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CN120897994A - 具有改进的立体选择性的脂肪酶和基于脂肪酶的手性拆分方法 - Google Patents

具有改进的立体选择性的脂肪酶和基于脂肪酶的手性拆分方法

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CN120897994A
CN120897994A CN202480018818.8A CN202480018818A CN120897994A CN 120897994 A CN120897994 A CN 120897994A CN 202480018818 A CN202480018818 A CN 202480018818A CN 120897994 A CN120897994 A CN 120897994A
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CN
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amino acid
protein
nucleic acid
seq
lipase
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CN202480018818.8A
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A·埃尔南德斯马丁
O·肯斯齐
F·里奇特
C·皮茨勒
W·A·莫拉迪
A·伦比亚克
M·J·福特
A·利什钦斯基
M·斯佩尔伯格
N·祖布雷格尔
F·巴索
F·厄尔沃尔
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Bayer AG
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Bayer AG
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Abstract

本发明涉及具有改进的脂肪酶活性的蛋白质、编码具有改进的脂肪酶活性的相应蛋白质的核酸分子和仲醇的手性拆分方法。

Description

具有改进的立体选择性的脂肪酶和基于脂肪酶的手性拆分 方法
技术领域
本发明涉及具有改进的脂肪酶活性的蛋白质、编码所述蛋白质的核酸分子以及用于次级醇手性拆分的酶的方法。
背景技术
对映体富集的或纯的醇是用于农用化学品的生产或制药化合物的重要化合物。因此，手性醇的立体中心的绝对构型对于相应活性剂的合成至关重要。在所需靶分子的生产中，产生正确的手性通常是一个挑战。
用于制备对映体富集的醇的各种方法是本领域已知的。一方面，可以使用手性过渡金属催化剂，然而，其具有高成本的特征(G.R.Cook，Transition Metal-MediatedKinetic Resolution，Current Organic Chemistry,2000，4，869-885；Hirama etal.J.Org.Chem.1988，53，708)。除了金属催化之外，适用于大体积酯底物的有机催化的酰基转移动力学拆分也有记载(Deng et al.J.Org.Chem.2015，80，6，3159)。使用酶，例如脂肪酶，作为生物催化剂来生产手性化合物也是已知的。Kirchner等人(J.Am.Chem.Soc.(1985)，107，7072-7076)报道了两种脂肪酶，它们在几乎无水的有机溶剂中充当高度立体选择性的实用催化剂。在这种“非天然”条件下，所述酶可以不对称地催化酯化和酯交换反应，这在水溶液中是不可行的，因为水解占主导地位。因此，许多光学活性醇、羧酸和酯已经以克的规模进行制备了。Faber和Riva(1992；Synthesis1992(10)，895-910)和Nascimento等人(2003，Tetrahedron Asymmetry 14，311-311)描述了仲醇通过酯交换的酶促拆分反应。此外，Patil等人(J.Org.Chem.2008，73，4476-4483)和Reddy等人(Synth.Communications，2003，33，3717-3726)示出了酯酶在缓冲水性体系中用于对映选择性酯水解的用途，然而是在DMSO存在下且只有中等产率。
US 4，732,853 A记载了通过用脂肪酶进行对映选择性水解来制备手性环氧醇的方法。
EP 0716712 B1记载了醇与双烯酮的脂肪酶催化的酰化作用，特别是用于由外消旋醇生产对映选择性酰化醇。
WO2012146935A1公开了修饰的脂肪酶变体，以及编码脂肪酶变体多肽的多核苷酸和重组表达载体，以及在选定的细菌和真菌宿主细胞中产生此类脂肪酶变体的方法。所述特定脂肪酶变体具有增加的酶特异性或增强的反式选择性。还记载了它们用于从底物中减少或消除反式脂肪酸的方法。
尽管到目前为止已经实现了脂肪酶的若干改进，但是在仲醇的不对称合成或外消旋醇的拆分过程中出现的若干限制仍须克服，例如不利的平衡、底物和产物抑制、热稳定性差、底物特异性不足和特别是脂肪酶的低对映选择性。此外，目标手性醇的下游加工和分离在大规模应用中具有挑战性，而原子经济性的重要性在工业规模上大大增加。
因此，需要进一步的脂肪酶改进，特别是关于生产具有原子经济性增加的对映体富集的或纯的产物，以及进一步的工艺改进。
发明内容
本发明通过提供了具有优异对映异构体选择性的新型脂肪酶以及提供了用于工业相关结构单元的手性拆分的新型方法，解决了至少部分的上述问题。
本文所述的脂肪酶相比于已知野生型和其他已知脂肪酶具有若干优点。特别地，本文所述的修饰的或变体脂肪酶具有以下优点：它们可以比相应的野生型脂肪酶更好地产生对映体富集的或对映体近乎纯的或纯的化合物。
本发明的第一方面涉及具有脂肪酶活性的蛋白质，其中所述蛋白质由与SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列具有至少80％、优选地85％、更优选地90％、进一步优选地92％、甚至更优选地95％同一性的氨基酸序列编码，
其特征在于，所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于以下位置中的至少一处：
i.第44位的氨基酸不为L，优选地第44位的氨基酸为M、W或Y；
ii.第51位的氨基酸不为L，优选地第51位的氨基酸为N或M；
iii.第52位的氨基酸不为V，优选地第52位的氨基酸为L；
iv.第53位的氨基酸不为T，优选地第53位的氨基酸为S、P、I、E或A；
v.第54位的氨基酸不为D，优选地第54位的氨基酸为Q、M、F、G、E、L、T或P；
vi.第55位的氨基酸不为A，优选地第55位的氨基酸为R、M、D、Y、S或I；
vii.第109位的氨基酸不为G，优选地第109位的氨基酸为H或F；
viii.第110位的氨基酸不为M，优选地第110位的氨基酸为T或V；
ix.第111位的氨基酸不为A，优选地第111位的氨基酸为T或S；x.第117位的氨基酸不为Y，优选地第117位的氨基酸为F或S；
xi.第121位的氨基酸不为Y，优选地第121位的氨基酸为V；xii.第122位的氨基酸不为K，优选地第122位的氨基酸为Q、A、Y、R或V；
xiii.第153位的氨基酸不为H，优选地第153位的氨基酸为N、Y、D、E或C；
xiv.第160位的氨基酸不为T，优选地第160位的氨基酸为E、C、D、P、I、Q、K、M、S、F、A或N；
xv.第179位的氨基酸不为D，优选地第179位的氨基酸为C；xvi.第181位的氨基酸不为A，优选地第181位的氨基酸为Q；xvii.第184位的氨基酸不为A，优选地第184位的氨基酸为G或T；
xviii.第211位的氨基酸不为Y，优选地第211位的氨基酸为E；
xix.第212位的氨基酸不为A，优选地第212位的氨基酸为S或P；
xx.第216位的氨基酸不为Y，优选地第216位的氨基酸为K或A；
xxi.第234位的氨基酸不为S，优选地第234位的氨基酸为K、T或G；
xxii.第235位的氨基酸不为S，优选地第235位的氨基酸为V或M；
xxiii.第236位的氨基酸不为K，优选地第236位的氨基酸为T；
xxiv.第238位的氨基酸不为R，优选地第238位的氨基酸为A、K、D、E或Q；
xxv.第240位的氨基酸不为Y，优选地第240位的氨基酸为F；
xxvi.第289位的氨基酸不为D，优选地第289位的氨基酸为S或G；xxvii.第291位的氨基酸不为G，优选地第291位的氨基酸为E或W；
xxviii.第317位的氨基酸不为N，优选地第317位的氨基酸为T；
xxix.第320位的氨基酸不为N，优选地第320位的氨基酸为E或G；
xxx.第321位的氨基酸不为L，优选地第321位的氨基酸为F。
SEQ ID No.1指的是具有脂肪酶活性的参考蛋白序列。
氨基酸缩写A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y的含义可从下文副标题为“序列描述”的段落下的表2中查得。
第一氨基酸序列(如SEQ ID No.1中的第44位)中的“对应于第x位的氨基酸”在本文中意指，在第二氨基酸序列的氨基酸编号不同于第一氨基酸序列的氨基酸编号的情况下，当与第一氨基酸序列比较时，第二氨基酸序列的氨基酸出现在第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的成对序列比对中第一氨基酸序列的第x位。
在本发明的上下文中，关于序列同一性或序列相同性的术语“同一性(identity)”应理解为意指在整个序列长度上由第一核酸或氨基酸序列与另一(第二)核酸或氨基酸序列共有的相同氨基酸或核苷酸的数目，分别以百分比表示。
