CN120958136A

CN120958136A - 噬菌体载体

Info

Publication number: CN120958136A
Application number: CN202480007443.5A
Authority: CN
Inventors: 阿明·哈吉图; 基蒂萨克·苏万
Original assignee: Imperial Institute Of Technology Innovation Co ltd
Current assignee: Imperial Institute Of Technology Innovation Co ltd
Priority date: 2023-01-10
Filing date: 2024-01-10
Publication date: 2025-11-14
Also published as: WO2024149989A1; EP4649161A1; KR20250139307A

Abstract

本发明涉及噬菌体载体，以及包含转基因的新型噬菌体载体，尤其是包含常规哺乳动物转基因盒的新型噬菌体载体。本发明还扩展至此类噬菌体载体作为研究工具的用途，以及其在多种基因治疗应用、DNA和/或肽疫苗递送及成像技术中递送转基因的用途。

Description

噬菌体载体

技术领域

本发明涉及噬菌体载体，尤其是但不限于包含转基因的新型噬菌体载体，尤其是传统的哺乳动物转基因盒。本发明扩展至将这种噬菌体载体用作研究工具，并用于在各种基因治疗应用、DNA和/或肽疫苗递送以及成像技术中递送转基因。

背景技术

噬菌体(phage)正持续成为用于转基因靶向递送的安全载体，因为它们对哺乳动物细胞受体无固有趋向性，但可经改造以在外壳蛋白上展示组织特异性配体，从而允许细胞进入，且不会破坏病毒结构(1-6)。然而，尽管相比真核病毒具有明显优势，组织靶向的噬菌体载体已显示出有限的功效，因为噬菌体已进化为仅感染细菌，并且在进入真核细胞后没有表达转基因的优化策略(2)。

发明人之前的研究表明，丝状M13噬菌体的基因转移效率是可以改进的，而一种有效的策略是将噬菌体与动物病毒的特性相结合。重要的是，在过去几年中，发明人设计了多种策略来提高丝状M13噬菌体衍生载体的基因递送效率。事实上，与其他病毒载体一样，M13噬菌体载体成功介导基因递送需要：i)通过细胞外基质(ECM)的有效扩散以到达细胞表面，ii)细胞表面受体结合以实现细胞摄取，iii)内体逃逸，以及iv)核进入以启动基因表达。显然，噬菌体已进化为仅感染细菌，且没有经过优化的策略来完成上述步骤以在哺乳动物细胞中表达转基因。在过去几年中，发明人设计了多种方法来克服这些限制，包括通过减小M13噬菌体颗粒的尺寸以促进其通过细胞外基质(ECM)的扩散(7,8)，以及在重组pVIII主要衣壳蛋白上掺入内体逃逸肽以增强噬菌体从内体/溶酶体降解途径中的逃逸(9,10)。此外，为了改善细胞核中的基因表达，发明人先前在哺乳动物转基因表达盒的两侧添加了来自腺相关病毒(AAV2)的反向末端重复序列(ITR)，从而提高了噬菌体的基因递送效率(6)。此外，为了增强载体在癌细胞核中治疗性基因的转录，发明人用葡萄糖调节蛋白Grp78的肿瘤激活和化疗诱导启动子取代了巨细胞病毒CMV启动子(11,12)。发明人还将抗癌药物与M13噬菌体载体结合，以增加噬菌体在癌细胞中的核进入(13)。

然而，与传统病毒载体不同，丝状M13噬菌体需要将其单链DNA(ssDNA)基因组额外转化为双链DNA(dsDNA)的形式，才能被细胞的转录机制正确识别(14)。虽然M13噬菌体进入细胞核的能力已得到成功解决，但单链(ss)基因组向双链(ds)基因组的转化仍是一个有待解决的关键问题。在哺乳动物细胞中，M13噬菌体的ssDNA向dsDNA的转化依赖于细胞因子，这是一个效率非常低的过程，限制了转导效率(15)。

显然，将M13噬菌体转化为双链DNA(dsDNA)长期以来一直是M13噬菌体介导的向哺乳动物细胞递送基因的主要挑战。互补链合成或募集的需求目前被认为是限制M13噬菌体载体效率的限速因素。为了克服这一限制，通过对预先与噬菌粒颗粒共孵育的人类细胞系进行基因毒性处理，来促进ssDNA向dsDNA的转化(15)。遗憾的是，此类处理方法不适用于活体生物。

除了上述与丝状噬菌体(如M13噬菌体)相关的问题外，腺相关病毒(AAV)载体中也存在与ssDNA转化为dsDNA这一限速步骤相关的显著问题。此外，尽管AAV的衣壳可携带两条自身互补的ssDNA序列，每条ssDNA序列均包含一个转基因表达盒，以便在细胞转导时产生dsAAV DNA，但每条ssDNA的最大长度不能超过2.3kb。因此，在包装大于2.3kb的表达盒(即大基因组)以在转导细胞中生产dsDNA AAV并用于基因治疗应用时，存在包装方面的问题。

因此，需要提供一种用于递送转基因盒的新型噬菌体载体，例如将其递送到哺乳动物细胞中。

发明内容

与依赖可能存在变异的细胞机制为单链基因组噬菌体载体提供互补链不同，发明人意外发现，可通过设计一种携带转基因表达盒互补序列的单一噬菌体载体来规避这一问题。

因此，根据本发明的第一方面，提供了一种噬菌体载体，其包含由连接子分隔的至少两个单链自互补的转基因表达盒，其杂交形成双链转基因表达盒。

如实施例中所讨论的，发明人设计了一种携带转基因表达盒互补序列的噬菌体载体，这些互补序列可杂交形成双链转基因表达盒。有利地，本发明的噬菌体载体克服了丝状噬菌体载体(如M13)的单链(ss)DNA向双链(ds)DNA转化的问题，以及腺相关病毒(AAV)载体中单链DNA向双链DNA转化的相关问题。本发明还解决了为生产双链AAV载体而包装大基因组的问题。为了证明本发明的噬菌体载体比现有技术具有更好的基因递送效果，发明人使用了报告基因(如绿色荧光蛋白GFP和荧光素酶)。随后，发明人利用细胞因子TRAIL来支持其发现，并进一步证明本发明的载体在基因递送方面表现出惊人的优越性。当在表达盒中使用编码细胞因子(如TRAIL)的基因时，发明人还证实了癌细胞的死亡，这表明本发明的噬菌体载体可用于有效递送治疗性基因。

因此，本发明的噬菌体载体可以是丝状噬菌体载体，如M13，也可以是AAV DNA和丝状噬菌体衣壳的杂交载体。

发明人使用多种细胞系和转基因进行了数次体外实验，令人惊讶的是，发明人观察到本发明的噬菌体载体的转导效率比传统单链DNA噬菌体载体的转导效率高(高出3倍至15倍)。实际上，有利的是，本发明的噬菌体载体在所有测试的细胞系中都表现出起效迅速且转基因表达水平更高的特点。更重要的是，与传统单链噬菌体载体不同，DNA复制抑制剂不会影响本发明噬菌体载体的转导。此外，如实施例中所讨论的，体内研究表明，与传统单链DNA噬菌体颗粒相比，当对小鼠全身性施用本发明的噬菌体载体时，其向实体瘤的基因递送效率显著提高。所有这些生物学特性都证明了一类新型丝状噬菌体载体的产生和特性，这类载体能够递送双链DNA，这将对基于噬菌体的基因递送系统的持续发展做出重大贡献。

由于环状噬菌体基因组可能会影响双链DNA的形成过程，发明人使用了一种噬菌粒，例如WO 2017/077275中所描述的那种，该专利的全部内容通过引用并入本文。这一过程包括去除噬菌体基因组，仅保留f1复制起点，以实现转基因表达盒在细菌中的复制和包装。噬菌粒的定义是一种包含噬菌体复制起点的质粒DNA，因此得名“噬菌粒(phage-mid)”。本文中，发明人以噬菌粒作为DNA骨架，设计出了携带两个转基因表达盒的新型噬菌体基因组。所产生的双链载体是一种噬菌体颗粒。

因此，优选地，噬菌体载体是由噬菌体衍生的外壳蛋白包裹的杂合噬菌粒基因组。这种杂合噬菌粒基因组可称为“噬菌粒基因组”(即一种包含两个复制起点的基因构建体——一个来自噬菌体(如F1)，另一个来自细菌(如pUC1))。

优选地，噬菌体载体的基因组包含包装信号，该包装信号用于使至少两个单链自互补的转基因表达盒能够复制，这些转基因表达盒能够在细菌中杂交，随后在原核宿主内作为双链转基因表达盒被包装到噬菌体载体中。包装信号可以优选地包括噬菌体复制起点。例如，复制起点优选包含一个F1起点，更优选来自F1噬菌体。F1起点的一个实施方式的DNA序列在本文中表示为SEQ ID No:1，如下所示：

ACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTT

[SEQ ID NO:1]

优选地，噬菌体载体的基因组包含复制起点，用于使至少两个单链自互补的转基因表达盒能够在原核宿主内复制。优选地，复制起点能够在宿主内实现载体高拷贝数的复制。优选地，复制起点包括细菌复制起点。优选地，复制起点包含pUC起点(用于分子克隆)。pUC起点的一个实施方式的DNA序列在本文中表示为SEQ ID No:2，如下所示：

TTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAA

[SEQ ID NO:2]

或者，在另一个实施方式中，噬菌体载体可被设计为能整合到宿主细胞的基因组中。在这种情况下，需设想有利于载体基因组靶向整合(例如通过同源重组)的核酸序列。因此，噬菌体载体的基因组可包含一个或多个能使其靶向整合到宿主基因组中的DNA序列。

在一个实施方式中，噬菌体载体可用作实验研究工具并用于离体或体外。

在另一个实施方式中，优选地，噬菌体载体可用于将至少两个自互补的转基因表达盒递送至组织特异性靶点，无论该载体是在体内全身或局部给予受试者，还是在体外应用于细胞混合物，亦或是在离体情况下应用于器官。优选地，至少两个自互补的转基因表达盒包含病毒转基因表达盒。更优选地，至少两个自互补的转基因表达盒包含哺乳动物病毒转基因表达盒。例如，在一个优选实施方式中，至少两个自互补的转基因表达盒可以包含慢病毒转基因表达盒。至少两个自互补的转基因表达盒优选为腺相关病毒(AAV)转基因表达盒。

至少两个自互补的转基因表达盒可以包含编码一种因子的任何核酸，该因子可在靶细胞或组织中具有治疗或工业用途。在本发明的一个实施方式中，该核酸可以是DNA，其可以是基因组DNA或cDNA。在一些实施方式中，非天然存在的cDNA可能是优选的。在另一个实施方式中，该核酸可以是RNA，例如为反义RNA或shRNA。

由该核酸编码的因子可以是多肽或蛋白质。例如，在第一方面的噬菌体载体用于治疗癌症的实施方式中，转基因可以编码单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，该基因随后可对靶肿瘤细胞发挥治疗作用。转基因可以编码细胞因子，例如肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)。该载体可用于治疗任何癌症，如骨癌。

然而，应该理解的是，噬菌体载体所靶向的细胞类型取决于载体表面表达的细胞靶向配体的类型。例如，细胞靶向配体可能包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，如RGD4C。

上述至少两个转基因表达盒可以包含在靶细胞中表达核酸所需的一种或多种功能元件。例如，优选地，这至少两个转基因表达盒各自包含一个启动子，用于驱动转基因的表达。合适的启动子可以是巨细胞病毒(CMV)启动子。本文中，CMV启动子一个实施方式的DNA序列在本文中表示为SEQ ID No:3，如下所示：

ACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCC

[SEQ ID NO:3]

在另一个优选的实施方式中，至少两个转基因表达盒各自包含一个葡萄糖调节蛋白78(grp78)启动子。本文中，grp78启动子的一个实施方式的核酸序列在本文中表示为SEQIDNo:4，如下所示：

CCCGGGGGCCCAACGTGAGGGGAGGACCTGGACGGTTACCGGCGGAAACGGTTTCCAGGTGAGAGGTCACCCGAGGGACAGGCAGCTGCTCAACCAATAGGACCAGCTCTCAGGGCGGATGCTGCCTCTCATTGGCGGCCGTTAAGAATGACCAGTAGCCAATGAGTCGGCTGGGGGGCGCGTACCAGTGACGTGAGTTGCGGAGGAGGCCGCTTCGAATCGGCAGCGGCCAGCTTGGTGGCATGAACCAACCAGCGGCCTCCAACGAGTAGCGAGTTCACCAATCGGAGGCCTCCACGACGGGGCTGCGGGGAGGATATATAAGCCGAGTCGGCGACCGGCGCGCTCGATACTGGCTGTGACTACACTGACTTGGAC

[SEQ ID NO:4]

或者，在另一个优选的实施方式中，至少两个转基因表达盒各自包含肿瘤特异性启动子或组织特异性启动子。组织特异性启动子可用于通过展示配体的噬菌体载体靶向转录和基因表达，以将其递送至这些特定组织。

优选地，至少两个转基因表达盒各自包含一段编码多聚腺苷酸(polyA)尾的核酸。优选地，多聚腺苷酸尾位于转基因表达盒的末端，即转基因表达盒的5'端或3'端。本文中，一段编码多聚腺苷酸尾的核酸的一个实施方式的DNA序列在本文中表示为SEQ ID No:5，如下所示：

ACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTT

[SEQ ID NO:5]

因此，在一个优选的实施方式中，至少两个单链自互补的转基因表达盒各自包含一个启动子(优选为CMV)、一段编码一种因子(例如治疗性因子)的核酸以及一个polyA尾。

优选地，噬菌体载体包含由连接子分隔的至少两个单链自互补转基因表达盒，其通过杂交形成双链转基因表达盒。或者，噬菌体载体可以包含由连接子分隔的四个单链自互补的转基因表达盒(即两对自互补的表达盒)，其通过杂交形成两个双链转基因表达盒。

如图2所示，为使单链自互补的转基因表达盒能够相互杂交，它们在噬菌体载体中必须以相反的方向排列，即第一个表达盒沿5’到3’方向延伸，而对应的第二个表达盒沿3’到5’方向延伸。应当理解，这些表达盒在序列方面基本相同，但在分隔它们的连接子两侧以相反或反平行的方向延伸。因此，在一个优选实施方式中，这两个单链自互补的转基因表达盒在噬菌体载体中以相反的方向排列。

可以理解的是，为了使至少两个单链自互补的转基因表达盒成功杂交形成双链转基因表达盒，它们的序列即使不完全相同，也应该相似，尽管它们的延伸方向相反。然而，它们的序列并非必须完全相同，只要每个表达盒在足够长的片段上具有足够的序列一致性，就会发生杂交。

第一转表达盒与第二表达盒之间的序列一致性百分比可以至少为65％、70％或75％。优选地，第一转表达盒与第二表达盒之间的序列一致性百分比至少为80％、85％或90％。更优选地，第一转表达盒与第二表达盒之间的序列一致性百分比至少为92％、94％或95％。进一步更优选地，第一转表达盒与第二表达盒之间的序列一致性百分比至少为96％、97％或98％。最优选地，第一转表达盒与第二表达盒之间的序列一致性百分比至少为99％或为100％。

优选地，分隔至少两个自互补的转基因表达盒的所述连接子为末端反向重复序列(ITR)。优选地，噬菌体载体包含第二ITR。更优选地，第二ITR位于至少两个自互补的转基因表达盒中一个的侧翼。

