CN121108106A - 一种萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料及其应用，其中萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料的结构通式如下所示：。本发明萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料具有癌细胞多个亚细胞器显影功能。与单光子荧光材料相比，具有激发能量低、波长长、穿透性强、光损伤小、低毒等特点，因此，对正常细胞无损伤，可用于癌细胞检测，具有明显的应用价值。

Description

一种萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料及其应用

技术领域

本发明属于荧光材料领域，具体涉及一种萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料及其应用。

背景技术

癌症作为一种全球范围内严重威胁人类健康的疾病，其发病率和死亡率逐年上升，给患者及其家庭带来了沉重的负担，也对社会医疗资源造成了巨大的压力。在癌症的诊断与治疗过程中，精准的细胞成像技术发挥着至关重要的作用。在细胞成像中，亚细胞器的显影材料是关键工具之一，这种材料不仅可以研究细胞内部结构与功能、更能揭示癌细胞生长、分裂、代谢、甚至凋亡的机制。

然而，目前市面上广泛研究的亚细胞器显影材料大多基于单光子激发，其激发波长主要集中在400-500 nm波段。这一波段的激发光具有一定的生物毒性，可能会对正常细胞和组织的生理过程产生干扰，甚至导致损伤，影响了其在癌症诊断、治疗研究中的应用。

与传统的单光子荧光成像技术相比，双光子荧光显微成像具有高度空间分辨、高度空间选择性、良好介质穿透性、长波激发、短波发射、生物体系自发荧光干扰小和光毒性低等优点，但现有双光子荧光材料在生物显影成像方面仍存在明显短板。目前，绝大多数双光子荧光材料只能靶向单一亚细胞器；若需要在癌细胞内同时观察细胞膜、线粒体、脂滴、溶酶体等多个亚细胞器，就必须先后或同时引入多种荧光材料。这不仅导致给药剂量成倍增加，还会因材料间的潜在相互作用而放大细胞毒性，严重制约其在活体或长期动态研究中的实际应用。因此，需要一类单一分子实现多种亚细胞器同步或步进显影的双光子荧光材料，从而降低材料用量与毒副作用。

鉴于此，本发明提出了一类新型的双光子荧光材料，其激发波长位于700-800 nm，这一波段的激发光具有显著的生物安全性，能够有效避免对细胞造成的损伤，可以为细胞成像提供更为温和、安全的条件。本发明的双光子荧光材料还能够实现对多个亚细胞器的同时显影，并且可以清晰地追踪显影材料在亚细胞器之间的动态变化过程。这种多细胞器显影与示踪能力为深入研究细胞内部复杂的代谢过程、信号转导通路以及细胞器之间的相互作用提供了新的策略，有望为癌症等疾病的发病机制研究、药物筛选以及临床诊断带来全新的视角。

发明人对本申请的相关内容作了如下检索：

1、http://scholar.google.com网检索结果：(2025/9/12)

2、中国知网检索结果：(2025/9/12)

检索方式一：

篇名-----具有级联靶向双光子细胞显影功能的萘酰亚胺类荧光材料 无相关文献。

篇名-----萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料 无相关文献。

篇名-----双光子细胞显影材料 16项，均与目标化合物无关。

检索方式二：

全文-----具有级联靶向双光子细胞显影功能的萘酰亚胺类荧光材料 189项，均与目标化合物无关。

全文-----萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料 448项，均与目标化合物无关。

全文------双光子细胞显影材料 2980项，均与目标化合物无关。

检索方式三：

关键词-----具有级联靶向双光子细胞显影功能的萘酰亚胺类荧光材料 无相关文献。

关键词-----萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料 无相关文献。

关键词-----双光子细胞显影材料 无相关文献。

发明内容

本发明旨在提供一种萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料及其应用。所要解决的技术问题是：遴选合适的具有双光子荧光性质的分子，并使其具备低毒性和多个癌细胞亚细胞器显影功能，从而适于生物学癌细胞亚细胞器显影。

本发明萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料，其结构通式如下所示：

；

其中：R₁选自羧基、氨基、线性聚醚基、烷基等；R₂选自苯乙烯、二苯乙烯、二苯基丙烯腈中的一种；R₃选自甲基、苄基、4-硼酸酯苄基、4-硼酸酯苄羟基中的一种；X^-选自溴离子Br^-、氯离子Cl^-、氢氧根离子OH^-、硝酸根NO₃ ^-、磺酸根SHO₃ ^-以及六氟磷酸根离子PF₆ ^-中的一种。

本发明萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料以具有双光子荧光发射功能的萘酰亚胺作为结构母体，具有较低的生物毒性和癌细胞双光子荧光显影的特性。

