CN120843605A - 一种pd-1基因组敲除的同种异体双阴性t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种PD‑1基因组敲除的同种异体双阴性T细胞及其制备方法和应用。具体地，本发明基于CRISPR‑Cas12a基因编辑系统，提供了一种在DNT细胞中准确高效地敲除PD‑1基因的方法。使用本发明的方法制备得到的双阴性T细胞其PD‑1敲除率高、敲除后的细胞活率高且对靶细胞具有显著提高的杀伤效果。本发明的制备方法操作简便，安全高效，适用于基因组敲除的同种异体双阴性T细胞大规模生产。

Description

一种PD-1基因组敲除的同种异体双阴性T细胞及其制备方法 和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种PD-1基因组敲除的同种异体双阴性T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

1.CRISPR-Cas基因编辑系统

CRISPR-Cas基因编辑系`统分为两类(类型1:Class I，类型2:Class II)。第一类系统包含I，III,IV型，使用多个CRISPR核糖核蛋白。第二类系统包含II，V，VI型，使用单个CRISPR核糖核蛋白，与向导RNA组装成核糖核蛋白复合物引导核酸酶功能。著名的基因编辑系统CRISPR-Cas9属于第二类系统II型(Class-2type II)。CRISPR-Cas12a(简称Cpf1)属于第二类系统V型(Class 2type V)，在体内以高特异性结合和切割dsDNA靶标使其扩展成为用于精确基因组编辑的理想工具。

CRISPR-Cas12a基因编辑系统由两部分组成：核酸酶Cas12a(Cpf1),是一种只需要单一的CRISPR RNA引导的核酸内切酶。Cas12a识别5'端-富含A-T的原间隔序列(PAM，通常为5'-TTTN-3')，在向导RNA的引导之下，识别PAM位点，切割特定靶基因DNA序列，在PAM位点远端产生交错末端。Cas12a系统向导RNA部分只需要一条CRISPR RNA链(crRNA),不需要反式激活crRNA。crRNA包含靶向特定基因组DNA序列的信息。其支架环区的核苷酸与Cas12a相互作用，形成核酸/蛋白复合物(ribonucleic protein,RNP)。在与靶基因DNA结合后，CRISPR-Cas12a核酸酶在目标DNA链中诱导切割，产生双链DNA断裂。

两种Cpf1直系同源物：AsCpf1(来自Acidaminococcus sp.BV3，氨基酸球菌属)和LbCpf1(来自Lachnospiraceae bacterium，毛螺旋菌属)，在哺乳动物细胞中表现出强大的核酸酶活性。两者都使用相同的TTTV PAM位点识别靶基因组DNA，与Cas9 NGG识别位点相比，Cpf1核酸酶在人细胞中表现出更高的靶向特异性；Cpf1核酸酶切割靶基因时产生交错末端，其与供体DNA重组时，准确性比平端切除重组更高；并且，Cpf1核酸酶同时具有RNA酶和DNA酶活性，可以识别前体crRNA形成的空间结构并切割。因此，根据基于前体crRNA结构的重复序列，Cpf1核酸酶可以识别切割产生几个不同的向导crRNA。该特征可以被用于多重基因组的同步敲除。这些独特的优点使Cas12a系统被扩展成为用于真核细胞精确基因组编辑的理想工具。

2.同种异体双阴性T细胞DNT

人体免疫系统有两个主要组成部分：先天免疫系统和适应性免疫系统。双阴性T细胞(CD3⁺CD4^-CD8^-，DNT)是成熟的T细胞亚群，占人外周血T细胞的1％至10％。其表型为CD3阳性，CD4和CD8阴性。DNT细胞具有先天性免疫和适应性免疫双重功能，可以桥接适应性和先天免疫系统。DNT细胞识别抗原不受组织相容复合体(MHC)限制，现有临床数据表明，将同种异体DNT细胞输注到血液肿瘤患者体内，不会引起GvHD和其它严重不良，具有开发现货通用型T细胞药的巨大潜力。

人外周血分离的双阴性T细胞(DNT)在细胞生物学研究以及动物实验靶向多种癌细胞模型研究中，以不受供体限制的方式发挥作用杀死源自血液和实体恶性肿瘤。健康供者来源的体外扩增的DNT细胞能够保留其抗肿瘤能力和抑制移植物抗宿主病的能力。在人类临床研究中，体外扩增培养的DNT细胞表现出对血液系统恶性肿瘤的良好的杀伤作用。这些特征和研究数据证明了DNT细胞在肿瘤免疫治疗领域中的潜在能力，支持体外制备同种异体DNT细胞用作为通用“现成”型的细胞治疗产品(Off the-Shelf Product for CellTherapy)，可随时直接提供于临床应用。

DNT又分为TCRαβ⁺和TCRγδ⁺两种类型，对正常细胞和造血干细胞没有毒性。DNT表达高水平的NKG2D、DNAM-1、NKp30、穿孔素和颗粒酶B，IFNγ和可溶性TNF相关细胞凋亡诱导配体TRAIL，杀死恶性肿瘤细胞。基于DNT过继细胞疗法对于血液肿瘤的治疗，研究又发现健康供体来源的DNT细胞联合抗PD-1制剂，可以显著抑制晚期肺癌肿瘤模型的生长并提高实验小鼠的生存率。

