CN120897800A

CN120897800A - 用于在载体相内产生组合微区室的装置和方法

Info

Publication number: CN120897800A
Application number: CN202480020849.7A
Authority: CN
Inventors: 哈娜·萨梅特; 克里斯托夫·梅尔滕
Original assignee: Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Current assignee: Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Priority date: 2023-03-24
Filing date: 2024-03-25
Publication date: 2025-11-04
Also published as: WO2024200381A1; EP4434627A1; KR20250170073A

Abstract

本公开内容提供了用于在载体相内产生一个或更多个包含至少两个样品种类的组合微区室的方法和微流控装置，所述微流控装置包含：目标通道、包含第一样品种类的第一样品种类储器和包含第二样品种类的至少第二样品种类储器、包含与第一样品种类储器连接的样品注射通道储器端和与目标通道连接的样品注射通道接合端的第一样品注射通道、以及包含与第二样品种类储器连接的样品注射通道储器端和与目标通道连接的样品注射通道接合端的至少第二样品注射通道；其中第一样品注射通道和/或第二样品注射通道的样品注射通道接合端与目标通道无阀地连接并且包含至少一个流体动力阻力器。本公开内容还提供了用于在根据本发明的微流控装置中将实体与条码寡核苷酸或其组分组共定位的方法。

Description

用于在载体相内产生组合微区室的装置和方法

本文中所述的实施方案涉及用于在载体相内产生一个或更多个包含至少两个样品种类的组合微区室的方法和装置，特别是微流控装置。

背景技术

在微流控装置中遇到的一个问题与微流控回流有关。微流控回流可以指液体、流体或水性样品非预期地从微流控装置中的一个通道或一个区室流入另一通道或另一区室中。因此，回流导致例如相邻通道、微区室和/或组合微区室之间的交叉污染，这可能是微流控实验和测定中的严重问题，因为应保持分开的液体、流体或水性样品可（例如非预期地）混合或扰乱微流控装置中流体的预期流动。

如所述的，微流控回流可在通道和/或微区室之间发生。数个因素可促成通道中的微流控回流，例如压力差：如果一个通道中的压力大于另一通道中的压力，则液体、流体或水性样品可从较高压力通道流入较低压力通道中而导致回流；流体动力流：当液体、流体或水性样品在一个通道中流动时，它们可产生一种流，将液体、流体或水性样品从其他通道吸入到流动通道中；毛细力：毛细力可导致液体、流体或水性样品被吸入到邻近或相邻通道中；和/或不完全密封：如果通道之间的密封没有适当设计或没有紧密密封，则液体、流体或水性样品可从一个通道泄漏至另一个中。

微区室中的微流控回流可由例如以下引起：微通道间的压力差，导致通道堵塞的不良通道设计；液体、流体或水性样品的黏性曳力；入口与出口之间的流量不匹配；液体、流体或水性样品与通道壁之间的静电相互作用以及/或者液体、流体或水性样品的温度和黏度变化。

通常，使用流量控制和/或切换芯片上阀例如气动阀（例如Quake阀）或Braille阀可通过使得能够精确控制微流控装置中流体的流动来帮助防止或减少回流。

可使用阀来产生不同的水性样品。通过利用阀选择性地引导和控制微流控通道中流体的流动的能力，结合载体相（例如水或油）的共注射，水性样品可在微流控芯片上混合和/或区室化。为此，可使用阀来引导流体流入微流控芯片内的具体微区室中，使得产生具有例如不同化学或生物环境的多个隔离区室。这些水性微区室可用于多种目的，例如进行化学反应，包封细胞或其他生物材料，或者用于高通量筛选应用，例如使得产生用于筛选反应或测定的多个隔离环境。

然而，当使用阀来产生不同水性样品或组合混合物时存在多种限制，包括i）复杂性，例如，阀由于其小尺寸和复杂的设计可能难以制造以及整合到微流控装置中；ii）维护，例如，阀可能易于随时间而堵塞、泄漏或磨损，其可能需要定期维护和清洁以确保正常功能；iii）有限的通道数目；例如，可使用单个阀来控制的通道数目是有限的，其可限制可同时进行的筛选测定的数目；iv）精确性，例如，要求非常精确地调准阀，例如在外部致动器上（例如在Braille显示器上调准Braille阀）；和/或v）有限的可扩展性，例如，由于复杂的制造过程和需要在微流控装置内精确对准阀，可能难以增加阀的数量以用于高通量筛选应用。然而，使用阀产生组合混合物还需要防止不期望的微流控回流。此外，阀发挥正确功能需要柔性材料，例如PDMS（聚二甲基硅氧烷）材料，其为基于有机硅的聚合物材料，因其透明度、低表面能和生物相容性而通常用于微流控，然而其难以以标准化的可扩展方式生产。

标题为“Valveless Liquid Microswitch”的美国专利No. 5,726,404描述了可用于在微流控装置中控制流体流动的无阀液体微开关。该微开关包含填充有液体的室，该室可由压电元件或其他合适的致动器来致动。

因此，提供改进的微流控装置和方法以防止、减少和/或抵消通道和/或微区室之间的微流控回流，同时最小化或消除与阀的使用相关的限制是有益的。

发明内容

本发明提供的主题在独立权利要求中限定，而本发明的优选实施方案在从属权利要求中限定。

本发明在其最通用的实施方案中涉及用于通过在样品注射接合处（其应理解为目标通道与至少两个样品注射通道之一之间的通道接合处）将来自至少两个样品注射通道之一的至少两个样品流体中的至少一个临时注射到含有目标通道流体的目标通道中来在微流控装置内将两个或更多个不同样品流体（或液体）与目标通道流体组合的方法和装置。目标通道优选包含经由目标通道流体储器提供的目标通道流体的连续流。然后，本发明的方法和装置规定，待注射的至少一个样品注射流体经由加压的样品注射流体储器被供给到样品注射通道中，优选地，其中在注射阶段施加注射压力P_i并且在非注射阶段施加非注射压力P_ni，并且其中至少两个样品注射通道各自经由至少一个流体动力阻力器（hydrodynamicresistor）与样品注射流体储器无阀地连接。因此本发明提供了在注射阶段和非注射阶段二者期间由持续加压的样品注射储器供给的样品注射通道与布置在样品注射接合处和样品注射储器之间的流体动力阻力器的组合。这样的组合与现有技术的装置和方法相比，在避免注射通道回流方面出乎意料地有效。本发明将参照特别优选的实施方案在以下详细描述。

在本发明的以下详细描述中，目标通道流体也称为载体流体或载体相，其中注射通道流体可称为样品种类（sample species）或流体。

鉴于以上，提供了微流控装置以及用于在微流控装置中组合至少两种流体的方法。这样的用于组合流体的发明方法特别可用于产生组合微区室。因此，鉴于以上，本发明还提供了用于在载体相内产生一个或更多个包含至少两个样品种类的组合微区室的微流控装置和方法。

根据一个实施方案，提供了在载体相内包含至少两个样品种类的微流控装置。该微流控装置包含：目标通道、包含第一样品种类的第一样品种类储器和包含第二样品种类的至少第二样品种类储器。微流控装置包含：第一样品注射通道，其包含与第一样品种类储器连接的样品注射通道储器端和与目标通道连接的样品注射通道接合端；以及至少第二样品注射通道，其包含与第二样品种类储器连接的样品注射通道储器端和与目标通道连接的样品注射通道接合端。第一样品注射通道和/或第二样品注射通道的样品注射通道接合端与目标通道无阀地连接并且包含至少一个流体动力阻力器。在本发明的一些优选的实施方案中，包含在本发明的微流控装置中的样品种类储器能够在样品液体的注射和非注射期间被加压。在一个优选的实施方案中，微流控装置用于产生一个或更多个组合微区室。

根据一个实施方案，提供了用于操纵微流控装置的方法，该方法包括：将来自第一样品种类储器的第一样品种类经由第一样品注射通道注射到目标通道的载体相的连续流中（其中优选地，载体相的连续流从载体相储器注射到目标通道中）。该方法还包括将来自第二样品种类储器的至少一个第二样品种类经由第二样品注射通道注射到目标通道的载体相的连续流中，其中（i）通过向相应的第一种类储器和第二种类储器施加注射压力P_i来注射第一样品种类和第二样品种类，同时在每个非注射的样品注射通道的每个样品种类储器上维持低于该注射压力P_i的非注射压力P_ni，并且/或者（ii）使用至少一个流体动力阻力器在第一注射通道和/或第二注射通道内提供阻力。

根据另一个实施方案，提供了用于提供一个或更多个包含至少两个样品种类的组合微区室的方法。该方法包括：将来自第一样品种类储器的第一样品种类经由第一样品注射通道注射到目标通道的载体相的连续流中以产生微区室。该方法还包括将来自第二样品种类储器的至少一个第二样品种类经由第二样品注射通道注射到所产生的微区室中以产生组合微区室，其中（i）通过向相应的第一种类储器和第二种类储器施加注射压力P_i来注射第一样品种类和第二样品种类，同时在每个非注射的样品注射通道的每个样品种类储器上维持低于该注射压力P_i的非注射压力P_ni，并且/或者（ii）使用至少一个流体动力阻力器在第一注射通道和/或第二注射通道内提供阻力。

根据一个实施方案，提供了微流控芯片，其包含一个或更多个包含至少两个样品种类的组合微区室，所述组合微区室通过以下产生：将来自第一样品种类储器的第一样品种类经由第一样品注射通道注射到目标通道的载体相的连续流中以产生微区室，以及将来自第二样品种类储器的至少一个第二样品种类经由第二样品注射通道注射到所产生的微区室中以产生组合微区室，其中（i）通过向相应的第一种类储器和第二种类储器施加注射压力P_i来注射第一样品种类和第二样品种类，同时在每个非注射的样品注射通道的每个样品种类储器上维持低于该注射压力P_i的非注射压力P_ni，并且/或者（ii）使用至少一个流体动力阻力器在第一注射通道和/或第二注射通道内提供阻力。

根据另一个实施方案，提供了用于在如本文中所述的微流控装置中将实体与条码寡核苷酸或其组分组共定位的方法，所述方法包括以下步骤：

（i）将实体供给到目标通道中；

（ii）使实体经过第一样品注射通道和至少一个第二样品注射通道，其中所述样品注射通道之一将条码寡核苷酸或其组分组从样品种类储器经由相应样品注射通道和相应样品注射通道接合端供给至目标通道，其通过向第一和第二样品种类储器中相应的一个施加注射压力（P_i）从而将条码寡核苷酸或其组分组注射到目标通道中实现；

（iii）任选地重复步骤（ii），优选地，其中当重复步骤（ii）时，第一样品注射通道和至少一个第二样品注射通道中的另一个将条码寡核苷酸或其组分组从样品种类储器供给至目标通道。

根据一个实施方案，方法还包括在非注射阶段向第一样品种类储器和/或至少一个第二样品种类储器施加非注射压力（P_ni），其中P_ni大于环境的压力（P_大气），并且其中P_i >P_ni > P_大气。

根据另一个实施方案，注射压力（P_i）和非注射压力（P_ni）是通过对第一样品种类储器和至少一个第二样品种类储器加压而产生。

根据一个实施方案，将条码寡核苷酸或其组分组从样品种类储器供给至目标通道通过一个或更多个检测工具或传感器来控制。

根据一个实施方案，实体是核酸或细胞或药物。

根据一个实施方案，方法还包括产生包含实体和条码寡核苷酸或其组分的微流控液滴。

根据一个实施方案，方法还包括将包含实体和条码寡核苷酸或其组分的微流控液滴与另外的微流控液滴融合，以及/或者方法还包括将试剂注射到微流控液滴中。

根据一个实施方案，方法还包括检测实体和条码寡核苷酸或其组分。

根据另一个实施方案，本发明提供了用于对待在细胞或细胞培养物中测试的物质进行条码标记的方法，该方法包括以下步骤：

（i）使用本发明的方法在微流控液滴中将该物质与条码寡核苷酸或其组分和任选的细胞共定位；

（ii）任选地，如果步骤（i）中没有细胞被共定位，则将细胞引入到步骤（i）的微流控液滴中；

（iii）将包含试剂的反应混合物注射到或融合到步骤（ii）的微流控液滴中；

（iv）孵育步骤（iii）的微流控液滴，使得反应混合物能进行反应。

根据从属权利要求、说明书和附图，其他方面、优点和特征是显而易见的。

附图说明

为了能够详细理解本公开内容的上述特征的方式，可以参考实施方案对上文简要概述的本公开内容进行更具体的描述。附图涉及本公开内容的实施方案并且在以下中描述：

图1示出了根据本文中所述的一些实施方案的用于产生组合微区室的微流控装置的示意图；

图2A示出了注射第一样品种类和第二样品种类并且由于没有将（i）维持非注射的样品注射通道的样品种类储器上的非注射压力与（ii）流体动力阻力器结合而出现不期望的回流的示意图；

图2B示出了根据本公开内容的一些实施方案，在维持非注射的样品注射通道的样品种类储器上的非注射压力和使用流体动力阻力器的同时，注射第一样品种类和第二样品种类时避免了不期望的回流的示意图；

图2C示出了根据本公开内容的一些实施方案在目标通道的载体相中产生的不同微区室和组合微区室的示意图；

图3示出了根据本文中所述的一些实施方案的方法的流程图；

图4A示出了在没有将维持非注射的样品注射通道的样品种类储器上的非注射压力与使用流体动力阻力器结合的情况下，样品注射期间的压力谱；

图4B示出了根据本公开内容的一些实施方案，在维持非注射的样品注射通道的样品种类储器上的非注射压力和使用流体动力阻力器的同时，样品注射期间的压力谱；

图5A示出了在没有将维持非注射的样品注射通道的样品种类储器上的非注射压力与使用流体动力阻力器结合的情况下，样品注射期间的流量谱；

图5B示出了根据本公开内容的一些实施方案，在维持非注射的样品注射通道的样品种类储器上的非注射压力和使用流体动力阻力器的同时，样品注射期间的流量谱；

图5C示出了在维持非注射的样品注射通道的样品种类储器上的非注射压力的同时而不使用流体动力阻力器的情况下，样品注射期间的另一流量谱；

图6A示出了用没有维持非注射的样品注射通道的样品种类储器上的非注射压力但使用了流体动力阻力器的微流控装置产生的微区室中交叉污染的测量结果；

图6B示出了根据本公开内容的一些实施方案，维持非注射的样品注射通道的样品种类储器上的非注射压力但使用了流体动力阻力器产生的微区室中交叉污染的测量结果；

图6C示出了在维持非注射的样品注射通道的样品种类储器上的非注射压力的同时但在芯片上没有用流体动力阻力器的情况下产生的微区室中交叉污染的测量结果；

图7A示出了在没有使用流体动力阻力器的情况下，微流控芯片内记录的以ul/分钟计的流量数据（即回流和/或过冲）。

图7B示出了根据本发明的一些优选的实施方案，在使用流体动力阻力器结合维持非注射的样品注射通道的样品种类储器上的非注射压力的情况下，微流控芯片内记录的以ul/分钟计的流量数据（即回流和/或过冲）。

