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CN120936384A - 掩蔽多肽、可活化细胞因子构建体以及相关组合物和方法 - Google Patents

掩蔽多肽、可活化细胞因子构建体以及相关组合物和方法

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CN120936384A
CN120936384A CN202480024772.0A CN202480024772A CN120936384A CN 120936384 A CN120936384 A CN 120936384A CN 202480024772 A CN202480024772 A CN 202480024772A CN 120936384 A CN120936384 A CN 120936384A
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CN
China
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acc
amino acids
cytokine
seq
polypeptide
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Application number
CN202480024772.0A
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P·库马
蔡娜
E·勒斯科兰
M·M·派敦加特
D·L·丹尼尔
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Cytomx Therapeutics Inc
Original Assignee
Cytomx Therapeutics Inc
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Publication date
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Abstract

本文提供了可活化细胞因子构建体，其包含新型掩蔽部分、细胞因子多肽、以及所述掩蔽部分与所述细胞因子多肽之间的可裂解部分。在一些实施方案中，所述ACC是单体。在一些实施方案中，所述ACC是两个、三个、四个或更多个构建体的复合物。在一些实施方案中，所述ACC是二聚体复合物，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，所述第一单体构建体包含第一细胞因子多肽、第一掩蔽部分和第一二聚化结构域，所述第二单体构建体包含第二细胞因子多肽和/或所述第一细胞因子多肽的激动剂和第二二聚化结构域以及任选的第二掩蔽部分，其中所述第一掩蔽部分和/或所述第二掩蔽部分是所述新型掩蔽部分。

Description

掩蔽多肽、可活化细胞因子构建体以及相关组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2023年4月12日提交的美国临时申请第63/495,754号的优先权权益，所述临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请含有已经以XML格式以电子方式提交并且特此通过引用以其整体并入的序列表。所述XML副本创建于2024年4月12日，命名为“4862-146.xml”，并且大小为819,200字节。
技术领域
本公开涉及生物技术领域，并且更具体地涉及分离的多肽和可活化细胞因子构建体，包括可活化白细胞介素构建体。
背景技术
细胞因子是由大多数有核细胞响应于病毒感染和/或其他抗原刺激而产生和分泌的天然存在的小蛋白和糖蛋白家族。白细胞介素是细胞因子的另一亚类。白细胞介素调节细胞生长、分化和运动。它们在刺激免疫应答诸如炎症方面特别重要。白细胞介素已用于治疗癌症、自身免疫病症和其他病症。例如，白细胞介素-2 (IL2)被指示用于治疗黑素瘤、移植物抗宿主疾病(GVHD)、神经母细胞瘤、肾细胞癌(RCC)，并且还被认为可用于包括以下的疾患：急性冠脉综合征、急性髓样综合征、特应性皮炎、自身免疫肝病、基底细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、念珠菌病(candidiasis)、结直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜瘤、HIV感染、缺血性心脏病、类风湿性关节炎、鼻咽腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰腺癌、系统性红斑狼疮、结核病和其他病症。已知白细胞介素-15 (IL-15)促进T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞的分化和扩增，从而增强抗肿瘤反应。IL-15已被认为是抗癌治疗的有希望的候选药物，并且已在大量临床试验中进行了测试。尽管有这样的前景，IL-15已知会表现出不良的促炎作用，并且与多种自身免疫性疾病的发病机制有关。据报道，重组IL-15的最大耐受剂量为2微克/千克。Conlon KC等人 “IL15 by Continuous Intravenous Infusion toAdult Patients with Solid Tumors in a Phase I TrialInduced Dramatic NK-CellSubset Expansion.” Clin Cancer Res. 2019年8月15日;25(16):4945-4954。还据报道，重组可溶性IL-15在体内的半衰期较短，这阻碍了其作为治疗的应用。Berraondo, P等人“Cytokines in clinical cancer immunotherapy.” Br J Cancer 120, 6–15 (2019)。其他白细胞介素诸如IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12和IL-21等也是用于癌症和其他病症的潜在治疗方法。然而，白细胞介素疗法通常伴有非所需副作用，包括流感样症状、恶心、呕吐、腹泻、低血压和心律失常等。
因此，人们一直需要一种比现有细胞因子疗法具有更少不良副作用的细胞因子疗法。
发明内容
本公开提供了包括一个或多个新型掩蔽部分的分离的多肽和可活化细胞因子构建体(ACC)。
在一个方面，本公开包括细胞因子掩蔽部分(MM)，其包含：
(a) 第一掩蔽亚基，所述第一掩蔽亚基由编码细胞因子的受体的第一受体多肽的氨基酸序列的第一子序列编码，和
(b) 第二掩蔽亚基，所述第二掩蔽亚基由选自由以下组成的组的第二氨基酸序列编码：
(i) 编码细胞因子受体多肽的氨基酸序列的第二子序列，所述细胞因子受体多肽选自由编码第一受体多肽的氨基酸序列和编码细胞因子的受体的第二受体多肽的氨基酸序列组成的组，其中在编码第一受体多肽的氨基酸序列内，第一子序列和第二子序列不连续；和
(ii) 编码阻断部分(BM)的氨基酸序列。
在一个方面，本公开包括可活化细胞因子构建体(ACC)，其包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)和细胞因子多肽(CP)，其中MM包含：
(a) 第一掩蔽亚基，所述第一掩蔽亚基由编码CP的受体的第一受体多肽的氨基酸序列的第一子序列编码，和
(b) 第二掩蔽亚基，所述第二掩蔽亚基由选自由以下组成的组的第二氨基酸序列编码：
(i) 编码细胞因子受体多肽的氨基酸序列的第二子序列，所述细胞因子受体多肽选自由编码第一受体多肽的氨基酸序列和编码CP的受体的第二受体多肽的氨基酸序列组成的组，其中在编码第一受体多肽的氨基酸序列内，第一子序列和第二子序列不连续；和
(ii) 编码阻断部分(BM)的氨基酸序列。
在一个方面，本公开包括一种分离的多肽，其包含多肽序列，所述多肽序列包含两个或更多个受体子序列的串联序列，其中所述受体子序列中的每一个来自细胞因子多肽(CP)的受体；并且所述两个或更多个受体子序列：
i) 在所述受体的所述序列中不连续；并且
ii) 彼此直接或间接连接。
在一个方面，本公开包括ACC，其包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)和细胞因子多肽(CP)，其中：
a) 所述MM包含多肽序列，所述多肽序列包含两个或更多个受体子序列的串联序列；
b) 所述受体子序列中的每一个来自所述CP的受体；并且
c) 所述两个或更多个受体子序列：
i) 在所述受体的所述序列中不连续；并且
ii) 彼此直接或间接连接。
在一个方面，所述两个或更多个受体子序列中的每一个包含所述受体中的连续氨基酸，所述连续氨基酸具有在所述受体和所述细胞因子的复合物的共晶结构(细胞因子-受体复合物共晶结构)中的所述细胞因子氨基酸的任何原子(C、O、N或S)的1.0至8.0埃、2.0至8.0埃或2.0至7.0埃的范围内的至少一个原子(C、O、N或S)。在一个方面，分离的多肽还包含设置在两个或更多个受体子序列中的至少两个之间的接头。在一个方面，受体子序列中的每一个包含2、3、4或更多个氨基酸。在一个方面，所述两个或更多个受体子序列中的至少一个包含相对于所述受体的所述序列的至少一个氨基酸的保守取代。在一个方面，所述两个或更多个受体子序列包括第一受体子序列和第二受体子序列，其中所述第二受体子序列位于所述受体的所述序列中所述第一受体子序列的C末端，其中所述接头包含X个氨基酸，其中X = n/y，其中n=所述细胞因子-受体复合物共晶结构中所述第一受体子序列的N末端肽的C末端与所述第二受体子序列的C末端肽的N末端之间的距离，以埃为单位，并且y是在1.5-3.5、或2-3.5、或2-3或2-2.5范围内的数字，并且如果X不是整数，则X四舍五入到下一个整数。在一些方面，所述两个或更多个受体子序列包括第一受体子序列和第二受体子序列，其中所述第二受体子序列位于所述受体的所述序列中所述第一受体子序列的C末端，其中所述接头包含X个氨基酸，其中X = n/2.5，并且如果X不是整数，则X四舍五入到下一个整数。
已经发现，如本文所述，具有串联受体子序列的掩蔽部分在干扰细胞因子与其受体结合的能力方面表现出优异的掩蔽性质。此外，包含这些MM的ACC在活化后表现出非常好的细胞因子活性恢复。
在一个方面，本公开包括一种分离的多肽，其包含氨基酸序列ALTTVX-接头-ASHYFE (SEQ ID NO: 508) (MM)，其中X是D、K或R，并且其中N末端丙氨酸残基任选地不存在或任选地被任何其他氨基酸取代(如在SEQ ID NO: 515-518中)。在一些方面，N末端丙氨酸残基被赖氨酸取代。在一些方面，N末端、C末端或两者延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些方面，分离的多肽包含选自以下的序列：SQKLTTVDGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 731)、SQKLTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO:734)、SQALTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO:736)或SQALTTVDGGGGSASHYFERHLE (SEQ IDNO: 737)。在一些方面，接头由1至20个氨基酸组成。在一些方面，分离的多肽包含选自以下的氨基酸序列：ALTTVDGGGGSASHYFE (SEQ ID NO: 512)、ALTTVDGGGGSASHYFER (SEQ IDNO: 236)、ALTTVDGGGGSASHYFEK (SEQ ID NO: 237)、ALTTVKGGGGSASHYFE (SEQ ID NO:513)、ALTTVKGGGGSASHYFER (SEQ ID NO:238)、ALTTVKGGGGSASHYFEK (SEQ ID NO: 239)、ALTTVRGGGGSASHYFE (SEQ ID NO: 514)、ALTTVRGGGGSASHYFER (SEQ ID NO: 240)或ALTTVRGGGGSASHYFEK (SEQ ID NO: 241)，或其中每个序列中的N末端丙氨酸残基任选地不存在或任选地被任何其他氨基酸取代。在一些方面，N末端丙氨酸残基被赖氨酸取代。在一些方面，本文的MM序列的N末端、C末端或两者延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
根据本公开，氨基酸序列是抑制细胞因子与其受体结合的掩蔽部分。
在一个方面，本公开包括进一步包含细胞因子的分离的多肽。在一些方面，所述分离的多肽设置在包含两种或更多种多肽的复合物中，并且其中所述复合物包含细胞因子。在一个方面，本公开包括一种复合物，所述复合物包含一种多肽，所述多肽包含与本公开的分离的多肽复合的细胞因子。在一些方面，细胞因子设置在与分离的多肽复合的多肽中。在一些方面，细胞因子是结合IL2/IL15受体β和/或IL2/IL15受体γ的细胞因子。在一些方面，细胞因子是结合至IL-15Rα的细胞因子。在一些方面，细胞因子是结合至IL-2Rα的细胞因子。
在一个方面，本公开包括可活化细胞因子构建体(ACC)，其包含细胞因子多肽(CP)、可裂解部分(CM)和本公开的分离的多肽(MM)，其中MM通过CM与CP偶联并抑制CP与其受体的结合。
在一个方面，本公开包括一种ACC，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中第一单体构建体包含第一细胞因子多肽(CP1)、第一可裂解部分(CM1)、通过CM1与CP1偶联的第一二聚化结构域(DD1)和第一掩蔽部分(MM1)，第二单体构建体包含第二细胞因子多肽(CP2)、第二可裂解部分(CM2)、通过CM2与CP2偶联的第二二聚化结构域(DD2)和第二掩蔽部分(MM2)，DD1和DD2彼此结合，从而形成第一单体构建体和第二单体构建体的二聚体，并且MM1和/或MM2包含本公开的分离的多肽。
在一个方面，本公开包括一种ACC，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中第一单体构建体包含第一细胞因子多肽(CP1)、第一二聚化结构域(DD1)和第一掩蔽部分(MM1)，第二单体构建体包含第二细胞因子多肽(CP2)、第一可裂解部分(CM1)、通过CM1与CP2偶联的第二二聚化结构域(DD2)和第二掩蔽部分(MM2)，MM1和/或MM2是本公开的分离的多肽，并且DD1和DD2彼此结合，从而形成第一单体构建体和第二单体构建体的二聚体。
在一个方面，本公开包括一种ACC，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中第一单体构建体包含第一细胞因子多肽(CP1)、第一二聚化结构域(DD1)和第一掩蔽部分(MM1)，第二单体构建体包含第二细胞因子多肽(CP2)、第二二聚化结构域(DD2)和第二掩蔽部分(MM2)，CP1和/或CP2包含用作蛋白酶的底物的氨基酸序列，并且DD1和/或DD2通过氨基酸序列与CP1和/或CP2偶联，MM1和/或MM2是本公开的分离的多肽，并且DD1和DD2彼此结合，从而形成第一单体构建体和第二单体构建体的二聚体。
在一个方面，本公开包括一种ACC，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中第一单体构建体包含本公开的细胞因子多肽(CP)、第一二聚化结构域(DD1)、第一可裂解部分(CM1)、第二可裂解部分(CM2)和分离的多肽或掩蔽部分(MM)，其中分离的多肽或MM通过CM1与CP偶联，并且DD1通过CM2与CP偶联，第二单体构建体包含CP的激动剂、第三可裂解部分(CM3)、通过CM3与激动剂偶联的第二二聚化结构域(DD2)，并且DD1和DD2彼此结合，从而形成第一单体构建体和第二单体构建体的二聚体。
在一个方面，本公开包括编码本公开的分离的多肽或本公开的单体构建体的多核苷酸。本公开还包括根据以下公开内容的载体、宿主细胞、组合物、制造方法和治疗方法。
附图说明
图1A至图1B示出了IL-15与其受体(图1A，左)或IL-2 (图1B，左)的复合物，以及与IL-15 (图1A，右)或IL-2 (图1B，右)结合并中断白细胞介素与其受体之间的结合的示例性MM。
图2是说明性可活化细胞因子构建体的示意图，所述可活化细胞因子构建体从N末端至C末端包含：(1)第一单体构建体110，所述第一单体构建体具有任选的MM1119、任选的CM3117、CP1115、CM1113和DD1111；和(2)第二单体构建体120，所述第二单体构建体具有任选的MM2129、任选的CM4127、CP2125、CM2123和DD2121；和(3)一个或多个使第一单体构建体110键合于第二单体构建体120的共价或非共价键(← →)。ACC还可在组分之间包含任选的接头112、114、116、118、122、124、126和128中的一个或多个。在一个实例中，DD1111和DD2121是相同的。在另一实例中，DD1111和DD2121是不同的。
图3A至图3E示意性地示出了ACC的附加实例。具有MM (例如，β肽)、CM (“底物”)、CP (例如IL-15)(图3A)以及图3B中的DD1和DD2 (Fc)的示例性ACC。具有细胞因子激动剂(例如，寿司结构域)和任选的组氨酸标签(“His标签”)的示例性ACC (图3C至图3E)。
图4示意性地示出了表示ACC的连接区(LR)的ACC的实施方案。
图5示出了示例性ACC ProC2970的结构示意图(左上)、包含白细胞介素、可裂解部分和MM的单体构建体的三级结构(右上)，以及与其受体(所示受体的α、β和γ链)复合的单体构建体的三级结构(底部)。
图6示出了uPA对示例性ACC ProC2970的裂解的电泳测试结果。
图7示出了通过报告基因测定测试的掩蔽部分对示例性ACC ProC2970的掩蔽效率，并与ProC1879进行了比较。
图8示出了示例性ACC ProC2970对PMBC增殖的活性并与ProC1879进行了比较。
图9A至图9E示出了ACC的活化。图9A至图9B示出了uPA裂解之前和之后ACC的电泳图。图9C至图9E示出了在HEK-Blue报告基因测定中ACC的EC50在uPA介导的活化后降低。
图10示出了没有MM的ACC (顶行)和具有MM的示例性ACC构建体(底行)的结构示意图。
具体实施方式
尽管本公开的主题的方面可以多种形式体现，但以下描述仅旨在公开其中一些形式作为本公开所涵盖的主题的具体实例。因此，本公开的主题不限于所描述的形式或方面。
除非另有限定，否则本文中所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常所理解相同的含义。本文描述了用于本发明中的方法和材料；还可使用本领域中已知的其他适合的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，并且不意图是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目以及其它参考文献都通过引用以其整体并入本文。在冲突的情况下，将以本说明书为准，包括定义。
根据以下详细描述和附图以及根据权利要求，本发明的其他特征和优势将是显而易见的。
术语“一个(种) (a/an)”是指所述冠词的一个(种)或多个(种) (即，至少一个(种))语法对象。借助于实例，“一个细胞”涵盖一个或多个细胞。
如本文所用，术语“约”和“大约”当用于修饰数值或范围内指定的量时，表示数值以及与本领域技术人员已知的值的合理偏差。例如，在适当的情况下，±20%、±10%或±5%在所述值的预期含义内。
浓度、量和其它数值数据可在本文中以范围格式表示或呈现。应了解，这种范围格式仅为了方便和简洁而使用，因此应灵活解释为不仅包括明确叙述为范围的限值的数值，而且还包括涵盖在该范围内的所有个别数值或子范围，就好像每个数值和子范围被明确叙述一样。作为说明，“约0.01至2.0”的数值范围应解释为不仅包括明确叙述的约0.01至约2.0的值，而且还包括所指示范围内的个别值和子范围。因此，这个数值范围内包括单个值诸如0.5、0.7和1.5，以及子范围诸如0.5至1.7、0.7至1.5和1.0至1.5等。此外，无论范围的宽度或所描述的特征如何，此种解释都应适用。另外，应注意，除非另外指定，否则所有百分比都以重量计。
在理解本公开的范围时，如本文所用的术语“包括”或“包含”和它们的派生词意图是指定所陈述的特征、要素、组分、组、整数和/或步骤的存在，但不排除其它未陈述的特征、要素、组分、组、整数和/或步骤的存在的开放式术语。前述内容也适用于具有类似含义的词语，例如术语“包括”、“具有”和它们的派生词。如本文所用的术语“由……组成”和它的派生词意图是指定所陈述的特征、要素、组分、组、整数和/或步骤的存在，但排除其它未陈述的特征、要素、组分、组、整数和/或步骤的存在的封闭式术语。如本文所用的术语“基本上由……组成”意图指定所陈述的特征、要素、组分、基团、整数和/或步骤以及不实质上影响特征、要素、组分、基团、整数和/或步骤的一种或多种基本和新颖特征的那些特征、要素、组分、基团、整数和/或步骤的存在。应了解，提及这些过渡术语(即“包含”、“由……组成”或“基本上由……组成”)中的任一者都为替换成未具体使用的任何其他过渡术语提供直接支持。例如，由于这个定义针对在整篇本公开中公开的任何要素，所以将术语从“包含”修改为“基本上由……组成”或“由……组成”将得到直接支持。基于这个定义，本文公开或以引用的方式并入的任何要素都可包括在要求的发明中或从要求的发明排除。
如本文所用，为了方便起见，多个化合物、要素或步骤可呈现在共同的清单中。然而，这些清单应解释为好像清单的每个成员被单独地标识为单独和独特成员一样。因此，仅基于它们在共同组中呈现而没有相反指示，这种清单的个别成员不应解释为同一清单的任何其它成员的事实上的等效物。
此外，某些分子、构建体、组合物、要素、部分、赋形剂、病症、疾患、性质、步骤等可在一个具体实施方案或方面的上下文中或在本公开的单独段落或章节中讨论。应了解，这仅是为了方便和简洁，并且任何这种公开内容都可同样适用于在本公开和权利要求书中的任何地方所见的任何其它实施方案或方面，并且意图与所述任何其它实施方案或方面组合，这些都形成本申请和在申请日要求的发明。例如，关于构建体、组合物或方法描述的构建体、分子、方法步骤、药盒或组合物的清单意图并且确实为与本公开的任何其他部分中描述的构建体、组合物、制剂和方法相关的实施方案找到直接支持，即使那些方法步骤、活性剂、药盒或组合物未在该实施方案或方面的上下文或章节中重新列出。
术语“可裂解部分”和“CM”在本文中可互换使用，是指氨基酸序列包含序列特异性蛋白酶的底物的多肽。适用于本文的ACC的可裂解部分包括本领域已知的任何蛋白酶底物。示例性可裂解部分在以下更详细描述。
术语“掩蔽部分”或“MM”在本文中可互换用于指代降低或抑制细胞因子多肽的一种或多种活性的肽或蛋白质。在一些实施方案中，当位于细胞因子多肽的近端时，MM会干扰细胞因子多肽与其结合配偶体(例如，其受体)的结合。在一些实施方案中，MM是少于50个氨基酸的氨基酸序列，包括1至50个范围内的任何数量的氨基酸或氨基酸范围。在一些实施方案中，MM的长度不超过40个氨基酸。在优选的实施方案中，MM的长度不超过20个氨基酸。在一些实施方案中，MM的长度不超过19、18、17、16或15个氨基酸。在一些方面，MM是至少1、2、3、4个氨基酸。在一些方面，MM是5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸。
如本文所用，术语“掩蔽效率”是指未裂解ACC的活性(例如，EC50)除以对照白细胞介素的活性，其中所述对照白细胞介素可为ACC的裂解产物或用作ACC的CP的白细胞介素。至少一种白细胞介素活性的水平降低的ACC具有大于10的掩蔽效率。在一些实施方案中，本文所述的ACC具有大于10、大于100、大于1000或大于5000的掩蔽效率。在一些实施方案中，ACC具有约10至约100、或约10至约200、或约50至约150、或约50至约80的掩蔽效率，如通过IL-2/IL-15反应性HEK293细胞中未裂解的ACC的EC50与ACC裂解产物的EC50的比率测量。
如本文所用，术语“阻断部分”或“BM”是指减少或抑制细胞因子多肽与其结合配偶体之间的相互作用但不含有受体序列或细胞因子受体序列的子序列的部分。
如本文所用，术语“子序列”意指所述部分不包括细胞因子受体序列的全长氨基酸序列，而是具有少于细胞因子受体序列的氨基酸序列中的所有氨基酸。因此，如本文所用，由子序列“编码”的亚基、单体、构建体、多肽或氨基酸序列不包括细胞因子受体序列的全长氨基酸序列，而是亚基、单体、构建体、多肽或氨基酸序列具有少于细胞因子受体序列的氨基酸序列中的所有氨基酸。
如本文所用，在受体子序列的上下文中，“连续”意指子序列中从N末端至C末端方向顺序相同的两个或更多个相邻氨基酸。
在关于细胞因子构建体使用时，术语“可活化”是指细胞因子构建体展现一种或多种活性的第一水平，接着暴露于导致一个或多个可裂解部分裂解的条件导致产生展现所述一种或多种活性的第二水平的细胞因子构建体，其中所述第二活性水平大于所述第一活性水平。活性的非限制性实例包括本文所述或本领域中已知的细胞因子的任何示例性活性。
术语“成熟细胞因子多肽”在本文中是指缺乏信号序列的细胞因子多肽。细胞因子多肽(例如，白细胞介素多肽)可以是成熟的细胞因子多肽或具有信号肽的细胞因子多肽。因此，在一些方面，本公开的ACC可包括成熟细胞因子多肽序列。在一些方面，本公开的ACC可包括成熟细胞因子多肽序列和另外的信号序列。在一些方面，本公开的ACC可包括本文公开的序列，所述序列包括或缺乏本文叙述的信号序列。
术语“二聚化结构域”和“DD”在本文中可互换用于指代一对二聚化结构域中的一个成员，其中所述对中的每个成员能够通过一种或多种共价或非共价相互作用结合至另一成员。第一DD和第二DD可为相同的或不同的。在下文更详细地描述了适用作DD1和/或DD2的示例性DD。
如本文所用，多肽(诸如细胞因子或Fc结构域)可以是野生型多肽(例如天然存在的多肽)或野生型多肽的变体。变体可为通过对野生型多肽进行一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失和/或添加来修饰的多肽，条件是所述变体保留野生型多肽的基本功能或活性。在一些实例中，与野生型多肽相比，变体可具有改变的(例如，增加的或降低的)功能或活性。在一些方面，变体可为野生型多肽的功能性片段。术语“功能性片段”意指多肽(例如，细胞因子)的序列可包括比全长多肽序列少的氨基酸，但具有足够的多肽链长度以赋予活性(例如，细胞因子活性)。
在两个或更多个核酸或氨基酸序列的上下文中，术语“至少[一定]%同一”意指在比较窗口或指定的核酸或氨基酸序列上进行比较和比对以实现最大对应性时，两个或更多个序列在给定的百分比内具有共同的核苷酸或氨基酸残基(即序列具有至少90%(%)的同一性)。可使用具有默认参数的BLAST序列比较算法或通过手动比对和目视检查来测量核酸或氨基酸序列的百分比同一性(参见例如blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括实现在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，给定氨基酸序列A对、与或针对给定氨基酸序列B的序列同一性% (其可替代地表达为具有或包含对、与或针对给定氨基酸序列B的一定的序列同一性%的给定氨基酸序列A)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是程序A和B比对中序列标记为完全匹配的氨基酸残基数量，Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的氨基酸序列同一性%将不等于B对A的氨基酸序列同一性%。
如本文所用，“分离的多肽”意指cDNA、重组RNA或合成来源的多肽，或它们的某种组合，根据其来源或衍生来源，“分离的多肽”基本上不含宿主细胞诸如哺乳动物细胞内源性表达的成分，或者在无细胞表达系统的情况下，基本上不含无细胞表达试剂，并且不会在自然界中出现。使用常规分离技术(例如色谱法)，分离的多肽可以基本上不含宿主细胞内源性表达的成分或基本上不含无细胞表达试剂。根据本公开的方面，分离的多肽可设置在包含两种或更多种多肽的复合物中，包括其中复合物包含细胞因子。除非另外指定，否则“编码蛋白质的核酸序列”包括彼此是简并形式，因此编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
除非另外指定，否则“编码蛋白质的核酸序列”包括彼此是简并形式，因此编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
当涉及多肽一级氨基酸序列中第一结构域或序列相对于第二结构域或序列的位置时，术语“N末端”意指相比于所述第二结构域或序列，所述第一结构域或序列位于更靠近所述多肽一级氨基酸序列的N末端处。在一些实施方案中，在第一结构域或序列与第二结构域或序列之间可存在另外的序列和/或结构域。
当涉及多肽一级氨基酸序列中第一结构域或序列相对于第二结构域或序列的位置时，术语“C末端”意指相比于所述第二结构域或序列，所述第一结构域或序列位于更靠近所述多肽一级氨基酸序列的C末端处。在一些实施方案中，在第一结构域或序列与第二结构域或序列之间可存在另外的序列和/或结构域。
术语“外源性”是指从细胞、组织或生物体的外部引入或来源于细胞、组织或生物体的外部的任何材料不由它被引入其中的前述细胞、组织或生物体产生或不来源于它被引入其中的前述细胞、组织或生物体。
术语“转导”、“转染”或“转化”是指将外源性核酸引入或转移至细胞中所采用的过程。“经转导”、“经转染”或“经转化”细胞(例如哺乳动物细胞)是已用外源性核酸(例如载体)转导、转染或转化的细胞，所述外源性核酸包括编码本文所述的任何可活化细胞因子构建体的外源性核酸。
术语“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或它们的组合。除非具体限制，否则该术语涵盖含有与参考核苷酸具有类似结合性质的天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另外指示，否则特定核酸序列还隐含地涵盖互补序列以及明确指示的序列。在本文所述的任何核酸的一些实施方案中，核酸是DNA。在本文所述的任何核酸的一些实施方案中，核酸是RNA。
如本文所用，短语“特异性结合”意指ACC结合至其受体或靶标，并且不与其他多肽反应，或以低得多的亲和力(例如，约或大于10-6M)结合。
术语“治疗”是指改善病症的至少一种症状。在一些实施方案中，正在治疗的病症是癌症。在一些实施方案中，正在治疗的病症是自身免疫病症。在一些实施方案中，正在治疗的病症是炎症性病症。
包含新型掩蔽部分的多肽
本文提供了包含可用作可活化细胞因子构建体中的掩蔽部分的氨基酸序列的分离的多肽。
在一个方面，本公开包括细胞因子掩蔽部分(MM)，其包含：
(a) 第一掩蔽亚基，所述第一掩蔽亚基由编码细胞因子的受体的第一受体多肽的氨基酸序列的第一子序列编码，和
(b) 第二掩蔽亚基，所述第二掩蔽亚基由选自由以下组成的组的第二氨基酸序列编码：
(i) 编码细胞因子受体多肽的氨基酸序列的第二子序列，所述细胞因子受体多肽选自由编码所述第一受体多肽的所述氨基酸序列和编码所述细胞因子的所述受体的第二受体多肽的氨基酸序列组成的组，其中在编码所述第一受体多肽的所述氨基酸序列内，所述第一子序列和所述第二子序列不连续；和
(ii) 编码阻断部分(BM)的氨基酸序列。
本文提供的细胞因子MM是非天然存在的分子。在一些方面，第一掩蔽亚基和第二掩蔽亚基中的一个或两个的长度不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个氨基酸。细胞因子MM可以多肽的形式表达，所述多肽包括直接或间接偶联至可裂解部分(CM)的细胞因子MM，所述可裂解部分直接或间接偶联至细胞因子多肽(CP)。
在一些方面，本公开提供了包含中断白细胞介素与其结合配偶体之间的结合的掩蔽部分(MM)的分离的多肽。例如，MM可包含来自细胞因子受体的串联肽，其中包括受体-细胞因子相互作用位点的氨基酸残基。本公开的串联肽包括来自细胞因子受体序列的一个或多个受体子序列。受体子序列是来自CP受体的氨基酸序列。包含串联肽的MM中的受体子序列可能彼此不同或相同。因此，在一些实例中，受体子序列并不相同。在一些实例中，受体序列可以相同。
当细胞因子受体具有多个亚基时，MM可包含来自不同亚基的受体子序列。
已经发现，如本文所述，具有串联受体子序列的掩蔽部分在干扰细胞因子与其受体结合的能力方面表现出优异的掩蔽性质。此外，包含这些MM的ACC在活化后表现出非常好的细胞因子活性恢复。
下文通过参考特定氨基酸序列描述的MM是包含本公开的串联氨基酸序列的MM的实例。