“序列同一性(sequence identity)”可以通过使用全局或局部比对算法比对两个氨基酸序列或两个核苷酸序列来确定，所述全局或局部比对算法例如包括在已知软件如GAP或BESTFIT或Emboss的程序“Needle”中。该软件使用Needleman和Wunsch全局比对算法在两个序列的整个长度上进行比对，最大化匹配的数量并最小化空位的数量。通常，(对于核苷酸和蛋白质比对两者均)使用缺省参数，空位产生罚分＝10，空位延伸罚分＝0.5。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是DNAFULL，且对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89，10915-10919)。序列比对和序列同一性的百分比分数可以例如使用软件如EMBOSS来确定，EMBOSS可在EBI的万维网网站(ebi.ac.uk/Tools/emboss/)上访问。或者，可以通过使用通常已知的算法和输出格式如FASTA、BLAST等针对数据库(如，EMBL、GenBank)进行搜索来确定序列相似性或同一性，但优选地应检索匹配序列(hit)并进行成对比对以最终确定序列同一性。
如果要相互比较的序列具有不同的长度，则通过分别测定较短序列与较长序列共有的氨基酸或核苷酸数目的百分比来确定同一性。优选地，使用已知的和可公开获得的计算机程序ClustalW(Thompson et al.，Nucleic Acids Research 22(1994)，4673-4680)确定同一性。 ClustalW是由Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和TobyGibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)，European Molecular Biology Laboratory，Meyerhofstrasse 1，D 69117Heidelberg，Germany公开获得。ClustalW也可以从各种互联网页面下载，特别是从IGBMC(Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire etCellulaire，B.P.163，67404Illkirch Cedex，France；ftp：//ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI(ftp：//ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)以及EBI(European BioinformaticsInstitute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB101SD，UK)的所有镜像互联网页面。
优选地，使用ClustalW计算机程序1.8版或Clustal2来确定在本发明上下文中描述的蛋白质与其他蛋白质之间的同一性。在这种情况下，参数须设置如下：KTUPLE＝1，TOPDIAG＝5，WINDOW＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，MATRIX＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。
优选地，使用ClustalW计算机程序1.8版或Clustal 2来确定例如在本发明上下文中描述的核酸分子的核苷酸序列与其他核酸分子的核苷酸序列之间的同一性。在这种情况下，参数须设置如下：
KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNAMATRIX：IUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，TRANSITIONS：未加权(unweighted)。
此外，“同一性”意指在所述核酸分子或由它们编码的蛋白质之间存在功能和/或结构等同。功能等同是指核酸分子序列或氨基酸序列编码具有脂肪酶活性的蛋白质。与上述分子同源并代表这些分子的衍生物的核酸分子通常是这些分子的变体，其代表具有相同生物学功能或催化相同反应的修饰，即编码具有脂肪酶活性的蛋白质。它们可为天然存在的变体，例如来自其他物种的序列，或突变，其中这些突变可以天然方式发生或通过靶向诱变引入。此外，变体可为合成产生的序列。等位基因变体可为天然存在的变体或合成产生的变体或通过重组DNA技术产生的变体。然而，关于本发明，那些变体编码具有脂肪酶活性的蛋白质并且包含本文所述的关于根据本发明的蛋白质的氨基酸取代(置换)、缺失或插入是决定性的。
一种特殊类型的衍生物为，例如，由于遗传密码的简并性而不同于本发明的上下文中所描述的核酸分子的核酸分子。
根据NC-IUBMB(国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会，NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)，脂肪酶属于水解酶类(EC 3)。水解酶是一类通常用作生化催化剂的酶，其使用水来破坏化学键，这通常导致将较大分子分成较小分子。在非天然、无水条件下，这些酶还可以催化酯化反应，如，乙酰化和酯交换反应。水解酶组包括作用于酯键的酶(EC 3.1)，其包括羧酸酯水解酶(EC 3.1.1)和作为亚家族的脂肪酶(EC 3.1.1.3)。已经从植物、哺乳动物和微生物中鉴定出脂肪酶，包括如假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、不动杆菌属(Acinetobacter)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、色杆菌属(Chromobacterium)、来自茄腐镰孢菌(Fusarium solani，FSC)的角质酶(cutinase)、南极假丝酵母菌A(Candidaantarctica A，CalA)、米根霉(Rhizopus oryzae，ROL)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus，TLL)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei，RML)、黑曲霉(Aspergillus Niger)、异孢镰孢菌(Fusarium heterosporum)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)或黄色镰孢菌(Fusarium culmorum)。
如果蛋白质具有脂肪酶的活性，这可以被本领域已知和记载的方法检测到。
用于检测根据本发明的蛋白质是否具有脂肪酶活性的方法不是决定性的。优选地，与本发明有关，所述方法在“实施例”部分中进行描述。
在本发明的一个进一步的实施方案中，所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于以下修饰中的至少一个：
i.第44位的氨基酸为W或Y；
ii.第54位的氨基酸为F；
iii.第55位的氨基酸为R；
iv.第109位的氨基酸为H；
v.第110位的氨基酸为T或V；
vi.第117位的氨基酸为F；
vii.第122位的氨基酸为Q或R；
viii.第160位的氨基酸为E；
ix.第216位的氨基酸为K；
x.第236位的氨基酸为T；
xi.第238位的氨基酸为K或E；
xii.第240位的氨基酸为F。
优选地，所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处至少在于具有突变G109H，即第109位的氨基酸为H。
相比于上文所描述的对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的氨基酸序列，根据本发明的脂肪酶变体蛋白可表现出其他氨基酸修饰(氨基酸取代、缺失或插入)。
在本发明的一个进一步的实施方案中，所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于选自以下修饰中的至少两个，进一步优选地至少三个，甚至进一步优选地至少四个，特别优选地至少五个：
i.第57位的氨基酸不为N，优选地所述氨基酸为P；
ii.第109位的氨基酸不为G，优选地所述氨基酸为H；
iii.第122位的氨基酸不为K，优选地所述氨基酸为R；
iv.第212位的氨基酸不为A，优选地所述氨基酸为P；
v.第234位的氨基酸不为S，优选地所述氨基酸为K；
vi.第289位的氨基酸不为D，优选地所述氨基酸为G。
优选地，所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于以下修饰：
i.第57位的氨基酸是P；
ii.第109位的氨基酸为H；
iii.第212位的氨基酸是P；
iv.第234位的氨基酸为K；和
v.第289位的氨基酸为G。
进一步优选地，所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于以下修饰：
i.第57位的氨基酸是P；
ii.第109位的氨基酸为H；
iii.第122位的氨基酸为R；
iv.第212位的氨基酸是P；
v.第234位的氨基酸为K；和
vi.第289位的氨基酸为G。
在本发明的一个进一步的实施方案中，所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于以下修饰：
-第57位的氨基酸为P；第109位的氨基酸为H；第122位的氨基酸为R或K或Q，优选R；第212位的氨基酸为P；第234位的氨基酸为K；第289位的氨基酸为G；
-和额外地至少一个以下修饰：第44位的氨基酸为W或Y；第54位的氨基酸为F，第55位的氨基酸为R，第110位的氨基酸为V或T；第111位的氨基酸为T，第117位的氨基酸为F，第160位的氨基酸为E，第216位的氨基酸为K，第236位的氨基酸为T，第238位的氨基酸为K或E，第240位的氨基酸为F。
本发明的优选实施方案是编码具有SEQ ID No.7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227，229，231、233、235、237、239所示氨基酸序列的脂肪酶的根据本发明的蛋白质。