图8A示出了根据本发明的包含流体动力阻力器的微流控芯片设置，例如用于图4至6B的芯片；

图8B示出了不含流体动力阻力器的微流控芯片设置，例如用于图5C、6C和7A的芯片。

图9示出了用于使用本发明的装置和方法产生微区室的实验设置和结果。

图10示出了用于使用本发明的装置和方法产生微区室的另外的实验设置和结果。

图11示出了根据本发明的微流控装置的一个优选的实施方案。

图12示意性地示出了根据本发明的一个实施方案的条码的产生。

图13A和13B是实施例2中产生的两个示例性微区室的示意性可视化图。图13C示意性地示出了将用于细胞裂解和逆转录的试剂添加至微区室。

具体实施方式

在以下详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且其不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限制。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

优选地，本文使用的术语如"A multilingual glossary of biotechnologicalterms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H.eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland中所述进行定义。

在本说明书通篇和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含/包括”及其变化形式将被理解为暗含包括所述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但是不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。在以下的段落中，更详细地限定了本发明的不同方面。除非明确相反地指出，否则如此限定的每个方面可与任何其他一个或更多个方面组合。指示为任选、优选或有利的任何特征可与指示为任选、优选或有利的任何其他一个或更多个特征组合。

在本说明书的正文通篇引用了数篇文献。无论是在上文还是在下文，本文引用的每篇文献（包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明等）均在此通过引用以其整体并入。本文中的内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于这样的公开内容。本文引用的一些文献被标识为“通过引用并入”。在这种并入的参考文献的定义或教导与本说明书中记载的定义或教导之间冲突的情况下，以本说明书的正文优先。

在下文中，将描述本发明的一些要素。这些要素以具体实施方案列出，然而，应理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以形成另外的实施方案。不应将各种描述的实施例和优选实施方案解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本说明书应理解为支持和涵盖将明确描述的实施方案与任何数目的所公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合都应被视为被本申请的说明书公开。

现在将详细参考本公开内容的各种实施方案，其一个或更多个实例在图中示出。图是示意图，其没有按比例绘制。为了突出本公开内容的一些方面和/或为了表述清楚起见，图中的一些元件可能具有被夸大的尺寸。为便于理解，在可能的情况下，使用了相同的附图标记来表示附图中共有的相同元件。预期一个实施方案的要素和特征可有益地并入到另一些实施方案中而无需进一步叙述。通常来说，仅对各个实施方案之间的差异进行了描述。

每个实例仅被提供来解释本公开内容，而不意在限制本公开内容。此外，作为一个实施方案的一部分举例说明或描述的特征可用于另一些实施方案或与另一些实施方案结合使用以产生又一个实施方案。本说明书旨在包含这样的修改和变化。

本文中所述的实施方案涉及用于产生一个或更多个组合微区室的微流控装置。

“微流控装置”可被理解为用于控制、引导和/或操纵例如微升规模或纳升规模内的流体、液体或水性样品的量的小型化系统。这些装置可通过在基底材料（例如玻璃、塑料或有机硅）中制造通道和区室制成，以产生用于（微）流控过程的受控环境。微流控装置可用于进行广泛的流体操作，例如混合、泵送、分离和反应，并且它们可用于多种应用，包括化学分析、细胞培养、药物发现和医学诊断。微流控装置的小尺寸和精确控制允许高效且成本有效的实验，以及使用传统的较大规模的流控系统不可能进行的实验和测定的能力。

“微区室”可被理解为分散在连续相（例如周围的载体相或载体流体，例如油或水）内的液体、流体或水性样品。在这方面中，微区室被可视作小型化反应或测定容器。微区室内部的流体、液体或水性样品与载体相的流体或液体不混溶。

微区室可以是表面活性剂液滴的形式，例如体积在皮升范围内的乳剂。表面活性剂液滴可以是例如被连续相（例如油或水）包围的表面活性剂溶液的球形液滴。表面活性剂是具有表面活性的化合物，其可降低两种不混溶液体之间的表面张力，允许例如连续相内稳定液滴的形成。在表面活性剂液滴中，表面活性剂分子被吸附在液滴与连续相之间的界面处，产生了防止液滴以及内部的物质与连续相合并的稳定界面。这些液滴也称为微流控液滴。

微区室也可以是完全填充目标通道或管的（微流控）塞（plug），例如体积在纳升范围内。塞可被载体相或载体流体（例如油或水）隔开。在这种情况下，无需使用稳定性表面活性剂。

微区室也可以是流段，例如微流控通道或管内的一部分或一段，其中流体流具有特定且不同的性能，例如超过微升体积。

“组合微区室”可理解为包含至少两个样品种类或物质（例如样品种类（A）和样品种类（B），其可在化学上和/或在生物学上不同）的微区室。因此，组合微区室可以指包含在载体相内区室化的不同种类的混合物。

可能的样品种类包括分子药物或化合物、蛋白质或酶、核酸（DNA、RNA）、细胞或微生物（例如原核或真核细胞）、微观组织样品、颗粒或纳米颗粒以及/或者生物分子（例如糖、脂质或激素）。

在化学上和/或在生物学上不同可以指具有不同化学/生物学特性和组成的物质、实体或材料。这可以理解为它们可能在其分子结构、化学行为和/或生物活性方面不同。区别可以基于单个分子组成的差异、原子的类型和排列、特定官能团的存在或不存在情况、或者生物活性的差异。例如，在化学上不同的实体包括不同的生物活性物质，例如引起特异性细胞应答的药物。在生物学上不同的实体包括不同类型的细胞、来自不同供体的细胞、表达给定蛋白质的不同变体的细胞文库和组织切片。

根据本文中讨论的一些实施方案的微流控装置可包含含有第一样品种类（A）的第一样品种类储器和含有第二样品种类（B）的至少第二样品种类储器。

“储器”或“样品种类储器”可理解为用于储存、容纳或保持一定体积的特定样品种类（例如容纳水性样品、流体或液体）的储存设施或容器。在储器上施加的压力也可调节这些样品种类的流动或流出。这样的样品种类储器的典型容积为几皮升至几毫升，特别是几纳升至几微升，更特别是几微升至几毫升或者还甚至更高/更低。根据本发明的一个实施方案的样品种类储器可由刚性或非刚性材料制成，然而，刚性材料是优选的。用于样品种类储器的优选材料为塑料材料，如聚丙烯或聚碳酸酯和玻璃。

储存在样品种类储器中的“样品种类”可理解为流体、液体或水性样品（包括例如水），其还可包括溶解或混悬的物质，例如特定化学/生物学种类，例如在化学上和/或生物学上具有不同特性、特征、化合物和/或组成的物质或材料，例如（A）、（B）、（C）等。样品种类还可包括载体相，例如油和水。样品、样品种类和/或载体相可以以流体或液体的形式储存，其中这些术语可在本文中互换使用。载体相流体或载体相液体通常选自油，但在本发明的某些应用中可包括水性样品液体。

本发明的上下文中的“目标通道”应理解为两种、三种或更多种流体被组合到其中的通道，并且其中组合的流体被进一步运输至例如任何测定区域、检测区域、储存储器或用于进行流体组合的任何其他工具。该术语应理解为根据本发明的样品被组合到其中的（例如微流控芯片的）通道或管。目标通道可被配置成用于保持、引导或支撑目标通道流体例如载体相。 “载体相”（例如目标通道内）可被认为是（例如连续地）流动通过芯片的流体或液体，以移动或运输样品通过该芯片。载体相可以是液体（例如水或油）并且其特性（例如黏度、表面张力和pH）可被调节以优化样品的运输。

术语“注射通道”应该是指这样的一个或更多个通道：流体被从其注射到目标通道中以组合根据本发明的一种或更多种流体。在一些情况下，本发明的注射通道也可称为样品注射通道。术语“样品”在这种情况下应该是指待被注射到目标通道中的一种或更多种流体。

尽管提及了第一样品种类储器包含可能与包含在第二样品种类储器中的第二样品种类（B）不同的第一样品种类（A），但还可能的是两个样品种类储器包含相同样品种类，例如（A）或（B）。

微流控装置可包含第一样品注射通道和第二样品注射通道。“样品注射通道”可理解为（流体）通道、途径或管，其用于将流体、液体或水性样品（例如特定样品种类）运输或递送至例如目标通道。载体相也可使用一个或更多个样品注射通道来注射。

样品注射通道可由玻璃、有机硅或塑料制成。样品注射通道的直径为几十微米至数毫米。例如，在用于高通量筛选应用的微流控装置中，样品注射通道的直径可为数微米。

然而，较大的直径可能是有益的。例如，当处理细胞时，可使用较大的通道直径以避免通道堵塞，例如通过允许细胞通过而不被滞留或卡住。第一样品注射通道包含与第一样品种类储器连接的样品注射通道储器端和与目标通道连接的样品注射通道接合端，并且第二样品注射通道包含与第二样品种类储器连接的样品注射通道储器端和与目标通道连接的样品注射通道接合端。

在注射通道“储器端”处，样品注射通道可与样品种类储器无阀地连接。然而，样品种类储器可被加压，并且压力可通过“外部阀”（例如连接至压力源的阀）来释放（参见下文）。

一般而言，与相应的包含第一样品种类的第一样品种类储器和包含第二样品种类的第二样品种类储器连接的至少两个样品注射通道可用于产生本文中记载的组合微区室。对于产生微区室，仅一个样品注射通道也可能足够了。

第一样品注射通道和/或第二样品注射通道的样品注射通道接合端与目标通道无阀地连接并且包含流体动力阻力器。

样品注射通道“接合端”可限定样品注射通道的端部，在此处样品注射通道与目标通道相遇、相交、合并或连接。“无阀”连接可理解为不包含或不使用阀（例如用于控制流体的流动）的连接。在样品注射通道与载体相之间具有无阀连接的微流控装置中，样品可通过样品注射通道接合端处的小开口或收缩部被引入到载体相中。样品与载体相之间的压力差（例如连同通道的几何形状和通道的流体阻力）可决定水性样品和载体相的流量和混合。无阀连接可具有改善的可靠性、较低的成本和降低的复杂性。它们相比于其他使用阀的装置也可更易于制造和维持。

因此，术语“无阀”或“无阀地”优选意指没有阀用于关闭或打开进入通道的入口。优选地，没有阀与本文中所述的样品种类储器和/或来自样品种类储器的注射样品种类相关，例如，相应入口不使用阀关闭或打开。另外，根据另一个优选的实施方案，没有阀用于在流体动力阻力器中提供阻力以及/或者产生本文中所述的非注射压力（P_ni）和注射压力（P_i）。根据一些实施方案，没有阀来主动调节任何实体（例如颗粒、条码寡核苷酸或者其他要素或流体）向注射通道的供给。换言之，所有试剂仅通过向试剂储器施加压力来注射。因此，根据按照本发明的一个优选的实施方案，微流控装置在样品种类储器与目标通道之间不具有阀。根据另一个优选的实施方案，整个微流控装置上都没有阀。将理解，术语“无阀”不排除在微流控装置或芯片外部存在阀的情况，例如用于在相应要素或组分被注射或供给至目标通道或微流控装置的任何其他部分之后释放压力。还将理解，根据一个实施方案，未参与将要素或组分从样品种类储器开始并经由注射通道供给的过程的阀未被术语“无阀”排除在外。关于将实体、条码寡核苷酸或者其他要素或流体供给至注射通道的无阀的反义词是“阀操作的”，其意指可使用阀来关闭或打开相应通道。

“流体动力阻力器”可理解为向样品注射通道中的流体流动提供流体动力阻力以控制、调节微流控系统中流体的流动的装置。压降可跨阻力器产生，其阻挡流体的流动并调节流体的流量。流体动力阻力器可实现为微流控装置内的窄通道、收缩部或收缩区、或者流体阻力增加的区域，其产生压降或压力增量，例如在一段时间期间压力增加或减少的量，这产生流体动力阻力/流动阻力。

流体动力阻力器可实现为窄通道，例如具有较小的直径。这是因为由通道提供的阻力与通道直径的四次幂大致成反比。换言之，如果通道的直径减少1/2，则通道的阻力增加到16倍。因此，通道的直径越小，阻力越高，并且通道对压力的调节越有效。因此，流体动力阻力器可实现为小直径的通道，因为其提供了比更短、更宽的通道更高的阻力和更好的压力调节。

流体动力阻力器可充当压力调节器或压力控制器，其有助于在微流控装置中防止回流和确保稳定的压力。例如，当向微流控装置中的储器施加压力时，可产生压力脉冲，其可导致样品注射通道中由于突然的流量变化引起的快速压力变化，例如压力的过调节和过冲。这可能导致不期望的流向一个或另一个方向，并破坏系统。通过使用流体动力阻力器，压力脉冲可被减弱或抑制，并且在施加特定压力与在液滴产生点（例如产生液滴的地方）处具有作用之间的响应时间增加，允许更稳定和精确的压力调节。这对于非注射的通道也是重要的，因为在没有流体动力阻力器的情况下系统可能被严重过调节，引起压力脉冲和不期望的双向流动。因此，流体动力阻力器可通过调节或控制压力以及防止回流来维持微流控装置中的稳定性和精确性。

流体动力阻力器可以是特定的通道几何形状，例如收缩部、狭窄部、瓶颈、弯曲部；多孔材料；膜，例如具有受控孔径的膜；水凝胶，例如具有受控溶胀特性的水凝胶；和/或毛细管，例如具有受控内径和长度的毛细管。

根据一个优选的实施方案，流体动力阻力器被实现为通道的一部分中的特定的通道几何形状，更优选为相应通道的一段中的多个转弯或弯曲。根据一个特别优选的实施方案，流体动力阻力器是通道中多个转弯或弯曲的连续排列，所述转弯或弯曲为约170至190°，更优选为约180°，例如如图8A中所例示。流体动力阻力器的多个转弯或弯曲优选地包括4至40个转弯/弯曲，更优选6至30个、8至20个、10至18个、或12至16个转弯/弯曲。根据一个特别优选的实施方案，在通道中多个转弯或弯曲的连续排列中，转弯/弯曲沿着相应通道段均匀分布，被实现为流体动力阻力器。将理解，单个通道可包含不止仅一个流体动力阻力器，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个流体动力阻力器。