在一些方面，所述两个或更多个受体子序列中的每一个包含所述受体中的连续氨基酸，所述连续氨基酸具有在所述受体和所述细胞因子的复合物的共晶结构(细胞因子-受体复合物共晶结构)中的所述细胞因子氨基酸的任何原子(C、O、N或S)的1.0至8.0埃、2.0至8.0埃或2.0至7.0埃的范围内的至少一个原子(C、O、N或S)。在一些方面，ACC还包含设置在所述两个或更多个受体子序列中的至少两个之间的接头。在一些方面，受体子序列中的每一个包含2、3、4或更多个氨基酸。在一些方面，所述两个或更多个子序列中的至少一个包含相对于所述受体的所述序列的至少一个氨基酸的保守取代。
保守性氨基酸取代是其中氨基酸残基经具有类似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。本领域中已定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括：具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、非极性氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)、不带电荷的极性氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)、亲水性氨基酸(例如，精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)、疏水性氨基酸(例如，丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)。其他氨基酸家族包括：脂肪族-羟基氨基酸(例如，丝氨酸和苏氨酸)、酰胺家族(例如，天冬酰胺和谷氨酰胺)、脂肪族家族(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、芳香族家族(例如，苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)。
在一些方面，所述两个或更多个受体子序列包括第一受体子序列和第二受体子序列，其中所述第二子序列位于所述受体的所述序列中所述第一受体子序列的C末端，其中所述接头包含X个氨基酸，其中X = n/y，其中n=所述细胞因子-受体复合物共晶结构中所述第一受体子序列的N末端肽的C末端与所述第二受体子序列的C末端肽的N末端之间的距离，以埃为单位，并且y是在1.5-3.5、或2-3.5、或2-3或2-2.5范围内的数字，或y是2.5，并且如果X不是整数，则X四舍五入到下一个整数。在一些方面，受体子序列彼此不同。在一些方面，受体子序列中的两个或更多个是不同的或相同的。
在一个方面，本公开提供了包含一个或多个掩蔽部分(MM)的多肽(例如，分离的多肽)。
在一些方面，MM是通过串联形成细胞因子-受体界面至少一部分的受体蛋白的肽而产生的。形成细胞因子-受体界面至少一部分的受体肽(例如，3-20aa长)从受体-细胞因子复合物的共晶体结构中被鉴定为受体中位于细胞因子氨基酸的任何原子(C、O、N或S)2.0-7.0埃范围内的连续氨基酸。也可根据C-α原子的距离在1-20埃范围内计算距离。文献中已报道了许多受体/细胞因子晶体结构，并且可用于本文识别受体肽，诸如例如以下中报道的结构：Wang, Xinquan等人 “Structural biology of shared cytokine receptors.”Annual review of immunology27 (2009): 29-60, Ring, A., Lin, JX., Feng, D.等人Mechanistic and structural insight into the functional dichotomy between IL-2and IL-15.Nat Immunol13, 1187–1195 (2012) (doi.org/10.1038/ni.2449) (pdb:4GS7, IL-15), Josephson, Kristopher, Naomi J. Logsdon和Mark R. Walter.“Crystalstructure of the IL-10/IL-10R1 complex reveals a shared receptorbinding site.”Immunity15.1 (2001): 35-46 (doi.org/10.1016/s1074-7613(01)00169-8) (pdb:1J7V, IL-10),Tsutsumi, N., Kimura, T., Arita, K.等人Thestructural basis for receptor recognition of human interleukin-18.Nat Commun5, 5340 (2014). (doi.org/10.1038/ncomms6340) (pdb:3WO4, IL-18),Mendoza, J.L., Escalante, N.K., Jude, K.M.等人Structure of the IFNγ receptorcomplex guides design of biased agonists.Nature567, 56–60 (2019) (doi.org/10.1038/s41586-019-0988-7) (pdb:6E3K, IFNγ)等，所述文献通过引用以其整体并入本文。还可使用BIOVIA Discovery Studio (Dassault系统)、Schrodinger (Schrodinger,Inc)等通过同源性建模和分子对接协议来识别合适的肽。这些受体肽可与接头(例如，包含Gly、Ser、Thr、Asn、Pro的柔性接头，诸如下文公开的那些等)串联。接头的长度可基于共晶中各个肽的距离来确定。在一些实例中，如果N末端肽的C末端与C末端肽的N末端之间的距离为n埃，则接头的长度将被选择为等于或大于n/2.5 (四舍五入到下一个整数)(因为氨基酸之间的平均C-α距离为约2.5埃)。
在一些实施方案中，MM包含ALTTVX-接头-ASHYFE (SEQ ID NO: 508)的序列，其中X是D、K或R，并且其中每个序列中的N末端丙氨酸残基任选地不存在或任选地被任何其他氨基酸取代。在一些方面，N末端丙氨酸残基被赖氨酸取代。在一些方面，N末端丙氨酸残基被赖氨酸取代。在一些方面，N末端、C末端或两者延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些方面，MM包含选自以下的序列：SQKLTTVDGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO:731)、SQKLTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO:734)、SQALTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 736)或SQALTTVDGGGGSASHYFERHLE (SEQID NO: 737)。
MM序列与一个或多个接头序列相连接，例如柔性接头、包含Gly、Ser、Thr、Asn、Pro的接头(诸如下文所公开的那些)、设计用于赋予特定结构的接头等。
在一些实施方案中，接头由1至22个氨基酸组成。在一个实例中，接头由1个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由2个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由3个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由4个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由5个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由6个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由7个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由8个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由9个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由10个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由11个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由12个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由13个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由14个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由15个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由16个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由17个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由18个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由19个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由20个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由21个氨基酸组成。在另一个实例中，接头由22个氨基酸组成。在一些实例中，接头由21-53个氨基酸组成，例如，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53个氨基酸。
接头的实例包括下述序列，例如SEQ ID NO: 2和210-235、245或250。在一个实例中，接头是GGGGS (SEQ ID NO: 216)。
在一些实施方案中，MM包含ALTTVD-接头-ASHYFE (SEQ ID NO: 509)或ALTTVD-接头-ASHYFER (SEQ ID NO: 242)或ALTTVD-接头-ASHYFEK (SEQ ID NO: 243)的序列，或其中N末端丙氨酸残基任选地不存在或被任何其他氨基酸取代。在一些实施方案中，MM包含ALTTVK-接头-ASHYFE (SEQ ID NO: 510)或ALTTVK-接头-ASHYFER (SEQ ID NO: 244)或ALTTVK-接头-ASHYFEK (SEQ ID NO: 246)的序列，或其中N末端丙氨酸残基任选地不存在或被任何其他氨基酸取代。在一些实施方案中，MM包含ALTTVR-接头-ASHYFE (SEQ ID NO:511)或ALTTVR-接头-ASHYFER (SEQ ID NO: 247)或ALTTVR-接头-ASHYFEK (SEQ ID NO:248)的序列，或其中N末端丙氨酸残基任选地不存在或被任何其他氨基酸取代。在一些方面，N末端丙氨酸残基被赖氨酸取代。在一些方面，N末端丙氨酸残基被赖氨酸取代。在一些方面，N末端、C末端或两者延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些方面，MM包含选自以下的序列：SQKLTTVDGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO:731)、SQKLTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 734)、SQALTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQ IDNO:736)或SQALTTVDGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 737)。
在一些实施方案中，MM由ALTTVD-接头-ASHYFER (SEQ ID NO: 242)或ALTTVD-接头-ASHYFE(R/K) (SEQ ID NO: 502)的序列组成，或其中N末端丙氨酸残基任选地不存在或被任何其他氨基酸取代。在一些实施方案中，MM由ALTTVK-接头-ASHYFE (SEQ ID NO: 510)或ALTTVK-接头-ASHYFE(R/K) (SEQ ID NO: 503)的序列组成，或其中N末端丙氨酸残基任选地不存在或被任何其他氨基酸取代。在一些实施方案中，MM由ALTTVR-接头-ASHYFE (SEQID NO: 511)或ALTTVR-接头-ASHYFE(R/K) (SEQ ID NO: 504)的序列组成，或其中N末端丙氨酸残基任选地不存在或被任何其他氨基酸取代。在一些方面，N末端丙氨酸残基被赖氨酸取代。在一些方面，N末端、C末端或两者延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些方面，MM包含选自以下的序列：SQKLTTVDGGGGSASHYFERHLE(SEQ ID NO: 731)、SQKLTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 734)、SQALTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO:736)或SQALTTVDGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO:737)。
在一个实例中，MM包含ALTTVDGGGGSASHYFE (SEQ ID NO: 512)或ALTTVDGGGGSASHYFE(R/K) (SEQ ID NO: 505)的序列，或其中N末端丙氨酸残基任选地不存在或被任何其他氨基酸取代。在另一个实例中，MM包含ALTTVKGGGGSASHYFE (SEQ ID NO:513)或ALTTVKGGGGSASHYFE(R/K) (SEQ IDNO: 506)的序列，或其中N末端丙氨酸残基任选地不存在或被任何其他氨基酸取代。在另一个实例中，MM包含ALTTVRGGGGSASHYFE (SEQ IDNO: 514)或ALTTVRGGGGSASHYFE(R/K) (SEQ ID NO: 507)的序列，或其中N末端丙氨酸残基任选地不存在或被任何其他氨基酸取代。在一些方面，N末端丙氨酸残基被赖氨酸取代。在一些方面，N末端、C末端或两者延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些方面，MM包含选自以下的序列：SQKLTTVDGGGGSASHYFERHLE (SEQ IDNO:731)、SQKLTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 734)、SQALTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQID NO: 736)或SQALTTVDGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 737)。
在一个实例中，MM由ALTTVDGGGGSASHYFE (SEQ ID NO: 512)或ALTTVDGGGGSASHYFE(R/K) (SEQ ID NO: 505)的序列组成，或其中N末端丙氨酸残基任选地不存在或被任何其他氨基酸取代。在另一个实例中，MM由ALTTVKGGGGSASHYFE (SEQ ID NO:513)或ALTTVKGGGGSASHYFE(R/K) (SEQ IDNO: 506)的序列组成，或其中N末端丙氨酸残基任选地不存在或被任何其他氨基酸取代。在另一个实例中，MM由ALTTVRGGGGSASHYFE (SEQID NO: 514)或ALTTVRGGGGSASHYFE(R/K) (SEQ ID NO: 507)的序列组成，或其中N末端丙氨酸残基任选地不存在或被任何其他氨基酸取代。在一些方面，N末端丙氨酸残基被赖氨酸取代。在一些方面，N末端、C末端或两者延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些方面，MM包含选自以下的序列：SQKLTTVDGGGGSASHYFERHLE(SEQ ID NO:731)、SQKLTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 734)、SQALTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 736)或SQALTTVDGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO:737)。
MM中的接头可包含任何一个或多个氨基酸以及氨基酸序列的任何组合。在一些方面，接头是柔性接头。在一些方面，接头被设计为赋予MM所需的二维和/或三维结构。
在一些实施方案中，掩蔽部分(MM)“掩蔽”或降低或以其他方式抑制细胞因子多肽的活性。在一些实施方案中，MM掩蔽、降低或以其他方式抑制细胞因子多肽与其受体的结合。在一些实施方案中，细胞因子多肽与MM的偶联或修饰通过本领域已知的抑制(例如，结构变化和受体结合竞争)抑制细胞因子多肽特异性结合其受体的能力。在一些实施方案中，细胞因子多肽与MM的偶联或修饰会引起结构变化，从而降低或抑制蛋白质特异性结合其受体的能力。在一些实施方案中，细胞因子多肽与MM的偶联或修饰在空间上阻断、降低或抑制细胞因子多肽特异性结合其受体的能力。
可活化细胞因子构建体
在一个方面，本公开提供了可活化细胞因子构建体(ACC)，其包含细胞因子多肽(CP)，例如白细胞介素多肽、可裂解部分(CM)和本文所述的通过CM与CP偶联的MM。
在一些实例中，ACC从其N末端到C末端包含细胞因子多肽-CM-MM或MM-CM-细胞因子多肽。如本文所用并且除非另外陈述，否则ACC组分之间的每个短划线(-)表示直接键联或通过例如一个或多个接头的键联。
在一个方面，本公开包括ACC，其包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)和细胞因子多肽(CP)，其中：
a) 所述MM包含多肽序列，所述多肽序列包含两个或更多个受体子序列的串联序列；
b) 所述受体子序列中的每一个来自所述CP的受体；并且
c) 所述两个或更多个受体子序列：
i) 在所述受体的所述序列中不连续；并且
ii) 彼此直接或间接连接。
在一些方面，本公开提供了整合MM的各种形式的可活化细胞因子构建体(ACC)。
在一个方面，本公开包括可活化细胞因子构建体(ACC)，其包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)和细胞因子多肽(CP)，其中MM包含：
(a) 第一掩蔽亚基，所述第一掩蔽亚基由编码所述CP的受体的第一受体多肽的氨基酸序列的第一子序列编码，和
(b) 第二掩蔽亚基，所述第二掩蔽亚基由选自由以下组成的组的第二氨基酸序列编码：
(i) 编码细胞因子受体多肽的氨基酸序列的第二子序列，所述细胞因子受体多肽选自由编码所述第一受体多肽的所述氨基酸序列和编码所述CP的所述受体的第二受体多肽的氨基酸序列组成的组，其中在编码所述第一受体多肽的所述氨基酸序列内，所述第一子序列和所述第二子序列不连续；和
(ii) 编码阻断部分(BM)的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供了可活化细胞因子构建体(ACC)，所述可活化细胞因子构建体展现相应细胞因子的至少一种活性的水平降低，但在暴露于活化条件之后产生具有基本上恢复的活性的细胞因子产物。在一些实施方案中，ACC包含根据本公开的细胞因子多肽(CP)、可裂解部分(CM)和掩蔽部分(MM)。在一些实施方案中，MM破坏了CP与其结合配偶体(例如，其受体)之间的相互作用。在一些实施方案中，MM与IL-15 (图1A)或IL-2(图1B)结合，并中断白细胞介素与其受体之间的结合。
本发明人意外地发现，与不包含此类MM的对应ACC相比，包含本文所公开的MM的ACC具有改进的特性，诸如更高的掩蔽效率。
本公开的ACC可在暴露于患病组织后选择性活化，而在正常组织中不活化。在可裂解部分裂解后活化ACC之后，细胞因子活性得到恢复，这表明释放的掩蔽部分在裂解后似乎不会与细胞因子结合，也不会干扰或与细胞因子竞争与其靶标的结合。因此，ACC具有赋予基于细胞因子的疗法的益处的潜力，同时与某些基于细胞因子的疗法相关的毒性可能较少，并改善药代动力学。
本文还提供了相关中间体、组合物、药盒、核酸和重组细胞，以及相关方法，包括使用本文所述的任何ACC的方法和产生并递送本文所述的任何ACC的方法。
在一些实施方案中，ACC的特征在于，与相应的重组野生型细胞因子相比，细胞因子活性水平降低了至少1000、2000、3000、4000、5000或6000倍。例如，ACC的特征在于其EC50比重组野生型IL-15的EC50高至少1000、2000、3000、4000、5000或6000倍，如在IL-2/IL15反应性HEK293细胞中测量的。
在一些实施方案中，ACC还包含CP的激动剂，诸如寿司结构域。例如，ACC可包含本文所述的MM、CM、CP (例如，诸如IL-15或其突变体)和CP的激动剂(例如，寿司结构域)。在一些实例中，激动剂(例如，寿司结构域)可通过接头与CP偶联。
如本文所用，术语“寿司结构域”具有其在本领域中的一般含义，并且是指从IL-15Rα的信号肽后的第一个半胱氨酸残基(C1)开始，到所述信号肽后的第四个半胱氨酸残基(C4)结束的结构域。所述对应于IL-15Rα胞外区的一部分的寿司结构域对于其与IL-15结合是必需的(Wei等人, J.Immunol.，第167(1)卷, 第277-282页, 2001，其通过引用以其整体并入本文)。在一个实例中，寿司结构域包含SEQ ID NO: 520的序列。在另一个实例中，寿司结构域包含SEQ ID NO: 520的序列的功能片段。所述IL-15Rα的寿司结构域或其衍生物具有人IL-15Rα的寿司结构域与人白细胞介素-15的结合活性的至少10%，例如至少25%并且更优选至少50%。所述结合活性可通过上述Wei等人 2001公开的方法简单地测定。
在一些方面，寿司结构域与白细胞介素多肽、MM、DD1或DD2共价连接。在一些方面，共价键是非α碳共价键，例如异肽键。在一些实施方案中，异肽键介于赖氨酸与谷氨酸或天冬氨酸残基之间。在一些实施方案中，非α碳共价键介于MM与细胞因子中取代到α碳中的官能团之间。在一些实施方案中，异肽键介于谷氨酰胺的γ-羧酰胺基与赖氨酸侧链的ε-氨基之间。在一些实施方案中，非α碳共价键为介于苏氨酸与谷氨酰胺之间的酯键。在一些实施方案中，非α碳共价键为介于半胱氨酸与谷氨酰胺之间的硫酯键。在一些实施方案中，非α碳共价键为介于半胱氨酸与酪氨酸之间的硫醚键。在一些实施方案中，非α碳共价键由组氨酸与酪氨酸之间的交联形成(例如，已知这种类型的组氨酸-酪氨酸交联存在于细胞色素c氧化酶中)。在一些实施方案中，非α碳共价键为在赖氨酸与半胱氨酸之间形成的氮-氧-硫(NOS)键。在一些实施方案中，非α碳共价键为二硫键。
在ACC中，MM可通过CM和任选的一个或多个接头与细胞因子多肽偶联，如本文更详细地描述的。在一些实施方案中，当ACC未被活化时，MM会阻止细胞因子多肽与其受体结合；但当ACC被活化时(当MM与细胞因子多肽之间的CM被蛋白酶裂解时)，MM不会实质上或显著地干扰细胞因子多肽与受体的结合。
在ACC中，MM可直接或间接地(例如通过一个或多个接头)与细胞因子多肽偶联。替代地，MM可直接或间接地与ACC中非细胞因子多肽的组分偶联。例如，MM可直接或间接地与不同的细胞因子多肽偶联。在另一个实例中，MM可直接或间接地与DD偶联。在任一情况下，在可活化结构的三级或四级结构中，MM可处于允许MM掩蔽细胞因子多肽的位置(例如，靠近要掩蔽的细胞因子多肽)。
在一些实施方案中，ACC还包含CP的激动剂，诸如如下文所述的寿司结构域。例如，ACC可包含本文所述的MM、CM、CP (例如，诸如IL-15或其突变体)和CP的激动剂(例如，寿司结构域)。在一些实例中，激动剂(例如，寿司结构域)通过接头与CP偶联。
白细胞介素多肽
在一些实施方案中，CP是白细胞介素多肽。本文的ACC中的白细胞介素多肽的实例可包括IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-18、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-10、IL-20、IL-21 IL-14、IL-15、IL-16、IL-17和IL-21。
在一些实例中，CP是IL-15。例如，CP可包含SEQ ID NO: 348、129或130，或其功能片段。在一些实例中，CP可包含与SEQ ID NO: 348、129或130至少85%、90%或95%同一的序列。
在一些实施方案中，白细胞介素多肽是野生型IL-15。在一些实施方案中，白细胞介素多肽是野生型人IL-15。在一些实施方案中，白细胞介素多肽是突变体IL-15。在一些实施方案中，白细胞介素多肽是突变体人IL-15。在一些实施方案中，白细胞介素多肽与SEQID NO: 348至少85%、90%、95%、99%或100%同一。在一些实施方案中，白细胞介素多肽与IL-15 (SEQ ID NO: 348)至少85%同一，其中白细胞介素多肽的位置45处的氨基酸不是亮氨酸。在一些实例中，白细胞介素多肽与SEQ ID NO: 348至少90%同一，其中白细胞介素多肽的位置45处的氨基酸不是亮氨酸。在一些实例中，白细胞介素多肽与SEQ ID NO: 348至少95%同一，其中白细胞介素多肽的位置45处的氨基酸不是亮氨酸。在一些实例中，白细胞介素多肽与SEQ ID NO: 348至少99%同一，其中白细胞介素多肽的位置45处的氨基酸不是亮氨酸。突变的位置是相对于参考序列的。因此，例如，当突变位于位置45时，它是相对于参考序列的。例如，当参考序列为：NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (SEQ ID NO:348)时，位置45和52处的氨基酸以粗体显示。
在一些实例中，白细胞介素多肽中对应于SEQ ID NO: 348的位置45的位置处的氨基酸是天冬氨酸。在一些实例中，白细胞介素多肽中对应于SEQ ID NO: 348的位置45的位置处的氨基酸是天冬酰胺。在一些实例中，白细胞介素多肽中对应于SEQ ID NO: 348的位置45的位置处的氨基酸是苏氨酸。
在一些实施方案中，白细胞介素多肽与SEQ ID NO: 348至少85%同一，其中白细胞介素多肽的位置52处的氨基酸不是亮氨酸。在一些实例中，白细胞介素多肽与SEQ ID NO:348至少90%同一，其中白细胞介素多肽的位置52处的氨基酸不是亮氨酸。在一些实例中，白细胞介素多肽与SEQ ID NO: 348至少95%同一，其中白细胞介素多肽的位置52处的氨基酸不是亮氨酸。在一些实例中，白细胞介素多肽与SEQ ID NO: 348至少99%同一，其中白细胞介素多肽的位置52处的氨基酸不是亮氨酸。
在一些实例中，白细胞介素多肽中对应于SEQ ID NO: 348的位置52的位置处的氨基酸是天冬氨酸。在一些实例中，白细胞介素多肽中对应于SEQ ID NO: 348的位置52的位置处的氨基酸是天冬酰胺。在一些实例中，白细胞介素多肽中对应于SEQ ID NO: 348的位置52的位置处的氨基酸是苏氨酸。
在一些实施方案中，白细胞介素多肽与SEQ ID NO: 348至少85%同一，其中白细胞介素多肽的位置45处的氨基酸不是亮氨酸，并且位置52处的氨基酸不是亮氨酸。在一些实例中，白细胞介素多肽与SEQ ID NO: 348至少90%同一，其中白细胞介素多肽的位置45处的氨基酸不是亮氨酸，并且位置52处的氨基酸不是亮氨酸。在一些实施方案中，白细胞介素多肽与SEQ ID NO: 348至少95%同一，其中白细胞介素多肽的位置45处的氨基酸不是亮氨酸，并且位置52处的氨基酸不是亮氨酸。
在一些实例中，白细胞介素多肽中对应于SEQ ID NO: 348的位置45和52的位置处的氨基酸是天冬氨酸。在一些实例中，白细胞介素多肽中对应于SEQ ID NO: 348的位置45和52的位置处的氨基酸是天冬酰胺。在一些实例中，白细胞介素多肽中对应于SEQ ID NO:348的位置45和52的位置处的氨基酸是苏氨酸。
在一些实例中，白细胞介素多肽中对应于SEQ ID NO: 348的位置45和52的位置处的氨基酸是天冬氨酸、天冬酰胺或苏氨酸。
在一些实施方案中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 402-422中的任一个。在一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 402。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 403。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 404。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 405。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQIDNO: 406。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 407。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 408。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 409。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ IDNO: 410。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 411。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 412。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 413。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQIDNO: 414。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 415。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 416。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 417。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ IDNO: 418。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 419。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 420。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 421。在另一个实例中，白细胞介素多肽包含SEQIDNO: 422。