3.人T淋巴细胞程序性死亡受体-1(PD-1)

程序性死亡检查点受体-1(Programmed Death-1checkpoint receptor,PD-1)是1型跨膜蛋白质，在许多效应免疫细胞表达。其程序性死亡配体1(PD-L1)在恶性肿瘤表面高表达。PD-1与PD-L1结合，激活TCR下游信号通路多种机制去磷酸化。首先是包括SHP介导的TCR信号通路去磷酸化，具体地说，是CD3ζ、ZAP70和PI3K激酶的去磷酸化，导致TCR下游信号通路失活，从而抑制T细胞的激活，并抑制T细胞的增殖。因此，PD-1与PD-L1结合，导致肿瘤免疫逃避，最终导致临床治疗失败。

从临床癌症治疗方面来看，全身给药PD-L1/PD-1阻断抗体显示出部分抗肿瘤作用，但是，在细胞治疗领域，T细胞免疫检查点基因的敲除，去除内源性免疫检查点PD-1，改善工程化T细胞的生物活性和持久性，比长期使用PD-1抗体有更好的安全性，并减少可能由自身免疫引起的毒性。

综上，本领域需要一种针对同种异体双阴性T细胞(Allogeneic Double NegativeT,DNT,CD3⁺CD4^-CD8^-)的基因组编辑方法以定点敲除免疫抑制点PD-1基因组，增强DNT细胞杀瘤活性，在体内持续发挥抗肿瘤作用，提高DNT细胞、CAR-DNT细胞免疫治疗的临床疗效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PD-1基因组敲除的双阴性T细胞、制备所述双阴性T细胞的方法，以及所述双阴性T细胞的应用。

本发明的第一方面，提供了一种PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞(DNT)制备方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供分离的同种异体双阴性T细胞；

(ii)激活并培养所述双阴性T细胞后，转染Cas12a核酸酶/crRNA复合物，从而敲除所述双阴性T细胞中的PD-1基因；其中，所述crRNA针对具有SEQ ID NO:1所示序列的敲除靶点序列；

(iii)测定转染后双阴性T细胞的活率、基因组PD-1敲除Indel百分率和细胞表型，检测合格即得到所述PD-1基因敲除的双阴性T细胞。

在另一优选例中，所述分离的同种异体双阴性T细胞来源于健康供者。

在另一优选例中，所述分离的同种异体双阴性T细胞来源于新鲜分离的双阴性T细胞、冻存后复苏的双阴性T细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述双阴性T细胞为外周血进行体外分离纯化得到双阴性T细胞。

在另一优选例中，在所述步骤(ii)中，在抗人CD3单克隆抗体存在的条件下，激活所述双阴性T细胞，其中，所述抗人CD3单克隆抗体被固化在介质上。

在另一优选例中，所述介质选自下组：培养介质(例如培养皿、培养瓶或培养板)、磁珠、可降解微珠、或其组合。

在另一优选例中，在所述步骤(ii)中，用20ng/ml-25μg/ml，较佳地，100ng ng/ml-15μg/ml，最佳地，1μg/ml-15μg/ml的抗人CD3单克隆抗体包被培养瓶，从而获得包被有抗人CD3单克隆抗体的培养瓶，在包被有抗人CD3单克隆抗体的培养瓶中培养所述双阴性T细胞，以激活所述双阴性T细胞。

在另一优选例中，在所述步骤(ii)中，培养所述双阴性T细胞5-7天(较佳地，7天)后，进行转染。

在另一优选例中，在所述步骤(ii)中，所述转染包括电转染、脂质体转染；优选电转染。

在另一优选例中，在所述步骤(ii)中，转染时细胞的密度为1×10⁶至2.5×10⁶细胞/100ul转染系统。

在另一优选例中，在制备所述Cas12a核酸酶/crRNA复合物时，体系内的甘油总浓度维持在10％以下。

在另一优选例中，所述Cas12a核酸酶/crRNA复合物中Cas12a核酸酶与crRNA的摩尔比例为1：(2-3)；较佳地为1：2.5。

在另一优选例中，在所述步骤(ii)中，所述Cas12a核酸酶/crRNA复合物的转染剂量为60-120pmol/10E6细胞，较佳地为100pmol/10E/6细胞。

在另一优选例中，所述Cas12a核酸酶选自下组：AsCas12a、LbCas12a、或其优化的突变体、或其组合。

在另一优选例中，所述Cas12a核酸酶为AsCas12a。

在另一优选例中，所述crRNA由5’端手柄假结构、种子区和3’末端组成，其中种子区和3’末端与敲除靶点序列具有互补的结合序列。

在另一优选例中，所述crRNA的3’末端添加有6-8个uridine。

在另一优选例中，所述crRNA具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：

RScrRNA序列(SEQ ID NO:4)：

UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGCACGAAGCUCUCCGAUGUGUUGUU UUUUUU

在另一优选例中，在所述步骤(iii)中，在转染后72小时测定转染后双阴性T细胞的活率和基因组PD-1敲除Indel百分率。

在另一优选例中，在所述步骤(iii)中，在转染后7-9天测定细胞表型。

在另一优选例中，采用流式细胞术测定细胞表型。

在另一优选例中，在所述步骤(iii)中，“检测合格”是指：

(1)待测双阴性T细胞的活率≥90％，较佳地≥95％；

(2)待测双阴性T细胞的基因组PD-1敲除Indel百分率≥65％，较佳地≥70％；

(3)待测双阴性T细胞的细胞表型如下：PD-1敲除率大于90％，且CD3阳性率大于90％。

本发明的第二方面，提供了一种PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞，所述细胞采用如本发明第一方面所述的方法制备得到。

