CN120829353A - 一种顺反式Diels-Alder加合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种从桑白皮中提取的顺反式Diels‑Alder加合物，并公开了制备该Diels‑Alder加合物的方法及应用。具体制备流程是将桑白皮粗粉先经醇提法，以及通过大孔吸附树脂柱吸附层析法和薄层色谱检测收集含有目标化合物的馏分，再针对含有目标化合物的馏分进行硅胶柱减压层析、聚酰胺柱层析、ODS柱色谱和高效液相色谱进行分离纯化，得到顺反式Diels‑Alder加合物；本发明通过Ellman方法测定表明其对胆碱酯酶具有显著的抑制作用。本发明采用的制备顺反式Diels‑Alder加合物的方法操作明确可控，获得的化合物杂质少、纯度高，具有开发为抗阿尔茨海默病药物的潜力。

Description

一种顺反式Diels-Alder加合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种顺反式Diels-Alder加合物及其制备方法和应用。

背景技术

桑白皮作为桑科植物桑的干燥根皮，是我国传统中药材，在中医药领域有着广泛应用。现代研究表明，桑白皮富含黄酮类、多糖类、香豆素类等多种化学成分。黄酮类成分如桑皮素、桑根皮素等，具有抗炎、抗氧化等多种生物活性；多糖类成分则在免疫调节、抗肿瘤方面展现出潜在价值。然而，随着研究的深入，桑白皮中仍存在众多未知结构与功能的化学成分，等待被发现与挖掘。

丁酰胆碱酯酶(BChE)是一种存在于血浆、肝脏、神经组织等多种组织中的丝氨酸水解酶，在神经传导、脂代谢等生理过程中发挥着重要作用。在正常生理状态下，BChE与乙酰胆碱酯酶(AChE)协同维持体内胆碱能系统的平衡。然而，在阿尔茨海默病(AD)患者大脑中，随着病情进展，BChE的活性逐渐升高，其对乙酰胆碱的水解作用增强，导致突触间隙中乙酰胆碱含量显著降低，破坏胆碱能神经传递，进而引发认知功能障碍、记忆力减退等一系列临床症状。此外，BChE活性异常还与血管性痴呆、糖尿病周围神经病变等神经系统疾病的发生发展密切相关。因此，研发能够有效抑制BChE活性的药物，对于改善相关疾病患者的症状、延缓疾病进展具有重要意义。

目前，临床上用于治疗阿尔茨海默病等神经系统疾病的胆碱酯酶抑制剂主要为化学合成药物，如多奈哌齐、利斯的明等。虽然这些药物在一定程度上能够改善患者的认知功能，但长期使用会产生恶心、呕吐、失眠等多种不良反应。相比之下，从天然产物中寻找高效、低毒的BChE抑制剂成为近年来的研究热点。天然产物来源广泛、结构多样，许多植物、动物和微生物中含有的活性成分已被证实具有良好的BChE抑制活性。例如，石蒜科植物中的加兰他敏，是一种从天然植物中提取的生物碱，作为经典的胆碱酯酶抑制剂已应用于临床；从茶叶中提取的儿茶素类化合物，也表现出对BChE的抑制作用。然而，目前从桑白皮中分离得到具有抑制丁酰胆碱酯酶活性的Diels-Alder(DA)加合物鲜见报道，深入研究桑白皮中的化学成分，有望为BChE抑制剂的研发提供新的候选化合物。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的主要目的在于提供一种顺反式Diels-Alder加合物及其制备方法。

本发明还提供了所述顺反式Diels-Alder加合物在抑制丁酰胆碱酯酶活性、治疗阿尔茨海默病方面的用途。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种顺反式Diels-Alder加合物，其特征在于，所述顺反式Diels-Alder加合物的分子结构式为：

作为同一发明构思，本发明还提供了所述顺反式Diels-Alder加合物的制备方法，包括如下步骤：

S1：提取：将桑白皮粗粉置于提取容器中，加入3～10倍量的乙醇溶液，进行回流提取，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到桑白皮提取物浸膏；

S2：将桑白皮提取物浸膏用适量水或5-15％乙醇分散混悬，进行大孔吸附树脂柱吸附层析，依次用不同质量浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，分别合并后浓缩，得到各洗脱液；

