CN120835926A

CN120835926A - 产脂质海洋微藻

Info

Publication number: CN120835926A
Application number: CN202380087093.3A
Authority: CN
Inventors: J·A·C·阿尔彻; N·A·莫克塔尔
Original assignee: Hutan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hutan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-19
Filing date: 2023-12-14
Publication date: 2025-10-24
Also published as: WO2024132882A1; AU2023412833A1; EP4638699A1

Abstract

本发明提供了石莼纲石莼目海洋微藻藻株，所述藻株可用于高效且对环境有益地制备三酰基甘油酯和多不饱和脂肪酸，所述三酰基甘油酯和多不饱和脂肪酸进而能够用于燃料或饲料。

Description

产脂质海洋微藻

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2022年12月19日提交的马来西亚专利申请PI2022007223的优先权的权益，并且将所述马来西亚专利申请以其整体并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及新型海洋微藻以及其相关的新型方法和材料，例如使用微藻生产燃料、特种化学品或其他产品。

背景技术

将全球变暖限制在比工业化前温度高2℃的策略的核心在于将未来CO₂排放限制在低于目前化石燃料储量的排放水平。如果采用这些选项，在2020-2050年期间将有很大一部分的化石燃料储量保持未被使用，并且尽管能源和石化行业在即将到来的一段时期很可能仍是主要的供应者，但仍然迫切需要替代且可持续的石化商品来源。

运输产生了全球CO₂排放的大约29％。因为它们需要高能量密度的液体燃料，对于脱碳最具挑战性的运输方式是海运、重型运输和航空。这些行业，特别是海运和重型运输，对世界经济的平稳运行至关重要。

生物燃料，诸如通过生物质衍生的糖的发酵产生的生物乙醇或通过以生物方式产生的三酰基甘油酯的酯交换产生的脂肪酸甲酯生物柴油，是一类由细胞合成的高能量碳氢化合物。光合生物是这些分子的能量效率最高的来源。

微藻细胞是藻类生物燃料生产系统中最重要的组分。其光合和代谢能力限定了生物质和三酰基甘油酯合成的操作极限，合成控制生物燃料生产率。微藻极其多样并且已经扩展到占据能够支持光合自养代谢的每一个陆地、淡水和海洋环境[1]。然而，尽管可获得巨大的微藻生物多样性，估计数量有一百万个物种[2,3]，但筛选生物燃料生产藻株的规模有限并且很大程度上局限于数量少于50,000种藻株的现有学术培养物保藏库[4,5,6,7]。因此，大规模生物燃料计划中的性能测试仅限于小球藻属(Chlorella)、链带藻属(Desmodesmus)、单针藻属(Monoraphidium)、栅藻属(Scenedesmus)和微拟球藻属(Nannochloropsis)藻株，它们对非生物胁迫和生物胁迫的反应很差，导致非常低的生物质产量和脂质含量[8,9]。

如上所解释的，需要具有更高真实世界三酰基甘油酯生产率的新藻株，所述藻株可以在培养期间经历的多种非生物胁迫下高效地运行。

US2014/0199739(Calleja等人)涉及属于等鞭金藻属(Isochrysis)的微藻藻株，据报道所述藻株以混合营养模式产生多不饱和脂肪酸，值得注意的是二十碳五烯酸。此出版物进一步涉及使用以闪光形式的不连续光供应来选择和培养此类藻株的方法。这旨在允许与较弱光强度供应有关的空间和能量的可能节省。

US 8067225(Fernandez Sevilla等人)涉及栅藻属微藻物种藻株以及其用于动物和/或人类消费和生产类胡萝卜素的用途。所述藻株是在Cajamar的Las Palmerillas实验站分离的。

WO 2005003309涉及进化枝B属共生藻属(Symbiodinium)的分离的产伪蕨素藻的培养。优选条件是14小时光照-10小时黑暗周期以及在约20℃至约30℃的温度下照射约30至150μmol光子m^-2s^-1。

US2015/0337255涉及一种用于微藻的培养方法，所述方法使用pH为4或更低的肉汤在开放的室外培养系统中培养属于胶球藻属(Coccomyxa)的单细胞绿微藻和与其密切相关的生物群，或Watanabea进化枝。所述发明进一步涉及一种用于伪胶球藻属(Pseudococcomyxa)微藻的培养方法。

可见，提供新型微藻物种，特别是那些对环境具有新颖适应性的微藻物种，将对本领域做出贡献。

发明内容

我们对马六甲海峡和南中国海进行了生物勘探调查。两者的特点都在于非常高的太阳辐射率、全年高温和可变/高盐度海水(太阳辐射高达2100μM光子.s^-1.m^-2；全年海水高温28℃-30℃；可变的高盐度水域32-34PSU)。这些条件可以提供最佳的海洋环境用于适应高光、高温、高盐度的微藻的进化。

我们开发了一种高效且可规模化的第四代海洋微藻生物燃料生产技术，所述技术由一套全新的嗜极海洋微藻的属(我们将其命名为球形藻属(Sphaerica))的多种分离株组成。已经使用定向进化方法对这些分离株进行工程改造以产生高度高效的碳捕获和转化生产藻株，所述藻株可以使用大气、压缩、回收的CO₂或工业烟道气在大型光生物反应器中培养并且与适当的生物质/脂质下游加工步骤组合以产生有用的产物类别，包括基于或衍生自球形藻属三酰基甘油酯的碳中性生物燃料(“生物油”)、多不饱和脂肪酸(PUFA)和高蛋白、富含PUFA的鱼饲料和动物饲料。另外，球形藻属可以充当有效、可持续且经济的用于工业烟道气的碳捕获脱碳剂。

特别地，提供了定向进化工程改造的球形藻属藻株的例子，其可以利用高水平的阳光、温度和高可变盐度。因此，它们能够在符合其生长需求(光、温度和盐度)的热带和亚热带地区高度高效地产生生物质、生物油、PUFA和其他生物质衍生产物。另外，球形藻属也可以在人工系统中培养，诸如在亚热带/热带地区以外的地方使用人造光源和热源培养。

三种球形藻属分离株HB001、HB002和HB003已保藏在藻类和原生动物培养物保藏中心(Culture Collection of Algae and Protozoa)。另外，还分离和鉴定了19种其他球形藻属物种。总的来说，这些代表了由本文所述的表型和基因型性状定义的单细胞海洋微藻的独特新属的一部分。

因此，在一个方面，本发明提供了石莼纲石莼目的新型海洋微藻藻株，其特征在于表型和基因型特性的新型组合。

鉴于本公开文本，可以通过从海洋环境中筛选微藻或微藻生物膜，例如通过使用本文所述的包含补充有无维生素氮源、磷和痕量元素的过滤海水的培养基，来提供此类藻类藻株。

在另一个方面，提供了一种用于例如由从亲本保藏藻株或筛选藻株制备衍生(突变)藻株的方法。

关于本发明的海洋微藻，本发明进一步提供了培养、储存或使用所述藻株例如以生产生物质或生产产物的方法。

在另一个方面，提供了一种生产通过微藻培养产生的微藻生物质或生产所希望的产物的方法，所述方法包括培养本发明的海洋微藻群体。

微藻群体将共同具有上述特征，例如约280nm的平均EPS厚度等。

产物的例子包括生物燃料或生物燃料添加剂，其包括微藻三酰基甘油酯、多不饱和脂肪酸(PUFA)和高蛋白食物或饲料。另外，分裂后脱落的微藻荚膜可以是丰富的蔗糖来源，这为发酵提供了低碳糖来源。

本发明进一步提供了从所述藻株获得或可获得的这些产物，例如以分离或富集的形式，或利用这些微藻产物的下游产物。

在另一个方面，提供了本发明的微藻藻株或相关方法用于从含有CO₂的气体中捕获碳的用途，所述气体任选地是工业烟道气。

现在将更详细地描述这些方面和实施方案中的一些。

具体实施方式

本发明涉及石莼纲石莼目的新型海洋微藻藻株。这种新的绿色植物属(Chlorophyte genus)在本文中被称为球形藻属。

为了支持本发明，三种球形藻属分离株HB001、HB002和HB003已于2022年4月26日作为专利藻株保藏在藻类和原生动物培养物保藏中心(Culture Collection of Algaeand Protozoa)，具有以下编码：

CCAP 2271/1球形藻属物种HB001

CCAP 2271/2球形藻属物种HB002

CCAP 2271/3球形藻属物种HB003

藻类和原生动物培养物保藏中心,Scottish Association for Marine Science(SAMS)Ltd.英国阿盖尔郡奥班(Oban,Argyll)PA37 1QA。

将这些保藏物通过引用并入本文。本发明的分离藻株以前尚未向公众公开。

如本文所用，HB002也可以称为“HBMSM0012”。HB003也可以称为“HBMSM0031”。HB001也可以称为“HBMSM0061”。

除了HB001、HB002和HB003，本发明诸位发明人还分离和表征了十九种其他球形藻属物种：HBMSM0011；HBMSM0013；HBMSM0014；HBMSM0015；HBMSM0021；HBMSM0022；HBMSM0023；HBMSM0032；HBMSM0033；HBMSM0034；HBMSM0051；HBMSM0053；HBMSM0054；HBMSM0062；HBMSM0063；HBMSM0064；HBMSM0065；HBMSM0081和HBMSM0082。

总的来说，这些保藏的藻株代表了由本文所述的有利的多基因性状定义的单细胞海洋微藻的独特新属的一部分。小亚基18S rRNA序列数据证明藻株是独立和遗传异源的(图6)。更具体地，全长HB001、HB002和HB003 18S rRNA序列用作生成图6的系统发育分析的初始输入。球形藻属HB001、HB002和HB003 18S rRNA序列长1797bp并且源自每个HB物种的球形藻属基因组序列的功能注释，特别地通过密切相关属(由以下定义的绿藻门(Chlorophyta)：Lin,G.M.,Lai,Y.H.,Audira,G.和Hsiao,C.der.(2017).A Simple Methodto Decode the Complete 18-5.8-28S rRNA Repeated Units of Green Algae byGenome Skimming.International Journal of Molecular Sciences,18(11).https://doi.org/10.3390/IJMS18112341)中的序列保守性。

对于完整性，注意到图6中包括来自两个公共数据库序列条目的称作AB058352和AB058374的序列。这些序列长度为1746bp并且明显是使用寡核苷酸引物产生的，所述引物结合来自某些来源藻株的全长18S rRNA基因内部的高度保守区域。然而，如下文实施例3中更详细讨论的，这些部分序列的来源生物似乎没有被保藏并且已经证明不可从任何其他来源获得。也没有任何关于完整序列的进一步信息或可用的任何表型信息(例如，结构、超微结构和代谢等)。因此，明显获得这些序列的生物仍然不清楚。

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因此，在本发明的一个方面，提供了一种海洋微藻藻株，其特征在于以下特性(i)-(viii)中的至少5、6、7或8种：

(i)是单细胞且单核的；

(ii)无运动性且没有纤毛和鞭毛；

(iii)具有总体上球形的细胞；

(iv)具有约1.00至11.0μm、更优选1.5-10.3μm的直径；

(v)具有0.180μm to 0.400μm厚、更优选0.210至0.350μm厚的胞外多糖荚膜；

(vi)具有壁生叶绿体和单个蛋白核；

(vii)包含脂质体；

(viii)能够在母体荚膜内通过以下方式进行无性生殖：一个产生2个无运动性子细胞或两次彼此成大约90°连续分裂成为4个无运动性子细胞。

所述藻株还：

(ix)每个叶绿体具有120至300个类囊体膜；以及

(x)具有展现出与图5所示的18S rRNA序列的97％或更高的碱基序列同源性的18SrRNA。

在一个实施方案中，所述藻株的特征在于具有特征(i)-(x)中的全部。

在一个实施方案中，所述藻株的特征在于：

(i)叶绿体在成熟细胞中(任选地展现出五辐射对称性)并且是在壁生的，占据上细胞半球的五辐射对称性，并且裂片延伸到含有所述脂质体的剩余半球中；和/或

(ii)类囊体包封大约17nm宽的内腔并且形成遍及所述叶绿体的连续结构，并且类囊体平行于细胞膜；和/或

(iii)中性脂质含量可以达到细胞干质量的5％至70％，任选地5％至65％。

在一个实施方案中，所述藻株选自HBMSM0011；HBMSM0013；HBMSM0014；HBMSM0015；HBMSM0021；HBMSM0022；HBMSM0023；HBMSM0032；HBMSM0033；HBMSM0034；HBMSM0051；HBMSM0053；HBMSM0054；HBMSM0062；HBMSM0063；HBMSM0064；HBMSM0065；HBMSM0081和HBMSM0082。

在本发明的一个方面，提供了一种微藻藻株，其特征在于所述微藻藻株由保藏在CCAP的登录号为CCAP 2271/1、CCAP 2271/2或CCAP 2271/3的分离藻株组成。