或者，在另一个优选的实施方式中，分隔至少两个自互补的转基因表达盒的连接子是一段无关DNA片段。优选地，该连接子或无关DNA片段的长度在60bp至300bp之间、在80bp至280bp之间、在100bp至260bp之间、在120bp至240bp之间、在140bp至220bp之间，或在160bp至200bp之间。最优选地，连接子或无关DNA片段的长度为180bp。

“无关DNA片段”指的是与第一单链自互补的表达盒以及第二单链自互补的表达盒具有低序列一致性或无序列一致性的DNA。例如，连接子与第一表达盒和第二表达盒之间的序列一致性百分比低于50％、45％或40％。优选地，连接子与第一表达盒和第二表达盒之间的序列一致性百分比低于35％、30％或25％。优选地，连接子与第一表达盒和第二表达盒之间的序列一致性百分比低于20％、15％或10％。优选地，第一表达盒和第二个表达盒之间的序列一致性百分比至少为8％或5％。

优选地，第一ITR和第二ITR是AAV ITR。ITR可以是AAV-2或其他AAV血清型所特有的，并且可以是任何序列，只要其在二级结构中能形成发夹环即可。例如，AAV血清型可以是AAV1-9，但优选为AAV1、AAV2、AAV5、AAV6或AAV8。ITR的一个实施方式DNA序列(来自市售AAV质粒的左侧反向末端重复序列)在本文中表示为SEQ ID No:6，如下所示：

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT

[SEQ ID NO:6]

另一个实施方式的ITR的DNA序列(来自市售腺相关病毒(AAV)质粒的右侧反向末端重复序列)在本文中表示为SEQ ID No:7，如下所示：

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG

[SEQ ID NO:7]

优选地，噬菌体载体仅包含两个ITR。优选地，噬菌体载体包含少于三个ITR。

优选地，噬菌体载体的基因组包含一个选择标记，该标记将取决于载体所携带的宿主细胞，例如用于赋予宿主细胞(优选为细菌)抗生素(如氨苄青霉素)抗性。该标记在载体于宿主细胞中生产期间提供选择压力。因此，在一个优选实施方式中，噬菌体载体包含氨苄青霉素抗性基因。

优选地，噬菌体载体包含一种或多种衣壳次要外壳蛋白。该噬菌体载体可包含pIII衣壳次要外壳蛋白，其被配置为显示细胞靶向配体，从而使载体能够被递送至靶细胞。优选地，噬菌体载体包含一种或多种衣壳主要外壳蛋白。该噬菌体载体可包含至少一种pVIII衣壳主要外壳蛋白，其被配置为在其上显示外源肽。

噬菌体载体可以包含衣壳结构的修饰，例如通过处理或化学与生物化学偶联的方式(使其具有修饰)。合适的修饰的实施例可以包括将肽残基交联到噬菌体颗粒上。在另一个实施方式中，噬菌体载体可包含一个或多个附着于其衣壳的功能性肽。例如，功能性肽可包含核易位信号或内体逃逸肽。因此，噬菌粒颗粒可以是多功能的，并可利用WO 2014/184528中公开的特征，其内容以引用方式并入本文。

在另一个实施方式中，噬菌体载体可以与阳离子聚合物结合形成具有净正电荷的复合物，如WO 2014/184529中所述，其内容以引用方式并入本文。阳离子聚合物可以从包含以下的组中选择：壳聚糖；聚-D-赖氨酸(PDL)；二乙氨基乙基(DEAE)；二乙氨基乙基-葡聚糖(DEAE.DEX)；聚乙烯亚胺(PEI)；聚凝胺；硫酸鱼精蛋白；以及阳离子脂质。优选地，阳离子脂质选自和DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基硫酸盐)。优选地，阳离子聚合物包含DEAE，更优选DEAE.DEX。

优选地，噬菌体载体包含一个基因组，该基因组基本上缺失了该载体所衍生自的噬菌体基因组。优选地，噬菌体载体的基因组缺失其衍生自的噬菌体基因组的至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％。更优选地，噬菌体载体的基因组缺失其衍生自的噬菌体基因组的至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％。优选地，噬菌体载体的基因组缺失其衍生自的所有噬菌体基因组。然而，如上文所讨论的，在一些实施方式中，噬菌体载体的基因组可包含噬菌体复制起点，以使得单链DNA能在宿主细菌中复制，即F1噬菌体复制起点。

优选地，噬菌体载体的基因组中缺失噬菌体从原核宿主中形成、包装或释放颗粒所需的结构基因。这类结构基因编码衣壳蛋白等。因此，优选地，噬菌体载体缺失编码噬菌体衣壳蛋白的结构基因。优选地，噬菌体载体包含基因组，该基因组缺失编码该载体所衍生噬菌体的次要或主要外壳蛋白的基因。优选地，噬菌体载体包含基因组，该基因组缺失编码pIII衣壳次要外壳蛋白的基因，或者缺失编码pVIII衣壳主要外壳蛋白的基因。最优选地，噬菌体载体包含基因组，该基因组既缺失编码pIII衣壳次要外壳蛋白的基因，又缺失编码pVIII衣壳主要外壳蛋白的基因。

因此，噬菌体载体优选包含一种复制缺陷型病毒样颗粒或病毒粒子，其由源自噬菌体的结构成分构建而成并显示这些成分，这些成分包括但不限于蛋白质和其他缀合物，尽管该载体的基因组不包含其衍生自的噬菌体的结构基因。

因此，鉴于第一方面的噬菌体载体的基因组缺失了其衍生噬菌体的大部分基因组(包括结构基因)，需要一种替代系统来提供将噬菌体载体基因组包装到噬菌体衣壳中以产生本发明噬菌体载体所需的必要结构(即衣壳)基因。相应地，发明人设计了一种用于生产第一方面载体的系统，该系统涉及使用一种单独的所谓“辅助病毒”载体。因此，实际上，第一方面的噬菌体载体是一种杂交噬菌粒载体，其包含噬菌粒的顺式遗传组件和真核病毒的顺式遗传组件，例如AAV ITR。

因此，在第二方面，提供了一种用于从原核宿主产生噬菌体载体的系统，该系统包括：

(i)第一载体，其被配置为持续存在于原核宿主内，并包含由连接子分隔且杂交形成双链转基因表达盒的至少两个单链自互补的转基因表达盒，以及用于使至少两个单链自互补的转基因表达盒能够复制的包装信号；以及

(ii)第二载体，其包含核酸，用于编码包装双链转基因表达盒所需的结构蛋白，

从而使噬菌体载体能在原核宿主中形成并从中释放。

第二方面的系统优选能够将第一载体提供的真核病毒(如AAV或慢病毒)基因组包装到第二载体提供的原核病毒衣壳(即噬菌体)中。

有利的是，将噬菌体载体的繁殖元件分离到携带转基因表达盒的第一“治疗性”载体和携带病毒包装结构基因的第二独立“辅助”载体中，可显著减小基因组/载体的大小，从而大幅提高转基因容量。在噬菌体载体用于治疗的实施方式中，这对于基因治疗应用而言是一个特别有用的优势。因此，这会提高载体系统的生产产量、基因转导效率，并增强其在其他应用中的灵活性。

优选地，第二方面的系统用于产生根据第一方面的噬菌体载体。因此，优选地，第一载体包含噬菌体载体的基因组。第一载体的包装信号可以优选包含一个复制起点，优选为噬菌体复制起点。优选地，第一载体中的复制起点包含F1复制起点，更优选来自F1噬菌体复制起点。

优选地，第一载体包含第二复制起点，用于使至少两个单链自互补的转基因表达盒能在原核宿主内复制，以用于分子克隆。优选地，该复制起点能使载体在宿主内进行高拷贝数复制，以用于分子克隆。优选地，该复制起点包含pUC复制起点。或者，第一载体可以包含一个或多个有利于靶向整合到宿主基因组中的DNA序列，从而无需任何复制起点。

上述至少两个单链自互补的转基因表达盒包含一个病毒转基因表达盒，更优选为哺乳动物病毒转基因表达盒。例如，至少两个转基因表达盒可以包含AAV转基因表达盒或慢病毒转基因表达盒，其中AAV转基因表达盒为优选。

优选地，第一载体的连接子为ITR，更优选为AAV ITR，进一步更优选为腺相关病毒2型(AAV2)ITR。或者，在另一个优选的实施方式中，第一载体的连接子为不相关DNA片段。优选地，该连接子如上文对第一方面的噬菌体载体所描述的那样。

在一个优选的实施方式中，第一载体包含第二ITR。优选地，第二ITR位于至少两个自互补的转基因表达盒中的一个侧翼。优选地，第一ITR和/或第二ITR是AAV ITR。优选地，第一载体仅包含两个ITR。优选地，第一载体包含少于三个ITR。

第二载体或“辅助噬菌体”优选为经专门改造以从原核宿主中拯救第一载体基因组的噬菌体。因此，提供第二载体(即辅助噬菌体)是为了将其蛋白质和多肽提供给第一载体，或提供给任何其他包含功能性包装信号和/或单链复制起点的DNA实体。第二载体最优选为复制缺陷型。优选地，第二载体包含一个被破坏的包装信号，这会显著削弱其将自身包装到噬菌体颗粒中的能力。优选地，第二载体包含一个被破坏的复制起点。在一个实施方式中，该被破坏的复制起点是中等拷贝数起点，如p15a。在另一个实施方式中，该被破坏的复制起点是低拷贝数起点，如pMB1。优选地，第一载体(即噬菌体载体的基因组)被配置为在复制和包装两方面都优于第二载体(即辅助噬菌体)。

第二载体的基因组可经改造，使所得噬菌体载体具备靶向特性(或如WO2014/184528中所述的多功能特性)。因此，第二载体为噬菌体载体的组装提供结构衣壳蛋白。优选地，第二载体包含编码一种或多种衣壳次要外壳蛋白、或编码一种或多种衣壳主要外壳蛋白的核酸。所有衣壳蛋白可以是野生型或重组型，以单拷贝或多拷贝形式存在，并且可经修饰以显示嵌合肽或合成肽。这包括展示其他病毒的抗原，用于肽疫苗递送；或者，在需要(由第一方面的噬菌粒颗粒递送的)DNA疫苗的情况下，作为佐剂发挥作用。

因此，在一个实施方式中，第二载体可以包含编码pIII衣壳次要外壳蛋白的第一核酸序列，该蛋白被配置为显示细胞靶向配体，使噬菌体载体能够递送至靶细胞(例如肿瘤细胞)。因此，可能需要在重组噬菌粒颗粒的pIII次要外壳蛋白中引入一个9氨基酸突变，以使其对表达α_νβ₃和α_νβ₅整合素的肿瘤细胞以及血管生成性肿瘤相关内皮细胞具有特异性。由此，第二载体的基因组可以包含RGD4C靶向肽(序列为CDCRGDCFC——SEQ ID No:8)。

在另一个实施方式中，第二载体可以包含编码至少一种pVIII衣壳主要外壳蛋白的第二核酸序列，该蛋白被配置为在其上显示外源肽。因此，可能需要在噬菌体载体的野生型pVIII主要外壳蛋白中引入突变，以显示一种短肽，例如长度少于10个氨基酸。这种短肽可以是靶向部分，或者在体内或体外具有固有的生物学/化学功能。例如，通过抗原显示在体内产生免疫刺激，或通过显示金结合肽在体外与纳米颗粒(例如金)结合。

第一载体可以是逆转录病毒科或正逆转录病毒亚科的成员。第一载体也可以是慢病毒属的成员。优选地，第一载体是细小病毒科或其亚科的成员。更优选地，第一载体是依赖性细小病毒属或腺相关病毒种的成员。

一旦第一载体(即噬菌体载体的基因组)和第二载体(即辅助噬菌体)被构建后，它们被共同用于在原核宿主中产生第一方面的噬菌体载体。应当理解，第一载体中用于使噬菌体载体基因组能够复制的包装信号(例如复制起点)的作用是向第二载体(即辅助噬菌体)的结构蛋白发出信号，使其对该基因组进行包装(即它们在宿主中以反式作用方式协同作用)，从而形成第一方面的颗粒。

在第三方面，提供了一种从原核宿主产生噬菌体载体的方法，该方法包括：-

(i)将第一载体引入原核宿主细胞中，第一载体被配置为持续存在于原核宿主内，并包含由连接子分隔且杂交形成双链转基因表达盒的至少两个单链自互补的转基因表达盒，以及用于使至少两个单链自互补的转基因表达盒能够复制的包装信号；

(ii)将辅助噬菌体引入宿主，辅助噬菌体包含编码噬菌体结构蛋白的核酸；以及

(iii)在产生双链转基因表达盒的条件下培养宿主，双链转基因表达盒被结构蛋白包装，以使携带该双链转基因表达盒的噬菌体载体在原核宿主中形成并从中释放出。

有利的是，这会产生极高产量的噬菌体载体。可通过例如感染的方式将第一载体(即噬菌体载体的基因组)导入宿主细胞。然后可用辅助噬菌体转化该宿主细胞，从而产生噬菌体载体。优选地，该方法在培养步骤之后包括一个纯化步骤。纯化可包括离心和/或过滤。

在第四方面，提供了一种从原核宿主产生噬菌体颗粒的方法，该方法包括：-

(i)将以下引入原核宿主细胞：(a)第一载体，被配置为持续存在于原核宿主内，并且包含由连接子分隔且杂交形成双链转基因表达盒的至少两个单链自互补的转基因表达盒，以及用于使得至少两个单链自互补的转基因表达盒能够复制的包装信号；以及(b)第二载体，包含由核酸编码的、包装双链转基因表达盒所需的结构蛋白；以及

(ii)在产生被结构蛋白包装的双链转基因表达盒的条件下培养宿主，以使噬菌体载体在原核宿主中形成并从中释放出。

有利的是，这提高了安全性。可通过例如感染的方式将第二载体(即辅助噬菌体)导入宿主细胞。然后可用第一载体(即噬菌体载体的基因组)转化该宿主细胞，从而产生噬菌体载体。优选地，该方法在培养步骤之后包括一个纯化步骤。纯化可包括离心和/或过滤。

在第五方面，提供了一种辅助噬菌体的用途，该辅助噬菌体包含编码病毒载体结构蛋白的核酸，用于从原核宿主生产根据第一方面的噬菌体载体。

在第六方面，提供了包含如第二方面中所定义的第一载体和/或第二载体的宿主细胞。

宿主细胞优选为原核细胞，更优选为细菌细胞。合适的宿主细胞的实施例包括：(i)TG1(基因型：K-12supE thi-1Δ(lac-proAB)Δ(mcrB-hsdSM)5，(r_K-m_K ^-)，质粒：F'[traD36 proAB⁺lacI^q lacZΔM15])；(ii)DH5αF′IQ^TM(基因型：Δ(lacZYA-argF)U169 recA1endA1 hsdR17(rk^-,mk⁺)phoA supE44λ-thi-1gyrA96 relA1，质粒：F′proAB⁺lacIqZΔM15zzf::Tn5[KmR])；以及(iii)XL1-Blue MRF′(基因型：Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173endA1 supE44 thi-1recA1 gyrA96 relA1 lac，质粒：F′proABlacIqZΔM15 Tn10(Tetr))。