本文中使用的术语“实体”是指能够在根据本发明的微流控装置的通道中运输的物质、化合物或颗粒。该术语涵盖例如化学或生物学物质例如药剂、分子药物或化合物、蛋白质或酶和生物分子（例如糖、脂质和激素）。根据一个优选的实施方案，实体是药物（drug），例如化学物质和/或药剂（pharmaceutical）。术语“实体”还包括其最广泛意义上的颗粒。本文中使用的术语“颗粒”包括任何人造或天然的颗粒，其包含、包裹DNA和/或RNA，与DNA和/或RNA连接，由DNA和/或RNA组成，或者以任何其他方式与DNA和/或RNA相关联。在一个优选的实施方案中，它是生物颗粒，优选为细胞、非细胞生命形式、或者DNA和/或RNA载体、或者DNA和/或RNA。颗粒也可以是细胞的转录组或来自细胞的DNA扩增物（amplificate）。最优选地，颗粒是细胞。细胞可以是任何原核或真核细胞。优选地，它是真核细胞，例如酵母细胞、植物细胞或动物细胞。动物细胞包括昆虫、线虫、鱼和哺乳动物细胞。更优选地，它是哺乳动物细胞，例如小鼠、大鼠、猴或人细胞。例如，它可以是（例如来自组织的）异质细胞群的随机细胞，或者它可以是特别选择的细胞，例如通过FACS选择的细胞。此外，它可以是来自（例如原代细胞的）细胞系或同质培养物的细胞，其中“原代”意指直接来源于组织或生物体并且未被操纵以具有改变的特性，例如以无限分裂。细胞的另一些实例是发育中的细胞、干细胞或癌细胞。非细胞生命形式的一些实例是病毒、类病毒、黏粒、质粒、噬菌粒等。DNA和/或RNA载体的一些实例是蛋白质，例如组蛋白或核糖体。还设想了非生物颗粒，例如珠。“珠”（也称为“微珠”）是均匀的聚合物颗粒，其直径为长达1微米，优选为0.5至500 µm，其表面可结合或偶联核酸。珠在本文中通常是指聚乙烯或聚苯乙烯珠或由凝胶基质制成的珠。

术语“条码寡核苷酸”是指具有至少一个所谓的可变区的寡核苷酸，与使用的其他条码寡核苷酸相比，所述可变区的核苷酸序列对于该寡核苷酸来说是独特的。在一个优选的实施方案中，使用了至少两个这样的条码寡核苷酸。或者，条码寡核苷酸可具有至少两个可变区，与使用的其他条码寡核苷酸相比，这些可变区的组合的核苷酸序列对于该寡核苷酸来说是独特的。术语“可变”不意指特定寡核苷酸的序列可以变化，而是指存在这样的寡核苷酸，其除了可变区的序列之外，在结构和序列上相同，即可变区在除此之外结构和序列相同的寡核苷酸之间是不同的。如果条码寡核苷酸包含多于一个可变区，这些可变区中的每一个都来自单独且可组合的组分，所述组分可以以组合的方式进行组装以产生不同的条码寡核苷酸。条码优选地还包含至少一个引物区或者作为替代包含一个或更多个转座元件。

因此，条码寡核苷酸的“组分”本身是寡核苷酸，其具有一个可变区。条码寡核苷酸的“组分组”是恰好构成一种条码寡核苷酸（意指一种身份，而不是一个分子）的多个寡核苷酸，即它是完整的组分组。一组组分凭借其退火区通过退火而组合成优选的线性条码寡核苷酸，其中只有一种线性组合是可能的。因此，在一个组分组内，组分之间的退火区是不同的，但它们的可变区可以是相同的，尽管它们也更可能是不同的。

术语“共定位”基本上是指将两个或更多个实体（例如颗粒或药物）与条码寡核苷酸或其组分放置在一起，优选放置到同一微流控液滴中。这可以如下所述来实现，例如，通过由含有这些实体的水性流体产生微流控液滴、通过单独融合各自包含这些实体之一的液滴、或通过将例如连续水相注射到预形成的微流控液滴中。两个液滴的“融合”产生包含两个来源液滴的内容物的一个微流控液滴。因此，例如，来源于这样的融合的液滴包含含有颗粒的微流控液滴的内容物，以及含有条码寡核苷酸或其组分的微流控液滴的内容物。这样的融合可通过一对一融合实现，例如根据Mazutis et al.（A fast and efficientmicrofluidic system for highly selective one-to-one droplet fusion. Lab Chip(2009) vol. 9 (18) pp. 2665-2672）来实现。另外的液滴融合方法在P. Day et al.(eds.), Microdroplet Technology: Principles and Emerging Applications inBiology and Chemistry, Integrated Analytical Systems, DOI 10.1007/978-1-4614-3265-4_2, # Springer Science+Business Media, LLC 2012, Chapter 2中描述。

在流体或液体的上下文中使用的术语“不混溶”是指不与目标通道中包含实体（例如颗粒）和样品种类（例如条码寡核苷酸或其组分）的流体或液体混溶的流体或液体。不混溶液体优选为疏水性液体，优选为油。油相应具有接近于水的黏度并且/或者相对于包含在其中的生物试剂来说是惰性的。可使用数种油，例如低黏度硅油、或聚二甲基硅氧烷、硅油、烃油。用于本发明的上下文的优选的油是氟碳油（或氟化油），因为即使这些油的低黏度版本也不会溶胀PDMS。表面活性剂可用于降低油-水界面的表面张力和使液滴聚结最小化，并且可因此而存在于不混溶的流体或液体中。在基于液滴的微流控中利用的表面活性剂通常由亲水性头基和疏水性尾组成。这些分子的两亲性特征允许它们在液滴的油-水界面处组装，从而降低其界面张力并增强稳定性。具有非离子头基的表面活性剂是优选的，因为它们使大分子（例如蛋白质和DNA）在液滴界面的吸附最小化，最低限度地影响本发明的方法。可在实验室中容易地合成的合适的含氟表面活性剂是本领域已知的，并且在例如Clausell-Tormos J et al 2008 Chem. Biol. 15, 427–37或Sadtler et al. 1996 Angew. Chem.Int. Edn Engl. 35, 1976–8中描述，并且许多可商购获得，例如从英国的SphereFluidics Limited获得。水相中的添加剂还可通过增加小分子在液滴中的保留和使油-水界面处的吸附最小化来增强生物相容性。可以混合不同的油来优化用于特定应用的乳剂的特性，并且容易地表征所选组合的特性的方法是本领域已知的（Kaltenbach et al. 2012Lab Chip 12, 4185）。

本文中使用的术语“微流控液滴”是指包封水性液体的特定尺寸的水性微区室。微流控液滴的尺寸可例如表示为液滴的直径。该直径通常小于1 mm，例如为约10 µm至900 µm、约20 µm至800 µm、约20 µm至700 µm、约20 µm至600 µm、约20 µm至500 µm、约20 µm至400 µm，并且优选30至350 µm、40至300 µm、40至250 µm、40至200 µm或40至100 µm（其中每个较窄范围相对于前面的较宽范围是优选的，并且范围包含端值）。其他形式的微流控液滴包括细长的液滴，其可被描述为具有圆柱形形状，例如香肠形状，即它们的长度大于宽度。这样的细长的液滴在本文中也称为“塞”，其长度可以为数毫米，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9，并且长至10 mm，优选长度为约0.2 mm至6 mm，更优选为约0.5 mm至5.5 mm，甚至更优选为约1.0 mm至5 mm，并且直径为约300 µm至900 µm，优选为约400 µm至800 µm，更优选为约500 µm至700 µm。根据一个优选的实施方案，塞的直径为约300 µm并且长度为约1 mm至3mm。根据一个优选的实施方案，塞的直径使得其完全填充目标通道。在这样的实施方案中，单个塞可被载体相或载体流体（例如油或水）隔开。或者，微流控液滴的尺寸也可通过体积来限定。例如，其通常小于1微升（µl）。优选地，其小于900纳升（nanolitre，nl）、小于800nl、小于700 nl、小于600 nl、小于500 nl、小于400 nl、小于300 nl、小于250、小于150、小于100或小于50 nl。在一个优选的实施方案中，其为0.05至150 nl，优选为0.05至125 nl、0.05至100 nl、0.05至80 nl、或0.05至4 nl（其中每个较窄范围相对于前面的较宽范围是优选的，并且范围包含端值）。根据一个优选的实施方案，微流控液滴是体积为约500 nl的塞。

术语“产生微流控液滴”是指在不混溶相中产生单分散液滴的流（stream）。这可通过液滴发生器来实现。微流控液滴发生器通过将两股或更多股不混溶流体流组合，并在不连续相上产生剪切力，导致其分散成离散的液滴而运作。优选的液滴发生器是聚焦流（focused-flow）液滴发生器和T型液滴发生器。多种这样的区室化或微囊化程序都是可用的（Benita, S., Ed. (1996). Microencapsulation: methods and industrialapplications. Drugs and pharmaceutical sciences. Edited by Swarbrick, J. NewYork: Marcel Dekker）并且可用于产生根据本发明使用的微流控液滴。事实上，文献（Finch, C. A. (1993) Encapsulation and controlled release. Spec. Publ.-R.Soc. Chem. 138, 35）中已确定了超过200种微囊化或区室化方法。这些包括膜包裹的水性囊泡，例如脂质囊泡（脂质体）（New, R. R. C., Ed. (1990). Liposomes: a practicalapproach. The practical approach series. Edited by Rickwood, D. & Hames, B.D. Oxford: Oxford University Press）和非离子表面活性剂囊泡（van Hal, D. A.,Bouwstra, J. A. & Junginger, H. E. (1996). Nonionic surfactant vesiclescontaining estradiol for topical application. In Microencapsulation: methodsand industrial applications (Benita, S., ed.), pp. 329-347. Marcel Dekker,New York.），其全部通过引用并入本文。优选地，本发明的微流控液滴或微区室由乳剂形成；乳剂是两种不混溶液相的异质系统，其中一相作为微观尺寸的液滴分散在另一相中（Becher, P. (1957) Emulsions: theory and practice. Reinhold, New York;Sherman, P. (1968) Emulsion science. Academic Press, London; Lissant, K.J.,ed Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science New York: MarcelDekker, 1974; Lissant, K.J., ed. Emulsions and emulsion technology.Surfactant Science New York: Marcel Dekker, 1984），其全部通过引用并入本文。乳剂可由不混溶液体的任何合适的组合产生。优选地，本发明的乳剂具有作为以液滴形式存在的相的水相（包含颗粒和其他组分）和作为周围基质的疏水性不混溶液体（优选为油），这些液滴混悬于所述周围基质中。这样的乳剂称为“油包水”。其优点在于水相在离散的液滴中被区室化。外部相（优选为疏水性油）通常是惰性的。乳剂可通过添加一种或更多种表面活性试剂（表面活性剂）来稳定。这些表面活性剂在水/油界面处发挥作用以防止（或至少延迟）相的分离。许多油和许多乳化剂可用于产生油包水乳剂；最近的汇编列出了超过16,000种表面活性剂，其中许多被用作乳化剂（Ash, M. and Ash, I. (1993) Handbook ofindustrial surfactants. Gower, Aldershot），通过引用并入本文。合适的油已在上文提及。

图1示出了根据本文中所述的一些实施方案的用于产生一个或更多个组合微区室的微流控装置（100）。

微流控装置（100）包含目标通道（102）、包含第一样品种类（A）的第一样品种类储器（104）和包含第二样品种类（B）的至少第二样品种类储器（106）。微流控装置（100）最佳还可包含甚至更多的样品种类储器，例如包含第三样品种类（C）的第三样品种类储器（108）和包含第四样品种类（D）的第四样品种类储器（110）。第三和/或第四样品种类（C）和/或（D）也可在化学上和/或生物学上彼此不同以及/或者与种类（A）和（B）中的至少一个不同。

然而，与相应的包含第一样品种类（A）的第一样品种类储器（104）和包含第二样品种类（B）的第二样品种类储器（106）连接的至少两个样品注射通道（114；116）可用于在本文中记载的载体相内产生组合微区室。

如在图1中可以看出，微流控装置（100）包含：第一样品注射通道（114），其包含与第一样品种类储器（104）连接的样品注射通道储器端（114A）和与目标通道（102）连接的样品注射通道接合端（114B）；以及至少第二样品注射通道（116），其包含与第二样品种类储器（106）连接的样品注射通道储器端（116A）和与目标通道（102）连接的样品注射通道接合端（116B）。第一样品注射通道（114）和/或第二样品注射通道（116）的样品注射通道接合端（114B；116B）与目标通道（102）无阀地连接并且包含至少一个流体动力阻力器。

图1中示出的微流控装置（100）还包含：第三样品注射通道（118），其包含与第三样品种类储器（108）连接的样品注射通道储器端（118A）和与目标通道（102）连接的样品注射通道接合端（118B）；以及第四样品注射通道（120），其包含与第四样品种类储器（110）连接的样品注射通道储器端（120A）和与目标通道（102）连接的样品注射通道接合端（120B）。然而，其同样是任选的。第三样品注射通道（118）和/或第四样品注射通道（120）的样品注射通道接合端（118B；120B）也与目标通道（102）无阀地连接并且包含至少一个流体动力阻力器。

从图1的视图可以看出第一样品注射通道（114）和第二样品注射通道（116）分别以其相应的样品注射通道接合端（114B；116B）与目标通道（102）连接。这同样相应地适用于第三和第四样品注射通道（118；120）。为此，第一样品注射通道（114）和第二样品注射通道（116）也可被视为单独或分离的通道或途径，其允许保持例如可包含在第一样品种类储器（104）中的种类（A）和可包含在第二样品种类储器（106）中的种类（B）彼此隔开。因此，这可以防止不同的样品种类混合。

虽然图1中未示出，但一个或更多个组合微区室可流入出口通道或读出通道中。“读出通道”可被视为用于测量或检测流体并且特别是其中产生的一个或更多个（组合）微区室的特性的通道，它们被分析，例如以收集关于（组合）微区室内不同样品或样品种类（例如细胞）的信息。为此，可以使用荧光、发光、电化学和/或质谱。

图1中示出的微流控装置（100）还可包含一个或更多个传感器（114C；116C；118C；120C）。如在图1中可以看出，第一样品注射通道（114）与第一传感器（114C）连接并且第二样品注射通道（116）与第二传感器（116C）连接。这同样可相应地适用于图1中示出的第三和第四样品注射通道（118；120）与第三和第四传感器（118C，120C）。

