行第二次收集。将本研究中的受试者分成两组。半数受试者首次使用两块未处理的垫片，随后使用两块处理垫片收集口腔试样，其它受试者先使用两块处理垫片，随后使用未处理的垫片进行收集。

收集后，受试者将垫片插入空小瓶中，该瓶已标有试样编号和收集用垫片的类型(处理的或未处理的)。折断支架棒并盖紧小瓶。在离心前或离心过程中使试样保持在4℃。离心后，合并用两块相同的垫片从每个受试者中收集的口腔试样。试样储存在4℃。

使用Epitope，Inc.生产的EIA分析每个合并试样的IgG总量以确定每个试样中IgG的量。

表2

受试对象编号	IgG(μg/ml)
				未处理垫片	处理垫片
1*	6.7	9.1
			2*	4.9	7.8
3	4.6	11.2
			4	12.4	23.9
5*	10.2	26.4
			6*	9.2	43.9
7	5.3	45.4

^*：首先用未处理的垫片收集

由内部(in-house)IgG特性酶免疫测定(EIA)法分析可知，由处理垫片收集的试样比由未处理垫片收集的试样含有更高的免疫球蛋白G(IgG)水平。

由WO 91/13355垫片收集物和Sarstedt“吸附体”收集物的分析可知，垫片从粘膜渗出液而非唾液中收集IgG，并且其中的差异是明显的。

由WO 91/13355的处理垫片收集物和本发明未处理垫片收集物的分析可知，尽管未处理垫片收集的IgG少于处理的垫片，但是未处理垫片收集的IgG仍然明显多于希望从唾液中收集的量(5.3μg/ml对2.4μg/ml)。

Claims (16)

1.一种从口腔中择优收集用于测定的粘膜渗出液的方法，包括如下步骤：

(a)将吸附垫片插入口腔，其中，所述吸附垫片未浸入高渗盐溶液中；

(b)使垫片与口腔粘膜接触而不撕裂所述垫片；

(c)将垫片从口腔中移出。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于当垫片从口腔中取出后，将该垫片保存在一个容器中。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于容器中含有防腐溶液。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于防腐溶液包括葡糖酸洗必泰或硫柳汞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于防腐溶液包括葡糖酸洗必泰。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于容器包括由可移去的盖子密封的开口上端，以及具有连接容器内外的孔的下端，在保存所述垫片过程中该孔选择密封，而取出所述收集粘膜渗出液用于随后测定时选择开封。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于该孔被脆弱的乳头状突起选择性密封。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述粘膜渗出液含有分子量为176-950,000的被测物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述被测物选自可铁宁、葡萄糖、茶碱、可卡因、β2-微球蛋白、乙型肝炎表面抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、免疫球蛋白及其混合物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述被测物是免疫球蛋白。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述免疫球蛋白选自IgG、IgA和IgM。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述免疫球蛋白是HIV-1、甲型肝炎、乙型肝炎、麻疹和梅毒非螺旋体抗原中的至少一种抗体。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述分析是免疫测定。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于所述免疫测定是ELISA测定。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述垫片由碳水化合物材料制成。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括(d)将所述垫片保存在高渗溶液中，以便随后从垫片中取出收集的粘膜渗出液用于测定。

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