S3：对各洗脱液进行薄层色谱检测，收集合并含有目标化合物的馏分；将含有目标化合物的馏分进行硅胶柱减压层析，以二氯甲烷-甲醇系统，按照一定的体积比进行梯度洗脱，收集不同的洗脱流分；

S4:根据薄层色谱检测结果，合并相似洗脱流分，再将其中含有目标化合物的洗脱流分进一步通过聚酰胺柱层析、ODS柱色谱和高效液相色谱进行分离纯化，即得到所述顺反式Diels-Alder加合物。

在某些具体实施方式中，步骤S1中所述回流提取的工艺条件为：在50～80℃下回流提取2～5小时，重复提取2～3次。

在某些具体实施方式中，步骤S2中乙醇溶液的质量浓度依次为10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、60％乙醇、80％乙醇和95％乙醇。

在某些具体实施方式中，步骤S3中二氯甲烷-甲醇的体积比为(70-100)：(0-30)。

在某些具体实施方式中，步骤S4中所述聚酰胺柱层析以水-乙醇系统进行梯度洗脱，所述ODS柱色谱均以甲醇-水系统进行梯度洗脱；所述高效液相色谱，以甲醇-水系统进行梯度洗脱。

作为同一发明构思，本发明还提供了所述顺反式Diels-Alder加合物及其药学上可接受的盐作为丁酰胆碱酯酶抑制剂的用途。

作为同一发明构思，本发明还提供了所述的顺反式Diels-Alder加合物及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

关于药物的表述：

优选地，本发明的化合物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

本发明的化合物可单独或以药物组合物的形式给药；给药途径可以是口服、非肠道或局部给药；药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。

本发明的化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。

当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液；其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁；胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉；水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用；任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

本发明中，术语“药学上可接受的盐”是指药用无机或有机盐。本发明式I化合物中具有酸性基团的化合物可以与碱金属或碱土金属形成药用盐，优选但不限于钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。

另外需要指出，本发明化合物使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01～100mg/kg体重/天。

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

1)本发明从桑白皮中发现且提取得到式Ⅰ顺反式Diels-Alder加合物，并通过实验验证了其具有显著的丁酰胆碱酯酶抑制活性，故而具备作为抗阿尔茨海默病药物的潜力。

2)经研究发现，该顺反式Diels-Alder加合物通过与BChE活性位点特异性结合，改变酶的空间构象，降低酶对底物的亲和力，从而抑制BChE对乙酰胆碱的水解作用，提高大脑中乙酰胆碱的水平，改善胆碱能神经传递功能，进而缓解阿尔茨海默病患者的认知功能障碍症状。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明中式I化合物的HR-ESI-MS谱图；

图2为本发明中式I化合物的¹H-NMR谱图；

图3为本发明中式I化合物的¹³C-NMR和DEPT谱图；

图4为本发明中式I化合物的HSQC谱图；

图5为本发明中式I化合物的¹H-¹H COSY谱图；

图6为本发明中式I化合物的HMBC谱图；

图7为本发明中式I化合物的UV谱图；

图8为本发明中式I化合物的ECD谱图；

图9为本发明中式I化合物抑制丁酰胆碱酯酶的Lineweaver-Burk双倒数图；

图10为本发明中式I化合物的分子结构式。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

当以范围、优选范围、或者优选的数值上限以及下限的形式表述某个量、浓度或其它值或参数的时候，应当理解相当于具体揭示了通过将任意一对范围上限或优选数值与任意范围下限或优选数值结合起来的任何范围，而不考虑该范围是否具体揭示。除非另外指出，本文所列出的数值范围值在包括范围的端点，和该范围之内的所有整数和分数。

除非另外说明，本文中所有的百分比、份数、比值等均是按重量计。

本文的材料、方法和实施例均是示例性的，并且除非特别说明，不应理解为限制性的。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

下述实施中，所述的乙醇溶液均为乙醇的水溶液，80％乙醇指质量浓度为80％的乙醇水溶液。

在下面实施例的结构研究中，HR-ESI-MS用美国Agilent公司LCT 6200seriesTOF/6500型质谱仪测定，NMR谱图用瑞士Bruke公司Avance III 500型超导核磁共振仪(500MHz ¹H-NMR，125MHz ¹³C-NMR)测定。