在本发明的一个方面，提供了一种微藻藻株，其特征在于所述藻株是球形藻属藻株并且存在于石莼纲内的与保藏在CCAP的登录号为CCAP 2271/1、CCAP 2271/2或CCAP2271/3的藻株(参见图6，如上所指，CCAP 2271/1是球形藻属物种HB001，又称HBMSM0061/20；CCAP 2271/2是球形藻属物种HB002，又称HBMSM0012/20；CCAP 2271/3是球形藻属物种HB003，又称HBMSM0031/20)相同的系统发育进化枝。

如本文所解释的，本发明的微藻藻株可以通过使用补充有无维生素氮源、磷和痕量元素的过滤海水从海洋环境中筛选微藻、任选地微藻生物膜而获得或可获得的。

例如，球形藻属HB001、HB002和HB003藻株能够在简单培养基上快速繁殖至高生物质含量，所述简单培养基包含补充有FSM培养基(7.0592mM NaNO₃、0.3261mM NaH₂PO₄.H₂O、0.0233mM FeCl₃.6H₂O、0.0259mM C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O、7.85004 10^-5mM CuSO₄.5H₂O、0.000152mM ZnSO₄.7H2O、0.000154mM CoCl₂.6H₂O、0.001818mM MnCl₂.4H₂O、5.20730 10^- ⁵mM Na₂M0O₄.2H₂O)的过滤的非无菌海水38-45PSU；不含维生素补充剂也不含抗生素和抗真菌剂(参见图7)。

因此，可以通过以下方式使用选择培养基诸如“FSM”实现从海洋环境中筛选微藻：

(i)在所述培养基中的任一种中培养多样化的微藻池；

(ii)将所述培养物维持几个世代；

(iii)分离在所述世代中细胞数量增加最多的一个或多个藻株。

培养条件可以包括：

(i)在18℃与40℃之间，例如30℃-35℃的培养温度；

(ii)500μM光子PAR 400nm-700nm.s^-1.m^-2或更高的照射。

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本发明的藻株表现出优异的特性。

例如，球形藻属HB001、HB002和HB003在气升平板式光生物反应器中显示出延长的生物质生长曲线，其中在50天内连续生长中细胞生物质从大约1.8kg.m^-3细胞干重增加到大约7.2kg.m^-3细胞干重(图7)。这些藻株能够在包含补充有氮、磷和微量元素的粗过滤(例如，5μm)海水的简单培养基上在高达2100μM光子.s^-1.m^-2太阳日照量的高光水平下快速繁殖到高生物质含量。例如，这显示在光生物反应器中在高达2100μM光子.s^-1.m^-2日光12小时日间/12小时夜晚下实现的生物质生长曲线中(图5)。不需要对氮源进行灭菌，从而避免此类灭菌的能量需求。

此外，球形藻属藻株能够在相同的简单培养基上在可变的高温下快速繁殖到高生物质含量，而不需要冷却。例如，这显示在图8中的生物质生长曲线中，其中培养温度从24℃变化至35℃。

我们已经表明，球形藻属将在45℃下保持存活72小时。虽然它在45℃下不会快速生长，但当温度降至低于40℃时，它仍保持活力并且快速恢复快速细胞生长。此外，它低至至少4℃仍保持代谢活性。

因此，在一个实施方案中，所述微藻藻株的特征在于：

(i)与150、200、250或300μM光子s^-1.m^-2的最大值相比，当在最大日间日照量为大于或等于约1600、1700、1800、1900、2000、2100μM光子s^-1.m^-2的12:12日/夜周期中进行外部培养时具有更高的生长速率；

(ii)在45℃下培养72小时后仍然存活。

如上所指，球形藻属藻株能够在简单培养基上在氮限制条件下快速繁殖到高生物质，其具有非常高的脂质含量(>60％细胞干重脂质)(参见图8)。所述藻株可以产生简单的短链三酰基甘油酯(“TAG”-C₁₆-C₁₈)以及多不饱和脂肪酸(“PUFA”)。这可以例如见于总脂质提取物的球形藻属HB003 GC-MS图(图10)和图14，其示出了高水平的生物燃料TAG组分十六烷酸、十八碳二烯酸、和来自二十碳二烯酸、花生四烯酸、亚麻酸等的高价值PUFA衍生物。

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在一个方面，提供了一种用于制备上述本发明任何藻株的衍生藻株的方法，例如通过定向进化。

典型地，衍生藻株具有与保藏藻株相比相同或相似(或改善)的生物活性，即典型地，衍生藻株将维持或改善本文所述藻株的关键有利特征。

还提供了用于通过诱变和选择从保藏藻株制备衍生藻株的方法。

还提供了用于通过基因插入\缺失\修饰从保藏藻株制备衍生藻株的方法。

衍生藻株(其为“突变体”)是已经历突变的藻株，所述突变即例如与原始亲本生物(例如，本发明的保藏藻株)中存在的核酸或氨基酸序列相比核酸序列(诸如基因序列)或氨基酸序列发生变化。

突变可以自发发生，或者可以例如使用分子生物学方法引入。在具体例子中，突变包括一个或多个核苷酸取代、缺失、插入或其组合。

在一个实施方案中，定向进化包括以下步骤中的一个或多个：

(i)在选自高盐度和/或高日照量的环境胁迫下培养所保藏的亲本藻株，其中所述胁迫的强度逐步增加；

(ii)将所述培养物维持几个世代；

还提供了一种用于制备衍生藻株的方法，所述方法包括诱变和选择本发明的藻株之一。

为了选择或筛选藻株，可以在微孔板上在相同的封闭空间中平行培养多种藻株，同时精确监测多种培养物的状况和发育。

被动或主动诱变和选择的方法通常可以包括以下步骤中的一个或多个：

(i)在促进诱变的条件下培养所保藏的亲本藻株；

(ii)将所述培养物维持几个世代；

除了这些方法之外，还可以利用DNA诱变和突变体筛选。DNA诱变是本领域技术人员所熟知的并且包括各种化学和酶方法。

此类方法的例子包括但不限于将受试生物暴露于紫外线(UV)、亚硝酸、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NG)和4-硝基喹啉-N-氧化物(4NQO)(Leninger(1972)Biochemistry.Worth Publishers Inc.,纽约；Jeffrey H.Miller(1972)"Experiments inMolecular Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory,纽约冷泉港)。

举例来说，突变体可以通过将球形藻属细胞暴露于UV光约10至约180秒、优选45至约90秒并且最优选65至75秒的时间段来产生。涉及NG的诱变可以涉及改变NG的浓度和暴露时间。举例来说，可以使用NG(约13毫克/升(mg/L)至约400mg/L的NG)持续约15分钟至约120分钟的暴露时间段。

如本文所用，术语“遗传修饰”是指野生型细胞的内源基因组的任何变化，或向野生型细胞中添加非内源遗传密码，例如引入异源基因。更具体地，此类改变是通过使用重组核酸技术或诱变由人手工完成的。所述改变可以涉及蛋白质编码序列或非蛋白质编码序列，诸如作为启动子或增强子的调控序列或其他顺式或反式作用的调控DNA位点或RNA种类。

一般而言，本领域技术人员能够很好地构建载体和设计方案用于重组基因表达或靶基因组的一个或多个修饰。可以选择或构建合适的载体，其含有适当的调控序列，包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他适当的序列。诱变技术的例子包括但不限于寡核苷酸定向诱变、接头扫描突变或使用聚合酶链式反应的寡核苷酸定向诱变。关于进一步的细节，参见例如，Molecular Cloning:a Laboratory Manual:第2版,Sambrook等人,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press or CurrentProtocols in Molecular Biology,第2版,Ausubel等人编辑,John Wiley&Sons,1992。

出版物WO 2014/076571描述了用于修饰藻类细胞中遗传物质的具体方法，所述方法包括使用稀有切割核酸内切酶(例如，归巢核酸内切酶或TALE-核酸酶)来修饰所述靶基因组序列。

其他修饰方法对本领域技术人员而言是熟知的。

成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统是在细菌和古细菌物种中发现的适应性免疫机制，其允许宿主对抗病原体，诸如噬菌体(Barrangou,R.等人Science 315,1709-1712(2007)：Marraffini,L.A.和Sontheimer,E.J.Science 322,1843-1845(2008)；Bhaya,D.、Davison,M.和Barrangou,R.Annual review of genetics45,273-297(2011)；Garneau,J.E.等人Nature 468,67-71(2010))。将噬菌体衍生的30-bpDNA片段插入宿主细胞的CRISPR基因座并且转录为CRISPR RNA(crRNA)。这些与反式编码RNA(tracrRNA)和CRISPR相关(Cas)蛋白形成复合物，并且所述复合物在与crRNA序列匹配的DNA位点引入位点特异性切割。

CRISPR-Cas9是II型CRISPR-Cas系统。来自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的CRISPR-Cas9系统在本领域中被用作在不同生物中进行RNA指导的基因组编辑(RGE)的简单且通用的工具。在Cas9介导的RGE中，单或双链短RNA分子(指导RNA或gRNA)指导Cas9靶向所希望的DNA位点以进行基因组修饰或转录控制。gRNA-Cas9通过在gRNA的5’-末端前导序列(称为gRNA间隔区)与一条DNA链(原间隔区的互补链)之间进行gRNA-DNA配对来识别靶DNA。Cas9还要求在gRNA-DNA配对区域之后的靶位点中存在原间隔区邻近基序(PAM)。可以容易地编程大约20nt长的gRNA间隔区序列以靶向带有PAM的DNA位点。但是gRNA-Cas9还识别与gRNA间隔区不完美匹配的PAM位点，导致基因组编辑中的脱靶风险。因此，设计具有高度特异性间隔区序列的gRNA对RGE而言是至关重要的。

用于植物的CRISPR-cas9质粒是可商购的，例如来自Addgene-参见www.addgene.org/crispr/plant/。

在本发明的上下文中，例如，诸位发明人已经确定了HB003的基因组序列，并且由这些数据，在其基因组序列中鉴定的本发明微藻的基因可以是使用CRISPR-cas9质粒(即，用于提供“gRNA”)或其他RNA指导的位点特异性修饰技术进行编辑的靶标，从而修饰那些基因以便修饰藻株的表型。

本发明进一步提供了海洋微藻，所述海洋微藻衍生自其中任一种，例如通过培养和再选择、随机或定向诱变、或通过其他基因插入、缺失或修饰。

本发明进一步提供了海洋微藻，所述海洋微藻是通过使用如本文所述的选择方法从海洋环境中筛选微藻而获得或可获得的。

这些球形藻属藻株中的任一种都可以用于本发明的方法中，并且在本文中可以简称为“本发明的海洋微藻”。

本发明的此类海洋微藻的特征可以在于本文提及的任何特性。

例如，(衍生)微藻藻株可以是定向进化工程改造的衍生藻株，如球形藻属HB001、HB002和HB003。此类藻株能够在简单培养基上在可变的高盐度条件下快速繁殖到高生物质含量，所述简单培养基包含补充有氮、磷和微量元素的过滤的非无菌海水。举例来说，图9示出了当培养物盐度从40PSU上升到50PSU时，这些藻株从大约1.8kg.m^-3高效地繁殖到7.2kg.m^-3。.