在另一优选例中，所述双阴性T细胞具有以下的一种或多种特征：

(1)细胞的活率≥90％，较佳地≥95％；

(2)基因组PD-1敲除Indel百分率≥65％，较佳地≥70％；

(3)细胞表面表达的PD-1敲除率大于90％，且CD3阳性率大于90％；

(4)Tscm细胞增长率相对于未敲除的双阴性T细胞显著提高；其中，所述“显著提高”是指所述PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞的Tscm细胞增长率T1，相对于未敲除的双阴性T细胞的Tscm细胞增长率T0，T1/T0≥1.5，较佳地，T1/T0≥2；

(5)靶细胞杀伤效果相对于未敲除的双阴性T细胞显著提高；其中，所述“显著提高”是指所述PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞的靶细胞杀伤率R1，相对于未敲除的双阴性T细胞的靶细胞杀伤率R0，R1/R0≥1.2，较佳地，R1/R0≥1.5，更佳地，R1/R0≥2。

在另一优选例中，所述双阴性T细胞具有以下表型：CD3⁺CD4^-CD8^-PD-1^-。

在另一优选例中，所述双阴性T细胞被进一步修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)。在另一优选例中，所述嵌合抗原受体(CAR)包括但不限于靶向以下靶点的CAR：CD19、Mesothelin(MSLN)、CD5、CD7、CD20、CD22、CD33、CD123、BCMA、IM19、GPC-3、Claudin18.2、NY-ESO-1、GD2、EGFR、HER2、MUC1、PSMA、或其组合。

本发明的第三方面，提供了一种细胞制剂，所述制剂包括：(a)如本发明第二方面所述的PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞；和(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述制剂用于制备治疗和/或预防肿瘤的药物。

在另一优选例中，所述肿瘤选自实体肿瘤和/或血液肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：急性髓细胞性白血病(AML)、淋巴瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、肾脏肿瘤、黑素瘤、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、头颈癌、胰腺癌，或其组合。

本发明的第四方面，提供了一种如本发明第二方面所述的PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞的用途，用于制备治疗和/或预防肿瘤的药物。

在另一优选例中，所述双阴性T细胞用于制备负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞，即CAR-DNT。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体(CAR)包括但不限于靶向以下靶点的CAR：CD19、Mesothelin(MSLN)、CD5、CD7、CD20、CD22、CD33、CD123、BCMA、IM19、GPC-3、Claudin18.2、NY-ESO-1、GD2、EGFR、HER2、MUC1、PSMA、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤选自实体肿瘤和/或血液肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：急性髓细胞性白血病(AML)、淋巴瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、肾脏肿瘤、黑素瘤、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、头颈癌、胰腺癌，或其组合。

本发明的第五方面，提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用本发明第二方面所述的PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞，或本发明第三方面所述的细胞制剂。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.PD-1靶点筛选结果，具体显示了1号靶点载体U6-4-Cpf1的T7E1酶切实验(图中箭头所示：300bp)。

图2.PD-1靶基因扩增子PCR送检样品凝胶电泳结果，其中箭头所示：315bp。

图3.PD-1基因组敲除DNT细胞的扩增子测序结果实例图。

图4.DNT-PD1-KO细胞表型鉴定实例图。

图5.DNT-PD1-KO细胞CD3阳性率鉴定实例图。

图6.DNT对照组和DNT-PD1-KO组的Tscm流式检测结果；其中左图为DNT对照组的Tscm流式检测结果，右图为DNT-PD1-KO组的Tscm流式检测结果。

图7A.RTCA即时肿瘤细胞杀伤实验结果(A549)。

图7B.RTCA即时肿瘤细胞杀伤实验结果(A549)的定量数据。

图8A.RTCA即时肿瘤细胞杀伤实验结果(H460)。

图8B.RTCA即时肿瘤细胞杀伤实验(H460)的定量数据。

图9A.DNT-PD-1-KO细胞存活率测试结果(表2中的Study-3)。

图9B.DNT-PD-1-KO细胞生长曲线(表2中的Study-3)。

具体实施方式

本发明聚焦于同种异体双阴性T细胞(Allogeneic Double Negative T)基因组编辑。经过广泛而深入的研究，本发明人以CRISPR技术介导的基因编辑定点敲除免疫抑制点PD-1基因组，增强DNT细胞生物活性，在体内持续发挥抗肿瘤作用，提高DNT细胞、CAR-DNT细胞免疫治疗的疗效。由于CRISPR-Cas9基因编辑系统仍然无法避免的脱靶或非特异性插入，本发明使用更保守和更精确的CRISPR-Cas12a系统引导的PD-1基因组敲除。Cas12a特异性亲核活性识别序列(PAM)为5'-TTTV-3，相对于Cas9的PAM识别序列NGG，其更精确和保守，得以最大程度地避免脱靶的发生。使用本发明的方法制备得到的PD-1基因敲除的DNT细胞具有良好的生物活性和显著提高的抗肿瘤作用，更好地用于细胞免疫治疗。