本发明的一个进一步的实施方案涉及编码根据本发明的蛋白质的核酸分子。
根据本发明的核酸分子可以为任何种类的核酸，只要该核酸编码根据本发明的蛋白质。所述核酸可以为核糖核酸分子(如RNA、mRNA)或脱氧核糖核酸分子(DNA，包括基因组DNA，其可包含或可不包含内含子和编码DNA)。
本发明特别感兴趣的是编码具有脂肪酶活性的蛋白质的核酸分子，其包含SEQ IDNo.8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240所示的氨基酸序列。
因此，本发明还涉及编码具有脂肪酶活性的蛋白质的核酸分子，其选自
a)核酸分子，其包含SEQ ID No.8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240所示的核酸序列；
b)与a)中所示的核酸序列具有至少60％、优选地70％、更优选地80％、进一步优选地90％、甚至更优选地95％、甚至进一步优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或尤其优选地99％的同一性的核酸分子。
在本发明的上下文中，术语“与……杂交(hybridizingwith)”是指在常规杂交条件下，优选地在严格条件下进行杂交，如，例如Sambrook等人(Molecular Cloning，ALaboratory Manual，3rd edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor,NY.ISBN：0879695773)或Ausubel等人(Short Protocols inMolecularBiology，John Wiley&Sons；5th edition(2002)，ISBN：0471250929)中所记载的。特别优选地，“杂交(hybridization)”意指在以下条件下的杂交：
杂交缓冲液：
2xSSC；10xDenhardt溶液(Fikoll 400+PEG+BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mMEDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml鲱鱼精子DNA；50μg/mL的tRNA；
或
25M磷酸钠缓冲液，pH 7.2；ImM EDTA；7％SDS
杂交温度：T＝65-68℃
洗涤缓冲液：0.1xSSC；0.1％SDS
洗涤温度：T＝65-68℃。
与编码具有脂肪酶活性的蛋白质的核酸分子杂交的核酸分子可源于任何生物体；因此，它们可源于细菌、真菌、动物、人、植物或病毒。
与编码具有脂肪酶活性的蛋白质的核酸分子杂交的核酸分子优选地源于微生物，更优选地源于真菌或细菌，最优选地源于细菌。
与所述分子杂交的核酸分子可从例如，基因组文库或eDNA文库中分离。这些核酸分子可以使用本文所述的核酸分子来鉴定和分离，或它们可以使用这些分子的部分或这些分子的反向互补序列来鉴定和分离，例如通过根据标准方法杂交(参见，例如，Sambrook etal.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd edition(2001)Cold Spring HarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,NY.ISBN：0879695773；Ausubeletal.，ShortProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons；5thedition(2002)，ISBN：0471250929)或通过使用PCR扩增。
用作杂交样品的片段也可为使用常规合成技术制备的合成片段或寡核苷酸，其序列与本发明上下文中描述的核酸分子本质相同。当与本发明上下文中描述的核酸序列杂交的基因被鉴定并分离后，所述序列应被鉴定并分析由该序列编码的蛋白质的性质，以鉴定它们是否为具有脂肪酶活性的蛋白质。如何鉴定蛋白质是否具有脂肪酶活性的方法是本领域技术人员已知的。
与本发明上下文中所描述的核酸分子杂交的分子特别包括所述核酸分子的片段、衍生物和等位基因变体。在本发明的上下文中，术语“衍生物(derivative)”意指这些分子的序列在一个或多个位置上不同于上述核酸分子的序列，且与这些序列具有高度同一性。与上文所述核酸分子的差异可为，例如，由于缺失、添加、取代、插入或重组。
核苷酸缩写a、c、g、t和简并核苷酸r、y、s、w、k、m、b、d、h、v、n的缩写的含义可从下文副标题为“序列描述”的段落下的表1中查得。何种氨基酸由包含简并核苷酸的密码子编码可从下文副标题为“序列描述”的段落下的表3中查得。
此外，本发明涉及包含根据本发明的核酸分子的重组核酸分子。
结合本发明，术语“重组核酸分子(recombinantnucleic acid molecule)”应理解为意指除了根据本发明的核酸分子之外还含有额外的序列的核酸分子，所述序列不以它们在根据本发明的重组核酸中出现的组合中天然存在。在本文中，上述额外的序列可以为任何序列，优选地它们是功能或调节序列(启动子，终止信号，增强子，核糖体结合位点(rbs)，增强转录、翻译或RNA稳定性的前导序列，亚细胞靶向序列等)，特别优选地它们是在微生物中有活性的功能或调节序列，且尤其特别优选地它们是在真菌、特别是酵母或在细菌中有活性的调节序列。用于产生根据本发明的重组核酸分子的方法是本领域技术人员已知的，且包括遗传方法，例如通过核酸分子的连接、遗传重组或新合成来结合核酸分子。这些方法记载于如Sambrok等人(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd edition(2001)Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour,NY.ISBN：0879695773)或Ausubel等人(Short Protocolsin Molecular Biology,JohnWiley&Sons；5thedition(2002)，ISBN：0471250929)中。
在一个进一步的实施方案中，根据本发明的重组核酸分子包含与调控序列连接的根据本发明的核酸分子，所述调控序列在原核细胞或真核细胞中启动转录。
细胞中的“启动转录的调节序列”也称为启动子。
关于调控序列和质粒的信息是本领域技术人员熟知的，且记载于如在万维网(http：//parts.igem.org/Catalog)中由国际基因工程机器(The InternationalGeneticallyEngineeredMachine，iGEM)基金会支持的标准生物部件注册表(RegistryofStandardBiologicalParts)(OneKendall Square，SuiteB6104，Cambridge，MA02139，USA)。
在文献中充分记载了在原核生物(如大肠杆菌(E.coli))和真核生物中启动转录的调控序列，特别是记载了用于在酵母(如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))中表达的那些。用于在各种宿主生物中表达蛋白质的各种系统的概述可以发现于例如Methods inEnzymology153(1987)，383-516和Bitter等人(Methods in Enzymology153(1987)，516-544)或Gomes等人(2016,Advances in Animal and Veterinary Sciences,4(4)，346)和Baghban等人(2018,Current PharmaceuticalBiotechnology,19(6))中。常见的酵母启动子为pAOX1、pHIS4、pGAL、pScADH2(Baghban et al.，2018，参见上文)。常见的细菌启动子为T5、T7、鼠李糖诱导型、阿拉伯糖诱导型、PhoA、人工trc(trp-lac)启动子，如由Marschall等人(2017，Appl Microbiol Biotechnol 101，501-512)和Tegel等人(2011，FEBS Journal278，729-739)所描述的。
本发明的重组核酸分子的一个进一步的实施方案是包含根据本发明的核酸分子的载体或质粒。
“载体(Vectors)”在分子生物学领域中通常被理解为代表一种核酸序列或一种包含用于将遗传物质(DNA或RNA)转移到靶细胞中的核酸序列的媒介物。载体可以为质粒，如用于产生转基因植物的T-DNA或二元载体、用于在宿主细胞中表达核酸序列的表达载体、适合在不同宿主中繁殖的穿梭载体，或者载体可以为已被修饰以将外源遗传物质递送到宿主中的病毒颗粒或噬菌体。
“质粒”在分子生物学领域和本文中通常被理解为代表一种自主进行自我复制的、通常是环状的DNA分子，其当存在于宿主细胞中时与染色体DNA分离。
根据本发明的核酸分子、根据本发明的重组核酸分子、根据本发明的载体或质粒可用于产生根据本发明的蛋白质，例如通过在宿主细胞中表达根据本发明的核酸分子。
本发明的另一个实施方案涉及包含或表达根据本发明的核酸分子，或包含根据本发明的蛋白质，或包含根据本发明的重组核酸分子，或包含根据本发明的载体，或包含根据本发明的质粒的宿主或宿主细胞。
编码具有脂肪酶活性的蛋白质的根据本发明的核酸分子可以在宿主细胞中表达，如用于它们的增殖或用于产生根据本发明的蛋白质。为了在宿主细胞中表达，根据本发明的核酸分子可以包含在载体或质粒上，或者它们可以稳定地整合到相应宿主细胞的基因组中。根据本发明的核酸分子也可以包含在支持将其引入宿主细胞的载体中。
本发明的一个进一步的实施方案涉及根据本发明的宿主或宿主细胞，其包含根据本发明的核酸分子或包含根据本发明的重组核酸分子或包含根据本发明的载体或包含根据本发明的质粒，且在每种情况下包含根据本发明的蛋白质。
本发明的另一个实施方案涉及根据本发明的宿主或宿主细胞，其包含根据本发明的核酸分子或包含根据本发明的重组核酸分子或包含根据本发明的载体或包含根据本发明的质粒，且在每种情况下表达根据本发明的蛋白质。