因此，在一个实施方案中，与具有3PSU的其他方面相同的培养基相比，所述藻株能够在PSU大于或等于45PSU的无维生素培养基中更高效地生长。

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在本发明的一个实施方案中，提供了本文讨论的藻株的生物学纯培养物，例如斜面培养物或在液体培养基或肉汤中的培养物。

可以使用常规的洗涤、过滤或沉淀技术诸如离心收获藻株，或者可以使用旋风系统收获藻株。所收获的细胞可以立即使用或如本文所述储存。WO 2008041786 A1中描述了适用于微生物的冷冻干燥技术的非限制性例子。

在本发明的一个实施方案中，提供了所述藻株中的任一种的冻干样品、液氮冷冻样品或甘油冷冻制剂的形式。

在本发明的一个实施方案中，提供了所述藻株中的任一种的细胞提取物；细胞悬液；细胞匀浆；细胞裂解物；或细胞沉淀物。

在本发明的一个实施方案中，提供了所述藻株中的任一种的培养肉汤或无细胞或基本上无细胞的培养肉汤。

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在另一个方面，提供了一种生产通过微藻培养产生的微藻生物质或生产所希望的产物或化合物的方法，所述方法包括培养本发明的海洋微藻群体。

因此，所培养的海洋微藻(例如，作为生物质)可以是产物本身，或者所述方法可以用于生产所希望的化合物，诸如具有商业或工业利益的化学或生物化学产物，其中所述化合物是从培养物中回收的。

培养系统可以包括一个或多个检测器，用于检测选自pH、CO₂、盐度和光强度的一个或多个参数。

在一个实施方案中，在以下条件下培养所述海洋微藻：

(i)温度在约20℃至约50℃之间、优选28℃-35℃；和/或

(ii)pH在6与11之间、优选约pH 8；和/或

(iii)盐度在15至63PSU之间、优选30至40PSU；和/或

(iv)光子强度高达2100μmol光子m^-2.s^-1 400nm-700nm光合有效辐射。

在一个实施方案中，在培养基中培养所述海洋微藻，所述培养基的特征在于盐度范围20-45PSU，例如约20、25、30、35、38、40、42或45PSU。

本领域技术人员将理解，根据本公开文本，可以根据与当地水资源相关的经济因素调节盐度。例如，20PSU是微咸水，并且太平洋/大西洋/印度洋/大澳大利亚湾(GreatAustralian Bight)、巴斯海峡、塔斯曼海、珊瑚海、阿拉弗拉海或任何其他水域或海洋是30-36PSU。

如下所例举的，当在简单培养基上培养时球形藻属HB001、HB002和HB003藻株可以高效地利用工业烟道气(农业废物；椰子壳；棕榈油空果串)作为CO₂的直接来源-参见例如HB003生物质生长曲线(图11)。

因此，在一个实施方案中，在培养期间通过向培养基中鼓入空气将海洋微藻细胞混合，和\或向所述海洋微藻细胞补充CO₂，所述CO₂任选地是工业烟道气。

对于在本发明中的使用，可以从被动或主动冷却的来源(例如，烟囱)捕获工业/农业烟道气，并且优选地所述来源经压缩以供应给培养物(例如，在PBR中)。此类烟道气可以包含相对高的微粒组分和按体积计的高水平(例如，约15％)的CO₂。

在一个实施方案中，提供另外的CO₂来源，例如0.1％至15％、或0.1％至10％或5％。

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球形藻属分离株已经表明在一天开始时就开始光合自养生长，因此可以在非常低的光子通量(例如，1μM光子.s-1.m-2)下生长。然而，通过使用人工光源提供连续照明以增加光子通量来增加生产率以及由球形藻属进行的CO₂捕获和向生物质和三酰基甘油酯的转化(参见例如，HB003生物质生长曲线(图11))。在高光子通量(例如>500μM光子.s-1.m-2)下，当大多数其他微藻藻株受到光抑制时，球形藻属凭借其大量的类囊体膜而仍保持光合活性，所述类囊体膜通过吸收外部类囊体层中的过量光子并且以热的形式辐射能量来发挥减弱光子通量的作用，从而减少更多内部类囊体层中的有效光子通量。因此，它们可以在高光子通量下生长，不像某些当前的藻类生物燃料藻株在高于500μM光子.s-1.m-2下展现出强的光抑制。

对于工业应用，优选的范围是100μM-2100μM光子.s-1.m-2。在一个实施方案中，在人工光下培养海洋微藻。

在一个实施方案中，在约20与约2100μmol光子m^-2.s^-1光合有效辐射(400-700nm)之间的光子强度下培养所述海洋微藻。

优选在周围外部光下(即，在自然日/夜周期下)进行培养，其中培养所处的位置提供了在正常日间暴露峰值下在100与2100之间，例如约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、更多1600、1700、1800、1900、2000或2100μmol光子m^-2.s^-1。

在另一个实施方案中，将海洋微藻在自然日/夜周期下进行外部培养，其中：

(i)所述周期的日间部分峰值的最大光强度是在日间暴露峰值时至少或约1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100或2200-μmol光子m^-2.s^-1；和\或

(ii)在所述周期的日间部分峰值时的最高温度在30℃至约50℃之间，任选地至少35℃、38℃、48℃；和\或

(ii)在培养期间的最大盐度是至少30、35、40、45、50、55、60或63PSU。

在一个实施方案中，在约20℃至约50℃之间，例如24℃至48℃、优选约35℃的温度下培养所述海洋微藻。

在一个实施方案中，在培养基中培养所述海洋微藻，所述培养基的特征在于盐度范围20-60PSU，例如约20、25、30、35、40、45、50、55或60PSU。

在一个实施方案中，所述培养是光合自养的。

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对于工业应用，用脲(一种常用的工业副产物)代替硝酸盐可以达到显著的成本节省。其构成简单，将其三部分组成成分配制品根据需要添加到水/海水/工业盐水中。

优选的培养基是由以下制备的合成培养基：

(1a)天然盐-水来源，例如，海水、微咸水或盐湖，或

(1b)工业盐水副产物，例如来自用于人类消费和灌溉的脱盐、发电厂冷却塔、石油和天然气开采产生的水、酸性矿或酸性岩排放物、反渗透废弃物、氯碱废水处理、纸浆和造纸厂流出物以及来自食品和饮料加工的废物流。

(2)含氮化合物的另外一种或多种来源(例如，硝酸盐或脲)以及磷酸盐；

(3)任选地另外的痕量元素来源；和

(4)优选地不向培养基中添加维生素，也不添加抗生素和抗真菌补充剂。

在一个实施方案中，提供另外的痕量元素来源，并且任选地所述另外的痕量元素来源包含以下中的一种或多种：FeCl₃、CuSO₄、ZnSO₄、CoCl₂、MnCl₂或Na₂MoO₄。

优选的培养基基于非无菌过滤海水，例如地中海、大西洋、太平洋、南中国海、马六甲海峡、印度洋、澳大利亚湾、帝汶海、阿拉弗拉海、卡奔塔利亚湾、珊瑚海、塔斯曼海。

这些水域是高盐分且贫营养的。

通过例如使用0PSU(淡水)稀释至60PSU(工业盐水)来改变盐度，可以将培养基再配制成一定范围的盐度。

在一个实施方案中，所述培养基包含补充有以下的过滤海水：约7mM NaNO₃；约0.3mM NaH₂PO₄.2H₂O；约20μMC₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O；约25μM FeCl₃·6H₂O；约29nM CuSO_4.5H₂O；约150nM ZnSO₄.7H₂O；约150nM CoCl₂.6H₂O；约2μM MnCl₂.4H₂O；约50nM Na₂MoO₄.2H₂O。

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在一个实施方案中，所述方法以分批培养的方式进行。

可以根据规模和所希望的输出或产物按需持续培养过程-例如，可以将细胞保持在对数生长期的中期至晚期，或者培养至静止期。

在一个实施方案中，所述方法以连续培养的方式进行。

所述方法可以使用简单的开放池塘进行。可替代地，所述方法在培养反应器中进行。在一个实施方案中，所述方法在适于接受自然日光的竖直或倾斜培养反应器中进行。

优选地，培养反应器是光生物反应器(“PBR”)，例如，气升柱或平板。

“PBR”是人工构建物，其中针对有效入射光优化了通过藻类培养物的光路。典型地可以通过改变光生物反应器管的尺寸(在气升式PBR的情况下)或板的深度(在平板式PBR的情况下)来增加或减少光路。本发明特别适用于在PBR中实践。

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在一个实施方案中，其中所述方法用于生产选自以下的所希望的化合物或组合物：

(i)包含微藻三酰基甘油酯的生物燃料；和/或

(ii)多不饱和脂肪酸(PUFA)；和/或

(iii)其他脂质级分；

(iv)高蛋白、富含PUFA的食品或者鱼饲料或动物饲料；

(v)发酵用蔗糖。

***

在一个实施方案中，所述培养方法进一步包括以下步骤：从培养中回收、分离、纯化或富集所述所希望的产物。

可以通过各种机械方法从所培养的细胞中纯化球形藻属细胞内代谢物，所述机械方法包括珠磨、水力剪切、压力处理、水热液化或声波处理。细胞裂解后，可以通过使用氯仿/甲醇、己烷或其他合适的有机溶剂系统进行溶剂提取，或通过超临界CO₂纯化球形藻属生物油。

从异源混合物中纯化肽或其他化合物的方法是本领域中熟知的(例如，选择性沉淀、蛋白水解、用已知截留分子量过滤器超滤、离子交换色谱法、凝胶过滤等)。在这方面特别有用的技术是超速离心(例如，150,000x g超过1小时)。已知适用于蛋白质纯化的其他方法披露在“Methods in Enzymology Vol 182-Guide to Protein Purification”编辑M PDeutscher,Pub.Academic Press Inc.。典型的方案也阐述在“Protein Purification-principles and practice”Pub.Springer-Verlag,New York Inc(1982)以及Harris和Angal(1989)“Protein purification methods-a practical approach”Pub.O.U.P.UK，或其参考文献或后续版本。

在适当的情况下，产物可以衍生自培养物的上清液，例如在离心、过滤或倾析之后，任选地随后沉淀。

在一个实施方案中，通过切向流过滤回收所述所希望的产物。

在一个实施方案中，通过溶剂提取从培养物中回收三酰基甘油酯组合物。

提供三酰基甘油酯组合物的方法可以包括以下步骤：

(a)从所述培养物中过滤细胞团；

(b)在极性溶剂的存在下裂解所述细胞团中的藻类细胞，所述极性溶剂任选地是甲醇；

(c)将所述极性溶剂和裂解的细胞材料与非极性溶剂混合，所述非极性溶剂任选地是己烷；

(d)回收含有三酰基甘油酯的非极性溶剂层；

(e)从所述非极性溶剂层中回收三酰基甘油酯。

在一个实施方案中，通过超临界CO2从完整或破碎的干燥细胞中回收三酰基甘油酯组合物。

提供三酰基甘油酯组合物的方法可以包括以下步骤：

(a)从所述培养物中过滤细胞团；

(b)将所述细胞团干燥；

(c)任选地破碎/裂解所述细胞团中的细胞；

(d)使用超临界CO2溶解代谢产物诸如三酰基甘油酯，所述溶解任选地还能够使用有机共溶剂。

本发明还提供了根据本文所述的本发明的方法获得或可获得的产物。

例如，此类产物可以是：

(i)富含三酰基甘油酯的组合物，或

(ii)富含多不饱和脂肪酸(PUFA)的组合物。

典型地，所述组合物将包含三酰基甘油酯和多不饱和脂肪酸两者。

PUFA组合物将典型地包含至少亚麻酸；二十碳五烯酸；和花生四烯酸。

富含三酰基甘油酯的组合物的特征可以在于：

(i)所述三酰基甘油酯中最普遍的脂肪酸类型是十六烷酸和十八碳二烯酸；和/或

(ii)所述组合物包含以下化合物中的一种、两种、三种或四种：1-十六炔；顺式-13-十八碳烯酸；反式-13-十八碳烯酸；1,4-二十碳二烯；和/或

(iii)所述组合物不包含以下化合物：十四烷酸；十七烷酸；十九烷酸。

所述组合物或富含三酰基甘油酯的组合物可以进一步包含：(1α,2β,5α)-2,6,6-三甲基-双环[3.1.1]庚烷；B-谷甾醇；3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇。

富含三酰基甘油酯的组合物的特征可以在于所述富含三酰基甘油酯的组合物包含下文表5中所述的化合物中的一种或多种或全部，所述一种或多种或全部化合物在其中所示的相应％范围内。

富含三酰基甘油酯的组合物的特征在于大体上如图13或表3所示的GC-MS图谱，或具有大体上如表2所示的脂肪酸组成。

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诸位发明人已经表明，球形藻属生物燃料可以用作用于柴油内燃机的化石柴油:生物燃料混合物中的直接燃料。这种直接使用避免了在典型的生物柴油脂肪酸甲酯燃料中由动物和植物来源生产的多样且非常长链脂肪酸常规所需的酯交换步骤。此类常规方法使用每分子三酰基甘油酯3分子乙醇或甲醇；所述醇通常来源于化石燃料，这损害了源自酯交换的生物燃料碳足迹。球形藻属三酰基甘油酯对于柴油燃料应用不需要这种化学修饰。

具体地，未修饰的球形藻属生物油(既不是酯交换的也不是精制的-参见下文)已经成功地作为与石油柴油的低碳共混物用作柴油试验发动机的燃料。优选的共混物包括5％生物油95％柴油(B5 EU柴油)、B7 7％生物油93％柴油(亚洲生物燃料标准)；B10 10％生物油90％柴油(EU目标)；B24 24％生物油76％柴油，其为满足IMO2020法规所需的较低碳船用燃料的目标。

采用合适的燃料处理系统B100(100％生物油)本身可以用作航海或重柴油燃料。

因此，在一个实施方案中，球形藻属产物是“即用型”燃料组分，例如柴油燃料组分，例如用于陆地汽车或航海应用，或用于发电机用途。本发明的一个方面提供了一种生物柴油燃料，所述生物柴油燃料包含如上所讨论的球形藻属产物，任选地5％、10％、24％或更多(例如，100％)的所述产物与余量的化石燃料衍生柴油燃料的组合。此类燃料可以用于汽车、航海发动机或任何其他需要柴油燃料的应用。本领域技术人员将认识到，低碳燃料中“生物油”％的优选上限将由柴油喷射泵的能力来确定。例如，航海发动机具有能够使用多种多样的燃料的复杂且强大的喷射系统。然而，汽车和卡车柴油发动机可能受到许可机构对其可使用的燃料的限制。因此，优选的混合将由相关应用来确定。