在此基础上，完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“双阴性T细胞”、“DNT细胞”、“DNT”可互换使用，均指从外周血中分离得到的CD3⁺CD4^-CD8^-成熟T淋巴细胞亚群，其细胞表面表达CD3分子和αβ-或γδ-T细胞受体，但不表达CD4和CD8分子。

如本文所用，术语“未激活的双阴性T细胞”是指未经激活处理(抗人CD3单克隆抗体和细胞因子)，不具有Tscm/Tcm特征的双阴性T细胞。

如本文所用，术语“激活的双阴性T细胞”是指经激活处理后，具有Tscm/Tcm特征的双阴性T细胞。激活的双阴性T细胞经扩增培养后可被载有外源性基因序列(如编码嵌合抗原受体的基因序列)的慢病毒载体转导，用于制备嵌合抗原受体-双阴性T细胞(CAR-DNT)。

如本文所用，术语“PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞”、“PD-1基因敲除的DNT细胞”、“DNT-PD1-KO细胞”可以互换使用，均指基因组PD-1基因被敲除的DNT细胞，其具有CD3⁺CD4^-CD8^-PD-1^-的表型。在本发明中，以上术语特指使用本发明配制的Cas12a核酸酶/crRNA复合物敲除PD-1基因所获得的DNT细胞。

如本文所用，术语“负载有嵌合抗原受体的双阴性T细胞”、“嵌合抗原受体-双阴性T细胞”和“CAR-DNT”可互换使用，均指在细胞表面表达嵌合抗原受体的双阴性T细胞。

本发明的方法

本发明提供了一种同种异体双阴性T细胞的基因组编辑方法，包括以下步骤：

(i)提供分离的同种异体双阴性T细胞；

(ii)激活并培养所述双阴性T细胞后，转染Cas12a核酸酶/crRNA复合物，从而敲除所述双阴性T细胞中的目的基因；其中，所述crRNA针对所述目的基因的敲除靶点序列；

(iii)测定转染后双阴性T细胞的活率、基因组中目的基因敲除Indel百分率和细胞表型，检测合格即得到所述基因组目的基因敲除的双阴性T细胞。

具体地，本发明提供了一种PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞制备方法，其中步骤(ii)中所述的Cas12a核酸酶/crRNA复合物，所述crRNA针对具有SEQ ID NO:1所示序列的敲除靶点序列。

本发明的基因组编辑方法采用CRISPR-Cas12a系统引导DNT细胞中基因组目的基因的敲除，并优化了Cas12a核酸酶/crRNA复合物的制备和转染。具体地，在制备Cas12a核酸酶/crRNA复合物时，体系内的甘油总浓度维持在10％以下，且Cas12a核酸酶/crRNA复合物中Cas12a核酸酶与crRNA的摩尔比例为1：(2-3)；较佳地为1：2.5。制备得到的Cas12a核酸酶/crRNA复合物在转染剂量为60-120pmol/10E6细胞，较佳地为100pmol/10E/6细胞时转染DNT细胞，能够获得最佳的转染效率。以制备PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞为例，使用本发明的方法制备得到的双阴性T细胞的活率≥90％，基因组PD-1敲除Indel百分率≥65％，细胞表面的PD-1敲除率大于90％，且CD3阳性率大于90％；此外，其Tscm细胞增长率和靶细胞杀伤效果均得到显著提升。

本发明的基因组编辑方法适用于DNT细胞并可以扩展于真核细胞中任一基因组基因的敲除。此外，基于前体crRNA结构的重复序列，单个Cpf1核酸酶可以识别并驱动几个不同的向导crRNA，因此，本发明的基因组编辑方法可用于真核细胞单基因组和多重基因组的同步敲除。

本发明的双阴性T细胞和细胞制剂

本发明还提供了一种PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞，其采用如本发明第一方面所述的方法制备得到。

基于本发明的PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞，本发明还提供了一种细胞制剂，所述制剂包含：(a)本发明第二方面所述的PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞，和(b)药学上可接受的载体。

在本发明的另一个实施方式中，所述PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞被进一步修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)。示例性的CAR包括(但不限于)靶向CD19、Mesothelin(MSLN)、CD5、CD7、CD20、CD22、CD33、CD123、BCMA、IM19、GPC-3、Claudin18.2、NY-ESO-1、GD2、EGFR、HER2、MUC1、PSMA的CAR。因此，所述细胞制剂包括：负载有嵌合抗原受体的PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞，以及药学上可接受的载体。

在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述DNT细胞的浓度为1×10⁵-1×10⁸个细胞/ml，更优地1×10⁵-1×10⁶个细胞/ml。

在一个实施方式中，所述制剂中“药学上可接受的载体”可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水、细胞冻存液等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选被配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明还提供了本发明第二方面的PD-1基因敲除的双阴性T细胞和本发明第三方面所述的细胞制剂的用途，用于制备预防和/或治疗肿瘤(或癌症)的药物，以及用于治疗/或预防肿瘤(或癌症)。

所述的癌症包括各个进展期的肿瘤，包括临床上I期到IV期肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或实体瘤。用本发明的细胞或细胞制剂治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、卵巢癌。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明基于CRISPR-Cas12a基因编辑系统，提供了一种在DNT细胞中准确高效地敲除PD-1基因的方法；使用本发明的方法，PD-1基因组敲除率高于65％(Indel分析)，PD-1表型鉴定其敲除效率高于90％，且经转染后的细胞存活率可达到90％以上。

