CN120813606A

CN120813606A - 抗cldn6抗体和使用方法

Info

Publication number: CN120813606A
Application number: CN202480016331.6A
Authority: CN
Inventors: 李丹; 唐晓燕; 雷鸣; 邵婷
Original assignee: Guangzhou Baiji Shenzhou Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Guangzhou Baiji Shenzhou Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2023-03-06
Filing date: 2024-03-05
Publication date: 2025-10-17
Also published as: US20240301051A1

Abstract

本公开提供了结合于人类CLDN6的抗体和其抗原结合片段、包含所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物，以及所述抗体或其抗原结合片段或所述组合物用于治疗例如癌症的疾病的用途。

Description

抗CLDN6抗体和使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2023年3月6日提交的国际申请PCT/CN2023/079815的优先权，所述申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本文公开了结合于人类紧密连接蛋白6(CLDN6)的抗体或其抗原结合片段、结合于CLDN6和人类分化簇3(人类CD3)的多特异性抗体或其抗原结合片段以及产生其的方法。特定而言，本公开尤其提供了包含所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物以及治疗癌症的方法。

背景技术

本技术背景的以下描述仅作为理解本技术的帮助而提供，并且不被承认描述或构成本技术的现有技术。

紧密连接蛋白(CLDN)基因家族编码整合膜蛋白，所述蛋白是紧密连接(TJ)的重要结构和功能组分。CLDN显示四跨跨膜拓扑结构，具有两个胞外环并且N末端和C末端都位于细胞质中(Krause等人,Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes.2008)。有26种人类CLDN以组织特异性方式在上皮细胞和内皮细胞中表达(Günzel等人,PhysiolRev.2013)。通过以顺式(细胞内)和反式(细胞间)相互作用彼此相互作用，CLDN在调控细胞旁通透性和维持细胞极性方面发挥重要作用(Tsukita等人,Trends in BiochemicalSciences.2019)。另外，CLDN可作为在细胞连接处组装复合物的蛋白质支架，并且将信号传递至细胞内部以调节基因表达和细胞行为(Matter等人,Nat Rev Mol Cell Biol.2003；Singh等人,Pflugers Arch.2017)。

CLDN6于2001年首次被鉴定和表征(Turksen等人,Developmen talDynamics.2001)。CLDN6的表达受各种因素和机制动态调节(Du等人,Mol Med Rep.2021)。CLDN6是胚胎干细胞中最早表达的、决定上皮命运的蛋白质之一，并且是人类多能干细胞(hPSC)的细胞表面特异性标志物(Ben-David等人,Nat Commun.2013)。有趣的是，可在胎儿组织(包括胃、胰腺、肺和肾)中检测到CLDN6表达，但在相应成人组织样品中却检测不到(Reinhard等人,Science.2020；Abu azza等人,Am J Physiol Renal Physiol.2006；Hashizume等人,De v Dyn.2004)。值得注意的是，虽然在正常成人组织中转录沉默，但据报道，CLDN6在包括卵巢癌、子宫内膜癌、睾丸癌、肺癌、胃癌等的多种癌症类型中上调(Kohmoto等人,Gastric Cancer.2020；Kojim a等人,Cancers(Basel).2020；Micke等人,Int J Cancer.2014；Sul livan等人,Am J Surg Pathol.2012；Ushiku等人,Histopathology.2012)。癌组织与正常组织之间的CLDN6差异表达以及膜定位使其成为癌症免疫疗法的有吸引力的靶标。

靶向CLDN6的一个重要考虑因素为CLDN家族的许多成员具有很高的序列同一性，其中紧密连接蛋白9(CLDN9)与CLDN6具有最高的相似性。CLDN6和CLDN9胞外环的76个残基中仅3个不同。考虑到CLDN9在一些正常组织中高度表达，因此实现CLDN6相对于CLDN9的高选择性对于任何基于CLDN6靶向抗体的治疗剂至关重要。

发明内容

本公开提供了抗CLDN6抗体和其抗原结合片段。本公开涵盖以下实施方案。

在一些方面，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合于人类紧密连接蛋白6(CLDN6)的抗原结合域。