进一步，本发明萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料优选如下结构的化合物：

更进一步，所述X选择Cl^-，R₁选择烷基，R₂选择二苯基丙烯腈，R₃选择苄基，对应结构A4(其中R₁为丁基)。

本发明萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料在700-800 nm激发下具有双光子荧光发射性能。

本发明萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料在制备生物显影试剂中的应用。

所述生物显影试剂可以对癌细胞HepG2亚细胞器实现双光子荧光显影成像。

所述生物显影试剂在光照条件下能够级联靶向癌细胞HepG2的不同亚细胞器。癌细胞亚细胞器包括HepG2中的细胞膜、线粒体和脂滴。

所述生物显影试剂在HepG2中，进行光照后30 min，可以从细胞膜、线粒体迁移至脂滴，得到多个亚细胞器显影级联靶向作用。

本发明以具有较高反应活性和良好生物相容性的萘酰亚胺基团作为结构母体，高效地制备了具有吡啶盐结构的萘酰亚胺衍生物A4 (n = 3)，命名为A4₄，该双光子荧光材料具有较强的荧光活性，对其进行了癌细胞亚细胞器显影的研究。

经实验发现，本发明制备的A4₄双光子荧光材料在700 nm至800 nm之间具有双光子吸收性质，在740 nm处具有最强双光子吸收，双光子荧光发射峰位于461 nm。癌细胞HepG2被目标产物染色并加以光照后，可清晰地观察到A4₄对细胞膜、线粒体和脂滴的步进显影成像。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明合成的萘酰亚胺骨架吡啶盐衍生物具有癌细胞多个亚细胞器显影功能。与单光子荧光材料相比，具有激发能量低、波长长、穿透性强、光损伤小、低毒等特点，因此，对正常细胞无损伤，可用于癌细胞检测，具有明显的应用价值；

2、癌细胞HepG2与目标产物共孵育并加以光照后，可清晰地观察到材料从细胞膜逐步迁移到线粒体、脂滴。

3、原料易得，成本低，合成步骤简单，有些实验步骤在室温进行，节能减排；产率高，易于操作。

附图说明

图1为本发明的制备路线图。

图2是本发明A4₄的扫描电子显微镜(SEM)衍射花样。从SEM衍射花样可以看出该双光子荧光材料呈纳米纤维状结构，长约十几微米，宽约100~300 nm。

图3为本发明A4₄的单光子荧光发射图，双光子荧光发射图以及有效双光子吸收截面图。从图3中可以看出，该材料在496 nm处发射很强的单光子荧光发射；在760 nm处具有最强双光子吸收性能，有效双光子吸收截面187 GM(1 GM = 1×10^-50 cm⁴ s photon^-1)；在740 nm双光子激发下在461 nm处发射很强的双光子荧光。

图4是A4₄对HepG2细胞激光共聚焦荧光显微成像：(a) A4₄着色30分钟后HepG2细胞的单光子荧光显影照片；(b) A4₄着色30分钟后HepG2细胞的双光子荧光显影照片；(c)HepG2细胞明场图；(d) 叠加图。

图5是A4₄对HepG2细胞激光共聚焦荧光显微成像：(a) A4₄着色1分钟内HepG2细胞的双光子荧光显影照片；(b) HepG2细胞明场图；(c) 叠加图。

图6是A4₄与线粒体商染(MitoTracker Deep Red)对HepG2细胞激光共聚焦荧光显微成像：(a) A4₄着色10分钟后HepG2细胞的双光子荧光显影照片；(b) HepG2细胞线粒体商染(MitoTracker Deep Red)荧光显影照片；(c) HepG2细胞明场图；(d) 叠加图。

图7是A4₄与脂滴商染(Nile Red)对HepG2细胞激光共聚焦显微成像：(a) A4₄着色10分钟、白光照射30分钟后HepG2细胞的双光子荧光显影照片；(b) HepG2细胞中脂滴商染荧光显影照片；(c) HepG2细胞明场图；(d) 叠加图。

具体实施方式

双光子荧光材料A4₄制备路线图，见图1。具体包括如下步骤：

1、称取原料NI-CHO (357 mg，1 mmol)和1-萘乙腈(232 mg，1.2mmol)于50 mL圆底烧瓶中加入叔丁醇钾(336 mg，3mmol)以及乙醇(30 mL)。反应混合物回流搅拌3 h，经薄层色谱法分析结束反应，趁热将反应混合物中的乙醇通过减压蒸发除去，再将残余物通过柱层析(二氯甲烷/甲醇= 30/1，V/V)提取出黄色中间产物NI-Bz-Py，产量340 mg，产率62.3%。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, ppm) δ: 8.71 (d, J = 6.1, 2H), 8.64~8.67 (m,2H), 8.26 (dd, J = 8.5, 1.1 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 8.2, 2H), 7.87 (d, J = 8.3,2H), 7.71~7.78 (m, 5H), 7.64 (d, J = 8.3, 2H), 7.56~7.59 (m, 2H), 4.21 (t, J= 7.5, 2H), 1.70~1.78 (m, 2H), 1.42~1.51 (m, 2H), 0.99 (t, J = 7.3, 3H).