在一些实施方案中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 402-422中的任一个组成。在一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 402组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 403组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 404组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 405组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQIDNO: 406组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 407组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 408组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ IDNO: 409组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ IDNO: 410组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 411组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO:412组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 413组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ IDNO: 414组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 415组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 416组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 417组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ IDNO: 418组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 419组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 420组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ ID NO: 421组成。在另一个实例中，白细胞介素多肽由SEQ IDNO: 422组成。
在一些实例中，CP是IL-2或其功能片段。例如，CP可包含SEQ ID NO: 119或120，或其功能片段。在一些实例中，CP可包含与SEQ ID NO: 119或120至少85%、90%或95%同一的序列。
在一些实例中，CP是IL-4或其功能片段。例如，CP可包含SEQ ID NO: 121或122，或其功能片段。在一些实例中，CP可包含与SEQ ID NO: 121或122至少85%、90%或95%同一的序列。
在一些实例中，CP是IL-7或其功能片段。例如，CP可包含SEQ ID NO: 123或124，或其功能片段。在一些实例中，CP可包含与SEQ ID NO: 123或124至少85%、90%或95%同一的序列。
在一些实例中，CP是IL-9或其功能片段。例如，CP可包含SEQ ID NO: 125或126，或其功能片段。在一些实例中，CP可包含与SEQ ID NO: 125或126至少85%、90%或95%同一的序列。
在一些实例中，CP是IL-21或其功能片段。例如，CP可包含SEQ ID NO: 521或522，或其功能片段。在一些实例中，CP可包含与SEQ ID NO: 521或522至少85%、90%或95%同一的序列。
具有二聚化结构域的ACC
在一些实施方案中，本文的ACC是包含第一单体构建体和第二单体构建体的二聚体复合物。单体组分的二聚化由一对二聚化结构域促进。在一个方面，每个单体构建体包括细胞因子多肽、本文所述的MM和二聚化结构域(DD)。
在具体的实施方案中，本发明提供了一种ACC，所述ACC包括第一单体构建体和第二单体构建体，其中：
所述第一单体构建体包含第一细胞因子多肽(CP1)、第一可裂解部分(CM1)、通过所述CM1与所述CP1偶联的第一二聚化结构域(DD1)和第一掩蔽部分(MM1)，
所述第二单体构建体包含第二细胞因子多肽(CP2)、第二可裂解部分(CM2)、通过所述CM2与所述CP2偶联的第二二聚化结构域(DD2)和第二掩蔽部分(MM2)，
所述DD1和所述DD2彼此结合，从而形成所述第一单体构建体和所述第二单体构建体的二聚体，并且
MM1和/或MM2包括本文所述的MM。
在一些实施方案中，ACC的特征在于具有与至少一种CP1和/或CP2活性的对照水平相比降低的所述至少一种CP1和/或CP2活性的水平。
在一些实施方案中，第一单体构建体包含第三可裂解部分(CM3)，并且MM1通过CM3与CP1偶联。在一些实施方案中，MM1通过CM1与CP1偶联。在一些实施方案中，第二单体构建体包含第四可裂解部分(CM4)，并且MM2通过CM4与CP2偶联。在一些实施方案中，MM2通过CM2与CP2偶联。
在一些实施方案中，ACC还包含第三单体，所述第三单体包含含有SEQ ID NO: 520的序列的寿司结构域。在一些实施方案中，ACC还包含第四单体，所述第四单体包含含有SEQID NO: 520的序列的寿司结构域。在一些实施方案中，第三单体还包含标签(例如，肽标签，诸如His标签、myc标签等)。在一些实施方案中，第四单体还包含标签(例如，肽标签，诸如His标签、myc标签等)。
在一些实施方案中，ACC包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中第一单体构建体包含第一细胞因子多肽(CP1)、第一二聚化结构域(DD1)和第一掩蔽部分(MM1)，
第二单体构建体包含第二细胞因子多肽(CP2)、第一可裂解部分(CM1)、通过CM1与CP2偶联的第二二聚化结构域(DD2)和第二掩蔽部分(MM2)，
MM1和/或MM2是本文所述的MM，并且
DD1和DD2彼此结合，从而形成第一单体构建体和第二单体构建体的二聚体。
在一些实施方案中，第一单体构建体还包含第二可裂解部分(CM2)，并且MM1通过CM2与CP1偶联。在一些实施方案中，MM2通过CM1与CP2偶联。在一些实施方案中，第二单体构建体还包含第三可裂解部分(CM3)，其中MM2通过CM3与CP2偶联。
在一些实施方案中，ACC包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中
第一单体构建体包含第一细胞因子多肽(CP1)、第一二聚化结构域(DD1)和第一掩蔽部分(MM1)，
第二单体构建体包含第二细胞因子多肽(CP2)、第二二聚化结构域(DD2)和第二掩蔽部分(MM2)，
CP1和/或CP2包含用作蛋白酶的底物的氨基酸序列，并且DD1和/或DD2通过氨基酸序列与CP1或CP2偶联，
MM1和/或MM2是本文所述的MM，并且
DD1和DD2彼此结合，从而形成第一单体构建体和第二单体构建体的二聚体。
在一些实施方案中，CP1包含用作蛋白酶的底物的氨基酸序列，并且MM1通过氨基酸序列与CP1偶联。在一些实施方案中，第一单体构建体还包含第一可裂解部分(CM1)，并且MM1通过CM1与CP1偶联。在一些实施方案中，CP2包含用作蛋白酶的底物的氨基酸序列，并且MM2通过氨基酸序列与CP2偶联。在一些实施方案中，第二单体构建体还包含第二可裂解部分(CM2)，并且MM2通过CM2与CP2偶联。
在一些实施方案中，ACC包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中
第一单体构建体包含细胞因子多肽(CP)、第一二聚化结构域(DD1)、第一可裂解部分(CM1)、第二可裂解部分(CM2)和本文所述的MM，其中MM通过CM1与CP偶联，并且DD1通过CM2与CP偶联，
第二单体构建体包含CP的激动剂、第三可裂解部分(CM3)、通过CM3与激动剂偶联的第二二聚化结构域(DD2)，
DD1和DD2彼此结合，从而形成第一单体构建体和第二单体构建体的二聚体。
在一些实施方案中，CP是IL-15，并且激动剂是包含SEQ ID NO: 520的序列的寿司结构域。在一些实施方案中，ACC包含寿司结构域与CM3之间的接头。在一些方面，接头可包括1-10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在一些方面，接头可包括1-3个氨基酸，例如1、2或3个氨基酸，或在一些方面由2个氨基酸组成。
在作为二聚体复合物的ACC中，第一单体构建体和第二单体构建体还可包含额外元件，诸如例如一个或多个接头等。额外元件在以下更详细描述。第一单体构建体和第二单体构建体中的每一个中的CP、CM、MM和DD组分的组织可在每个单体构建体中按相同的顺序排列。与相应CP2、CM2、MM2和DD2相比，CP1、CM1、MM1和DD1组分在例如CP和CM组分(以及在DD组分是多肽的实施方案中的DD组分)的分子量、大小、氨基酸序列等方面可相同或不同。因此，所得二聚体可具有对称或不对称单体构建体组分。
在一些实施方案中，第一单体构建体从CP和CM组分的N末端至C末端包含CP1、CM1和直接或间接(通过接头)连接至CM1的C末端的DD1。在其他实施方案中，第一单体构建体从CP和CM组分的C末端至N末端包含CP1、CM1和直接或间接(通过接头)连接至CM1的N末端的DD1。在一些实施方案中，第二单体构建体从CP和CM组分的N末端至C末端包含CP2、CM2和直接或间接(通过接头)连接至CM2的C末端的DD2。在其他实施方案中，第二单体构建体从CP和CM组分的C末端至N末端包含CP2、CM2和直接或间接(通过接头)连接至CM2的N末端的DD2。在一些实施方案中，包含第一成熟细胞因子多肽(CP1)的第一单体和/或包含第二成熟细胞因子多肽(CP2)的第二单体包含一个或多个MM。在一些实施方案中，ACC还包含MM与CP之间的CM。
在一些实施方案中，可活化细胞因子构建体(ACC)包括第一单体构建体和第二单体构建体，其中：(a)所述第一单体构建体包含第一掩蔽部分(MM1)、第一成熟细胞因子多肽(CP1)、第一可裂解部分和第三可裂解部分(CM1和CM3)以及第一二聚化结构域(DD1)，其中所述CM1位于所述CP1与所述DD1之间，并且所述CM3位于所述MM1与所述CP1之间；并且(b)所述第二单体构建体包含第二成熟细胞因子多肽(CP2)、第二可裂解部分(CM2)和第二二聚化结构域(DD2)，其中所述CM2位于所述CP2与所述DD2之间；其中所述DD1和所述DD2彼此结合，由此形成所述第一单体构建体和所述第二单体构建体的二聚体；并且其中所述ACC的特征在于相较于至少一种CP1和/或CP2活性的对照水平，具有降低的所述至少一种CP1和/或CP2活性的水平。
在一些实施方案中，第二单体构建体还包含第二掩蔽部分(MM2)和第四可裂解部分(CM4)，其中CM4位于MM2与CP2之间。在一些实施方案中，第一单体构建体包含第一多肽，所述第一多肽包含MM1、CM3、CP1、CM1和DD1。在一些实施方案中，第二单体构建体包含第二多肽，所述第二多肽包含CP2、CM2和DD2。在一些实施方案中，第二单体构建体包含第二多肽，所述第二多肽包含MM2、CM4、CP2、CM2和DD2。
发现ACC结构以不导致活化之后细胞因子活性实质上受损的方式高度有效降低成熟细胞因子多肽组分的活性。ACC中CP的活性可通过ACC的结构(例如，二聚体结构)与ACC中的一个或多个掩蔽部分两者来降低。在一些实施方案中，本文所述的ACC的活化条件是暴露于一种或多种可使CP从DD与MM两者解离的蛋白酶。例如，一种或多种蛋白酶可裂解在CP与MM之间的CM和在CP与DD之间的CM。如实施例中所证明，ACC的活化导致细胞因子活性的实质性恢复。结果表明在ACC的情形下，细胞因子组分的构象未被不可逆地改变。
在一些实施方案中，当细胞因子多肽与MM偶联，并且在所述细胞因子多肽的天然结合配偶体(例如，它的受体)存在下时，当在掩蔽效率测定中测量时，与未偶联于MM的细胞因子多肽的结合，不存在或基本上不存在所述细胞因子多肽与所述结合配偶体的结合，或所述细胞因子多肽与它的结合配偶体的结合不超过0.001%、0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或50%，持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更久。例如，掩蔽效率测定可涉及通过例如FACS测量ACC与展示候选掩蔽部分的细胞表面结合的亲和力。另一个非限制性示例性测定包括评估掩蔽部分在治疗相关浓度和时间抑制ACC与其结合配偶体结合的能力。对于第二种方法，已经开发了一种免疫吸附测定法来测量前蛋白与其结合配偶体结合的时间依赖性结合，如US20200308243中所述，所述文献通过引用以其整体并入本文。在实施方案中，掩蔽效率测定可涉及测量IL-2/IL15反应性HEK293细胞中分泌性碱性磷酸酶(SEAP)的产生水平。
在某些实施方案中，第一单体构建体和第二单体构建体被定向为使得二聚体的每个成员中的组分从CP和CM组分的N末端至C末端按相同的顺序组织。图2是说明性可活化细胞因子构建体的示意图，所述可活化细胞因子构建体从N末端至C末端包含：(1)第一单体构建体110，所述第一单体构建体具有任选的MM1119、任选的CM3117、CP1115、CM1113和DD1111；和(2)第二单体构建体120，所述第二单体构建体具有任选的MM2129、任选的CM4127、CP2125、CM2123和DD2121；和(3)一个或多个使第一单体构建体110键合于第二单体构建体120的共价或非共价键(← →)。ACC还可在组分之间包含任选的接头112、114、116、118、122、124、126和128中的一个或多个。在一个实例中，DD1111和DD2121是相同的。在另一实例中，DD1111和DD2121是不同的。在一些实例中，DD1111和DD2121是彼此结合的不同多肽。
在替代方面，描绘为CP1115和CP2125的两个部分中的一个是缺乏细胞因子活性的突变细胞因子多肽。在替代方面，描绘为CP1115和CP2125的两个部分中的一个是缺乏细胞因子活性的多肽序列，例如信号部分和/或残段序列。在替代方面，描绘为CP1115和CP2125的两个部分中的第一部分是以高亲和力结合至描绘为CP1115和CP2125的两个部分中的第二部分，并且使第二部分的细胞因子活性与第二部分的对照水平相比降低的多肽序列。
图3A至图3E示出了ACC的额外示例性实施方案。这些图中附着于掩蔽部分的基底的任何描述都是本发明的任选的和示例性方面，并且CM或CM-MM特征是任选的和非限制性的。图3C的构建体的实例包括ProC2982 (SEQ ID NO: 525与SEQ ID NO: 526复合并与第二个相同的单体构建体复合物二聚化)，并且图3D的构建体的实例包括ProC3571 (SEQ IDNO: 528使用杵-臼Fc二聚体与SEQ ID NO: 527二聚化)。在一些方面，ACC可包括细胞因子多肽，例如IL-15，或其生物活性片段、CM和MM。在一些方面，ACC可包括第一单体构建体和第二单体构建体，每个单体构建体包括细胞因子多肽(例如，IL-15)或其生物活性片段、CM、MM和DD，其中第一单体构建体和第二单体构建体通过DD二聚化。在一些方面，ACC可包括第一单体构建体，其包括细胞因子多肽(例如，IL-15)或其生物活性片段、CM、MM和DD，以及第二单体建构体，其包括寿司结构域或其片段、CM和DD，其中第一单体构建体和第二单体构建体通过DD二聚化。在一些方面，ACC可包括第一单体构建体和第二单体构建物，第一单体建构体包括通过CM1连接到DD1的细胞因子多肽(例如，IL-15)或其生物活性片段，第二单体建构体包括连接至DD2的MM，其中第一单体构建体和第二单体构建物通过DD1和DD2二聚化。在一些方面，MM通过第二单体构建体上的CM2连接到DD2。在一些方面，细胞因子多肽通过第一单体构建体上的寿司结构域连接至CM1。在一些方面，ACC可包括细胞因子多肽(例如，IL-15)或其生物活性片段、CM、MM，并且IL-15连接至寿司结构域或其片段。在一些方面，ACC可包括第一单体构建体和第二单体构建体，每个单体构建体包括细胞因子多肽(例如，IL-15)或其生物活性片段、CM、MM和DD，其中第一单体构建体和第二单体构建体通过DD二聚化，并且其中每个IL-15结合至寿司结构域或其片段。
本文所描述的ACC的活化条件是暴露于可裂解ACC中的可裂解部分(CM)中的至少一个的蛋白酶。如实例中所证明的，ACC的活化导致细胞因子活性的明显恢复。结果表明在ACC的情形下，细胞因子组分的构象未被不可逆地改变。
成熟细胞因子多肽CP1和CP2可为相同的或不同的。在某些具体实施方案中，CP1和CP2是相同的。在其他实施方案中，CP1和CP2是不同的。ACC可在CP1和/或CP2的N末端和/或C末端中的任一者或两者处包含额外氨基酸残基。
二聚化结构域(DD)
作为二聚体复合物的ACC的每个单体构建体可采用多种二聚化结构域(DD)中的任一者。合适的DD包括聚合(例如，合成聚合物、多肽、多核苷酸等)和小分子(具有小于约1千道尔顿，并且有时小于约800道尔顿的分子量的非聚合部分)类型的部分。DD对可为本领域中已知会彼此结合的任何一对部分。
例如，在一些实施方案中，DD1和DD2是选自以下组的一对成员：来自人IL-15受体α链(IL15Rα)的寿司结构域和可溶性IL-15；barnase和barnstar；PKA和AKAP；基于突变的RNA酶I片段的衔接子/对接标签分子；一对抗原结合结构域(例如，一对单结构域抗体)；基于蛋白质突触蛋白、突触结合蛋白、小突触小泡蛋白和SNAP25的相互作用的可溶性N-乙基-马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)模块；单结构域抗体(sdAb)和相应表位；抗原结合结构域(例如，单链抗体(诸如单链可变片段(scFv))、单结构域抗体等)和相应表位；卷曲螺旋多肽结构(例如，Fos-Jun卷曲螺旋结构、酸/碱卷曲螺旋线、Glu-Lys卷曲螺旋线、亮氨酸拉链结构)、小分子结合对，诸如生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、胺/醛、凝集素/碳水化合物；可彼此结合的一对聚合物，诸如一对含硫聚合物或含硫醇聚合物(例如，一对Fc结构域、一对硫醇化人血清白蛋白多肽等)；等等。
在一些实施方案中，DD1和DD2是非多肽聚合物。非多肽聚合物可彼此共价结合。在一些实例中，非多肽聚合物是含硫聚合物，例如含硫聚乙二醇。在此类情况下，DD1和DD2通过一个或多个二硫键彼此共价结合。
当DD1和DD2对是一对表位和抗原结合结构域的成员时，表位可为天然或非天然存在的表位。示例性的非天然存在的表位包括例如非天然存在的肽，诸如像多His肽(例如His标签等)。
在某些具体实施方案中，DD1和DD2是一对Fc结构域。如本文所用，“Fc结构域”是指免疫球蛋白的单个重链的连续氨基酸序列。一对Fc结构域缔合在一起以形成免疫球蛋白的Fc区。
在一些实施方案中，Fc结构域对是人Fc结构域对(例如，野生型人Fc结构域对)。在一些实施方案中，人Fc结构域是人IgG1 Fc结构域(例如，野生型人IgG1 Fc结构域)、人IgG2Fc结构域(例如，野生型人IgG2 Fc结构域)、人IgG3 Fc结构域(例如，野生型人IgG3 Fc结构域)或人IgG4 Fc结构域(例如，野生型人IgG4 Fc结构域)。在一些实施方案中，人Fc结构域包含与SEQ ID NO: 3至少80%同一(例如，至少82%、至少84%、至少85%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一)的序列。
在一些实施方案中，Fc结构域对包含Fc结构域的杵突变体和臼突变体。杵突变体和臼突变体可彼此相互作用以促进二聚化。在一些实施方案中，杵突变体和臼突变体可在两个Fc结构域之间的界面内(例如在CH3结构域中)包含一个或多个氨基酸修饰。在一个实例中，修饰包含一条抗体重链中的氨基酸取代T366W和任选氨基酸取代S354C，以及另一条抗体重链中的氨基酸取代T366S、L368A、Y407V和任选Y349C (根据Kabat编号系统的EU索引进行编号)。杵和臼突变体的实例包括SEQ ID NO: 315和316的Fc突变体，以及美国专利号5,731,168；7,695,936；和10,683,368中所描述的那些突变体，所述专利通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，二聚化结构域包含分别与SEQ ID NO: 315和316至少80%同一(例如，至少82%、至少84%、至少85%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一)的序列。在一些实施方案中，人Fc结构域包含突变N297Q、N297A或N297G；在一些实施方案中，人Fc结构域在位置234和/或235处包含突变，例如L235E，或L234A和L235A (在IgG1中)，或F234A和L235A (在IgG4中)；在一些实施方案中，人Fc结构域是包含突变V234A、G237A、P238S、H268Q/A、V309L、A330S或P331S或它们的组合(全都根据EU编号)的IgG2 Fc结构域。本领域技术人员已知工程化人Fc结构域的其他实例。其中至少一个氨基酸中的突变导致Fc功能降低的Ig重链恒定区氨基酸的实例包括但不限于重链恒定区的氨基酸228、233、234、235、236、237、239、252、254、256、265、270、297、318、320、322、327、329、330和331中的突变(均根据EU编号)。突变氨基酸组合的实例也是本领域已知的，诸如但不限于氨基酸234、235和331中的突变组合，诸如L234F、L235E和P331S，或氨基酸318、320和322的组合，诸如E318A、K320A和K322A。
工程化Fc结构域的其他实例包括F243L/R292P/Y300L/V305I/P396 IgG1；S239D/I332E IgG1；S239D/I332E/A330L IgG1；S298A/E333A/K334A；在一个重链中，L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A IgG1，并且在相反重链中，D270E/K326D, A330M/K334EIgG；G236A/S239D/I332E IgG1；K326W/E333S IgG1；S267E/H268F/S324T IgG1；E345R/E430G/S440Y IgG1；N297A或N297Q或N297G IgG1；L235E IgG1；L234A/L235A IgG1；F234A/L235A IgG4；H268Q/V309L/A330S/P331S IgG2；V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331SIgG2；M252Y/S254T/T256E IgG1；M428L/N434S IgG1；S267E/L328F IgG1；N325S/L328F IgG1等。在一些实施方案中，工程化Fc结构域包含一个或多个选自由N297A IgG1、N297Q IgG1和S228P IgG4组成的组的取代。
在一些方面，二聚化结构域是其中已缺失上铰链残基的IgG Fc区。例如，Fc是其中已缺失N末端序列EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 387)、ERK、ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 388)或ESKYGPP (SEQ ID NO: 389)的变体。
在一些方面，DD或者DD1和/或DD2还可包括血清半衰期延长部分(例如，结合血清蛋白的多肽，诸如免疫球蛋白(例如，IgG)或血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA)))。半衰期延长部分的实例包括六hat GST (谷胱甘肽S-转移酶)谷胱甘肽亲和力、钙调蛋白(Calmodulin)结合肽(CBP)、Strep标签、纤维素结合结构域、麦芽糖结合蛋白、S肽标签、几丁质结合标签、免疫反应性表位、表位标签、E2Tag、HA表位标签、Myc表位、FLAG表位、AU1和AU5表位、Glu-Glu表位、KT3表位、IRS表位、Btag表位、蛋白激酶-C表位和VSV表位。
在一些实施方案中，DD1和/或DD2各自包括总计约5个氨基酸至约250个氨基酸、约5个氨基酸至约200个氨基酸、约5个氨基酸至约180个氨基酸、约5个氨基酸至约160个氨基酸、约5个氨基酸至约140个氨基酸、约5个氨基酸至约120个氨基酸、约5个氨基酸至约100个氨基酸、约5个氨基酸至约80个氨基酸、约5个氨基酸至约60个氨基酸、约5个氨基酸至约40个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约250个氨基酸、约10个氨基酸至约200个氨基酸、约10个氨基酸至约180个氨基酸、约10个氨基酸至约160个氨基酸、约10个氨基酸至约140个氨基酸、约10个氨基酸至约120个氨基酸、约10个氨基酸至约100个氨基酸、约10个氨基酸至约80个氨基酸、约10个氨基酸至约60个氨基酸、约10个氨基酸至约40个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约250个氨基酸、约20个氨基酸至约200个氨基酸、约20个氨基酸至约180个氨基酸、约20个氨基酸至约160个氨基酸、约20个氨基酸至约140个氨基酸、约20个氨基酸至约120个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸、约20个氨基酸至约80个氨基酸、约20个氨基酸至约60个氨基酸、约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约250个氨基酸、约40个氨基酸至约200个氨基酸、约40个氨基酸至约180个氨基酸、约40个氨基酸至约160个氨基酸、约40个氨基酸至约140个氨基酸、约40个氨基酸至约120个氨基酸、约40个氨基酸至约100个氨基酸、约40个氨基酸至约80个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约250个氨基酸、约60个氨基酸至约200个氨基酸、约60个氨基酸至约180个氨基酸、约60个氨基酸至约160个氨基酸、约60个氨基酸至约140个氨基酸、约60个氨基酸至约120个氨基酸、约60个氨基酸至约100个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约250个氨基酸、约80个氨基酸至约200个氨基酸、约80个氨基酸至约180个氨基酸、约80个氨基酸至约160个氨基酸、约80个氨基酸至约140个氨基酸、约80个氨基酸至约120个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约250个氨基酸、约100个氨基酸至约200个氨基酸、约100个氨基酸至约180个氨基酸、约100个氨基酸至约160个氨基酸、约100个氨基酸至约140个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约250个氨基酸、约120个氨基酸至约200个氨基酸、约120个氨基酸至约180个氨基酸、约120个氨基酸至约160个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约250个氨基酸、约140个氨基酸至约200个氨基酸、约140个氨基酸至约180个氨基酸、约140个氨基酸至约160个氨基酸、约160个氨基酸至约250个氨基酸、约160个氨基酸至约200个氨基酸、约160个氨基酸至约180个氨基酸、约180个氨基酸至约250个氨基酸、约180个氨基酸至约200个氨基酸、约200个氨基酸至约250个氨基酸、约210至约220个氨基酸、约215至约225个氨基酸、约215至约220个氨基酸、约217至约200个氨基酸或约218至约200个氨基酸。在一些实施方案中，DD1和DD2各自是包含铰链区的一部分(所述部分包括两个半胱氨酸残基)、CH2结构域和CH3结构域的Fc结构域。在一些实施方案中，DD1和DD2各自是其N末端是铰链区中在N方向至C方向上读取的第一个半胱氨酸残基(例如，人类IgG1或IgG4的半胱氨酸226，使用EU编号)的Fc结构域。
在一些实施方案中，第一单体和/或第二单体可各自包括总共约150个氨基酸至约800个氨基酸、约150个氨基酸至约750个氨基酸、约150个氨基酸至约700个氨基酸、约150个氨基酸至约650个氨基酸、约150个氨基酸至约600个氨基酸、约150个氨基酸至约550个氨基酸、约150个氨基酸至约500个氨基酸、约150个氨基酸至约450个氨基酸、约150个氨基酸至约400个氨基酸、约150个氨基酸至约350个氨基酸、约150个氨基酸至约300个氨基酸、约150个氨基酸至约250个氨基酸、约150个氨基酸至约200个氨基酸、约200个氨基酸至约800个氨基酸、约200个氨基酸至约750个氨基酸、约200个氨基酸至约700个氨基酸、约200个氨基酸至约650个氨基酸、约200个氨基酸至约600个氨基酸、约200个氨基酸至约550个氨基酸、约200个氨基酸至约500个氨基酸、约200个氨基酸至约450个氨基酸、约200个氨基酸至约400个氨基酸、约200个氨基酸至约350个氨基酸、约200个氨基酸至约300个氨基酸、约200个氨基酸至约250个氨基酸、约250个氨基酸至约800个氨基酸、约250个氨基酸至约750个氨基酸、约250个氨基酸至约700个氨基酸、约250个氨基酸至约650个氨基酸、约250个氨基酸至约600个氨基酸、约250个氨基酸至约550个氨基酸、约250个氨基酸至约500个氨基酸、约250个氨基酸至约450个氨基酸、约250个氨基酸至约400个氨基酸、约250个氨基酸至约350个氨基酸、约250个氨基酸至约300个氨基酸、约300个氨基酸至约800个氨基酸、约300个氨基酸至约750个氨基酸、约300个氨基酸至约700个氨基酸、约300个氨基酸至约650个氨基酸、约300个氨基酸至约600个氨基酸、约300个氨基酸至约550个氨基酸、约300个氨基酸至约500个氨基酸、约300个氨基酸至约450个氨基酸、约300个氨基酸至约400个氨基酸、约300个氨基酸至约350个氨基酸、约350个氨基酸至约800个氨基酸、约350个氨基酸至约750个氨基酸、约350个氨基酸至约700个氨基酸、约350个氨基酸至约650个氨基酸、约350个氨基酸至约600个氨基酸、约350个氨基酸至约550个氨基酸、约350个氨基酸至约500个氨基酸、约350个氨基酸至约450个氨基酸、约350个氨基酸至约400个氨基酸、约400个氨基酸至约800个氨基酸、约400个氨基酸至约750个氨基酸、约400个氨基酸至约700个氨基酸、约400个氨基酸至约650个氨基酸、约400个氨基酸至约600个氨基酸、约400个氨基酸至约550个氨基酸、约400个氨基酸至约500个氨基酸、约400个氨基酸至约450个氨基酸、约450个氨基酸至约800个氨基酸、约450个氨基酸至约750个氨基酸、约450个氨基酸至约700个氨基酸、约450个氨基酸至约650个氨基酸、约450个氨基酸至约600个氨基酸、约450个氨基酸至约550个氨基酸、约450个氨基酸至约500个氨基酸、约500个氨基酸至约800个氨基酸、约500个氨基酸至约750个氨基酸、约500个氨基酸至约700个氨基酸、约500个氨基酸至约650个氨基酸、约500个氨基酸至约600个氨基酸、约500个氨基酸至约550个氨基酸、约550个氨基酸至约800个氨基酸、约550个氨基酸至约750个氨基酸、约550个氨基酸至约700个氨基酸、约550个氨基酸至约650个氨基酸、约550个氨基酸至约600个氨基酸、约600个氨基酸至约800个氨基酸、约600个氨基酸至约750个氨基酸、约600个氨基酸至约700个氨基酸、约600个氨基酸至约650个氨基酸、约650个氨基酸至约800个氨基酸、约650个氨基酸至约750个氨基酸、约650个氨基酸至约700个氨基酸、约700个氨基酸至约800个氨基酸、约700个氨基酸至约750个氨基酸或约750个氨基酸至约800个氨基酸。
可裂解部分(CM)
在一些实施方案中，ACC包含一个或多个CM。CM可位于ACC中的两个组分之间，例如，细胞因子多肽与MM之间、细胞因子多肽与DD之间、和/或细胞因子多肽和ACC中的另一个组分之间。在一些实施方案中，MM通过CM与细胞因子多肽偶联，即CM位于白细胞介素与MM之间。
在一些实施方案中，CM直接或间接地(例如，通过接头)位于MM与细胞因子多肽之间。在一些实施方案中，CM直接或间接地(例如，通过接头)位于细胞因子多肽与DD之间。
在一些实施方案中，本文中的CM可包含已在一种癌症或多种癌症中报道过的蛋白酶的底物。参见例如La Roca等人, British J. Cancer 90(7):1414-1421, 2004。适用于本文采用的CM组分中的底物包括更普遍见于癌性细胞和组织中的那些。因此，在某些实施方案中，CM包含更普遍见于与癌症相关的患病组织中的蛋白酶的底物。在一些实施方案中，癌症选自以下组：胃癌、乳腺癌、骨肉瘤和食管癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是HER2阳性癌症。在一些实施方案中，癌症是卡波西肉瘤、毛细胞白血病、慢性髓样白血病(CML)、滤泡性淋巴瘤、肾细胞癌(RCC)、黑素瘤、神经母细胞瘤、基底细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤、鼻咽腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、BCG抗性非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)、子宫内膜癌、胰腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌、食管癌、胆囊癌、胶质瘤、头颈癌、子宫癌、子宫颈癌或睾丸癌等。在一些上述实施方案中，CM组分包含在肿瘤组织中更普遍的蛋白酶的底物。例如，蛋白酶可以由受试者的肿瘤产生。