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本发明的另一个方面提供了通过酯交换球形藻属生物油产物获得的燃料产物，其中一种或多种三酰基甘油酯已经转化为相应的脂肪酸甲酯。此类酯交换可以降低燃料产物的粘度。

球形藻属三酰基甘油酯通过酯交换(在KOH的催化下与过量的醇、典型地是甲醇反应形成相应的甲酯和甘油)进行转化。

可替代地，可以在过量氢气和合适的催化剂的存在下，通过加氢脱氧将三酰基甘油酯处理成烷烃(Choudhary,T.v和Phillips,C.B.(2011).Renewable fuels viacatalytic hydrodeoxygenation.Applied Catalysis A:General,397,1–12.https://doi.org/10.1016/j.apcata.2011.02.025)。

本发明的另一个方面提供了一种通过精制本文讨论的球形藻属产物或球形藻属细胞制剂而获得的燃料产物。例如，球形藻属三酰基甘油酯可以用作低碳原料，无论是共混的还是未掺杂的，可以用于标准石油化工精制方法，例如作为精制厂裂化塔原料。本领域技术人员熟知标准精制技术。

标准石油化学工程方法将然后衍生出一系列低碳石化产物，诸如燃料、溶剂、化学物、添加剂、油漆和塑料。

本发明的另一个方面提供了一种航空燃料，例如通过如本文所讨论的产物的简单化学修饰或精制而产生的。

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本发明的另一个方面提供了一种燃料产物，所述燃料产物包含与酯交换或精制产物组合的含有天然球形藻属三酰基甘油酯的产物。

因此，本发明的非限制性燃料包括与石油柴油共混的、与已酯交换成脂肪酸甲酯的球形藻属三酰基甘油酯共混的、或与精制球形藻属燃料共混的含有球形藻属三酰基甘油酯的产物。

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本发明还可以用于生产其他产物-例如，细胞也可以生产人体必需的营养物ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFA)，目前从海洋含油鱼生产这种营养物是不可持续的并且易受重金属和放射性核素污染。

本发明的另一个方面提供了高蛋白农业原料，所述高蛋白农业原料包含根据以上讨论的本发明的方法获得的微藻生物质。

在又一个方面，提供了本发明的微藻藻株或本发明的方法用于从含有CO2的气体中捕获碳的用途，所述气体任选地是工业烟道气。

定义和通用术语

“藻类”是一大群多样的光合生物的非正式术语，所述光合生物不一定密切相关。所包括的生物范围为从单细胞属到多细胞形式。

尽管藻类被普遍认为是水中植物，但它们通常不与所谓的真正植物(植物界(Plantae))归为同一界。

事实上，大多数藻类含有与蓝藻细菌(cyanobacteria)结构相似的叶绿体。藻类的颜色是由叶绿体中的色素确定的。绿色叶绿素是所有藻类的主要色素，但一些类型具有可以掩盖这种颜色的辅助色素。

藻类物种可以具有盘状或网状的壁生叶绿体。“壁生”意指叶绿体靠着细胞壁。“盘状”意指每个细胞含有许多小叶绿体。

藻类以碳水化合物--淀粉或糖--的形式将能量储存在其叶绿体内。蛋白核是淀粉储存单位。蛋白核的形状可以变化很大，例如球形、细长形、透镜状、多叶形或复合形。一些藻类物种诸如球形藻属能够产生三酰基甘油酯碳能储存化合物。三酰基甘油酯是在复杂的代谢途径中合成的，起始于叶绿体中并且转运到内质网。

“微藻”是一大群异源的原始单细胞藻类，其遍布于海洋或淡水类型的水生生境和潮湿的陆地环境(参见例如，Marine Botany,Clinton Dawes,John Wiley&Sons,1998,第168-页)。

可以使用GAP4来评估“同源性”(相似性或同一性)(Staden,R.,K.F.Beal和J.K.Bonfield,The Staden package,1998.Methods Mol Biol,2000.132:第30页)-参见http://staden.sourceforge.net/。

如本文所用的术语“生物学纯培养物”或“生物学纯分离株”是指本发明相关藻株的培养物，其包含至少90％、优选95％、优选99％并且更优选至少99.5％的相关藻株细胞。

实际盐度单位(“PSU”)的测量是本领域中熟知的，例如使用可商购的CTD仪器。因此，实际盐度为35的海水具有在含有质量为32.4356克KCl/千克溶液的氯化钾(KCl)溶液的情况下在15℃和1个大气压下为一的电导率比。

400-700nm光合有效光(“PAR”)可以通过使用可商购的传感器(例如，来自LI-CORBiosciences UK Ltd.，英国剑桥考利路CB4 0WS圣约翰创新中心(St.John’s InnovationCentre Cowley Road Cambridge CB4 0WS United Kingdom))方便地测量。LICOR提供合适的量子传感器(用于放置在光生物反应器的表面)和数据记录器。

球形藻属“生物油”在本文中用于描述典型地溶剂提取的燃料产物，其由破裂的或在某种程度上裂解的球形藻属细胞制成，主要含有三酰基甘油酯和多不饱和脂肪酸以及少量来自球形藻属细胞的其他组分。

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本文引用了许多专利和出版物，以便更全面地描述和公开本发明以及本发明所属领域的现状。在本文中这些参考文献中的每一篇都通过引用以其整体并入本公开文本，其程度如同每篇单独的参考文献被具体和单独地指示通过引用并入。

如本说明书中所用的术语“包括”意指“至少部分由……组成”。当解释本说明书中包括术语“包括”的每个陈述时，除了以所述术语开头的一个或多个特征之外的特征也可能存在。诸如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”的相关术语以及术语“包含(including)”、“包含(include)”和“包含(includes)”将以相同的方式解释。

当在本说明书中使用时，术语“基本上由……组成”是指所陈述的特征并且允许不实质上改变指定特征的基本特征的其他特征的存在。

必须指出，如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/一种(a、an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地规定。因此，例如，对“药物载体”的提及包括两种或更多种这此类载体的混合物等。

范围在本文中通常表达为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解特定值形成另一个实施方案。

本文的任何子标题仅出于便利而被包括，并不应被解释为以任何方式限制本公开文本。

现在将参考以下非限制性附图和实施例进一步描述本发明。本领域技术人员根据这些内容将会想到本发明的其他实施方案。

本文引用的所有参考文献的披露内容，因为本领域技术人员可以使用它们来实施本发明，因此通过交叉引用特此具体地并入本文。

附图说明

图1至图3：球形藻属营养细胞的光学显微镜下结构

球形藻属营养细胞、分裂细胞和子细胞。球形藻属物种HBMSM003在其细胞周期的各个阶段期间的光学显微照片x1000。在补充有FSM培养基(7.0592mM NaNO₃、0.3261mMNaH₂PO₄.H₂O、0.0233mM FeCl₃.6H₂O、0.0259mM C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O、7.85004 10^-5mMCuSO₄.5H₂O、0.000152mM ZnSO₄.7H2O、0.000154mM CoCl₂.6H₂O、0.001818mM MnCl₂.4H₂O、5.20730 10^-5mM Na₂M0O₄.2H₂O)的非无菌过滤的马六甲海峡海水上在不含维生素补充剂也不含抗生素和抗真菌剂并且供应有15％v/v CO₂作为冷却的压缩烟道气的情况下培养细胞。在室外300L光生物反应器中培养，所述光生物反应器接受大约12小时高达2100μM光子.s^-1.m^-2照射12小时黑暗，28℃至35℃昼夜温度范围。在光学显微镜x1000放大倍数下使用油浸透镜以及使用Zeiss Axio Imager A2(Zeiss International Singapore)在明视野照射下目视观察未染色细胞。使用Teledyne Photometrics Micropublisher 6CCD 12.5x10mm(16mm对角线)6兆像素Teledyne Photometrics(中国上海，200032)记录图像。

图1：单独细胞的明视野图像，示出了被细胞荚膜包围的其特征性球形细胞形状。壁生叶绿体占一个半球，脂质储存体占另一个半球。注意不存在纤毛和鞭毛。球形藻属是无运动性的。比例尺10μM。图1的要点：(A)成熟球形藻属细胞的顶视图，揭示了蛋白核和具有五辐射对称性的壁生叶绿体；(B)母体球形藻属细胞的顶视图；(C)成熟球形藻属细胞的腹侧视图，示出了壁生叶绿体和脂质体；(D)空球形藻属母体细胞荚膜的腹侧视图；(E)成熟球形藻属细胞的底侧视图。

图2：单独细胞的明视野图像，示出了发育阶段。比例尺10μM。图2的要点：(A)含有4个子细胞的母体细胞，在完整母体荚膜内每个子细胞具有其自己的荚膜；(B)处于第一分裂期的母体细胞(2个子细胞)；(C)第一次分裂前的母体细胞。

图3：母体细胞破裂释放出4个包封的无运动性的包封子细胞的明视野图像。比例尺10μM。

图4：球形藻属细胞的透射电子显微镜下超微结构。

球形藻属细胞的球形藻属细胞超微结构透射电子显微照片，示出了Cap细胞荚膜；Pm质膜；Nm核膜；Nuc核；Cm叶绿体膜；Tyk类囊体；Mit线粒体。将细胞用2.5％戊二醛固定48h。使用还原锇(2％四氧化锇和3％亚铁氰化钾的1:1混合物)进行锇处理(osmication)。在1％琼脂中预包埋后，将样品在乙醇系列中脱水并且包埋在环氧树脂中。在铜载网上收集薄切片(100nm至120nm厚度)并且用柠檬酸铅进行对比度增强。使用在300kV下运行的透射电子显微镜(TEM)(Titan Cryo Twin,FEI Company，俄勒冈州希尔斯伯勒)进行成像。在4kx 4k CCD照相机(Gatan Inc.，加利福尼亚州普莱森顿)上记录图像。

图5：HB001、HB002和HB003的球形藻属18S rRNA基因序列。

图6：球形藻属HB001、HB002和HB003的系统发育分析。

邻接系统发育树，球形藻属18S rRNA小亚基核糖体RNA的1000次重复的自展检验(bootstrap)。使用ClustalW[97,98]在矩阵内逐步比对全长18S rRNA序列。使用邻接算法[99]生成引导树并且进行1000次自展检验。根据它们与其他分类学上建立的藻属的关系，单系18S rRNA序列分析将球形藻属归于石莼纲石莼目中。后者主要涵盖海洋大型藻与所描述的少量海洋微藻。与球形藻属关系最近的进化枝是Ctenocladus，其描述了一种陆地丝状嗜极微藻。

图7：在工业300L平板中培养的球形藻属HB001、HB002、HB003

在工业300L平板式PBR中培养的球形藻属HB001、HB002、HB003；培养基：补充有FSM培养基的过滤的非无菌海水(开始40PSU-最终50PSU)，不含维生素补充剂也不含抗生素和抗真菌剂；周围昼夜温度范围24℃-35℃(光生物反应器不冷却)，最大日照量高达2100μM光子.s^-1.m^-2日光12小时日间/12小时夜晚。每48小时用显微镜评估培养物纯度。

图8：球形藻属HB003生物质和脂质产量。

在工业300L平板式PBR中培养的球形藻属HB003；培养基：补充有FSM的过滤海水。昼夜温度范围24℃-35℃，最大日照量2100μM光子.s^-1.m^-2，第14-24天2.0％ CO₂，第24-32天5.0％ CO₂。每48小时用显微镜评估培养物纯度。

图9：在高可变盐度水平下的球形藻属HB003生物质产量。

在工业300L平板式PBR中培养的球形藻属HB001、HB002、HB003；培养基：补充有FSM的过滤海水，调节至开始40PSU-最终50PSU。在白天期间供应纯CO₂ 2％v/v/m。昼夜温度范围24℃-35℃，最大日照量2100μM光子.s^-1.m^-2。用分光光度法测量培养基中的由于蒸发引起的盐度升高，并且通过添加过滤海水维持在或低于50PSU。

图10：球形藻属的总中性脂质GC-MS分析。

衍生球形藻属HB003总中性脂质提取物的气相色谱-质谱分析，示出了高水平的生物燃料三酰基甘油酯组分十六烷酸三甲基甲硅烷基酯(Hx)、十八碳二烯酸三甲基甲硅烷基酯(Ox)；以及高价值多不饱和饱和脂肪酸衍生物二十碳二烯酸三甲基甲硅烷基酯(Ex)、花生四烯酸三甲基甲硅烷基酯(Ax)、亚麻酸三甲基甲硅烷基酯(Lx)。