(2)本发明提供的PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞(DNT-PD1-KO细胞)对靶细胞具有显著提高的杀伤效果，尤其是在低效靶比(E：T)的情况下，相对于PD-1敲除前的DNT细胞，DNT-PD1-KO细胞对靶细胞的杀伤效率可以提高10％以上。

(3)本发明的制备方法操作简便，安全高效，适用于大规模生产。

(4)本发明的基因敲除技术适用于DNT细胞并可以扩展于真核细胞中任一基因组基因的敲除。又因为，基于前体crRNA结构的重复序列，单个Cpf1核酸酶可以识别并驱动几个不同的向导crRNA，因此，本发明的基因敲除技术可用于真核细胞单基因组和多重基因组的同步敲除。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例

实施例1：同种异体双阴性T细胞精确定点敲除免疫抑制点PD-1基因组

1.1PD-1基因组敲除靶点序列设计

PD-1基因组序列从基因库调出(NCBI Gene Bank：NM_005018.3)，根据Cas12a特异性亲核活性识别序列(5’-TTTN-3’)，其设计的敲除靶点序列见表1。

表1：PD-1基因组Cas12a敲除靶点筛选序列表：

靶点1	SEQ ID NO:1.	GCACGAAGCTCTCCGATGTGTTG
			靶点2	SEQ ID NO:2.	ATCTGCGCCTTGGGGGCCAG
靶点3	SEQ ID NO:3	GAACTGGCCGGCTGGCCTGG

1.2靶点筛选

本发明采取质粒表达系统筛选PD-1基因敲除靶点。

Cas12aCpf1 cDNA序列来自Addgene：PY016，Cpf1表达由CMV启动子启动。筛选靶点序列置于Cpf1 cDNA序列前端，由人U6启动子启动，基因合成由武汉金开瑞生物技术公司完成。crRNA序列3’端添加9个Uridine，以此稳定表达的单链RNA；9个Uridine序列其间，由一个任意碱基(N)隔开，即UUUUNUUUUU；crRNA由吉玛生物科技合成。RC自建Cpf1蛋白和向导RNA共表达载体，以此内源性地切割重组基因组。质粒转染293T细胞72小时，提取转染细胞基因组，进行巢式PCR(nest PCR)：扩增PD-1基因组(PD-1靶点上下游序列300-350nt片段)，然后T7E1酶切，筛选出最优向导RNA靶点：1号靶点。图1显示了1号靶点载体U6-4-Cpf1的T7E1酶切实验结果。

1.3化学合成向导RNA

以下所有功能研究均使用优选的1号靶点序列。

完整的向导crRNA由5’端手柄假结构，种子区(S)和3’末端组成。种子区和3’末端与目标DNA序列具有互补的结合序列。化学合成时，在向导RNA序列3端添加6-8个uridine以增加RNA链的稳定性。向导RNA合成单位：吉玛生物科技。合成的针对1号靶点的向导RNA序列如下所示：

RScrRNA序列(SEQ ID NO:4)：

UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGCACGAAGCUCUCCGAUGUGUUGUU UUUUUU

1.4选定核酸酶

在本发明的实施方式中，所述核酸酶Cpf1可以是但不限于AsCas12a，或者LbCas12a，或者突变的优化的Cpf1核酸酶。在本实施例中，使用AsCas12a核酸酶，生产厂家：Integrated DNA Technologies,Inc.(IDT)，核酸酶规格：100μg/10μl。

1.5DNT细胞培养

DNT细胞由健康供者外周全血分离冻存(参见专利ZL201410259944.0)。

实验步骤总结如下：使用CD4和CD8抗体分离去除CD4+和CD8+细胞，冻存，记为Day0天细胞。在细胞复苏培养前一天，使用抗CD3抗体(OKT3)包被培养皿过夜。新鲜配制培养基X-Vivo TM 15，Lonza(加入FBS和IL-2)，复苏冻存细胞时，用培养基洗涤解冻DNT细胞1次，加至预热的培养皿中，37℃，5％CO₂培养细胞。在抗CD3抗体(OKT3)包被培养皿中培养富集以激活DNT细胞。补充新鲜培养基继续培养至Day7进行电转染。

本发明上下文所用培养基的具体成分参见专利ZL201410259944.0。

1.6DNT细胞电转染

试剂和仪器：

电转仪：Lonza，4D-NucleofectorTM；程序：CK-137；试剂盒：AmaxaTM PrimaryCell P2试剂盒(V4XP-2024)，电转染体积：100μl±10。

Cas12核酸酶：AsCas12a：100μg/10μl(IDT，633pmol，成品溶液)，以培养基稀释为5μg/μl，分装后-20℃冻存。

向导RNA：RScrRNA序列(Seq ID No:4)，吉玛生物科技，1OD/33ug/管，按说明书以IDT Buffer稀释。分装后-80℃冻存。

电转染具体操作步骤：

(1)Cas12核酸酶/RScrRNA复合物(RNP)制备：以每个反应为例：取AsCas12a100pmol，RScrRNA 250pmol，加X-Vivo培养基至总体积20μl，轻轻混合，室温培育15分钟；得到RNP 100pmol。

