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CN120813701A - 高产率载体 - Google Patents

高产率载体

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Publication number
CN120813701A
CN120813701A CN202380084144.7A CN202380084144A CN120813701A CN 120813701 A CN120813701 A CN 120813701A CN 202380084144 A CN202380084144 A CN 202380084144A CN 120813701 A CN120813701 A CN 120813701A
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CN
China
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sample
biomolecule
nucleic acid
molecule
carrier
Prior art date
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Pending
Application number
CN202380084144.7A
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English (en)
Inventor
L·埃德曼
D·列金
O·伦德贝里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gnothis Holding SA
Original Assignee
Gnothis Holding SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gnothis Holding SA filed Critical Gnothis Holding SA
Publication of CN120813701A publication Critical patent/CN120813701A/zh
Pending legal-status Critical Current

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    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
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Abstract

本公开涉及载体和制造此类载体的方法，所述载体包括基底和所述载体表面上的多个样品点，其中所述样品点在空间上彼此分离，并且其中单个生物分子被固定在单个样品点上。

Description

高产率载体
描述
本公开涉及载体和制造此类载体的方法，所述载体包括基底和所述载体表面上的多个样品点，其中所述样品点在空间上彼此分离，并且其中单个生物分子被固定在单个样品点上。
背景
人类基因组或其它生物基因组的测序以及单个序列变体的测定和比较需要提供测序方法，该方法首先是快速的，其次可被常规地和经济有效地使用。
对经济高效的测序的高需求已经推动了高通量测序技术的发展，所述技术使同时产生多个序列的测序过程并行化。这些测序技术的实例是大规模并行特征测序(LynxTherapeutics)、克隆扩增测序(Life Technologies)、454焦磷酸测序(RocheDiagnostics)、illumina测序(SolexaInc.)、连接法测序(sequencing byligation)(LifeTechnologies)、离子半导体测序(Life Technologies)或DNA纳米球测序(CompleteGenomics)。这些技术允许快速分析核酸群体中的共有序列。然而，存在于待分析的核酸群体中的少数序列中的突变，例如，存在于少数细胞基因组中的突变，将不会被检测到，因为它们被群体中存在的大多数其它序列所掩盖。
为了解决这些问题，已经开发了几种不同形式的单分子检测方法，诸如测序。对于所述后一种情况，通常，核酸聚合酶和/或核酸降解酶以及荧光标记的核酸和/或核苷酸构件被用于单独测定单个核酸分子的序列，所述序列测定基于在核苷酸构件被掺入核酸分子或从核酸分子上切除时荧光的时间依赖性变化。单分子测序方法和适用于进行此类方法的设备例如描述于共同拥有的申请WO 2002/097406、WO 2003/052137、WO 2006/013110、WO2013/131888、WO 2015/104245、WO 2017/001407和WO 2018/104301中。
在几种已知的方法和设备中，核酸降解酶分子和/或核酸合成酶分子或此类酶分子与核酸分子的复合物以固定化形式提供在固体载体上。
虽然假设每个样品点上有一个单分子，但是没有描述单分子固定过程的实际效率。
除了DNA和/或RNA测序之外，还有许多额外的应用，对于所述应用，存在对高产率的单分子分析的很高需求。
本公开的目的是提供适用于单分子事件分析，例如适用于单个核酸分子的序列分析的载体，包括增加的其中固定一个且仅一个生物分子的样品点的产率。
发明简述
在第一方面，本公开涉及制备用于分析单分子事件的载体的方法，所述单分子事件包括与特征电磁辐射的发射相关的单个生物分子的反应，所述方法包括以下步骤：