适用于本文的ACC的CM包括本领域已知的任何蛋白酶底物。在一些实例中，CM可包含丝氨酸蛋白酶(例如，u型纤溶酶原活化剂(uPA，也称为尿激酶))、蛋白裂解酶(本文中也称为MT-SP1或MTSP1)的底物。在一些实例中，CM可包含基质金属蛋白酶(MMP)的底物。在一些实例中，CM可包含半胱氨酸蛋白酶(CP) (例如，豆荚蛋白)的底物。
在一些实施方案中，CM可包含以下各者的底物：解整合素和金属蛋白酶(ADAM)或具有凝血酶敏感素基元的解整合素和金属蛋白酶(ADAMTS) (例如，ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADEMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5)、天冬氨酸蛋白酶(例如，BACE、肾素)、天冬氨酸组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶D、组织蛋白酶E)、凋亡蛋白酶(例如，凋亡蛋白酶1、凋亡蛋白酶2、凋亡蛋白酶3、凋亡蛋白酶4、凋亡蛋白酶5、凋亡蛋白酶6、凋亡蛋白酶7、凋亡蛋白酶8、凋亡蛋白酶9、凋亡蛋白酶10、凋亡蛋白酶14)、半胱氨酸组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶G、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V/L2、组织蛋白酶X/Z/P)、半胱氨酸蛋白酶(例如，克鲁兹蛋白酶(Cruzipain)、豆荚蛋白、Otubain-2)、糜蛋白酶、DESC1、DPP-4、FAP、弹性蛋白酶、FVIIa、FiXA、Fxa、FXIa、FXIIa、颗粒酶B、胍基苯甲酸酶、黑珀素(Hepsin)、HtrA1、人中性粒细胞弹性蛋白酶、KLK (例如，KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14)、金属蛋白酶(例如，穿膜肽酶(Meprin)、脑啡肽酶、PSMA、BMP-1)、乳铁蛋白、马拉素(Marapsin)、间质蛋白酶-2、MT-SP1/间质蛋白酶、NS3/4A、PACE4、纤溶酶、PSA、MMP (例如，MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP23、MMP24、MMP26、MMP27)、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、tPA、凝血酶、类胰蛋白酶和uPA。
在一些实施方案中，CM中的蛋白酶底物可包含与由相同蛋白酶天然裂解的任何多肽序列基本上不同一(例如，不超过90%、80%、70%、60%或50%同一)的多肽序列。
在一些实施方案中，CM包含LSGRSDNH (SEQ ID NO: 552)或PLGLAG (SEQ ID NO:615)的序列或由其组成。在一些实施方案中，CM包含由WO2015048329 (其通过引用以其整体并入本文)中公开的SEQ ID NO: 317-327、329-335、340-347、352-363、371-378、394-401、410-419、425-433、436-449、453-456、458-469、473、475-482、485-495以及WO2015116933 (其通过引用以其整体并入本文)中公开的SEQ ID NO: 1-162、268-306中的任一者的共有序列所涵盖的序列或由其组成。
在一些实施方案中，CM包含WO2015048329中公开的SEQ ID NO: 14-52、126-154、159、315-316、328、336-339、348-351、364-370、379-393、402-409、420-424、434-435、450-452、457、470-472、474、483、484、WO2015116933中公开的SEQ ID NO: 163-267、307-384、402-445、665-683、WO2016118629 (其通过引用以其整体并入本文)中公开的SEQ ID NO:20-21、411、480-482、351-369、18、71、370-380、412-415、468、547-554、319-346以及WO2020118109 (其通过引用以其整体并入本文)中公开的SEQ ID NO: 1-16、50-56、60-63、20、70-76、78-115、120-128、130-132、135-140、141、152、21-23、17-19、25-43中的任一者的序列或由其组成。在一些实例中，半胱氨酸蛋白酶的CM包含AAN、SAN或GPTN (SEQ ID NO:152)的序列或由其组成。CM的实例还包括WO 2010/081173、WO2021207669、WO2021207657、WO2021142029、WO2021061867、WO2020252349、WO2020252358、WO2020236679、WO2020176672、WO2020118109、WO2020092881、WO2020086665、WO2019213444、WO2019183218、WO2019173771、WO2019165143、WO2019075405、WO2019046652、WO2019018828、WO2019014586、WO2018222949、WO2018165619、WO2018085555、WO2017011580、WO2016179335、WO2016179285、WO2016179257、WO2016149201、WO2016014974(其通过引用以其整体并入本文)中所述的CM。
在一些实施方案中，CM包含下表1的CM序列中任一个序列的序列或由其组成或由所述序列的共有序列所涵盖。
表1. CM序列
在一些实施方案中，CM包含上文所讨论的示例性序列的组合、C末端截短变体或N末端截短变体或由其组成。适用于CM中的以上提及的氨基酸序列的截短变体是保留相应蛋白酶的识别位点的任何截短变体。这些变体包括C末端和/或N末端截短变体，所述C末端和/或N末端截短变体包含保留蛋白酶识别位点的上述氨基酸序列的至少3个连续氨基酸，或上述氨基酸序列的至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个氨基酸。在某些实施方案中，上述氨基酸序列的截短变体是对应于任何以上氨基酸序列，但C末端和/或N末端截短1至约10个氨基酸、1至约9个氨基酸、1至约8个氨基酸、1至约7个氨基酸、1至约6个氨基酸、1至约5个氨基酸、1至约4个氨基酸或1至约3个氨基酸，并且：(1)具有至少三个氨基酸残基；并且(2)保留蛋白酶的识别位点的氨基酸序列。在一些前述实施方案中，截短的CM是N末端截短的CM。在一些实施方案中，截短的CM是C末端截短的CM。在一些实施方案中，截短的C是C末端和N末端截短的CM。
在一些实施方案中，CM可总共包含3个氨基酸至25个氨基酸。在一些实施方案中，CM可总共包含3至25、3至20、3至15、3至10、3至5、5至25、5至20、5至15、5至10、10至25、10至20、10至15、15至25、15至20或20至25个氨基酸。
在一些实施方案中，CM通过至少一种蛋白酶以约0.001-1500×104M-1S-1或至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250或1500×104M-1S-1的速率特异性地裂解。所述速率可通过底物裂解动力学(kcat/Km)来测量，如WO2016118629中公开的那样。
在本文所述的任何可活化细胞因子构建体的一些实施方案中，CM包含总计约3个氨基酸至约25个氨基酸。在一些实施方案中，CM包含总计约3个氨基酸至约25个氨基酸、约3个氨基酸至约20个氨基酸、约3个氨基酸至约15个氨基酸、约3个氨基酸至约10个氨基酸、约3个氨基酸至约5个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约25个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸或约20个氨基酸至约25个氨基酸。
在一些实施方案中，ACC包含多个CM，所述多个CM包含不同蛋白酶的底物。在一些实施方案中，二聚体构建体中的CM1和CM2包含不同蛋白酶的底物。在一些实施方案中，二聚体构建体中的CM1和CM2包含相同蛋白酶的底物。
ACC，或作为二聚体复合物的ACC的第一单体构建体和第二单体构建体可包含一个或多个额外组分，包括一个或多个接头等。在一些实施方案中，第一单体可包括设置在CP与CM之间的接头。在一些实施方案中，CP和CM彼此直接邻接。
在一些实施方案中，在作为二聚体复合物的ACC中，第一单体可包含设置在CP1与CM1之间的接头。在一些实施方案中，CP1和CM1在第一单体中彼此直接邻接。在一些实施方案中，第一单体包含设置在CM1与DD1之间的接头。在一些实施方案中，接头具有1个氨基酸至约15个氨基酸的总长度。在一些实施方案中，CM1和DD1在第一单体中彼此直接邻接。在一些实施方案中，CM和设置在CP1与DD1之间的任何接头具有3至15个氨基酸、或3至10个氨基酸、或3至7个氨基酸的组合总长度。
在一些实施方案中，第二单体包含设置在CP2与CM2之间的接头。在一些实施方案中，CP2和CM2在第二单体中彼此直接邻接。在一些实施方案中，第二单体包含设置在CM2与DD2之间的接头。在一些实施方案中，接头具有1个氨基酸至约15个氨基酸的总长度。在一些实施方案中，接头包含G；GG；或GGGS (SEQ ID NO: 2)的序列。在一些实施方案中，CM2 (例如，本文所描述的可裂解部分中的任一个)和DD2 (例如，本文所描述的DD中的任一个)在第二单体中彼此直接邻接。在一些实施方案中，CM和设置在CP2与DD2之间的任何接头具有3至15个氨基酸、或3至10个氨基酸、或3至7个氨基酸的组合总长度。
细胞因子掩蔽部分(MM)和阻断部分(BM)
在一些实施方案中，细胞因子掩蔽部分(MM)包含设置在第一掩蔽亚基与第二掩蔽亚基之间的接头。
在一些实施方案中，所述第二掩蔽亚基由编码受体多肽的氨基酸序列的第二子序列编码，所述受体多肽选自由编码所述第一受体多肽的所述氨基酸序列和编码所述细胞因子的所述受体的第二受体多肽的氨基酸序列组成的组，其中在编码所述第一受体多肽的所述氨基酸序列内，所述第一子序列和所述第二子序列不连续。
在一些实施方案中，细胞因子受体的受体多肽是受体的细胞外结构域。细胞因子受体的细胞外结构域已在文献中鉴定，所述文献例如Wang, Xinquan等人 “Structuralbiology of shared cytokine receptors.”Annual review of immunology27 (2009):29-60，其通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，对细胞因子具有结合亲和力的此类肽包括表2中公开的序列。
表2. 与适当细胞因子相关的掩蔽肽(MM)的实例
在一些实施方案中，第二掩蔽亚基由编码阻断部分(BM)的第二氨基酸序列编码。在一些实施方案中，BM是与细胞因子多肽结合的多肽，但不是细胞因子受体多肽或细胞因子受体多肽的子序列。因此，BM特异性和/或选择性结合细胞因子多肽而不是肿瘤抗原或组织抗原。在一些实例中，BM可以是抗体或抗体片段(例如，Fab片段、F(ab')2片段、scFv、scAb、骆驼型纳米抗体(VHH)的可变结构域、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体)、模拟抗体结合和/或结构的非免疫球蛋白(例如，抗促凝素、亲和素、亲和体分子、亲和体、亲和素、alphabody、avimer、DARPin、fynomer、kunitz结构域肽、单体抗体)以及基于其他工程支架(诸如SpA、GroEL、纤连蛋白、脂质运载蛋白和CTLA4支架)的结合结构域，其与细胞因子多肽结合，从而中断细胞因子多肽与其靶标的结合。在一些实例中，BM可以是与细胞因子多肽结合并中断细胞因子多肽与其靶标结合的肽。
本文提供了筛选候选肽以获得选择性和/或特异性结合细胞因子多肽的BM肽的方法，并且可包括蛋白质展示方法和筛选候选肽以识别BM的方法，例如在US20200308243A1、WO2009025846A2和WO2010081173中描述，所述文献通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，BM包括WO2022/197764、WO2010096838A2、WO2020/069398 A1和WO2019/246392中公开的掩蔽部分序列，所述文献通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，BM包含对细胞因子具有结合亲和力的scFv。
在一些方面，BM是一种空间掩码，其通过空间位阻抑制细胞因子与其结合配偶体的结合。
在一些实施方案中，第一子序列和第二子序列是相同的。在一些实施方案中，第一子序列和第二子序列是不同的。
在一些实施方案中，第一受体多肽和第二受体多肽是相同的。在一些实施方案中，第一受体多肽和第二受体多肽是不同的。
在一些实施方案中，细胞因子MM可操作地连接到细胞因子。在一些方面，细胞因子MM直接或通过接头与细胞因子连接，并置于功能关系中，使得细胞因子MM能够结合细胞因子并抑制细胞因子多肽与其在受试者体内的结合配偶体之间的相互作用。
额外掩蔽部分(MM)
在一些实施方案中，本文中的ACC除了上述MM之外还可包含一个或多个MM。下文针对额外MM讨论的以下公开内容和实施方案也适用于根据本文所述的任何实施方案的BM。在一些实施方案中，额外MM与细胞因子多肽相互作用，由此降低或抑制细胞因子多肽与它的结合配偶体之间的相互作用。在一些实施方案中，额外MM包含细胞因子多肽的天然存在的结合配偶体的至少部分或全部氨基酸序列。例如，额外MM可为天然存在的结合配偶体的片段。片段可保留与天然存在的结合配偶体不超过95%、90%、80%、75%、70%、60%、50%、40%、30%、25%或20%的核酸或氨基酸序列同源性。如本文所用，术语“天然存在”当应用于对象时是指对象可在自然界中找到的事实。例如，可从自然界中的来源分离并且不通过人在实验室中或以其它方式有意修饰的存在于生物(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列为天然存在的。
在一些实施方案中，额外MM包含非天然存在的氨基酸序列，或不含有天然存在的结合配偶体的氨基酸序列。在某些实施方案中，MM不是细胞因子多肽的天然结合配偶体。额外MM可为细胞因子多肽的修饰结合配偶体，其含有降低与细胞因子多肽的结合亲和力和/或亲合力的氨基酸变化。在一些实施方案中，额外MM不含有或基本上不含有与细胞因子多肽的天然结合配偶体的核酸或氨基酸同源性。在其他实施方案中，额外MM与细胞因子多肽的天然结合配偶体不超过5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%类似。
在一些实施方案中，额外MM不特异性结合至细胞因子多肽，而是通过非特异性相互作用诸如空间位阻(“空间掩码”)来干扰细胞因子多肽与它的结合配偶体结合。例如，额外MM可位于ACC中，使得ACC的三级或四级结构允许额外MM通过基于电荷的相互作用掩蔽细胞因子多肽，由此将额外MM保持在在适当位置以干扰结合配偶体接近细胞因子多肽。
在一些实施方案中，额外MM对结合至细胞因子多肽的解离常数不大于细胞因子多肽与结合配偶体的解离常数。在一些实施方案中，额外MM在裂解状态下不干扰或竞争细胞因子多肽与结合配偶体的结合。
可根据诸如为干扰蛋白质与结合配偶体的结合所需的最小氨基酸序列、目标结合配偶体蛋白质-蛋白质结合对、细胞因子多肽的大小、接头的存在或不存在等的因素选择MM的结构性质。
在一些实施方案中，对于偶联的细胞因子多肽来说，额外MM是独特的。额外MM的实例包括被特异性筛选以结合细胞因子多肽或其片段的结合结构域的MM (例如，亲和力掩码)。用于筛选MM以获得对于细胞因子多肽来说独特的MM和特异性和/或选择性结合结合配偶体的结合结构域的那些MM的方法在本文中提供，并且可包括蛋白质展示方法。
在一些实施方案中，额外MM是长度为约2至50个氨基酸的多肽。例如，额外MM可以是长度为2至40、2至30、2至20、2至10、5至15、10至20、15至25、20至30、25至35、30至40、35至45、40至50个氨基酸的多肽。例如，额外MM可以是长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸的多肽。在一些实例中，额外MM可以是长度超过50个氨基酸，例如100、200、300、400、500、600、700、800或更多个氨基酸的多肽。
在一些实施方案中，当在例如如US20200308243A1中所述的体外免疫吸附测定中测量时，在具有细胞因子多肽和干扰MM的ACC的非活性状态下，在存在细胞因子多肽的结合配偶体下，细胞因子多肽与它的结合配偶体无结合或基本上无结合，或者与无干扰MM的对应抗体的结合相比，细胞因子多肽与它的结合配偶体的结合不超过0.001%、0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或50%，持续至少0.1、0.5、1、2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。
在干扰MM下细胞因子多肽对结合配偶体的结合亲和力可比当不存在干扰MM时细胞因子多肽对它的结合配偶体的结合亲和力低至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍，或当不存在干扰MM时细胞因子多肽对它的结合配偶体的结合亲和力低5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍。
MM对其掩蔽的细胞因子多肽的解离常数可能大于细胞因子多肽对结合配偶体的解离常数。MM对掩蔽的细胞因子多肽的解离常数可比细胞因子多肽对结合配偶体的解离常数大至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍。相反，MM对掩蔽的细胞因子多肽的结合亲和力可能低于细胞因子多肽对结合配偶体的结合亲和力。MM对细胞因子多肽的结合亲和力可为细胞因子多肽对结合配偶体的结合亲和力的至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍。
在一些实施方案中，额外MM含有遗传编码氨基酸或遗传非编码氨基酸。遗传非编码氨基酸的实例包括但不限于D-氨基酸、β-氨基酸和γ-氨基酸。在具体实施方案中，MM含有不超过50%、40%、30%、20%、15%、10%、5%或1%的遗传非编码氨基酸。
在一些实施方案中，一旦从ACC释放并处于游离状态，额外MM具有生物活性或治疗作用，诸如结合能力。例如，游离肽可与相同或不同的结合配偶体结合。在某些实施方案中，游离MM发挥治疗作用，从而为本文公开的组合物提供次要功能。在一些实施方案中，一旦与TB解偶联并处于游离状态，MM可有利地不展现生物活性。例如，在一些实施方案中，处于游离状态的MM不在受试者中引发免疫反应。
适合的额外MM可通过筛选程序从具有可变MM的候选ACC的文库鉴定和/或进一步优化。例如，可选择细胞因子多肽和CM以提供所需酶/靶标组合，并且可通过下文所述的鉴定提供可转换表型的MM的筛选程序鉴定额外MM的氨基酸序列。例如，随机肽文库(例如，包含2至40个氨基酸或更多个氨基酸的肽的随机肽文库)可在本文公开的筛选方法中用于鉴定适合的MM。
本文提供了筛选候选肽以获得细胞因子多肽特有的MM的方法，并且可包括蛋白质展示方法和筛选候选肽以鉴定掩蔽部分(MM)、阻断部分(BM)或额外MM的方法，例如US20200308243A1、WO2009025846A2和WO2010081173中所述，所述文献通过引用以其整体并入本文。
额外MM和BM肽的实例包括与IL-15和/或IL-2结合的多肽，例如SEQ ID NO: 358-374中的任一个。
接头
在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，一个或多个接头(例如，柔性接头)引入可活化细胞因子构建体中以在一个或多个在结构域之间的接界、在部分之间的接界、在部分与结构域之间的接界处，或在接头将有益的任何其他接界处提供柔性。在一些实施方案中，当ACC以构象受约束构建体形式提供时，插入柔性接头以有助于未裂解的可活化细胞因子构建体中结构的形成和维持。本文所述的任何接头都可提供所需柔性以有助于抑制结合配偶体(例如，细胞因子的受体)的结合，或有助于蛋白酶对CM的裂解。在一些实施方案中，全部或部分柔性的接头包括在ACC中，使得接头可包括柔性接头以及一个或多个赋予柔性较小的结构的部分以提供所需ACC。一些接头可包括半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基可形成二硫键并降低构建体的柔性。在一些实施方案中，减少接头或连接区的长度会降低ACC中成熟细胞因子多肽的活性。在大多数情况下，接头长度通过在N至C方向上对从接头的与先前组分的C末端氨基酸邻接的N末端到接头的与之后组分的N末端氨基酸邻接的C末端的氨基酸数目进行计数来确定(即其中接头长度不包括先前组分的C末端氨基酸或之后组分的N末端氨基酸)。在其中在包含Fc结构域的DD的N末端使用接头的实施方案中，接头长度是通过计数从与前一个组分的C末端氨基酸邻接的接头的N末端至与Fc铰链区的第一个半胱氨酸邻接的接头的C末端的氨基酸的数量来确定(即接头长度不包括前一个组分的C末端氨基酸或Fc铰链区的第一个半胱氨酸)。
在一些实施方案中，本公开的ACC包括CP与在二聚化结构域之间的近端相互作用点之间的氨基酸链段(参见图4中的实例)。所述段氨基酸可称为连接区(LR)。如本文所用，术语“连接区”或“LR”是指在细胞因子的C末端与N末端邻接二聚化结构域之间相互作用的近点的氨基酸残基之间的一段氨基酸残基(即连接区不包括细胞因子的C末端氨基酸或DD的N末端氨基酸，所述DD与相应第二单体的DD形成相互作用的近点)。例如，当DD是一对Fc结构域时，连接区是细胞因子的C末端与参与Fc的二硫键联的第一个N末端半胱氨酸残基之间的一段氨基酸残基(例如IgG1或IgG4 Fc结构域的半胱氨酸226，根据EU编号)。当二聚化结构域不是肽时，则连接区是从细胞因子的C末端至最后一个氨基酸的一段氨基酸残基。例如，当DD是生物素-链霉亲和素对时，含有生物素的单体的连接区是在细胞因子的C末端与生物素分子之间的氨基酸残基链段，并且含有链霉亲和素的单体的连接区是在细胞因子的C末端与链霉亲和素分子之间的氨基酸残基链段。在一些方面，连接区可包含不超过24、18、14、12、11、10、9、8、7、6、5或4个氨基酸，例如，5至14、7至12、7至11或8至11个氨基酸。
在一些实施方案中，额外氨基酸序列位于任何ACC的任何结构域的N末端或C末端。实例包括但不限于靶向部分(例如，存在于靶组织中的细胞的受体的配体)和血清半衰期延长部分(例如，结合血清蛋白的多肽，诸如免疫球蛋白(例如，IgG)或血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(I)))。
在本文所述的任何可活化细胞因子构建体的一些实施方案中，接头可包括总计约1个氨基酸至约25个氨基酸(例如，约1个氨基酸至约24个氨基酸、约1个氨基酸至约22个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约18个氨基酸、约1个氨基酸至约16个氨基酸、约1个氨基酸至约15个氨基酸、约1个氨基酸至约14个氨基酸、约1个氨基酸至约12个氨基酸、约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约8个氨基酸、约1个氨基酸至约6个氨基酸、约1个氨基酸至约5个氨基酸、约1个氨基酸至约4个氨基酸、约1个氨基酸至约3个氨基酸、约1个氨基酸至约2个氨基酸、约2个氨基酸至约25个氨基酸、约2个氨基酸至约24个氨基酸、约2个氨基酸至约22个氨基酸、约2个氨基酸至约20个氨基酸、约2个氨基酸至约18个氨基酸、约2个氨基酸至约16个氨基酸、约2个氨基酸至约15个氨基酸、约2个氨基酸至约14个氨基酸、约2个氨基酸至约12个氨基酸、约2个氨基酸至约10个氨基酸、约2个氨基酸至约8个氨基酸、约2个氨基酸至约6个氨基酸、约2个氨基酸至约5个氨基酸、约2个氨基酸至约4个氨基酸、约2个氨基酸至约3个氨基酸、约4个氨基酸至约25个氨基酸、约4个氨基酸至约24个氨基酸、约4个氨基酸至约22个氨基酸、约4个氨基酸至约20个氨基酸、约4个氨基酸至约18个氨基酸、约4个氨基酸至约16个氨基酸、约4个氨基酸至约15个氨基酸、约4个氨基酸至约14个氨基酸、约4个氨基酸至约12个氨基酸、约4个氨基酸至约10个氨基酸、约4个氨基酸至约8个氨基酸、约4个氨基酸至约6个氨基酸、约4个氨基酸至约5个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约24个氨基酸、约5个氨基酸至约22个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约18个氨基酸、约5个氨基酸至约16个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约14个氨基酸、约5个氨基酸至约12个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约8个氨基酸、约5个氨基酸至约6个氨基酸、约6个氨基酸至约25个氨基酸、约6个氨基酸至约24个氨基酸、约6个氨基酸至约22个氨基酸、约6个氨基酸至约20个氨基酸、约6个氨基酸至约18个氨基酸、约6个氨基酸至约16个氨基酸、约6个氨基酸至约15个氨基酸、约6个氨基酸至约14个氨基酸、约6个氨基酸至约12个氨基酸、约6个氨基酸至约10个氨基酸、约6个氨基酸至约8个氨基酸、约8个氨基酸至约25个氨基酸、约8个氨基酸至约24个氨基酸、约8个氨基酸至约22个氨基酸、约8个氨基酸至约20个氨基酸、约8个氨基酸至约18个氨基酸、约8个氨基酸至约16个氨基酸、约8个氨基酸至约15个氨基酸、约8个氨基酸至约14个氨基酸、约8个氨基酸至约12个氨基酸、约8个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约10个氨基酸至约24个氨基酸、约10个氨基酸至约22个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约18个氨基酸、约10个氨基酸至约16个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约14个氨基酸、约10个氨基酸至约12个氨基酸、约12个氨基酸至约25个氨基酸、约12个氨基酸至约24个氨基酸、约12个氨基酸至约22个氨基酸、约12个氨基酸至约20个氨基酸、约12个氨基酸至约18个氨基酸、约12个氨基酸至约16个氨基酸、约12个氨基酸至约15个氨基酸、约12个氨基酸至约14个氨基酸、约14个氨基酸至约25个氨基酸、约14个氨基酸至约24个氨基酸、约14个氨基酸至约22个氨基酸、约14个氨基酸至约20个氨基酸、约14个氨基酸至约18个氨基酸、约14个氨基酸至约16个氨基酸、约14个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约25个氨基酸、约15个氨基酸至约24个氨基酸、约15个氨基酸至约22个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约15个氨基酸至约18个氨基酸、约15个氨基酸至约16个氨基酸、约16个氨基酸至约25个氨基酸、约16个氨基酸至约24个氨基酸、约16个氨基酸至约22个氨基酸、约16个氨基酸至约20个氨基酸、约16个氨基酸至约18个氨基酸、约18个氨基酸至约25个氨基酸、约18个氨基酸至约24个氨基酸、约18个氨基酸至约22个氨基酸、约18个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约20个氨基酸至约24个氨基酸、约20个氨基酸至约22个氨基酸、约22个氨基酸至约25个氨基酸、约22个氨基酸至约24个氨基酸或约24个氨基酸至约25个氨基酸)。
在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，接头包括总计约1个氨基酸、约2个氨基酸、约3个氨基酸、约4个氨基酸、约5个氨基酸、约6个氨基酸、约7个氨基酸、约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、约19个氨基酸、约20个氨基酸、约21个氨基酸、约22个氨基酸、约23个氨基酸、约24个氨基酸或约25个氨基酸。
在一些实施方案中，ACC不包含CP与DD之间的任何接头。相对于野生型成熟细胞因子，此类ACC可表现出细胞因子活性的最显著降低。此外，CP与DD之间没有接头的配置仍可允许有效裂解位于CP与DD之间的CM。因此，在一些实施方案中，ACC在CP与DD之间不包含任何接头，并且CP与DD之间的CM包含不超过10、9、8、7、6、5、4或3个氨基酸。在一些实施方案中，LR中的氨基酸总数包含不超过25个氨基酸，例如不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3个氨基酸，或3至10个氨基酸或5至15个氨基酸，或7至12个氨基酸，或从由3至25个氨基酸涵盖的范围内选择的任何范围或指定数目个氨基酸。
在一些实施方案中，接头富含甘氨酸(Gly或G)残基。在一些实施方案中，接头富含丝氨酸(Ser或S)残基。在一些实施方案中，接头富含甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施方案中，接头具有一个或多个甘氨酸-丝氨酸残基对(GS) (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GS对)。在一些实施方案中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Gly-Ser (GGGS；SEQ ID NO:228)序列(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGGS序列)。在一些实施方案中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS；SEQ ID NO: 216)序列(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGGGS序列)。在一些实施方案中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Ser-Gly (GGSG；SEQ ID NO: 229)序列(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGSG序列)。
在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，接头包括以下中的任一种或一种或多种的组合：G、GG、GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 210)、GGGS (SEQ ID NO: 2)、GGGSGGGS (SEQID NO: 211)、GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 212)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 213)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 214)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 215)、GGGGS(SEQ ID NO: 216)、GS、GGGGSGS (SEQ ID NO: 217)、GGGGSGGGGSGGGGSGS (SEQ ID NO:218)、GGSLDPKGGGGS (SEQ ID NO: 219)、PKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 220)、SKYGPPCPPCPAPEFLG (SEQ ID NO: 221)、GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO: 222)、GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO:223)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO: 224) 和GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 225)。