由于核酸酶通常保存在含50％甘油的缓冲液中。在实验调试过程中发现，RNP体系甘油总浓度维持在10％以下，RNP形成比较好，有更好的转染效果。

(2)细胞准备：将冻存复苏培养至第7天的DNT细胞，AO/PI染色，K2细胞计数仪计数。每个实验样品取1.00E+06个DNT细胞，加入1xPBS洗涤细胞，100g，10min离心。

(3)电转液S1/P2配制：每个样品取18μL的S1和82μL的P2，配置于1.5ml无菌EP管内。

(4)电转染：弃去DNT细胞上清液，加入配制的电转液S1/P2，重悬细胞。加入上述步骤(1)配制的RNP，每个样品20μL，轻轻混匀，以每个样品100μL±10μL的体积电转。

(5)电转染后，室温孵育1分钟，然后将细胞传输回预热的24孔板(400μL/孔完全培养基)，37℃，5％ CO₂培养箱培养，记为电转Day0细胞。

1.7DNT细胞基因组制备

电转染72小时后，测定活细胞比率，制备DNT细胞基因组，具体方法如下：

收集电转染72小时的DNT细胞，K2细胞计数及细胞活率检测，活细胞比例>90％，见表2。取出1x10⁵细胞，离心，去除上清液，用水重悬，细胞热裂解法提取基因组。其余细胞继续培养。细胞热裂解：1x10⁵细胞重悬于体积60μl的水中；85℃，10min；95℃，10min。涡旋混匀，瞬离。Nanodrop N60测定基因组DNA浓度，-20℃保存。

实施例2：PD-1基因组敲除DNT细胞(DNT-PD1-KO)的鉴定

2.1DNT-PD1-KO细胞基因组测序

2.1.1基因组测序样品准备(扩增子PCR)

根据优选的1号靶点序列，设计PCR引物，引物5’端加接头序列(read 1,read2)，引物序列见SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6。

FastNGS-F2(SEQ ID NO:5):

TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTTCTTAGACTCCCC AGACAGG

FastNGS-R2(SEQ ID NO:6):

GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTGACCACGCTCAT GTGGAAG

PCR体系：

PCR程序：

Step1.98℃for 3min；

Step2.98℃for 15s；

Step3.57℃for 10s；

Step4.72℃for 10s；

循环Step2-Step4，7个循环，每个循环升高1℃；

Step5.98℃for 15s；

Step6.64℃for 10s；

Step7.72℃for 10s；

循环Step5-Step7，25个循环；

Step8.72℃for 5min；

Step9.4℃保持。

取10μl PCR产物，2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2所示：PCR产物315bp，见图2箭头所指。其余PCR产物-20℃冻存，送样测序。

PCR产物测序送样要求：PCR原液浓度>＝5ng/μl，体积>＝20μl，主带无明显降解。

2.1.2电转染细胞基因组测序(FastNGS测序)

电转染细胞基因组测序和分析由擎科生物Illumina平台完成(8)。送检样品质量和测序质量：Q30碱基百分比在87.27％及以上(Q30：碱基识别出错的概率1/1000)；碱基识别精度：99.9％。分别将各样品的Clean Reads与指定的参考序列进行序列比对，参考序列见SEQ ID NO:7(PD-1基因组,NCBI Gene Bank：NM_005018.3)。根据比对结果使用prank软件检测每个样品的SNP和INDEL信息，计算Indel百分率(包括Deletion、Insertion和Mutation)。

SEQ ID NO:7(PD-1基因序列，NCBI Gene Bank：NM_005018.3):

TTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGAC TTCCACATGAGCGTGGTCA

PD-1敲除Indel百分率计算公式：(1－PD1序列完全匹配率)×100％。

结果如表2和图3所示。

2.2DNT-PD1-KO细胞表型流式鉴定

DNT-PD1-KO细胞表型鉴定实验具体操作：

(1)收集电转染RNP DNT细胞(Day7-9，混匀后K2细胞计数仪计数(AO/PI染色1：1)，并检测细胞存活率>90％。

(2)实验样品准备：取2x 10⁵个细胞/管，PBS清洗离心，弃上清，以流式缓冲液重悬细胞至100μl，按照以下分组，分别加入对应的流式抗体2μl/管，4℃避光孵育30min。加入PBS 3ml清洗，300g，5min离心弃上清。流式缓冲液100μl重悬细胞，上机检测。流式仪：FACSCanto II，BD。

流式抗体：CD279-APC(抗PD-1抗体，Biolegend，329908)；CD3-FITC(抗CD3抗体，Biolegend，300306)。

分组：

对照组：阴性对照：DNT细胞，

阳性对照：DNT细胞+CD279-APC；

DNT细胞+CD3-FITC

实验组：DNT-PD-1-KO-1+CD279-APC；

DNT-PD-1-KO-1+CD3-FITC；

DNT-PD-1-KO-2+CD279-APC；

DNT-PD-1-KO-2+CD3-FITC

DNT细胞PD-1敲除百分率计算公式：

PD-1敲除百分率＝(阳性对照组PD-1⁺％－实验组PD-1⁺％)/(阳性对照组PD-1⁺％)×100％

结果如表2和图4所示。

2.3DNT-PD1-KO细胞活力检测、基因组测序分析、细胞表型鉴定结果

DNT-PD-1-KO细胞电转染72小时后细胞存活率、扩增子测序Indel百分率、电转染第9天PD-1表达流式表型鉴定结果见表2：表2是RNP 100pmol剂量组三次实验的总结。分别是指：实验-1，实验-2，实验-3。