将脂质样品在甲氧基胺盐酸盐/吡啶中在70℃下孵育90分钟，随后在70℃下与N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(50μL)反应60分钟。在配备有Perkin Elmer 5MS毛细管柱(30.0m×0.25mm ID，0.25μm膜厚度)的Perkin Elmer 600Clarus气相色谱仪上分析衍生脂质提取物。GC条件是：进样器温度200℃：氦气作为载气，流速为1ml/分钟并且分流比为50；以及温度编程。将柱温最初在40℃下保持1分钟并且以10℃/分钟斜升至50℃，然后最终温度以60℃/min增加达到300℃。将GC流出物引入Perkin Elmer 600Clarus质谱仪进行EI质谱分析，其中数据以全扫描或线性模式记录，质量范围为50-600m/z。

图11：在2％工业烟道气、12小时和24小时照射下球形藻属HB003生物质的产量。

在2x 450L大型平板式光生物反应器中在补充有FSM的过滤海水38-45PSU上培养球形藻属HB003。既没有维生素也没有抗细菌剂、抗真菌剂。昼夜温度范围22℃-35℃(无冷却)。最大日照量2100μM光子.s^-1.m^-2。在夜间，对于24小时培养，由白色LED灯供应300μM光子.s^-1.m^-2。工业烟道气是从焚烧椰子壳和外壳以及棕榈油空果串的焚烧炉烟囱中直接捕获和压缩的。在白天12小时光条件期间以及连续地在24小时光条件期间以2％v/v/分钟供应压缩的未过滤烟道气(约15％ CO₂)。每48小时用显微镜评估培养物纯度。

图12：球形藻属三酰基甘油酯的合成-叶绿体途径。

图13：球形藻属三酰基甘油酯的合成-内质网途径。

图14：示例性GCMS。如实施例9和表2所述，峰的身份在下文表3中列出。

简而言之，使用在氮限制下生长0小时、12小时、24小时和72小时(条件分别为M3-N1、M3-N2、M3-N3、M3-N4)的培养的球形藻属HB003细胞进行球形藻属三酰基甘油酯脂肪酸图谱的分析。图14的样品条件是“M3-N4”。

实施例

实施例1-新型海洋微藻生物燃料生产技术的开发背景

藻类生物燃料生产中的非生物和生物胁迫因素

微藻培养物易受一系列胁迫因素的影响，所述胁迫因素单独或协同作用损害细胞功能。非生物光、热和盐度胁迫通过使蛋白质、光色素、脂质膜和RuBisCo失能而降解类囊体膜和光收集系统的结构和功能。这些损伤的一致影响是光合活性的降低，剩余的光合电子流从碳固定转换到三酰基甘油酯代谢。生物胁迫因素诸如竞争者光合自养生物、病毒、真菌和浮游动物捕食者引起生产微藻的快速损失和群体崩溃。

大规模生物燃料生产对生产藻株施加了多种生物和非生物胁迫，所述生产藻株经历光、温度和盐度的急剧变化，使代谢效率降低到低于理论最大值[10]，导致产量损失[11,12,13]。另外，被其他微藻[14,15]、病毒感染[16]、真菌寄生虫[17,18]和捕食性浮游动物[19]的污染会引起大规模培养的完全崩溃。这些胁迫因素对生物燃料藻株生产率产生协同影响。

光胁迫反应

光胁迫是影响生物燃料产率的核心非生物胁迫因素[11,12,13]。在产生具有高光密度的培养物的工业培养系统中，当单独细胞在光生物反应器或池塘中循环时，它们经受不均匀的光分布[11,20]。这种可改变的环境给生产细胞带来了另外的胁迫。在自然界中，微藻不断调整其光收集系统以优化在有限光子通量下收集的能量，同时使在过量光子通量下的光损伤最小化。嵌入类囊体膜中的光系统II(PSII)、光系统I(PSI)和细胞色素b6f复合物催化从水到NADPH的电子流，连同从基质侧到腔侧类囊体膜面的质子转移，其驱动了ATP的产生[21]。在PSII和PSI中，光收集复合物LHCII和LHCI分别收集光子并且将激发能量转移到D1 D2异二聚体和氧化还原辅因子[22,23,24,25]。当超过藻株特异性的辐照水平时，会发生光抑制。这导致增强水平的光合产生的NADPH和ATP，其快速超过卡尔文-班森反应(Calvin-Benson reaction)的能力，导致电子传递链饱和。这增加了三线态叶绿素将能量转移到分子氧形成有毒活性氧类(ROS)的可能性[26]。同时，它提高了跨类囊体质子梯度，其激活跨膜蛋白LHCSR2接合PSII以及LHCSR3接合PSI，使两个光系统的构象转换到淬灭状态，启动非光化学淬灭(NPQ)，从而将激发能量以热的形式耗散[11,27,28]。腔侧酸化诱导紫黄质脱环氧酶(VDE)，所述紫黄质脱环氧酶将紫黄质光色素转化为玉米黄质，玉米黄质参与Chl淬灭和ROS清除[27]。

光胁迫减轻

为了避免光抑制，微藻采用三种策略：(1)在高光条件下表达的胁迫相关的光收集复合物II亚基LHCSR，其将吸收的光导向非光化学过程，从而减少ROS的形成[28,29,30]；(2)通过磷酸化诱导的LHCII蛋白从PSII的解离而使PSII天线尺寸减小，随后叶绿素b含量下降并且LHCII基因表达减少。这些结构和遗传变化增强了在高光水平下的光合效率，因为活性氧类的产生减少，从而允许高稳态的光合作用。因此，充分减少了ROS损害，从而允许PSII修复循环以连续更换受损的反应中心组件[31,32,33,34]；(3)通过与PSII和LHCII叶绿素密切相关的类胡萝卜素的合成增加激发能量的吸收。类胡萝卜素叶黄素和b-胡萝卜素淬灭叶绿素的激发状态，从而防止活性氧类的产生[35,36]。另外，在叶黄素类循环中，紫黄质首先转化为环氧玉米黄质并且然后转化为玉米黄质，玉米黄质在PSII中累积并且淬灭光激发的叶绿素自由基，从而将能量转化为热量[37]。

热胁迫

室外工业微藻培养受制于昼夜和季节性温度变化。虽然池塘培养可以通过蒸发冷却来调节温度增加，代价是盐度每天增加高达20％，但没有温度管理的低体积、高表面积平板或管式光生物反应器系统可以在午后中段产生比周围温度高达10℃的内部温度[38]。分离自高纬度地区的所表征的生物燃料藻株在20℃与24℃之间的温度条件下展现出最佳生长[39]。在热胁迫下，触发热胁迫反应[40]。微藻展现出由其生态位限定的物种特异性热胁迫诱导温度[41]。热胁迫在多个水平上影响细胞功能，包括细胞周期、蛋白质折叠/结构/组装；细胞周期；膜流动性；代谢协调，包括三酰基甘油酯合成[42,44]。热休克快速诱导G1和G2期的细胞周期停滞以及DNA复制和细胞分裂的停滞[45]。错误折叠蛋白的累积诱导Hsp核和质体分子伴侣[46]和脂质代谢酶磷脂酶C和D、磷脂酰肌醇磷酸激酶、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸[45](其快速增加磷脂酸的细胞库)、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(转化为二酰基甘油和肌醇1,4,5-三磷酸[45])。膜流动性的调节是通过从头合成饱和脂肪酸[47,48]来管理的，其中利用增加的由脂质代谢酶产生的前体库从头合成饱和脂肪酸，其代替不饱和脂肪酸，从而增加膜刚性[49]。同时，富含多不饱和物的三酰基甘油酯累积在脂质体中[45]。催化从Rubisco活性位点释放核酮糖-1,5-二磷酸的Rubisco活化酶的热失活减少了CO2固定[49]，这有利于光反应NADPH和ATP向脂肪酸合成和脂质滴累积的代谢转换[50,51,52]。

盐度胁迫反应

盐度胁迫会延缓细胞分裂，减小细胞大小，停止细胞运动，并且在某些藻株中诱导胶状群体的形成[53,54]。在盐胁迫下，当水分离开细胞时，存在快速但可逆的渗透效应。在这个时期，PSII和PSI功能的恢复依赖于由膜流动性调节的Na⁺/H⁺逆向转运系统[55,56,57]。如果盐胁迫持续数小时，Na⁺经由K⁺/Na⁺通道流入对PSII和PSI以及Na⁺/H⁺逆向转运系统造成不可逆的损害。增加膜脂肪酸的不饱和度会保护PSII和PSI既免受快速可逆失活也免受较慢不可逆失活的影响[57]。在代谢水平上，产生高浓度的具有中性电荷和低毒性的相容溶质诸如甘油[58-61]海藻糖[62]和脯氨酸[63]来平衡渗透压。

生物胁迫因素

大规模微藻生物燃料单培养受制于四类生物胁迫因素：(1)被其他微藻和蓝藻细菌污染，所述其他微藻和蓝藻细菌竞争营养物并且降低生物质和三酰基甘油酯生产率[64]；(2)使微藻群体快速崩溃的病毒感染[65]；(3)真菌寄生虫诸如壶菌[66,67]；(4)纤毛虫、变形虫、轮虫摄食浮游动物[68]。核质大DNA病毒诸如青绿藻病毒(prasinovirus)以10⁴.ml^-1的浓度存在于海洋光合带中并且对大规模微藻培养而言是重大挑战[69]，在数小时内引起细胞裂解，从而引起群体崩溃和产量损失[70,71,72]。已在几种不同的微藻类群中观察到获得性病毒抗性[73,74,75,76]，包括多年抗性[75]。病毒抗性是基因遗传的并且是特定微藻藻株的特性。长期抗病毒的Ostreococcus的基因组研究表明病毒抗性与特定的小的高变染色体区域相关[73,77,78]。

用于新海洋微藻生物燃料生产藻株的生物勘探

微藻藻株利用一套共同的胁迫途径来管理非生物和生物胁迫因素。然而，反应的触发点是藻株特异性的，因为微藻在其生态位的环境范围内进化以优化细胞生长和代谢[32]。因此，从极端生境中筛选藻类生物多样性可以鉴定出展现出生物燃料方法友好特征(诸如高光耐受性)的新藻株[79,80]。然而，迄今为止，还没有对地球上接收最大太阳辐射的极端热带海洋环境进行生物勘探调查，筛选能够比任何当前可得藻株更高产地利用更多太阳能而运行的海洋微藻生物燃料藻株。

实施例2-新型海洋微藻生物燃料生产技术的开发

为了找到新的候选高生产率工业海洋微藻藻株，其展现出方法友好的表型并且显著地合成高水平的将适用于运输应用而无需化学修饰的短链三酰基甘油酯，我们在中国南海和马六甲海峡开展了广泛的长期生物勘探计划，对这些海洋在其整个季节变化中的大量未开发的生物多样性进行了取样[81]。这些高日照量、高温、可变盐度、贫营养的热带海洋为高度稳健的微藻藻株提供了密集的选择性环境，所述微藻藻株利用高水平的日照量来捕获CO₂并且将其转化为高能量密度的生物油。我们的高通量生物勘探调查利用与工业过滤系统连接的工业泵来产生按大小分级的生物膜样品。将这些生物膜与多个非生物和生物筛选管道偶联以选择新的高效微藻候选物，所述候选物能够在海水中生长到具有高的即用型燃料能力的三酰基甘油酯含量的高生物质，而不需要先前生物燃料藻株所需的昂贵的补充剂、抗生素、抗真菌剂，并且对多种生物和非生物胁迫因素具有抗性。

生物勘探管道

我们的生物勘探计划在大规模平行的非生物和生物多重胁迫选择和分离管道中从南中国海和马六甲海峡筛选了海洋微藻分离株以生成工业藻株文库，所述工业藻株文库包含超过100种生理稳健、高效的海洋藻株，所述海洋藻株在高光、高温和盐度条件下茁壮成长。在一项长期生物勘探计划中，全年从每个海域的多个位置获得来自海洋表层(2m)的微藻样品。通过高体积连续过滤以15μM、5μM、1μM和0.1μM提取微藻。通过在补充有无维生素氮源、磷和痕量元素的过滤海水中在30℃-35℃、100-500μM光子.s^-1.m^-2、35-40PSU下孵育使所获得的生物膜培养物经受多重胁迫因素选择。在这个初级生长时期期间，生物胁迫因素、特别是病毒和捕食性细菌和浮游动物充当针对高抗性微藻的选择剂[82,83,84,85,86,87]。通过显微操纵和稀释培养产生纯微藻培养物。