在另一方面，提供了根据第一方面的噬菌体载体或根据第二方面的系统，用于作为实验研究工具。

例如，载体或系统可以离体或体外使用。

然而，优选地，载体用于治疗或诊断方法中，优选用于体内。

因此，在第七方面，提供了根据第一方面的噬菌体载体或根据第二方面的系统，其用于治疗或诊断。

由于本发明的噬菌体载体具有靶向特异性和转导效率，因此可用于治疗种类繁多的疾病。因此，本发明能够为宿主细菌提供两个自互补转基因表达盒，这些表达盒在宿主细菌中制造噬菌体颗粒的过程中杂交形成双链转基因表达盒，这一特性可显著拓展重组噬菌体在基因治疗中的治疗应用前景。本发明可以预防性地用于疾病的预防，也可在疾病发生后用于改善和/或治疗疾病。

因此，在第八方面，提供了根据第一方面的噬菌体载体或根据第二方面的系统，用于基因治疗技术。

在第九方面，提供了一种使用基因治疗技术治疗、预防或改善受试者疾病的方法，该方法包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的根据第一方面的噬菌体载体或根据第二方面的系统。

应当理解，本发明可用于构建多种不同的噬菌体载体，这些载体可根据其自身性质及所显示的外源蛋白用于治疗和/或诊断多种疾病。例如，在噬菌体载体包含肿瘤靶向配体和/或包含表达抗肿瘤基因(如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因)的转基因的实施方式中，该载体可与更昔洛韦(GCV)联合用于治疗癌症。基因治疗技术中的靶细胞优选为真核细胞，更优选为哺乳动物细胞。

因此，该基因治疗技术优选用于治疗、预防或改善癌症。肿瘤可能位于脑部，例如髓母细胞瘤、胶质母细胞瘤或弥漫性内生性脑桥胶质瘤(DIPG)。该噬菌体载体可与常规治疗联合使用，例如化疗药物(即阿霉素、替莫唑胺、洛莫司汀)、放射治疗、免疫检查点抑制剂(即PD-1、PD-L1或CTLA4抑制剂)或其他药物/外源性化合物，包括但不限于组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC抑制剂)、蛋白酶体抑制药物以及来自天然和膳食来源的抗癌产物(例如染料木黄酮)。

发明人认为，本发明的噬菌体载体在递送肽和/或DNA和/或佐剂疫苗方面具有重要的商业价值。

因此，在第十方面，提供了一种疫苗，其包含根据第一方面的噬菌体载体或根据第二方面的系统。

在第十一方面，提供了根据第一方面的噬菌体载体或根据第二方面的系统，用于将疫苗递送至受试者。

优选地，该疫苗为肽疫苗。该疫苗优选为DNA疫苗。该疫苗优选包含合适的佐剂。在一个实施方式中，噬菌体载体可用于携带编码抗原的转基因或DNA盒(即至少两个单链自互补转基因表达盒，其杂交形成一个双链转基因表达盒)，以刺激机体的免疫系统。噬菌体载体还可用于在主要pVIII外壳蛋白上直接显示和表达目标抗原，从而为同时递送提供一个高效的平台，可通过单个噬菌体颗粒同时递送多种抗原(作为疫苗DNA疫苗)、蛋白质或易于在噬菌体表面表达的佐剂。受试者可为哺乳动物，且优选为人。

因此，在第十二方面，提供了根据第一方面的噬菌体载体或根据第二方面的系统，用于将外源抗原靶向递送至疫苗受试者的肿瘤。

首先将动物接种外来抗原疫苗，或动物已接种过所用抗原的疫苗，然后向已接种疫苗的动物施用肿瘤靶向载体，以将外来抗原递送至肿瘤部位，从而诱导针对这些肿瘤的免疫攻击。

发明人还认为，本发明的噬菌体载体还可用于多种不同的遗传-分子成像技术，例如正电子发射断层扫描(PET)、超声(US)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、功能磁共振成像或生物发光成像。

因此，在第十三方面，提供了一种根据第一方面的噬菌体载体或根据第二方面的系统在遗传分子成像技术中的用途。

噬菌粒颗粒携带的转基因可编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)和/或钠/碘共转运体(NIS)，且该颗粒优选与放射性标记的底物联合使用。例如，人钠/碘共转运体(NIS)成像基因优选与I¹²⁴联合用于临床适用的正电子发射断层扫描(PET)成像，或与I^125/99mTc高锝酸盐联合用于临床适用的SPECT成像。

或者，HSVtk基因优选与放射性标记的核苷类似物联合使用，例如20-[18F]-氟-20-脱氧-1-b-D-阿拉伯呋喃糖基5-乙基尿嘧啶([18F]FEAU)。

应当理解，根据本发明的噬菌体载体和系统(以下称为“试剂”)可用于药物中，该药物可用于单一疗法，或作为已知疾病(如癌症)治疗、改善或预防疗法的辅助手段，或与这些已知疗法联合使用。例如，一种将本发明的噬菌体颗粒和系统与现有的化疗药物(如替莫唑胺、阿霉素或染料木黄酮)联合使用的治疗方法是优选的。

在另一个优选的实施方式中，治疗可包括将本发明的噬菌体载体和系统与细胞外基质降解剂(如酶或氯沙坦)联合使用。发明人认为，细胞外基质降解剂应能增强噬菌体载体在受治的受试者体内的扩散，尤其是在实体瘤内的扩散。

本发明的试剂(即第一方面的噬菌体载体或第二方面的系统)可配制成多种不同形式的组合物，具体取决于该组合物的使用方式。因此，例如，该组合物可以是粉末、片剂、胶囊、液体等形式，或者是可施用于需要治疗的人或动物的任何其他合适形式。应当理解，本发明药物的载体应是受治的受试者能够良好耐受的载体。

包含本发明的试剂的药物可通过多种方式使用。例如，可能需要口服给药，在这种情况下，试剂可包含在组合物中，该组合物可通过口服摄入，例如以片剂、胶囊或液体形式。包含本发明的试剂的组合物可通过吸入(如经鼻吸入)给药。组合物也可配制成局部用制剂，例如，可涂抹于皮肤的乳膏或软膏。

本发明的试剂还可以纳入缓释或延迟释放装置中。例如，此类装置可植入皮肤表面或皮下，药物可在数周乃至数月内持续释放。该装置至少可放置在治疗部位附近。当需要长期使用本发明的试剂进行治疗，且通常需要频繁给药(例如至少每日注射)时，这类装置可能尤为有利。

在一个优选的实施方式中，本发明的试剂和组合物可通过注射到血流中或直接注射到需要治疗的部位来施用于受试者。注射方式包括静脉内(推注或输注)、皮下(推注或输注)、皮内(推注或输注)、腹腔内注射，或通过对流增强给药(适用于疾病部位的局部注射)。

应当理解，试剂的所需用量取决于其生物活性和生物利用度，而这又取决于给药方式、试剂(即噬菌体载体或系统)的理化性质，以及其是用于单一疗法还是联合疗法。给药频率还会受到试剂在受治的受试者体内半衰期的影响。最佳给药剂量可由本领域技术人员确定，且会因所用特定药剂、药物组合物的浓度、给药方式以及疾病的进展情况而有所不同。取决于特定受治受试者的其他因素，包括受试者的年龄、体重、性别、饮食和给药时间，也会需要调整剂量。

通常，本发明的试剂的每日剂量可在0.01μg/kg体重至500μg/kg体重之间。更优选地，每日剂量在0.01μg/kg体重至400μg/kg体重之间，进一步优选在0.1μg/kg体重至200μg/kg体重之间。

该试剂可在疾病发作前、发作期间或发作后施用。例如，可在受试者发病后立即施用该试剂。每日剂量可通过全身给药一次(如每日一次注射)的方式施用。或者，该药剂可能需要在一天内施用两次或更多次。举例来说，该药剂可按每日两次(或根据所治疗疾病的严重程度增加次数)、每次25mg至7000mg的剂量施用(即假设体重为70千克)。接受治疗的患者可在醒来时接受第一剂，然后在晚上接受第二剂(若为每日两次给药方案)，或在第一剂后每3小时或4小时接受一次。此外，也可使用缓释装置向患者提供本发明的试剂的最佳剂量，而无需重复给药。

已知的规程，例如制药行业常规采用的规程(如体内实验、临床试验等)，可用于制备包含本发明所述载体或系统的特定制剂，以及制定精确的治疗方案(如试剂的每日剂量和给药频率)。

因此，在本发明的第十四方面，提供了一种药物组合物，其包含根据第一方面的噬菌体载体或根据第二方面的系统，以及药学上可接受的载体。

该组合物可用于对受试者的任何可通过基因疗法治疗的疾病(如癌症)进行治疗性改善、预防或治疗。

本发明在第十五方面还提供了一种制备根据第十二方面的药物组合物的方法，该方法包括使治疗有效量的根据第一方面的噬菌体载体或根据第二方面的系统与药学上可接受的载体接触。

“受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物或家畜。因此，本发明的试剂、组合物和药物可用于治疗任何哺乳动物，例如家畜(如马或狗)、宠物，或可用于其他兽医应用中。然而，最优选地，受试者是人。

“治疗有效量”的试剂(即噬菌体载体)是指当施用于受试者时，治疗目标疾病或产生预期效果(例如实现转基因向靶细胞或靶组织的有效递送，进而实现肿瘤杀伤等)所需的药物剂量。

例如，所用试剂的治疗有效量可以为约0.01mg至约800mg，优选为约0.01mg至约500mg。

本文中所指的“药学上可接受的载体”是本领域技术人员已知的、可用于配制药物组合物的任何已知化合物或已知化合物的组合。

在一个实施方式中，药学上可接受的载体可以是固体，相应的组合物可以为粉末或片剂形式。固体的药学上可接受的载体可包含一种或多种物质，这些物质还可起到调味剂、润滑剂、增溶剂、助悬剂、染料、填充剂、助流剂、压缩助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、包衣剂或片剂崩解剂的作用。该载体也可以是包囊材料。在粉末中，载体是一种细分的固体，与根据本发明的细分活性药剂混合。在片剂中，活性药剂(例如本发明的颗粒或系统)可按适当比例与具有必要压缩性能的载体混合，并压制成所需的形状和大小。粉末和片剂优选含有高达99％的活性药剂。合适的固体载体包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糖类、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一个实施方式中，药用载体可以是凝胶，且组合物可以为乳膏等形式。

然而，药用载体也可以是液体，相应的药物组合物呈溶液形式。液体载体可用于制备溶液、混悬液、乳剂、糖浆、酏剂和加压组合物。根据本发明的颗粒或体系可溶解或悬浮于药学上可接受的液体载体中，如水、有机溶剂、二者的混合物或药学上可接受的油类。液体载体可包含其他合适的药用添加剂，如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、助悬剂、增稠剂、色素、黏度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。适合口服和注射用的液体载体的实例包括水(部分含有上述添加剂，如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇类(包括一元醇和多元醇，如二醇类)及其衍生物，以及油类(如分馏椰子油和花生油)。对于注射给药，载体还可以是油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯等油性酯类。无菌液体载体可用于制备供注射用的无菌液体组合物。加压组合物的液体载体可以是卤代烃或其他药学上可接受的抛射剂。

无菌溶液或混悬液形式的液体药物组合物可通过例如肌内注射、鞘内注射、硬膜外注射、腹腔内注射、静脉注射，特别是皮下注射的方式使用。该载体或体系可制备为无菌固体组合物，在给药时可使用无菌水、生理盐水或其他合适的无菌注射介质将其溶解或混悬。

本发明的噬菌体载体、体系及药物组合物可经口服给药，其形式可为含有其他溶质或助悬剂(例如，足以使溶液等渗的生理盐水或葡萄糖)、胆盐、阿拉伯胶、明胶、失水山梨醇单油酸酯、聚山梨酯80(山梨糖醇及其酐类与环氧乙烷共聚而成的油酸酯)等的无菌溶液或混悬液。本发明的颗粒和体系也可通过口服给药，形式可为液体或固体组合物。适合口服给药的组合物包括固体形式(如丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂和散剂)和液体形式(如溶液剂、糖浆剂、酏剂和混悬剂)。可用于胃肠外给药的形式包括无菌溶液剂、乳剂和混悬剂。

应当理解，腺相关病毒(AAV)通常是基因治疗的首选载体。作为基因递送载体，慢病毒载体相较于其他系统也具有几个关键优势。首先，其具有较大的包装容量，至少可容纳8Kb的DNA，当包装包含组织特异性启动子和转基因的大型表达盒时，这是一项重要特性。其次，慢病毒载体不仅在基因组结构上与结构较简单的逆转录病毒不同，而且能够转导非分裂细胞，在考虑将其作为基因治疗载体应用于肌肉、神经元和造血干细胞等非增殖组织时，这一特性非常有用。此外，与腺病毒载体相比，慢病毒载体的免疫原性更低，这使得全身性给药途径具有可行性。然而，AAV或慢病毒在实验室研究和临床研究中应用的障碍包括其极高的生产成本和较低的产量。

除了在基因治疗、成像和疫苗递送方面体现出实用价值外，本发明的噬菌体载体还可用于在体外或体内(包括原位)生产重组病毒载体，如AAV或慢病毒。噬菌体介导的AAV生产利用了噬菌体载体能够包装大量单链DNA(ssDNA)的能力。典型的AAV生产系统包含三个主要元件：重组腺相关病毒(rAAV)、rep-cap基因以及腺病毒辅助基因，这些元件共同作用以产生rAAV颗粒。

因此，在第十六方面中，提供了一种根据第一方面的噬菌体载体或根据第二方面的系统的用途，用于产生重组病毒载体，该重组病毒载体包含或衍生自噬菌体载体的基因组内的病毒基因组。

在第十七方面，提供了一种产生重组病毒载体的方法，该方法包括将根据第一方面的噬菌体载体或根据第二方面的系统引入真核宿主细胞，使该宿主细胞能够产生重组病毒载体。

优选地，重组病毒载体是重组哺乳动物病毒、rAAV、重组自互补AAV载体或重组慢病毒载体。换言之，重组病毒载体可以是常规AAV载体或根据第一方面的自互AAV载体。优选地，根据第一方面的噬菌体载体或根据第二方面的系统被用于与真核宿主细胞内生产哺乳动物病毒所需的、由噬菌体载体的基因组决定的其他遗传元件的递送和/或存在一起，以顺式和/或反式发挥作用。用于辅助或增强噬菌粒颗粒向宿主细胞转移基因的方法包括WO2014/184528(即多功能)和WO 2014/184529(即与阳离子聚合物结合形成具有净正电荷的复合物)中所述的方法。

真核宿主细胞可以是哺乳动物细胞。该宿主细胞可包含或衍生自人胚肾细胞(HEK293)、草地贪夜蛾蛹卵巢组织细胞(Sf9)或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。昆虫细胞也在考虑范围内。

在一个实施方式中，宿主细胞可通过一种或多种噬菌体载体基因组进行转化，这些基因组携带的基因选自包含以下的组：rAAV基因、慢病毒基因、衣壳基因、复制基因、辅助蛋白编码基因，以及哺乳动物病毒表达和包装所需的任何其他基因。

例如，在噬菌体载体介导的rAAV/scAAV的产生中，rAAV基因或scAAV序列可由根据第一方面的噬菌体载体携带，而腺病毒辅助基因和rep-cap基因可由单独的载体携带，或整合到真核宿主基因组中。rAAV、rep-cap和腺病毒辅助基因的任意组合均可由一种或多种载体携带，即呈顺式或反式构型。或者，在rAAV的产生中，rep-cap蛋白或腺病毒辅助蛋白也可作为稳定表达的辅助DNA(如质粒)整合到真核宿主中或导入真核宿主，此时噬菌体载体提供重组病毒基因组，以便包装成重组病毒，具体由噬菌体载体基因组内的转基因表达盒决定。