(a)提供载体，所述载体包括基底和所述载体表面上的多个样品点，其中所述样品点在空间上彼此分离，并且其中通过使所述样品点的尺寸适配待固定在其上的特定生物分子的大小，来使所述样品点适配于一个单个生物分子在一个样品点上的固定，以及
(b)在允许所述生物分子饱和固定到所述样品点上的条件下，将所述载体上的所述样品点与生物分子一起孵育，其中生物分子的量高于可用样品点的量。
本公开的另一方面涉及载体，所述载体包括基底和所述载体表面上的多个样品点，其中样品点在空间上彼此分离，并且其中生物分子被固定在样品点上，其中单个生物分子被固定到至少约50％的所述样品点中的单个样品点上，并且其中所述样品点的尺寸被适配于特定的被固定的生物分子的大小。
本公开的另一方面涉及上述载体用于分析包含单个生物分子的反应的事件的用途，所述单个生物分子反应与单个样品点处的特征电磁辐射的发射相关，其中所述事件与电磁辐射的发射相关。在特定实施方案中，事件是单分子事件。
本公开的另一方面涉及用于分析单分子事件的方法，所述单分子事件包括与特征电磁辐射的发射相关的单个生物分子的反应，所述方法包括：
(i)提供上述载体，其中单个生物分子被固定在至少约50％的样品点中的单个样品点上，以及
(ii)通过检测来自单个样品点的电磁辐射来分析与单个生物分子相关的事件。
在特定实施方案中，单分子事件包括单个核酸分子的序列分析。
本公开的另一方面涉及用于分析单分子事件的设备，所述单分子事件包括与特征电磁辐射的发射相关的单个生物分子的反应，所述设备包括：
(i)上述载体，其中单个生物分子被固定在至少约50％的样品点中的单个样品点上，
(ii)用辐射照射载体上至少一个样品点的装置，和
(iii)用于通过检测来自单个样品点的电磁辐射来分析与单个生物分子相关的事件的装置。
在特定实施方案中，所述设备适用于单个核酸分子的序列分析。
说明书的项目
1.一种制备用于分析单分子事件的载体的方法，其包括以下步骤：
(c)提供载体，所述载体包括基底和在载体表面上的多个样品点，其中所述样品点在空间上彼此分离，并且其中所述样品点适配于一个单个生物分子在一个样品点上的固定，以及
(d)在允许所述生物分子饱和固定到所述样品点上的条件下，将所述载体上的所述样品点与生物分子一起孵育。
2.项目1的方法，其中单个生物分子被固定在所述载体上至少约50％的所述样品点中的单个样品点上。
3.项目1或2的方法，其中单个生物分子被固定在至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约99％和高达99.99％的样品点中的单个样品点上。
4.前述项目中任一项的方法，其中所述载体包含至少10个、至少100个、至少1,000个、至少104个、至少105个、至少106个、至少107个或至少108个样品点。
5.前述项目中任一项的方法，其中在所述载体的表面上提供样品点，使得相邻样品点之间的距离为约1nm至约5000nm，例如为约2nm至约2000nm。
6.根据前述项目中任一项的方法，其中提供样品点，所述样品点具有基于待固定于其上的特定生物分子的预定尺寸。
7.项目6的方法，其中所述样品点具有约5nm至约10nm的尺寸，特别是约6nm至约8nm的尺寸，更特别是约7nm，用于在一个所述样品点上固定一个单个生物分子，其中所述单个生物分子是多肽和/或核酸分子。
8.项目7的方法，其中所述生物分子是核酸聚合酶，特别是DNA或RNA聚合酶，和/或核酸分子，特别是DNA或RNA分子。
9.前述项中任一项的方法，其中提供了具有20％或更小的在其平均尺寸附近的标准偏差的样品点。
10.前述项目中任一项的方法，其中使所述样品点的表面化学适配于一个单个生物分子在一个所述样品点上的固定。
11.项目10的方法，其中所述样品点的表面包含至少一种功能性锚定分子，其包含适于生物分子的直接或间接附着的部分。
12.项目11的方法，其中所述功能性锚定分子通过含硫基团(例如，硫醇基团)附着至所述样品点的表面。
13.项目11或12的方法，其中所述样品点包括金属表面，特别是Au或Au/Pd表面。
14.前述项目中任一项的方法，其中允许所述生物分子饱和固定到所述样品点的条件包括适配以下参数中的至少一个：
(i)生物分子的浓度；
(ii)孵育时间；
(iii)孵育温度；
(iv)(i)、(ii)和/或(iii)的任意组合。
15.前述项目中任一项的方法，其中允许所述生物分子饱和固定到所述样品点的条件包括在其中生物分子的量高于可用样品点的量的条件下进行孵育步骤。
16.项目14所述的方法，其中生物分子的量至少为用样品点的量的10倍。
17.前述项目中任一项的方法，其中所述载体至少基本上是平面的。
18.前述项目中任一项的方法，其中所述载体是结构化的。
19.前述项目中任一项的方法，其中所述基底是光学透明的。
20.前述项目中任一项的方法，其中所述基底包括折射率至少为1.01的材料。
21.前述项目中任一项的方法，其中所述基底包括非导电材料，例如，选自由二氧化硅、石英和玻璃组成的组的材料。
22.前述项目中任一项的方法，其中所述基底的厚度为约10μm至约5mm，特别是约20μm至约2mm。
23.前述项目中任一项的方法，其中样品点包含至少一种导电材料，例如包括纯金属或金属组合(例如，多种不同金属的合金或混合物)在内的金属。
24.前述项目中任一项的方法，其中所述样品点包含能够与含硫基团(例如，呈硫醇或二硫化物的形式)形成键的金属。
25.前述项目中任一项的方法，其中所述至少一种金属具有正电化学势。
26.前述项目中任一项的方法，其中所述至少一种金属选自Au、Cu、Ni、Pt、Pd、Rh、Ir、Os、Ru以及包含至少两种所述金属的任意组合。
27.前述项目中任一项的方法，其中所述至少一个样品点包含至少一种金属氧化物，诸如TiO2、NiO或ITO。