接头的非限制性实例可包括与GGGS (SEQ ID NO: 2)、GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO:210)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 213)、GGGGSGS (SEQ ID NO: 217)、GGGGSGGGGSGGGGSGS (SEQ ID NO: 218)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ IDNO: 235)、GGSLDPKGGGGS (SEQ ID NO: 219)和GSTSGSGKPGSSEGST (SEQ ID NO: 226)至少70%同一(例如，至少72%、至少74%、至少75%、至少76%、至少78%、至少80%、至少82%、至少84%、至少85%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一)的序列。
在一些实施方案中，接头包括选自以下组的序列：GGSLDPKGGGGS (SEQ ID NO:219)、GGGGSGGGGSGGGGSGS (SEQ ID NO: 218)、GGGGSGS (SEQ ID NO: 217)、GS、(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 227)和(GGGS)n (SEQ ID NO: 228)、GGSG (SEQ ID NO:229)、GGSGG (SEQ ID NO: 230)、GSGSG (SEQ ID NO: 231)、GSGGG (SEQ ID NO: 232)、GGGSG (SEQ ID NO: 233)、GSSSG (SEQ ID NO: 234)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:213)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 235)、GSTSGSGKPGSSEGST (SEQ ID NO: 226)、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 216)，其中n是至少是1的整数。在一些实施方案中，接头包括选自由以下组成的组的序列：GGSLDPKGGGGS (SEQ ID NO: 219)、GGGGSGGGGSGGGGSGS (SEQ IDNO: 218)、GGGGSGS (SEQ ID NO: 217)和GS。在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，接头包括选自以下组的序列：GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 213)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 235)和GSTSGSGKPGSSEGST (SEQ ID NO: 226)。在本文所述的任何可活化细胞因子构建体的一些实施方案中，接头包括选自以下组的序列：GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ IDNO: 213)或GGGGS (SEQ ID NO: 216)。在一些实施方案中，接头包含GGGS(SEQ ID NO: 2)的序列。在一些实施方案中，接头包含单个甘氨酸残基(G)或两个甘氨酸残基(GG)的序列。
在一些实施方案中，ACC可包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如，本文所述或本领域中已知的任何示例性接头序列的相同或不同的接头序列)。在一些实施方案中，接头包含磺基-SIAB、SMPB和磺基-SMPB，其中接头与伯胺氢硫基反应。
在一些方面，在本公开的多肽或构建体中采用了间隔物。如本文所用，术语“间隔物”或“头部”是指在成熟ACC的游离末端例如在信号肽与成熟ACC的N末端之间掺入的氨基酸残基或氨基酸序列。在一些方面，间隔物包含一个或多个谷氨酰胺(Q)残基。在一些方面，间隔物中的残基使氨基肽酶和/或外肽酶作用最小化以防止对N末端氨基酸的裂解。说明性和非限制性间隔物氨基酸序列可包含任何以下示例性氨基酸序列或由任何以下示例性氨基酸序列组成：QGQSGS (SEQ ID NO:375)；GQSGS (SEQ ID NO:376)；QSGS (SEQ ID NO:377)；SGS；GS；S；QGQSGQG (SEQ ID NO: 378)；GQSGQG (SEQ ID NO: 379)；QSGQG (SEQ IDNO: 380)；SGQG (SEQ ID NO: 381)；GQG；QG；G；QGQSGQ (SEQ ID NO: 382)；GQSGQ (SEQ IDNO: 383)；QSGQ (SEQ ID NO: 384)；QGQSG (SEQ ID NO: 385)；QGQS (SEQ ID NO: 386)；SGQ；GQ；和Q。在一些实施方案中，省略间隔物序列。
在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，ACC的特征在于与CP1和/或CP2的至少一种活性的对照水平相比，如果ACC是二聚体复合物，则CP或者CP1和/或CP2的所述至少一种活性降低。在一些实施方案中，对照水平是重组CP或者CP1和/或CP2 (例如可商购获得的重组CP或者CP1和/或CP2、重组野生型CP或者CP1和/或CP2等)的活性水平。在一些实施方案中，对照水平是ACC的经裂解(活化)形式的活性水平。在某些实施方案中，对照水平是聚乙二醇化CP或者聚乙二醇化CP1和/或CP2的活性水平。
在一些实施方案中，至少一种活性是CP或者CP1和/或CP2对其同源受体的结合亲和力(KD)，如使用(例如，在25℃的磷酸盐缓冲盐水中进行的)表面等离子体共振所测定的。在某些实施方案中，至少一种活性是淋巴瘤细胞的增殖水平。在其他实施方案中，至少一种活性是淋巴瘤细胞中JAK/STAT/ISGF3通路活化的水平。在一些实施方案中，至少一种活性是淋巴瘤细胞中SEAP产生水平。在一些实施方案中，至少一种活性是使用HEK细胞的基于细胞的测定中SEAP产生水平。在另一实施方案中，CP或者CP1和/或CP2的至少一种活性是使用例如RNAseq方法测定的细胞因子刺激的基因诱导的水平(参见例如Zimmerer等人,Clin. Cancer Res.14(18):5900-5906, 2008；Hilkens等人,J. Immunol.171:5255-5263,2003)。
在一些实施方案中，ACC的特征在于与至少一种CP或者CP1和/或CP2活性的对照水平相比，所述至少一种CP或者CP1和/或CP2活性至少降低2倍。在一些实施方案中，ACC的特征在于与CP或者CP1和/或CP2的至少一种活性的对照水平相比，CP或者CP1和/或CP2的所述至少一种活性至少降低5倍。在一些实施方案中，ACC的特征在于与CP或者CP1和/或CP2的至少一种活性的对照水平相比，CP或者CP1和/或CP2的所述至少一种活性至少降低10倍。在一些实施方案中，ACC的特征在于与CP或者CP1和/或CP2的至少一种活性的对照水平相比，CP或者CP1和/或CP2的所述至少一种活性至少降低20倍。在一些实施方案中，ACC的特征在于与CP或者CP1和/或CP2的至少一种活性的对照水平相比，CP或者CP1和/或CP2的至少一种活性至少降低30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施方案中，ACC的特征在于与CP或者CP1和/或CP2的至少一种活性的对照水平相比，CP或者CP1和/或CP2的至少一种活性至少降低1倍至20倍、降低200倍至500倍、降低300倍至500倍、降低400倍至500倍、降低500倍至600倍、降低600倍至700倍、降低150倍至1000倍、降低100倍至1500倍、降低200倍至1500倍、降低300倍至1500倍、降低400倍至1500倍、降低500倍至1500倍、降低1000倍至1500倍、降低100倍至1000倍、降低200倍至1000倍、降低300倍至1000倍、降低400倍至1000倍、降低500倍至1000倍、降低100倍至500倍、降低20倍至50倍、降低30倍至50倍、降低40倍至50倍、降低100倍至400倍、降低200倍至400倍或降低300倍至400倍、降低100倍至300倍、降低200倍至300倍或降低100倍至200倍。
在一些实施方案中，ACC的特征在于在暴露于蛋白酶之后产生裂解产物，其中裂解产物包含CP1和/或CP2的至少一种活性。在一些实施方案中，CP1和/或CP2的至少一种活性是抗增殖活性。在一些实施方案中，对照水平是野生型成熟细胞因子的EC50值，并且其中EC50 (裂解产物)与EC50 (野生型对照水平)的比率小于约10、或小于约9、或小于约8、或小于约7、或小于约6、或小于约5、或小于约4、或小于约3、或小于约2、或小于约1.5、或等于约1。在一些实施方案中，裂解产物的EC50与野生型成熟细胞因子的EC50大致相同，从而证明在裂解之后，CP1和/或CP2的活性完全恢复，或几乎完全恢复。在一些实施方案中，裂解产物的EC50与野生型对照的EC50的比率为约1至约10，或约2至约8，或约3至约7，或约4至约6，这证明蛋白酶活化后细胞因子活性良好恢复。在一些实施方案中，ACC的特征在于在蛋白酶活化后具有裂解产物，其中裂解产物的EC50与重组IL-15的EC50的比率为1至约10、或约2至约8、或约3至约7、或约4至约6、或约5至约7、或约6，如在IL-2/IL-15反应性HEK293细胞中测量的。
在一些实施方案中，CP或者CP1和/或CP2的至少一种活性的对照水平是在蛋白酶裂解CM或者CM1和CM2 (“裂解产物”)之后从ACC中释放的CP或者CP1和/或CP2的活性。在一些实施方案中，CP或者CP1和/或CP2的至少一种活性的对照水平是相应野生型成熟细胞因子(例如，重组野生型成熟细胞因子)的活性。
在一些实施方案中，ACC与蛋白酶一起孵育产生一种或多种活化的细胞因子产物，其中所述一种或多种活化的细胞因子产物的CP或者CP1和/或CP2的一种或多种活性大于完整ACC的CP或者CP1和/或CP2的所述一种或多种活性。在一些实施方案中，一种或多种活化的细胞因子产物的CP或者CP1和/或CP2的一种或多种活性是ACC的CP或者CP1和/或CP2的所述一种或多种活性的至少1倍大。在一些实施方案中，一种或多种活化的细胞因子产物的CP或者CP1和/或CP2的一种或多种活性是ACC的CP或者CP1和/或CP2的所述一种或多种活性的至少2倍大。在一些实施方案中，一种或多种活化的细胞因子产物的CP或者CP1和/或CP2的一种或多种活性是ACC的CP或者CP1和/或CP2的所述一种或多种活性的至少5倍大。在一些实施方案中，一种或多种活化的细胞因子产物的CP或者CP1和/或CP2的一种或多种活性是ACC的CP或者CP1和/或CP2的所述一种或多种活性的至少10倍大。在一些实施方案中，一种或多种活化的细胞因子产物的CP或者CP1和/或CP2的一种或多种活性是ACC的CP或者CP1和/或CP2的所述一种或多种活性的至少20倍大。在一些实施方案中，一种或多种活化的细胞因子产物的CP或者CP1和/或CP2的一种或多种活性是ACC的CP或者CP1和/或CP2的一种或多种活性的至少1倍至20倍、2倍至20倍、3倍至20倍、4倍至20倍、5倍至20倍、10倍至20倍、15倍至20倍、1倍至15倍、2倍至15倍、3倍至15倍、4倍至15倍、5倍至15倍、10倍至15倍、1倍至10倍、2倍至10倍、3倍至10倍、4倍至10倍、5倍至10倍、1倍至5倍、2倍至5倍、3倍至5倍、4倍至5倍、1倍至4倍、2倍至4倍、3倍至4倍、1倍至3倍、2倍至3倍或1倍至2倍。
在一些实施方案中，ACC可包括与SEQ ID NO:423-431中的任一个至少80% (例如，至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%)同一的序列。在一些实施方案中，ACC可包括与SEQ ID NO: 423至少80% (例如，至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%)同一的序列。在一些实施方案中，ACC可包括与SEQ ID NO: 424至少80% (例如至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%)同一的序列。在一些实施方案中，ACC可包括与SEQ ID NO: 425至少80% (例如至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%)同一的序列。在一些实施方案中，ACC可包括与SEQ ID NO: 426至少80% (例如至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%)同一的序列。在一些实施方案中，ACC可包括与SEQ ID NO: 427至少80% (例如至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%)同一的序列。在一些实施方案中，ACC可包括与SEQ ID NO: 428至少80% (例如至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%)同一的序列。在一些实施方案中，ACC可包括与SEQ ID NO: 429至少80% (例如至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%)同一的序列。在一些实施方案中，ACC可包括与SEQ ID NO: 430至少80% (例如至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%)同一的序列。在一些实施方案中，ACC可包括与SEQ ID NO: 431至少80% (例如至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%)同一的序列。
在一些方面，ACC可包括此类序列，但具有或不具有这些序列的信号序列。信号序列不受特定限制。信号序列的一些非限制性实例包括例如MRAWIFFLLCLAGRALA (SEQ IDNO: 343)、MALTFALLVALLVLSCKSSCSVG (SEQ ID NO: 344)、METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQID NO: 345)。
这些可活化细胞因子构建体的各种示例性方面在以下描述，并且可以任何组合用于本文提供的方法中而没有限制。可活化细胞因子构建体和制备可活化细胞因子构建体的方法的示例性方面在以下描述。
在一些方面，ACC包括选自SEQ ID NO: 402-422的CP1、选自SEQ ID No: 5-118、131-209、251-314、432-499、530-599和603-719的CM1和DD1，它们与选自SEQ ID NO: 402-422的CP2、选自SEQ ID No: 5-118、131-209、251-314、432-499、530-599和603-719的CM2和DD2二聚化。在一些方面，ACC可包括在CP1与CM1之间和/或在CM1与DD1之间的选自SEQ IDNo: 2和210-235、245或250的接头，和在CP2与CM2之间和/或在CM2与DD2之间的选自SEQ IDNo: 2和210-235、245或250的接头。在一些实施方案中，ACC包括具有与SEQ ID NO: 3或SEQID NO: 4至少80%同一(例如，至少82%、至少84%、至少85%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一)的氨基酸序列的DD1和/或DD2。在一些实施方案中，ACC包括具有与SEQ ID NO: 315或SEQ ID NO: 316至少80%同一(例如，至少82%、至少84%、至少85%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一)的氨基酸序列的DD1。在一些实施方案中，ACC包括具有与SEQ ID NO: 315或SEQ ID NO: 316至少80%同一(例如，至少82%、至少84%、至少85%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一)的氨基酸序列的DD2。
与剂缀合
本公开还提供了用于在本文所述的任何分离的多肽和ACC中包括额外元件的方法和材料，所述额外元件包括例如用以促进向目标细胞或组织的递送的靶向部分、剂(例如，治疗剂、抗赘生剂)、毒素或其片段。
在一些实施方案中，ACC缀合于细胞毒性剂，包括但不限于毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，可活化细胞因子构建体缀合于细胞毒性剂，包括但不限于毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
可缀合于本文所述的任何ACC的非限制性示例性细胞毒性剂包括：多拉司他汀(dolastatin)及其衍生物(例如，澳瑞他汀E (auristatin E)、AFP、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、单甲基澳瑞他汀F (MMAF)、单甲基澳瑞他汀E (MMAE)、去甲基澳瑞他汀E(DMAE)、澳瑞他汀F、去甲基澳瑞他汀F (DMAF)、多拉司他汀16 (DmJ)、多拉司他汀16 (Dpv)、澳瑞他汀衍生物(例如，澳瑞他汀酪胺(auristatin tyramine)、澳瑞他汀喹诺酮(auristatinquinolone))、类美登素(maytansinoid) (例如，DM-1、DM-4)、类美登素衍生物、倍癌霉素(duocarmycin)、α-鹅膏蕈碱(alpha-amanitin)、涡轮他汀(turbostatin)、芬他汀(phenstatin)、羟基芬他汀(hydroxyphenstatin)、海绵抑制素5 (spongistatin 5)、海绵抑制素7、哈利他汀1 (halistatin1)、哈利他汀2、哈利他汀3、哈坎他汀(halocomstatin)、吡咯并苯并咪唑(PBI)、西博他汀6 (cibrostatin6)、多沙利仿(doxaliform)、西马多丁(cemadotin)类似物(CemCH2-SH)、假单胞菌毒素A (PES8)变体、假单胞菌毒素A(ZZ-PE38)变体、ZJ-101、蒽环霉素(anthracycline)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、苔藓抑素(bryostatin)、喜树碱(camptothecin)、7-取代的喜树碱、10,11-二氟亚甲基二氧基喜树碱、考布他汀(combretastatin)、脱溴海兔毒素(debromoaplysiatoxin)、KahaMide-F、圆皮海绵内酯(discodermolide)和海鞘素(Ecteinascidin)。
可缀合于本文所述的任何ACC的非限制性示例性酶活性毒素包括：白喉毒素(diphtheria toxin)、来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A链(exotoxin A chain)、篦麻毒素A链(ricin A chain)、相思子毒素A链(abrin A chain)、蒴莲根毒素A链(modeccin A chain)、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleuriies fordii)蛋白、石竹素(dianfhin)蛋白、美洲商陆(Phytoiaca Americana)蛋白(例如PAPI、PAPII和PAP-8)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素(curcin)、巴豆毒素(crotirs)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、米托洁林(mitogeliin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、新霉素(neomycin)和新月毒素(tricothecene)。
可缀合于本文所述的任何ACC的非限制性示例性抗赘生剂包括：阿霉素(adriamycin)、司比定(cerubidine)、博莱霉素(bleomycin)、爱克兰(alkeran)、维尔班(velban)、昂可文(oncovin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、甲氨蝶呤(methotrexate)、噻替派(thiotepa)、比生群(bisantrene)、诺凡特龙(novantrone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、丙卡巴肼(procarabizine)和阿糖胞苷(cytarabine)。
可缀合于本文所述的任何ACC的非限制性示例性抗病毒剂包括：阿昔洛韦(acyclovir)、阿糖腺苷(vira A)和兴梅屈尔(symmetrel)。
可缀合于本文所述的任何ACC的非限制性示例性抗真菌剂包括：制霉菌素(nystatin)。
可缀合于本文所述的任何ACC的非限制性示例性可缀合检测试剂包括：荧光素及其衍生物、异硫氰酸荧光素(FITC)。
可缀合于本文所述的任何可活化细胞因子构建体的非限制性示例性抗菌剂包括：氨基糖苷(aminoglycoside)、链霉素(streptomycin)、新霉素(neomycin)、卡那霉素(kanamycin)、阿米卡星(amikacin)、庆大霉素(gentamicin)和妥布霉素(tobramycin)。
可缀合于本文所述的任何可活化细胞因子构建体的非限制性示例性3β,16β,17α-三羟基胆甾-5-烯-22-酮16-O-(2-O-4-甲氧基苯甲酰基-β-D-吡喃木糖基)-(1-->3)-(2-O-乙酰基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷) (OSW-1)包括：O6-苯甲基鸟嘌呤的s-硝基苯甲基氧基羰基衍生物、拓扑异构酶抑制剂、哈米特林(hemiasterlin)、三尖杉碱(cephalotaxine)、高三尖杉酯碱(homoharringionine)、吡咯并苯并二氮䓬二聚体(PBD)、官能化吡咯并苯并二氮䓬、卡奇霉素(calcicheamicin)、鬼臼毒素(podophyiitoxin)、紫杉烷和长春花生物碱。
可缀合于本文所述的任何可活化细胞因子构建体的非限制性示例性放射性药物包括：123I、89Zr、125I、131I、99mTc、201T1、62Cu、18F、68Ga、13N、15O、38K、82Rb、111In、133Xe、11C和99mTc(锝)。
可缀合于本文所述的任何ACC的非限制性示例性重金属包括：钡、金和铂。
可缀合于本文所述的任何ACC的非限制性示例性抗支原体剂包括：泰乐菌素(tylosine)、壮观霉素(spectinomycin)、链霉素B (streptomycin B)、氨苄青霉素(ampicillin)、磺胺(sulfanilamide)、多粘菌素(polymyxin)和氯霉素(chloramphenicol)。
本领域普通技术人员将认识到多种可能的部分可缀合于本文所述的任何可活化细胞因子构建体。缀合可包括将使两个分子结合的任何化学反应，只要ACC和其他部分保留它们的相应活性即可。缀合可包括许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合和络合。在一些实施方案中，优选的结合是共价结合。共价结合可通过现有侧链的直接缩合或通过掺入外部桥接分子实现。许多二价或多价连接剂可用于缀合本文所述的任何可活化细胞因子构建体。例如，缀合可包括有机化合物，诸如硫代酸酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。在一些实施方案中，可活化细胞因子构建体可包括或以其他方式引入一个或多个非天然氨基酸残基以提供适合缀合位点。
在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，剂和/或缀合物通过二硫键(例如半胱氨酸分子上的二硫键)附接于抗原结合结构域。因为许多癌症天然地释放高水平的还原剂谷胱甘肽，所以存在于癌性组织微环境中的谷胱甘肽可还原二硫键，并且随后在递送部位处释放剂和/或缀合物。
在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，当缀合物在靶标部位(例如患病组织(例如癌性组织))内在补体存在下结合至它的靶标时，将缀合物和/或剂附接于接头的酰胺键或酯键被裂解，从而导致缀合物和/或剂以它的活性形式释放。当施用至受试者时，这些缀合物和/或剂将实现缀合物和/或剂在靶标部位(例如患病组织(例如癌性组织))处的递送和释放。这些缀合物和/或剂对于体内递送本文所述的任何缀合物和/或剂来说是特别有效的。
在一些实施方案中，接头不可由补体系统的酶裂解。例如，缀合物和/或剂在无补体活化的情况下释放，因为补体活化最终会溶解靶标细胞。在此类实施方案中，缀合物和/或剂将被递送至靶标细胞(例如激素、酶、皮质类固醇、神经递质或基因)。此外，接头轻微地易经受血清蛋白酶的裂解，并且缀合物和/或剂在靶标部位处缓慢释放。
在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，缀合物和/或剂被设计为使得缀合物和/或剂被递送至靶标部位(例如，疾病组织(例如，癌性组织))，但缀合物和/或剂不被释放。
在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，缀合物和/或剂直接或通过非可裂解接头附接于ACC。示例性非可裂解接头包括氨基酸(例如，D-氨基酸)、肽、或可被修饰以包括可随后用于通过本文所述的方法附接于ACC的官能团的其他有机化合物。
在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，ACC包括至少一个用于剂的缀合点。在一些实施方案中，所有可能的缀合点都可用于与剂的缀合。在一些实施方案中，一个或多个缀合点包括但不限于二硫键中涉及的硫原子、链间二硫键中涉及的硫原子、链间硫键中涉及的硫原子而非链内二硫键中涉及的硫原子、和/或半胱氨酸或含有硫原子的其他氨基酸残基的硫原子。在此类情况下，残基可天然地存在于蛋白质构建体结构中，或使用包括但不限于定点诱变、化学转化、或非天然氨基酸的错误掺入的方法掺入蛋白质构建体中。
本公开还提供了用于制备用于缀合的ACC的方法和材料。在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，ACC被修饰以包括一个或多个链间二硫键。例如，ACC中的二硫键可在暴露于还原剂诸如但不限于TCEP、DTT或β-巯基乙醇之后经受还原。在一些情况下，二硫键的还原仅是部分的。如本文所用，术语部分还原是指其中使ACC与还原剂接触，并且所有可能的缀合位点的一部分经受还原(例如并非所有二硫键都被还原)的情况。在一些实施方案中，如果所有可能的缀合位点中的少于99%(例如少于98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或少于5%)被还原，那么可活化细胞因子构建体在与还原剂接触之后被部分还原。在一些实施方案中，使具有一个或多个链间二硫键的还原的ACC缀合于与游离硫醇具有反应性的药物。
本公开还提供了用于使治疗剂缀合于ACC上的特定位置的方法和材料。在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，ACC被修饰以使治疗剂可在ACC上的特定位置处缀合于ACC。例如，ACC可以有助于与ACC的缀合的方式被部分还原。在此类情况下，ACC的部分还原以ACC中的缀合位点不被还原的方式发生。在一些实施方案中，选择ACC上的一个或多个缀合位点以有助于剂在蛋白质构建体上的特定位置处的缀合。各种因素可影响在用还原剂处理后ACC的“还原水平”。不加限制地举例来说，还原剂与ACC的比率、孵育的时长、孵育温度和/或还原反应溶液的pH可需要优化以用本文所述的方法和材料实现ACC的部分还原。因素(例如还原剂与ACC的比率、与还原剂一起孵育的时长和温度以及/或者还原剂的pH)的任何适当组合可用于实现ACC的部分还原(例如可能的缀合位点的普遍还原或在特定缀合位点处的还原)。
还原剂与ACC的有效比率可为以允许与剂的缀合的方式至少部分地还原ACC (例如可能的缀合位点的普遍还原或在特定缀合位点处的还原)的任何比率。在一些实施方案中，还原剂与ACC的比率将在约20:1至1:1、约10:1至1:1、约9:1至1:1、约8:1至1:1、约7:1至1:1、约6:1至1:1、约5:1至1:1、约4:1至1:1、约3:1至1:1、约2:1至1:1、约20:1至1:1.5、约10:1至1:1.5、约9:1至1:1.5、约8:1至1:1.5、约7:1至1:1.5、约6:1至1:1.5、约5:1至1:1.5、约4:1至1:1.5、约3:1至1:1.5、约2:1至1:1.5、约1.5:1至1:1.5或约1:1至1:1.5的范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约8:1至约1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约2.5:1至1:1的范围内。
用于用还原剂处理ACC的有效孵育时间和温度可为以允许剂与ACC的缀合的方式至少部分地还原ACC (例如可能的缀合位点的普遍还原或在特定缀合位点处的还原)的任何时间和温度。在一些实施方案中，用于处理ACC的孵育时间和温度将处于在37℃下约1小时至在37℃下约12小时的范围(或其中的任何子范围)内。
用于用还原剂处理ACC的还原反应的有效pH可为以允许ACC与剂的缀合的方式至少部分地还原ACC (例如可能的缀合位点的普遍还原或在特定缀合位点处的还原)的任何pH。
当使部分还原的ACC与含有硫醇的剂接触时，所述剂可缀合于ACC中的链间硫醇。剂可使用含有硫醇的试剂(例如，半胱氨酸或N-乙酰基半胱氨酸)以包括硫醇的方式来修饰。例如，ACC可在约37℃下以还原剂与ACC的所需比率与还原剂(例如，TCEP)一起孵育约1小时之后被部分还原。还原剂与ACC的有效比率可为以允许含有硫醇的剂的缀合的方式部分地还原至少两个位于ACC中的链间二硫键(例如，可能的缀合位点的普遍还原或在特定缀合位点处的还原)的任何比率。
在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，ACC以避免还原任何链内二硫键的方式被还原剂还原。在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，ACC以避免还原任何链内二硫键并且还原至少一个链间二硫键的方式被还原剂还原。
在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，ACC还可包括缀合于ACC的剂。在一些实施方案中，缀合的剂是治疗剂。
在一些实施方案中，剂(例如缀合于可活化细胞因子构建体的剂)是可检测部分，诸如像标记或其他标记物。例如，剂是或包括经放射性标记氨基酸、一种或多种可通过标记化亲和素(例如含有可通过光学或量热方法检测的荧光标记物或酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分、一种或多种放射性同位素或放射性核素、一种或多种荧光标记、一种或多种酶标记和/或一种或多种化学发光剂。在一些实施方案中，可检测部分通过间隔物分子来附接。
在一些实施方案中，剂(例如缀合于可活化细胞因子构建体的细胞毒性剂)使用碳水化合物部分、氢硫基、氨基或羧酸酯基团连接于ACC。
在缀合于剂的本文所述的任何ACC的一些实施方案中，所述剂(例如缀合于可活化细胞因子构建体的细胞毒性剂)通过接头和/或CM (也被称为可裂解序列)缀合于ACC。在一些实施方案中，剂(例如缀合于可活化细胞因子构建体的细胞毒性剂)缀合于ACC中的半胱氨酸或赖氨酸。在一些实施方案中，剂(例如缀合于可活化细胞因子构建体的细胞毒性剂)缀合于ACC的另一残基，诸如本文公开的那些残基。在一些实施方案中，接头是含硫醇接头。在一些实施方案中，接头为不可裂解的接头。表3提供了可裂解部分和接头的一些非限制性实例。
表3.