该方法可在体内、体外、离体或原位进行。对于原位产生，噬菌体载体优选包含针对作为指定真核宿主的靶真核细胞的靶向部分。优选地，在原位、离体和体内病毒生产中，指定的真核宿主细胞类型为病变细胞。优选地，病变细胞为恶性肿瘤细胞或良性肿瘤细胞。在体外病毒生产中，真核宿主优选为上述所列任何一种真核宿主的衍生物。噬菌体载体以及产生重组病毒所需的遗传元件(由噬菌体载体中的转基因表达盒决定)在真核宿主细胞内的应用方式可如前文所述，既可以是顺式作用组合，也可以是反式作用组合。

应当理解，本发明延伸至基本上包含本文所提及的任一序列的氨基酸或核酸序列的任何核酸、肽或其变体、衍生物或类似物。术语“基本上是该氨基酸/多核苷酸/多肽序列”“功能变体”和“功能片段”，指的是与本文所提及的任一序列的氨基酸/多核苷酸/多肽序列具有至少40％序列一致性的序列，例如与本文所定义的核酸具有40％的序列一致性。

本发明还涵盖与本文所提及的任一序列具有更高序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列，具体而言，序列同一性大于65％，更优选大于70％，进一步优选大于75％，更进一步优选大于80％。优选地，所述氨基酸/多核苷酸/多肽序列与本文所提及的任一序列具有至少85％的同一性，更优选至少90％的同一性，进一步优选至少92％的同一性，更进一步优选至少95％的同一性，再进一步优选至少97％的同一性，更优选至少98％的同一性，最优选至少99％的同一性。

本领域技术人员应懂得如何计算两条氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的序列一致性百分比。要计算两条氨基酸/多核苷酸/多肽序列的序列一致性百分比，首先必须对这两条序列进行对齐，然后再计算序列一致性数值。两条序列的一致性百分比可能会因以下因素而呈现不同数值：-(i)所使用的序列对齐方法，例如ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman(在不同程序中实现)，或基于三维结构比较的结构比对；-(ii)对齐方法所使用的参数，例如局部对齐与全局对齐、所使用的配对评分矩阵(如BLOSUM62、PAM250、Gonnet等)，以及空位罚分，如函数形式和常数。

完成序列对齐后，计算两条序列之间的百分比一致性有许多不同的方法。例如，可以用一致位点的数量除以以下任一数值：(i)较短序列的长度；(ii)对齐的长度；(iii)两条序列的平均长度；(iv)非空位位点的数量；或者(v)排除突出端后的等效位点数量。此外，值得注意的是，百分比一致性还与序列长度密切相关。因此，一对序列越短，由于偶然因素导致的序列一致性就可能越高。

因此，应当理解的是，蛋白质或DNA序列的精确对齐是一个复杂的过程。常用的多序列对齐程序ClustalW(Thompson等人，1994年，《Nucleic Acids Research》，第22卷，第4673-4680页；Thompson等人，1997年，《Nucleic Acids Research》，第24卷，第4876-4882页)是本发明中生成蛋白质或DNA多序列对齐的优选方法。适用于ClustalW的参数如下：对于DNA比对：Gap Open Penalty＝15.0,Gap Extension Penalty＝6.66,Matrix＝Identity。对于蛋白质比对：Gap Open Penalty＝10.0,Gap Extension Penalty＝0.2,Matrix＝Gonnet。对于DNA和蛋白质比对：ENDGAP＝-1,GAPDIST＝4。本领域技术人员应当知晓，为获得最佳的序列对齐结果，可能需要调整这些参数及其他参数。

优选地，两条氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比一致性是根据这样的对齐结果，通过(N/T)×100来计算的，其中N是两条序列具有相同残基的位置数量，T是所比较的位置总数，包括空位，且可以包括或不包括突出端。优选地，计算中应包含突出端。因此，计算两条序列之间相对百分比一致性的一种最优选方法包括：(i)使用ClustalW程序，采用一组合适的参数(例如上述参数)进行序列比对；(ii)将N和T的值代入以下公式：序列一致性＝(N/T)×100。

本领域技术人员将熟知用于鉴定相似序列的替代方法。例如，高度相似的核苷酸序列可由在严格条件下与本文所述核酸序列或其互补序列杂交的序列编码。严格条件是指，核苷酸在约45℃下与滤膜结合的DNA或RNA在3倍氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在约20-65℃下用0.2倍SSC/0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)至少洗涤一次。或者，高度相似的多肽与本文所示序列相比，其氨基酸差异可至少为1个，但少于5个、10个、20个、50个或100个。

由于遗传密码的简并性，显然任何核酸序列都可以发生变化或改变，而基本上不影响其编码的蛋白质序列，从而产生其功能变体。合适的核苷酸变体是指那些序列中因编码同一氨基酸的不同密码子替换而改变的变体，从而产生同义突变。其他合适的变体是那些具有同源核苷酸序列，但包含全部或部分序列，这些序列因编码氨基酸的不同密码子替换而改变，且所替换的氨基酸与被替换氨基酸具有相似的生物物理性质侧链，从而产生保守性突变。例如，小的非极性、疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性、疏水性氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此，应当理解哪些氨基酸可以被具有相似生物物理性质的氨基酸替代，并且本领域技术人员会知晓编码这些氨基酸的核苷酸序列。

本文所描述的所有特征(包括任何所附权利要求、摘要和附图)，以及/或者所公开的任何方法或过程的所有步骤，均可与上述任何方面以任意组合方式结合，但至少部分此类特征和/或步骤相互排斥的组合除外。

附图说明

为了更好地理解本发明，并且为了说明本发明的实施方式如何实施，将通过实施例并参考附图来示出，其中：

图1示出了现有技术中源自M13噬菌体的单链DNA载体的DNA构建体示意图，即腺相关病毒/噬菌体(“AAVP”)和现有技术中的噬菌粒腺相关病毒(“PAAV”)载体，并与本发明的新型自互补噬菌体颗粒(“自互补噬菌体”，以下称为“自互补噬菌体颗粒”或“scPhagemid”)进行了对比，该新型自互补噬菌体颗粒可以是M13或AAV。在本发明中，携带两个单链自互补的转基因表达盒的噬菌粒被用作DNA骨架，以诱导宿主细菌中转基因盒的杂交，随后产生双链转基因盒，以便由噬菌体衣壳包装。“噬菌粒”的定义是一种包含噬菌体复制起点的质粒DNA，因此得名噬菌粒。在此，发明人使用噬菌粒作为DNA骨架来设计携带两个转基因盒的新型噬菌体基因组。所产生的双链载体是一种噬菌体颗粒。现有技术中的AAVP包含完整的噬菌体基因组和单个哺乳动物转基因盒，该转基因盒两侧是源自AAV2病毒的ITR序列(6)。另一方面，现有技术中的PAAV颗粒基于噬菌粒设计，其中包含单个转基因盒，并且在生产过程中需要辅助噬菌体来提供结构基因(8)。与之相比，根据本发明的最新一代噬菌体载体(即“自互补噬菌体颗粒”或“scPhagemid”)，与AAVP和PAAV相比，携带了一种额外的转基因盒。这两个表达盒是相同的，由来自AAV的ITR连接子分隔，但方向相反，即第一表达盒沿5'至3'方向延伸，而第二表达盒沿3'至5'方向延伸，如图1所示。可以看到，这些表达盒是相同的，但在将它们分隔开的ITR两侧沿相反或反平行方向延伸。还包含第二AAV ITR，位于一个转基因表达盒的侧翼。与PAAV的情况相同，辅助噬菌体为“单链互补噬菌体”提供结构基因，使其能够复制。

图2示出了本发明的单链自互补噬菌粒“scPhagemid”或“scPP”如何使ITR连接子两侧的两个互补转基因表达盒之间发生杂交，从而产生类似于发夹环结构的转基因表达盒双链DNA(dsDNA)。

图3示出了用于构建携带互补转基因表达盒的噬菌粒骨架的克隆策略，该噬菌粒骨架用于制备递送绿色荧光蛋白(GFP)的scPP。使用含有PciI限制性酶切位点的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)从一个噬菌粒中扩增出从启动子到多聚腺苷酸(poly A)信号的完整GFP转基因表达盒。然后将该插入片段克隆到同一噬菌粒的PciI酶切位点中。最终的噬菌粒包含两个互补的GFP转基因表达盒和两个AAV2-ITR，一个左侧ITR连接两个转基因表达盒，另一个右侧ITR位于一个表达盒的侧翼。可以看到，这些表达盒是相同的，但在左侧ITR的两侧沿相反或反平行方向延伸，并且ITR连接子两侧的两个互补转基因表达盒之间可以发生杂交，从而形成双链DNA。

图4显示了用靶向RGD4C.scPP(即根据本发明形成双链DNA发夹环结构的噬菌体载体)或RGD4C.PAAV载体(即用作对比对照的单链噬菌体载体)转导后第5天，B16-F1细胞的绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。A)使用荧光显微镜对细胞进行显微成像；B)通过流式细胞术分析对GFP阳性细胞进行定量。

图5总结了用于评估基因递送效率的构建体，即PAAV、scPP(根据本发明的噬菌体载体)和cwPP。PAAV展示了一种噬菌体载体，其具有一个由AAV ITR侧翼包围的表达盒拷贝，scPP展示了本发明的噬菌体颗粒载体，其具有两个方向相反的表达盒，其会形成双链DNA，而cwPP展示了一种对照噬菌体颗粒，其携带两个方向相同的Lucia转基因表达盒，即顺时针方向(cw)，使得这些表达盒无法杂交形成双链DNA。实验使用了携带报告基因Lucia或绿色荧光蛋白(GFP)的颗粒，以及携带治疗基因肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素15(IL15)和TRAIL的颗粒。

图6比较了靶向RGD4C.scPP-Lucia(即本发明的噬菌体载体)和靶向RGD4C.PAAV-Lucia在B16-F1黑色素瘤细胞中的Lucia基因表达情况。使用了不同剂量的载体：25000、50000、100000、500000和10⁶转导单位(TU)/细胞来转导细胞。误差线表示平均标准误差(SEM)。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行每天及每个构建体的统计分析，随后进行选定的多重比较：对双链载体和单链载体进行成对比较。实验中还纳入了用缺乏RGD4C的非靶向载体(scPP-Lucia或PAAV-Lucia)处理的细胞以及未处理的细胞。数据以相对发光单位(RLU)表示。实验重复了多次，至少有n＝5次生物学重复，每次生物学重复有n＝3个技术重复。

图7证实了在100000TU/细胞的条件下，scPP载体(即根据本发明的噬菌体载体)在B16-F1细胞中相较于由两位不同研究人员制备的单链PAAV批次具有优越性。

图8示出了使用剂量为10⁶TU/细胞的载体，对B16-F1细胞进行四次实验所得的数据的示例。

图9示出了在不同剂量下B16-F1黑色素瘤细胞中Lucia基因表达的比较，与图6中类似。误差线表示平均标准误差(SEM)。采用单因素方差分析进行第天及每个构建体的统计分析，随后进行选定的多重比较：对双链载体和单链载体进行成对比较。实验中还纳入了用缺乏RGD4C的非靶向载体scPP或PAAV处理的细胞以及未处理的细胞。数据以相对发光单位(RLU)表示。实验重复了多次，至少有n＝5次生物学重复，每次生物学重复有n＝3个技术重复。

图10示出了在不同剂量(100000、500000和10⁶TU/细胞)下，人源HEK293细胞中Lucia基因表达的比较。误差线表示平均标准误差(SEM)。采用单因素方差分析进行每天及每个构建体的统计分析，随后进行选定的多重比较：对双链载体和单链载体进行成对比较。实验中还纳入了用缺乏RGD4C的非靶向载体scPP或PAAV处理的细胞以及未处理的细胞。数据以相对发光单位(RLU)表示。实验重复了多次，至少有n＝5次生物学重复，每次生物学重复有n＝3个技术重复。

图11示出了在100000、500000和10⁶TU/细胞的剂量下，横纹肌肉瘤(RMS)转移癌细胞中Lucia基因表达的比较。误差线表示平均标准误差(SEM)。采用单因素方差分析进行每天及每个构建体的统计分析，随后进行选定的多重比较：对双链载体和单链载体进行成对比较。实验中还纳入了用缺乏RGD4C的scPP或PAAV处理的细胞以及未处理的细胞。数据以相对发光单位(RLU)表示。实验重复了多次，至少有n＝5次生物学重复，每次生物学重复有n＝3个技术重复。

图12示出了在500000和10⁶TU/细胞的条件下，人A549肺癌细胞中Lucia基因表达的比较。误差线代表标准误(SEM)。采用单因素方差分析进行每天及每个构建体的统计分析，随后进行选定的多重比较：对双链载体和单链载体进行成对比较。实验中还纳入了用缺乏RGD4C的非靶向载体scPP或PAAV处理的细胞以及未处理的细胞。数据以相对光单位(RLU)表示。实验重复了多次，至少有n＝5次生物学重复，每次生物学重复有n＝3个技术重复。

图13示出了另一位研究人员在100000和10⁶TU/细胞的条件下对人A549肺癌细胞Lucia基因表达数据的验证结果。

图14示出了在100000TU/细胞的条件下，人MCF7乳腺癌细胞中Lucia基因表达的比较。误差线代表标准误(SEM)。采用单因素方差分析进行每天及每个构建体的统计分析，随后进行选定的多重比较：将双链载体与单链载体进行成对比较。实验中还纳入了用缺乏RGD4C的非靶向载体scPP或PAAV处理的细胞以及未处理的细胞。数据以相对光单位(RLU)表示。实验重复了多次，至少有n＝5次生物学重复，每次生物学重复有n＝3个技术重复。

图15示出了B16-F1细胞经scPP(即本发明所述的噬菌体载体)或携带TNFα基因的PAAV转导后第4天(D4)和第6天(D6)分泌型TNFα的ELISA定量结果，转导剂量分别为500000(500k)、1×10⁶(1M)或4×10⁶(4M)TU/细胞。采用单因素方差分析进行每天及每个构建体的统计分析，随后进行选定的多重比较：将双链载体与单链载体进行成对比较。实验中还纳入了用缺乏RGD4C的非靶向载体scPP或PAAV处理的细胞以及未处理的细胞。

图16示出了B16-F1细胞经携带IL15基因的RGD4C.scPP(即本发明所述的噬菌体载体)或RGD4C.PAAV转导后第4天分泌型IL15的ELISA定量结果，转导剂量分别为500000(500k)、10⁶(1M)和4×10⁶(4M)TU/细胞。采用单因素方差分析进行每天及每个构建体的统计分析，随后进行选定的多重比较：将双链载体与单链载体进行成对比较。实验中还纳入了用缺乏RGD4C的非靶向载体(M13)处理的细胞以及未处理的细胞。

图17示出了B16-F10黑色素瘤细胞经携带IL15基因的RGD4C.scPP(即本发明所述的噬菌体载体)或RGD4C.PAAV转导后第4天分泌型IL15的ELISA定量结果，转导剂量分别为500000(500k)、10⁶(1M)和4×10⁶(4M)TU/细胞。采用单因素方差分析进行每天及每个构建体的统计分析，随后进行选定的多重比较：将双链载体与单链载体进行成对比较。实验中还纳入了用缺乏RGD4C的非靶向载体scPP或PAAV处理的细胞以及未处理的细胞。