28.前述项目中任一项的方法，其中所述生物分子选自由以下组成的组：多肽、核酸、碳水化合物及其任意组合。
29.前述项目中任一项的方法，其中所述生物分子是核酸聚合酶，特别是DNA聚合酶或RNA聚合酶，或者是核酸聚合分子复合物，特别是包含核酸聚合酶和核酸分子的DNA或RNA聚合复合物。
30.前述项目中任一项的方法，其中所述生物分子是具有DNA结合裂缝的DNA聚合酶，特别是A族DNA聚合酶，包括但不限于Klenow、Taq或T7 DNA聚合酶或其任何遗传修饰形式，或B族聚合酶，包括但不限于therminator、Phi29、RB-69或T4 DNA聚合酶或其任何遗传修饰形式。
31.前述项目中任一项的方法，其中所述生物分子是基因编辑酶，特别是Cas核酸酶，诸如Cas9核酸酶或其任何遗传修饰形式，或包含基因编辑酶和核酸分子(例如引导RNA和/或靶核酸)的基因编辑复合物。
32.一种载体，其包括基底和在载体表面上的多个样品点，其中所述样品点在空间上彼此分离，并且其中生物分子被固定在样品点上，其中单个生物分子被固定在至少约50％的所述样品点的单个样品点上。
33.可通过项目1-31中任一项的方法获得的项目32的载体。
34.项目32或33的载体用于分析单分子事件的用途。
35.项目34的用途，其中所述单分子事件包括单个核酸分子的序列分析。
36.一种用于分析单分子事件的方法，其包括：
(i)提供项目32-33中任一项的载体，其中单个生物分子被固定在至少约50％的所述样品点中的单个样品点上，以及
(ii)通过检测来自单个样品点的电磁辐射来分析与所述单个生物分子相关的事件。
37.项目36的方法，包括并行地分别检测来自多个单独样品点的电磁辐射。
38.项目36或37的方法，其中所述单分子事件包括单个核酸分子的序列分析。
39.一种用于分析单分子事件的设备，其包括：
(i)项目32-33中任一项的载体，其中单个生物分子被固定在至少约50％的所述样品点中的单个样品点上，
(ii)用辐射照射载体上至少一个样品点的装置，和
(iii)用于通过检测来自单个样品点的电磁辐射来分析与所述单个生物分子相关的事件的装置。
40.项目39的设备，其适配于并行地分别检测来自多个单独样品点的电磁辐射。
41.项目39或40的设备，其适配于单个核酸分子的序列分析。
详细描述
本公开涉及制备用于分析单分子事件的载体的方法以及可通过该方法获得的载体。该载体包括基底和在载体表面上的多个样品点，所述样品点在空间上彼此分离。在某些实施方案中，载体表面由基底和样品点形成。样品点是载体表面上适配于固定一个单个生物分子的点。
在某些实施方案中，基底形成连续区域，样品点分布在该连续区域中。载体表面上的单个样品点被基底包围，所述基底例如在材料和/或表面方面不同于样品点。通常，基底适配于抑制和/或阻断生物分子诸如多肽的粘附，而样品点适配于允许所需生物分子的粘附。
由本公开提供的载体包含增加的产率的其中固定有一个且仅一个生物分子的样品点。本发明人已经确定了在每个样品点上如何将一个且仅一个单分子定位，以及如何可实现100％理论产率(并且在实践中接近100％，例如，高达99.9％或99.99％)的手段。
在某些实施方案中，以所述载体上所述样品点的至少约50％的产率将单个生物分子固定在单个样品点上。在特定实施方案中，单个生物分子被固定在至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约99％和高达99.99％的样品点中的单个样品点上。对于特定载体，固定在单个样品点上的单个生物分子的产率可以通过几种光谱和/或显微镜方法来实现。在某些实施方案中，如果结合的分子是荧光的或者如果它们被用于催化其中形成荧光产物的反应，则通过荧光光谱法来确定被单个生物分子占据的样品点。在另外的实施方案中，通过原子力显微镜来确定单个生物分子占据的样品点。
如下计算单个生物分子占据的样品点的百分比P：
P＝n/N
其中n是单个生物分子占据的单个样品点的数量，N是载体上样品点的总数。
术语“单个生物分子”涵盖单个分子实体，诸如多肽或由多个单个单元组成的复合物，例如其中单个单元一起形成功能性生物部分的单个分子实体。
在某些实施方案中，载体是基本上平面的载体，即其不包含约1000nm或更大或约100nm或更大的凸起或凹陷。在另外的实施方案中，载体是结构化的载体，例如，载体包含凹陷，诸如体积可为约5x 10-24升至约1x 10-15升的孔，或高度为约1nm至500nm的柱。原则上，载体可以具有任何设计，只要可以形成使得能够在其中固定单个生物分子的样品点上发生单个分子事件的反应空间即可。
在某些实施方案中，基底是光学透明材料，即对于电磁辐射(例如可见光范围内的辐射和/或近红外范围内的辐射)基本透明的材料。在某些实施方案中，基底包含具有至少1.01(例如在可见光范围内为约1.5至约3，或者在近红外范围内为约1.5至约4)的绝对折射率的材料。在另外的实施方案中，基底是光学不透明材料，例如金属或半金属(诸如硅)。
在特定实施方案中，基底包含非导电材料。具体实例为玻璃、石英、塑料、基于金属氧化物的材料，例如基于二氧化硅的材料，诸如玻璃、二氧化硅或石英，或包含所述材料的复合材料。在另外的实施方案中，基底包含导电材料，例如光学透明材料，诸如氧化铟锡。
通常，基底的厚度为约10μm至约5mm，特别是约20μm至约2mm。
在某些实施方案中，如共同未决的申请US 63/382,624(其内容通过引用并入本文)中所述，基底涂覆有一层类金刚石碳和/或无定形碳(也称为“碳膜”)。碳膜可以通过物理气相沉积、化学气相沉积(CVD)或原子层沉积(ALD)技术沉积在基底上。除样品点区域外，碳膜可以在载体表面上形成连续层。在某些实施方案中，碳膜被氟化。可通过已知程序，例如在DLC沉积过程中通过CVD或者通过暴露于来自基于碳氟的气体等(例如，C4F8、CHF3、NF3或SF6)的含氟等离子体引入氟原子。