本领域普通技术人员将认识到多种可能的部分可偶联于本公开的ACC。(参见例如“Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M.Cruse和R. E. Lewis, Jr (编), Carger Press, New York,(1989)，其全部内容通过引用并入本文)。一般来说，剂(例如细胞毒性剂)与ACC的有效缀合可通过将使所述剂结合至所述ACC，同时还允许所述剂和所述ACC保留功能性的任何化学反应来实现。
在缀合于剂的任何ACC的一些实施方案中，多种双官能蛋白质偶联剂可用于使所述剂缀合于ACC，包括但不限于3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮鎓衍生物(例如双(对重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，篦麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人, Science 238: 1098 (1987)中所述来制备。在一些实施方案中，碳-14标记的1-异硫氰基苯甲基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)螯合剂可用于使放射性核苷酸缀合于ACC。(参见例如WO94/11026)。
适合接头和CM描述于文献中。(参见例如Ramakrishnan, S.等人, Cancer Res.44:201-208 (1984)，其描述MBS(间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的使用)。还参见美国专利第5,030,719号，其描述通过寡肽接头偶联于ACC的卤化乙酰基酰肼衍生物的使用。在一些实施方案中，适合接头包括(i) EDC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii) SMPT (4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)-甲苯(Pierce Chem. Co.，目录(21558G)；(iii) SPDP (6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯(Pierce Chem. Co.，目录号21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP (6-[3-(2-吡啶基二硫基)-丙酰胺基]己酸磺基琥珀酰亚胺酯(Pierce Chem. Co.，目录号2165-G)；和(v)缀合于EDC的磺基-NHS (N-羟基磺基-琥珀酰亚胺：Pierce Chem. Co.，目录号24510)。额外接头包括但不限于SMCC、磺基-SMCC、SPDB或磺基-SPDB。
上文所描述的CM和接头含有具有不同属性的组分，因此导致具有不同物理化学性质的缀合物。例如，羧酸烷基酯的磺基-NHS酯比羧酸芳基酯的磺基-NHS酯稳定。含有NHS酯的接头的可溶性小于磺基-NHS酯。此外，接头SMPT含有具有空间位阻的二硫键，并且可形成具有增加的稳定性的缀合物。一般来说，二硫键联的稳定性小于其他键联，因为二硫键联在体外被裂解，从而导致可用的缀合物较少。特别地，磺基-NHS可增强碳二亚胺偶联的稳定性。相比于单独碳二亚胺偶联反应，碳二亚胺偶联(诸如EDC)在与磺基-NHS联合使用时形成对水解更加具有抗性的酯。
在任何ACC的一些实施方案中，剂可使用包括在ACC的氨基酸序列中的经修饰氨基酸序列缀合于ACC。通过在ACC的氨基酸序列内的特定位置处插入使得能够实现缀合的氨基酸，蛋白质构建体可被设计以达成缀合的剂(例如，细胞毒性剂)的受控放置和/或剂量。例如，ACC可被修饰以在第一单体、第二单体、第三单体和/或第四单体上的位置处包括提供反应性硫醇基团，并且不负面影响蛋白质折叠和/或组装以及不改变靶标性质的半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，ACC可被修饰以在ACC的氨基酸序列内包括一个或多个非天然氨基酸残基以提供适合缀合位点。在一些实施方案中，ACC可被修饰以在ACC的氨基酸序列内包括可酶促活化的肽序列。
核酸
本文提供了包括编码分离的多肽或ACC的序列的核酸，或者如果ACC是二聚体复合物，则包括编码本文所述的任何ACC的第一单体构建体(或第一单体构建体的蛋白质部分)(例如，本文所述的任何第一单体构建体)和第二单体构建体(或第二单体构建体的蛋白质部分) (例如，本文所述的任何第二单体构建体)的序列的核酸。在一些实施方案中，一对核酸一起编码第一单体构建体(或第一单体构建体的蛋白质部分)和第二单体构建体(或第二单体构建体的蛋白质部分)。在一些实施方案中，编码第一单体构建体(或第一单体构建体的蛋白质部分)的核酸序列与编码第二单体构建体(或第二单体构建体的蛋白质部分)的核酸序列至少70%同一(例如，至少72%同一、至少74%同一、至少76%同一、至少78%同一、至少80%同一、至少82%同一、至少84%同一、至少86%同一、至少88%同一、至少90%同一、至少92%同一、至少94%同一、至少96%同一、至少98%同一、至少99%同一或100%同一)。
在一些实施方案中，编码第一单体构建体的蛋白质部分的核酸编码包含CP1和CM1部分的多肽。在一些实施方案中，编码第二单体的蛋白质部分的核酸编码包含CP2和CM2部分的多肽。在一些实施方案中，一对核酸一起编码第一单体构建体的蛋白质部分和第二单体构建体的蛋白质部分，其中蛋白质部分然后分别与DD1和DD2部分缀合(在随后的缀合步骤中)。
在一些实施方案中，编码第一单体构建体的核酸编码包含DD1部分的多肽。在一些实施方案中，编码第二单体构建体的核酸编码包含DD2部分的多肽。
本公开包括编码如本文所述的蛋白质或其部分的多核苷酸，以及此类多核苷酸用于产生蛋白质和/或用于治疗目的的用途。此类多核苷酸可包括编码如本文定义的蛋白质的DNA和RNA分子(例如，mRNA、自我复制型RNA、自我扩增型mRNA等)。本公开包括包含此类多核苷酸的组合物。在一些方面，此类组合物可以治疗性或预防性使用。
修饰可通过本领域中已知的标准技术，诸如定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)介导的诱变来引入核苷酸序列中。
载体
本文提供了包括本文所述的任何核酸的载体和载体组。本领域技术人员将能够选择用于制备本文所述的任何ACC的适合载体或载体组(例如表达载体)，并且使用所述载体或载体组表达本文所述的任何ACC。例如，在选择载体或载体组时，必须考虑细胞，因为所述一种或多种载体可需要能够整合至细胞的染色体中并且/或者在所述细胞中复制。可用于产生ACC的示例性载体还在以下描述。
如本文所用，术语“载体”是指能够诱导重组蛋白(例如第一或第二单体)在细胞(例如本文所述的任何细胞)中的表达的多核苷酸。“载体”能够将核酸和其片段递送到宿主细胞中，并且包括调节序列(例如启动子、增强子、多腺苷酸(poly (A))信号)。外源性多核苷酸可插入至表达载体中以进行表达。术语“载体”还包括人工染色体、质粒、逆转录病毒和杆状病毒载体。
用于构建包括本文所述的任何核酸并且适于对细胞(例如，哺乳动物细胞)进行转化的适合载体的方法在本领域中是熟知的。参见例如Sambrook等人编 “MolecularCloning: A Laboratory Manual,” 第2版, Cold Spring Harbor Press, 1989以及Ausubel等人编 “Current Protocols in Molecular Biology,” Current Protocols,1993。
载体的非限制性实例包括质粒、转座子、粘粒和病毒载体(例如任何腺病毒载体(例如pSV或pCMV载体)、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体)以及任何Gateway®载体。载体可例如包括足以达成表达的顺式作用性元件；用于表达的其他元件可由宿主哺乳动物细胞或在体外表达系统中提供。熟练从业者将能够选择用于制备本文所述的任何ACC的适合载体和哺乳动物细胞。
在本文所述的任何ACC的一些实施方案中，ACC使用重组DNA技术以及在真核或原核物种中的表达来以生物合成方式制备。
在一些实施方案中，载体包括编码本文所述的任何ACC的第一单体和第二单体的核酸。在一些实施方案中，载体是表达载体。
在一些实施方案中，一对载体一起包括一起编码本文所述的任何ACC的第一单体和第二单体的一对核酸。在一些实施方案中，载体对是表达载体对。
细胞
本文还提供了包括本文所述的任何载体或载体组的宿主细胞，所述任何载体或载体组包括本文所述的任何核酸。
将核酸和载体(例如，本文所述的任何载体或任何载体组)引入细胞中的方法在本领域中是已知的。可用于将核酸引入细胞中的方法的非限制性实例包括：脂质体转染、转染、磷酸钙转染、阳离子聚合物转染、病毒转导(例如，腺病毒转导、慢病毒转导)、纳米颗粒转染和电穿孔。
在一些实施方案中，引入步骤包括向细胞中引入包括编码组成本文所述的任何ACC的单体的核酸的载体(例如，本文所述的任何载体或载体组)。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，ACC可由任何细胞产生，包括原核细胞(例如，细菌细胞)或真核细胞。如本文所用，术语“真核细胞”是指具有明显的、有膜包围的细胞核的细胞。此类细胞可包括例如哺乳动物、昆虫、真菌或植物细胞。在一些实施方案中，真核细胞是酵母细胞，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施方案中，真核细胞是高等真核细胞，诸如哺乳动物、鸟类、植物或昆虫细胞。哺乳动物细胞的非限制性实例包括啮齿动物细胞(例如，小鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或非人灵长类动物细胞，或人细胞，诸如人胚胎肾细胞(例如，HEK293细胞)。
在一些实施方案中，细胞含有编码本文所述的任一ACC的第一单体和第二单体的核酸。在一些实施方案中，细胞含有一起编码本文所述的任何ACC的第一单体和第二单体的核酸对。在一些方面，编码第一单体和第二单体的核酸被整合到宿主细胞的基因组DNA中。
产生可活化细胞因子构建体的方法
本文提供了产生本文所述的任何ACC的方法，所述方法包括：(a)在足以产生所述ACC的条件下在液体培养基中培养本文所述的任何重组宿主细胞；以及(b)从所述宿主细胞和/或所述液体培养基回收所述ACC。
培养细胞的方法在本领域中是熟知的。可在有利于细胞增殖、细胞分化和细胞生长的条件下在体外维持细胞。例如，可通过使细胞(例如本文所述的任何细胞)与包括足以支持细胞活力和生长的必需的生长因子和补充剂的细胞培养基接触来培养细胞。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，方法还包括分离回收的ACC。分离方法的非限制性实例包括：硫酸铵沉淀、聚乙二醇沉淀、尺寸排阻色谱法、配体亲和色谱法、离子交换色谱法(例如，阴离子或阳离子)和疏水性相互作用色谱法。
在一些实施方案中，本公开包括诱导细胞以产生以下的方法：第一单体构建体的包括CP1、CM1、MM2和CM3的蛋白质部分，和第二单体构建体的包括CP2和CM2以及任选的MM2和CM4的蛋白质部分，随后将蛋白质部分分别缀合于DD1和DD2部分。
本文所述的组合物和方法可涉及使用允许在二聚化结构域之间形成二硫键以形成和维持ACC的二聚化的非还原性或部分还原性条件。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，方法还包括将分离的ACC配制成药物组合物。各种制剂在本领域中是已知的，并且在本文中描述。本文所述的任何分离的ACC都可被配制用于任何施用途径(例如静脉内、肿瘤内、皮下、真皮内、口服(例如吸入)、经皮(例如经表面)、经黏膜或肌肉内)。
本文还提供了通过本文所述的任何方法产生的ACC。还提供了包括通过本文所述的任何方法产生的任何ACC的组合物(例如药物组合物)。本文还提供了包括至少一剂的本文所述的任何组合物(例如，药物组合物)的药盒。
在一些实施方案中，本文公开的ACC包括细胞因子的突变体。例如，可使用与野生型细胞因子相比具有有利特性的突变体，例如，与野生型细胞因子多肽或不包含突变的细胞因子多肽的对照ACC相比表现出较少的聚集。在一些实施方案中，本公开提供了一种生产ACC的方法，其包括：在足以生产ACC的条件下，在液体培养基中培养包含编码本文中ACC的多核苷酸的细胞；使用亲和层析纯化ACC，其中纯化的多肽具有至少约40%单体的纯度；以及从细胞或液体培养基中回收ACC。在一些实施方案中，纯化的多肽具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%单体的纯度。
在另一方面，本公开还提供了一种组合物(例如，在制造ACC的过程中产生的组合物)，其中至少40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的纯化ACC为单体形式。
治疗方法
本文提供了治疗受试者的疾病(例如癌症(例如本文所述的任何癌症))的方法，所述方法包括将治疗有效量的本文所述的任何ACC施用至所述受试者。
如本文所用，术语“受试者”是指任何哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是猫科动物(例如猫)、犬科动物(例如狗)、马科动物(例如马)、兔、猪、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠或豚鼠)、非人灵长类动物(例如猿猴(例如猴(例如狒狒、狨猴)或猿(例如黑猩猩、大猩猩、猩猩或长臂猿))或人。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，受试者先前已被鉴定或诊断为患有疾病(例如癌症(例如本文所述的任何癌症))。
如本文所用，术语“治疗”包括降低受试者(例如本文所述的任何受试者)的疾病(例如癌症(例如本文所述的任何癌症))的一种或多种(例如1、2、3、4或5种)症状或体征的严重性、频率或数目。在疾病是癌症的一些实施方案中，治疗导致减少患有癌症的受试者的癌症生长、抑制其癌症进展、抑制其癌症转移或降低其癌症复发的风险。
在本文所描述的方法中的任一种的一些实施方案中，疾病是癌症。本文还提供了治疗有需要的受试者(例如本文所述或本领域中已知的任何示例性受试者)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的任何ACC或本文所述的任何组合物(例如药物组合物)。
在这些方法的一些实施方案中，受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。癌症的非限制性实例包括：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、横纹肌肉瘤、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)、骨肉瘤、B细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤)、白血病(例如，毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL))、骨髓增生异常综合征(MDS)、卡波西肉瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿路上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌和食管癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌、结肠癌、骨癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、鼻咽腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，淋巴瘤是伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)。在一些方面，受试者已被鉴定或诊断为患有家族性癌症综合征，例如利-弗劳梅尼综合征(LiFraumeni Syndrome)、家族性乳腺癌-卵巢癌(BRCA1或BRAC2突变)综合征等。所公开方法还可用于治疗非实体癌症。示例性实体瘤包括各种器官系统的恶性病(例如肉瘤、腺癌和癌瘤)，例如肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如结肠)和泌尿生殖(例如肾、尿路上皮或睾丸肿瘤)道、咽、前列腺和卵巢的恶性病。示例性腺癌包括结直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌和小肠癌。
美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)描述的示例性癌症包括：成人急性淋巴母细胞白血病；儿童急性淋巴母细胞白血病；成人急性髓样白血病；肾上腺皮质癌；儿童肾上腺皮质癌；AIDS相关淋巴瘤；AIDS相关恶性肿瘤；肛门癌；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤；肝外胆管癌；膀胱癌；儿童膀胱癌；骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤骨癌；儿童脑干胶质瘤；成人脑肿瘤；儿童脑干胶质瘤脑肿瘤；儿童小脑星形细胞瘤脑肿瘤；儿童大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤脑肿瘤；儿童室管膜瘤脑肿瘤；儿童髓母细胞瘤脑肿瘤；儿童幕上原始神经外胚层肿瘤脑肿瘤；儿童视路和下丘脑胶质瘤脑肿瘤；儿童脑肿瘤(其他)；乳腺癌；乳腺癌和妊娠；儿童乳腺癌；男性乳腺癌；儿童支气管腺瘤/类癌；儿童类癌肿瘤；胃肠类癌肿瘤；肾上腺皮质癌；胰岛细胞癌；原发灶不明癌(Carcinoma of UnknownPrimary)；原发性中枢神经系统淋巴瘤；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；子宫颈癌；儿童癌症；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓性白血病；慢性骨髓增生性病症；腱鞘透明细胞肉瘤；结肠癌；儿童结直肠癌；皮肤T细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；儿童室管膜瘤；卵巢上皮癌；食管癌；儿童食管癌；尤因氏家族肿瘤；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼内黑素瘤眼癌；视网膜母细胞瘤眼癌；胆囊癌；胃(胃部)癌；儿童胃(胃部)癌；胃肠类癌肿瘤；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；卵巢生殖细胞肿瘤；妊娠滋养细胞肿瘤；儿童脑干胶质瘤；儿童视路和下丘脑胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；成人(原发性)肝细胞(肝)癌；儿童(原发性)肝细胞(肝)癌；成人霍奇金氏淋巴瘤；儿童霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期霍奇金氏淋巴瘤；下咽癌；儿童下丘脑和视路胶质瘤；眼内黑素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西氏肉瘤；肾癌；喉癌；儿童喉癌；成人急性淋巴母细胞白血病；儿童急性淋巴母细胞白血病；成人急性髓样白血病；儿童急性髓样白血病；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓性白血病；毛细胞白血病；唇和口腔癌；成人(原发性)肝癌；儿童(原发性)肝癌；非小细胞肺癌；小细胞肺癌；成人急性淋巴母细胞白血病；儿童急性淋巴母细胞白血病；慢性淋巴细胞白血病；AIDS相关淋巴瘤；中枢神经系统(原发性)淋巴瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；成人霍奇金氏淋巴瘤；儿童霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期霍奇金氏淋巴瘤；成人非霍奇金氏淋巴瘤；儿童非霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期非霍奇金氏淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Macroglobulinemia, Waldenstrom's)；男性乳腺癌；成人恶性间皮瘤；儿童恶性间皮瘤；恶性胸腺瘤；儿童髓母细胞瘤；黑素瘤；眼内黑素瘤；梅克尔细胞癌(Merkel Cell Carcinoma)；恶性间皮瘤；原发灶隐匿的转移性鳞状颈部癌；儿童多发性内分泌瘤形成综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物；蕈样肉芽肿病；骨髓增生异常综合征；慢性髓性白血病；儿童急性髓样白血病；多发性骨髓瘤；慢性骨髓增生性病症；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；儿童鼻咽癌；神经母细胞瘤；成人非霍奇金氏淋巴瘤；儿童非霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期非霍奇金氏淋巴瘤；非小细胞肺癌；儿童口腔癌；口腔和唇癌；口咽癌；骨肉瘤/恶性骨纤维组织细胞瘤；儿童卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜能肿瘤；胰腺癌；儿童胰腺癌；胰岛细胞胰腺癌；鼻旁窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞瘤；儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体肿瘤；浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠和乳腺癌；妊娠和霍奇金氏淋巴瘤；妊娠和非霍奇金氏淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；成人原发性肝癌；儿童原发性肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；儿童肾细胞癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；视网膜母细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤；唾液腺癌；儿童唾液腺癌；尤因氏家族肿瘤肉瘤；卡波西氏肉瘤；肉瘤(骨肉瘤)/恶性骨纤维组织细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤肉瘤；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；塞扎里综合征(SezarySyndrome)；皮肤癌；儿童皮肤癌；皮肤癌(黑素瘤)；梅克尔细胞皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；原发灶隐匿的转移性鳞状颈部癌；胃部(胃)癌；儿童胃部(胃)癌；儿童幕上原始神经外胚层肿瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；睾丸癌；儿童胸腺瘤；恶性胸腺瘤；甲状腺癌；儿童甲状腺癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；妊娠滋养细胞肿瘤；原发部位未知的儿童癌症；不寻常的儿童癌症；输尿管和肾盂移行细胞癌；尿道癌；子宫肉瘤；阴道癌；儿童视路和下丘脑胶质瘤；外阴癌；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；和维尔姆斯氏肿瘤(Wilms' Tumor)。
其他示例性癌症包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和套细胞淋巴瘤(MCL)。
以上提及的癌症的转移也可根据本文所述的方法来治疗或预防。
在一些实施方案中，这些方法可导致受试者的癌症的一种或多种症状的数目、严重性或频率降低(例如，与在治疗之前受试者的癌症的一种或多种症状的数目、严重性或频率相比)。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，方法还包括向受试者施用额外治疗剂(例如，表4中所列的治疗剂中的一种或多种)。
表4.额外治疗剂
组合物/药盒
本文还提供了组合物(例如药物组合物)，所述组合物包括本文所述的任何ACC和一种或多种(例如1、2、3、4或5种)药学上可接受的载体(例如本文所述的任何药学上可接受的载体)、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，包括本文所述的任何ACC的组合物(例如药物组合物)可安置在无菌小瓶或预装载注射器中。
在一些实施方案中，包括本文所述的任何ACC的组合物(例如药物组合物)可被配制用于不同施用途径(例如静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内或肿瘤内)。
在一些实施方案中，本文所述的任何药物组合物都可包括一种或多种缓冲剂(例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、氨基酸(例如甘氨酸)、一种或多种碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、右旋糖酐或甘露糖醇)、一种或多种抗氧化剂、一种或多种螯合剂(例如EDTA或谷胱甘肽)、一种或多种防腐剂和/或药学上可接受的载剂(例如抑菌水、PBS或盐水)。
如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指可与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗微生物剂、等张剂和吸收延迟剂等。适合载体包括但不限于：水、盐水、林格氏溶液(ringer’s solution)、右旋糖溶液和约5%人血清白蛋白。
在本文所述的任何药物组合物的一些实施方案中，本文所述的任何ACC与防止从身体的快速消除的载体一起制备，所述载体例如是持续和控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用生物可降解的生物可相容聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类药物组合物和制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。
本文还提供了包括本文所述的任何ACC、包括本文所述的任何ACC的任何组合物、或包括本文所述的任何ACC的任何药物组合物的药盒。还提供了除本文所述的ACC之外还包括一种或多种选自表4的第二治疗剂的药盒。一种或多种第二治疗剂可以与ACC分开的剂量施用形式提供。替代地，一种或多种第二治疗剂可与ACC一起配制。在一些实施方案中，所述药盒包括(1)包含选自由SEQ ID NO: 129和SEQ ID NO: 347-356组成的组的氨基酸序列的ACC，和(2)选自表4的第二治疗剂。
本文所述的任何药盒都可包括关于使用本文所述的任何组合物(例如，药物组合物)和/或任何ACC的说明书。在一些实施方案中，药盒可包括关于进行本文所述的任何方法的说明书。在一些实施方案中，药盒可包括至少一剂本文所述的任何组合物(例如药物组合物)。在一些实施方案中，药盒可提供用于施用本文所描述的任何药物组合物的注射器。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例不限制权利要求书中所述的本发明的范围。
实施例1：可活化IL-15细胞因子构建体的产生
通过重组方法制备含有人IL-15的可活化细胞因子构建体(ProC2970)。所述ProC2970的第1单体构建体和第2单体构建体是相同的，各自是具有SEQ ID NO: 523的氨基酸序列和在它的N末端的信号序列的多肽。第一单体构建体和第二单体构建体中的每一个从N末端到C末端包含来自小鼠IgG κ信号序列(METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO:345))的信号序列、MM (SEQ ID NO: 236)、可裂解部分SGRSDNI (SEQ ID NO: 655)、对应于人IL-15氨基酸残基49-161的成熟细胞因子蛋白(SEQ ID NO: 347)、可裂解部分SGRSDNI (SEQID NO: 655)和对应于人IgG4 Fc的二聚化结构域，在Cys226处截短(根据EU编号)，并包括S228P突变(SEQ ID NO: 3)(图5)。ProC2970的完整单体构建体序列(包括信号序列)在SEQID NO: 524中示出。
根据IL-15四元复合物(PDB ID: 4GS7)晶体结构中IL-2Rβ的序列设计了IL-15的肽掩码ALTTVDGGGGSASHYFER(SEQ ID NO: 236)。来自IL-2Rβ的两个肽基序KLTTVD (SEQ IDNO: 720)和ASHYFER (SEQ ID NO: 721)与IL-15相互作用，它们通过接头串联，形成单个串联肽作为细胞因子掩蔽部分(MM)。
通过用具有SEQ ID NO: 529的序列的多核苷酸对宿主细胞进行转化，随后培养所得重组宿主细胞来制备多肽。所得到的所表达多肽的二聚化产生细胞因子构建体ProC2970。ProC2970通过蛋白A和尺寸排阻色谱法从培养上清液中纯化，经测定为所需物种的>95%。
实施例2：对示例性IL-15细胞因子构建体的体外表征
为了裂解结构引导肽串联掩蔽、MM和二聚化结构域，将含有IL-15的ACC在37℃下与重组人蛋白酶尿激酶型纤溶酶原活化剂(uPA)处理过夜。在测试活性之前，添加了蛋白酶抑制剂混合物来中和蛋白酶。用uPA在可裂解部分中预期位点处的裂解通过电泳来确认(图6)。结果表明，uPA蛋白酶裂解ProC2970和ProC1879中的可裂解部分(CM)。
使用IL-2/IL-15反应性HEK293细胞在uPA裂解之前和之后对ProC2970和ProC1879的活性进行体外测试。通过稳定转染人CD25 (IL-2Rα)、CD122 (IL-2Rβ)和CD132 (IL-2Rγ)基因以及人JAK3和STAT5基因，产生IL-2/IL15反应性HEK293细胞，以获得完全功能的IL-2/IL-15信号传导通路。细胞还以STAT5诱导型SEAP (分泌型胚胎碱性磷酸酶)报告基因为特征。为维持转基因表达，在补充有10% FBS、青霉素/链霉素(Pen/Strep)、10ug/ml嘌呤霉素和100 μg /mL NormocinTM的DMEM GlutaMaxTM培养基中培养细胞。将IL-2和IL-15添加至这些细胞中会活化STAT5并随后诱导SEAP的产生，此可容易地使用QUANTI-Blue溶液(对碱性磷酸酶活性的比色检测)在上清液中评估。
以280,000个细胞/mL的浓度在补充有10% FBS的DMEM培养基中制备IL-2/IL-15反应性HEK293细胞，并且将180 μL等分试样吸移至白色平底96孔板的孔中(50,000个细胞/孔)。将测试细胞因子在补充有10% FBS的DMEM培养基中稀释。制备一式两份三倍连续稀释液，从中将20 μL添加至每个孔中。在37℃下孵育20-24小时后，将20 μl诱导的报告细胞上清液转移到平底96孔板的孔中。每个孔加入180 μl重悬的QUANTI-Blue溶液。将板在37℃的培养箱中孵育1-3 h后，使用620 nm的分光光度计测量SEAP水平。生成剂量反应曲线，并使用GraphPad Prism软件通过S形拟合非线性回归获得EC50值。
在报告基因测定中，与PeproTech IL-15 (重组人IL-15 (rhIL-15)，可从PeproTech获得，目录号200-15)相比，ProC2970的活性降低了至少6000倍(6000倍)，并且与Fc掩蔽的IL-15 ProC1879 (SEQ ID NO: 356)相比，ProC2970的活性降低了9.5倍(9.5倍)(图7)。这表明根据本公开的MM融合为ACC构建体中的IL-15提供了额外的掩蔽。用uPA活化蛋白酶部分恢复ProC2970的活性，使其接近但低于重组IL-15的水平。下表5提供了rhIL-15、ProC1879、ProC2970、ProC1879+uPA和ProC2970+uPA的EC50值。
表5.EC50：HEK-Blue报告基因测定
rhIL-15 ProC1879 ProC2970 ProC1879+uPA ProC2970+uPA
EC50 (pM) 2.133 1413 13817 30.83 43.71
实施例3：含IL-15的ACC对人PBMC增殖的活性
在细胞增殖测定中，将人PBMC与重组IL-15或IL-15-ACC (有或没有预先蛋白酶活化)孵育3天。孵育后，用可固定活力染料eFlurTM780、抗CD3-FITC (UCHTI)、抗CD4-BV608(RPA-T4)、抗CD8-BV480 (RPA-T8)、抗CD56-BV421 (HCD56)和抗Ki67-APC (Ki67)抗体对PBMC进行染色。分析了包括CD3-、CD56+NK细胞，CD3+、CD8+T细胞，CD3+、CD4+T细胞的各种细胞群，并基于Ki67的表达百分比确定各种细胞群的增殖，如图8所示。蛋白酶处理的IL-15-ACC比相应的完整的含IL-15的ACC表现出更强的增殖活性。表6示出了PBMC中各种含IL-15的ACC的EC50。
表6. EC50：人PBMC增殖Ki67
EC50 (nM) NK细胞 CD8 CD4
rhIL-15 0.1167 0.2225 0.1701
ProC1879+uPA 1.352 3.584 6.779
ProC2970+uPA 0.8067 3.644 3.673
ProC1879 71560 721308 28697
ProC2970 3392706 41289 780.3
实施例4：可活化细胞因子X
基于对细胞因子-受体复合物的结构模型的检查，为其他细胞因子设计了串联掩蔽肽。例如，可基于IL-10二元复合物(PDB ID: 1J7V)晶体结构中IL-10R1的序列设计IL-10掩码(SEQ ID NO: 722)。与IL-10二聚体分子相互作用的来自IL-10R1的两个肽序列TNTRFSVDEVT (SEQ ID NO: 723)和SVASRSNKG (SEQ ID NO: 724)通过接头串联，以产生候选IL-10掩蔽部分，如下所示。
类似地，IL-18掩蔽部分(SEQ ID NO: 725)可基于IL-18三元复合物(PDB ID:3WO4)晶体结构中IL-18α的序列进行设计。与IL-18相互作用的来自IL-18Rα的肽序列VDEVYDYHQ (SEQ ID NO: 726)和LLLGSTG (SEQ ID NO: 727)通过接头串联，以获得潜在的IL-18掩蔽部分。使用相同策略，可根据IFNγ三元复合物(PDB ID: 6E3K)晶体结构中IFNGR1的序列设计IFNγ的肽掩码(SEQ ID NO: 728)。与IFNγ二聚体分子相互作用的来自IFNGR1的两个肽序列EEFAVLRDGK (SEQ ID NO: 729)和GVLNVWGV (SEQ ID NO: 730)通过接头串联，以获得SEQ ID NO: 728的IFNγ掩蔽部分。本公开的下文和全文提供了串联掩码的额外实例。
表7.串联掩码肽
实施例5：对示例性含IL-15的ACC的体外表征
将IL-15 WT ACC和IL-15突变蛋白ACC在37℃下用重组uPA处理过夜。在测试活性之前，添加了蛋白酶抑制剂混合物来中和蛋白酶。表8示出了IL-15的掩码序列。ACC示意图如图10所示。通过将构建体在37℃下孵育过夜，以ACC与uPA的比率为1:5来活化ACC。通过电泳证实了可裂解部分的预期位点处被uPA裂解(图9A和图9B)。HEK293报告基因测定表征了完整和蛋白酶处理的含IL-15ACC的活性(图9C至图9E)。表9示出了来自多个实验的含IL-15的ACC的平均EC50值。结果表明，基于结构的肽掩蔽对WT和含有突变蛋白IL-15的ACC提供活性衰减。
表8.