一个或更多个传感器（114C；116C；118C；120C）可被配置成用于监测与在相应样品注射通道（114，116；118；120）内流动的流体、液体或水性样品（例如相应样品种类）相关的数据。例如，该数据可包括流数据或流量，其指示每单位时间流动或通过相应样品注射通道（114，116；118；120）的流体、液体或水性样品的体积，或者压力数据，例如每单位时间流动或通过相应样品注射通道（114，116；118；120）的流体液体或水性样品的压力。示例性注射流量可以是5至40 µl/分钟，特别是8至17 µl/分钟。优选的压力可选自10毫巴至10巴，特别是100毫巴至5巴，更特别是300毫巴至2000毫巴。一个或更多个传感器（114C；116C；118C；120C）可以是压力传感器和/或流量传感器。

根据一个优选的实施方案，将样品种类（例如条码寡核苷酸或其组分组）从样品种类储器（104，106）供给至目标通道（102）通过一个或更多个传感器或检测工具（114C；116C；118C；120C）来控制。特别地，施加非注射压力P_ni或注射压力P_i的时间点可通过一个或更多个传感器或检测工具来控制。按时间进行的控制也可基于实体（例如颗粒）供给到目标通道中的时间点、其到达和离开注射通道所需要行进的距离、以及颗粒的流动速度。如果例如多个颗粒与样品种类在同一微流控液滴中组合，则按时间进行的控制可以任意或者基于颗粒在目标通道中的频率或密度。检测工具可置于例如相应注射通道的开端和/或结尾处，以及/或者样品种类储器上方或附近，并在检测到颗粒后触发施加非注射压力P_ni或注射压力P_i。如果将一个或更多个检测工具置于距相应注射通道的开端和/或结尾一定的距离处，也可以使用上述两者的组合。在这样的情况下，控制可基于检测到颗粒的时间、其到达和离开一系列寡核苷酸入口所需要行进的距离、以及颗粒的流动速度。用于检测微流控通道中的颗粒的检测工具是本领域公知的，并且包括光传感器（例如光电倍增管、CMOS或CCD相机）、检测电极或流量传感器（例如空气流量传感器）。通常来说，检测工具适合于检测颗粒和/或与颗粒连接的标记，特别是荧光标记，并且可使用荧光或激光光谱、成像、阻抗或磁性测量来进行检测。

在一个特别优选的实施方案中，一个或更多个检测工具或传感器在第一样品注射通道接合端（114B）上游的10 mm至50 mm内，优选1 mm至30 mm内，并且更优选200 µm至500µm内，其中上游意指载体相使颗粒流经目标通道的来向方向。因此，布置在样品注射通道接合端上游的检测工具或传感器意指该检测工具或传感器位于目标通道上，在载体相使颗粒流经目标通道的来向方向。检测工具或传感器也可位于不仅仅是第一样品注射通道接合端（114B）的上游，例如每个第二样品注射通道接合端的上游或甚至每个样品注射通道接合端的上游。另一个实施方案也包括在内，其中检测工具在目标通道中微流控液滴产生处的下游。

图1中示出的微流控装置（100）还可包含一个或更多个压力控制装置（114D；116D；118D；120D）。第一压力控制装置（114D）可与第一样品种类储器（104）连接并且至少第二压力控制装置（116D）可与第二样品种类储器（106）连接。这同样可相应地适用于第三和第四压力控制装置（118D；120D）与第三和第四样品种类储器（108，110）。

压力控制装置（114D；116D；118D；120D）可与压力源（122）连接，该压力源可用于在微流控装置（100）中产生压力。压力源（122）的一个实例可以是注射泵、气动泵和压电泵。

压力控制装置（114D；116D；118D；120D）可用于提供正压和负压二者，并且可被编程为以多种方式操作，例如具有恒定压力、恒定流量或逐步压力变化。压力控制装置（114D；116D；118D；120D）被配置成向样品种类储器（104；106；108；110）施加不同压力，包括用于注射的压力或“注射压力P_i”和用于非注射的压力或“非注射压力P_ni”。

例如，第一压力控制装置（114D）可被配置成向第一样品种类储器（104）施加第一注射压力P_i以引起经由第一样品注射通道（114）注射第一样品种类（A），并且第二压力控制装置（116D）可被配置成向第二样品种类储器（106）施加第二注射压力P_i以引起经由第二样品注射通道（116）注射第二样品种类（B）。第一注射压力P_i和第二注射压力P_i可以相同或不同。

“注射压力”（P_i）可理解为用于注射所施加的压力，例如（正）压力，其驱动流体、液体或水性样品从样品种类储器（104；106；108；110）经过样品注射通道（114；116；118；120）至目标通道（102）。注射压力可通过压力控制装置（114D；116D；118D；120D）施加（例如直接施加）在相应的样品种类储器（104；106；108；110）处。示例性注射压力P_i可在10毫巴至10巴，特别是20毫巴至7巴、100毫巴至5巴、60毫巴至4巴，更特别是125毫巴至2000毫巴、或300毫巴至2000毫巴的范围内。这样的注射压力导致注射流量在1至500 µl/分钟，特别是1至100 µl/分钟，更特别是8至17 µl/分钟的范围内。然而，这些示例性流量可以调节或改变，例如取决于连接至出口的管/通道等的长度。

压力（P_i或P_ni）可通过技术人员已知的相应方式产生，例如通过（外部）压力源，例如（外部）机械泵（例如注射泵、气动泵和压电泵），或者通过（集成）微型泵（例如机械微型泵）。微型泵优选选自注射微型泵、气动膜微型泵、压电微型泵、Braille销微型泵、电化学微型泵、电渗微型泵、声学微型泵、磁流体动力微型泵、电流体动力微型泵和气体渗透微型泵；更优选地，主动微型泵独立地选自注射微型泵、气动膜微型泵和Braille销微型泵。

压力控制装置（114D；116D；118D；120D）可与样品注射通道（114；116；118；120）的相应传感器（114C；116C；118C；120C）通信地耦合以基于通过样品注射通道（114；116；118；120）的相应传感器（114C；116C；118C；120C）所监测的流数据来调节压力（例如一种或更多种注射压力P_i或者一种或更多种非注射压力P_ni）。

例如，第一压力控制装置（114D）可与第一样品注射通道（114）的第一传感器（114C）通信地耦合并且第二压力控制装置（116D）可与第二样品注射通道（116）的第二传感器（116C）通信地耦合，其中第一和第二注射压力P_i分别基于所监测的第一样品注射通道（114）和第二样品注射通道（116）中液体的流数据来施加。

毋庸置疑，第三压力控制装置（118D）可与第三样品注射通道（118）的第三传感器（118C）通信地耦合并且第四压力控制装置（120D）可与第四样品注射通道（120）的第四传感器（120C）通信地耦合，其中第三和第四注射压力P_i分别基于所监测的第三样品注射通道（118）和第二样品注射通道（120）中液体的流数据来施加。

当施加注射压力P_i时，例如在一个或更多个样品种类储器（104；106；108；110）上施加时，一个或更多个样品种类经由一个或更多个样品注射通道（114；116；118；120）被注射例如到目标通道（102）中。在经由一个样品注射通道（例如第一样品注射通道（114））进行注射期间，一个或更多个其他样品注射通道（例如第二样品注射通道（116）和/或第三样品注射通道等）也可以是注射或非注射的。在后一种情况下，“非注射”应理解为基本上没有流体、液体或水性样品的流离开相应的样品注射通道，例如在样品注射通道接合端处。没有注射样品种类（例如在第一时间）的样品注射通道可称为“非注射通道”。因此，注射样品种类（例如在第一时间或在不同于第一时间的第二时间）的样品注射通道可称为“注射通道”。

根据本发明的一些实施方案，还向非注射通道施加压力。这样的压力可称为“非注射压力”（P_ni）。例如，非注射压力可在1毫巴至5600毫巴或10毫巴至10巴，特别是100毫巴至5巴，50毫巴至3200毫巴，更特别是300毫巴至2000毫巴或100毫巴至1600毫巴的范围内。这样的非注射压力P_ni导致流体、液体或水性样品的流量基本上为零，例如其流量低于约30 μl/小时，特别是低于约20 μl/小时。

第一和第二压力控制装置（114D；116D）被配置成在每个非注射的样品注射通道（114；116）的每个样品种类储器（104；106）上维持非注射压力P_ni。优选的是，非注射压力P_ni低于第一和第二注射压力Pi并遵循关系：P_i > P_ni > P_大气。P_大气优选是指当没有施加其他压力例如注射压力P_i和非注射压力P_ni时，作用于装置上的环境的压力（pressure of theenvironment）或环境压力（ambient pressure），并且特别是指作用于样品种类储器上的压力。每个压力控制装置（114D；116D；118D；120D）都进一步被配置成随时间增加非注射压力P_ni。

例如，非注射压力P_ni可以以如下方式增加：逐渐或持续地增加，例如以稳定的增加量；逐步地增加，例如在离散的步骤中，其中每一步之间有一段稳定期；脉冲式增加，例如在一系列短的尖锐的脉冲中，其中每个脉冲之间有一段稳定期；和/或随机增加，例如随时间随机变化。因此，第一和第二压力控制装置（114D；116D）被配置成随时间增加每个非注射的样品注射通道（114；116）的每个样品种类储器（104；106）上的非注射压力P_ni。这同样适用于第三和第四压力控制装置（118D；120D）。

如图1中所示，目标通道（102）可包含在微流控芯片（124）内，其可用于在芯片（124）内将流体（包括相应的水性样品或区室）从一个位置运输或移动至另一位置。

图1中示出的微流控装置（100）可用于例如癌症治疗领域和/或用于组合药物筛选。特别地，根据本文中所述的一些实施方案的微流控装置（100）允许高水平的自动化，其具有针对主要读出的不同选择，例如荧光光谱、测序、成像等。

另外，一个或更多个（组合）微区室（例如使用图1中示出的微流控装置（100）产生的）可用于高通量筛选应用。虽然在例如使用微量滴定板的常规系统中需要约20,000个细胞，但是在微流控装置（100）中仅需要约100个细胞来测试对癌细胞的单一治疗选择。

此外，与Braille阀微流控系统（其中细胞被连续注射至液滴制造器或废料）相比，无阀设置仅在液滴产生期间消耗细胞（没有细胞前往废料中）。因此，总的细胞消耗为约三分之一。

如以下进一步详细讨论的，微流控装置（100）使得能减少或防止微流控回流，例如液体、流体或水性样品非预期地从一个样品注射通道（114；116；118；120）或一个组合微区室（200A；200B）流入一个或更多个其他样品注射通道（114；116；118；120）或者另一组合微区室（200A；200B）中。为此，例如相邻通道、微区室和/或组合微区室之间的交叉污染可降低并且液体、流体或水性样品可保持分开。因此，可以减少或避免样品无意的混合。

此外，由于微流控装置（100）包含至少一个流体动力阻力器的事实，因突然的流量变化和/或压力变化而引起的样品注射通道中压力的过调节和过冲被平衡、降低、防止或最小化。

图2A示出了与目标通道（102）连接的第一样品注射通道（114）和第二样品注射通道（116）的示意图。图2A示出了在不使用流体动力阻力器（未示出）的情况下注射第一样品种类（A）和第二样品种类（B）。

如在图2A中可以看出，第一样品注射通道（114）以其样品注射通道接合端与例如微流控芯片（124）的目标通道（102）连接。第二样品注射通道（116）以其样品注射通道接合端与例如微流控芯片（124）的目标通道（102）连接。在图2A中，第一样品注射通道（114）是注射通道，即当前（例如在第一时间期间）在目标通道（102）中注射第一样品种类（A），而第二样品注射通道（116）是非注射通道，即当前（例如在第一时间期间）不注射第二样品种类（B）。这可以在图2A的所得微区室（202）中看到，作为一个实例，其仅包含样品种类（A）。

如在图2A中可以进一步看出，第一样品种类（A）不仅最终进入目标通道（102）中，例如在其中形成微区室（202），而且还进入了旨在用于注射第二样品种类（B）的第二样品注射通道（116）。因此，这种回流导致例如所产生微区室（202）的显著交叉污染，特别是在例如不同于第一时间的第二时间期间当第二样品注射通道（116）变成注射通道时，即当其用于注射第二样品种类（B）时，因为剩余痕量的第一样品种类（A）将与其共注射。

尽管在图2A中未示出，但是这样的回流和/或交叉污染不仅可流入当前非注射的（相邻）样品注射通道中，例如第二样品注射通道（116）中，而且甚至还可流入第二样品种类储器（106）中。这同样相应地适用于图1中示出的微流控装置（100）中存在的其他非注射的样品注射通道。

如在图2A的实施方案中可以进一步看出，所产生微区室（202）大小不等，并且具有不均匀的形状，例如微区室（202）体积大、变形或扭曲，这归因于与图2A中看到的回流相关的压力差和/或与因突然的流量变化引起的过冲或过调节相关的压力/流量差。对于组合微区室（参见例如图2C的组合微区室（200A；200B）），这还可产生交叉污染的组合微区室，即其中混合了两个种类。

图2B示出了如图2A中所示的与目标通道（102）无阀地连接的第一样品注射通道（114）和第二样品注射通道（116）的示意图。图2B示出了根据本公开内容的一些实施方案使用流体动力阻力器（未示出）来注射第一样品种类（A）和第二样品种类（B）。

在图2B的实施方案中，第一样品注射通道（114）以其样品注射通道接合端与例如微流控芯片（124）的目标通道（102）无阀地连接。同样地，第二样品注射通道（116）以其样品注射通道接合端与例如微流控芯片（124）的目标通道（102）无阀地连接。第一样品注射通道（114）和/或第二样品注射通道（116）的样品注射通道接合端（114B；116B）包含至少一个流体动力阻力器（未示出）。

在图2B中，第一样品注射通道（114）是注射通道，即当前（例如在第一时间期间）在目标通道（102）中注射第一样品种类（A），而第二样品注射通道（116）是非注射通道，即当前（例如在第一时间期间）不注射第二样品种类（B）。这可以在图2B的所得微区室（202）中看到，作为一个实例，其仅包含样品种类（A）。