在某些实施方案中，包括氟化碳膜在内的碳膜具有约0.3nm至约200μm，特别是约10nm至约100μm，更特别是约1μm至约50μm的厚度。
在某些实施方案中，基底的表面涂覆有有机钝化剂，例如，抑制和/或阻断诸如蛋白质和/或核酸的生物分子粘附的含聚乙二醇的试剂。
载体的表面包含多个样品点，所述样品点通过基底表面在空间上彼此分离。样品点适配于单个生物分子的附着。在某些实施方案中，载体包含多个样品点，例如至少10个、至少100个、至少1,000个、至少104个、至少105个、至少106个、至少107个或至少108个样品点。在某些实施方案中，载体可以在单个载体上包含多达109个或甚至更多的样品点。在某些实施方案中，在载体的表面上提供样品点，使得相邻样品点之间的距离为约1nm至约5000nm，例如为约2nm至约2000nm。载体上样品点的分布可以是均匀的或不均匀的，例如成组簇集。
在某些实施方案中，样品点包含至少一种导电材料(例如，包括单一金属或金属的组合(例如，多种不同金属的合金或混合物)在内的金属)或由所述至少一种导电材料组成。例如，能够附着至含硫部分(例如呈硫醇或二硫化物的形式)的金属，或者能够附着至螯合部分(例如聚组氨酸标签)的金属是合适的。在某些实施方案中，金属具有正的电化学势。合适金属的具体实例包括但不限于Au、Cu、Ni、Pt、Pd、Rh、Ir、Os、Ru以及包含至少两种所述金属的任意组合。
在某些实施方案中，样品点包含至少一种金属氧化物(包括单一金属氧化物或金属氧化物的组合)或由其组成。例如，能够附着至含磷部分(例如呈膦酸或膦酸酯的形式)的金属氧化物，或者能够附着至螯合部分(例如聚组氨酸标签)的金属氧化物是合适的。合适的金属氧化物的具体例子包括TiO2和NiO。
在另外的实施方案中，样品点包含至少一种非导电材料或由其组成。
样品点可以通过金属的气相沉积来制备，在被栅格掩模覆盖的载体上蒸发所述金属，所述栅格掩模可以通过电子束光刻或等效技术来产生。栅格掩模中孔的尺寸可以对应于支持表面上点的尺寸。或者，载体上的点可以通过在载体上，特别是在具有平坦表面的载体上精确吸移颗粒，通过纳米颗粒(例如，具有2-10nm的尺寸)的位点特异性沉积来制备。
样品点可具有适合于附着本文定义的单个生物分子的尺寸。在特定实施方案中，样品点具有约1nm至约30nm的直径，特别是约2nm至约20nm的直径。
在某些实施方案中，样品点是基底表面上的独立物体。在某些实施方案中，样品点具有靠近基底的下表面和远离基底的上表面，其中下表面与上表面之间的距离限定了样品点的高度。在特定实施方案中，高度为约50pm至约500nm，特别是约100pm至约20nm，更特别是约500pm至约10nm，例如约2nm。
为了实现所需的高产率，样品点适配于将一个单个生物分子固定在一个样品点上。这可通过设计由于空间原因(例如，每个点没有足够的空间来容纳超过正好一个分子)使每个点只能结合不超过一个生物分子的样品点来实现。
在某些实施方案中，提供了具有基于待固定在其上的特定生物分子的预定尺寸的样品点。使样品点的尺寸(例如其直径)适配于特定生物分子的大小。
在特定实施方案中，样品点具有约5nm至约10nm的尺寸，特别是为约6nm至约8nm的尺寸，更特别是约7nm的尺寸，用于在一个样品点上固定一个单个生物分子，例如多肽和/或核酸分子。在那些实施方案中，生物分子是核酸聚合酶，特别是DNA或RNA聚合酶和/或核酸分子，特别是DNA或RNA分子。
在某些实施方案中，样品点在其平均尺寸附近具有低标准偏差，从而提供均匀的尺寸分布轮廓。这可通过现代纳米制造技术来实现。在特定实施方案中，样品点尺寸在其平均尺寸附近的标准偏差约为20％或更小。
在某些实施方案中，样品点就其表面化学性质适配于将单个生物分子固定在一个所述样品点上。在特定实施方案中，样品点具有涂层，该涂层为生物分子的固定提供了有限数量的结合位点，例如，在至少50％的所述样品点中有单一的生物分子结合位点。
在某些实施方案中，样品点的表面包含至少一种功能性锚定分子，其包含适于生物分子的直接或间接附着的部分。适于附着生物分子的部分可以例如选自生物素或点击官能团。在特定实施方案中，功能性锚定分子通过含硫基团(例如，硫醇基团)附着至所述样品点的表面。金属点的表面可包含金属，例如，如上所述的金属，特别是Au或Au/Pd表面。
在特定实施方案中，样品点的尺寸和表面化学性质适配于特定单个生物分子的固定。例如，核酸聚合酶，特别是DNA或RNA聚合酶，可被固定在尺寸为约6nm至约8nm，更特别是约7nm的样品点上，并且表面，例如金属诸如Au和/或Pd的表面，与具有含硫基团如硫醇基团的锚定分子连接。
根据本公开，在允许将所述生物分子饱和固定在样品点上的条件下，将包含适配于固定单个生物分子的样品点的载体与生物分子一起孵育，通常与生物分子一起在合适的液体介质中孵育。
饱和固定意指在关于生物分子的饱和条件下进行孵育，即有利于生物分子与载体上每个可用的样品点的结合。
在某些实施方案中，允许将生物分子饱和固定在样品点上的条件包括适配，特别是增加以下参数中的至少一个：
(v)生物分子的浓度；
(vi)孵育时间；
(vii)孵育温度；
(viii)(i)、(ii)和/或(iii)的任意组合。
在某些实施方案中，在液体介质中用高浓度生物分子进行孵育。这提供了确保在所述点已经适配于单分子固定的情况下，每个点结合一个且仅一个生物分子的手段。