表9.EC50：HEK-Blue报告基因测定
表10.实例序列
编号项目
1. 一种细胞因子掩蔽部分(MM)，其包含：
(a) 第一掩蔽亚基，所述第一掩蔽亚基由编码细胞因子的受体的第一受体多肽的氨基酸序列的第一子序列编码，和
(b) 第二掩蔽亚基，所述第二掩蔽亚基由选自由以下组成的组的第二氨基酸序列编码：
(i) 编码细胞因子受体多肽的氨基酸序列的第二子序列，所述细胞因子受体多肽选自由编码所述第一受体多肽的所述氨基酸序列和编码所述细胞因子的所述受体的第二受体多肽的氨基酸序列组成的组，其中在编码所述第一受体多肽的所述氨基酸序列内，所述第一子序列和所述第二子序列不连续；和
(ii) 编码阻断部分(BM)的氨基酸序列。
2. 如项目1所述的细胞因子MM，其中所述细胞因子MM包含设置在所述第一掩蔽亚基与所述第二掩蔽亚基之间的接头。
3. 如项目1-2中任一项或组合所述的细胞因子MM，其中所述第二掩蔽亚基由编码BM的第二氨基酸序列编码。
4. 如项目3所述的细胞因子MM，其中所述BM包含对所述细胞因子具有结合亲和力的肽。
5. 如项目3所述的细胞因子MM，其中所述BM包含对所述细胞因子具有结合亲和力的scFv。
6. 如项目1-2中任一项或组合所述的细胞因子MM，其中所述第二掩蔽亚基由编码受体多肽的氨基酸序列的第二子序列编码，所述受体多肽选自由编码所述第一受体多肽的所述氨基酸序列和编码所述细胞因子的所述受体的第二受体多肽的氨基酸序列组成的组，其中在编码所述第一受体多肽的所述氨基酸序列内，所述第一子序列和所述第二子序列不连续。
7. 如项目6所述的细胞因子MM，其中所述第一子序列和所述第二子序列相同，或者其中所述第一受体多肽和所述第二受体多肽相同。
8. 如项目6所述的细胞因子MM，其中所述第一子序列和所述第二子序列不同。
9. 如项目6和8中任一项或组合所述的细胞因子MM，其中所述第一受体多肽和所述第二受体多肽不同。
10. 如项目1-9中任一项或组合所述的细胞因子MM，其中所述细胞因子MM可操作地连接至所述细胞因子。
11. 一种可活化细胞因子构建体(ACC)，其包含可裂解部分(CM)、细胞因子多肽(CP)和项目1-10中任一项或组合所述的细胞因子MM。
12. 一种可活化细胞因子构建体(ACC)，其包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)和细胞因子多肽(CP)，其中：
a) 所述MM包含多肽序列，所述多肽序列包含两个或更多个受体子序列的串联序列；
b) 所述受体子序列中的每一个来自所述CP的受体；并且
c) 所述两个或更多个受体子序列：
i) 在所述受体的所述序列中不连续；并且
ii) 彼此直接或间接连接。
13. 如项目12所述的ACC，其中所述两个或更多个受体子序列中的每一个包含所述受体中的连续氨基酸，所述连续氨基酸在所述受体和所述细胞因子的复合物的共晶结构(细胞因子-受体复合物共晶结构)中的所述细胞因子氨基酸的1.0至8.0埃、2.0至8.0埃或2.0至7.0埃的范围内。
14. 如项目12所述的ACC，其还包含设置在所述两个或更多个受体子序列中的至少两个之间的接头。
15. 如项目12-13中任一项或组合所述的ACC，其中所述受体子序列中的每一个包含2、3、4或更多个氨基酸。
16. 如项目12-14中任一项或组合所述的ACC，其中所述两个或更多个受体子序列中的至少一个包含相对于所述受体的所述序列的至少一个氨基酸的保守取代。
17. 如项目12-15中任一项或组合所述的ACC，其中所述两个或更多个受体子序列包括第一受体子序列和第二受体子序列，
其中所述第二受体子序列位于所述受体的所述序列中所述第一受体子序列的C末端，
其中所述接头包含X个氨基酸，
其中X = n/y，
其中n=所述细胞因子-受体复合物共晶结构中所述第一受体子序列的N末端肽的C末端与所述第二受体子序列的C末端肽的N末端之间的距离，以埃为单位，并且y是在1.5-3.5、或2-3.5、或2-3或2-2.5范围内的数字，或者y是2.5，并且如果X不是整数，则X四舍五入到下一个整数。
18. 如项目12-16中任一项或组合所述的ACC，其中所述MM包含氨基酸序列ALTTVX-接头-ASHYFE (SEQ ID NO: 508) (MM)，其中X是D、K或R，其中所述N末端丙氨酸残基任选地不存在或任选地被任何其他氨基酸取代，并且所述接头由1至20个氨基酸组成。
19. 如项目18所述的ACC，其中所述MM的N末端、C末端或两者延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
20. 一种分离的多肽，其包含多肽序列，所述多肽序列包含两个或更多个受体子序列的串联序列，其中所述受体子序列中的每一个来自细胞因子多肽(CP)的受体；并且所述两个或更多个受体子序列：
i) 在所述受体的所述序列中不连续；并且
ii) 彼此直接或间接连接。
21. 如项目20所述的分离的多肽，其中所述两个或更多个受体子序列中的每一个包含所述受体中的连续氨基酸，所述连续氨基酸在所述受体和所述细胞因子的复合物的共晶结构(细胞因子-受体复合物共晶结构)中的所述细胞因子氨基酸的1.0至8.0埃、2.0至8.0埃或2.0至7.0埃的范围内。
22. 如项目20所述的分离的多肽，其还包含设置在所述两个或更多个受体子序列中的至少两个之间的接头。
23. 如项目20-22中任一项或组合所述的分离的多肽，其中所述受体子序列中的每一个包含2、3、4或更多个氨基酸。
24. 如项目20-23中任一项或组合所述的分离的多肽，其中所述两个或更多个受体子序列中的至少一个包含相对于所述受体的所述序列的至少一个氨基酸的保守取代。
25. 如项目21-24中任一项或组合所述的分离的多肽，其中所述两个或更多个受体子序列包括第一受体子序列和第二受体子序列，
其中所述第二受体子序列位于所述受体的所述序列中所述第一受体子序列的C末端，
其中所述接头包含X个氨基酸，
其中X = n/y，
其中n=所述细胞因子-受体复合物共晶结构中所述第一受体子序列的N末端肽的C末端与所述第二受体子序列的C末端肽的N末端之间的距离，以埃为单位，并且y是在1.5-3.5、或2-3.5、或2-3或2-2.5范围内的数字，或者y是2.5，并且如果X不是整数，则X四舍五入到下一个整数。
26. 一种分离的多肽，其包含氨基酸序列ALTTVX-接头-ASHYFE (SEQ ID NO:508) (MM)，其中X是D、K或R，其中所述N末端丙氨酸残基任选地不存在或任选地被任何其他氨基酸取代，并且所述接头由1至20个氨基酸组成。
27. 如项目26所述的分离的多肽，其中所述分离的多肽的N末端、C末端或两者延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
28. 如项目12-27中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述X是D。
29. 如项目12-28中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述X是K。
30. 如项目12-29中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述X是R。
31. 如项目12-30中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述接头由4、5、6、7或8个氨基酸组成。
32. 如项目12-31中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述接头由6个氨基酸组成。
33. 如项目12-32中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述接头选自由SEQ ID NO: 2、210-235、245、250和318-335组成的组。
34. 如项目12-33中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述接头是GGGGS (SEQ ID NO: 216)。
35. 如项目12-34中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述氨基酸序列包含ALTTVDGGGGSASHYFER (SEQ ID NO: 236)或ALTTVDGGGGSASHYFEK (SEQ ID NO: 237)，或其中所述N末端丙氨酸残基任选地不存在或任选地被任何其他氨基酸取代。
36. 如项目12-35中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述氨基酸序列包含ALTTVKGGGGSASHYFER (SEQ ID NO: 238)或ALTTVKGGGGSASHYFEK (SEQ ID NO: 239)，或其中所述N末端丙氨酸残基任选地不存在或任选地被任何其他氨基酸取代。
37. 如项目12-36中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述氨基酸序列包含ALTTVRGGGGSASHYFER (SEQ ID NO: 240)或ALTTVRGGGGSASHYFEK (SEQ ID NO: 241)，或其中所述N末端丙氨酸残基任选地不存在或任选地被任何其他氨基酸取代。
38. 如项目12-37中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述N末端丙氨酸残基被赖氨酸取代。
39. 如项目12-37中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述分离的多肽包含选自以下的序列：SQKLTTVDGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 731)、SQKLTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 734)、SQALTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO:736)或SQALTTVDGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 737)。
40. 如任何前述项目或项目组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述分离的多肽包括细胞因子。
41. 如项目12-40中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述分离的多肽设置在包含两种或更多种多肽的复合物中，并且其中所述复合物包含细胞因子。
42. 如项目12-41中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述细胞因子设置在与所述分离的多肽复合的多肽中。
43. 如项目12-42中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述氨基酸序列是抑制所述细胞因子与其受体结合的掩蔽部分。
44. 如项目12-43中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述细胞因子是结合IL2/IL15受体β和/或IL2/IL15受体γ的细胞因子。
45. 如项目12-44中任一项或组合所述的分离的多肽或ACC，其中所述细胞因子结合至IL-15Rα。
46. 如项目12-45中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述细胞因子结合至IL-2Rα。
47. 一种可活化细胞因子构建体(ACC)，其包含细胞因子多肽(CP)、可裂解部分(CM)和所述分离的多肽，所述分离的多肽包含含有串联序列的多肽序列或任何前述项目或项目组合所述的细胞因子掩蔽部分(MM)，其中所述分离的多肽或所述MM通过所述CM与所述CP偶联并抑制CP与其受体的结合。
48. 如项目47所述的ACC，其中所述CP是白细胞介素多肽。
49. 如项目48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含与SEQ ID NO: 348、129或130至少85%、90%或95%同一的序列。
50. 如项目48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 348、129或130。
51. 如项目48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含与SEQ ID NO: 119或120至少85%、90%或95%同一的序列。
52. 如项目48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 119或120。
53. 如项目48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含与SEQ ID NO: 121或122至少85%、90%或95%同一的序列。
54. 如项目48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 121或122。
55. 如项目48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含与SEQ ID NO: 123或124至少85%、90%或95%同一的序列。
56. 如项目48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 123或124。
57. 如项目48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含与SEQ ID NO: 125或126至少85%、90%或95%同一的序列。
58. 如项目48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 125或126。
59. 如项目48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含与SEQ ID NO: 521或522至少85%、90%或95%同一的序列。
60. 如项目48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 521或522。
61. 如项目47-60中任一项或组合所述的ACC，其中所述CM包含不超过8个氨基酸。
62. 如项目47-61中任一项或组合所述的ACC，其中所述CM能够被尿激酶(uPA)和/或基质金属蛋白酶(MMP)裂解。
63. 如项目47-62中任一项或组合所述的ACC，其还包含所述CM与所述CP之间的接头(L1)。
64. 如项目47-63中任一项或组合所述的ACC，其还包含所述CM与所述MM之间的接头(L2)。
65. 如项目47-64中任一项或组合所述的ACC，其还包含所述CM与所述CP之间的第一接头(L1)以及所述CM与所述MM之间的第二接头(L2)。
66. 如项目47-65中任一项或组合所述的ACC，其还包含进一步抑制所述CP与其受体结合的空间掩码。
67. 一种ACC，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中
所述第一单体构建体包含第一细胞因子多肽(CP1)、第一可裂解部分(CM1)、通过所述CM1与所述CP1偶联的第一二聚化结构域(DD1)和第一掩蔽部分(MM1)，
所述第二单体构建体包含第二细胞因子多肽(CP2)、第二可裂解部分(CM2)、通过所述CM2与所述CP2偶联的第二二聚化结构域(DD2)和第二掩蔽部分(MM2)，
所述DD1和所述DD2彼此结合，从而形成所述第一单体构建体和所述第二单体构建体的二聚体，并且
所述MM1和/或所述MM2包含任何前述项目或项目组合所述的分离的多肽。
68. 如项目67所述的ACC，其中所述第一单体构建体包含第三可裂解部分(CM3)，并且所述MM1通过所述CM3与所述CP1偶联。
69. 如项目67-68中任一项或组合所述的ACC，其中所述MM1通过所述DD1和所述CM1与所述CP1偶联。
70. 如项目67-69中任一项或组合所述的ACC，其中所述第二单体构建体包含第四可裂解部分(CM4)，并且所述MM2通过所述CM4与所述CP2偶联。
71. 如项目67-70中任一项或组合所述的ACC，其中所述MM2通过所述DD2和所述CM2与所述CP2偶联。
72. 如项目67-71中任一项或组合所述的ACC，所述第一单体构建体和所述第二单体构建体中的每一个包含含有不超过18个氨基酸的连接区。
73. 如项目67-72中任一项或组合所述的ACC，其中
所述CP1和所述CM1彼此直接邻接，且/或
所述CM1和所述DD1彼此直接邻接。
74. 如项目67-73中任一项或组合所述的ACC，其中
所述CP2和所述CM2彼此直接邻接，且/或
所述CM2和所述DD2彼此直接邻接。
75. 如项目67-74中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP1包含与SEQ ID NO:348、129或130至少85%、90%或95%同一的序列。
76. 如项目67-75中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP2包含与SEQ ID NO:348、129或130至少85%、90%或95%同一的序列。
77. 如项目67-76中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP1包含SEQ ID NO: 348、129或130。
78. 如项目67-77中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP2包含SEQ ID NO: 348、129或130。
79. 如项目67-78中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP1包含与SEQ ID NO:119或120至少85%、90%或95%同一的序列。
80. 如项目67-79中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP2包含与SEQ ID NO:119或120至少85%、90%或95%同一的序列。
81. 如项目67-80中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP1包含SEQ ID NO: 119或120。
82. 如项目67-81中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP2包含SEQ ID NO: 119或120。
83. 如项目67-82中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP1包含与SEQ ID NO:121或122至少85%、90%或95%同一的序列。
84. 如项目67-83中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP2包含与SEQ ID NO:121或122至少85%、90%或95%同一的序列。
85. 如项目67-84中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP1包含SEQ ID NO: 121或122。
86. 如项目67-85中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP2包含SEQ ID NO: 121或122。
87. 如项目67-86中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP1包含与SEQ ID NO:123或124至少85%、90%或95%同一的序列。
88. 如项目67-87中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP2包含与SEQ ID NO:123或124至少85%、90%或95%同一的序列。
89. 如项目67-88中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP1包含SEQ ID NO: 123或124。
90. 如项目67-89中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP2包含SEQ ID NO: 123或124。
91. 如项目67-90中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP1包含与SEQ ID NO:125或126至少85%、90%或95%同一的序列。
92. 如项目67-91中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP2包含与SEQ ID NO:125或126至少85%、90%或95%同一的序列。
93. 如项目67-92中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP1包含SEQ ID NO: 125或126。
94. 如项目67-93中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP2包含SEQ ID NO: 125或126。
95. 如项目67-94中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP1包含与SEQ ID NO:521或522至少85%、90%或95%同一的序列。
96. 如项目67-95中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP2包含与SEQ ID NO:521或522至少85%、90%或95%同一的序列。
97. 如项目67-96中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP1包含SEQ ID NO: 521或522。
98. 如项目67-97中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP2包含SEQ ID NO: 521或522。
99. 如项目67-98中任一项或组合所述的ACC，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体是相同的。
100. 如项目67-99中任一项或组合所述的ACC，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体具有95%序列同源性。
101. 如项目67-100中任一项或组合所述的ACC，其还包含第三单体，所述第三单体包含含有SEQ ID NO: 520的序列的寿司结构域，其中所述第三单体非共价或共价结合至所述ACC。
102. 如项目67-101中任一项或组合所述的ACC，其还包含第四单体，所述第四单体包含含有SEQ ID NO: 520的序列的寿司结构域，其中所述第四单体非共价或共价结合至所述ACC。
103. 如项目100或101所述的ACC，其中所述第三单体和/或所述第四单体还包含标签。
104. 一种ACC，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中
所述第一单体构建体包含第一细胞因子多肽(CP1)、第一二聚化结构域(DD1)和第一掩蔽部分(MM1)，
所述第二单体构建体包含第二细胞因子多肽(CP2)、第一可裂解部分(CM1)、通过所述CM1与所述CP2偶联的第二二聚化结构域(DD2)和第二掩蔽部分(MM2)，并且
所述MM1和/或所述MM2是任何前述项目或项目组合所述的分离的多肽，
所述DD1和所述DD2彼此结合，从而形成所述第一单体构建体和所述第二单体构建体的二聚体。
105. 如项目104所述的ACC，其中所述第一单体构建体还包含第二可裂解部分(CM2)，并且所述MM1通过所述CM2与所述CP1偶联。
106. 如项目104或105所述的ACC，其中所述MM2通过所述DD2和所述CM1与所述CP2偶联。
107. 如项目104-106中任一项或组合所述的ACC，其中所述第二单体构建体还包含第三可裂解部分(CM3)，其中所述MM2通过所述CM3与所述CP2偶联。
108. 一种ACC，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中
所述第一单体构建体包含第一细胞因子多肽(CP1)、第一二聚化结构域(DD1)和第一掩蔽部分(MM1)，
所述第二单体构建体包含第二细胞因子多肽(CP2)、第二二聚化结构域(DD2)和第二掩蔽部分(MM2)，
所述CP1和/或所述CP2包含用作蛋白酶的底物的氨基酸序列，并且所述DD1和/或所述DD2通过所述氨基酸序列与所述CP1或所述CP2偶联，并且
所述MM1和/或所述MM2是任何前述项目或项目组合所述的分离的多肽，
所述DD1和所述DD2彼此结合，从而形成所述第一单体构建体和所述第二单体构建体的二聚体。
109. 如项目108所述的ACC，其中所述CP1包含用作蛋白酶的底物的所述氨基酸序列，并且所述MM1通过所述氨基酸序列与所述CP1偶联。
110. 如项目108-109中任一项或组合所述的ACC，其中所述第一单体构建体还包含第一可裂解部分(CM1)，并且所述MM1通过所述CM1与所述CP1偶联。
111. 如项目108中任一项或组合所述的ACC，其中所述CP2包含用作蛋白酶的底物的所述氨基酸序列，并且所述MM2通过所述氨基酸序列与所述CP2偶联。
112. 如项目108-111中任一项或组合所述的ACC，其中所述第二单体构建体还包含第二可裂解部分(CM2)，并且所述MM2通过所述CM2与所述CP2偶联。
113. 如项目67-112中任一项或组合所述的ACC，其中所述DD1和所述DD2是一对人IgG Fc结构域。
114. 如项目113所述的ACC，其中所述DD1和所述DD2是一对人IgG4 Fc结构域。
115. 如项目114所述的ACC，其中所述DD1和所述DD2是在N末端截短至如根据EU编号所编号的半胱氨酸226的一对人IgG1或IgG4 Fc结构域。
116. 如项目114所述的ACC，其中所述人IgG4 Fc结构域包含如根据EU编号所编号的S228P突变。
117. 如项目67-116中任一项或组合所述的ACC，其中所述DD1和所述DD2中的每一个包含与SEQ ID NO: 3至少95%同一的序列。
118. 如项目67-117中任一项或组合所述的ACC，其中所述DD1和所述DD2中的每一个包含SEQ ID NO: 3的序列。
119. 如项目67-118中任一项或组合所述的ACC，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体通过至少一个、两个、三个或四个二硫键彼此共价结合。
120. 如项目12-19和47-119中任一项或组合所述的ACC，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体中的每一个包含与SEQ ID NO: 523至少85%、90%或95%同一的序列。
121. 如项目12-19和47-120中任一项或组合所述的ACC，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体中的每一个包含SEQ ID NO: 523。
122. 如项目12-19和47-121中任一项或组合所述的ACC，其中所述ACC的特征在于与白细胞介素活性的对照水平相比，具有降低的白细胞介素活性的水平。
123. 如项目12-19和47-122中任一项或组合所述的ACC，其中所述ACC的特征在于与野生型人IL-15相比，具有降低的白细胞介素活性的水平。
124. 如项目12-19和47-123中任一项所述的ACC，其中所述ACC的特征在于与重组人IL-15相比具有降低的IL-15活性的水平，如通过IL-2/IL-15反应性HEK293细胞中的SEAP(分泌性胚胎碱性磷酸酶)产生水平所测量的。
125. 如项目12-19和47-124中任一项所述的ACC，其中所述ACC的特征在于与重组人IL-15的活性相比，具有降低的IL-15活性的水平。
126. 如项目125所述的ACC，其中所述ACC的特征在于与重组人IL-15相比，其IL-15活性的水平降低至少6000倍。
127. 如项目12-19和47-126中任一项或组合所述的ACC，其中所述ACC的特征在于，在uPA蛋白酶裂解所述ACC之后，其EC50为重组野生型IL-15的EC50的至少1000倍、5000倍或6000倍，如在IL-2/IL15反应性HEK293细胞中测量的。
128. 一种ACC，其包含细胞因子多肽(CP)、所述CP的激动剂、所述分离的多肽和可裂解部分(CM)，所述分离的多肽包含含有串联序列的多肽序列或任何前述项目或项目组合所述的细胞因子掩蔽部分(MM)，其中所述分离的多肽或所述MM通过所述CM与所述CP偶联。
129. 如项目128所述的ACC，其中所述CP是IL-15，并且所述激动剂是寿司结构域。
130. 如项目128或项目129所述的ACC，其中所述激动剂通过接头与所述CP偶联。
131. 如项目130所述的ACC，其中所述激动剂通过可裂解接头与所述CP偶联。
132. 如项目120所述的ACC，其中所述激动剂通过不可裂解的接头与所述CP偶联。
133. 如项目128或项目129所述的ACC，其中所述激动剂非共价结合至所述CP。
134. 一种ACC，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中
所述第一单体构建体包含细胞因子多肽(CP)、第一二聚化结构域(DD1)、第一可裂解部分(CM1)、第二可裂解部分(CM2)和所述分离的多肽，所述分离的多肽包含含有串联序列的多肽序列或任何前述项目或项目组合所述的细胞因子掩蔽部分(MM)，其中所述分离的多肽或所述MM通过所述CM1与所述CP偶联，并且所述DD1通过所述CM2与所述CP偶联，
所述第二单体构建体包含所述CP的激动剂、第三可裂解部分(CM3)、通过所述CM3与所述激动剂偶联的第二二聚化结构域(DD2)，并且
所述DD1和所述DD2彼此结合，从而形成所述第一单体构建体和所述第二单体构建体的二聚体。
135. 如项目134所述的ACC，其中所述CP是IL-15，并且所述激动剂是包含SEQ IDNO: 520的序列的寿司结构域。
136. 如项目134或135所述的ACC，其包含由所述寿司结构域与所述CM3之间的2个氨基酸组成的接头。
137. 一种多核苷酸，其编码任何前述项目或项目组合所述的分离的多肽、任何前述项目或项目组合所述的ACC、或任何前述项目或项目组合所述的单体构建体。
138. 一种载体，其包含项目137所述的多核苷酸。
139. 如项目138所述的载体，其中所述载体是表达载体。
140. 一种宿主细胞，其包含项目137所述的多核苷酸或项目138或139所述的载体。
141. 如项目所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
142. 一种组合物，其包含任何前述项目或项目组合所述的分离的多肽、或任何前述项目或项目组合所述的ACC、或项目137所述的多核苷酸。
143. 如项目142所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
144. 一种容器、小瓶、注射器、注射笔或药盒，其包含至少一剂的项目142或143所述的组合物。
145. 一种治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的任何前述项目或项目组合所述的分离的多肽、任何前述项目或项目组合所述的ACC、或项目142或143所述的组合物。