本发明的另一个实施方案涉及根据本发明的宿主或宿主细胞，其包含根据本发明的核酸分子或包含根据本发明的重组核酸分子或包含根据本发明的载体或包含根据本发明的质粒，且在每种情况下表达蛋白质，其中所述蛋白质具有脂肪酶的活性。
“表达核酸分子”在本文中应理解为意指在核酸分子是RNA或mRNA的情况下，核酸分子被翻译成蛋白质，优选地翻译成具有脂肪酶活性的蛋白质，或者在核酸分子是DNA或cDNA的情况下，其被转录(且在含有内含子的基因组DNA的情况下被加工)为mRNA，优选地为编码具有脂肪酶活性的蛋白质的mRNA，且随后被翻译成蛋白质，优选地翻译成具有脂肪酶活性的蛋白质。
宿主中给定核酸分子的转录可以通过本领域技术人员已知的方法来证实，例如通过Northern印迹杂交分析(Northern blot analysis)或RT-PCR检测外源核酸分子的特异性转录物(mRNA)。
宿主或宿主细胞是否包含给定的蛋白质或包含衍生自表达核酸分子的蛋白质可以通过本领域技术人员已知的方法测定，例如通过免疫学方法，例如蛋白质印迹分析(Western blot analysis)、ELISA(酶联免疫吸附测定，Enzyme LinkedImmuno SorbentAssay)或RIA(放射免疫分析，Radio Immune Assay)。本领域技术人员熟悉制备与特定蛋白质特异性反应，即与特定蛋白质特异性结合的抗体的方法(参见，例如，Lottspeich andZorbas(eds.)，1998，Bioanalytik，Spektrum akad，Verlag，Heidelberg，Berlin，ISBN 3-8274-0041-4)。一些公司((Thermo Fisher Scientific，168 Third Avenue，Waltham，MAUSA 0245；GenScript，60 Centennial Ave.，Piscataway,NJ 08854，USA)提供这种抗体的制备作为订单服务。
此外，本领域技术人员可以通过检测相应宿主细胞中具有脂肪酶活性的蛋白质的(额外的)活性来测试宿主或宿主细胞是否包含根据本发明的蛋白质。优选地，通过比较根据本发明的宿主细胞的脂肪酶活性与不包含根据本发明的蛋白质的宿主细胞的相应活性，来检测在相应宿主细胞中具有脂肪酶额外活性的蛋白质的活性。
测试蛋白质是否具有脂肪酶的活性可以通过本领域已知的方法进行。
根据本发明的宿主或宿主细胞可以由本领域技术人员通过用于遗传修饰或转化生物体的已知方法产生。
因此，本发明的一个进一步的主题为根据本发明的宿主或宿主细胞，特别是原核或真核宿主或宿主细胞，其使用根据本发明的核酸分子或使用根据本发明的重组核酸分子或根据本发明的载体或根据本发明的质粒进行遗传修饰(或转化)。优选地，根据本发明的经遗传修饰(转化)的宿主或宿主细胞表达具有脂肪酶活性的蛋白质，更优选地，根据本发明的经遗传修饰(转化)的宿主或宿主细胞表达根据本发明的蛋白质。
“用核酸分子遗传修饰的”或“用核酸分子转化的”在本文中应理解为意指通过技术和/或非天然存在的手段，优选地通过分子生物学、生物技术或遗传修饰领域中的技术方法，将核酸分子引入或已经引入至宿主或宿主细胞中。
根据本发明的宿主或宿主细胞的后裔(Descendants)、子代(offspring)或后代(progeny)也是本发明的一个实施方案，优选这些后裔、子代或后代包含根据本发明的核酸分子或包含根据本发明的重组核酸分子或包含根据本发明的载体或包含根据本发明的质粒或包含根据本发明的蛋白质，更优选这些后裔、子代或后代包含根据本发明的核酸分子或包含根据本发明的重组核酸分子或包含根据本发明的载体或包含根据本发明的质粒，且在每种情况下表达蛋白质，其中所述蛋白质具有脂肪酶的活性，甚至更优选这些后裔、子代或后代包含根据本发明的核酸分子或包含根据本发明的重组核酸分子或包含根据本发明的载体或包含根据本发明的质粒，且在每种情况下表达蛋白质，其中所述蛋白质具有根据本发明的脂肪酶的活性。
根据本发明的宿主或宿主细胞可以是源自任何原核或真核生物的宿主或宿主细胞。宿主或宿主细胞可以为细菌或细菌细胞(如大肠杆菌(E coli)；芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌，特别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；农杆菌属(Agrobacterium)，特别是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)；假单胞菌属(Pseudomonas)，特别是荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；链霉菌属(Streptomyces spp)；红球菌属(Rhodococcus spp)，特别是紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)，需钠弧菌(Vibrio natrigens)；棒状杆菌属(Corynebacterium)，特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum))，或真菌或真菌细胞(如蘑菇(Agaricus)，特别是双孢蘑菇(Agaricus bisporus)；曲霉属(Aspergillus)；木霉(Trichoderma)；或酵母(yeasts)，特别是酿酒酵母(S.cerevisiae)；毕赤酵母属(Pichia ssp.)，如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))，以及植物或植物细胞，或者它们可以是动物或动物细胞。
根据本发明优选的宿主细胞是微生物的细胞。在本专利申请的范围内，这应理解为包括例如Schlegel“General Microbiology”(Georg Thieme Publishing House(1985)，1-2)中定义的所有细菌和所有原生生物(例如真菌，特别是酵母和藻类)。
关于微生物，根据本发明的宿主或宿主细胞优选地是细菌/细菌细胞或酵母/酵母细胞，最优选地它们是细菌/细菌细胞。关于细菌/细菌细胞，根据本发明的宿主或宿主细胞优选地是芽孢杆菌属物种/芽孢杆菌属物种细胞或大肠杆菌/大肠杆菌细胞，最优选地大肠杆菌/大肠杆菌细胞。
或者，假单胞菌属，特别是荧光假单胞菌；链霉菌属；红球菌属，特别是紫红红球菌；弧菌属，特别是需钠弧菌；棒状杆菌属，特别是谷氨酸棒状杆菌等可以是根据本发明的宿主或宿主细胞。
本发明的一个优选实施方案涉及包含根据本发明的核酸分子的根据本发明的宿主或宿主细胞，其中根据本发明的核酸分子的特征在于所述核酸分子的密码子被改变，使得它们分别适应于宿主或宿主细胞的密码子的使用频率。
根据本发明的宿主细胞可用于产生根据本发明的蛋白质。根据本发明的蛋白质可用于生产对映体富集的或几乎对映体纯的仲醇的方法中。
本发明的第二方面涉及以对映体选择性方式水解式(II)的外消旋底物以分离对映体富集的或纯的式(I)化合物的方法，该方法包括使底物与具有根据本发明第一方面的脂肪酶活性的变体蛋白或与根据SEQ ID No.1的脂肪酶接触，
其中R1和R2彼此独立地选自取代或未取代的(n)-烷基、异烷基、未取代的芳基、烷基取代的或芳基取代的芳基。
优选地，所述底物与根据本发明第一方面的具有脂肪酶活性的变体蛋白接触。
R1和R2优选地彼此独立选择为直链或支链的C1-10残基。
进一步优选地，R1选自甲基、异丁基、叔丁基和异丙基；和/或R2为甲基。
甚至进一步优选地，R1选自甲基、异丁基、叔丁基和异丙基；和R2为甲基。
在本发明的另一个实施方案中，该方法包括以对映体选择性方式水解式(II-1)的外消旋底物以分离对映体富集的或纯的式(I-1)的化合物，
该方法优选地包括在水解后分离化合物(I)或(I-1)和/或(III)或(III-1)。化合物(I-1)的分离可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行，并且优选地通过萃取和/或直接蒸馏进行。
根据本发明的脂肪酶变体或蛋白质变体在立体选择性水解3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯(式II-1)方面显示出改进的选择性和/或改进的比活性，且与野生型脂肪酶相比更适于分离对映体富集的或几乎纯的底物(3S)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯(式I-1)。
式(I)化合物
代表了复杂农用化学化合物合成中的重要结构单元。特别地，式(I-1)的(3S)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯
其是外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯的S-对映异构体，是WO 2018/228985中记载的农用化学化合物的相应合成中的重要中间体。根据本发明的脂肪酶变体选择性水解外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯的R-对映异构体，允许分离所述外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯的S-对映异构体。
在本发明的一个进一步的实施方案中，所述方法在水溶液中进行。
优选地，所述方法在水和有机溶剂例如甲基叔丁基醚、甲苯、2-甲基四氢呋喃、甲基异丁基酮、环已烷、环戊基甲基醚、氯苯、叔戊基甲基醚、乙酸乙酯、乙酸异丙酯的混合物或双相液体体系中进行。甚至进一步优选地，所述有机溶剂为甲基叔丁基醚(MTBE)。
有机溶剂与水的比例进一步优选地为1：1至6：1，甚至更优选地为2：1至4：1。
出人意料的是，发现部分被有机溶剂取代的水相的显著减少不仅使得最终产物的浓度更高，从而增加生产率，而且使得酶/脂肪酶负载减少。
此外，有机溶剂，例如MTBE的存在促进了反应产物的有效下游加工，即式(I)或(I-1)化合物的分离。