这是与现有技术的方法相比本方法的主要有利方面，在现有技术的方法中，生物分子的浓度保持在非常严格的区间内，以便优化其中固定单个生物分子的样品点的数量。在现有技术的方法中，结合遵循泊松随机密度，这意味着永远不可能达到在大多数样品点中每个样品点结合一个生物分子的情况。在当前创新的情况下，避免了泊松统计，并且如果在饱和条件下进行结合，例如通过在介质中使用非常高浓度的生物分子，则高达100％的点可具有一个且仅一个生物分子。
在某些实施方案中，允许所述生物分子饱和固定到样品点上的条件包括在生物分子的量高于可用样品点的量的条件(特别是其中生物分子的量为可用样品点的量的至少2倍、至少5倍或至少10倍)下进行孵育步骤。
载体上的样品点被适配于附着生物分子，使得单个生物分子例如通过共价或非共价附着被固定在单个样品点上。生物分子可选自多肽、核酸、碳水化合物及其任意组合，例如糖基化多肽或核糖核蛋白。在某些实施方案中，生物分子是由几个单个单元(例如几个多肽单元，或几个多肽和核酸单元)组成的复合物。
在具体实施方案中，生物分子是核酸聚合酶，特别是DNA聚合酶或RNA聚合酶，或核酸聚合分子复合物，特别是包含核酸聚合酶和核酸分子的DNA或RNA聚合复合物。在特定实施方案中，生物分子是具有DNA结合裂缝的DNA聚合酶，特别是A族DNA聚合酶，包括但不限于Klenow、Taq或T7 DNA聚合酶或其任何遗传修饰形式，或B族聚合酶，包括但不限于therminator、Phi29、RB-69或T4 DNA聚合酶或其任何遗传修饰形式。在本说明书中参考了US 7,745,116 B2(其内容通过引用并入本文)。
在另外的实施方案中，生物分子是核酸降解酶，特别是核酸外切酶，或核酸降解分子复合物，特别是包含核酸降解酶和核酸分子的降解DNA或RNA的分子复合物。
在又一另外的实施方案中，生物分子是基因编辑酶，特别是Cas核酸酶，诸如Cas3、Cas9、Cas10或Cas12核酸酶或其任何遗传修饰形式，例如Cas切口酶，或包含基因编辑酶和核酸分子(例如引导RNA和/或靶核酸)的基因编辑复合物。
在某些实施方案中，生物分子包含至少一个锚，例如附着至单个样品点的单个锚。
在某些实施方案中，生物分子直接附着至样品点，例如，通过提供具有适合于直接共价或非共价附着至样品点表面(例如，附着至样品点的无机表面)的锚的生物分子直接附着至样品点。在那些实施方案中，锚可包含含硫基团诸如硫醇基团-SH、取代的硫醇基团-SR的反应产物，其中R是有机残基，例如C1-C4烷基或二硫基-S-S-或含磷基团与样品点上的金属或金属氧化物表面的反应产物。或者，锚可包含硅烷基团与金属氧化物的反应产物，例如二氧化硅表面，或聚(组氨酸)标签与Ni或NiO表面的反应产物。
在某些实施方案中，生物分子例如通过与涂层(例如，样品点表面上的有机涂层)的非共价键联间接附着至样品点。在那些实施方案中，可以提供具有锚的生物分子，所述锚包含附着氨基酸，诸如半胱氨酸、经修饰的苯丙氨酸、组氨酸或谷氨酰胺，或附着标签，例如生物素、半抗原、聚(组氨酸)标签或碳水化合物基团，其能够与附着至样品点表面的涂层的互补部分例如链霉抗生物素蛋白、抗体、凝集素等形成键联。
在某些实施方案中，可以提供生物分子，所述生物分子具有生物正交基团，即不存在于生物分子中的基团，诸如叠氮基或炔基，例如末端或环张力炔基，诸如环辛炔。此类生物正交基团能够与附着至样品点表面的互补生物正交基团形成共价键联。在那些实施方案中，锚可包括两个生物正交反应基团之间的偶联反应的反应产物。在某些实施方案中，偶联反应是点击反应，例如两个点击官能团(例如，叠氮基和炔基)之间的反应。在某些实施方案中，锚包含三唑基团。
本公开的载体适于分析发生在样品点上的事件，其中该事件与来自样品点的电磁辐射的发射相关。在特定实施方案中，该事件包括与特征电磁辐射的发射相关的生物分子的反应。在特定实施方案中，事件是单分子事件。
在特定实施方案中，本公开的载体适合于分析事件，例如在至少一个样品点上发生的单分子事件，特别地适于分别分析各自在至少一个样品点上发生的多个单分子事件，甚至更特别地适合于并行地分别分析多个单分子事件。在特定实施方案中，单分子事件包括核酸序列测定。
另一方面涉及用于分析单分子事件的方法，所述单分子事件包括与特征电磁辐射的发射相关的单个生物分子的反应，所述方法包括：
(i)提供上述载体，其中单个生物分子被固定在至少约50％的所述样品点中的单个样品点上，以及
(ii)通过检测来自单个样品点的电磁辐射来分析与所述单个生物分子相关的事件。
在特定实施方案中，单分子事件包括单个核酸分子的序列分析。
另一方面涉及用于分析单分子事件的方法，所述单分子事件包括与特征电磁辐射的发射相关的单个生物分子的反应，所述方法包括：
(i)提供上述载体，其中短的单链核酸分子，特别是DNA或RNA分子，优选长度在3-300个核苷酸范围内，被固定在单个样品点上，
(ii)加入包含互补核酸分子，特别是互补DNA或RNA分子的样品，以及
(iii)测量任何杂交事件。
另一方面涉及用于分析单分子事件的设备，所述单分子事件包括与特征电磁辐射的发射相关的单个生物分子的反应，所述设备包括：
(i)上述载体，其中单个生物分子被固定在至少约50％的所述样品点的单个样品点上，
(ii)用辐射照射载体上至少一个样品点的装置，和
(iii)用于通过检测来自单个样品点的电磁辐射来分析与所述单个生物分子相关的事件的装置。
在特定实施方案中，该设备适用于单个核酸分子的序列分析。
用于分析单分子事件的方法和设备例如公开于WO 2002/097406、WO 2003/052137、WO 2006/013110、WO 2013/131888、WO 2015/104245、WO 2017/001407和WO 2018/104301(其内容通过引用并入本文)中。