实施例1：

本实施例提供了一种顺反式Diels-Alder加合物的制备方法，其包括如下步骤：

1)桑白皮提取

取桑白皮粗粉9.3kg(取干燥的市售桑白皮，粉碎成粗粉，备用)，3倍量80％乙醇浸泡1小时后，80℃加热提取3次，每次3小时，过滤，合并得到约90L提取液，60℃减压浓缩至无醇味，得到桑白皮提取物浸膏；

2)提取处理与乙酸乙酯浸膏的制备

将步骤1)中得到的桑白皮提取物浸膏用10％乙醇分散混悬后，得到混悬液(约20L，固形物约990g)，进行AB-8大孔吸附树脂柱(柱体积约4L)层析，依次用10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、60％乙醇、80％乙醇和95％乙醇进行梯度洗脱，分别洗脱3个柱体积，分别合并后浓缩至干重，以及得到各洗脱液；

对各洗脱液进行HPLC指纹图谱分析，将10％乙醇部位标记为组分A(580g)，30％乙醇部位标记为组分B(61.2g)，50％～80％乙醇部位合并为组分C(180g)，95％乙醇部位标记为组分D(50.8g)；

将组分C(180g)进行硅胶减压柱层析，用二氯甲烷-甲醇(100:30)为洗脱剂进行梯度洗脱，根据HPLC指纹图谱分析结果，将流份合并得到组分C1～C4；

将组分C3(93g)进一步进行聚酰胺柱层析(以水-乙醇系统进行梯度洗脱)，以40％～90％乙醇进行梯度洗脱，经HPLC指纹图谱分析后，合并相似流份得到6个组分C31～C36；

组分C33经硅胶减压柱层析(以甲醇-水系统进行梯度洗脱)分离得到C331～C-334四个组分；

组分C333经高效液相色谱(HPLC，60min内45％甲醇梯度洗脱)纯化得到Diels-Alder加合物(16mg)。

测试例1：

本申请对实施例1制备到的Diels-Alder加合物的通过核磁共振(NMR)技术(包括¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、HSQC、HMBC等)、高分辨质谱(HR-ESI-MS)、紫外光谱(UV)、圆二色谱(ECD)等多种波谱学方法对所得Diels-Alder加合物进行结构鉴定，具体的：

其中Diels-Alder加合物：淡黄色无定形粉末，显示正的旋光活性 紫外光谱中在220、275、320nm存在最大吸收峰(如图7所示)。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 521.1448[M–H]^–(C₂₈H₂₅O₁₀计算值521.1448，如图1所示)，确定其分子式为C₂₈H₂₆O₁₀，不饱和度为16。¹H NMR谱(表1，如图2和图3所示)中给出2组ABX型芳香质子信号：[δ_H 8.20(1H,d,J＝8.9Hz,H-27),6.27(1H,dd,J＝8.9,2.4Hz,H-26),6.14(1H,d,J＝2.4Hz,H-24)]和[δ_H 6.88(1H,d,J＝8.4Hz,H-20),6.30(1H,d,J＝2.4Hz,H-17),6.19(1H,dd,J＝8.4,2.5Hz,H-19)]，1个孤立的芳香质子信号δ_H 5.79(1H,s,H-5)，以及三取代甲基环己烯环的相关信号[δ_H 4.10(1H,brs,H-8),5.53(1H,br s,H-9),2.45(1H,dd,J＝17.2,5.5Hz,Hα-11),2.19(1H,br d,J＝17.2Hz,Hβ-11),3.77(1H,q,J＝5.0Hz,H-12),4.44(1H,t,J＝5.0Hz,H-13),1.86(3H,br s,H-14)]。此外氢谱中还有一个连氧甲基信号[δ_H 3.91(3H,s,H-1′)]。上述氢信号偶合关系经¹H-¹H COSY谱中相关信号予以建立，并经HSQC谱相关信号将其与相应碳信号进行关联(图4和图5所示)。式I化合物的¹³C-NMR谱显示有28个碳信号(表1，图3所示)，除了与上述氢信号对应的碳信号之外，还有14个季碳原子，包括1个酮羰基碳信号δ_C 209.6(C-21)、1个酯羰基碳信号δ_C 171.8(C-7)、7个连氧sp²杂化碳信号[δ_C156.9(C-16),157.7(C-18),161.7(C-4),162.3(C-2),164.5(C-6),166.4(C-25),166.7(C-23)]，以及5个常规sp²杂化碳信号[δ_C 94.2(C-1),108.5(C-3),114.4(C-22),123.3(C-15),134.4(C-10)]。HMBC谱中H-14与C-9、C-10和C-11，以及H-11与C-9和C-10之间的HMBC相关信号进一步证明了分子中存在甲基环己烯结构片段。再者，H-5与C-1、C-3、C-4和C-6有强相关信号，与C-2和C-7也存在弱相关信号，H-1′与C-7相关，表明分子中存在2,4,6-三羟基取代苯甲酸甲酯结构片段。此外，H-17和H-19与C15、H-20与C-16和C-18之间存在HMBC相关信号；H-24与C-22、C-23和C-25，H-26与C-22和C-25存在HMBC相关信号，分别归属了两个2,4-二羟基三取代苯环片段中的有关碳氢信号。接下来HMBC相关信号的解析将上述片段连接起来(如图6所示)。首先，H-12与C15、C-16和C-20之间的相关信号将其中一个三取代苯环连接在甲基环己烯环的C-12位；再者，H-13与C-21之间有强HMBC相关信号，而H-24也与C-21存在弱相关信号，提示另一个三取代苯环通过羰基C-21连接在甲基环己烯环的C-13位；此外，H-13也与C-3存在强相关，表明苯甲酸乙酯片段与甲基环己烯片段通过C-3与C-8之间共价键相连。至此，化合物平面结构如式I所示，为Diels–Alder加合物，即本发明中的Diels-Alder加合物为式I化合物(如图10所示)。