实验结果显示在本系统电转染条件下，DNT细胞电转染72小时后细胞存活率均达到90％以上。连续三次实验送检样品扩增子测序平均INDEL％>65％。流式表型鉴定PD-1平均敲除率在90％以上。

表2：DNT PD-1-KO细胞电转染72小时后细胞存活率、Indel百分率，电转染第9天PD-1表达流式表型鉴定总结表

扩增子测序实例图，见图3。图3是三次实验样品送擎科生物Illumina平台测序分析，以其中一个样品的测序分析条带为示例。Cas12a系统crRNA与基因组的碱基配对向crRNA的3’端进行，Cas12a/向导RNA对于基因组碱基匹配的检查大约18个碱基，DNA切割发生在向导RNA的16nt或17nt后，这解释了Cas12a系统更有可能只编辑靶基因的预期部分，达到预期的准确性。图3测序结果显示了PD-1基因组切割原则上发生在crRNA的16nt或17nt后的准确位置上，与理论预期相符合。

流式表型检测表明PD-1基因组敲除率达到90％以上，检测实例见图4。连续三次PD-1基因组敲除实验(RPN剂量：100pmol)PD-1敲除率平均达到90％以上。

并且，连续三次PD-1基因组敲除实验的细胞，其CD3阳性率均高于90％(图5)。CD3阳性是DNT细胞的特征标志之一，流式检测表明PD-1基因组敲除没有改变DNT细胞的特征标志。

2.4流式检测Tscm细胞增长率(*/memory phenotype of T cells)

细胞样品准备：同上，收集电转染RNP DNT细胞(Day7-9，混匀后K2细胞计数仪计数(AO/PI染色1：1)，检测细胞存活率>90％。

准备2x10⁵细胞/管，PBS清洗，离心，弃上清，以流式缓冲液重悬细胞至100μl，按照以下分组，分别加入对应的流式抗体2μl/管，4℃避光孵育30min。加入PBS 3ml清洗，300g，5min离心弃上清。流式缓冲液100μl重悬细胞，上机检测。流式仪：FACS Canto II，BD。

流式抗体：CD3-FITC(抗CD3抗体，Biolegend，货号300306)；

CD45RA-APC(抗CD45RA抗体，Biolegend，货号304108)，

CD62L-APC/Cy7(抗抗CD62L抗体，Biolegend，货号304814)，

7-AAD-PerCP-Cy5.5(核酸染料，用于区分死细胞；Biolegend，货号420404)。

分组：

对照组：未电转染DNT细胞：CD3-FITC+CD45RA-APC+CD62L-APC/Cy7+7-AAD-PerCP-Cy5.5

样品组：DNT-PD1-KO细胞：CD3-FITC+CD45RA-APC+CD62L-APC/Cy7+7-AAD-PerCP-Cy5.5

检测结果发现，与未电转染DNT细胞相比，DNT-PD1-KO细胞组的Tscm细胞增长率明显高于PD-1未敲除的DNT细胞组，见图6。

2.5DNT-PD-1-KO细胞存活率和增长曲线

电转染后的DNT-PD-1-KO细胞连续培养至第22天，其存活率良好，均高于90％，见图9A；并具有稳定的细胞增殖率，见图9B。

实施例3：DNT-PD1-KO细胞的肿瘤即时杀伤实验

实验细胞：

对照效应细胞：DNT细胞

本发明效应细胞：DNT-PD-1-KO细胞

靶细胞：A549：7.5x10³/孔；H460：7.5x10³/孔

效应细胞：靶细胞(E:T)比例：40:1；20:1；10:1

3.1RTCA(Real-Time Cell Analysis)多功能实时细胞功能检测实验

使用eSight xCELLigence(Agilent)，实验操作程序：在效应细胞培养第13天时，收集靶细胞，K2细胞计数仪计数，取6.0x10⁴个靶细胞重悬于0.8mL各自完全培养基中(细胞数：A549：6.0x10⁴/0.8ml，10％ FBS F-12K完全培养基；H460：6.0x10⁴/0.8ml，10％ FBS1640完全培养基)，以100μl/孔将计算量的靶细胞铺入对应16孔E电极板中，以各自完全培养基作为空白对照。37℃，5％ CO2培养箱中RTCA仪器上培养过夜。24小时后，即效应细胞培养第14天，收集效应细胞K2细胞计数仪计数，各取1.05x10⁶细胞重悬于0.35ml D2完全培养基中。吸弃16孔E电极板中靶细胞培养上清，加入含20％自体血浆的D2完全培养基和计算量的效应细胞共孵育，总体积200μl/孔。将样品电极板放回37℃，5％ CO₂培养箱中RTCA仪器上继续培养24h后，进行RTCA杀伤结果分析。