对于单个分子事件的分析，生物分子位于载体上的样品点上。在那里，它们与含有游离反应配偶体的样品液体接触。由此，限定了一个或多个反应空间。特别是可以在单个载体(例如单个平面载体)上进行分析至少100个、至少1000个、或至少10000个以及多达超过106个分子。
其序列待测定的核酸分子可以选自例如DNA分子，诸如基因组DNA片段、cDNA分子、质粒等，或者选自RNA分子，诸如mRNA分子。核酸分子可来源于从细胞或生物体(例如，真核或原核细胞或生物体)产生的基因组或表达文库。这允许对多个不同的核酸模板分子，例如，至少10个、100个、1,000个或10,000个，最多100,000个、106个或107个或甚至更多个不同的核酸分子进行平行测序。
待测序的核酸分子可以是呈线性或环状形式(例如呈共价连接的环状形式)的单链核酸分子。为了获得环状核酸模板，在样品制备过程中，可以对线性核酸分子进行环化程序和任选的链分离程序。环化可以通过根据已知方案的连接，例如使用DNA或RNA连接酶来实现。在一些实施方案中，可将衔接子和/或标识符分子，即已知序列的核酸分子，与核酸分子偶联。
序列测定可以包括核酸延伸和/或核酸降解。测序过程包括一个或多个测序循环。
核酸合成酶分子能够延伸与核酸模板分子退火的引物。引物延伸可以通过在正在生长的核酸链的3'末端逐步掺入单个核苷酸构件来进行，其中产生与环状核酸模板序列互补的核酸分子。核酸合成酶选自能够进行模板特异性核酸聚合的聚合酶，优选选自DNA聚合酶和RNA聚合酶，例如天然或经修饰的聚合酶，包括热稳定的DNA聚合酶。
合适的DNA聚合酶的具体实例包括Taq聚合酶、核酸外切酶缺陷型Taq聚合酶、大肠杆菌(E.Coli)DNA聚合酶I、Klenow片段、逆转录酶、相关聚合酶(包括野生型聚合酶和此类聚合酶的衍生物，诸如核酸外切酶缺陷型形式)、T7 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、RB69聚合酶等。
核酸降解酶分子能够从核酸分子中逐步裂解出单个核苷酸构件。优选使用核酸外切酶，更优选使用在3'→5'方向或5'→3'方向降解的单链核酸外切酶。特别优选使用的核酸外切酶是3'→5'核酸外切酶，诸如大肠杆菌核酸外切酶I和大肠杆菌核酸外切酶III，以及5'→3'核酸外切酶，诸如T7核酸外切酶、大肠杆菌核酸外切酶II和大肠杆菌核酸外切酶VIII。此外，可以使用各种聚合酶例如Klenow片段、Taq聚合酶或T4聚合酶的核酸外切酶活性。
将核酸合成酶分子与线性或环状核酸模板分子(例如单链DNA或RNA分子)和与核酸模板分子退火或能够与其退火的引物分子接触。引物分子优选为具有游离3'末端的单链核酸或核酸类似物分子，其可以通过被固定的核酸合成酶分子催化的酶促反应来延伸。选择引物分子的长度，以允许在反应条件下与模板有效退火。通常，引物分子的长度为至少8个、至少10个、至少12个或至少15个核苷酸，例如高达20个、25个、50个或100个核苷酸，或甚至更多个核苷酸。在一些实施方案中，引物例如通过掺入核苷酸类似物构件和/或核苷酸构件之间的键联来抵抗核酸降解酶分子的消化，其对降解是稳定的。在其它实施方案中，引物对核酸降解酶分子的消化敏感。
选择引物的序列是因为其在反应条件下能有效地与模板分子退火。例如，引物可以是能够与未知核酸序列统计学退火的通用简并引物。在其它实施方案中，引物可能能够与核酸模板分子的已知序列部分退火。在该实施方案中，可将已知的衔接子和/或标识符序列掺入核酸模板分子中。引物可以是未标记的或包含荧光标记基团。
此外，需要存在携带至少一个荧光标记基团的核苷酸构件。优选地，每个不同的核苷酸构件(A、G、C、T/U)包含不同的荧光标记基团。
荧光标记基团可选自已知的用于标记生物聚合物(特别是核酸)的荧光标记基团，例如荧光素染料、罗丹明、噁嗪，例如Evoblue或Gnothis Blue、藻红蛋白、Cy3、Cy5、IR染料或其衍生物等。
核苷酸构件可以携带(i)荧光标记基团，当构件在由核酸合成酶分子催化的引物延伸过程中掺入核酸分子时，该荧光标记基团保留在构件中，和/或(ii)荧光标记基团，当构件在由核酸合成酶分子催化的引物延伸过程中掺入核酸分子时，该荧光标记基团从构件上切除。保留在构件中的荧光标记基团优选连接于α-磷酸基团、糖和/或核碱基基团。
在特定实施方案中，保留在构件中的荧光标记基团例如通过可具有多达15个，优选10-12个碳原子的链长的接头(任选地包含杂原子，例如N、O或S原子)连接于核碱基。当构件掺入到核酸分子中时被切除的荧光标记基团可以连接于例如多磷酸盐构件(包括但不限于六-、五-、四-或三磷酸盐构件)的末端磷酸基团，诸如三磷酸盐构件的γ-磷酸基团。在某些实施方案中，选择包含(i)掺入后剩余的荧光标记基团和(ii)掺入过程切除的荧光标记基团两者的构件。在这种情况下，可选择能够例如通过淬灭和/或能量转移相互作用的荧光基团。
在使用核酸降解酶分子对核酸分子进行直接测序的情况下，待测序的核酸分子将包含荧光标记基团。另一方面，如果核酸分子在引物延伸中用作模板，待测序的核酸分子可以不含荧光标记基团。
测序程序可包括产生核酸分子的步骤和/或由核酸降解酶分子催化的从产生的核酸分子中切下单个核苷酸构件的第二步骤，所述核酸分子在由核酸合成酶分子催化的引物延伸中掺入了核苷酸构件。根据荧光标记的类型，核酸序列测定可以在引物延伸和/或降解过程中进行。
引物延伸过程中的序列测定涉及携带荧光标记基团的核苷酸构件的使用，当所述构件掺入核酸分子中时，所述荧光标记基团从构件上被切割下来。在这种情况下，可以测定由从核苷酸构件中切除荧光标记基团引起的时间依赖性荧光变化。核酸降解过程中的序列测定涉及核苷酸构件的使用，所述构件携带荧光标记基团，当构件掺入到核酸分子中时，所述荧光标记基团保留在构件中。当标记的核苷酸构件从核酸分子中释放出来时，单个核苷酸构件从核酸分子中的逐步切割引起荧光的时间依赖性变化。在某些实施方案中，也可以在延伸和降解过程中进行序列测定，即当使用核苷酸构件时，所述核苷酸构件既携带保留在构件中的荧光标记基团，又携带当构件掺入核酸分子中时从构件上切下的荧光标记基团。在该实施方案中，两种荧光基团可以相同或不同。