图18示出了人骨肉瘤细胞经携带分泌型TRAIL基因的RGD4C.scPP(即本发明所述的噬菌体载体)或RGD4C.PAAV以500000TU/细胞转导后第4天分泌型TRAIL的ELISA定量结果。实验中还纳入了经空RGD4C.scPP载体(无TRAIL基因载体或称模拟载体)处理的细胞以及未处理的细胞。此外，还使用了携带跨膜型TRAIL的RGD4C.scPP载体(RGD4C.scPP-TRAIL)对细胞进行转导。

图19比较了在免疫缺陷小鼠中，经静脉注射5×10¹⁰TU/只的RGD4C.scPP(即本发明所述的噬菌体载体)和RGD4C.PAAV载体后，对皮下实体瘤(人骨肉瘤)的基因递送情况。在载体注射后第7天收集肿瘤和健康组织。实验中还纳入了缺乏RGD4C的非靶向载体scPP或PAAV处理的小鼠以及未处理的小鼠。

图20示出了噬菌体在基质胶(Matrigel)中的扩散情况。scPP和PAAV载体用异硫氰酸荧光素(FITC)标记，并以5mg/ml的浓度接种到基质胶中。在接种时(t＝0)和接种18小时后(t＝18)，通过荧光显微镜拍摄图像。

图21示出了B16-F1细胞中噬菌体颗粒的内化情况。A)使用抗噬菌体抗体对细胞进行的流式细胞术(FACS)分析；B)使用针对载体中位于转基因表达盒外部的氨苄青霉素基因的引物进行的定量聚合酶链反应(qPCR)。

图22比较了scPP(即本发明所述的噬菌体载体)与对照载体cwPP和awPP的转导效率。A)所用三种载体的示意图：ITR以蓝色表示，转基因及其方向也已标注。B)用编码Lucia的载体转导B16F1细胞，剂量为10⁶TU/细胞。该图示出了具有代表性的实验结果(n＝3)，此实验重复了两次，数据为转导后第4天的发光检测值。采用单因素方差分析来分析统计差异，显著性水平设为α＝0.05。

图23比较了scPP(即本发明所述的噬菌体载体)与cwPP和awPP混合载体的转导效率。A)转导过程及可能的杂交情况示意图：ITR以蓝色表示，转基因及其方向也已标注。B)用编码Lucia的载体转导B16F1细胞，剂量为10⁶TU/细胞，或用剂量为5×10⁵TU/细胞的cwPP与剂量为5×10⁵TU/细胞的awPP的混合载体进行转导。该图示出了具有代表性的实验结果(n＝3)，此实验重复了两次，数据为转导后第4天的发光检测值。采用单因素方差分析来分析统计差异，显著性水平设为α＝0.05。

图24示出了基于透射电子显微镜(TEM)图像的噬菌体颗粒测量结果。A)不同噬菌体颗粒的透射电子显微镜图像。B)噬菌体颗粒的大小量化结果。每种噬菌体颗粒均对两个不同的储备液进行成像，且每种噬菌体共量化100个颗粒。采用单因素方差分析来计算四个样本间的统计差异，图中仅显示无统计学差异的成对比较。

图25示出了对scPP、PAAV和辅助噬菌体载体的颗粒大小的测定分析。A)对每种载体均分析了两种不同的制备物，并从获得的透射电子显微镜(TEM)图像中总共测量了100个颗粒。B)在非变性条件下，将完整的噬菌体颗粒上样到琼脂糖凝胶中。

图26示出了在细菌中生产scPP(即本发明所述的噬菌体载体)过程中转基因表达盒的自杂交情况。A)假设情况的示意图。展示了scPP基因组的假设性分子内杂交形式。这种形式会在转基因内部(橙色方框)形成一个可被BamHI酶切的双链DNA靶标。酶切后的基因组应产生一个1898bp的双链DNA片段，该片段若经变性处理，会形成一条3796bp的单链DNA条带。B)BamHI消化和未消化的scP-Lucia基因组样品之间的比较。C)变性的1kb Plus DNA阶梯(ladder)的迁移分析：将1kb Plus DNA阶梯和线性化的pAAV GFP质粒(5378bp)的等分试样，以其天然形式和变性形式在1M尿素变性琼脂糖凝胶中进行电泳。当阶梯样品变性后，5000bp的DNA阶梯条带会转变为双条带。D)scPP-Lucia噬菌体基因组形成双链DNA片段能力的验证：将噬菌体基因组经BamHI酶切后得到的1898bp片段，分别以天然形式(左侧)和变性形式(右侧)与经相同处理的1kb Plus DNA阶梯一同进行电泳。变性后的样品与DNA阶梯中4000bp条带的迁移速度一致。

图27示出了羟基脲(hydroxyurea，HU)对PAAV载体基因表达的抑制作用。A)在羟基脲存在的条件下，用载体转导B16-F1细胞后，Lucia基因表达的时间曲线。B)同时进行了对照实验，即细胞接受的是水而非羟基脲。C)该图显示在羟基脲存在的情况下，B16-F1细胞转导后第6天的Lucia基因表达数据。D)该图显示在无羟基脲存在的情况下，转导后第6天的Lucia基因表达数据。

图28示出了在1天至3天的时间内，随着载体剂量的增加，PAAV和scPP向转移性人骨肉瘤143B细胞递送Lucia报告基因的效果比较。Lucia的表达以相对发光单位(RLU)表示。载体通过RGD4C配体靶向肿瘤细胞，非靶向载体(NT)作为对照。

图29示出了PAAV和scPP向转移性人骨肉瘤143B细胞递送分泌型细胞因子TRAIL(即可溶性TRAIL，sTRAIL)的效果比较。图中为酶联免疫吸附测定(ELISA)数据，用于量化经载体处理后癌细胞培养基中的sTRAIL蛋白的释放量。

图30示出了在体外条件下，经编码分泌型sTRAIL的scPP-sTRAIL处理后，骨肉瘤细胞死亡的诱导情况。

图31示出了毒性评估结果。施用编码sTRAIL的RGD4C.scPP载体后，已建立骨肉瘤的小鼠的毒性生物标志物乳酸脱氢酶(LDH)未出现升高。

图32示出了在已建立骨肉瘤的荷瘤小鼠中，经全身给予编码sTRAIL的PAAV和scPP载体后，sTRAIL递送的生物分布情况。

图33示出了经编码sTRAIL的RGD4C.PAAV和RGD4C.scPP处理后，肿瘤中sTRAIL蛋白表达的免疫荧光染色结果。在接受RGD4C.scPP处理的小鼠肿瘤中，检测到更高水平的sTRAIL产生。

图34示出了肿瘤的苏木精和伊红染色结果：与未处理组小鼠或注射非靶向NT载体的小鼠相比，经全身给予RGD4C.scPP-sTRAIL处理的小鼠，显示广泛肿瘤损伤。

具体实施方式

实施例

发明人旨在提供一种新型噬菌体载体，其包含转基因表达盒的自互补序列，以在宿主细菌中生产期间或转导哺乳动物细胞时实现杂交，进而递送哺乳动物转基因表达盒的双链DNA。这种新型噬菌体载体解决了双链噬菌体因衣壳和庞大基因组带来的相关问题，同时也克服了与AAVs相关的问题。在各实施例中，这种新型噬菌体载体被称为自互补噬菌体颗粒或scPP。为证明scPP的基因递送效果优于现有技术，发明人使用了绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶等报告基因。随后，发明人通过TRAIL或可溶性TRAIL(sTRAIL)进一步验证研究结果，以证明scPP颗粒在基因递送方面具有出人意料的优异表现。此外，当使用TRAIL等基因时，发明人还观察到癌细胞死亡，这表明该载体可用于递送治疗性基因。

材料和方法

构建体的分子克隆

通过PCR从pAAV-GFP质粒(Cell Biolabs公司)中扩增了从启动子到多聚腺苷酸化信号的绿色荧光蛋白(GFP)转基因表达盒，其侧翼为AAV2 ITR，所用引物包含PciI限制性位点。然后用PciI(英国NEB公司)酶切质粒骨架和PCR插入片段，并用T4连接酶(英国NEB公司)连接过夜。将构建体转化至DH5α大肠杆菌(E.coli)中。随后，通过小量提取试剂盒(Miniprep，Qiagen公司)从不同细菌菌落中提取质粒，并通过限制性酶切和DNA测序(Eurofins公司)进行验证。将正确的克隆转化至TG1 Mix&Go感受态大肠杆菌(美国Zymoresearch公司)中，以产生噬菌体载体。克隆策略的示意图见图3。为了生成携带TNFα、TRAIL或IL15转基因的噬菌体颗粒，用相应的DNA编码序列替换GFP。

噬菌体生产

用载体的骨架DNA构建体转化TG1 Mix&Go感受态大肠杆菌(美国Zymo Research公司)。双串联载体(编码两个同向转基因拷贝的对照噬菌体颗粒，方向可为顺时针(cw)或逆时针(aw))在2xYT培养基中培养，直至600nm处的吸光度(OD_600nm)达到0.3-0.6，这一数值表明细菌处于指数生长期。此时，用相应的辅助噬菌体(无论是显示RGD4C的靶向噬菌体还是非靶向(NT)M13噬菌体)感染细菌培养物，并在37℃下孵育15分钟。孵育后，将培养物加入含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml羧苄青霉素的2xYT培养基中，在32℃、160rpm的条件下培养过夜。次日，将培养物在4℃、6000g的条件下离心15分钟。收集上清液，与0.4倍体积的21mM聚乙二醇(PEG，分子量8000)/3.36M氯化钠/1％曲拉通X-100混合，于4℃放置过夜。然后，将该溶液在4℃、10000g的条件下离心30分钟。将沉淀重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中，与0.5倍体积的21mM聚乙二醇(PEG)/3.36M氯化钠(NaCl)混合，于4℃放置过夜。接着，在4℃、10000g的条件下再离心30分钟，通过在37℃、120rpm的条件下轻轻振荡3小时将沉淀重悬于PBS中。在室温、10000g的条件下离心10分钟去除重悬沉淀中残留的细菌污染，所得上清液经0.45μm滤器过滤。随后，通过PCR检测pIII衣壳蛋白基因中是否存在RGD4C编码序列，以验证所制备噬菌体的靶向性纯度，并进一步通过2％琼脂糖凝胶进行分析。

噬菌体颗粒的滴定

在原核宿主中对噬菌体颗粒进行定量。将噬菌体在PBS中进行系列稀释，用于感染在2xYT培养基中生长至对数期的TG1大肠杆菌，随后在37℃下孵育。在37℃水浴中孵育20分钟后，将噬菌体/细菌混合物再次充分混合，并将其涂布在含选择性抗生素的固体琼脂培养基上。由于噬菌体颗粒含有氨苄青霉素抗性基因，因此使用了含100μg/ml氨苄青霉素的TYE顶层琼脂。而辅助噬菌体含有卡那霉素抗性基因，因此使用了含50μg/ml卡那霉素的TYE顶层琼脂。通过将细菌涂布在含氨苄青霉素的TYE顶层琼脂上，可通过菌落计数确定样品中scPP颗粒的浓度；涂布在含卡那霉素的培养基上，则可确定辅助噬菌体的浓度。噬菌体颗粒的浓度以细菌转导单位TU/μl表示。

自互补噬菌体颗粒(scPP)中转基因表达盒的分子内自杂交

首先用DNAse-I处理scPP，然后提取其基因组。简而言之，用100mM Tris-HCl、25mMEDTA pH8处理样品，加入4％十二烷基硫酸钠(SDS)，在70℃下孵育10分钟以裂解噬菌体衣壳。随后，向样品中加入pH 5.5的3M醋酸钾，在室温、12000g的条件下离心10分钟，使噬菌体衣壳蛋白沉淀。用0.1M醋酸钠(pH5.0)、0.6M氯化钠、0.15％(v/v)Triton X-100平衡阴离子交换柱(Qiagen Midiprep试剂盒)。将离心后的上清液上样至柱中，依靠重力流使溶液流出。然后用0.1M醋酸钠(pH5.0)、825mM氯化钠洗涤柱两次，再用QF洗脱缓冲液(Qiagen)洗脱样品。所得样品经异丙醇-乙醇沉淀进一步纯化，最后重悬于TE缓冲液(Qiagen)中。

提取的噬菌体基因组浓度按单链DNA样本进行计算(1个OD₂₆₀单位＝33μg/ml单链DNA)。随后，用BamHI(英国NEB公司)酶切基因组，并进行琼脂糖凝胶电泳。通过凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)回收2000bp条带，并用异丙醇-乙醇沉淀。将提取的DNA条带和1kb PlusDNA阶梯(Thermo Fisher公司)的等分试样与含0.5mg/ml溴酚蓝、8M尿素、1％(v/v)TritonX-100和1mM Tris pH 8的溶液混合。将每个样本(提取的条带和阶梯)各取一半，在80℃下变性5分钟。随后，将DNA阶梯和提取的条带的变性与未变性形式上样至变性的1M尿素1.2％琼脂糖凝胶中，在冰浴条件下以55V电压电泳4小时。凝胶在含0.5μg/μl溴化乙锭的TAE缓冲液中室温染色2小时。

由于DNA阶梯的分子量参照条带在天然和变性条件下的迁移行为不同，因此使用了额外的对照来确认这些参照条带的迁移情况。为此，将线性化的scPP-GFP质粒(5378bp)的变性样本与DNA阶梯在尿素变性凝胶中并排电泳。

细胞转导与Lucia表达

将贴壁细胞接种到合适规格的孔板/组织培养皿中，确保接种后48小时细胞汇合度达到70-80％。在转导当天，测定每个孔/培养皿中的平均细胞数，用于计算需加入细胞的噬菌体颗粒量。随后制备转导混合物，将适量的噬菌体颗粒储备液稀释到无血清培养基中，充分混合。每个孔/培养皿使用的转导混合物推荐体积为刚好完全覆盖细胞单层的最小体积。转导时，弃去原有培养基，向细胞中加入转导混合物，在37℃、5％ CO₂条件下孵育6-12小时，之后补充等体积的完全培养基。24小时后，弃去全部培养基，更换为新鲜培养基。将转导后的细胞维持在培养物中直至进行分析。

培养基中分泌荧光素酶表达的定量

在用携带Lucia DNA序列的噬菌体颗粒转导后的特定时间点，从各孔中收集10μL培养基，转移至不透明的96孔板中。使用QUANTI-Luc定量荧光素酶活性，根据制造商的方案(法国Invivogen公司)制备荧光素酶底物，并将其加入孔板中。使用GloMax Discover微孔板发光检测仪(英国Promega公司)测定荧光素酶活性。在这些实验中，各时间点均未更换培养基。

转导细胞中的GFP表达

对经scPP-GFP转导的细胞及其转导比例，通过FACS或荧光显微镜进行分析。

透射电子显微镜(TEM)

将涂覆有碳膜的铜网格进行辉光放电处理以增强亲水性。将噬菌体颗粒滴加至铜网格上，孵育10-15分钟后，用吸水纸吸去多余液体。随后，用无菌过滤的去离子水冲洗铜网格，并用吸水纸吸干，重复两次，干燥15分钟。在铜网格上滴加1％乙酸双氧铀溶液对颗粒进行负染色，30秒后，用无菌过滤的去离子水冲洗两次并干燥。使用扫描电子显微镜(英国的JEOL JEM-2010)对铜网格进行成像，并通过ImageJ软件进行分析。

噬菌体的琼脂糖凝胶分析

通过纳米分光光度计(Nanodrop)分析噬菌体储备液，确定30μg的噬菌体样品。将这些样品与2x上样缓冲液(126mM Tris-HCl，pH 6.8，15％Type 400和0.002％溴酚蓝)按1:1比例混合，上样至0.8％琼脂糖凝胶中。样品在50V电压下电泳5小时，随后用10％乙酸和50％甲醇溶液固定凝胶过夜。次日，用考马斯亮蓝染色液对凝胶染色3小时，再用20％甲醇和5％乙酸溶液脱色过夜。通过BioRad凝胶成像仪检测条带。