目标表型

我们的生物勘探管道的目标是五个关键表型特征，我们认为所述特征是使三酰基甘油酯的产量最大化的经济上可行、稳健且可规模化的工业生物燃料微藻生产系统所需的。这些是：(1)多个独立的快速生长、高生物质累积的分离株，所述分离株在没有维生素补充剂的简单的基于海水的培养基上快速且常规地产生生物燃料相容的链长特征(<C22)的高生物质(>5g.l^-3细胞干重)，其具有高的三酰基甘油酯含量(>40％细胞干重)，允许快速、高且成本有效的三酰基甘油酯收获循环；(2)多个独立的高耐光藻株，所述藻株可以高效地利用高光子通量(>2000光子.s^-1.m^-2)并且具有最小的光抑制；(3)多个独立的耐热藻株，所述耐热藻株在20℃与38℃之间良好生长并且在45℃下仍保持存活，能够在热带温度范围内高效运行；(4)多个独立的高盐度耐受性藻株，所述藻株能够在35PSU至40PSU的盐度范围内快速且高效地生长并且累积三酰基甘油酯，消除了需要昂贵淡水以控制否则会由于蒸发而快速增加的盐度；(5)多个重独立分离株，以防止生物胁迫因素(病毒、食草性动物和捕食者)攻击单一微藻克隆并且引起群体崩溃[82,83,84,85,86,87]。

实施例3-球形藻属的分离和定向进化工程改造

我们的生物勘探计划产生工业藻株文库，所述工业藻株文库包含超过100种生理上稳健、高度高产的海洋藻株，所述海洋藻株在高光、高温和盐度条件下茁壮成长并且展现出对生物胁迫因素的强抗性。从这个文库中，使用定量生理学排序来确定最佳藻株，我们鉴定了一组存在于所有三种环境中的单细胞海洋微藻，随后的单系分类学分析表明其为所有三个热带海洋位置所特有的全新的热带海洋微藻属。我们将这种新的绿色植物属命名为球形藻属。

球形藻属细胞结构

光学显微分析(图1-图3)表明，球形藻属营养细胞是无运动性的，既没有纤毛也没有鞭毛，是单核、球形和单生的，具有光滑的细胞壁和荚膜。叶绿体是壁生的，具有五辐射对称性裂片和单个蛋白核。叶绿体的显著之处在于它拥有非常大数量的类囊体。每个叶绿体含有与细胞壁平行的高达约300个类囊体膜(范围为120-298个类囊体膜/细胞，n＝1430)。单一核被叶绿体完全包围，所述叶绿体提供显著的保护免受UV辐射的影响。细胞可以含有超过60％的细胞干质量作为脂质。多个脂质体移位至下半球。无性生殖发生在两轮分裂中(图1-图3)；第二分裂面与第一分裂面成90°。所有的分裂都包含在母体细胞荚膜中。自体孢子(4)无运动性，每个都有细胞壁和荚膜。这得出了生长速率((4n)x0.25)，即4、16、64、256。尚未观察到有性生殖。

球形藻属细胞(图1-图3)的大小范围为约1.52μm至10.28μm(n＝427)；新生子细胞的直径范围为1.52μm至2.50μm，成熟细胞的直径范围为2.50μm至6.00μm，并且母体细胞的直径范围为6.00μm至10.28μm。

细胞在结构上始终是球形的或接近球形的，被包封在厚度范围为0.215μm至0.344μm(平均厚度为0.277μm(n＝35))的多糖荚膜中。这在细胞膜周围提供了可渗透的、抵抗捕食者的层。细胞本身受叶绿体主导，所述叶绿体约占细胞体积的大约40％。它是杯形的通常五裂叶的壁生结构，其包围细胞核、蛋白核和线粒体。球形藻属叶绿体的特点在于叶绿体内巨大数量的类囊体层。球形藻属各含有高达约300个类囊体膜。类囊体包封大约17nm宽的内腔并且形成遍及所述叶绿体的连续结构，并且类囊体平行于细胞膜。非常大数量的类囊体膜有利于球形藻属的高耐光性，因为重叠的类囊体可以减弱在高光条件下的光穿透，使叶绿体内更深处的类囊体的光抑制最小化。与类囊体层紧密相连的是1.17μm x 0.64μm的卵形蛋白核。这是与叶绿体基质相关的非膜结合的相分离的亚细胞器[88]，所述亚细胞器含有碳酸酐酶[89]、RuBisCO活化酶[90]和紧密组织的RubisCO阵列[88]，它们共同充当细胞CO₂浓缩和固定系统[91,92,93]。蛋白核通过微管与类囊体内腔相通[88]。叶绿体还包封1μm x 0.8μm卵形、膜结合的核和脂质小泡，所述脂质小泡是膜结合的三酰基甘油酯储存细胞器，位于细胞下半球的叶绿体裂片之下和之间。

球形藻属的描述

球形藻属细胞是单细胞的、球形的、无运动性，范围为约1.52μm至约10.28μm。叶绿体是亮绿色且壁生的，占据细胞的一个半球，其中裂片延伸到含有脂质液泡的剩余半球。细胞被0.215μm至0.344μm厚的多糖荚膜包围，所述多糖荚膜随着细胞的生长而扩展并且在多糖荚膜内发生细胞分裂。超微结构研究表明，成熟球形藻属细胞被球形多糖荚膜包封，所述球形多糖荚膜提供了可渗透的、抵抗捕食者的外部细胞被膜。大约40％的细胞体积被通常五裂叶的壁生叶绿体占据，所述壁生叶绿体包裹核、蛋白核和线粒体亚细胞隔室。叶绿体的特点在于非常大数量的类囊体膜(每个细胞约300个)。

球形藻属分类学分析

基于全长18S rRNA基因(1770bp)的系统发育分析，我们获得的所选球形藻属分离株的分类学位置被确立为石莼纲石莼目中的新的且独特的属(图5)。石莼纲是绿藻门的四个纲之一，并且它涵盖界中最大的形态学和细胞学多样性。石莼纲由已经根据生命周期和超微结构元件而经典定义的八个目构成，并且目前这已经通过分子系统发育方法得到进一步定义。石莼目(其中球形藻属形成新的属)是由核和质体基因系统发育支持的独特进化枝[94,95]。石莼目的范围为从单细胞至丝状微藻形式到大型海藻。

石莼目本身是多系进化枝，并且有明显的证据表明大型藻类成员与微型藻类成员之间的rRNA基因座的水平基因转移。虽然主要是海洋生物，但也描述了一些淡水物种。分子系统发育表明，大型藻类石莼纲从简单的单细胞或丝状形式独立进化成多种谱系[96]。我们对球形藻属的分离、生理学和基因组表征的描述为我们理解这个表征不足的组群提供了基准。

球形藻属HB001、HB002和HB003的18S rRNA单系分析表明，它们最近的系统发育属是嗜极陆地丝状微藻Ctenocladus属。这是一种罕见发现的丝状微藻，所述微藻通过细丝断裂成静息孢子进行复制[Blinn D.W.,Stein,J.R.,1970.Distribution and taxonomicreappraisal of Ctenocladus circinnatus(Chlorophyceae,Chartophorales)J.Phycol.6101-105]。球形藻属和Ctenocladus的物理外观、细胞形式和生命周期完全不同，这是两个进化枝的一致独立属级地位。观察到与石莼目的以下其他五个属有更远的单系关系：嗜盐藻属(Halophilum)、Paulbroadya、Pseudoendococlonium、Bolbocoleon和石莼属(Ulva)。再一次，基于细胞形式和生命周期，球形藻属明显是与这些生物不同的属：嗜极性的嗜盐藻属是地衣形成真菌蛇形瓶口衣(Verrucaria serpuloides)的共生光合生物。嗜盐藻属是一种短分枝分裂性丝状高纬度海洋微藻[Darienko,T.,Roschuld,T.2017.Towarda monograph of non-marine Ulvophyceae using an interative approachPhytotaxa324(1),001-041]。Paulbroadya是一种丰富丝状的海洋微藻，其被发现附着在南极岩石表面，其单一壁生叶绿体内具有多达四个类囊体膜[Paul A.Broady和ManfredIngerfeld(1993)Three new species and anew record of chaetophoracean(Chlorophyta)algae from terrestrial habitats in Antarctica,EuropeanJournal ofPhycology,28:1,25-31,DOI:10.1080/09670269300650041]。Pseudoendoclonium是一种描述不足的高纬度陆地丝状微藻，其被发现于藤壶和岩石表面上[T.Edelstein andJ.McLachlan 1967Investigations of the marine algae of nova scotia:iv.speciesof chlorophyceae new or rare to Nova Scotia Candadian Journal of Botany 45(2)；Tupa,D.D.1974.An investigation of certain chaetophoralean algae.Beih.zurNova Hedwigia 46(增刊):64-67.]并且作为附生生物[https://ethos.bl.uk/ OrderDetails.do？uin＝uk.bl.ethos.297830]。Bolbocoleon是附生在海洋海草上的海洋丝状微藻[Karl Gunnarsson和Ruth Nielsen 2016.Culture and field studies ofUlvellaceae and other microfilamentous green seaweeds in subarctic and arcticwaters around Iceland 2016Nova Hedwigia 103(1):17-46DOI:10.1127/nova_hedwigia/2016/0334S]。石莼(Ulva)是一种长达1m的海洋大型藻，其存在于高纬度沿海和内陆咸水湖中[Hayden,H.S.,J.Blomster,C.A.Maggs,P.C.Silva,M.J.Stanhope和J.R.Waaland.2003.Linnaeus was right all along:Ulva and Enteromorpha are notdistinct genera.European Journal of Phycology 38:277-294]。

AB058352和AB058374的考虑

用HB001全长18S rRNA基因座进行ncbi非冗余序列数据库的DNA-DNA序列同源性搜索鉴定出一个序列条目“18S rRNA的AB058352.1:1-1746石莼纲物种MBIC10479基因，部分序列”，追溯到2001年。

这种1746nt 18S rRNA部分序列片段提交展现了与HB001 18SrRNA基因座1-1746bp 18S rRNA子区的100％ DNA:DNA同源性。

对ncbi数据库的进一步研究揭示了第二序列条目，具有相同的序列。此序列条目“AB058374”也被定义为石莼纲的未鉴定成员。

这些部分序列的来源生物似乎没有被保藏并且已经被证明不可从任何其他来源获得，也不可获得关于其全序列的进一步信息、或任何表型信息(例如结构、超微结构和代谢等)。因此，不幸的是，序列数据库中给出的有限信息不能以任何方式得到证实或补充。

实施例4-产生优化的生物燃料生产藻株

生物燃料的生产典型地需要大规模水资源[100,101,102,103]，包括添加排放淡水用于海洋微藻培养[104,105]。在室外热带条件约2100μM光子.s^-1.m^-2的典型最大值、20℃-35℃周围温度下，我们记录了在我们的平板式光生物反应器系统中每天盐度增加2.4％。在30天的时间段内，培养基的盐度从32PSU上升到60PSU。在开放池塘中，在同样的条件下，盐度每天上升20％。这种盐度上升通常通过添加排放淡水来控制，这导致了大的运行成本和宝贵淡水资源的不可持续使用[101,104,105,106]。为了开发使运行成本最小化并且不需要添加排放淡水的球形藻属生物燃料生产藻株，必须改变多个基因座[60,61,63]。因此，我们应用定向进化技术来产生高盐度耐受性的高生物质和三酰基甘油酯球形藻属生产藻株[107]。进行野生型球形藻属藻株的随机UV诱变，其中根据经验确定UV剂量(生存力降低至约50％)，并且用盐度加强的培养基对诱变群体进行激发以选择高盐度培养基耐受性增加的衍生物。在第二轮诱变和选择中，通过定向进化从高盐度藻株构建高通量碳摄取球形藻属藻株，使它们能够在15％CO₂(CO2气体或者农业或工业烟道气)中高效生长，所述数字与工业烟道气CO₂含量直接相容。使用这种方法，我们成功地产生了优化的球形藻属生产藻株的文库，包括优选的球形藻属生物燃料生产藻株HB001、HB002和HB003。

表1总结了优化的主导球形藻属生物燃料生产藻株的生理性能范围(对于球形藻属HB001、HB002和HB003)。由于多重遗传变化，这些优化的生产藻株展现出格外稳健的生理学。

表1：优化的球形藻属生物燃料藻株的性能的总结

实施例5-球形藻属的产物类别

三酰基甘油酯生物油

包含TAG和PUFA的球形藻属生物油产物可以不经加氢处理或酯交换而直接用于柴油燃料中。这种高能量密度液体燃料提供了优于生物乙醇的能量密度特征。可持续航空燃料也可以通过简单的化学修饰产生。