桑树植物中含丰富的Diels–Alder型加合物，根据甲基环己烯环上取代基的相对构型，分成2个主要类型：顺反型(cis-trans)和全反型(all-trans)。化合物I中，H-8/H-13和H-12/H-13之间的偶合常数均为5.5，表明C-8、C-12和C-13的相对构型为顺反式。式I化合物具有正旋光活性，且其ECD谱主要呈现正的cotton效应(如图8所示)，根据激子手性原理确定其绝对构型为8S,12S,13R。

表1.Diels-Alder加合物的500MHz ¹H和125MHz ¹³C NMR数据(CD₃OD)

式I化合物理化常数：淡黄色无定形粉末；176.5(c 0.05，MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)：220(3.21)，280(2.20)，320(2.03)nm；ECD(c 0.00025，MeOH)mdeg(nm)：–1.34(326)，+5.49(268)，+6.39(223)，+13.21(205)；HR-ESI-MS：负离子模式实测值m/z521.1448[M–H]^–(C₂₈H₂₅O₁₀计算值521.1448)，确定其分子式为C₂₈H₂₆O₁₀。

应用例

本应用例提供了本申请中式Ⅰ化合物对胆碱酯酶的影响，具体的：

采用Ellman方法测试式I化合物对乙酰胆碱酯酶(AChE，EC 3.1.1.7)和丁酰胆碱酯酶(BChE，EC 3.1.1.8)的抑制活性；

测试方法为：配制磷酸盐缓冲液(PBS，0.1M，pH 8.0)，用PBS制备AChE和BChE溶液(0.2u/mL)，以及5-氨基-1,3,4-噻二唑-2-甲醛(ATCI)、苯并三氮唑-1-碳硫酸S-苄酯(BTCI)和5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸(DTNB)溶液(浓度均为10mM)；

使用甲醇制备待测试式I化合物储备溶液(10mM)，并用甲醇经倍比稀释来制备每种化合物的五个系列浓度，用以测定半数抑制浓度(IC₅₀)。首先，将160μL PBS、2μL测试样品、20μL AChE或20μL BChE和10μL DTNB混合在96孔板中，在37℃下预孵育10分钟；

然后，加入10μL ATCI或BTCI溶液以引发反应，在37℃下继续孵育25分钟；孵育期间在412nm处测量吸光度。

使用以下公式计算抑制率：IR％＝[(Ac-As)]/(Ac–Ab)]×100％，其中Ab表示空白对照品的吸光度(20μL PBS代替酶溶液)，Ac表示对照品的吸光度(2μL甲醇代替样品溶液)，As表示样品的吸光度(10μL PBS代替ATCI或BTCI溶液)；每个样品的所有试验设置3个重复；通过绘制抑制率与其对数浓度线性回归曲线计算各化合物的IC₅₀值。