2、将中间产物NI-Bz-Py (273 mg，0.50 mmol)置于50 ml圆底烧瓶中，加入10 mL氯卞作为溶剂在60℃下搅拌3 h，反应结束后，趁热过滤得到粗产物，经柱层析(二氯甲烷/甲醇= 10/1，V/V)分离提纯得到橙红色固体，产量235 mg，产率70%。

FT-TIR (cm^-1，KBr)：2963, 2347, 2214, 1680, 1598, 1331, 1227, 1145,1056, 760, 694. ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 9.32 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 8.63 (d,J = 7.0 Hz, 2H), 8.57 – 8.53 (m, 2H), 8.42 (s, 1H), 8.28 – 8.24 (m, 3H), 8.21(d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.07 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.78(d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.64 – 7.58 (m, 2H), 7.48 (s, 3H), 5.90 (s, 2H), 4.06(t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.62 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 1.36 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 0.93(s, 3H). MS (ESI) calcd for (C₄₃H₃₆N₃O₂ ⁺) 661.73, found m/z: [A4₄-Cl]⁺ 624.26。

双光子荧光材料A4₄的结构用SEM表征，见图2。从图2可以看出该双光子荧光材料呈纳米纤维状结构，长约十几微米，宽约100~300 nm。

双光子荧光材料A4₄的单光子荧光发射、双光子荧光发射、双光子吸收性质结果见图3。

将清洗干净且灭菌的盖玻片放入6孔组织培养板中，肝癌组织细胞(HepG2细胞) 5×10⁵个/孔的密度接种在直径35 mm的6孔板培养皿中，并用DMEM作为细胞培养基进行细胞培养，细胞培养基中含有胎牛血清(10%)、青霉素(100 μg/ mL)和链霉素 (100 μg/mL)。细胞培养皿置于含5% CO₂和95% O₂的培养箱中维持温度37℃进行细胞培养24 h，用PBS (磷酸缓冲液，pH = 7.4，Gibco试剂公司生产) 洗涤HepG2细胞三次，洗去培养基。

向HepG2细胞中分别加入A4₄-水-DMSO(1/99，v/v)混合溶液、线粒体商染、脂滴商染，使其工作浓度分别为10 μM、1 μM、1 μM，37℃培养24 h(5% CO₂和95% O₂)，用4℃ PBS缓冲溶液(pH = 7.4)冲洗细胞培养皿2~3次，将细胞培养皿置于激光共聚焦显微镜(LSM-710，Zeiss，德国)下观察细胞形态及荧光摄取情况，结果见图4、图5、图6、图7。

从图6和图7可以清楚地看到，在双光子激发条件下，A4₄进入癌细胞HepG2后，展现出了独特的动态作用机制。它首先靶向细胞膜，旋即进入线粒体，对线粒体造成初步损伤，破坏其正常功能。随后，在光照条件下材料逐渐迁移至脂滴，进一步扰乱癌细胞的代谢平衡，加剧细胞内的氧化应激，造成广泛的氧化损伤。这类双光子荧光材料的制备对于细胞显影材料的遴选、制备、生物应用、材料科学等方面都有着重要的意义。

Claims (6)

1.一种萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料，其特征在于其结构通式如下所示：

；

其中：R₁选自羧基、氨基、线性聚醚基、烷基中的一种；R₂选自苯乙烯、二苯乙烯、二苯基丙烯腈中的一种；R₃选自甲基、苄基、4-硼酸酯苄基、4-硼酸酯苄羟基中的一种；X^-选自Br^-、Cl^-、OH^-、NO₃ ^-、SHO₃ ^-、PF₆ ^-中的一种。

2.根据权利要求1所述的萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料，其特征在于选自如下结构的化合物：

。

3.根据权利要求1所述的萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料，其特征在于其结构如下所示：

。

4.权利要求1所述萘酰亚胺骨架吡啶盐类双光子荧光材料在制备生物显影试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述生物显影试剂能够对癌细胞HepG2亚细胞器实现双光子荧光显影成像。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述生物显影试剂在光照条件下能够级联靶向癌细胞HepG2的不同亚细胞器，包括HepG2中的细胞膜、线粒体和脂滴。