在本发明的一个进一步的实施方案中，所述方法在20℃至60℃、优选地30℃至55℃之间的温度下进行。进一步优选地，所述方法在35℃至50℃之间的温度下进行。
在本发明的一个进一步的实施方案中，所述方法进行至少1小时，优选地至少2小时，进一步优选地至少3小时。
在本发明的一个进一步的实施方案中，所述方法进行至多40h，优选地至多30h，进一步优选地至多20h。
在本发明的一个进一步的实施方案中，该方法在pH为7-8.5，优选地7.2-8.0，进一步优选地7.4-7.6下进行。所述pH可以通过添加有机或无机碱来调节，优选地通过添加无机碱，例如碳酸氢盐或碳酸盐、磷酸氢盐和氢氧化物。
在pH高于8.5时，酶失活；进一步的，存在式(I)的酯的部分水解。在pH 7以下，反应速率降低，且最终反应停止。进一步地，在4.5或更低的pH下，所述酶失活。
所述pH可以通过添加碱如NaOH、KOH、K2CO3、KHCO3、Na2CO3、NaHCO3来控制。优选的碱是碳酸盐或碳酸氢盐。所述碱可以作为固体或水溶液(稀释或饱和的)加入。所述碱可以在底物定量添加之前加入到反应中，或者所述碱与底物平行地定量添加至反应中。所述底物和/或碱可以定量添加或一次性添加。
根据本发明第一方面的SEQ ID No.1的脂肪酶或蛋白质变体可以作为纯化的酶或以喷雾干燥或冷冻干燥的生物质的形式或作为肉汤提供。优选地，所述蛋白质变体作为肉汤(即作为细胞培养物)提供，或将肉汤离心并将细胞沉淀冷冻干燥以获得冻干的细胞或生物质。
虽然冻干生物质在进行所要求保护的方法的独立定时(independent timing)方面易于处理，但直接使用肉汤/细胞培养物来进行所要求保护的方法是节省成本和时间的。
对于下游的加工，所述反应优选在水和与水不混溶的溶剂的混合物中进行。在包含水和不混溶的有机溶剂的双相混合物中进行反应的情况下，分离各相并最终反萃取水相。可以在蒸馏之前通过已知的技术手段(如离心、过滤或倾析)分离生物质，或者可以在不分离生物质的情况下进行蒸馏。
在本发明的上下文中应当理解，涉及根据第二方面的方法的所有实施方案可以与根据本发明第一方面的所有不同脂肪酶变体组合，且特别是与优选的脂肪酶变体组合。即，以对映体选择性方式对式(II)的外消旋底物进行水解以分离对映体富集的或纯的式(I)的化合物的方法可以借助于具有脂肪酶活性的蛋白质进行，其中所述蛋白质由具有SEQ IDNo.1所示氨基酸序列至少80％、优选地85％、更优选地90％、进一步优选地92％、甚至更优选地95％的氨基酸序列编码，
其特征在于，所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于以下位置中的至少一处：
i.第44位的氨基酸不为L，优选地第44位的氨基酸为M、W或Y；
ii.第51位的氨基酸不为L，优选地第51位的氨基酸为N或M；
iii.第52位的氨基酸不为V，优选地第52位的氨基酸为L；
iv.第53位的氨基酸不为T，优选地第53位的氨基酸为S、P、I、E或A；
v.第54位的氨基酸不为D，优选地第54位的氨基酸为Q、M、F、G、E、L、T或P；
vi.第55位的氨基酸不为A，优选地第55位的氨基酸为R、M、D、Y、S或I；
vii.第109位的氨基酸不为G，优选地第109位的氨基酸为H或F；
viii.第110位的氨基酸不为M，优选地第110位的氨基酸为T或V；
ix.第111位的氨基酸不为A，优选地第111位的氨基酸为T或S；
x.第117位的氨基酸不为Y，优选地第117位的氨基酸为F或S；
xi.第121位的氨基酸不为Y，优选地第121位的氨基酸为V；
xii.第122位的氨基酸不为K，优选地第122位的氨基酸为Q、A、Y、R或V；
xiii.第153位的氨基酸不为H，优选地第153位的氨基酸为N、Y、D、E或C；
xiv.第160位的氨基酸不为T，优选地第160位的氨基酸为E、C、D、P、I、Q、K、M、S、F、A或N；
xv.第179位的氨基酸不为D，优选地第179位的氨基酸为C；
xvi.第181位的氨基酸不为A，优选地第181位的氨基酸为Q；xvii.第184位的氨基酸不为A，优选地第184位的氨基酸为G或T；
xviii.第211位的氨基酸不为Y，优选地第211位的氨基酸为E；
xix.第212位的氨基酸不为A，优选地第212位的氨基酸为S或P；
xx.第216位的氨基酸不为Y，优选地第216位的氨基酸为K或A；
xxi.第234位的氨基酸不为S，优选地第234位的氨基酸为K、T或G；
xxii.第235位的氨基酸不为S，优选地第235位的氨基酸为V或M；
xxiii.第236位的氨基酸不为K，优选地第236位的氨基酸为T；xxiv.第238位的氨基酸不为R，优选地第238位的氨基酸为A、K、D、E或Q；
xxv.第240位的氨基酸不为Y，优选地第240位的氨基酸为F；
xxvi.第289位的氨基酸不为D，优选地第289位的氨基酸为S或G；xxvii.第291位的氨基酸不为G，优选地第291位的氨基酸为E或W；
xxviii.第317位的氨基酸不为N，优选地第317位的氨基酸为T；
xxix.第320位的氨基酸不为N，优选地第320位的氨基酸为E或G；
xxx.第321位的氨基酸不为L，优选地第321位的氨基酸为F。
用于以对映体选择性方式对式(II)的外消旋底物进行水解以分离对映体富集的或纯的式(I)化合物的方法中的变体蛋白脂肪酶的氨基酸序列可通过以下修饰中的至少一种区别于SEQ ID NO.1的氨基酸序列：
i.第44位的氨基酸为W或Y；
ii.第54位的氨基酸为F；
iii.第55位的氨基酸为R；
iv.第109位的氨基酸为H；
v.第110位的氨基酸为T或V；
vi.第117位的氨基酸为F；
vii.第122位的氨基酸为Q或R；
viii.第160位的氨基酸为E；
ix.第216位的氨基酸为K；
x.第236位的氨基酸为T；
xi.第238位的氨基酸为K或E；
xii.第240位的氨基酸为F。
优选地，用于以对映体选择性方式对式(II)的外消旋底物进行水解以分离对映体富集的或纯的式(I)的化合物的方法中的变体蛋白脂肪酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于至少具有突变G109H，即第109位的氨基酸为H。
用于以对映体选择性方式对式(II)的外消旋底物进行水解以分离对映体富集的或纯的式(I)的化合物的方法中的变体蛋白脂肪酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处可以在于至少两个，进一步优选地至少三个，甚至进一步优选地至少四个，特别优选地至少五个选自以下的修饰：
i.第57位的氨基酸不为N，优选地所述氨基酸为P；
ii.第109位的氨基酸不为G，优选地所述氨基酸为H；
iii.第122位的氨基酸不为K，优选地所述氨基酸为R；
iv.第212位的氨基酸不为A，优选地所述氨基酸为P；
v.第234位的氨基酸不为S，优选地所述氨基酸为K；
vi.第289位的氨基酸不为D，优选地所述氨基酸为G。
优选地，所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于以下修饰：
i.第57位的氨基酸是P；
ii.第109位的氨基酸为H；
iii.第212位的氨基酸是P；
iv.第234位的氨基酸为K；和
v.第289位的氨基酸为G。
进一步优选地，所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于以下修饰：
i.第57位的氨基酸是P；
ii.第109位的氨基酸为H；
iii.第122位的氨基酸为R；
iv.第212位的氨基酸是P；
v.第234位的氨基酸为K；和
vi.第289位的氨基酸为G。
用于以对映体选择性方式对式(II)的外消旋底物进行水解以分离对映体富集的或纯的式(I)化合物的方法中的变体蛋白脂肪酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处可在于以下修饰：
-第57位的氨基酸为P；第109位的氨基酸为H；第122位的氨基酸为R或K或Q，优选R；第212位的氨基酸为P；第234位的氨基酸为K；第289位的氨基酸为G；
-和额外地至少一个以下修饰：第44位的氨基酸为W或Y；第54位的氨基酸为F，第55位的氨基酸为R，第110位的氨基酸为V或T；第111位的氨基酸为T，第117位的氨基酸为F，第160位的氨基酸为E，第216位的氨基酸为K，第236位的氨基酸为T，第238位的氨基酸为K或E，第240位的氨基酸为F。
编码可用于以对映体选择性方式对式(II)的外消旋底物进行水解以分离对映体富集的或纯的式(I)化合物的方法中的脂肪酶的根据本发明优选的蛋白质以SEQ ID No.7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239所示。
本发明的一个进一步的实施方案是根据本发明第一方面的蛋白质用于外消旋的3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯的立体选择性水解以分离(3S)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯的用途。
“对映异构体富集的(Enantiomerically enriched)”在本文中是指两种对映异构体中的一种以高于另一种对映异构体的量存在于所述组合物中，优选地至少60％的一种对映异构体存在于所述组合物中，更优选地至少65％的一种对映异构体存在于所述组合物中，甚至更优选地至少70％的一种对映异构体存在于所述组合物中，甚至更优选地至少75％的一种对映异构体存在于所述组合物中，甚至更优选地至少80％的一种对映异构体存在于所述组合物中，特别优选地至少85％的一种对映异构体存在于所述组合物中，最优选地至少90％的一种对映异构体存在于所述组合物中，或者尤其优选地至少94％的一种对映异构体存在于所述组合物中。