如在图2B中可以看出，第一样品种类（A）未最终进入旨在用于注射第二样品种类（B）的第二样品注射通道（116）中。这是由于在当前（例如在第一时间期间）非注射的样品注射通道（116）的第二样品种类储器（106）上维持了非注射压力P_ni并且结合无阀连接使用了流体动力阻力器的事实。因此，避免了第二样品注射通道（116）中样品种类（A）的“回流”。这降低或防止了交叉污染，特别是在例如不同于第一时间的第二时间期间当第二样品注射通道（116）变成注射通道时，即当其用于注射第二样品种类（B）时，因为将没有剩余痕量的第一样品种类（A）与其共注射。此外，与因突然的流量变化引起的过冲或过调节相关的压力和/或流量差可被平衡、降低、防止或最小化。

另外，与图2A的所产生微区室（202）相比，图2B的所产生微区室（202）大小更均等，并且具有更均匀（例如连续）的形状，这是减少或避免回流，即因为在非注射的第二样品注射通道（116）的样品种类储器（106）上维持非注射压力P_ni结合使用流体动力阻力器的结果。

应注意，尽管图2A和2B描绘了微区室（202）的产生，但这些实施方案不限于此，即第一和第二样品注射通道（114；116）同样可用于产生如图2C中所示的组合微区室（200A；200B），例如其包含第一样品种类（A）和第二样品种类（B）的混合物。

图2C示出了根据本公开内容的一些实施方案在目标通道（102）的载体相内产生的不同微区室的示意图，例如，根据本公开内容的一些实施方案，在非注射的第二样品注射通道（116）的样品种类储器（106）上维持非注射压力P_ni并使用至少一个流体动力阻力器所产生的不同微区室。

特别地，图2C示出了两个包含至少两个样品种类（例如具有不同组成）的组合微区室（200A；200B）和包含仅一个样品种类的微区室（202）。第一个组合微区室（200A）包含第一样品种类（A）和第二样品种类（B）。第二个组合微区室（200B）包含多个样品种类（A至D），包括第一样品种类（A）、第二样品种类（B）、第三第二样品种类（C）和第四第二样品种类（D）。样品种类（A至D）可在化学上和/或生物学上不同。组合微区室（200A）中样品种类的数量不受限制，只要包含至少两个样品种类即可。

图2C的两个组合微区室（200A；200B）和微区室（202）已例如通过图1中所示的微流控装置（100）产生，并且从而具有均匀的形状和/或大小均等。如关于组合微区室（200A；200B）可以进一步看出，所产生组合微区室（200A；200B）内不同的样品种类（A至D）之间不存在交叉污染。相反，样品种类（A至D）彼此明显隔开、分离或不同。

图3示出了根据本文中所述的一些实施方案的方法（300）的流程图。如图3中所示，方法（300）用于提供一个或更多个组合微区室（200A；200B），其各自包含至少两个样品种类（A；B）。该方法包括将来自第一样品种类储器（104）的第一样品种类（A）经由第一样品注射通道（114）注射（302）到目标通道（102）的载体相的连续流中以产生微区室（202），以及将来自第二样品种类储器（106）的至少一个第二样品种类（B）经由第二样品注射通道（116）注射（304）到所产生的微区室（202）中以产生组合微区室（200）。该方法还包括使用至少一个流体动力阻力器在第一注射通道（114）和/或第二注射通道（116）中提供（306）阻力。根据一个优选的实施方案，第一样品种类和至少一个第二样品种类是条码寡核苷酸或其组分组。优选地，第一样品种类的条码寡核苷酸或其组分组不同于至少一个第二样品种类的条码寡核苷酸或其组分组。

阻力可以是流体动力阻力。阻力可在i）注射（302）第一样品种类（A）和/或注射（304）第二样品种类（B）以及ii）不注射第一样品种类（A）和/或不注射第二样品种类（B）期间提供。

第一样品种类（A）和第二样品种类（B）可通过向相应的第一种类储器（104）和第二种类储器（106）施加注射压力P_i来注射，同时在每个非注射的样品注射通道（114；116）的每个样品种类储器（104；106）上可维持低于该注射压力P_i的非注射压力P_ni。

方法可任选地包括重复（306）步骤（302；304）以产生另一组合微区室的步骤，以在目标通道（102）的载体相内产生一系列组合微区室。

在根据图3的方法中，注射第二样品种类（B）可与注射第一样品种类（A）依次发生或同时发生。也就是说，在第一时间期间，可注射第一样品种类（A）和第二样品种类（B）二者。或者，第一样品种类（A）可在第一时间注射，并且第二样品种类（B）可在不同于第一时间的第二时间注射，或反之亦然。

在图3的方法中，第一样品种类（A）未最终进入旨在用于注射第二样品种类（B）的第二样品注射通道（116）中。这是由于在第二样品种类储器上维持非注射压力P_ni以及使用至少一个流体动力阻力器在第一注射通道（114）和/或第二注射通道（116）内提供阻力的事实。因此，减少或避免了样品种类（A）从第一样品注射通道（114）向第二样品注射通道（116）中的“回流”。此外，与因突然的流量变化引起的过冲或过调节相关的压力和/或流量差可被平衡、降低、防止或最小化。此外，这避免了交叉污染，例如在第二样品注射通道（116）被用于注射第二样品种类（B）时，因为将没有剩余痕量的第一样品种类（A）与其共注射。

图4A示出了在没有在非注射的样品种类储器上维持非注射压力P_ni的情况下样品注射期间的压力谱。图4A的x轴示出了以秒计的时间，而图4A的y轴示出了以毫巴计的压力。

在图4A的图中，可以清楚地看见，在没有维持非注射压力P_ni的情况下，呈现或出现不规则的压力谱或压力峰，其表明不期望的回流和因此发生交叉污染的高度可能性。由此产生的（组合）微区室可能不太均匀且大小不等（参见例如图2A中产生的微区室）。这还可能导致因突然的流量变化而引起的过冲或过调节。

在另一方面，图4B示出了根据本公开内容的一些实施方案，在维持非注射压力P_ni和使用流体动力阻力器的情况下样品注射期间的压力谱。图4B的x轴示出了以秒计的时间，而图4B的y轴示出了以毫巴计的压力。

可以看到，与图4A中所示的测量值相比，压力峰的压力谱相当均匀，导致形成大小均等且未被污染的（组合）微区室（参见例如图2B或图2C）。对于微区室（参见例如图2C），这也可导致减少或防止交叉污染，以及减少因突然的流量变化而引起的过冲或过调节。

应注意，在图4B中，压力的线性增加是因为例如目标通道（102）（参见图1）中的背压随着样品数量的增加而增加。

图5A示出了在没有维持非注射压力P_ni的情况下样品注射期间的流量谱。图5A的x轴示出了以秒计的时间，而图5A的y轴示出了以μl/分钟计的流量。

期望图5A所示的流量谱尽可能彼此相似，因为这样做将导致由其产生的（组合）微区室均匀和/或大小均等。这还减少了交叉污染。

应注意，在图5A的图中，y轴上的流量包含正值和负流量值。可以看到，对于第二样品种类B（其对应于图5A的图中的样品2），观察到了负（小于零）流量。这样的负流量表示如上所述的相邻样品注射通道之间不期望的回流和交叉污染（参见例如图2A）。

如在图5A中可以看出，观察到由相邻样品注射通道之间的负流量表示的“回流”，导致样品种类（A）（其对应于图5A的图中的样品1）与样品种类（B）（其对应于图5A的图中的样品2）之间的显著交叉污染。

在另一方面，图5B示出了根据本公开内容的一些实施方案，维持非注射压力P_ni和使用流体动力阻力器的情况下的流量谱。图5A的x轴示出了以秒计的时间，而图5A的y轴示出了以μl/分钟计的流量。

如在图5B中可以看出，与相邻通道之间的回流相关的负流量显著降低（基本上为零），由此避免了相邻样品注射通道之间的交叉污染。为此，实现了更均匀的流量，导致形成大小均等且未被污染的（组合）微区室（参见例如图2B和图2C）。对于组合微区室，这也可导致减少或防止交叉污染（参见例如图2C）。

图5C示出了在维持非注射压力P_ni但不使用流体动力阻力器的情况下微流控芯片的另一流量谱。图5C的x轴示出了以秒计的时间，而图5C的y轴示出了以μl/分钟计的流量。

图5C还示出了在注射三种样品（样品1至3）时流量是如何随时间变化的。在注射开始时，发生突然的流量变化，例如过冲，其中流量短暂地超过期望或目标流量，然后回落或返回目标流量。也就是说，在图5C中，过冲峰表示流量超过期望流量的情况。这些过冲或峰可对微流控系统中流量的准确性和一致性具有负面影响，导致回流和交叉污染。

为了测量交叉污染，如图6A、6B和6C中的情况，使用了不同注射用荧光团（例如绿色、橙色和蓝色荧光染料）的样品来产生微区室。荧光染料是这样一类分子，其在一个波长下吸收光并在更长的波长下重新发射光，产生不同颜色的可见荧光，例如取决于所使用的荧光团。这些染料可用于使微区室内的具体结构可视化或追踪细胞内分子的运动。在这种情况下，荧光染料可用于检测（组合）微区室内的交叉污染。荧光染料可用特定光源激发以产生明亮且可易于检测的荧光信号，其可指示交叉污染。

图6A示出了在没有维持非注射压力P_ni的情况下产生的包含至少两个样品种类（A；B）的组合微区室中交叉污染的测量结果。

在图6A的实例中，在微区室中注射绿色、橙色和蓝色荧光染料以产生组合微区室（200A；200B）（即包含至少两个样品种类）的同时监测交叉污染。在图6A的实施方案中，在没有维持非注射压力P_ni的情况下产生组合微区室。图6A的x轴示出了以秒计的时间，而图6A的y轴示出了以任意单位计的荧光强度，例如不基于任何国际公认的标准，而是基于由实验者选择的任意标度（包括0至6 A.U.的值）的测量单位。

对于荧光分析，可以使用Z因子。Z因子可以是用于评价测定质量的统计学量度，或者在这种情况下，用于评价组合微区室内样品种类的统计学量度。因此，Z因子可对应于指示组合微区室中至少两个种类之间的交叉污染的量度，因为交叉污染改变了荧光读数并例如降低了Z因子。通常Z因子为0.5至1.0被认为是良好的（例如不具有交叉污染或交叉污染减少），而低于0.5的值或甚至负的Z因子值指示组合微区室内种类之间的交叉污染。

如在图6A中示出的测量结果中可以看出，荧光响应相当不均匀，指示了荧光染料之间的交叉污染。针对绿色荧光染料测量的Z因子为-4.03，针对橙色荧光染料测量的Z因子为-0.726，并且针对蓝色荧光染料测量的Z因子为-1.462。

在图6A中示出的测量结果中，在没有维持非注射压力P_ni的情况下产生的组合微区室中测量的Z因子为负数，指示了组合微区室内之间的显著交叉污染。

在图6B的实施方案中，在微区室中注射绿色、橙色和蓝色荧光染料以产生组合微区室（200A；200B）（即包含至少两个样品种类）的同时监测交叉污染。在图6B的实施方案中，根据本公开内容的一些实施方案，在维持非注射压力P_ni和使用流体动力阻力器的情况下产生组合微区室。图6B的x轴示出了以秒计的时间，而图6B的y轴示出了以任意单位计的荧光强度，例如不基于任何国际公认的标准，而是基于由实验者选择的任意标度（包括0至1 AU的值）的测量单位。

在图6B中示出的测量结果中可以看出，荧光响应相当均匀，指示了与图6A中示出的测量结果相比，荧光染料之间的交叉污染显著减少。针对绿色荧光染料测量的Z因子为0.612，针对橙色荧光染料测量的Z因子为0.74，并且针对蓝色荧光染料测量的Z因子为0.714。

在图6B中示出的测量结果中，根据本公开内容的一些实施方案通过维持非注射压力P_ni和使用流体动力阻力器而产生的组合微区室中测量的Z因子不仅是正值，而且还在0.5至1.0的范围内，指示了与图6A中示出的测量结果相比，组合微区室内的交叉污染显著减少或被避免。

图6B中测量的组合微区室是使用图1中示出的微流控装置（100）和/或图3中示出的方法产生的。

图7A示出了在不使用流体动力阻力器的情况下用微流控芯片记录的流量数据（即回流和过冲），而图7B示出了根据本公开内容的一些实施方案在使用流体动力阻力器同时维持非注射压力P_ni二者的情况下用微流控芯片记录的流量数据（即回流和过冲）。

图8A示出了根据本发明的微流控芯片的一个特别优选的实施方案，其包括被实现为在相应通道中的约180°弯曲或转弯的流体动力阻力器。图8B示出了不含流体动力阻力器的微流控装置。

当比较所记录的回流和/或所记录的过冲二者时，可以看出，并入了流体动力阻力器的微流控芯片的回流和/或过冲的发生率与没有并入流体动力阻力器的微流控芯片相比显著更低。

根据另一个方面，本发明提供了用于在微流控装置中将实体与条码寡核苷酸或其组分组共定位的方法。用独特标识符对细胞mRNA进行条码标记（例如在cDNA合成期间并入独特的核苷酸序列）被广泛用于基因组应用中（A. E. Saliba, A. J. Westermann, S. A.Gorski, J. Vogel, Single-cell RNA-seq: advances and future challenges.Nucleic Acids Research 42, 8845 (2014)），并且相应的方法例如在WO 2016/207441中描述，其通过引用整体并入本文。

在用于将实体与条码寡核苷酸或其组分组共定位的方法中使用的微流控装置优选是本文中公开的装置。就图1而言，该装置优选包含目标通道（102）（其优选包含目标通道流体，例如载体相）、包含第一条码寡核苷酸或其组分组形式的第一样品种类（A）的第一样品种类储器（104）、以及包含第二条码寡核苷酸或其组分组的形式的第二样品种类（B）的至少第二样品种类储器（106）。载体相优选是不混溶相，更优选是不混溶流体。第一和至少一个第二条码寡核苷酸或其组分组可以是相同或不同的。根据一个优选的实施方案，第一和至少一个第二条码寡核苷酸或其组分组彼此不同。应理解，该装置可不仅包含具有第一和第二条码寡核苷酸或其组分组的第一和第二样品种类储器，其可包含例如具有相应数量的条码寡核苷酸或其组分组的多个三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个，例如35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、140、160、180或200个样品种类储器。在图1的实施方案中，示出了第三和第四样品种类储器（108，110）。根据一个优选的实施方案，多个样品种类储器中的相应条码寡核苷酸或其组分组彼此不同。