噬菌体颗粒的荧光染料标记

噬菌体颗粒用用FITC标记。将50mL噬菌体颗粒(总量为5×10¹¹TU)加入200μL含5mg/mL FITC(英国Sigma公司)的溶液中，在室温、避光条件下旋转混合1小时。随后，加入终浓度为25-30％的PEG/NaCl溶液，在4℃下过夜沉淀噬菌体颗粒。将溶液以13000rpm离心15分钟，收集噬菌体颗粒沉淀。沉淀用250μL PBS重悬后，再次用PEG/NaCl沉淀，重复操作直至游离的FITC被完全去除。最后，将FITC偶联的噬菌体颗粒重悬于PBS中，并通过大肠杆菌感染及菌落计数法测定其滴度。

噬菌体颗粒的基质胶扩散

将200μl浓度为2.5mg/ml的Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤基质胶(英国Sigma公司)加入48孔板中，随后转移至37℃环境中。同时，制备浓度为5μg/ml的FITC标记颗粒。将5μl每种颗粒溶液吸入凝胶上样吸头中，将吸头固定插入基质胶内，让颗粒进行扩散。此后分别在0小时和18小时，使用荧光显微镜(日本尼康Eclipse TE2000U)拍摄荧光图像，并通过Openlab成像软件进行分析。

颗粒内化

使用1×10⁶TU/细胞或5×10⁵TU/细胞的FITC标记噬菌体颗粒转导细胞。转导后6小时，用PBS洗涤细胞，然后在冰上用2mg/ml的冰浴链霉蛋白酶处理10分钟使细胞脱落。使用20％胎牛血清(FBS)终止链霉蛋白酶的作用，在室温下以200g离心5分钟。沉淀用20％胎牛血清重悬后再次离心。沉淀用4％多聚甲醛重悬，在室温下孵育10分钟。孵育后，细胞在室温下以300g离心5分钟，并用含0.1％皂素和2％牛血清白蛋白(BSA)的溶液在室温下封闭30分钟。细胞在室温下以300g离心5分钟，沉淀用含0.1％皂素和1％牛血清白蛋白的PBS溶液稀释的兔抗fd噬菌体抗体(sigma 086k4860；1:1000稀释)处理，在室温下孵育1小时。孵育后，细胞以相同条件离心，并用含0.1％皂素和1％牛血清白蛋白的PBS洗涤，重复洗涤3次。随后，用含0.1％皂素和1％牛血清白蛋白的PBS溶液稀释的山羊抗兔AlexaFluor-647(Invitrogen 21245；1:500稀释)标记细胞，在室温下避光孵育1小时。细胞用含0.1％皂素的PBS洗涤两次，最后重悬于PBS中。

接下来，对细胞内的噬菌体颗粒进行流式细胞术分析。使用配备氩离子激光(488nm)和红色二极管激光(635nm)的BD FACscalibur流式细胞仪(BD Biosciences)进行FACS检测。对每个三重复孔中至少10000个门控细胞测量其平均荧光强度和百分比。使用FACScalibur软件对细胞群进行门控和分析。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

向样品中加入上样染料(Laemmli缓冲液和β-巯基乙醇)，然后上样至4-15％的mini-PROTEAN TGX Stain-Free^TM凝胶中。10x Tris-甘氨酸-SDS(Sigma公司)用作为电泳缓冲液，NEB蛋白质彩色标准品作为蛋白质阶梯(protein ladder)。

辅助噬菌体污染的测定

将噬菌体样品用DNAse-I在37℃下预处理30分钟。随后，用50mM EDTA在65℃下孵育10分钟使DNAse-I失活；在含1％ SDS的条件下，在95℃下加热10分钟以裂解噬菌体衣壳。将温度以3℃为梯度逐步降至23℃后，使用1％ Triton X-100结合SDS，并将样品用DEPC水按1:250稀释。使用scPAAV和辅助噬菌体质粒(作为标准品)得到浓度范围为2×10⁸至2×10³个质粒/μL的标准曲线。

肿瘤坏死因子α(TNFα)酶联免疫吸附测定(ELISA)

用噬菌体颗粒转导细胞，转导24小时后更换为新鲜的完全培养基。在转导后第4天收集条件培养基，更换为新鲜培养基，并在转导后第6天再次收集条件培养基。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

使用小鼠IL15 DuoSet ELISA试剂盒(英国R&D Systems公司)对转导后上清液中IL15的产生量进行定量。

按照制造商的说明，使用ELISA MAX^TM标准套装试剂盒对条件培养基中的肿瘤坏死因子α(TNFα)浓度进行定量。

对于TRAIL ELISA，我们用捕获抗体包被平板。接下来，用洗涤缓冲液(含0.05％吐温20的PBS)洗涤平板两次，并加入含1％ BSA的PBS在室温下封闭1小时。用洗涤缓冲液洗涤平板两次，将样品加入平板中，在室温下孵育2小时。接下来，将检测抗体在室温下孵育1小时。然后，向每孔中加入抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶D(avidin-HRP D)，随后加入底物溶液。

结果

实施例1-构建用于两个自互补转基因表达盒杂交的DNA骨架

参照图1和图2，其中展示了已知的腺相关病毒/噬菌体(“AAVP”)载体(左侧)以及已知的噬菌粒腺相关病毒(“PAAV”)载体(中间)的示意图，两者均衍生自单链M13丝状噬菌体。AAVP包含完整的噬菌体基因组和一种单一的哺乳动物转基因表达盒，该表达盒两侧带有源自AAV2病毒的ITR序列；而PAAV基于噬菌粒设计，其中包含两侧带有ITR的单一转基因表达盒，且在生产过程中需要辅助噬菌体提供结构基因。AAVP和PAAV存在一个问题：在处理哺乳动物细胞时，这两种载体递送的是转基因表达盒的单链DNA，该单链DNA必须转化为双链DNA才能发生基因表达和转导。这一过程依赖于哺乳动物细胞因子，效率不高，导致基因表达起始延迟，且随着时间推移，基因递送的增加缓慢且效率较低。

发明人先前发现，用两种携带哺乳动物转基因表达盒互补序列的噬菌体载体转导细胞，并未增强基因递送。因此，发明人尝试在单个噬菌体载体中提供转基因表达盒的互补序列(图1)，换言之，即设计一种同时携带转基因表达盒及其互补序列的噬菌体载体，以在以下期间诱导杂交：(i)在细胞转导时，或(ii)在细菌宿主中生产和制备期间(图2)。

图1和图2(右侧)示出了用于本发明的噬菌体生产的单链(SS)自互补噬菌粒骨架(“自互补噬菌体颗粒或scPP”)。实际上，该自互补噬菌粒骨架使两个单链自互补的转基因表达盒能够杂交并形成双链转基因表达盒。AAVP和PAAV仅包含一个表达盒拷贝，而本发明的scPP与AAVP以及PAAV相比，携带了一个额外的转基因表达盒。这两个表达盒完全相同，由一个反向末端重复序列(ITR)连接子分隔，但它们的序列读取方向相反，即第一表达盒沿5’至3’方向延伸，而第二表达盒则沿3’至5’方向延伸，如图1所示。如图2所示，本发明的噬菌粒使ITR连接子两侧的两个自互补转基因表达盒之间能够发生杂交，从而形成类似发夹环结构的双链DNA。另一AAV ITR被包含在内，以侧接其中一个转基因表达盒。

为避免环状噬菌体基因组可能对双链DNA形成过程产生影响，发明人使用了噬菌粒而非噬菌体，以去除噬菌体基因组，仅保留f1复制起点，使转基因表达盒能在细菌中复制并被包装(图1和图2)。由于不存在噬菌体基因组，需使用辅助噬菌体感染细菌，以提供编码包装所需衣壳蛋白的结构基因(图1和图2)。噬菌体对哺乳动物细胞无嗜性，因此，为使载体能够进入细胞，发明人在辅助噬菌体上展示了一种双环RGD4C配体(图1和图2)，该配体已被广泛表征并用于噬菌体介导的基因递送。这种配体通过与主要在癌细胞表面表达的αvβ3整合素异二聚体受体结合，使噬菌体能够进入哺乳动物细胞。发明人使用RGD4C/αvβ3作为配体-受体系统，以证明这一新平台技术的概念可行性。

在这种新颖的设计中，两个互补的哺乳动物转基因表达盒通过源自AAV2的ITR连接(图1和图2)。发明人还加入了第二ITR，使其侧接亲本转基因表达盒，以在细胞转导时对其进行保护，并提高其随时间推移的持久性(图1和图2)。

实施例2-与PAAV相比，scPP显示出基因传递的显著增加

在第一组实验中，发明人试图研究新设计的噬菌体载体(scPP)的基因递送情况，以验证scPP载体在哺乳动物细胞中的表现是否优于相应的单链噬菌体载体对照(PAAV)。因此，发明人将scPP与PAAV的基因表达进行了平行比较。为转导细胞，发明人构建了靶向肿瘤的噬菌体颗粒，该颗粒在丝状M13KO7辅助噬菌体的pIII基因中显示了双环RGD4C。RGD4C配体可与αvβ3整合素异二聚体受体结合，该受体在肿瘤细胞和肿瘤血管上高表达，而在健康组织上几乎检测不到。该配体已被广泛用于使M13噬菌体载体进入哺乳动物细胞。实验中还纳入了不含RGD4C的非靶向载体，并将其加入细胞中作为阴性对照。

首先，发明人使用了表达绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的载体(图3)，并处理了小鼠黑色素瘤B16-F1细胞，因为该细胞表达RGD4C配体的αvβ3受体。转导后第4天，对GFP表达的显微镜分析显示，经RGD4C.scPP-GFP转导的B16-F1肿瘤细胞中GFP大量产生，明显高于经RGD4C.PAAV-GFP处理的细胞(图4A)。此外，通过流式细胞术对GFP表达的分析显示，RGD4C.scPP-GFP诱导的GFP表达具有剂量依赖性，在10⁶TU/细胞时，GFP阳性细胞比例超过35％；相比之下，RGD4C.PAAV-GFP在10⁶TU/细胞时，GFP阳性细胞比例不足5％(图4B)。重要的是，在经不含RGD4C配体的非靶向噬菌体颗粒(NT)处理的细胞中，未检测到GFP表达，这证明靶向颗粒的基因递送对表达整合素的细胞具有选择性，且由RGD4C配体介导(图4B)。

接下来，为验证这些数据，发明人使用携带编码分泌型高斯荧光素酶(Lucia)报告基因的颗粒，对基因递送进行了全面的定量分析(8,16)(图5)。通过分析生长培养基中的荧光素酶活性来量化基因表达。发明人测试了不同剂量的颗粒，并在几天的时间内评估基因表达情况。此外，发明人收集了一组来自不同物种和不同组织学来源的肿瘤细胞系，以排除所观察到的RGD4C.scPP的基因递送效率具有物种特异性或组织学特异性的可能性。转导实验使用了小鼠黑色素瘤B16-F1细胞、B16-F10细胞以及RMS转移性黑色素瘤细胞。发明人还纳入了人MCF7乳腺癌细胞、A549肺癌细胞以及人骨肉瘤细胞。此外，发明人在人胚肾HEK293细胞上测试了这些载体，因为该细胞已被广泛用于常规基因递送、病毒和非病毒转导以及DNA转染实验，且此前也被用作噬菌体介导的基因递送的标准体外模型。数据显示，在所有测试剂量下，RGD4C.scPP颗粒的基因表达最早在处理后1天至2天即可检测到，并随时间逐渐增加(图6-图14)。相比之下，RGD4C.PAAV的基因表达起始延迟，且在所有测试的时间点、剂量和细胞系中，其表达量始终显著低于RGD4C.scPP(图6-图14)。作为对照的非靶向颗粒未显示任何基因表达(图6-图14)。这些发现表明，所观察到的基因表达增强可能是由于更早的诱导、更多成功转导的细胞，或者可能是这两个并非互斥的事件共同作用的结果。

最后，为证实scPP在基因递送方面的这种优势不仅限于报告基因，即GFP或Lucia，还可应用于治疗性基因，发明人构建了携带肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素15(IL15)这两种细胞因子的载体，这些细胞因子用于癌症免疫治疗(8)。噬菌体转导后，通过ELISA检测细胞培养基中这两种细胞因子的蛋白表达水平。类似地，数据显示，与PAAV相比，新设计的scPP颗粒在细胞培养基中表达的TNFα和IL15水平均显著更高(图15-图17)。发明人还构建了携带另一种细胞因子——肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的载体，并再次证实，与经PAAV处理的人骨肉瘤细胞相比，scPP在人骨肉瘤细胞上清液中产生的TRAIL水平显著更高(图18)。

实施例3-全身给药后对小鼠实体瘤的体内基因递送比较

为将这些发现转化到体内研究中，发明人对向荷瘤小鼠静脉给药后scPP和PAAV的基因递送情况进行了比较。发明人使用了递送TRAIL的载体，并向已建立人皮下异种移植物(骨肉瘤)的免疫缺陷小鼠注射该载体。为此，按先前用于噬菌体载体的剂量，向荷瘤小鼠施用5×10¹⁰TU/只，随后通过逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)鉴定肿瘤中TRAIL mRNA转录本的表达(图19)。还在荷瘤小鼠中对scPP与PAAV进行了平行的生物分布研究，以分析肿瘤与主要内脏器官中的基因递送情况。开展这些生物分布实验是为了确保，在静脉施用RGD4C.scPP颗粒后，基因表达对小鼠体内已建立的肿瘤具有选择性，而在健康组织中无表达(健康组织中的表达可能导致脱靶效应)。与注射RGD4C.PssAAV的小鼠相比，在注射RGD4C.scPP的小鼠肿瘤中，检测到的TRAIL mRNA转录本表达显著更高(图19)。此外，健康组织中的TRAIL表达微不足道，与对照组相似，这表明RGD4C.scPP能高效且全身性地靶向肿瘤，同时不影响其他主要内脏器官。非靶向颗粒在肿瘤或所研究的任何器官中均未显示出显著表达。

实施例4-转基因表达机制的研究

为了解scPP介导的转基因表达的分子机制及其优于PAAV的原因，发明人研究了颗粒在处理哺乳动物细胞后的胞外和胞内去向，并在基因递送的各个步骤中对scPP与PAAV进行了平行比较。

通过细胞外基质(ECM)的扩散

使用FITC标记的颗粒及其在基质胶支持物中的迁移能力评估扩散效率(图20)。两种构建体之间未检测到明显差异，这表明它们通过细胞外基质(ECM)的扩散特征相似。这与先前的研究所报道的一致，即M13噬菌体载体的扩散由颗粒大小决定(8)。实际上，对scPP和PAAV的细胞外基质分析显示，这两种颗粒在尺寸上没有差异。

内化

接下来，发明人试图研究噬菌体进入被转导细胞的情况。为此，对B16-F1细胞进行转导，并在转导后6小时采用两种不同方法进行处理。第一种方法是，用抗fd噬菌体抗体对颗粒进行染色，通过流式细胞术进行定量(图21A)。第二种方法是，提取DNA并以噬菌粒中存在的氨苄青霉素基因为靶标，通过qPCR进行定量(图21B)。两种颗粒之间再次未检测到差异。