结果表明，式I化合物对BChE显示了较好的选择性抑制活性，IC₅₀为19.6μM，而对AChE则没有表现出明显的抑制作用。

进一步使用与活性测定相同的方法，用一系列浓度的底物BTCI(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mM)进行BChE抑制活性动力学研究。对于每个抑制剂，根据其IC₅₀值设置各自的三个测试浓度，正常组(抑制剂浓度为0)平行操作。加样反应后，在酶促反应期间的10分钟、20分钟和25分钟进行吸光度的检测。

以每分钟吸光度的变化表示酶促反应的速度(V)；以BTCI浓度倒数(1/[BTCI])为横坐标(x轴)，速度倒数(1/V)为纵坐标(y轴)，绘制正常组和不同浓度处理组(0μM、10μM、20μM、30μM)的Lineweaver–Burk图(双倒数曲线)，并使用由此获得的米氏常数(Km)和最大速度(Vmax)来检测抑制模式；随后，以抑制剂浓度[I]为横坐标(x轴)，以各实验组双倒数线函数斜率为纵坐标(y轴)建立二次曲线，曲线在x轴上的截距等于-Ki；以抑制剂浓度[I]为横坐标，以各实验组双倒数线函数的截距为纵坐标(y轴)建立二次曲线，曲线在x轴上的截距等于-αKi；根据Ki和αKi数值计算出热力学因子α值。

结果显示，在Lineweaver-Burk双倒数图(如图9所示)中，式I化合物给出了一组具有不同斜率的直线，在第二象限相交，表明其是混合型抑制剂。对于这种类型的相互作用，抑制剂可以与游离酶(E)和酶-底物(ES)复合物结合，分别形成EI和ESI复合物。式I化合物对BChE的Ki和αKi值分别为11.3和65.7μM，进一步计算出其对BChE的热力学协同因子α值为5.82。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (8)

1.一种顺反式Diels-Alder加合物，其特征在于，所述顺反式Diels-Alder加合物的分子结构式为：

2.一种权利要求1所述的顺反式Diels-Alder加合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：提取：将桑白皮粗粉置于提取容器中，加入3～10倍量的乙醇溶液，进行回流提取，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到桑白皮提取物浸膏；

S2：将桑白皮提取物浸膏用适量水或5-15％乙醇溶液分散混悬，进行大孔吸附树脂柱吸附层析，依次用不同质量浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，分别合并后浓缩，得到各洗脱液；

S3：对各洗脱液进行薄层色谱检测，收集合并含有目标化合物的馏分；将含有目标化合物的馏分进行硅胶柱减压层析，以二氯甲烷-甲醇系统，按照一定的体积比进行梯度洗脱，收集不同的洗脱流分；

S4:根据薄层色谱检测结果，合并相似洗脱流分，再将其中含有目标化合物的洗脱流分进一步通过聚酰胺柱层析、ODS柱色谱和高效液相色谱进行分离纯化，即得到所述顺反式Diels-Alder加合物。

3.根据权利要求2所述的顺反式Diels-Alder加合物的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述回流提取的工艺条件为：在50～80℃下回流提取2～5小时，重复提取2～3次。

4.根据权利要求2所述的顺反式Diels-Alder加合物的制备方法，其特征在于，步骤S2中乙醇溶液的质量浓度依次为10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、60％乙醇、80％乙醇和95％乙醇。

5.根据权利要求3所述的顺反式Diels-Alder加合物的制备方法，其特征在于，步骤S3中二氯甲烷-甲醇的体积比为(70-100)：(0-30)。

6.根据权利要求2所述的顺反式Diels-Alder加合物的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述聚酰胺柱层析以水-乙醇系统进行梯度洗脱，所述ODS柱色谱均以甲醇-水系统进行梯度洗脱；所述高效液相色谱，以甲醇-水系统进行梯度洗脱。

7.根据权利要求1所述的顺反式Diels-Alder加合物及其药学上可接受的盐作为丁酰胆碱酯酶抑制剂的用途。

8.根据权利要求1所述的顺反式Diels-Alder加合物及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。