该装置优选地还包含第一样品注射通道（114），其包含与第一样品种类储器（104）连接的样品注射通道储器端（114A）和与目标通道（102）连接的样品注射通道接合端（114B）。该装置同样地包含至少第二样品注射通道（116），其包含与第二样品种类储器（106）连接的样品注射通道储器端（116A）和与目标通道（102）连接的样品注射通道接合端（116B）。应理解，该装置可不仅包含含有样品注射通道储器端和样品注射通道接合端的第一和第二样品注射通道，其可包含例如三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个，例如35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、140、160、180、200或更多个样品注射通道，它们各自包含样品注射通道储器端和样品注射通道接合端。在图1的示例性实施方案中，示出了具有相应注射通道（118，120）的第三和第四样品注射通道（118，120）。第一样品注射通道（114）和至少一个第二样品注射通道（116）的样品注射通道接合端（114B，116B）与目标通道（102）无阀地连接。术语“无阀地”应理解为以上本文中所限定的。该术语优选地意指在通道的连接处没有提供阀，并且更优选地，在样品注射通道和它们与目标通道和与相应样品种类储器的接合处之间的任何地方都没有提供阀。

根据一个实施方案的注射通道是整体式通道。根据一个替代实施方案，注射通道可由两个或更多个不同段构成。在一个这样的实施方案中，注射通道具有与样品种类储器连接的第一段（例如管）和与目标通道连接的第二段（例如微通道）。第一段和第二段可通过适配的方式相互连接。在第一段和第二段具有不同直径的情况下，适配器可具有锥形形状，允许直径不同和/或由不同材料制成的两个通道段的连接。

根据一个特别优选的实施方案，每个样品注射通道包含至少一个流体动力阻力器。流体动力阻力器如本文中所限定并且优选被实现为通道的一部分中的特定的通道几何形状，更优选为相应通道的一段中的多个转弯或弯曲。根据一个特别优选的实施方案，流体动力阻力器是通道中多个转弯或弯曲的连续排列，所述转弯或弯曲为约170°至190°，更优选为约180°，例如如图8A中所例示。流体动力阻力器的多个转弯或弯曲优选地包括4至40个转弯/弯曲，更优选6至30个、8至20个、10至18个、或12至16个转弯/弯曲。根据一个特别优选的实施方案，在通道中多个转弯或弯曲的连续排列中，转弯/弯曲沿着通道段均匀分布，充当流体动力阻力器。根据另一个优选的实施方案，从流体动力阻力器中的一个转弯或弯曲到流体动力阻力器中接下来的下一个转弯或弯曲的距离基本上相同。应理解，单个通道可包含不止仅一个流体动力阻力器，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个流体动力阻力器。

用于在微流控装置中将实体与条码寡核苷酸或其组分组共定位的方法包括作为第一步将实体供给到目标通道中。目标通道优选是本文中公开的装置之一的目标通道（102）。实体优选是物质，例如药物或颗粒，所述颗粒优选包含核酸（优选DNA和/或RNA）。根据一个优选的实施方案，颗粒是细胞。根据另一个优选的实施方案，颗粒是药物。

在第二步中，方法包括使实体经过第一样品注射通道和至少一个第二样品注射通道，其中样品注射通道之一将条码寡核苷酸或其组分组从第一或至少一个第二样品种类储器经由相应样品注射通道和相应样品注射通道接合端供给至目标通道。这通过向相应的第一和至少一个第二样品种类储器之一施加注射压力（P_i）从而将条码寡核苷酸或其组分组注射到目标通道中来完成。第一和至少一个第二样品注射通道、第一和至少一个第二样品种类储器以及相应的注射通道接合端优选如本文中所限定。因此，根据一个优选的实施方案，第二步包括使实体经过第一样品注射通道（114）和至少一个第二样品注射通道（116），其中通过向相应的第一和至少一个第二样品储器（104，106）之一施加注射压力（P_i），样品注射通道之一将条码寡核苷酸或其组分组从样品种类储器（104，106）经由相应样品注射通道（114，116）和相应样品注射通道接合端（114B，116B）供给至目标通道（102），从而将条码寡核苷酸或其组分组注射到目标通道（102）中。

在任选的第三步中，方法包括重复第二步。这种重复不限于单次重复，而是可涉及多次重复，其可根据个体需求来选择。当重复第二步时，根据一个优选的实施方案，第一样品注射通道和至少一个第二样品注射通道中的另一个将条码寡核苷酸或其组分组从相应的第一和至少一个第二样品种类储器中的另一个供给至目标通道。因此，根据一个优选的实施方案，当在第二步中条码寡核苷酸或其组分组从第一样品种类储器经由第一样品注射通道供给到目标通道中时，第三步中的条码寡核苷酸或其组分组从至少一个第二样品种类储器经由至少一个第二样品注射通道供给到目标通道中。根据情况和个体需求，在有或没有交替从第一和至少一个第二样品种类储器供给条码寡核苷酸或其组分组的情况下，第三步可重复多次。可以设置方法步骤（ii）从相同或不同的样品种类储器供给条码寡核苷酸或其组分组的特定重复顺序，以满足个体需求。因此应理解，本发明不限于从任何特定样品种类储器供给的任何特定顺序，而是可以相应地进行调整。这同样适用于样品种类储器和相应注射通道的数目。

根据本发明的一个特别优选的实施方案，方法还包括在非注射阶段期间向第一样品种类储器（104）和/或至少一个第二样品种类储器（106）施加非注射压力（P_ni）。非注射压力P_ni优选大于环境的压力（P_大气）。环境的压力或环境压力是指当没有施加其他压力例如注射压力P_i和非注射压力P_ni时，作用于装置上的压力，并且特别是指作用于样品种类储器上的压力。因此其可能与装置周围的压力相同。然而，如果作用于装置的组件并且特别是作用于样品种类储器的装置内压力不同于该装置周围的压力，则环境的压力是指作用于样品种类储器的压力。根据一个优选的实施方案，P_i大于P_ni，并且P_ni大于P_大气。根据一个特别优选的实施方案，P_i与P_ni之间的比率为约1.25至约2.5，优选为约1.5至约2.25、约1.75至约2.0，最优选为约2.0。

根据一个优选的实施方案，P_ni为约5至5600毫巴并且P_i为约10至7000毫巴，更优选地，P_ni为约50至3200毫巴并且P_i为约60至4000毫巴，最优选地，P_ni为约100至1600毫巴并且P_i为约125至2000毫巴。根据本发明，所有表示的压力都高于（即附加于）环境压力或P_大气，换言之，表示的压力值是表压值。

根据本发明，当向一个样品种类储器施加注射压力P_i时，同时向其他样品种类储器施加非注射压力P_ni，以防止任何来自注射样品种类储器和注射通道的样品种类进入非注射通道。将理解，根据装置和方法相应的实际使用，同时向不止一个样品种类储器施加注射压力P_i以允许进行来自不同样品种类储器的条码寡核苷酸或其组分组的受控混合。然而，在大多数情况下，仅向单个样品种类储器施加注射压力P_i，而与此同时，即只要向一个样品种类储器施加注射压力P_i，便向所有其他样品种类储器施加非注射压力P_ni。

根据本发明的一个优选的实施方案，每个非注射的样品注射通道的每个样品种类储器上的非注射压力P_ni随时间增加。如果非注射压力P_ni随时间增加，它仍然不会超过注射压力P_i，并且P_i与P_ni之间的比率优选保持在约0.25至约2.5。

根据本发明的一个优选的实施方案，注射压力（P_i）和非注射压力（P_ni）是通过对第一样品种类储器（104）和/或至少一个第二样品种类储器（106）加压而产生的。这优选在压力控制装置的控制下完成，例如图1中示例性地示出的压力控制装置（114D、116D、118D、120D）。一种优选的压力控制装置是微流控流量调节器，例如微流控流量控制系统（Microfluidic Flow Control System，MFCS）。

根据本发明的一个实施方案，将条码寡核苷酸或其组分组从样品种类储器供给至目标通道通过一个或更多个检测工具或传感器来控制。检测工具或传感器如上所限定，并且在图1中分别用附图标记114C、116C、118C和120C示例性地示出。应理解，图1中示出的布置仅仅是一个实例，且因此不限制本发明。因此，检测工具或传感器可作为替代或补充置于装置中的其他位置，例如，在相应注射通道的开端和/或末端处，在目标通道上，或者在样品种类储器处或附近，例如在样品种类储器与样品种类储器到微流控装置外部（例如，到用于用样品种类来填充样品种类储器的填充线）的连接之间。用于检测颗粒的检测工具（也称为颗粒检测工具）和微流控通道中的其他组件是本领域公知的，并且包括光传感器，例如光电倍增管、CMOS或CCD相机、或者检测电极。通常来说，检测工具适合于检测颗粒和/或与颗粒连接的标记，特别是荧光标记，并且可使用荧光或激光光谱、成像、阻抗或磁性测量来进行检测。根据一个优选的实施方案，检测工具是传感器，优选是流量传感器，例如基于例如微机电系统（micro-electromechanical system，MEMS）技术的高度灵敏的微流控流量传感器。另一个优选的检测工具是例如高精度热流量传感器，其特别可用于监测液体和细胞的流量。可用于本发明的上下文中的另外的传感器是例如科里奥利质量流量传感器（coriolis mass flow sensor）。根据一个优选的实施方案，传感器是检测供给到样品种类储器中的流体的流量传感器。例如，这样的流量传感器检测气体（例如空气）的量，其跟随从样品种类储器供给到相应注射通道中的样品种类的量。换言之，对于从样品种类储器供给到注射通道中并随后供给到目标通道中的每个体积的样品种类，相应体积的流体（例如空气）进入样品种类储器。流量传感器被布置成使得其能够检测进入样品种类储器的流体的体积。作为补充或替代，该装置可包含检测工具或传感器，其布置在相应注射通道的一端和/或另一端（即在注射通道与样品种类储器的接合处和/或在注射通道与目标通道的接合处）以及/或者在一个或更多个注射通道本身上。检测工具或传感器在样品种类储器、注射通道和/或注射通道的接合处或其上或附近的布置也称为上游布置或上游检测。用于上游检测的优选方式为流量传感器例如本文中所述的流量传感器。

作为检测工具或传感器以及特别是上述上游布置的补充或替代，该装置可包含布置在目标通道处或上的检测工具或传感器。检测工具或传感器的这样的布置在本文中称为下游布置。用于下游布置或下游检测的特别优选的检测工具或传感器是颗粒检测工具，特别是允许检测固体颗粒（例如细胞）的颗粒检测工具。用于下游检测的特别优选的检测工具是能够成像或检测荧光信号的检测工具。

根据一个优选的实施方案，实体经过样品注射通道接合端时供给到目标通道中的条码寡核苷酸或其组分组是预先确定的或被记录。

为了控制条码寡核苷酸或其组分组从样品种类储器到目标通道的供给，检测工具或传感器优选地在检测到实体后触发在相应样品种类储器之一上施加非注射压力P_ni或注射压力P_i。根据一个优选的实施方案，实体在目标通道（102）中检测到。

在样品种类储器上施加非注射压力P_ni或注射压力P_i可以另外地或替代地由时间触发。按时间进行的控制可基于实体供给到目标通道中的时间点、其到达和离开样品注射通道接合端所需要行进的距离、以及实体的流动速度。

根据本发明的一个优选的实施方案，用于在微流控装置中将实体与条码寡核苷酸或其组分组共定位的方法包括在第一个实体被供给到目标通道之后，另一实体供给到目标通道之前，对该另一实体重复所有步骤一次或更多次。对于通过相应样品注射通道接合端的每个实体，不同的样品储器用注射压力P_i加压，而其他样品储器用非注射压力P_ni加压。优选地，实体经过样品注射通道接合端时供给到目标通道中的条码寡核苷酸或其组分组是预先确定的或被记录。

根据一个使多个实体与条码寡核苷酸或其组分共定位的实施方案，一个优选的实施方案包括在实体不断供给到目标通道中时重复所有步骤一次或更多次，其中随后用注射压力P_i优选以时间依赖性方式对不同的样品种类储器加压。优选地，条码寡核苷酸或其组分组供给到目标通道中的顺序被记录。

该方法优选产生包含实体和条码寡核苷酸或其组分的微流控液滴。根据一个优选的实施方案，方法还包括将包含实体和条码寡核苷酸或其组分的微流控液滴与另外的微流控液滴例如包含另外的实体（例如细胞）的微流控液滴融合。或者，可将另外的实体注射到包含实体和条码寡核苷酸或其组分的微流控液滴中。

微流控液滴在如本文中所述的微流控装置中产生、处理和/或控制。微流控液滴的产生基于对通过微制造通道的连续液体流的操纵。在本发明中，液体流的致动通过例如（外部）压力源、（外部）机械泵、（集成）机械微型泵将非注射压力P_ni或注射压力P_i施加到样品种类储器上来实现。

可通过使用例如两相微流控产生独立的区室来产生微流控液滴，其中被不混溶的油相包围的水性液滴充当封闭容器，如例如WO 2016/207441中所述。

根据一个实施方案，方法还可包括将另外的组分或要素注射到包含实体和条码寡核苷酸或其组分组的微流控液滴中的步骤。另外的组分或要素优选包括试剂，例如反应混合物，特别是连接混合物、引物延伸混合物、逆转录混合物（RT）、PCR混合物、RT-PCR混合物、转座混合物和/或裂解缓冲液中的一种或更多种。在微流控液滴包含实体例如药物、条码寡核苷酸或其组分以及至少一个细胞的情况下，这样的另外的组分或要素特别合适。根据一个实施方案，优选通过将含有相应另外的组分或要素的水相注射到所述微流控液滴中来进行注射。

如果多个实体与条码寡核苷酸或其组分组在同一微流控液滴中共定位，则按时间进行的控制可以任意或者基于颗粒在共定位通道中的频率或密度。

根据本发明的一个实施方案，方法还包括检测实体和条码寡核苷酸或其组分。优选使用技术人员已知的任何合适的方式对实体用与之相关的相应条码寡核苷酸或其组分进行检测。例如，实体和条码寡核苷酸或其组分可通过测序的方式来检测。

根据一个实施方案，如果实体是细胞，则优选在细胞与条码寡核苷酸或其组分组在例如目标通道中共定位之后或在细胞离开目标通道之后对该细胞进行表型分型。表型分型优选在与条码寡核苷酸或其组分组共定位的细胞在目标通道中的时候进行。或者，表型分型可在与条码寡核苷酸或组分组共定位的细胞已离开目标通道的时候进行。在包含实体和条码寡核苷酸或其组分的微流控液滴还包含如上所述的细胞以及任选地还包含（反应）试剂形式的另外的要素或组分的情况下，表型分析在允许试剂进行期望反应（例如裂解和/或PCR）的孵育之后进行。技术人员可以容易地针对待发生的期望反应选择相应的孵育参数。表型分型可包括检测细胞的任何生物物理或生物化学特性，例如大小、形状、形态、染色（例如免疫染色）、配体结合等。这可以通过应用成像技术（例如明场或荧光成像）、光谱（包括荧光光谱）等来实现。表型分型允许例如将特定的细胞表型（特别是单个细胞的表型）与其转录组或遗传畸变（例如突变）或者特定药物对特定细胞或细胞组的作用相关联。