实施例5-scPP基因递送效率的提高并非由于存在两个转基因表达盒

由于两种载体在细胞外基质扩散和细胞进入方面未显示任何差异，为进一步深入了解scPP与PAAV之间差异背后的机制，发明人研究了scPP的基因递送优势是否因其携带了一个额外的转基因表达盒而产生。因此，发明人构建了一种对照载体，该载体包含两个拷贝的转基因表达盒，但方向相同，均为顺时针(cw)，以避免任何序列互补性和杂交。该载体被命名为顺时针噬菌体颗粒或cwPP(图22A)。为考虑两个转基因表达盒的特定方向可能产生的任何潜在影响，构建了第二个对照载体，其中两个转基因表达盒均为逆时针(aw)方向，命名为awPP(图22A)。随后，将scPP与对照载体进行平行转导，结果显示scPP载体的效率优于cwPP和awPP这两种对照(图22B)。此外，为研究在不同载体中提供的互补转基因序列之间的分子间杂交是否能达到与scPP相当的效率，发明人用cwPP和awPP载体进行了同步转导(图23A)。尽管这种同步转导的效率高于单独使用cwPP和awPP，但仍低于scPP(图23B)。总体而言，这些数据表明，观察到的scPP载体效率的提高与其实现成功分子内杂交的能力相关。

实施例6-颗粒尺寸

cPP与PAAV颗粒在扩散和内化方面的相似性表明，这两种颗粒的尺寸没有差异，与最近的报道一致(8)。因此，发明人推测，scPP应能包装压缩的基因组，从而形成与PAAV颗粒尺寸相似的颗粒。作为初步研究，发明人通过透射电子显微镜(TEM)对scPP和PAAV颗粒进行了分析，并对单个噬菌体颗粒的长度进行了量化(图24)。还对辅助噬菌体进行了分析，以帮助识别scPP和PAAV制剂中的辅助噬菌体群。重要的是，TEM成像显示scPP与PAAV颗粒的尺寸极为接近(图24)。为进一步证实这些发现，发明人还通过电镜分析了cwPP颗粒的大小，发现与scPP相比，cwPP载体的尺寸有所增加(图24)。通过对完整噬菌体颗粒进行琼脂糖凝胶电泳，平行验证了上述结果(图25)。

综上所述，这些发现表明scPP是一种比PAAV更高效的载体。由于在扩散和细胞进入方面未检测到差异，这种差异很可能与其不同的基因组设计有关。两种载体的颗粒尺寸相似也支持这一点，这可能是因为自互补噬菌体颗粒(scPP)包装了更紧凑的基因组，而这可能是两个互补转基因表达盒之间发生自杂交的结果。实际上，编码两个同向转基因表达盒拷贝的对照颗粒无法达到scPP的转导效率，这一事实表明，双转基因表达盒负载的存在并非直接导致效率提升的原因(无论是单独存在还是联合存在)，反而支持在噬菌体生产过程中形成双链DNA转基因表达盒的自杂交，是scPP具有优势的背后机制。

实施例7-scPP衣壳包装双链转基因DNA表达盒

为证实scPP基因组能够形成双链DNA结构并能以双链DNA形式被噬菌体衣壳包装，发明人从噬菌体衣壳/颗粒中提取了scPP基因组，然后用BamHI进行消化，BamHI是一种双链DNA消化酶，其靶序列位于转基因表达盒内。换言之，BamHI的成功消化只能在双链DNA存在的情况下发生(图26A)。正如预期的那样，在消化后的样品中检测到一条1898bp的条带，而在未消化的对照中未检测到该条带(图26B)。为进一步证实该条带确实是由单一单链DNA分子自杂交产生的，发明人推测，在导致DNA解杂交的变性条件下，该分子会展开，并以3796kb的条带形式迁移(图26A)。

在变性条件下，5000bp的DNA阶梯条带产生了两条不同的条带(由于其互补链的分离)(图26C)，这表明4000bp的参照条带对应于变性阶梯中的第六条带。正如假设的那样，提取的条带在变性形式下，预计长度为3796bp，其迁移速度与变性阶梯中4000bp条带的迁移速度大致相同(图26D)。

这些发现提供了有力的证据，表明噬菌体衣壳在细菌中生产期间包装了双链DNA转基因表达盒，这是由于在宿主细菌中制备scPP期间，其两个互补的转基因表达盒发生自杂交所致。

实施例8-scPP颗粒在转导哺乳动物细胞时递送双链转基因表达盒

接下来，发明人试图研究scPP载体是否能递送双链转基因表达盒，且该表达盒在转导和基因表达过程中不需要宿主细胞合成转基因表达盒的互补链。实际上，发明人推测，如果这些载体在进入哺乳动物细胞时能递送双链转基因表达盒，那么就可以省去宿主细胞DNA合成在转导中所起的作用。

发明人比较了scPP-Lucia载体和PAAV-Lucia在B16-F1细胞中的表现，这些细胞在转导前24小时用羟基脲(HU)预处理以抑制宿主细胞DNA合成。转导后继续以相同浓度不间断地进行羟基脲处理，并持续到检测Lucia表达为止。重要的是，与传统的单链噬菌体载体(PAAV)不同，DNA复制抑制剂羟基脲并未影响scPP载体的转导(图27)。与之相比，羟基脲抑制了PAAV的基因表达(图27)。这些数据表明，scPP的转导不依赖于DNA合成，进而也不依赖于转基因表达盒从单链到双链的转化。

实施例8-Lucia报告基因递送的比较

参考图28，示出了在人转移性骨肉瘤143B细胞中，PAAV与scPP的Lucia报告基因递送情况比较，时间范围为处理后第1天至第3天，所用载体剂量逐渐增加。在转导后第1天和第2天，对照组(未处理组和非靶向组)未观察到Lucia基因的表达。然而，在转导后第1天，在500000和1000000TU/细胞剂量下，RGD4C.scPP处理组可观察到Lucia基因的表达，而PAAV处理组则未观察到。这证实了自互补scPP载体在转基因即时表达方面的有效性。在转导后第2天和第3天，在100000至1000000TU/细胞剂量下，RGD4C.scPP处理组的Lucia表达水平高于RGD4C.PAAV处理组。

方法：

将143B细胞以96孔板形式接种，以便在接种48小时后达到60-70％的汇合度。在转导当天计算每孔或每培养板的平均细胞数量，并以此为依据计算需加入培养体系的携带分泌型荧光素酶(Lucia)基因的肿瘤靶向性RGD4C-PAAV或scPP颗粒的量。携带相同基因的非靶向(NT)噬菌体以及未处理的细胞被用作对照。随后，将适量的颗粒储备液在含10％血清的DMEM培养基中稀释，并充分混合以制备转导混合物。转导混合物的浓度范围为每细胞100000至1000000转导单位(TU)。每孔所用转导混合物的建议体积为能完全覆盖细胞单层的最小量(50ul)。转导24小时后，向培养基中补充含10％血清的DMEM培养基至150uL。转导后的细胞继续培养，直至进行分析(从第1天到第3天)。

为评估和定量基因表达，对于携带分泌型荧光素酶报告基因的噬菌体(PAAV或scPP)颗粒，在转导后的每一天，取10μl培养基来检测荧光素酶活性：将样品与25μlQUANTI-Luc^TM试剂(美国InvivoGen公司)混合5分钟，然后用Navigator微孔板发光检测仪(美国Promega公司)进行检测，积分时间为0.1秒。

实施例9-向人转移性骨肉瘤143B细胞递送分泌型细胞因子sTRAIL的比较

参考图29，示出了在用PAAV或scPP DNA构建体转染的人转移性骨肉瘤143B细胞的培养基中，sTRAIL基因的表达情况。未处理的细胞和经转染试剂处理的细胞被用作对照。通过TRAIL ELISA试剂盒检测sTRAIL蛋白的水平(pg/ml)。该实验进行了三次生物学重复。统计学分析采用独立t检验、单因素方差分析和Tukey's HSD事后检验。所有结果均以平均值±标准误(SEM)表示。***P<0.01，****P<0.001。数据显示，用scPP-sTRAIL DNA构建体转染的细胞在培养基中表达的sTRAIL水平高于用PAAV-sTRAIL DNA构建体转染的细胞。

方法：

将143B细胞接种到6孔形式的培养板中，以在培养24小时达到80％的汇合度。转染前，将培养基更换为低血清培养基(Opti-MEM，英国Thermofisher公司)，持续2小时。转染混合物的制备方法为，在低血清培养基中，将2μg PAAV-sTRAIL或scPP-sTRAIL DNA构建体与6μlHD(英国Promega公司)混合。该混合物在室温下孵育20-25分钟。接下来，将混合物逐滴加入到含有低血清培养基和细胞的培养板中。之后，将细胞放回培养箱中培养48小时。最后，收集培养基，通过ELISA定量TRAIL水平。*sTRAIL＝分泌型TRAIL。上清液中分泌的sTRAIL水平采用人TRAIL/TNFSF10 DuoSet ELISA试剂盒(英国R&D systems公司)检测。检测操作按照制造商的规程进行。

实施例10-编码分泌型sTRAIL的scPP-sTRAIL处理后在体外诱导骨肉瘤细胞死亡

参考图30，示出了RGD4C.scPP-sTRAIL颗粒处理组具有剂量依赖性更低的细胞活力。数据以相对于未处理细胞的细胞活力百分比表示。该实验进行了三次生物学重复。统计学分析采用单因素方差分析和Tukey's HSD事后检验。所有结果均以平均值±标准误(SEM)表示。**P<0.05。

方法：

将143B细胞接种到6孔形式的培养板中，以在接种48小时后达到60-70％的汇合度。在转导当天计算每孔的平均细胞数量，并以此为依据计算需加入培养物中的携带分泌型TRAIL(sTRAIL)基因的肿瘤靶向性RGD4C.scPP颗粒的量。携带相同基因的非靶向(NT)噬菌体以及未处理的细胞被用作对照。随后，将适量的颗粒储备液在含10％血清的DMEM培养基中稀释，并充分混合以制备转导混合物。转导混合物的浓度范围为每细胞500000至1000000转导单位(TU)(在图表中分别显示为0.5和1.0)。每孔所用转导混合物的建议体积为能完全覆盖细胞单层的最小量(1ml)。转导24小时后，向培养基中补充含10％血清的DMEM培养基至2mL。转导后的细胞继续培养3天。通过细胞活力测定评估细胞死亡情况。

CellTiter-Glo发光细胞活力测定：向含有转导细胞的培养孔中的培养基中加入等体积的CellTiter-Glo试剂(英国Promega公司)，然后在轨道振荡器上混合两分钟以诱导细胞裂解。接下来，让混合物在室温下孵育10分钟，使发光信号稳定，随后转移至读板发光仪中。使用GloMax Navigator微孔板发光检测仪(英国Promega公司)检测信号。

实施例11-毒性评估。小鼠体内毒性生物标志物乳酸脱氢酶(LDH)未升高

参考图31，示出了与未处理的小鼠相比，经scPP-sTRAIL和PAAV-sTRAIL颗粒处理的小鼠，其血清LDH水平均未升高。该数据表明，PAAV和scPP用于体内治疗均是安全的。LDH数据以相对于未处理组的相对值表示。该实验进行了三次生物学重复。统计学分析采用单因素方差分析和Tukey's HSD事后检验。本实验中无统计学显著性差异。

方法：

无胸腺小鼠(BALB/c nu/nu，8-10周龄)购自英国查尔斯河实验室。将143B细胞以每只小鼠2×10⁶个细胞的量皮下接种到无胸腺小鼠体内，建立人OS细胞(人骨肉瘤细胞)。在实验的第3天、第5天和第9天，向荷瘤小鼠静脉注射携带sTRAIL基因的靶向(RGD4C)或非靶向(NT)噬菌体(PAAV或scPP)颗粒，剂量为每只小鼠5×10¹⁰TU。实验结束时(第10天)，通过心脏灌流处死小鼠。随后，从心脏采集全血，经1600g离心15分钟制备血清样本。检测血清中的LDH水平，以评估噬菌体处理的毒性。本实验使用CytoTox非放射性细胞毒性检测试剂盒(英国Promega公司)，检测操作按照制造商的规程进行。

实施例12-在已建立骨肉瘤模型的荷瘤小鼠中sTRAIL递送的生物分布

参考图32，数据示出了用携带sTRAIL基因的PAAV或scPP颗粒处理后，小鼠不同器官中人TRAIL基因的相对表达量(相对于未处理组)。RGD4C.scPP-sTRAIL颗粒能最有效地靶向肿瘤并向其递送基因，其次是RGD4C.PAAV-sTRAIL。非靶向颗粒在肿瘤或其他任何器官中均未表现出显著表达。该实验进行了三次生物学重复。统计学分析采用双因素方差分析(two-way ANOVA)及多重比较t检验。所有结果均以平均值±标准误(SEM)表示。***P<0.01。

方法：

无胸腺小鼠(BALB/c nu/nu，8-10周龄)购自英国查尔斯河实验室。将143B细胞以每只小鼠2×10⁶个细胞的量皮下接种到无胸腺小鼠体内，建立人OS细胞。在实验的第3天、第5天和第9天，向荷瘤小鼠静脉注射携带sTRAIL基因的靶向(RGD4C)或非靶向(NT)噬菌体(PAAV或scPP)颗粒，剂量为每只小鼠5×10¹⁰TU。实验结束时(第10天)，通过心脏灌流处死小鼠。收集肿瘤及正常器官，包括肺、肝、脾、心脏、肾、胰腺和脑。从这些器官中提取总RNA，通过逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测人TRAIL的表达。

实施例13-经编码sTRAIL的RGD4C.PAAV和RGD4C.scPP处理后，显示sTRAIL蛋白表达的肿瘤的免疫荧光染色

参考图33，共聚焦显微镜分析显示，仅在经RGD4C.PAAV.sTRAIL和RGD4C.scPP.sTRAIL处理的组的肿瘤中检测到TRAIL表达(绿色)。在scPP处理的肿瘤中观察到更高的TRAIL表达。这些发现表明，RGD4C.scPP.sTRAIL能有效且全面地靶向肿瘤。非靶向(NT)噬菌体颗粒在肿瘤中未表现出明显的TRAIL表达。

方法：

无胸腺小鼠(BALB/c nu/nu，8-10周龄)购自英国查尔斯河实验室。将143B细胞以每只小鼠2×10⁶个细胞的量皮下接种到无胸腺小鼠体内，建立人OS细胞。在实验的第3天、第5天和第9天，向荷瘤小鼠静脉注射携带sTRAIL基因的靶向(RGD4C)或非靶向(NT)噬菌体(PAAV或scPP)颗粒，剂量为每只小鼠5×10¹⁰TU。实验结束时(第10天)，通过心脏灌流处死小鼠。收集肿瘤并进行冷冻切片处理。通过免疫荧光染色检测肿瘤组织中人TRAIL的表达。在组织的最佳切割温度化合物(OCT)冷冻切片(6μm)上，使用抗人TRAIL抗体评估TRAIL的表达。切片在4％多聚甲醛(德国达姆施塔特Merck公司)中于室温固定15分钟。然后，将切片在含0.3％ Triton-X的TBS(Tris缓冲盐溶液)中的5％正常山羊血清中孵育1小时，之后再与一抗(兔抗人TRAIL多克隆抗体，英国Thermo Fisher Scientific公司)孵育。随后，组织切片在含1％过滤牛血清白蛋白和0.3％ Triton-X的TBS中，与Alexa 488偶联的山羊抗兔IgG孵育30分钟。用PBS洗涤三次后，载玻片用Prolong Gold抗荧光淬灭封片剂(英国LifeTechnoligies公司)封片。使用DMi8高级共聚焦荧光显微镜(德国韦茨拉尔LeicaMicrosystems公司)对细胞切片进行成像。