3.2生物学功能实验结果检测和分析：

使用RTCA software，DP/TP，Agilent xCELLigence RTCA实时细胞分析仪(Real-Time Cell Analysis(RTCA)，采用微电子生物传感器技术对细胞事件进行实时和连续的监测，包括细胞数量变化，细胞粘附，细胞形态和细胞增殖速率。细胞指数(Cell Index)是一个表示微电极阻抗变化的参数。当细胞接种在E电极板中，E电极板底部微电极阻抗响应与接种在孔中的细胞数量细胞形态以及细胞附着的强度成正比。在相同的培养条件下，当电极上的细胞更多时，阻抗会更大，其显示出的细胞指数(Cell Index)就更大。在这种情况下，细胞指数(Cell Index)值相当于对于孔中存在的细胞数的定量测定。当细胞不存在或不能很好地粘附在电极板上时，细胞指数(Cell Index)为零。取共孵育24小时的时间点细胞指数数据，通过下列公式计算细胞生物学效力：

效应细胞杀伤功能＝((靶细胞Cell Index－效应细胞Cell Index)/靶细胞CellIndex)×100％

RTCA肿瘤细胞即时杀伤实验结果显示，与DNT细胞相比较，DNT-PD1-KO细胞对于H460细胞(PD-L1高表达肺癌细胞株)具有显著增强的杀伤效力。见图7A和图7B，图8A和图8B。

RTCA实验发现，在效应细胞与靶细胞比例高的情况下，DNT细胞和DNT-PD-1-KO细胞对A549和H460靶细胞均有着一致、且较好的杀伤效果(效靶比E:T＝20:1时，杀伤效率在82％-87％之间)。

在效应细胞与靶细胞比较低的情况下，效靶比E:T＝10:1时，DNT PD-1-KO细胞杀伤效率明显高于DNT细胞：DNT PD-1KO细胞对于A549的杀伤效率为76.4％，DNT细胞对于A549的杀伤效率为67.8％(图7B)；DNT-PD-1-KO细胞对于H460的杀伤效率为67.4％；DNT细胞对于H460的杀伤效率为52.8％(图8B)。

总结：

本发明选择的CRISPR-Cas12a系统更适合人类生物医药系统的基因组编辑。因为Cas12a-crRNA复合物识别靶基因组DNA富含T的PAM序列(TTTN)，相比较于Cas9系统识别富含G的靶基因组PAM序列(NGG)来说，其识别精密度要求更高；同时由于Cas12a是单个crRNA分子引导的核酸酶，Cas12a相关的CRISPR阵列可以加工多重成熟的crRNA，引导多重基因编辑而不需要额外的反式激活crRNA(tracrRNA)。

由于Cas12a核酸酶通常保存在含50％甘油的缓冲液中。在本发明的实验调试过程中发现，配制RNP纳米颗粒体系，其甘油总浓度维持在10％以下，RNP纳米颗粒形成比较好，有比较好的转染效果。

在本发明所用的基因编辑系统中，发明人调整并确定了核酸酶与引导crRNA比例为1：2.5。在试验过程中，RNP纳米颗粒剂量是100pmol/10E6细胞，72小时后转染的细胞存活率均可达到90％以上，PD-1基因组敲除率高于60％(Indel分析)；电转染7天后，PD-1表型鉴定其敲除效率高于90％。为了扩大生产的需要，目前将试验调整到158pmol RNP纳米颗粒剂量用于2.5E6细胞。同样达到了预期的基因编辑效果：即电转染72小时后的细胞存活率均可达到90％以上；电转染7天后，PD-1表型鉴定其敲除效率高于90％。这个基因编辑系统所需的RNP剂量，远远小于目前其他市场上的电转染剂量。为今后扩大生产奠定了基础。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞(DNT)制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(i)提供分离的同种异体双阴性T细胞；

(ii)激活并培养所述双阴性T细胞后，转染Cas12a核酸酶/crRNA复合物，从而敲除所述双阴性T细胞中的PD-1基因；其中，所述crRNA针对具有SEQ ID NO:1所示序列的敲除靶点序列；

(iii)测定转染后双阴性T细胞的活率、基因组PD-1敲除Indel百分率和细胞表型，检测合格即得到所述PD-1基因敲除的双阴性T细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(ii)中，培养所述双阴性T细胞5-7天(较佳地，7天)后，进行转染。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在制备所述Cas12a核酸酶/crRNA复合物时，体系内的甘油总浓度维持在10％以下。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cas12a核酸酶/crRNA复合物中Cas12a核酸酶与crRNA的摩尔比例为1：(2-3)；较佳地为1：2.5。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(ii)中，所述Cas12a核酸酶/crRNA复合物的转染剂量为60-120pmol/10E6细胞，较佳地为100pmol/10E/6细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cas12a核酸酶选自下组：AsCas12a、LbCas12a、或其优化的突变体、或其组合。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(iii)中，“检测合格”是指：

(1)待测双阴性T细胞的活率≥90％，较佳地≥95％；

(2)待测双阴性T细胞的基因组PD-1敲除Indel百分率≥60％，较佳地≥70％；

(3)待测双阴性T细胞的细胞表型如下：PD-1敲除率大于90％，且CD3阳性率大于90％。

8.一种PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞，其特征在于，所述细胞采用如权利要求1-7中任一项所述的方法制备得到。

9.一种细胞制剂，其特征在于，所述制剂包括：(a)如权利要求8所述的PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞；和(b)药学上可接受的载体。

10.一种如权利要求8所述的PD-1基因敲除的同种异体双阴性T细胞的用途，其特征在于，用于制备治疗和/或预防肿瘤的药物。