根据另一个实施方案，微流控装置还可包含一个或更多个与目标通道连接的另外的注射通道，其可将另外的组分供给到目标通道中。

根据一个实施方案，本发明还提供了用于确定药物对细胞或细胞的转录组或来自细胞的DNA扩增物的作用的方法，所述方法包括使用本文中所述的发明的方法对药物或细胞的转录组或来自细胞的DNA扩增物进行条码标记。药物中条码的序列或条码标记的转录组或条码标记的DNA扩增物优选指示细胞所暴露的药物或暴露于药物的细胞。

用于将实体与条码寡核苷酸或其组分组共定位的微流控装置和方法可用于例如对细胞或细胞培养物中的待测试物质（例如药物）进行条码标记。在这样的应用中，方法包括以下步骤：

（i）使用本文中所述的方法在微流控液滴中将物质（例如药物）与条码寡核苷酸或其组分和任选的细胞共定位；

（ii）如果步骤（i）中没有细胞被共定位，则将细胞引入到步骤（i）的微流控液滴中；

（iii）将包含试剂的反应混合物注射或融合到步骤（ii）的微流控液滴中，所述试剂例如用于逆转录和PCR和/或任选地用于细胞裂解；

（iv）孵育步骤（iii）的微流控液滴，使得反应混合物能够任选地裂解细胞和/或进行反应，例如逆转录和PCR，任选地使微流控液滴中的条码寡核苷酸与裂解细胞的RNA或DNA退火。

根据一个实施方案，所述方法还可包括以下步骤：

（v）以任意顺序使微流控液滴中的任何酶失活和/或破坏微流控液滴；以及

（vi）分析微流控液滴的内容物，任选地通过测序进行。

如果存在步骤（ii），优选通过将包含物质和条码寡核苷酸或其组分的微流控液滴与包含细胞的另一微流控液滴融合的方式将细胞引入微流控液滴中。或者，可将细胞注射到包含物质和条码寡核苷酸或其组分的微流控液滴中。

在步骤（v）中，优选使酶失活以阻止酶活性，例如聚合酶或逆转录酶活性。可以例如通过改变温度（例如热失活）、pH、缓冲剂组成或通过添加酶特异性抑制剂来实现酶在其中不发挥功能的条件而使酶失活。

上述方法的任何或所有步骤均可在本文中所述的微流控装置（即根据本发明的微流控装置）上进行。根据一个优选的实施方案，至少步骤（i）和任选的步骤（ii）在根据本发明的装置上进行。

反应混合物可包含缓冲剂、核苷酸、培养物和/或表达培养基和/或酶（例如逆转录酶、聚合酶、连接酶、RNA酶和/或DNA酶抑制剂）。根据一个优选的实施方案，反应混合物包含用于进行RT-PCR的RT-PCR混合物，以及任选地用于裂解细胞的裂解缓冲液和用于防止RNA降解的RNA酶抑制剂。根据一个实施方案，反应混合物选自RT混合物、RT-PCR混合物、PCR混合物、转座混合物。技术人员可以根据预期目的容易地选择反应混合物的相应组分及其浓度。

应理解，本文中所述的对物质（例如药物）进行条码标记的方法不限于对单一物质或药物进行条码标记，而且还对多于一种物质或药物进行条码标记，例如不同物质和/或药物的组合可用于本文中所述方法的上下文中。换言之，该方法可用于对例如物质或药物组合（例如不同药物的组合治疗）进行条码标记。

用于本文中所述的对物质（例如药物）进行条码标记的方法的装置优选是本文中所述的微流控装置。在对物质（例如药物）进行条码标记的当前设置中，样品种类储器优选地不仅包含条码寡核苷酸和/或其组分，而且至少一个样品种类储器优选地还包含待进行条码标记的物质药物。如果不止单一物质或药物待进行条码标记，则不同的物质或药物可能包含在单一种类储器中（例如作为预混合物），或者它们可以单独地或以其他预混合的组合方式包含在不止一个样品种类储器中。本发明的方法和装置允许不同的物质和药物以不同组合的方式进行组合。应理解，其他实体（例如细胞或者DNA和/或RNA）也可以从相应样品种类储器经由相应注射通道供应到目标通道中。

根据一个特别优选的实施方案，以及特别是根据本文中所述的对细胞或细胞培养物中的待测试物质（例如药物）进行条码标记的方法，微流控装置的样品种类储器包含条码寡核苷酸或其组分组、待进行条码标记的物质和/或药物、以及任选地物质和/或药物应在其中进行测试的细胞。

该方法还可包括本文中所述的对细胞进行表型分型的后续步骤。表型分型优选在细胞离开目标通道之后进行，更优选在步骤（iv）的孵育之后进行。

反应混合物的注射优选在如图13C中示例性示出的T型接合通道中进行。

用于将实体与条码寡核苷酸或其组分组共定位的微流控装置和方法还可用于例如对细胞的转录组进行条码标记、用于对来自细胞的DNA扩增物进行条码标记、或用于对细胞的基因组进行条码标记。在这样的应用中，方法包括以下步骤

（i）使用本文中所述的方法在微流控液滴中将细胞与条码寡核苷酸共定位，

（ii）裂解微流控液滴中的细胞，以及

（iii）使微流控液滴中的条码寡核苷酸与裂解细胞的RNA或DNA退火，

（iv）在微流控液滴中或在微流控液滴被破坏后的水相中，分别使用退火的条码寡核苷酸作为引物或转座元件进行逆转录（RT）、RT-PCR、PCR或转座反应，从而产生条码标记的转录组、DNA扩增物或基因组。RT混合物、RT-PCR混合物、PCR混合物或转座混合物分别优选地包含在目标通道中、与本发明的方法中产生的微流控液滴融合的微流控液滴中、或包含在微流控液滴被破坏后的水相中。根据一个实施方案，方法还可包括

（v）以任意顺序使包含条码寡核苷酸的微流控液滴的任何酶失活和破坏微流控液滴，以及

（vi）分析条码标记的转录组、条码标记的DNA扩增物或条码标记的基因组。

在步骤（v）中，优选使酶失活，以阻止酶活性，例如聚合酶或逆转录酶活性，所述酶活性将会使用微流控液滴的组分（引物、DNA或RNA）和不包含在同一微流控液滴中（例如，如果液滴被合并，则其包含在不同的微流控液滴中）的引物、DNA或RNA。可以例如通过改变温度（例如热失活）、pH、缓冲剂组成或通过添加酶特异性抑制剂来实现酶在其中不发挥功能的条件而使酶失活。

分析条码标记的转录组、条码标记的DNA扩增物或条码标记的基因组优选包括测序，例如通过下一代测序。优选地，对条码标记的转录组、条码标记的DNA扩增物和/或条码标记的基因组一起进行测序。这允许对所有待分析的细胞只进行一个分析步骤，例如一个测序反应，而不是对每个待分析的细胞进行单独的分析。

本发明还提供了用于将单个细胞的表型与其转录组、与来源于细胞的DNA扩增物或与其基因组相关联的方法，包括使用本文中所述的发明的方法对单个细胞的转录组进行条码标记、对来自单个细胞的DNA扩增物进行条码标记或对单个细胞的基因组进行条码标记，其中进一步对所述细胞进行表型分型，并且其中条码标记的转录组、扩增物或基因组中的条码序列指示了该转录组、DNA扩增物或基因组所来源的细胞的表型。表型分型可如上所述进行。

如本文中所示，本发明的方法和装置通过采用单一样品种类储器来产生储存在每个储器中的不同浓度梯度的样品种类而简化系统结构。之前，对于每种试剂浓度需要单独的储器，减少了与污染和装置故障相关的风险。此外，本发明允许在宽范围内连续调节浓度，而不是仅具有预填充在储器中的不同浓度的试剂。这也减少了试剂的总消耗并加速了制备进程。

本发明还涉及以下项目。

项目1：微流控装置（100），其包含

- 目标通道（102），其包含目标通道流体，例如载体相，

- 包含第一样品种类（A）的第一样品种类储器（104）和包含第二样品种类（B）的至少第二样品种类储器（106），

- 第一样品注射通道（114），其包含与所述第一样品种类储器（104）连接的样品注射通道储器端（114A）和与所述目标通道（102）连接的样品注射通道接合端（114B），以及

- 至少第二样品注射通道（116），其包含与所述第二样品种类储器（106）连接的样品注射通道储器端（116A）和与所述目标通道（102）连接的样品注射通道接合端（116B）；其中

- 所述第一样品注射通道（114）和/或所述第二样品注射通道（116）的所述样品注射通道接合端（114B；116B）与所述目标通道（102）无阀地连接并且包含至少一个流体动力阻力器。

项目2：项目1所述的微流控装置（100），其中所述装置被配置成使得所述第一样品种类储器（104）和所述至少一个第二样品种类储器（106）能够被加压，优选在注射阶段和非注射阶段二者期间被加压。

项目3：项目1或2所述的微流控装置（100），其中所述第一样品注射通道（114）和所述第二样品注射通道（116）分别以其相应的样品注射通道接合端（114B；116B）与所述目标通道（102）连接。

项目4：权利要求1至3中任一项所述的微流控装置（100），其中所述微流控装置用于在所述载体相内产生一个或更多个包含至少两个样品种类（A；B）的组合微区室（200A；200B），并且其中所述第一样品种类（A）和所述第二样品种类（B）在化学上不同，其中所述组合微区室（200A；200B）是组合液滴或组合塞。

项目5：项目1至4中任一项所述的微流控装置（100），其中所述载体相是不混溶相，其中一个或更多个组合微区室（200A；200B）流入出口通道或读出通道中。

项目6：项目1至5中任一项所述的微流控装置（100），其中所述第一样品注射通道（114）和所述第二样品注射通道（116）中的每一个与相应的传感器（114C；116C）连接，所述传感器被配置成监测相应第一和第二样品注射通道（114；116）中液体的流数据。

项目7：项目1至6中任一项所述的微流控（100）装置，其包含与所述第一样品种类储器（104）连接的第一压力控制装置（114D）和与所述第二样品种类储器（106）连接的至少第二压力控制装置（116D），优选地其中所述第一压力控制装置（114D）和所述至少一个第二压力控制装置（116D）与压力源（120）连接。

项目8：项目7所述的微流控装置（100），其中所述第一压力控制装置（114D）被配置成

- 向所述第一样品种类储器（104）施加第一注射压力P_i，以引起经由所述第一样品注射通道（114）注射所述第一样品种类，并且

所述第二压力控制装置（116D）被配置成

- 向所述第二样品种类储器（106）施加第二注射压力P_i，以引起经由所述第二样品注射通道（116）注射所述第二样品种类。

项目9：项目8所述的微流控装置（100），其中所述第一压力控制装置（114D）与所述第一样品注射通道（114）的第一传感器（114C）通信地耦合并且所述第二压力控制装置（116D）与所述第二样品注射通道（116）的第二传感器（116C）通信地耦合，其中第一和第二注射压力P_i基于所监测的相应样品注射通道（114；116）中液体的流数据来施加。

项目10：项目7至9中任一项所述的微流控装置（100），其中第一和第二压力控制装置（114D；116D）被配置成在每个非注射的样品注射通道（114；116）的每个样品种类储器（104；106）上维持非注射压力P_ni，优选地，其中所述非注射压力P_ni低于所述第一和第二注射压力P_i并遵循关系：P_i > P_ni > P_大气，并且任选地，其中所述第一和第二压力控制装置（114D；116D）被配置成随时间增加每个非注射的样品注射通道（114；116）的每个样品种类储器（104；106）上的所述非注射压力P_ni。

项目11：项目10所述的微流控（100）装置，其中向每个非注射的样品注射通道（114；116）的每个样品种类储器（104；106）施加的所述非注射压力引起相应样品注射通道（114；116）中液体的流动。

项目12：用于提供一个或更多个包含至少两个样品种类（A；B）的组合微区室（200A；200B）的方法（300），所述方法包括：

- 将来自第一样品种类储器（104）的第一样品种类（A）经由第一样品注射通道（114）注射（302）到目标通道（102）的载体相的连续流中以产生微区室（202）；

- 将来自第二样品种类储器（106）的至少一个第二样品种类（B）经由第二样品注射通道（116）注射（304）到所产生的微区室（202）中以产生组合微区室（200）；

- 使用至少一个流体动力阻力器在第一注射通道（114）和/或第二注射通道（116）内提供阻力。

项目13：项目12所述的方法，其中通过向相应的第一种类储器（104）和第二种类储器（106）施加注射压力P_i来注射所述第一样品种类（A）和所述第二样品种类（B），同时在每个非注射的样品注射通道（114；116）的每个样品种类储器（104；106）上维持低于所述注射压力P_i的非注射压力P_ni。

项目14：项目13所述的方法，其还包括：

- 随时间增加每个非注射的样品注射通道（114；116）的每个样品种类储器（104；106）上的所述非注射压力P_ni，其中所述注射压力P_i和所述非注射压力P_ni遵循关系：P_i > P_ni> P_大气。

项目15：项目10至14中任一项所述的方法，其中注射所述第二样品种类（B）与注射所述第一样品种类（A）依次发生或同时发生，并且其中所述载体相是不混溶相，并且其中所述第一样品种类（A）和所述第二样品种类（B）在化学上不同，其中所述组合微区室（200）是包含至少一种原核或真核细胞的组合液滴或组合塞。

项目16：微流控芯片（122），其包含通过项目10至15中任一项所述的方法产生的一个或更多个包含至少两个样品种类（A；B）的组合微区室（200）。

项目17：微流控装置用于将第一样品种类（A）和第二样品种类（B）组合到目标通道流体中的用途，所述用途包括以下步骤

在非注射阶段向包含第一样品种类（A）的第一样品种类储器（104）施加非注射压力P_ni，并且在非注射阶段向包含第二样品种类（B）的至少第二样品种类储器（106）施加P_ni，

在注射阶段向第一和第二样品储器（104，106）中的至少一个施加注射压力P_i，从而将所述样品种类A和/或B注射到所述目标通道流体中，其中P_i > P_ni > P_大气；