在一些实施方案中，该方法包括一个或多个核酸合成和核酸降解循环，以便确定核酸分子模板的碱基序列。核酸合成包括由核酸合成酶分子催化的与核酸模板分子退火的引物的延伸，其中产生与核酸模板的序列互补的核酸分子。在下一步中，产生的核酸分子被核酸降解酶分子降解。
当核苷酸构件被掺入到伸长的核酸分子中时，可以发生荧光的时间依赖性变化，这可以如上所述被检测到。优选地，将核苷酸构件掺入到延伸的核酸分子中与荧光的可检测增加相关，优选地与荧光的瞬时增加相关。例如，可以使用核苷酸构件，所述核苷酸构件在分子的一部分上(例如，在γ-磷酸基团上)携带荧光标记基团，当构件被掺入引物时，所述荧光标记基力被切除。
当从合成的核酸分子上切除核苷酸构件时，由于掺入核酸链中的荧光标记基团与相邻基团，例如与核酸的化学基团(特别是核碱基，例如G)或/和相邻的荧光标记基团的相互作用，可以测定荧光的时间依赖性变化，并且由于淬灭过程或/和能量转移过程，这些相互作用导致与呈“分离”形式的荧光标记基团相比的荧光的变化，特别是荧光强度的变化。通过切割单个核苷酸构件的去除改变了总体荧光，例如固定的核酸链的荧光强度，并且这种变化是通过切割单个核苷酸构件的去除的函数，即时间的函数。
在某些实施方案中，通过测量发射的光子的偏振来检测标记核苷酸与生物分子复合物的缔合。激发态光子的偏振通过发光核苷酸标记物的旋转运动而改变，并且可用于在聚合过程中鉴定自由移动的反向结合的标记核苷酸。
在延伸和/或降解过程中，可以平行记录多个核酸分子的荧光的这种时间依赖性变化，并且该变化与单个核酸链的碱基序列相关联。优选使用那些荧光标记基团，当掺入核酸链中时，所述荧光标记基团至少部分被淬灭，使得在含有标记基团的核苷酸构件或引起淬灭的相邻构件通过切割被去除后，荧光强度增加。
在掺入和/或去除单个核苷酸构件的过程中，由于淬灭过程或能量转移过程，可以测量核酸链和/或掺入或切除的核苷酸构件的荧光强度的变化。这种荧光强度随时间的变化取决于所研究的核酸链的碱基序列，因此可以与序列相关联。
核酸分子的完整序列可以通过使用核苷酸构件的混合物来确定，所述核苷酸构件在所有四种不同的碱基上，例如在A、G、C和T上，或者在两种或三种不同碱基的组合上被标记。在适当的情况下，也可以例如通过使用连接酶和/或末端转移酶的酶促反应将“序列标识符”(即，标记的序列已知的核酸)附接至待研究的核酸链上，使得在测序开始时最初获得已知的荧光模式，并且仅在其后获得对应于待研究的未知序列的荧光模式。
检测包括优选通过激光或另一种合适的光源将光照射到载体上，以引起荧光标记基团的激发。在这方面，可以使用一个或多个激光束，例如扩展的激光束(具有大约1-20mm的横截面)，和/或多个激光束。检测优选包括通过激光的多点荧光激发，例如通过衍射光学元件(参见WO 2002/097406)或量子阱激光器产生的激光点的点阵。
可以使用检测器矩阵并行检测多个核酸链的荧光发射，所述检测器矩阵包括例如电子检测器矩阵(例如CCD照相机)、CMOS检测器矩阵(例如CMOS照相机)或雪崩光电二极管矩阵。检测可以以这样的方式进行，即在所研究的部分或全部核酸链上并行进行荧光激发和检测。优选对基本上垂直于载体表面发射的荧光进行检测，所述荧光穿过反应空间或穿过载体。
例如，可以通过单分子检测来，例如通过荧光相关光谱法进行检测，所述单分子检测包括将非常小的、优选共焦的体积元素(例如10-21至10-10l)暴露于激光器或另一合适光源的激发光，该光激发存在于该测量体积中的接受器，使得后者发射荧光，从所述测量体积发射的荧光通过光电检测器进行测量，并且所测量的发射随时间的变化与分析物的浓度相关，使得可以在适当高的稀释度下鉴定所述测量体积中的单个分子。用于检测的程序和仪器的细节可见于EP 0 679 251(其内容通过引用并入本文)的公开内容中。单分子的共焦测定还描述于Rigler和Mets(Soc.Photo-Opt.Instrum.Eng.1921(1993),239ff.)以及Mets和Rigler(J.Fluoresc.4(1994)259-264)中，所述文献的内容通过引用并入本文。
可选地或另外地，检测也可以通过时间分辨衰减测量(称为“时间门控”，如例如由Rigler等人，“Ultrafast Phenomena”,D.H.Auston，编辑，Springer 1984中的“PicosecondSingle Photon Fluorescence Spectroscopy of Nucleic Acids”(其内容通过引用并入本文)所描述的)的方式来进行。此处，在测量体积中激发荧光分子，随后例如以≥100ps的时间间隔在光电检测器上打开检测间隔。这样，可以使由拉曼效应产生的本底信号保持足够低，以使得能够以基本上无干扰的方式检测单个分子。
本公开的方法和设备也适用于其它单分子事件的分析，对于所述事件，存在对高产率的单分子分析(即，结合至选定的点的用于分析的单个生物分子)的很高需求。
在某些实施方案中，本公开涉及受体-配体相互作用的单分子分析，例如，包括受体蛋白与样品点的结合，以及之后在例如药物开发中研究其与其配体的相互作用。
在另外的实施方案中，本公开涉及杂交事件的单分子分析，例如，包括例如长度在3至300个核苷酸范围内的短单链核酸分子(例如，DNA或RNA分子)的附着和/或固定，以及之后加入包含互补核酸分子的样品并观察任何杂交事件。应用领域可以是例如病毒RNA/DNA的检测、细菌DNA/RNA的检测和来自血流中的癌细胞的DNA的短区段的检测。