多不饱和脂肪酸

球形藻属产生高价值的多不饱和饱和脂肪酸(观察为衍生物二十碳二烯酸、花生四烯酸和亚麻酸。

高蛋白饲料

球形藻属生物质提供了高品质高蛋白农业原料。

实施例6-球形藻属中三酰基甘油酯的合成

微藻中三酰基甘油酯的合成在两个循环的多酶催化阶段中掺入丙二酰基分子，所述两个阶段起始于叶绿体并且随后转运出叶绿体，在内质网中完成(图12和图13)。

球形藻属三酰基甘油酯的生物合成始于在微藻叶绿体基质中的脂肪酸合成(图12)。第一反应是由丙酮酸脱氢酶(PDH)催化的乙酰辅酶A的形成，丙酮酸脱氢酶在通过所述途径的碳通量中起关键作用。叶绿体丙酮酸脱氢酶将丙酮酸氧化脱羧以生成乙酰辅酶A和NADH[1]。

在诱导TAG累积的氮饥饿条件下，PDH的表达上调[2,3]；叶绿体E1a PDH亚基的基因沉默使总脂肪酸产量减少40％[4]。乙酰辅酶A合成酶(ACC)催化TAG合成途径中形成丙二酰辅酶A的第一步定向反应[5]，绿藻门中的叶绿体ACC是生物素羧化酶(BC)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)以及a和b-羧基转移酶(a-b-CT)的异聚多亚基复合物[6]，其在由ATP驱动的两步反应中催化丙二酰辅酶A的形成。MCMT丙二酰辅酶A:ACP丙二酰转移酶将丙二酰辅酶转化为丙二酰酰基载体蛋白。MCMT基因的过表达使中性脂质含量增加30％并且提高了生长速率和光合效率[7]。脂肪酸链延长通过以下方式发生：通过连接将丙二酰基-ACP按顺序添加到乙酰辅酶A，从而通过酮酰基-ACP合酶(KAS)形成3-酮酰基-ACP并且释放出CO2。通过酮酰基-ACP还原酶(KAR)还原4-碳3-酮酰基-ACP，通过羟酰基-ACP脱水酶(HD)脱水，再次通过烯酰基-ACP还原酶(ER)还原，产生6碳ACP链产物。KAS-KAR-HD-ER形成多亚基细菌II型脂肪酸合酶(FAS)复合物[8]。七个FAS反应循环产生由酰基-ACP硫酯酶(FAT)释放的C16脂肪酸链长度产物。FAT的过度表达增加了总脂肪酸含量[9,10]。新生脂肪酸通过至今未知的运输途径从叶绿体运输到细胞质，在细胞质中通过肯尼迪途径(Kennedy pathway)产生三酰基甘油酯。在这些反应中，甘油-3-磷酸被甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)酰化形成溶血磷脂酸，溶血磷脂酸被溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT)转化为磷脂酸。磷脂酸经去磷酸化形成二酰基甘油。TAG途径中的最后一步由二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)催化，生成TAG碳能量储存分子[11,12]。

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实施例7-球形藻属工业三酰基甘油酯生产方案

a)培养基组成

向非无菌海水培养基补充如下制备成非无菌储备物的非无菌氮、磷和痕量元素FSM培养基：

FSM100

70.5926mM NaNO₃、3.2611mM NaH₂PO₄.2H₂O、0.2594mM C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O、0.2331mM FeCl₃.6H₂O、0.0012mM CuSO₄.5H₂O、0.0015mM ZnSO₄.7H₂O、0.0008mM CoCl₂.6H₂O、0.0182mM MnCl₂.4H₂O、0.0005mM Na₂MoO₄.2H₂O。

FSM10

7.0592636952657mM NaNO3、0.326110587723748mM NaH2PO4.H2O、0.02330743618202mM FeCl3.6H2O、0.0259361708456024mM Na2EDTA、7.85004806151874E-05mM CuSO4.5H2O、0.000152990264255911mM ZnSO4.7H2O、0.000154036922650359mMCOCl2.6H2O、0.00181891673403395mM MnCl2.4H2O、5.2073065950538E-05mMNa2M0O4.2H2O。

FSM5

3.52963184763285mM NaNO3、0.163055293861874mM NaH2PO4.H2O、0.01165371809101mM FeCl3.6H2O、0.0129680854228012mM Na2EDTA、3.92502403075937E-05mM CuSO4.5H2O、7.6495 1321279555E-05mM ZnSO4.7H2O、7.70184613251795E-05mMCOCl2.6H2O、0.000909458367016975mM MnCl2.4H2O、2.6036532975269E-05mMNa2M0O4.2H2O。

b)在不同规模下的示例性球形藻属生产培养方案

1升阶段接种物

在五个2.8L气升式光生物反应器中，向300ml FSM10培养基接种50ml由纯起始培养物产生的球形藻属培养物。通过添加FSM10培养基使培养体积增加至1L，21天，3千勒克斯.m^-2照射(LED白光)，32℃。用分光光度法并且通过细胞干重测量来跟踪培养物生长。

10升阶段接种物

向十个5升FSM10培养基接种1L球形藻属接种物，在十个15L气升式光生物反应器中培养至1g.L^-1的初始浓度。通过添加FSM10，使培养体积增加到10L。将培养物孵育21天，10千勒克斯.m^-2照射(LED白光)32℃。用分光光度法并且通过细胞干重测量来跟踪培养物生长。

300升阶段接种物

向150L FSM5培养基接种50L接种物至1g.L^-1的初始浓度。通过逐渐添加FSM5培养基使培养体积增加至300L。用大气空气充气大约0.5vol.vol^-1.min^-1。由工业烟道气(大约15％vol.vol-1CO₂)供应CO²，以大约1.6％vol.vol^-1.min^-1供应。在高达大约105千勒克斯日光(典型地25℃-35℃)将培养物孵育30天。用分光光度法并且通过细胞干重测量来跟踪培养物生长。

1000升生产培养物

向700L FSM5培养基接种300L接种物至1g.L^-1的初始浓度。用大气空气充气大约0.5vol.vol^-1.min^-1。由工业烟道气(大约15％vol.vol^-1.min^-1CO₂)供应CO²，以大约1.6％vol.vol^-1.min^-1供应。在高达大约105千勒克斯日光(典型地25℃-35℃)将培养物孵育30天。用分光光度法并且通过细胞干重测量来跟踪培养物生长。

实施例8-三酰基甘油酯提取方法

孵育大约30天后，低氮高碳比环境诱导高水平的三酰基甘油酯合成。可以根据以下方案提取三酰基甘油酯“生物油”：

·停止1000L PBR内的充气以让细胞生物质沉降。

·将沉降的细胞浆液(粘度5-10cP)从PBR底部泵出并且引导至过滤单元(倾斜的尼龙网500目(孔径25-28μm))。

·浓缩细胞团(700-800cP；通过过滤保留80％生物质，将约20％生物质(主要是新生细胞)返回PBR以继续培养)。可以将浓缩细胞团储存在4℃或直接引导至细胞裂解。

·使用高速工业匀浆器(5700rpm 90分钟，30℃-32℃)在40％0.5和1.0mm玻璃珠的存在下在甲醇(等体积的50％甲醇)的存在下进行裂解。

·裂解后，允许玻璃珠沉积，并且将上清液(裂解的细胞材料)转移到另一个容器中并且与等体积的己烷混合。使用高速分散器单元(3000rpm，10分钟，30℃-32℃)将混合物混合。

·通过在室温下以4000rpm短暂离心5分钟分离相。

·回收己烷三酰基甘油酯层，并且通过温和加热/蒸馏以除去己烷留下三酰基甘油酯来纯化三酰基甘油酯。

·(将甲醇和己烷再循环)

实施例9-球形藻属三酰基甘油酯代谢图谱和累积的分析

微藻的详细代谢分析最近得益于GC-MS数据库/解释技术的进步(Beale,D.J.,Pinu,F.R.,Kouremenos,K.A.等人Review of recent developments in GC–MSapproaches to metabolomics-based research.Metabolomics 14,152(2018).https://doi.org/10.1007/s11306-018-1449-2)。

标准GC-MS分析将三酰基甘油酯衍生为其相应的脂肪酸甲酯(FAME)。通过对分子片段的质谱的生物信息学分析来确定分子身份。这项技术正在迅速发展，并且特别地，数据库的分子片段覆盖范围的广度正在扩大。

合成的三酰基甘油酯的总质量以及其分子身份是单独生产微藻的特征，其决定了从光合作用到三酰基甘油酯合成的碳通量以及三酰基甘油酯分子本身的分子图谱。

球形藻属三酰基甘油酯的GC-MS谱分析-脂肪酸图谱

分析基于从t 0小时、12小时、24小时和72小时(分别为M3-N1、M3-N2、M3-N3、M3-N4)的诱导(氮限制)时间曲线中球形藻属HB003细胞的图谱。

对于此分析，使用FSM 100培养基，工作体积为10L。FSM100培养基是非无菌海水，其含有：70.592636952657mM NaNO3、3.26110587723748mM NaH2PO4.H2O、0.2330743618202mM FeCl3.6H2O、0.259361708456024mM Na2EDTA、0.000785004806151874mM CuSO4.5H2O、0.00152990264255911mM ZnSO4.7H2O、0.00154036922650359mM COCl2.6H2O、0.0181891673403395mM MnCl2.4H2O、0.00052073065950538mM Na2M0O4.2H2O。

使用以下方案：

·在第7天：将工作体积从5L增加到10L

·在第22天：将浓缩FSM 100培养基添加到10L培养物中

·间隔4至5天：添加无菌水来代替蒸发的水。

在10L工作体积下培养物的生长持续时间是约30天。

GC-MS样品制备

在培养期结束时，使细胞经受胁迫条件以诱导脂质产生。这是如下实现的：

1通过关闭充气，允许细胞沉降。使用蠕动泵除去大部分液体。使用无菌海水洗涤细胞，然后也泵出所述无菌海水。

2a对于袋A，作为对照，添加10L FSM 100。

2b对于袋B，作为N-饥饿(诱导)条件，添加10L不含氮源的FSM 100培养基。

3如下进行取样：

4通过使用氯仿：甲醇：水(2：2：0.8)方法进行湿生物质的脂质提取。并且用珠打浆进行涡旋20至30分钟。在4000rpm下离心3分钟并且收集氯仿层。

编码	样品
		M3-C1	对照-第0天
M3-C2	对照-第1/2天
		M3-C3	对照-第1天
M3-C4	对照-第3天
		M3-N1	N饥饿-第0天
M3-N2	N饥饿-第1/2天
		M3-N3	N饥饿-第1天
M3-N4	N饥饿-第3天

5对于进一步比较，比较藻株HBMSM 001、HBMSM 002和HBMSM 003的TAG脂质产量。将藻株在25_cm直径的聚乙烯袋中在FSM10/FSM5中在LED下培养，并且通过空气鼓泡驱动传质。如下进行提取：

藻株	溶剂	提取方法
			HBMSM 001	氯仿/甲醇/水	珠打浆20分钟
HBMSM 002	氯仿/甲醇/水	珠打浆20分钟
			FBMSM 003	己烷/甲醇	珠打浆20分钟

编码	样品
		M1	HBMSM 001
M2	HBMSM 002
		M3	HBMSM 003

结果示出于下文图14以及表2和表3中。

图14示出了条件M3-N4的GC-MS。下表3给出了峰的身份。

如从表中可以看出，整个系统是动态的。表2示出了通过C16TAG在24小时内略微降低(截止72小时时恢复)以及通过暂时增加C18 TAG产量同时降低PUFA产量得出三酰基甘油酯-脂肪酸代谢如何对(胁迫)氮限制反应。PUFA(亚麻酸)在72小时内增加。

考虑到在12小时时氮限制的指示，所述阶段时的生物油大约包含：

·23％ C16 TAG

·25％ C18 TAG

·9％ C18 PUFA

·4％ C20 PUFA，

与少部分的

·类胡萝卜素

·固醇

·叶绿素。

诱导细胞的变化总结如下文表5所示。

实施例10-与淡水实验室模型生物普通小球藻(Chlorella vulgaris)相比球形藻属三酰基甘油酯代谢图谱的讨论

以下报道了淡水实验室模型生物普通小球藻的三酰基甘油酯的综合分析：Pantami HA,Ahamad Bustamam MS,Lee SY,Ismail IS,Mohd Faudzi SM,Nakakuni M,Shaari K.Comprehensive GCMS and LC-MS/MS Metabolite Profiling of Chlorellavulgaris.Mar Drugs.2020年7月17日；18(7):367.doi:10.3390/md18070367.PMID:32709006；PMCID:PMC7404257。普通小球藻是实验室模型淡水微藻藻株。

与小球藻属相比，球形藻属的特点在于(1)非常高的向三酰基甘油酯的碳通量，允许累积例如高达65％细胞干重；和(2)下面讨论的它们产生的三酰基甘油酯“生物油”的确切分子图谱。