其特征在于，

使用的装置包含：

- 目标通道（102），其包含所述目标通道流体，

项目18：用于在根据项目1至11中任一项所述的微流控装置中将实体与条码寡核苷酸或其组分组共定位的方法，所述方法包括：

（i）将所述实体供给到所述目标通道（102）中；

（ii）使所述实体经过所述第一样品注射通道（114）和所述至少一个第二样品注射通道（116），其中所述样品注射通道之一将条码寡核苷酸或其组分组从所述样品种类储器（104，106）经由相应样品注射通道（114，116）和相应样品注射通道接合端（114B，116B）供给至所述目标通道（102），其通过向第一和第二样品储器（104，106）中相应的一个施加注射压力（P_i）从而将所述条码寡核苷酸或其组分组注射到所述目标通道（102）中实现；

（iii）任选地重复步骤（ii），优选地，其中当重复步骤（ii）时，所述第一样品注射通道（114）和所述至少一个第二样品注射通道（116）中的另一个将条码寡核苷酸或其组分组从所述样品种类储器（104，106）供给至所述目标通道（102）。

项目19：项目18所述的方法，所述方法还包括在非注射阶段向所述第一样品种类储器（104）和/或至所述至少一个第二样品种类储器（106）施加非注射压力（P_ni），其中P_ni大于环境的压力（P_大气），并且其中P_i > P_ni > P_大气。

项目20：项目18或19所述的方法，其中所述注射压力（P_i）和所述非注射压力（P_ni）是通过对所述第一样品种类储器（104）和所述至少一个第二样品种类储器（106）加压而产生的。

项目21：项目18至20中任一项所述的方法，其中将所述条码寡核苷酸或其组分组从所述样品种类储器（104，106）供给至所述目标通道（102）通过一个或更多个检测工具或传感器来控制。

项目22：项目18至21中任一项所述的方法，其中所述实体是核酸、细胞或药物。

项目23：项目18至22中任一项所述的方法，其中所述方法还包括产生包含所述实体和所述条码寡核苷酸或其组分的微流控液滴，或者其中所述方法还包括将包含所述实体和所述条码寡核苷酸或其组分的微流控液滴与另外的微流控液滴融合，以及/或者所述方法还包括将试剂注射到所述微流控液滴中。

项目24：项目18至23中任一项所述的方法，其中所述方法还包括检测所述实体和所述条码寡核苷酸或其组分。

虽然上述涉及本公开内容的实施方案，但是在不脱离其基本范围的情况下，可以设计出本公开内容的其他和另外的实施方案，并且其范围由所附权利要求来确定。

实施例

实施例1：容纳不同浓度试剂的微区室的产生

该实施例举例说明了根据本发明的压力控制微流控装置可如何产生具有不同浓度的储存在种类样品储器中的试剂的微流控微区室。实验设置包括填充有载体油、荧光染料刃天青（7-羟基-10-氧化吩嗪-10--3-酮，钠）和FreeStyle™ 293表达培养基的加压储器。如图9A中所示，通过将不同的试剂注射到通道网络中来产生微流控微区室。通过调节施加至储器的压力，动态改变水性样品（荧光染料和缓冲液）的相对流量，从而在以恒定流量注射油的同时得到微流控微区室内不同最终浓度的染料。

在本实施例中，产生了荧光染料浓度为加载到储器中的荧光染料的浓度的¼和¾的微区室。对于条件A：通过以8 μl/分钟注射红色荧光染料并且以24 μl/分钟注射缓冲液来产生微区室。对于条件B：通过以24 μl/分钟注射红色荧光样品并且以8 μl/分钟注射缓冲液来产生微区室。对于条件A和B二者，P_ni为100至600毫巴，并且P_i为125至2000毫巴。

在产生微流控微区室之后，通过激光光谱测定样品的荧光信号，所使用的设置如Panwar, J., Autour, A. & Merten, C.A.（Design and construction of amicrofluidics workstation for high-throughput multi-wavelength fluorescenceand transmittance activated droplet analysis and sorting. Nat Protoc 18,1090–1136 (2023). https://doi.org/10.1038/s41596-022-00796-2，通过引用并入本文）中所述。结果在图9B中示出。对于条件A产生的微区室的所测量荧光信号为：0.068[a.u.]，并且对于条件B产生的微区室的所测量荧光信号为：0.209 [a.u.]。条件B与A的微区室荧光信号的比率为3.077 [a.u.]，与所得染料浓度相匹配（[a.u.] =任意单位（arbitrary unit），描述了振幅取决于放大倍数的定量信号）。

在图10A中示出的替代设置中，使用了相同的方法来产生浓度对应于样品储器中荧光染料的0.0909至0.909倍的微区室（储备物浓度为11 μM）。

对于条件C：通过以24 μl/分钟注射红色荧光液体并且以2.4 μl/分钟注射缓冲液来产生微区室。对于条件D：通过以2.4 μl/分钟注射红色荧光液体并且以24 μl/分钟注射缓冲液来产生微区室。结果在图10B中示出。对于条件C产生的微区室的所测量荧光信号为：8.924 [a.u.]，并且对于条件D产生的微区室的所测量荧光信号为：0.895 [a.u.]。条件C与D的微区室荧光信号的比率为9.969 [a.u.]，与从流量中所预期的10倍差异相匹配。

这些结果表明，该方法允许产生具有宽范围浓度的存在于样品种类储器中的储备溶液的微流控微区室。

实施例2：容纳不同组合的条码标记寡核苷酸的微区室的产生

该实施例举例说明了可如何使用该装置产生用于将细胞与不同组合的条码标记寡核苷酸共定位的微流控微区室。实验设置包括填充有载体油、细胞悬液和与已知寡核苷酸序列的条码（如Mathur L, Szalai B, Du NH et al. Combi-seq for multiplexedtranscriptome-based profiling of drug combinations using deterministicbarcoding in single-cell droplets. Nat Commun 13, 4450 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32197-0中所述的Combi-seq条码，通过引用并入本文）混合的药物的加压样品种类储器。如图11中所示，通过将不同的试剂注射到通道网络中来产生微流控微区室。通过改变注射试剂的组合，产生了具有不同组合的药物和条码标记寡核苷酸的微区室。具体地，根据下表1产生了18种不同的组合条码。连接的条码是双链的，并且在5’-条码与3’ poly-T条码之间具有连接位点（gcggc）。条码连接的方案在图12中示出。表1示出了该实施例中使用的条码元件。

表1：条码元件（Pred =泼尼松；DMSO =二甲基亚砜；VCR =长春新碱；Dauno =柔红霉素；ASP =天冬酰胺酶；Venet =维奈托克（venetoclax））

图13A和图13B在示意图中示例性地示出了对于如上表1中详述的6号条件（图13A）和11号条件（图13B）产生的微区室。

产生之后，将微流控微区室在培养箱中维持在37℃、5% CO₂下孵育16小时。孵育之后，将微区室注射到T型接合通道中，用于另外注射试剂以将两个条码片段连接成单个组合寡核苷酸并进行逆转录，如图13中所示。以30 μl/分钟的流量注射微区室，并且以10 μl/分钟的流量注射试剂。相应的试剂组成在表2中示出。

表2：注射到预孵育的微区室中以启动组合条码片段的连接、细胞裂解和逆转录的储备溶液的组成。

随后，将微区室在室温下孵育40分钟，然后在50℃下孵育30分钟，并最后在85℃下孵育5分钟。然后将微区室合并成一种水性溶液，其用于文库制备以用于测序，如Mathur,L., Szalai, B., Du, N.H. et al., Nat Commun 13, 4450 (2022), https://doi.org/10.1038/s41467-022-32197-0中所述，通过引用并入本文），不使用C1 dynabead进行cDNA纯化。在NextSeq 500仪器（Illumina）上对文库进行测序，测序深度为平均1690万个读出/样品。所获得的每个连接的条码的读出数目在表3中列出。

表3：所获得的每个连接的条码的读出数目

获得了所有组合产生的条码的大量测序读出，证明了使用本发明的方法和装置可以成功地产生期望的按需样品组合物，并且期望的条码是功能性的且可用于为所有样品扩增细胞RNA和产生条码标记的cDNA。

Claims

1.微流控装置（100），其包含

- 目标通道（102），其包含目标通道流体，例如载体相，

2.权利要求1所述的微流控装置（100），其中所述装置被配置成使得所述第一样品种类储器（104）和所述至少一个第二样品种类储器（106）能够被加压，优选在注射阶段和非注射阶段二者期间被加压。

3.权利要求1或2所述的微流控装置（100），其中所述第一样品注射通道（114）和所述第二样品注射通道（116）分别以其相应的样品注射通道接合端（114B；116B）与所述目标通道（102）连接。

4.权利要求1至3中任一项所述的微流控装置（100），其中所述微流控装置用于在所述载体相内产生一个或更多个包含至少两个样品种类（A；B）的组合微区室（200A；200B），并且其中所述第一样品种类（A）和所述第二样品种类（B）在化学上不同，其中所述组合微区室（200A；200B）是组合液滴或组合塞。

5.权利要求1至4中任一项所述的微流控装置（100），其中所述载体相是不混溶相，其中一个或更多个组合微区室（200A；200B）流入出口通道或读出通道中。

6.权利要求1至5中任一项所述的微流控装置（100），其中所述第一样品注射通道（114）和所述第二样品注射通道（116）中的每一个与相应的传感器（114C；116C）连接，所述传感器被配置成监测相应第一和第二样品注射通道（114；116）中液体的流数据。

7.权利要求1至6中任一项所述的微流控（100）装置，其包含与所述第一样品种类储器（104）连接的第一压力控制装置（114D）和与所述第二样品种类储器（106）连接的至少第二压力控制装置（116D），优选地其中所述第一压力控制装置（114D）和至少一个第二压力控制装置（116D）与压力源（120）连接。

8.权利要求7所述的微流控装置（100），其中所述第一压力控制装置（114D）被配置成

所述第二压力控制装置（116D）被配置成

9.权利要求8所述的微流控装置（100），其中所述第一压力控制装置（114D）与所述第一样品注射通道（114）的第一传感器（114C）通信地耦合并且所述第二压力控制装置（116D）与所述第二样品注射通道（116）的第二传感器（116C）通信地耦合，其中第一和第二注射压力P_i基于所监测的相应样品注射通道（114；116）中液体的流数据来施加。

10.权利要求7至9中任一项所述的微流控装置（100），其中第一和第二压力控制装置（114D；116D）被配置成在每个非注射的样品注射通道（114；116）的每个样品种类储器（104；106）上维持非注射压力P_ni，优选地，其中所述非注射压力P_ni低于所述第一和第二注射压力P_i并遵循关系：P_i > P_ni > P_大气，并且任选地，其中所述第一和第二压力控制装置（114D；116D）被配置成随时间增加每个非注射的样品注射通道（114；116）的每个样品种类储器（104；106）上的所述非注射压力P_ni。

11.权利要求10所述的微流控（100）装置，其中向每个非注射的样品注射通道（114；116）的每个样品种类储器（104；106）施加的所述非注射压力引起相应样品注射通道（114；116）中液体的流动。

12.用于提供一个或更多个包含至少两个样品种类（A；B）的组合微区室（200A；200B）的方法（300），所述方法包括：

13.权利要求12所述的方法，其中通过向相应的第一种类储器（104）和第二种类储器（106）施加注射压力P_i来注射所述第一样品种类（A）和所述第二样品种类（B），同时在每个非注射的样品注射通道（114；116）的每个样品种类储器（104；106）上维持低于所述注射压力P_i的非注射压力P_ni。

14.权利要求13所述的方法，其还包括：

- 随时间增加每个非注射的样品注射通道（114；116）的每个样品种类储器（104；106）上的所述非注射压力P_ni，其中所述注射压力P_i和所述非注射压力P_ni遵循关系：P_i > P_ni >P_大气。

15.权利要求10至14中任一项所述的方法，其中注射所述第二样品种类（B）与注射所述第一样品种类（A）依次发生或同时发生，并且其中所述载体相是不混溶相，并且其中所述第一样品种类（A）和所述第二样品种类（B）在化学上不同，其中所述组合微区室（200）是包含至少一个原核或真核细胞的组合液滴或组合塞。

16.微流控芯片（122），其包含通过权利要求10至15中任一项所述的方法产生的一个或更多个包含至少两个样品种类（A；B）的组合微区室（200）。

17.微流控装置用于将第一样品种类（A）和第二样品种类（B）组合到目标通道流体中的用途，所述用途包括以下步骤

其特征在于，

使用的装置包含：

- 目标通道（102），其包含所述目标通道流体，

18.用于在根据权利要求1至11中任一项所述的微流控装置中将实体与条码寡核苷酸或其组分组共定位的方法，所述方法包括：

（i）将所述实体供给到所述目标通道（102）中；

19.权利要求18所述的方法，所述方法还包括在非注射阶段向所述第一样品种类储器（104）和/或至所述至少一个第二样品种类储器（106）施加非注射压力（P_ni），其中P_ni大于环境的压力（P_大气），并且其中P_i > P_ni > P_大气。

20.权利要求18或19所述的方法，其中所述注射压力（P_i）和所述非注射压力（P_ni）是通过对所述第一样品种类储器（104）和所述至少一个第二样品种类储器（106）加压而产生的。

21.权利要求18至20中任一项所述的方法，其中将所述条码寡核苷酸或其组分组从所述样品种类储器（104，106）供给至所述目标通道（102）通过一个或更多个检测工具或传感器来控制。

22.权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述实体是核酸、细胞或药物。

23.权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述方法还包括产生包含所述实体和所述条码寡核苷酸或其组分的微流控液滴，或者其中所述方法还包括将包含所述实体和所述条码寡核苷酸或其组分的微流控液滴与另外的微流控液滴融合，以及/或者所述方法还包括将试剂注射到所述微流控液滴中。

24.权利要求18至23中任一项所述的方法，其中所述方法还包括检测所述实体和所述条码寡核苷酸或其组分。

25.用于对细胞或细胞培养物中的待测试物质进行条码标记的方法，所述方法包括以下步骤：

（i）使用权利要求18至24中任一项所述的方法在微流控液滴中将所述物质与条码寡核苷酸或其组分和任选的细胞共定位；

（ii）任选地，如果步骤（i）中没有细胞被共定位，则将细胞引入到步骤（i）的所述微流控液滴中；

（iii）将包含试剂的反应混合物注射到或融合到步骤（ii）的所述微流控液滴中；

（iv）孵育步骤（iii）的所述微流控液滴，使得所述反应混合物能进行反应。