此外，通过参考以下具体实施方案来详细解释本公开。
图1显示了现有技术的实施方案。生物分子(3)被结合到载体(1)上约100nm直径的样品点(2)上。分子随机结合，导致结合分子的表面密度呈泊松分布。根据这种泊松分布，存在没有生物分子与其结合的样品点、有单个生物分子与其结合的样品点和有两个(或更多个)生物分子与其结合的样品点的谱。(泊松分布的参数取决于几个参数，而在结合之前的步骤中添加的生物分子的浓度是一个这样的参数)。
图2A、图2B和图2C显示了本公开的实施方案。
A(俯视图)和B(侧视图)：载体(1)上具有1-30nm，特别是5-10nm，更特别是6-8nm的单个直径的样品点(4)具有单个附着至其上的生物分子(3)。由于关于单个点的尺寸和/或表面化学的空间考虑，只有一个生物分子(3)可以结合至其上。在饱和条件下进行生物分子的固定化程序导致一个且仅一个生物分子所结合的点的高且(几乎)定量的产率。
C：描述了具有荧光基团(例如附接至生物分子的外部标记基团)的生物分子(4)。荧光基团可具有任意的发射波长分布和相应的激发波长分布。在某些实施方案中，荧光基团在有限的时间段内可见，并且在某些实施方案中，其在长时间段内可见。在另一个实施方案中，生物分子不需要任何附接的外部标记基团以通过光谱方法检测分子，例如在拉曼光谱的情况下。

Claims (15)

1.一种制备用于分析单分子事件的载体的方法，所述单分子事件包括与特征电磁辐射的发射相关的单个生物分子的反应，所述方法包括以下步骤：
(a)提供载体，所述载体包括基底和载体表面上的多个样品点，其中所述样品点在空间上彼此分离，并且其中通过使所述样品点的尺寸适配待固定在其上的特定生物分子的大小，来使所述样品点适配于一个单个生物分子在一个样品点上的固定，以及
(b)在允许所述生物分子饱和固定到所述样品点上的条件下，将所述载体上的所述样品点与生物分子一起孵育，其中生物分子的量高于可用样品点的量。
2.权利要求1所述的方法，其中单个生物分子被固定在至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约99％和高达99.99％的样品点中的单个样品点上。
3.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述载体包含至少10个、至少100个、至少1,000个、至少104个、至少105个、至少106个、至少107个或至少108个样品点。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品点具有约5nm至约10nm的尺寸，特别是约6nm至约8nm，更特别是约7nm的尺寸，用于固定一个单个生物分子。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物分子是核酸聚合酶，特别是DNA或RNA聚合酶，和/或核酸分子，特别是DNA或RNA分子。
6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品点就其表面化学性质适配于一个单个生物分子在一个所述样品点上的固定。
7.权利要求6所述的方法，其中所述样品点的表面包含至少一种功能性锚定分子，所述锚定分子包含适于生物分子的直接或间接附着的部分。
8.权利要求7所述的方法，其中所述功能性锚定分子通过含硫基团例如硫醇基团附着至所述样品点的表面。
9.权利要求7或8所述的方法，其中所述样品点包含金属表面，特别是Au或Au/Pd表面。
10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中允许所述生物分子饱和固定到所述样品点的条件包括适配以下参数中的至少一个：
(i)生物分子的浓度；
(ii)孵育时间；
(iii)孵育温度；
(iv)(i)、(ii)和/或(iii)的任意组合。
11.一种载体，其包括基底和所述载体表面上的多个样品点，其中所述样品点在空间上彼此分离，并且其中生物分子被固定在样品点上，其中单个生物分子被固定在至少约50％的所述样品点中的单个样品点上，并且其中所述样品点的尺寸被适配于特定的被固定的生物分子的大小。
12.权利要求11所述的载体用于分析单分子事件，特别是用于单个核酸分子的序列分析的用途，所述单分子事件包括与特征电磁辐射的发射相关的单个生物分子的反应。
13.一种用于分析单分子事件的方法，所述单分子事件包括与特征电磁辐射的发射相关的单个生物分子的反应，所述方法包括：
(i)提供权利要求11的载体，其中单个生物分子被固定在至少约50％的所述样品点中的单个样品点上，以及
(ii)通过检测来自单个样品点的电磁辐射来分析与所述单个生物分子相关的事件。
14.权利要求13所述的方法，所述方法包括
(i)提供权利要求11的载体，其中短单链核酸分子，特别是DNA或RNA分子，优选长度在3-300个核苷酸范围内，被固定在单个样品点上，
(ii)加入包含互补核酸分子，特别是互补DNA或RNA分子的样品，以及
(iii)测量任何杂交事件。
15.一种用于分析单分子事件的设备，所述单分子事件包括与特征电磁辐射的发射相关的单个生物分子的反应，所述装置包括：
(i)权利要求11的载体，其中单个生物分子被固定在至少约50％的所述样品点中的单个样品点上，
(ii)用辐射照射所述载体上至少一个样品点的装置，和
(iii)用于通过检测来自单个样品点的电磁辐射来分析与所述单个生物分子相关的事件的装置。
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