光生物反应器和开放池塘中的微藻生物质的脂质含量分别为2.26％±0.51％和3.18％±0.80％。脂肪酸含量的范围在0.7％-22.8％与0.9％-22.6％之间，并且两种培养系统中的优势脂肪酸是棕榈酸C16(参见Jay,M.I.,M.Kawaroe和H.Effendi.“Lipid andfatty acid composition microalgae Chlorella vulgaris using photobioreactorand open pond.”IOP Conference Series:Earth and Environmental Science.第141卷.第1期.IOP Publishing,2018)。

总之，根据已发表的研究，小球藻属产生低的三酰基甘油酯含量并且概况复杂，表明与球形藻属生物油在分子身份上有一些重叠。

在本发明的实施方案中，球形藻属生物油可以任选地不包含更具小球藻属特征的化合物，或者包含有小球藻属特征的化合物。

表3-参见图14

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表5

化合物类型	低％	高％
			十六烷酸(C16)	17	23
十八烷酸(C18)	3％	25％
			二十碳五烯酸(C20)	1％	8％
亚麻酸(C18)	9％	29％
			(1α，2β，5α)-2，6，6-三甲基-双环[3.1.1]庚烷	1％	15％
B-谷甾醇	＜1％	4％
			3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇	＜1％	2％

所选球形藻属三酰基甘油酯(>1％峰高)结构

正十五碳酸

十六烷酸

1-十六炔

(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸

顺式-9，12，15-十八碳三烯酸

十八烷酸

9-十八炔

顺式-13-十八碳烯酸

反式-13-十八碳烯酸

1,4-二十碳二烯

顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸

顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸

Claims

1.一种石莼纲石莼目海洋微藻藻株，其特征在于以下特性中的至少5、6、7或8种：

(i)是单细胞且单核的；

(ii)无运动性且没有纤毛和鞭毛；

(iii)具有总体上球形的细胞；

(iv)具有约1.00至11.0μm、更优选1.5μm至10.3μM的直径；(v)具有0.215μm至0.344μm厚的胞外多糖荚膜；

(vi)具有壁生叶绿体和单个蛋白核；

(vii)包含脂质体；

(viii)能够在母体荚膜内通过以下方式进行无性生殖：两次彼此成大约90°连续分裂成为4个包封在其自身的荚膜内的无运动性子细胞，子细胞通过母体细胞被膜的破裂而被释放，

所述藻株还：

(ix)具有每个叶绿体120-300个类囊体膜；

2.根据权利要求1所述的微藻藻株，其特征在于具有特征(i)-(x)中的全部。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的微藻藻株，其中：

(i)所述叶绿体展现出占据上细胞半球的五辐射对称性，并且裂片延伸到含有所述脂质体的剩余半球中；和/或

(iii)中性脂质含量是细胞干质量的5％至70％，任选地5％至65％。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的微藻藻株，所述微藻藻株：

(i)与150、200、250或300μM光子s^-1.m^-2的最大值相比，当在最大日间日照量为大于或等于1600μM光子s^-1.m^-2的12:12日/夜周期中进行外部培养时具有更高的生长速率；和/或

(ii)在45℃下培养72小时后仍然存活。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的微藻藻株，其中所述藻株能够产生表2和任选地表3所示的化合物。

***

6.一种微藻藻株，其特征在于所述微藻藻株由保藏在CCAP的登录号为CCAP 2271/1、CCAP 2271/2或CCAP 2271/3的分离藻株组成。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的微藻藻株，所述藻株是通过使用补充有无维生素氮源、磷和痕量元素的过滤海水从海洋环境中筛选获得或可获得的。

8.根据权利要求7所述的微藻藻株，所述藻株存在于石莼纲内的与以登录号CCAP2271/1、CCAP 2271/2或CCAP 2271/3保藏的藻株相同的系统发育进化枝。

9.一种微藻藻株，所述藻株是根据权利要求6至8中任一项所述的任何海洋微藻藻株的衍生物，所述衍生物具有根据权利要求1至5中任一项所述的微藻的特性。

10.根据权利要求9所述的微藻藻株，所述微藻藻株是定向进化工程改造的衍生藻株，与在其他方面相同的低PSU培养基中的生长速率相比，所述定向进化工程改造的衍生藻株能够在PSU大于或等于30、35、40或45PSU的无维生素培养基中更高效地生长。

***

11.根据权利要求1至10中任一项所述的藻株，所述藻株呈所述藻株的生物学纯培养物的形式，所述生物学纯培养物能够是斜面培养物或液体培养基肉汤。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的藻株，所述藻株呈所述藻株的冻干样品、液氮冷冻样品或甘油冷冻制剂的形式。

13.一种根据权利要求1至10中任一项所述的藻株的细胞提取物；细胞悬液；细胞匀浆；细胞裂解物；或细胞沉淀物。

14.一种根据权利要求1至10中任一项所述的藻株的培养肉汤或无细胞或基本上无细胞的培养肉汤。

***

15.一种用于从根据权利要求6所述的保藏藻株或从根据权利要求7所述的筛选藻株制备根据权利要求9所述的衍生藻株的方法，所述方法包括定向进化。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述定向进化包括以下步骤中的一个或多个：

(ii)将所述培养物维持几个世代；

17.一种用于从根据权利要求6所述的保藏藻株或从根据权利要求7所述的筛选藻株制备根据权利要求9所述的衍生藻株的方法，所述方法包括诱变和选择。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述诱变和选择包括以下步骤中的一个或多个：

(i)在促进诱变的条件下培养所保藏的亲本藻株；

(ii)将所述培养物维持几个世代；

19.一种用于通过重组分子生物学从根据权利要求6所述的保藏藻株或从根据权利要求7所述的筛选藻株制备根据权利要求9所述的衍生藻株的方法，所述方法包括基因插入、缺失或修饰中的一种或多种。***

20.一种生产微藻生物质或生产通过微藻培养产生的所希望的产物或化合物的方法，所述方法包括培养根据权利要求1至12中任一项所述的海洋微藻群体。

21.根据权利要求20所述的方法，其中在以下条件下培养所述海洋微藻：

(i)温度在约20℃至约50℃之间、优选28℃-35℃；和/或

(ii)pH在6与11之间、优选约pH 8；和/或

(iii)盐度在15至63PSU之间、优选30至40PSU；和/或

(iv)光子强度高达2100μmol光子m^-2.s^-1光合有效辐射。

22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中在培养期间通过向培养基中鼓入空气将海洋微藻细胞混合，和\或向所述海洋微藻细胞补充CO₂，所述CO₂任选地是工业烟道气。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中将所述海洋微藻在自然日/夜周期下进行外部培养，并且其中：

(i)所述周期的日间部分峰值的最大光强度是在日间暴露峰值时至少或约100至2100μmol光子m^-2.s^-1；和\或

(ii)在培养期间的最大盐度是至少或约30、35、40、45、50、55、60或63PSU。

24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述培养是光合自养的。

25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其中所述培养在培养基中进行，所述培养基是由以下制备的合成培养基：

(i)(ia)天然盐-水来源，所述天然盐-水来源任选地是海水、微咸水或盐湖水，或(ib)工业盐水产物；

(ii)含氮化合物的另外一种或多种来源，所述来源任选地是硝酸盐或脲，以及磷酸盐；

(iii)任选地另外的痕量元素来源；和

(iv)优选地不添加维生素，也不添加抗生素和抗真菌补充剂。

26.根据权利要求25所述的方法，其中提供另外的痕量元素来源，并且任选地所述另外的痕量元素来源包含以下中的一种或多种：FeCl₃、CuSO₄、ZnSO₄、CoCl₂、MnCl₂或Na₂MoO₄。

27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述培养基包含补充有以下的过滤海水：约7mM NaNO₃；约0.3mM NaH₂PO₄.2H₂O；约20μM C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O；约25μM FeCl₃·6H₂O；约29nM CuSO_4.5H₂O；约150nM ZnSO₄.7H₂O；约150nM CoCl₂.6H₂O；约2μMMnCl₂.4H₂O；约50nM Na₂MoO₄.2H₂O。

28.根据权利要求20至27中任一项所述的方法，其中按以下方式进行所述方法：

(i)分批培养；或

(ii)连续培养。

29.根据权利要求20至28中任一项所述的方法，其中按以下方式进行所述方法：

(i)在开放池塘中，或

(ii)在培养反应器中，所述培养反应器任选地是立式培养反应器。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述方法在培养反应器中进行，所述培养反应器是光生物反应器，所述光生物反应器任选地是气升柱或平板。

***

31.根据权利要求20至30中任一项所述的方法，其中所述方法用于生产选自以下的所希望的化合物：

(i)包含微藻三酰基甘油酯的生物燃料；和/或

(ii)多不饱和脂肪酸(PUFA)；和/或

(iii)其他脂质级分；和/或(iv)高蛋白、富含PUFA的食物或者鱼饲料或动物饲料。

***

32.根据权利要求20至31中任一项所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：从所述培养物中回收、分离、纯化或富集所述所希望的产物。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述所希望的产物衍生自所述培养物的上清液，任选地通过离心、过滤或倾析中的一种或多种，随后任选地是沉淀。

34.根据权利要求32或权利要求33所述的方法，其中通过切向流过滤回收所述所希望的产物。

35.根据权利要求32所述的方法，所述方法用于从所述培养物生产三酰基甘油酯组合物，所述方法包括溶剂提取所述三酰基甘油酯。

36.根据权利要求32或权利要求35所述的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)从所述培养物中过滤所述细胞团；

(d)回收含有三酰基甘油酯的非极性溶剂层；

(e)从所述非极性溶剂层中回收所述三酰基甘油酯，

或者所述方法包括以下步骤：

(a)从所述培养物中过滤细胞团；

(b)将所述细胞团干燥；

(c)任选地破碎/裂解所述细胞团中的细胞；

***

37.一种通过根据权利要求32至36中任一项所述的方法获得或可获得的所希望的产物，所述产物是：

(i)富含三酰基甘油酯的组合物，或

(ii)富含多不饱和脂肪酸(PUFA)的组合物。

38.根据权利要求37所述的PUFA组合物，任选地，其特征在于，所述PUFA组合物至少包含亚麻酸；二十碳五烯酸；花生四烯酸。

39.根据权利要求37所述的富含三酰基甘油酯的组合物，任选地，其特征在于：

(ii)所述组合物包含以下化合物中的一种或多种或全部：1-十六炔；顺式-13-十八碳烯酸；反式-13-十八碳烯酸；1,4-二十碳二烯；和/或

40.根据权利要求39所述的富含三酰基甘油酯的组合物，所述富含三酰基甘油酯的组合物进一步包含：(1α,2β,5α)-2,6,6-三甲基-双环[3.1.1]庚烷；B-谷甾醇；3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇。

41.根据权利要求39或40所述的富含三酰基甘油酯的组合物，其特征在于，所述富含三酰基甘油酯的组合物包含表5中所述的化合物中的一种或多种或全部，所述一种或多种或全部化合物在其中所示的相应％范围内。

42.根据权利要求39至41中任一项所述的富含三酰基甘油酯的组合物，其特征在于大体上如图14或表3所示的GC-MS图谱，或具有大体上如表2所示的脂肪酸组成。

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43.一种用于生产脂肪酸甲酯组合物的方法，所述方法包括将根据权利要求39至42中任一项所述的富含三酰基甘油酯的组合物进行酯交换。

44.一种用于生产燃料产物的方法，所述方法包括将根据权利要求39至42中任一项所述的富含三酰基甘油酯的组合物进行催化加氢脱氧。

45.一种用于生产精制产物的方法，所述方法包括工业精制根据权利要求39至42中任一项所述的富含三酰基甘油酯的组合物，或通过权利要求20至30中任一项获得的培养的微藻生物质。

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46.一种通过根据权利要求43所述的方法获得或可获得的脂肪酸甲酯组合物。

47.一种分别通过根据权利要求44或权利要求45所述的方法获得或可获得的燃料产物或精制产物。

48.根据权利要求39至42中任一项所述的富含三酰基甘油酯的组合物、根据权利要求46所述的甲酯组合物或根据权利要求47所述的燃料产物或精制产物作为燃料或作为燃料组分的用途。

49.一种燃料，所述燃料任选地是汽车、航空或船用燃料，所述燃料包含根据权利要求39至42、46或47中任一项所述的产物。

50.一种生物柴油燃料，所述生物柴油燃料包含根据权利要求39至42中任一项所述的产物，任选地5％至24％的所述产物与95％至76％的标准柴油燃料或根据权利要求46所述的甲酯组合物或根据权利要求47所述的燃料产物或精制产物的组合。

51.一种高蛋白农业原料，所述高蛋白农业原料包含按照根据权利要求20到30中任一项所述的方法获得的微藻生物质。

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52.根据权利要求1至10中任一项所述的微藻藻株或根据权利要求20至30中任一项所述的方法用于从含有CO2的气体中捕获碳的用途，所述含有CO2的气体任选地是工业烟道气。