“对映异构体上几乎纯的(Enantiomerically nearly pure)”在本文中是指两种对映异构体中的一种以至少95.0％的量存在于所述组合物中，优选地两种对映异构体中的一种以至少95.5％的量存在于组合物中，更优选地两种对映异构体中的一种以至少96.0％的量存在于组合物中，甚至更优选地两种对映异构体中的一种以至少97.0％的量存在于组合物中，甚至更优选地两种对映异构体中的一种以至少98.0％的量存在于组合物中，特别优选地两种对映异构体中的一种以至少98.5％的量存在于组合物中，最优选地两种对映异构体中的一种以至少99.0％的量存在于组合物中，或尤其优选地两种对映异构体中的一种以至少99.5％的量存在于组合物中。
本发明的第三方面涉及式(I)化合物的对映体富集的方法
其包括在脂肪酶存在下，在无水条件下使式(II)化合物与式(IV)化合物反应
且特别的
其中R1和R2如上文所定义的，且R3为取代或未取代的(n)-烷基或异烷基。
“无水条件(anhydrous condition)”是指在液相中包含至多3％水的反应体系。
所述反应优选地在有机溶剂，例如己烷或正庚烷中进行，或在没有任何其他溶剂的情况下进行。
R3可以优选地为直链C1-16残基，特别是甲基或未取代且饱和的C8-C12残基。化合物(IV)特别地可以是乙酸乙烯酯或月桂酸乙烯酯。
脂肪酶优选地在作用期间固定在固体载体上。固定化导致酶在非水溶液中的稳定性增加。
反应优选地在20-40℃的温度下进行，优选地在25-35℃。这样的温度范围允许最佳的酶促反应性。
反应优选地进行至少1h，进一步优选地至少3h，甚至进一步优选地至少5h。
脂肪酶优选在反应发生后再循环。这使得以节省成本的方式设计该方法。因此，脂肪酶可以多次用于根据第三方面的反应或额外的反应。
式(I)的化合物优选地通过蒸馏直接从反应混合物或从倾倒反应混合物后获得的上清液中分离。脂肪酶优选地保留在剩余的反应混合物中，且可以重复用于另一反应。
脂肪酶优选地为CALB脂肪酶。CALB为源自南极假丝酵母B(Candida antarcticaB)的非特异性脂肪酶，在1994年首次被记载(Uppenberg J，Patkar S，Bergfors T，JonesTA(1994)J Mol Biol 235(2)：790-792)。
此外，脂肪酶优选地固定在疏水性载体，例如丙烯酸树脂上。CALB的商购版本为，例如，435，其可用于进行所述反应。
具体实施方式
根据本发明的多肽(酶，即脂肪酶)以及方法允许式(I)化合物的有效对映体富集
发现将某些氨基酸修饰引入根据本发明的蛋白质变体中提高了脂肪酶的活性，特别是在其底物特异性方面，这意味着与已知的脂肪酶变体相比，这些进一步修饰的脂肪酶变体更适合于产生对映体富集的或几乎纯的产物。这特别是指底物(I-1)。对映体纯的或至少富集的(3S)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯
其为外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯的S-对映异构体，是Wo2018/228985中记载的化合物的相应合成中的重要中间体。本发明的脂肪酶变体选择性地催化外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯水解成(3R)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸，留下未水解的(3S)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯。
本文所使用的术语是本领域技术人员已知的。否则，使用以下定义：
对于本发明的目的，术语“烷基(alkyl)”包括饱和烃残基，其可以为支链或直链的且未被取代或至少被单取代的。可为未取代或单取代或多取代的合适烷基残基的实例为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、2-丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、异戊基、新戊基、正己基、2-己基、3-己基、正庚基、正辛基、-C(H)(C2H5)2、-C(H)(n-C3H7)2和-CH2-CH2-C(H)(CH3)-(CH2)3-CH3。
除非在别处另有定义，术语“芳基(aryl)”单独或与其他术语结合应理解为单环或多环，优选地单环或双环，具有优选地6、10或14个碳原子的芳族烃基。芳基可以为未取代的或单取代的或多取代的，可具有相同或不同的取代基。
序列描述
在整个申请中，根据以下IUPAC编码使用核苷酸和氨基酸缩写：
表1
IUPAC核苷酸编码 碱基
A 腺嘌呤
C 胞嘧啶
G 鸟嘌呤
T(或U) 胸腺嘧啶(或尿嘧啶)
R A或G
Y C或T
S G或C
W A或T
K G或T
M A或C
B C或G或T
D A或G或T
H A或C或T
V A或C或G
N 任何碱基
- 空位
为了区分氨基酸和核苷酸，上表中给出的大写核苷酸代码缩写在本表中以小写字母书写。
表2
IUPAC氨基酸编码 三字母编码 氨基酸
A Ala 丙氨酸
C Cys 半胱氨酸
D Asp 天冬氨酸
E Glu 谷氨酸
F Phe 苯丙氨酸
G Gly 甘氨酸
H His 组氨酸
I Ile 异亮氨酸
K Lys 赖氨酸
L Leu 亮氨酸
M Met 蛋氨酸
N Asn 天冬酰胺
P Pro 脯氨酸
Q Gln 谷氨酸
R Arg 精氨酸
S Ser 丝氨酸
T Thr 苏氨酸
V Val 缬氨酸
W Trp 色氨酸
Y Tyr 酪氨酸
本文中的密码子使用遵循根据下表的所谓“通用遗传密码”，其中在核糖核酸(RNA)序列中“t”被“u”取代。
表3
与本申请相关的序列表以电子形式提交，并在此通过引用整体并入本说明书中。“PRT”代表“蛋白质”，“NUC”代表“核酸”。
表4a：根据本发明第一方面的脂肪酶变体(SEQ ID No.7-169)和另外的脂肪酶(SEQ ID No.1-6)
表4b：根据本发明的进一步的脂肪酶变体(蛋白质SEQ ID No.171-239)。所述变体包含骨架突变N57P、K122R、A212P、S234K、D289G和G109H(SEQ ID No.171、172)，除非(i)另外指示突变“R122K”，其意味着K122R突变已经回复突变，使得第122位再次携带K，或(ii)另外指示突变“R122Q”，这意味着K122R突变已经进一步突变，使得第122位携带Q。
实施例
以下实施例对本发明进行了解释，但不限制本发明。
起始材料和方案
分析级化学品和即用型试剂盒采购自常见供应商，如Sigma Aldrich、AcrosOrganics、Fisher Scientific、Qiagen或Stratagene。435购自SigmaAldrich。
实施例1
脂肪酶变体的克隆：
将SEQ ID No.1的核酸序列或其变体克隆到基于pKA81的表达载体中。通过本领域已知的方法将遗传元件并入载体中。为了表达不同的脂肪酶变体，将载体引入电感受态大肠杆菌(E.coli)W3110细胞中。
变体文库：
在野生型序列或由其衍生的序列中取代核苷酸以允许氨基酸取代。这种交换可以通过各种分子生物学方法来实现。替代核酸的一种方法是定点诱变，其可导致氨基酸序列中一个或多个位点的突变。用于定点诱变的方法是现有技术且在文献中有记载(如Directed Mutagenesis：A PracticalApproach，1991，Editedby M.J.McPHERSON，IRLPRESS)，且可以作为现成的试剂盒(如来自Qiagen或Stratagene的QUIKCHANGETMlightening mutagenesis kit)购买。在基因序列中插入突变并在合适的大肠杆菌克隆菌株中培养后，将获得的质粒转化到大肠杆菌W3110中。
在适当的生物转化反应中测试转化的细胞以确定产物产率和选择性。适当的生物转化反应如下所述，参见实施例2。如本领域已知的那样进行序列验证。
通过向一体积的大肠杆菌培养物中加入一体积的40％甘油溶液来制备用相应表达质粒转化的大肠杆菌培养物的甘油储备液。
为了分离单个细菌菌落，将适当稀释度的大肠杆菌培养物接种到含有合适浓度卡那霉素的LB-琼脂平板上，并在37℃下孵育直至获得多个单菌落。
实施例2
培养：
为了制备预培养物，使用灭菌的2ml 96孔深孔板(Eppendorf，Hamburg，Germany)并与590μlTB培养基(50μg/ml卡那霉素)和10μl充满相应大肠杆菌菌株的甘油储备液混合。或者，使用来自琼脂平板菌落的细胞材料接种至590μl TB培养基(50μg/ml卡那霉素)。将预培养物在37℃和250rpm下孵育17h。
使用含有510μL TB培养基(50mg/L卡那霉素)的无菌2ml 96孔深孔来生产主要培养物。使用30μl预培养物接种表达培养物，并在37℃和250rpm下孵育。孵育4小时后，通过加入60μL IPTG(在表达培养基中稀释的10mMIPTG，补充有50mg/L卡那霉素)诱导酶的表达。然后将表达培养平板在28℃和250rpm下孵育20h。
通过在4℃和2500×g下离心15分钟来收获细胞。弃去培养上清液，将细胞沉淀物悬浮于200μL PBS中。然后将细胞冻干24小时，并在4℃下储存直至使用。
生物转化、手性拆分和分析：
用冻干上清液在微量滴定板中进行(3S)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯的手性拆分。对于手性拆分，在每个孔中使用100μL外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯、105μL MTBE(甲基叔丁基醚)和45μL超纯水(含416.6g/L KHCO3)。将每个板密封并在45℃下300rpm的振荡器中孵育6h。然后通过加入22.5μL 20％H2SO4溶液终止反应。为了进一步提取，在深孔板中每孔添加1mL MTBE。将板在室温下振荡10分钟，然后以2500×g离心10分钟。然后将10μL有机相转移到含有100μL MTBE的96孔PCR板中，并通过HPLC进行分析。
HPLC分析方法
使用HPLC在以下设置下分析样品：