实施例14-经全身治疗后显示肿瘤广泛损伤的肿瘤苏木精-伊红染色

参考图34，示出了肿瘤的苏木精-伊红染色结果，与未处理组小鼠或经非靶向(NT)载体处理的小鼠相比，经RGD4C.scPP-sTRAIL全身治疗后的肿瘤出现了广泛损伤。

方法：

无胸腺小鼠(BALB/c nu/nu，8-10周龄)购自英国查尔斯河实验室。将143B细胞以每只小鼠2×10⁶个细胞的量皮下接种到无胸腺小鼠体内，建立人OS细胞。在实验的第3天、第5天和第9天，向荷瘤小鼠静脉注射携带sTRAIL基因的靶向(RGD4C)或非靶向(NT)噬菌体颗粒(PAAV或scPP)，剂量为每只小鼠5×10¹⁰TU。实验结束时(第10天)，通过心脏灌流处死小鼠。收集肿瘤并处理用于冷冻切片。制备组织的最佳切割温度复合物(OCT)冷冻切片(6μm)，并进行苏木精-伊红染色。

结论

发明人构建了一种新型噬菌体载体，该载体包含转基因表达盒的互补单链序列，以在细胞转导时或在细菌宿主中生产和制造过程中诱导杂交。发明人使用各种细胞系和转基因进行了体外实验，观察到与传统的纯单链DNA噬菌体载体相比，本发明的自互补噬菌体颗粒(scPP)的转导效率惊人地提高(3倍至15倍)。实际上，在所有测试的细胞系中，自互补噬菌体载体均表现出转导起效迅速且转基因表达水平更高的特点。更重要的是，与传统单链噬菌体载体不同，DNA复制抑制剂不会影响自互补噬菌体载体的转导。此外，体内研究表明，与单链DNA噬菌体颗粒相比，全身给药后对小鼠实体瘤的基因递送显著增强。所有这些生物学特性都证明，包含自互补单链DNA的新型丝状噬菌体载体(其通过杂交使转基因盒以双链DNA形式递送)的构建和表征，将为基于噬菌体的基因递送系统的持续发展做出重要贡献。

本文所述的技术具有多种独特特征，包括由M13噬菌体衣壳包装可杂交的自互补单链DNA(即双链DNA)转基因表达盒。此外，与现有技术相比，该系统通过使用两个反向末端重复序列(ITR)而非三个ITR，能够包装大基因组。而且，与现有噬菌体载体相比，该技术可使M13噬菌体在哺乳动物细胞中快速启动基因表达。这也是首次证明可杂交的自互补单链DNA(即双链腺相关病毒，dsAAV)基因组与噬菌体衣壳之间发生杂交。换言之，这是首个由噬菌体衣壳与可杂交的互补单链DNA(即双链重组腺相关病毒，ds-rAAV)组成的杂交载体。此外，这是首次报道具有包装和递送可杂交互补单链DNA转基因盒(即双链转基因盒)的能力，且该转基因盒可在哺乳动物细胞中准备启动基因表达。另外，由于发明人使用了由腺相关病毒反向末端重复序列(AAV ITR)侧翼修饰的转基因盒，这是首次报道显示利用噬菌体衣壳包装双链腺相关病毒DNA(来自可杂交互补单链DNA)并将其递送至哺乳动物细胞，因为其中不存在AAV衣壳。

此外，与现有噬菌体载体相比，本发明的噬菌体载体可使噬菌体在哺乳动物细胞中更快地启动基因表达。而且，双链腺相关病毒(ds AAV)载体的递送成本高昂，而如本发明所述，使用噬菌体衣壳来递送双链腺相关病毒DNA具有很高的成本效益，因为这种递送系统在细菌中生产，利用了原核宿主中噬菌体载体经济高效的生产和纯化过程，该过程与工业规模的反应器和分离系统相兼容。这也有助于扩大生产规模，从而直接降低成本。

发明人使用可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(sTRAIL)来支持其研究结果，证明了自互补噬菌体颗粒(scPP)在基因递送方面的表现出奇地好。例如，当使用诸如TRAIL之类的基因时，发明人证明了癌细胞死亡，这表明scPP载体可用于在体内或体外递送治疗性基因。

发明人认为，这项技术将对噬菌体基因递送领域以及腺相关病毒(AAV)基因治疗和全身递送产生影响。这种递送平台可应用于癌症和其他人类疾病的全身基因治疗，因为噬菌体衣壳对人体组织无靶向性，因此它可以通过噬菌体衣壳上显示的配体全身递送至疾病组织靶向部位，从而使治疗性DNA进入并递送到位。

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Claims

1.一种噬菌体载体，其特征在于，包括：

由连接子分隔的至少两个单链自互补的转基因表达盒，其杂交形成双链转基因表达盒。

2.根据权利要求1所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述噬菌体载体包含包装信号，该包装信号用于使所述至少两个单链自互补的转基因表达盒能够复制，所述转基因表达盒能够在细菌中杂交，随后作为双链转基因表达盒被包装到原核宿主内的所述噬菌体载体中。

3.根据权利要求2所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述包装信号包括噬菌体复制起点，可选地为F1起点。

4.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述噬菌体载体包含细菌复制起点，可选地为pUC起点。

5.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述噬菌体载体包含一个或多个DNA序列，其使得所述噬菌体载体能够靶向整合到宿主基因组中。

6.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述至少两个自互补的转基因表达盒包含病毒转基因表达盒，优选为哺乳动物病毒转基因表达盒。

7.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述至少两个自互补的转基因表达盒包含慢病毒转基因表达盒或腺相关病毒(AAV)转基因表达盒。

8.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述至少两个自互补的转基因表达盒包含编码一种因子的任何核酸，该因子可在靶细胞或组织中具有治疗或工业用途，可选地，其中，所述核酸为DNA、cDNA、RNA、反义RNA或shRNA。

9.根据权利要求8所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，由所述核酸编码的所述因子为多肽或蛋白质。

10.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述至少两个转基因表达盒各自包含启动子，可选地，其中，所述启动子为巨细胞病毒启动子、葡萄糖调节蛋白78启动子、肿瘤特异性启动子或组织特异性启动子。

11.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述至少两个转基因表达盒各自包含用于polyA尾的核酸。

12.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述噬菌体载体包含由连接子分隔的四个单链自互补的转基因表达盒，其杂交形成两个双链转基因表达盒。

13.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述两个单链自互补的转基因表达盒在所述噬菌体载体中以相反的方向定位，优选地，其中，第一转基因表达盒在5'至3'方向延伸，而相应的第二转基因表达盒在3'至5'方向延伸。

14.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述第一转基因表达盒与所述第二转基因表达盒之间的序列一致性百分比至少为65％、70％或75％，或者其中，所述第一转基因表达盒与所述第二转基因表达盒之间的序列一致性百分比至少为80％、85％、90％或95％。

15.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，分隔所述至少两个自互补的转基因表达盒的所述连接子为末端反向重复序列(ITR)。

16.根据权利要求15所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述噬菌体载体包含第二ITR，其中，所述第二ITR位于所述至少两个自互补的转基因表达盒中一个的侧翼。

17.根据权利要求15或16所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述第一ITR和/或所述第二ITR为AAV ITR。

18.根据权利要求15-17中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述噬菌体载体仅包含两个ITR，优选地，其中，所述噬菌体载体包含少于三个ITR。

19.根据权利要求1-14中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，分隔所述至少两个自互补的转基因表达盒的所述连接子是不相关DNA片段，其中，所述连接子与所述第一转基因表达盒以及所述第二转基因表达盒的序列一致性百分比小于50％、45％或40％，优选地小于35％、30％或25％，可选地，其中，所述不相关DNA片段的长度在60bp与300bp之间、在80bp与280bp之间、在100bp与260bp之间、在120bp与240bp之间、在140bp与220bp之间、或是在160bp与200bp之间。

20.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述噬菌体载体包含选择标记，可选地，其中，所述选择标记是氨苄青霉素抗性基因。

21.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述噬菌体载体包含一种或多种衣壳次要外壳蛋白，可选地，其中，所述噬菌体载体包含pIII衣壳次要外壳蛋白，其被配置为显示细胞靶向配体，以使所述载体能够递送至靶细胞；和/或

其中，所述噬菌体载体包含一种或多种衣壳主要外壳蛋白，可选地，其中，所述噬菌体载体包含至少一种pVIII衣壳主要外壳蛋白，其被配置为在其上显示外源肽。

22.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述噬菌体载体包含基因组，该基因组基本上缺失了该载体所源自的噬菌体基因组，可选地，其中，所述噬菌体载体的所述基因组缺失其源自的所述噬菌体基因组的至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％。

23.根据前述权利要求中任一项所述的噬菌体载体，其特征在于：

其中，所述噬菌体载体在其基因组中缺少用于从原核宿主形成、包装或释放颗粒所需的噬菌体结构基因。

24.一种用于从原核宿主产生噬菌体载体的系统，其特征在于，包括：

(i)第一载体，被配置为持续存在于原核宿主内，并且包含由连接子分隔且杂交形成双链转基因表达盒的至少两个单链自互补的转基因表达盒，以及用于使得所述至少两个单链自互补的转基因表达盒能够复制的包装信号；以及

(ii)第二载体，包含核酸，该核酸用于编码包装所述双链转基因表达盒所需的结构蛋白，从而实现所述噬菌体载体在所述原核宿主内的形成和释放。

25.根据权利要求24所述的系统，其特征在于：

其中，所述系统用于产生根据权利要求1-23中任一项所述的噬菌体载体。

26.根据权利要求24或25所述的系统，其特征在于：

其中，所述第一载体包含所述噬菌体载体的基因组。

27.根据权利要求24-26中任一项所述的系统，其特征在于：

其中，所述第一载体的所述包装信号包含噬菌体复制起点，优选为F1起点。

28.根据权利要求24-27中任一项所述的系统，其特征在于：

其中，所述第一载体包含第二复制起点，优选为pUC起点。

29.根据权利要求24-28中任一项所述的系统，其特征在于：

其中，所述第一载体的所述连接子为ITR，优选为AAV ITR。

30.根据权利要求24-29中任一项所述的系统，其特征在于：

其中，所述第二载体是专门设计用于从所述原核宿主中拯救所述第一载体的基因组的噬菌体，优选地，其中，所述第二载体是复制缺陷型的。

31.根据权利要求24-29中任一项所述的系统，其特征在于：

其中，所述第二载体包含被破坏的包装信号，其显著抑制所述第二载体被包装到噬菌体颗粒中的能力，优选地，其中，所述第二载体包含被破坏的复制起点。

32.根据权利要求31所述的系统，其特征在于：

其中，所述被破坏的复制起点是中等复制数起点，可选地，其为p15a，或是低复制数起点，可选地，其为pMB1。

33.根据权利要求24-32中任一项所述的系统，其特征在于：

其中，所述第二载体包含第一核酸序列和/或第二核酸序列，所述第一核酸序列编码pIII衣壳次要外壳蛋白，其被配置为显示细胞靶向配体，以使所述噬菌体载体能够递送至靶细胞，所述第二核酸序列编码至少一种pVIII衣壳主要外壳蛋白，其被配置为在其上显示外源肽。

34.一种从原核宿主产生噬菌体载体的方法，其特征在于，包括：

(i)将第一载体引入原核宿主细胞中，所述第一载体被配置为持续存在于所述原核宿主内，并包含由连接子分隔且杂交形成双链转基因表达盒的至少两个单链自互补的转基因表达盒，以及用于使得所述至少两个单链自互补的转基因表达盒能够复制的包装信号；

(ii)将辅助噬菌体引入宿主，所述辅助噬菌体包含编码噬菌体结构蛋白的核酸；以及

(iii)在产生双链转基因表达盒的条件下培养所述宿主，所述双链转基因表达盒被结构蛋白包装，以使携带所述双链转基因表达盒的噬菌体载体在所述原核宿主中形成并从中释放出。

35.一种从原核宿主产生噬菌体颗粒的方法，其特征在于，包括：

(i)将以下引入原核宿主细胞：(a)第一载体，被配置为持续存在于原核宿主内，并且包含由连接子分隔且杂交形成双链转基因表达盒的至少两个单链自互补的转基因表达盒，以及用于使得所述至少两个单链自互补的转基因表达盒能够复制的包装信号；以及(b)第二载体，包含由核酸编码的、包装所述双链转基因表达盒所需的结构蛋白；以及

(ii)在产生被结构蛋白包装的双链转基因表达盒的条件下培养宿主，以使噬菌体载体在所述原核宿主中形成并从中释放出。

36.一种辅助噬菌体的用途，其特征在于：

所述辅助噬菌体包含编码病毒载体结构蛋白的核酸，用于从原核宿主中产生如权利要求1-23中任一项所述的噬菌体载体。

37.一种宿主细胞，其特征在于，包括：

如权利要求24-33中任一项所述的第一载体和/或第二载体。

38.根据权利要求1-23中任一项所述的噬菌体载体，或根据权利要求24-33中任一项所述的系统，其特征在于，用于作为实验研究工具，可选地，该工具用于离体或体外。

39.根据权利要求1-23中任一项所述的噬菌体载体，或根据权利要求24-33中任一项所述的系统，其特征在于，用于治疗或诊断。

40.根据权利要求1-23中任一项所述的噬菌体载体，或根据权利要求24-33中任一项所述的系统，其特征在于，用于基因治疗技术。

41.根据权利要求40所述的噬菌体载体或系统，其特征在于，其中，所述基因治疗技术用于治疗、预防或管控癌症。

42.一种疫苗，其特征在于，包括：

如权利要求1-23中任一项所述的噬菌体载体或如权利要求24-33中任一项所述的系统。

43.根据权利要求1-23中任一项所述的噬菌体载体，或根据权利要求24-33中任一项所述的系统，其特征在于，用于向受试者递送疫苗。

44.根据权利要求1-23中任一项所述的噬菌体载体，或根据权利要求24-33中任一项所述的系统，其特征在于，用于将外源抗原靶向递送至疫苗受试者的肿瘤。

45.一种如权利要求1-23中任一项所述的噬菌体载体或如权利要求24-33中任一项所述的系统的用途，其特征在于，用于遗传分子成像技术中。

46.一种药物组合物，其特征在于，包括：

如权利要求1-23中任一项所述的噬菌体载体，或如权利要求24-33中任一项所述的系统，以及药学上可接受的载体。

47.一种制备如权利要求46所述的药物组合物的方法，其特征在于，包括：

将治疗有效量的如权利要求1-23中任一项所述的噬菌体载体或如权利要求24-33中任一项所述的系统与药学上可接受的载体接触。

48.一种如权利要求1-23中任一项所述的噬菌体载体或如权利要求24-33中任一项所述的系统的用途，其特征在于，用于产生重组病毒载体，其包含或衍生自所述噬菌体载体的基因组内的病毒基因组。

49.一种产生重组病毒载体的方法，其特征在于，包括：

将如权利要求1-23中任一项所述的噬菌体载体或如权利要求24-33中任一项所述的系统引入真核宿主细胞，使得所述宿主细胞能够产生重组病毒载体。

50.根据权利要求48所述的用途或权利要求49所述的方法，其特征在于：

其中，所述重组病毒载体是重组哺乳动物病毒、rAAV、重组自互补AAV载体或重组慢病毒载体。