146. 如项目145所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。
147. 如项目146所述的方法，其中所述癌症是白血病、淋巴瘤或实体瘤。
148. 如项目147所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有炎症或自身免疫性疾病、病症或疾患。
149. 一种产生ACC的方法，其包括
在液体培养基中培养包含项目137所述的多核苷酸的细胞以产生所述ACC；以及
从所述细胞或所述液体培养基回收所述ACC。
150. 如项目149所述的方法，其还包括分离从所述细胞或所述液体培养基回收的所述ACC。
151. 如项目149或150所述的方法，其还包括将所述分离的ACC配制成药物组合物。
152. 一种复合物，其包含多肽，所述多肽包含与任何前述项目或项目组合所述的分离的多肽复合的细胞因子。
其他实施方案
应了解尽管已结合本发明的详细描述对本发明进行描述，但先前描述意图说明而非限制由随附权利要求书的范围限定的本发明的范围。其他方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。

Claims (152)

1. 一种细胞因子掩蔽部分(MM)，其包含：
(a) 第一掩蔽亚基，所述第一掩蔽亚基由编码细胞因子的受体的第一受体多肽的氨基酸序列的第一子序列编码，和
(b) 第二掩蔽亚基，所述第二掩蔽亚基由选自由以下组成的组的第二氨基酸序列编码：
(i) 编码细胞因子受体多肽的氨基酸序列的第二子序列，所述细胞因子受体多肽选自由编码所述第一受体多肽的所述氨基酸序列和编码所述细胞因子的所述受体的第二受体多肽的氨基酸序列组成的组，其中在编码所述第一受体多肽的所述氨基酸序列内，所述第一子序列和所述第二子序列不连续；和
(ii) 编码阻断部分(BM)的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的细胞因子MM，其中所述细胞因子MM包含设置在所述第一掩蔽亚基与所述第二掩蔽亚基之间的接头。
3.如权利要求1-2中任一项所述的细胞因子MM，其中所述第二掩蔽亚基由编码BM的第二氨基酸序列编码。
4.如权利要求3所述的细胞因子MM，其中所述BM包含对所述细胞因子具有结合亲和力的肽。
5.如权利要求3所述的细胞因子MM，其中所述BM包含对所述细胞因子具有结合亲和力的scFv。
6.如权利要求1-2中任一项所述的细胞因子MM，其中所述第二掩蔽亚基由编码受体多肽的氨基酸序列的第二子序列编码，所述受体多肽选自由编码所述第一受体多肽的所述氨基酸序列和编码所述细胞因子的所述受体的第二受体多肽的氨基酸序列组成的组，其中在编码所述第一受体多肽的所述氨基酸序列内，所述第一子序列和所述第二子序列不连续。
7.如权利要求6所述的细胞因子MM，其中所述第一子序列和所述第二子序列相同，或者其中所述第一受体多肽和所述第二受体多肽相同。
8.如权利要求6所述的细胞因子MM，其中所述第一子序列和所述第二子序列不同。
9.如权利要求6和8中任一项所述的细胞因子MM，其中所述第一受体多肽和所述第二受体多肽不同。
10.如权利要求1-9中任一项所述的细胞因子MM，其中所述细胞因子MM可操作地连接至所述细胞因子。
11.一种可活化细胞因子构建体(ACC)，其包含可裂解部分(CM)、细胞因子多肽(CP)和权利要求1-10中任一项所述的细胞因子MM。
12.一种可活化细胞因子构建体(ACC)，其包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)和细胞因子多肽(CP)，其中：
a) 所述MM包含多肽序列，所述多肽序列包含两个或更多个受体子序列的串联序列；
b) 所述受体子序列中的每一个来自所述CP的受体；并且
c) 所述两个或更多个受体子序列：
i) 在所述受体的所述序列中不连续；并且
ii) 彼此直接或间接连接。
13.如权利要求12所述的ACC，其中所述两个或更多个受体子序列中的每一个包含所述受体中的连续氨基酸，所述连续氨基酸在所述受体和所述细胞因子的复合物的共晶结构(细胞因子-受体复合物共晶结构)中的所述细胞因子氨基酸的1.0至8.0埃、2.0至8.0埃或2.0至7.0埃的范围内。
14.如权利要求12所述的ACC，其还包含设置在所述两个或更多个受体子序列中的至少两个之间的接头。
15.如权利要求12-13中任一项所述的ACC，其中所述受体子序列中的每一个包含2、3、4或更多个氨基酸。
16.如权利要求12-14中任一项所述的ACC，其中所述两个或更多个受体子序列中的至少一个包含相对于所述受体的所述序列的至少一个氨基酸的保守取代。
17.如权利要求12-15中任一项所述的ACC，其中所述两个或更多个受体子序列包括第一受体子序列和第二受体子序列，
其中所述第二受体子序列位于所述受体的所述序列中所述第一受体子序列的C末端，
其中所述接头包含X个氨基酸，
其中X = n/2.5，
其中n=所述细胞因子-受体复合物共晶结构中所述第一受体子序列的N末端肽的C末端与所述第二受体子序列的C末端肽的N末端之间的距离，以埃为单位。
18. 如权利要求12-16中任一项所述的ACC，其中所述MM包含氨基酸序列ALTTVX-接头-ASHYFE (SEQ ID NO: 508) (MM)，其中X是D、K或R，其中所述N末端丙氨酸残基任选地不存在或任选地被任何其他氨基酸取代，并且所述接头由1至20个氨基酸组成。
19.如权利要求18所述的ACC，其中所述MM的N末端、C末端或两者延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
20. 一种分离的多肽，其包含多肽序列，所述多肽序列包含两个或更多个受体子序列的串联序列，其中所述受体子序列中的每一个来自细胞因子多肽(CP)的受体；并且所述两个或更多个受体子序列：
i) 在所述受体的所述序列中不连续；并且
ii) 彼此直接或间接连接。
21.如权利要求20所述的分离的多肽，其中所述两个或更多个受体子序列中的每一个包含所述受体中的连续氨基酸，所述连续氨基酸在所述受体和所述细胞因子的复合物的共晶结构(细胞因子-受体复合物共晶结构)中的所述细胞因子氨基酸的1.0至8.0埃、2.0至8.0埃或2.0至7.0埃的范围内。
22.如权利要求20所述的分离的多肽，其还包含设置在所述两个或更多个受体子序列中的至少两个之间的接头。
23.如权利要求20-22中任一项所述的分离的多肽，其中所述受体子序列中的每一个包含2、3、4或更多个氨基酸。
24.如权利要求20-23中任一项所述的分离的多肽，其中所述两个或更多个受体子序列中的至少一个包含相对于所述受体的所述序列的至少一个氨基酸的保守取代。
25.如权利要求21-24中任一项所述的分离的多肽，其中所述两个或更多个受体子序列包括第一受体子序列和第二受体子序列，
其中所述第二受体子序列位于所述受体的所述序列中所述第一受体子序列的C末端，
其中所述接头包含X个氨基酸，
其中X = n/2.5，
其中n=所述细胞因子-受体复合物共晶结构中所述第一受体子序列的N末端肽的C末端与所述第二受体子序列的C末端肽的N末端之间的距离，以埃为单位。
26. 一种分离的多肽，其包含氨基酸序列ALTTVX-接头-ASHYFE (SEQ ID NO: 508)(MM)，其中X是D、K或R，其中所述N末端丙氨酸残基任选地不存在或任选地被任何其他氨基酸取代，并且所述接头由1至20个氨基酸组成。
27.如权利要求26所述的分离的多肽，其中所述分离的多肽的N末端、C末端或两者延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
28.如权利要求12-27中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述X是D。
29.如权利要求12-28中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述X是K。
30.如权利要求12-29中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述X是R。
31.如权利要求12-30中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述接头由4、5、6、7或8个氨基酸组成。
32.如权利要求12-31中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述接头由6个氨基酸组成。
33. 如权利要求12-32中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述接头选自由SEQ IDNO: 2、210-235、245、250和318-335组成的组。
34. 如权利要求12-33中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述接头是GGGGS (SEQID NO: 216)。
35. 如权利要求12-34中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述氨基酸序列包含ALTTVDGGGGSASHYFER (SEQ ID NO: 236)或ALTTVDGGGGSASHYFEK (SEQ ID NO: 237)，或其中所述N末端丙氨酸残基任选地不存在或任选地被任何其他氨基酸取代。
36. 如权利要求12-35中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述氨基酸序列包含ALTTVKGGGGSASHYFER (SEQ ID NO: 238)或ALTTVKGGGGSASHYFEK (SEQ ID NO: 239)，或其中所述N末端丙氨酸残基任选地不存在或任选地被任何其他氨基酸取代。
37. 如权利要求12-36中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述氨基酸序列包含ALTTVRGGGGSASHYFER (SEQ ID NO: 240)或ALTTVRGGGGSASHYFEK (SEQ ID NO: 241)，或其中所述N末端丙氨酸残基任选地不存在或任选地被任何其他氨基酸取代。
38.如权利要求12-37中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述N末端丙氨酸残基被赖氨酸取代。
39. 如权利要求12-37中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述分离的多肽包含选自以下的序列：SQKLTTVDGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 731)、SQKLTTVRGGGGSASHYFERHLE(SEQ ID NO: 734)、SQALTTVRGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 736)或SQALTTVDGGGGSASHYFERHLE (SEQ ID NO: 737)。
40.如任何前述权利要求所述的分离的多肽或ACC，其中所述分离的多肽包括细胞因子。
41.如权利要求12-40中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述分离的多肽设置在包含两种或更多种多肽的复合物中，并且其中所述复合物包含细胞因子。
42.如权利要求12-41中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述细胞因子设置在与所述分离的多肽复合的多肽中。
43.如权利要求12-42中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述氨基酸序列是抑制所述细胞因子与其受体结合的掩蔽部分。
44.如权利要求12-43中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述细胞因子是结合IL2/IL15受体β和/或IL2/IL15受体γ的细胞因子。
45.如权利要求12-44中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述细胞因子结合至IL-15Rα。
46.如权利要求12-45中任一项所述的分离的多肽或ACC，其中所述细胞因子结合至IL-2Rα。
47.一种可活化细胞因子构建体(ACC)，其包含细胞因子多肽(CP)、可裂解部分(CM)和所述分离的多肽，所述分离的多肽包含含有串联序列的多肽序列或任何前述权利要求所述的细胞因子掩蔽部分(MM)，其中所述分离的多肽或所述MM通过所述CM与所述CP偶联并抑制CP与其受体的结合。
48.如权利要求47所述的ACC，其中所述CP是白细胞介素多肽。
49. 如权利要求48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含与SEQ ID NO: 348、129或130至少85%、90%或95%同一的序列。
50. 如权利要求48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 348、129或130。
51. 如权利要求48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含与SEQ ID NO: 119或120至少85%、90%或95%同一的序列。
52. 如权利要求48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 119或120。
53. 如权利要求48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含与SEQ ID NO: 121或122至少85%、90%或95%同一的序列。
54. 如权利要求48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 121或122。
55. 如权利要求48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含与SEQ ID NO: 123或124至少85%、90%或95%同一的序列。
56. 如权利要求48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 123或124。
57. 如权利要求48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含与SEQ ID NO: 125或126至少85%、90%或95%同一的序列。
58. 如权利要求48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 125或126。
59. 如权利要求48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含与SEQ ID NO: 521或522至少85%、90%或95%同一的序列。
60. 如权利要求48所述的ACC，其中所述白细胞介素多肽包含SEQ ID NO: 521或522。
61.如权利要求47-60中任一项所述的ACC，其中所述CM包含不超过8个氨基酸。
62.如权利要求47-61中任一项所述的ACC，其中所述CM能够被尿激酶(uPA)和/或基质金属蛋白酶(MMP)裂解。
63.如权利要求47-62中任一项所述的ACC，其还包含所述CM与所述CP之间的接头(L1)。
64.如权利要求47-63中任一项所述的ACC，其还包含所述CM与所述MM之间的接头(L2)。
65.如权利要求47-64中任一项所述的ACC，其还包含所述CM与所述CP之间的第一接头(L1)以及所述CM与所述MM之间的第二接头(L2)。
66. 如权利要求47-65中任一项所述的ACC，其还包含进一步抑制所述CP与其受体结合的空间掩码。
67.一种ACC，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中
所述第一单体构建体包含第一细胞因子多肽(CP1)、第一可裂解部分(CM1)、通过所述CM1与所述CP1偶联的第一二聚化结构域(DD1)和第一掩蔽部分(MM1)，
所述第二单体构建体包含第二细胞因子多肽(CP2)、第二可裂解部分(CM2)、通过所述CM2与所述CP2偶联的第二二聚化结构域(DD2)和第二掩蔽部分(MM2)，
所述DD1和所述DD2彼此结合，从而形成所述第一单体构建体和所述第二单体构建体的二聚体，并且
所述MM1和/或所述MM2包含任何前述权利要求所述的分离的多肽。
68.如权利要求67所述的ACC，其中所述第一单体构建体包含第三可裂解部分(CM3)，并且所述MM1通过所述CM3与所述CP1偶联。
69.如权利要求67-68中任一项所述的ACC，其中所述MM1通过所述DD1和所述CM1与所述CP1偶联。
70.如权利要求67-69中任一项所述的ACC，其中所述第二单体构建体包含第四可裂解部分(CM4)，并且所述MM2通过所述CM4与所述CP2偶联。
71.如权利要求67-70中任一项所述的ACC，其中所述MM2通过所述DD2和所述CM2与所述CP2偶联。
72. 如权利要求67-71中任一项所述的ACC，所述第一单体构建体和所述第二单体构建体中的每一个包含含有不超过18个氨基酸的连接区。
73. 如权利要求67-72中任一项所述的ACC，其中
所述CP1和所述CM1彼此直接邻接，且/或
所述CM1和所述DD1彼此直接邻接。
74. 如权利要求67-73中任一项所述的ACC，其中
所述CP2和所述CM2彼此直接邻接，且/或
所述CM2和所述DD2彼此直接邻接。
75. 如权利要求67-74中任一项所述的ACC，其中所述CP1包含与SEQ ID NO: 348、129或130至少85%、90%或95%同一的序列。
76. 如权利要求67-75中任一项所述的ACC，其中所述CP2包含与SEQ ID NO: 348、129或130至少85%、90%或95%同一的序列。
77. 如权利要求67-76中任一项所述的ACC，其中所述CP1包含SEQ ID NO: 348、129或130。
78. 如权利要求67-77中任一项所述的ACC，其中所述CP2包含SEQ ID NO: 348、129或130。
79. 如权利要求67-78中任一项所述的ACC，其中所述CP1包含与SEQ ID NO: 119或120至少85%、90%或95%同一的序列。
80. 如权利要求67-79中任一项所述的ACC，其中所述CP2包含与SEQ ID NO: 119或120至少85%、90%或95%同一的序列。
81. 如权利要求67-80中任一项所述的ACC，其中所述CP1包含SEQ ID NO: 119或120。
82. 如权利要求67-81中任一项所述的ACC，其中所述CP2包含SEQ ID NO: 119或120。
83. 如权利要求67-82中任一项所述的ACC，其中所述CP1包含与SEQ ID NO: 121或122至少85%、90%或95%同一的序列。
84. 如权利要求67-83中任一项所述的ACC，其中所述CP2包含与SEQ ID NO: 121或122至少85%、90%或95%同一的序列。
85. 如权利要求67-84中任一项所述的ACC，其中所述CP1包含SEQ ID NO: 121或122。
86. 如权利要求67-85中任一项所述的ACC，其中所述CP2包含SEQ ID NO: 121或122。
87. 如权利要求67-86中任一项所述的ACC，其中所述CP1包含与SEQ ID NO: 123或124至少85%、90%或95%同一的序列。
88. 如权利要求67-87中任一项所述的ACC，其中所述CP2包含与SEQ ID NO: 123或124至少85%、90%或95%同一的序列。
89. 如权利要求67-88中任一项所述的ACC，其中所述CP1包含SEQ ID NO: 123或124。
90. 如权利要求67-89中任一项所述的ACC，其中所述CP2包含SEQ ID NO: 123或124。
91. 如权利要求67-90中任一项所述的ACC，其中所述CP1包含与SEQ ID NO: 125或126至少85%、90%或95%同一的序列。
92. 如权利要求67-91中任一项所述的ACC，其中所述CP2包含与SEQ ID NO: 125或126至少85%、90%或95%同一的序列。
93. 如权利要求67-92中任一项所述的ACC，其中所述CP1包含SEQ ID NO: 125或126。
94. 如权利要求67-93中任一项所述的ACC，其中所述CP2包含SEQ ID NO: 125或126。
95. 如权利要求67-94中任一项所述的ACC，其中所述CP1包含与SEQ ID NO: 521或522至少85%、90%或95%同一的序列。
96. 如权利要求67-95中任一项所述的ACC，其中所述CP2包含与SEQ ID NO: 521或522至少85%、90%或95%同一的序列。
97. 如权利要求67-96中任一项所述的ACC，其中所述CP1包含SEQ ID NO: 521或522。
98. 如权利要求67-97中任一项所述的ACC，其中所述CP2包含SEQ ID NO: 521或522。
99.如权利要求67-98中任一项所述的ACC，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体是相同的。
100.如权利要求67-99中任一项所述的ACC，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体具有95%序列同源性。
101. 如权利要求67-100中任一项所述的ACC，其还包含第三单体，所述第三单体包含含有SEQ ID NO: 520的序列的寿司结构域，其中所述第三单体非共价或共价结合至所述ACC。
102. 如权利要求67-101中任一项所述的ACC，其还包含第四单体，所述第四单体包含含有SEQ ID NO: 520的序列的寿司结构域，其中所述第四单体非共价或共价结合至所述ACC。
103. 如权利要求100或101所述的ACC，其中所述第三单体和/或所述第四单体还包含标签。
104.一种ACC，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中
所述第一单体构建体包含第一细胞因子多肽(CP1)、第一二聚化结构域(DD1)和第一掩蔽部分(MM1)，
所述第二单体构建体包含第二细胞因子多肽(CP2)、第一可裂解部分(CM1)、通过所述CM1与所述CP2偶联的第二二聚化结构域(DD2)和第二掩蔽部分(MM2)，并且
所述MM1和/或所述MM2是任何前述权利要求所述的分离的多肽，
所述DD1和所述DD2彼此结合，从而形成所述第一单体构建体和所述第二单体构建体的二聚体。
105.如权利要求104所述的ACC，其中所述第一单体构建体还包含第二可裂解部分(CM2)，并且所述MM1通过所述CM2与所述CP1偶联。
106.如权利要求104或105所述的ACC，其中所述MM2通过所述DD2和所述CM1与所述CP2偶联。
107. 如权利要求104-106中任一项所述的ACC，其中所述第二单体构建体还包含第三可裂解部分(CM3)，其中所述MM2通过所述CM3与所述CP2偶联。
108.一种ACC，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中
所述第一单体构建体包含第一细胞因子多肽(CP1)、第一二聚化结构域(DD1)和第一掩蔽部分(MM1)，
所述第二单体构建体包含第二细胞因子多肽(CP2)、第二二聚化结构域(DD2)和第二掩蔽部分(MM2)，
所述CP1和/或所述CP2包含用作蛋白酶的底物的氨基酸序列，并且所述DD1和/或所述DD2通过所述氨基酸序列与所述CP1或所述CP2偶联，并且
所述MM1和/或所述MM2是任何前述权利要求所述的分离的多肽，
所述DD1和所述DD2彼此结合，从而形成所述第一单体构建体和所述第二单体构建体的二聚体。
109.如权利要求108所述的ACC，其中所述CP1包含用作蛋白酶的底物的所述氨基酸序列，并且所述MM1通过所述氨基酸序列与所述CP1偶联。
110.如权利要求108-109中任一项所述的ACC，其中所述第一单体构建体还包含第一可裂解部分(CM1)，并且所述MM1通过所述CM1与所述CP1偶联。
111.如权利要求108中任一项所述的ACC，其中所述CP2包含用作蛋白酶的底物的所述氨基酸序列，并且所述MM2通过所述氨基酸序列与所述CP2偶联。
112.如权利要求108-111中任一项所述的ACC，其中所述第二单体构建体还包含第二可裂解部分(CM2)，并且所述MM2通过所述CM2与所述CP2偶联。
113. 如权利要求67-112中任一项所述的ACC，其中所述DD1和所述DD2是一对人IgG Fc结构域。
114. 如权利要求113所述的ACC，其中所述DD1和所述DD2是一对人IgG4 Fc结构域。
115. 如权利要求114所述的ACC，其中所述DD1和所述DD2是在N末端截短至如根据EU编号所编号的半胱氨酸226的一对人IgG1或IgG4 Fc结构域。
116. 如权利要求114所述的ACC，其中所述人IgG4 Fc结构域包含如根据EU编号所编号的S228P突变。
117. 如权利要求67-116中任一项所述的ACC，其中所述DD1和所述DD2中的每一个包含与SEQ ID NO: 3至少95%同一的序列。
118. 如权利要求67-117中任一项所述的ACC，其中所述DD1和所述DD2中的每一个包含SEQ ID NO: 3的序列。
119.如权利要求67-118中任一项所述的ACC，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体通过至少一个、两个、三个或四个二硫键彼此共价结合。
120. 如权利要求12-19和47-119中任一项所述的ACC，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体中的每一个包含与SEQ ID NO: 523至少85%、90%或95%同一的序列。
121. 如权利要求12-19和47-120中任一项所述的ACC，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体中的每一个包含SEQ ID NO: 523。
122.如权利要求12-19和47-121中任一项所述的ACC，其中所述ACC的特征在于与白细胞介素活性的对照水平相比，具有降低的白细胞介素活性的水平。
123.如权利要求12-19和47-122中任一项所述的ACC，其中所述ACC的特征在于与野生型人IL-15相比，具有降低的白细胞介素活性的水平。
124. 如权利要求12-19和47-123中任一项所述的ACC，其中所述ACC的特征在于与重组人IL-15相比具有降低的IL-15活性的水平，如通过IL-2/IL-15反应性HEK293细胞中的SEAP(分泌性胚胎碱性磷酸酶)产生水平所测量的。
125.如权利要求12-19和47-124中任一项所述的ACC，其中所述ACC的特征在于与重组人IL-15的活性相比，具有降低的IL-15活性的水平。
126.如权利要求125所述的ACC，其中所述ACC的特征在于与重组人IL-15相比，其IL-15活性的水平降低至少6000倍。
127.如权利要求12-19和47-126中任一项所述的ACC，其中所述ACC的特征在于，在uPA蛋白酶裂解所述ACC之后，其EC50为重组野生型IL-15的EC50的至少1000倍、5000倍或6000倍，如在IL-2/IL15反应性HEK293细胞中测量的。
128.一种ACC，其包含细胞因子多肽(CP)、所述CP的激动剂、所述分离的多肽和可裂解部分(CM)，所述分离的多肽包含含有串联序列的多肽序列或任何前述权利要求所述的细胞因子掩蔽部分(MM)，其中所述分离的多肽或所述MM通过所述CM与所述CP偶联。
129.如权利要求128所述的ACC，其中所述CP是IL-15，并且所述激动剂是寿司结构域。
130.如权利要求128或权利要求129所述的ACC，其中所述激动剂通过接头与所述CP偶联。
131.如权利要求130所述的ACC，其中所述激动剂通过可裂解接头与所述CP偶联。
132.如权利要求120所述的ACC，其中所述激动剂通过不可裂解的接头与所述CP偶联。
133. 如权利要求128或权利要求129所述的ACC，其中所述激动剂非共价结合至所述CP。
134.一种ACC，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中
所述第一单体构建体包含细胞因子多肽(CP)、第一二聚化结构域(DD1)、第一可裂解部分(CM1)、第二可裂解部分(CM2)和所述分离的多肽，所述分离的多肽包含含有串联序列的多肽序列或任何前述权利要求所述的细胞因子掩蔽部分(MM)，其中所述分离的多肽或所述MM通过所述CM1与所述CP偶联，并且所述DD1通过所述CM2与所述CP偶联，
所述第二单体构建体包含所述CP的激动剂、第三可裂解部分(CM3)、通过所述CM3与所述激动剂偶联的第二二聚化结构域(DD2)，并且
所述DD1和所述DD2彼此结合，从而形成所述第一单体构建体和所述第二单体构建体的二聚体。
135. 如权利要求134所述的ACC，其中所述CP是IL-15，并且所述激动剂是包含SEQ IDNO: 520的序列的寿司结构域。
136.如权利要求134或135所述的ACC，其包含由所述寿司结构域与所述CM3之间的2个氨基酸组成的接头。
137.一种多核苷酸，其编码任何前述权利要求所述的分离的多肽、任何前述权利要求所述的ACC、或任何前述权利要求所述的单体构建体。
138.一种载体，其包含权利要求137所述的多核苷酸。
139.如权利要求138所述的载体，其中所述载体是表达载体。
140.一种宿主细胞，其包含权利要求137所述的多核苷酸或权利要求138或139所述的载体。
141.如权利要求所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
142.一种组合物，其包含任何前述权利要求所述的分离的多肽、或任何前述权利要求所述的ACC、或权利要求137所述的多核苷酸。
143.如权利要求142所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
144.一种容器、小瓶、注射器、注射笔或药盒，其包含至少一剂的权利要求142或143所述的组合物。
145.一种治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的任何前述权利要求所述的分离的多肽、任何前述权利要求所述的ACC、或权利要求142或143所述的组合物。
146.如权利要求145所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。
147.如权利要求146所述的方法，其中所述癌症是白血病、淋巴瘤或实体瘤。
148. 如权利要求147所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有炎症或自身免疫性疾病、病症或疾患。
149. 一种产生ACC的方法，其包括
在液体培养基中培养包含权利要求137所述的多核苷酸的细胞以产生所述ACC；以及
从所述细胞或所述液体培养基回收所述ACC。
150.如权利要求149所述的方法，其还包括分离从所述细胞或所述液体培养基回收的所述ACC。
151.如权利要求149或150所述的方法，其还包括将所述分离的ACC配制成药物组合物。
152.一种复合物，其包含多肽，所述多肽包含与任何前述权利要求所述的分离的多肽复合的细胞因子。
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