仪器：Agilent Technologies 1290InfinityII；柱：Lux cellulose-2，100x4.6mm，3μm；洗脱液A：预混合庚烷(+0.05％甲酸)；洗脱液B：乙醇；流速：等度(90％洗脱液A/10％洗脱液B)，流速：0.8mL/min；温度：25℃；样品进样量：1μL；检测：在210nm处的吸收。
将外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯和外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸(参照生物转化样品的制备方法制备)用作参考物质和定量标准。使用适当稀释度的标准品，以便能够使用标准品线定量所使用的底物和所得产物。分析样品的底物转化和产物形成。通过测定底物和产物ee[％]来进行各个样品之间的评价和比较。
实施例3：外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯酶水解为(3R)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸
如实施例2中所述进行培养、生物转化和HPLC分析。在培养过程中，使用甘油培养物进行接种。具有单个点突变的酶变体的活性和选择性结果可以在下表5和6中找到。具有组合突变的酶变体的活性和选择性结果可以在表7和8中找到。具有额外的组合突变的酶变体的活性和选择性结果可以在表9和10中找到。
各个酶变体的高选择性和高活性对于外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯有效转化为(3R)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸以高产率产生几乎对映体纯的产物是决定性的。
酶选择性ee[％]3-羟基-2-亚甲基-丁酸酯是由(3R)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸和(3S)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸的摩尔分数之差除以(3R)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸和(3S)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸的摩尔分数之和来定义。
底物(3R)3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯的摩尔分数转化率的酶活性ee[％]由(3S)3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯和(3R)3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯的摩尔分数之间的差除以(3S)3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯和甲基(3R)3-羟基-2-亚甲基-丁酸酯的总和来描述。
SEQ ID No.1的脂肪酶显示100％的选择性和100％的活性。
表5：与SEQ ID No.1的脂肪酶相比，显示出酶活性相对改善的脂肪酶变体。酶活性的相对改善定义为各变体的对映体过量ee[％]与参照脂肪酶(SEQ ID No.1)的对映体过量ee[％]的商，以百分比表示。SEQ ID No.1的脂肪酶的底物ee[％]为9.8。
表6：与SEQ ID No.1的参照脂肪酶相比，显示出酶选择性相对改善的脂肪酶变体。酶选择性的相对改善被定义为相应变体的3-羟基-2-亚甲基-丁酸的ee[％]与SEQ ID No.1的参照脂肪酶的3-羟基-2-亚甲基-丁酸的ee[％]的商，以百分比表示。参照脂肪酶的产物ee[％]为75.8。
表7：与SEQ ID No.1的参考脂肪酶相比，显示出酶活性相对改善的脂肪酶变体。酶活性的相对改善定义为各变体的对映体过量ee[％]与参照脂肪酶(SEQ ID No.1)的对映体过量ee[％]的商，以百分比表示。
表8：与SEQ ID No.1的参照脂肪酶相比，显示出酶选择性相对改善的脂肪酶变体。酶选择性的相对改善被定义为相应变体的3-羟基-2-亚甲基-丁酸的ee[％]与SEQ ID No.1的参照脂肪酶的3-羟基-2-亚甲基-丁酸的ee[％]的商，以百分比表示。
实施例4：
基于骨架突变N57P、K122R、A212P、S234K、D289G和G109H的变体已经补充有如以上实施例中所述的序列中的进一步突变，并且如实施例3中所述测试酶活性和选择性。
表9：与SEQ ID No.171的参考脂肪酶相比，显示出酶活性相对改善的脂肪酶变体。酶活性的相对改善定义为各变体的对映体过量ee[％]与参照脂肪酶(SEQ ID No.171)的对映体过量ee[％]的商，以百分比表示。表中的所有脂肪酶变体额外携带突变N57P、K122R、A212P、S234K、D289G、G109H。
表10：与SEQ ID No.171的参考脂肪酶相比，显示出酶选择性相对改善的脂肪酶变体。酶选择性的相对改善定义为相应变体的3-羟基-2-亚甲基-丁酸的ee[％]与SEQ IDNo.171的参考脂肪酶的3-羟基-2-亚甲基-丁酸的ee[％]的商，以百分比表示。表中的所有脂肪酶变体额外携带突变N57P、K122R、A212P、S234K、D289G、G109H。
实施例5：不同酯的酶水解
除3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯(a)之外，还在合适的条件下(1mL范围，5g/L酯化合物，5g/L SEQ ID No.1的酶的冻干物，100mMKPI缓冲液pH 8)测试相应的叔丁酯(b)、异丁酯(c)和异丙酯(d)的酶水解：
所有酯(a)至(d)允许有效的对映体拆分，其中(R)-酯优选地进行水解：
*与零时间点对照相比
实施例6：替代溶剂
已经测试了几种不同溶剂对3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯的手性拆分。反应条件为：100mL总体积，300g/L外消旋3-羟基-2-BCS亚甲基-丁酸甲酯，20g/L喷雾干燥的SEQ IDNo.1脂肪酶，70％溶剂，0.54当量KHCO3，pH 8.5(用40％w/v K2CO3滴定)，45℃，6h。特别地，MTBE、CPME、MIBK和甲苯允许水解产物(3R)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸(ee)的高对映体过量。
实施例7：外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯酶水解为(3R)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸的进一步实例
除SEQ ID No.1的脂肪酶之外，已经测试了另外三种相关变体，即具有突变Q295V和K298A的变体(SEQ ID No.3)；以及具有突变V33I和I254S的变体(SEQ ID No.5)；以及具有突变T188S、I254S、P302L和Q304E的变体(SEQ ID No.241)。
如实施例2中所述进行培养、生物转化和HPLC分析。如实施例3中所述，酶选择性ee[％]3-羟基-2-亚甲基-丁酸酯由(3R)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸和(3S)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸的差除以(3R)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸和(3S)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸的总和来定义。底物(3R)3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯转化的酶活性ee[％]由(3S)3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯和(3R)3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯之间的差除以(3S)3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯和(3R)3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯的总和来描述。SEQ ID No.1的参照脂肪酶显示100％的选择性和100％的活性。
表11：与SEQ ID No.1的参照脂肪酶相比，显示出相似酶活性谱的比较脂肪酶变体。酶活性的相对差异被定义为各个变体的对映体过量ee[％]和参考脂肪酶(SEQ IDNo.1)的对映体过量ee[％]的商，以百分比表示。
表12：与SEQ ID No.1的参考脂肪酶相比，显示出相似酶选择性的比较脂肪酶变体。酶选择性的相对差异被定义为相应变体的3-羟基-2-亚甲基-丁酸的ee[％]与SEQ IDNo.1的参考脂肪酶的3-羟基-2-亚甲基-丁酸的ee[％]的商，以百分比表示。
如表11和12所示，比较的脂肪酶具有更差的脂肪酶活性，且不改进所讨论的底物的选择性。
实施例8：外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯酶水解为(3R)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸
将8.0g喷雾干燥的脂肪酶SEQ ID No.1悬浮于50g水中并用100ml MTBE稀释。升温至45℃后，经3小时将120g外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯(99％纯度)在100g MTBE中的混合物加入悬浮液中。完全加料后，将混合物在45℃下进一步搅拌过夜。在加料和额外的搅拌时间期间，通过平行添加40％碳酸钾水溶液将pH保持在7.5。之后，通过离心分离生物质并分离相。在每次用2×125g MTBE萃取水相后，将合并的有机萃取物在45℃下减压浓缩，得到91％纯度、96％ee和40％校正收率的(3S)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯。
实施例9：外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯酶水解为(3R)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸
将120g水温热至45℃，加入2.0g喷雾干燥的脂肪酶SEQ ID No.1，然后加入280mLMTBE。在45℃下，经2小时将120g外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯(99％纯度)加入悬浮液中。完全加料后，将混合物在45℃下进一步搅拌8.5小时。在加料和额外的搅拌时间期间，通过平行添加40％碳酸钾水溶液将pH保持在7.5。然后，分离下部水相并用100mL MTBE反萃取一次。将萃取物与上层有机相合并，并将混合物在33-55℃下蒸馏并减压至10mbar。加入50g高沸点Marlotherm后，将残余物在3-10mbar下进一步蒸馏至150℃，得到58.2g(92％纯度，96％ee，45％产率)91％纯度、96％ee和40％校正产率的(3S)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯。
实施例10：外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯的对映选择性酰化
将1400g外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯[10.62mol，98.7％纯度]和105gNovozyme 435的悬浮液加热至25℃内部温度。使用计量泵在50mbar真空下在3h内加入1373g十二烷酸乙烯酯(5.95mol，98％)。随后，将反应混合物加热至35℃内部温度和50mbar，保持额外的8h。在真空下蒸馏出乙醛。然后使悬浮液在35℃和50mbar下再保持额外的8小时。在真空下将反应混合物加热至115℃夹套温度(jacket temperature)，以从悬浮液中蒸馏出(3S)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯。在这方面，真空逐渐降低至3mbar，夹套温度升高至135℃。使用手性HPLC标准方法分析产物。达到＞99％的化学纯度和＞98％ee的对映体过量。(3S)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯的分离产率为41％。

Claims (16)

1.一种具有脂肪酶活性的蛋白质变体，其中所述蛋白质由与SEQ ID No.1所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列编码，
其特征在于，所述蛋白质变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于以下位置中的至少一处：
i.第44位的氨基酸为M、W或Y；
ii.第51位的氨基酸为N或M；
iii.第52位的氨基酸为L；
iv.第53位的氨基酸为S、P、I、E或A；
v.第54位的氨基酸为Q、M、F、G、E、L、T或P；
vi.第55位的氨基酸为R、M、D、Y、S、I；
vii.第109位的氨基酸为H或F；
viii.第110位的氨基酸为T或V；
ix.第111位的氨基酸为S；
x.第117位的氨基酸为F或S；
xi.第121位的氨基酸为V；
xii.第122位的氨基酸为Q、A、Y、R或V；
xiii.第153位的氨基酸为Y、D、E或C；
xiv.第160位的氨基酸为E、C、D、P、I、Q、K、M、S、F、A或N；
xv.第179位的氨基酸为C；
xvi.第181位的氨基酸为Q；
xvii.第184位的氨基酸为G或T；
xviii.第211位的氨基酸为E；
xix.第212位的氨基酸为S；
xx.第216位的氨基酸为K或A；
xxi.第234位的氨基酸为K、T或G；
xxii.第235位的氨基酸为V或M；
xxiii.第236位的氨基酸为T；
xxiv.第238位的氨基酸为A、K、D、E或Q；
xxv.第240位的氨基酸为F；
xxvi.第289位的氨基酸为S或G；
xxvii.第291位的氨基酸为E或W；
xxviii.第317位的氨基酸为T；
xxix.第320位的氨基酸为E或G；
xxx.第321位的氨基酸为F。
2.根据权利要求1所述的蛋白质变体，其特征在于，所述蛋白质变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于至少存在以下突变之一：
i.第44位的氨基酸为W或Y；
ii.第54位的氨基酸为F；
iii.第55位的氨基酸为R；
iv.第109位的氨基酸为H；
v.第110位的氨基酸为T或V；
vi.第117位的氨基酸为F；
vii.第122位的氨基酸为Q或R；
viii.第160位的氨基酸为E；
ix.第216位的氨基酸为K；
x.第236位的氨基酸为T；
xi.第238位的氨基酸为K或E；
xii.第240位的氨基酸为F。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质变体，其特征在于，所述蛋白变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于至少具有以下突变：第109位的氨基酸为H。
4.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质变体，其中所述蛋白质变体包含至少两个，优选地至少三个所述氨基酸取代。
5.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质变体，其中所述蛋白质变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于选自以下修饰中的至少两个，进一步优选地至少三个，甚至进一步优选地至少四个，特别优选地至少五个且最优选地全部：
i.第57位的氨基酸是P；
ii.第109位的氨基酸为H；
iii.第122位的氨基酸为R；
iv.第212位的氨基酸是P；
v.第234位的氨基酸为K；
vi.第289位的氨基酸为G。
6.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质变体，其中所述蛋白质变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列的不同之处在于以下修饰：
i.第57位的氨基酸为P；第109位的氨基酸为H；第122位的氨基酸为R或K或Q，优选地为R；第212位的氨基酸为P；第234位的氨基酸为K；第289位的氨基酸为G；
ii.且额外至少一个以下修饰：第44位的氨基酸为W或Y；第54位的氨基酸为F，第55位的氨基酸为R，第110位的氨基酸为V或T；第111位的氨基酸为T，第117位的氨基酸为F，第160位的氨基酸为E，第216位的氨基酸为K，第236位的氨基酸为T，第238位的氨基酸为K或E，第240位的氨基酸为F。
7.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质变体，其中所述蛋白质变体携带SEQ IDNo.7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239中的一个所示的氨基酸序列。
8.根据前述权利要求中任一项的编码具有脂肪酶活性的蛋白质的核酸分子。
9.根据权利要求8所述的核酸分子，其编码具有脂肪酶活性的蛋白质，所述核酸分子选自
a)包含SEQ ID No.8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240所示的核酸序列的核酸分子；
b)与a)中所示的核酸序列具有至少60％、优选地70％、更优选地80％、进一步优选地90％、甚至更优选地95％、甚至进一步优选地96％、特别优选地97％、最优选地98％或尤其优选地99％的同一性的核酸分子。
10.一种重组核酸分子，其包含根据权利要求8或9所述的核酸分子。
11.根据权利要求10所述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子为载体或质粒。
12.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质或根据权利要求8或9所述的核酸分子或根据权利要求10或11所述的重组核酸分子。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质在外消旋3-羟基-2-亚甲基-丁酸甲酯立体选择性水解成(3R)-3-羟基-2-亚甲基-丁酸中的用途。
14.一种以对映体选择性方式将式(II)的底物水解成式(III)化合物的方法，其包括使所述底物与根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质变体接触，
其中R1和R2独立地选自取代或未取代的(n)-烷基、异烷基、芳基、烷基取代的或芳基取代的芳基。
15.根据权利要求14所述的方法，其用于以对映体选择性方式将式(II-1)的底物水解成式(III-1)的化合物，
进一步包括分离式(I-1)的化合物。
16.根据权利要求14或15中任一项所述的方法，其中所述方法在水和有机溶剂的双相体系中进行，所述有机溶剂优选地选自甲基叔丁基醚、甲苯、2-甲基四氢呋喃、甲基异丁基酮、环己烷、环戊基甲醚、氯苯、叔戊基甲醚、乙酸乙酯和乙酸异丙酯。
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