在一些实施方案中，其中所述抗原结合域不结合于其他紧密连接蛋白(CLDN)蛋白家族成员。

在一些实施方案中，其中所述抗原结合域不结合于人类紧密连接蛋白9(CLDN9)。

在一些实施方案中，其中相比于人类CLDN9，所述抗原结合域对人类CLDN6具有高选择性。

在一些实施方案中，其中特异性结合于人类CLDN6的所述抗原结合域包含：(a)重链可变区，其包含：(i)SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1，(ii)SEQ ID NO:2的HCDR2，(iii)SEQ ID NO:3的HCDR3，和轻链可变区，其包含：(iv)SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1，(v)SEQ ID NO:5的LCDR2，和(vi)SEQ ID NO:6的LCDR3；(b)重链可变区，其包含：(i)SEQ ID NO:1的HCDR1，(ii)SEQ ID NO:23的HCDR2，(iii)SEQ ID NO:3的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(iv)SEQ ID NO:4的LCDR1，(v)SEQ ID NO:5的LCDR2，和(vi)SEQ ID NO:6的LCDR3；(c)重链可变区，其包含(i)SEQ ID NO:1的HCDR1，(ii)SEQ ID NO:39的HCDR2，(iii)SEQ ID NO:3的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(iv)SEQ ID NO:40的LCDR1，(v)SEQ IDNO:5的LCDR2，和(vi)SEQ ID NO:6的LCDR3；或(d)重链可变区，其包含(i)SEQ ID NO:1的HCDR1，(ii)SEQ ID NO:45的HCDR2，(iii)SEQ ID NO:3的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(iv)SEQ ID NO:40的LCDR1，(v)SEQ ID NO:5的LCDR2，和(vi)SEQ ID NO:6的LCDR3。

在一些实施方案中，其中所述抗原结合域包含：(a)包含与SEQ ID NO:7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(b)包含与SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:12具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(c)包含与SEQ ID NO:41具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:42具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(d)包含与SEQ ID NO:43具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:44具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区；(e)包含与SEQ ID NO:46具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:47具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区；或(f)包含与SEQ ID NO:46具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含与SEQ ID NO:42具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些方面，其中SEQ ID NO:7、8、12、24、41、42、43、44、46或47的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸已被插入、缺失或取代。

在一些实施方案中，其中所述抗原结合域包含：(a)重链可变区具有包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列，并且轻链可变区具有包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(b)重链可变区域具有包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，并且轻链可变区具有包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(c)重链可变区具有包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，并且轻链可变区具有包含SEQID NO:42的氨基酸序列；(d)重链可变区具有包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，并且轻链可变区具有包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；(e)重链可变区具有包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，并且轻链可变区具有包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；或(f)重链可变区具有包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，并且轻链可变区具有包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如本文所公开的抗体或抗原结合片段为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类工程化抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。

在一些实施方案中，其中所述抗体为多特异性抗体。

在一些实施方案中，其中所述抗体为双特异性抗体。

在一些实施方案中，其中如本文所公开的抗体或抗原结合片段具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。

在一些实施方案中，其中如本文所公开的抗体或抗原结合片段具有减少的糖基化或无糖基化或为低岩藻糖基化的。

在一些实施方案中，其中如本文所公开的抗体或抗原结合片段包含增加的平分型GlcNac结构。

在一些实施方案中，其中如本文所公开的抗体或抗原结合片段的Fc域为IgG1。

在一些实施方案中，其中所述Fc域为具有降低的效应功能的IgG1。

在一些实施方案中，其中所述Fc域为IgG4。

在一些方面，本公开提供了包含如本文所公开的抗体或抗原结合片段的药物组合物。

在一些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载剂。

在一些实施方案中，所述药物组合物还包含组氨酸/组氨酸HCl、海藻糖二水合物和/或聚山梨醇酯20。

在一些方面，本公开提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的如本文所公开的抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，其中所述癌症为实体癌症。

在一些实施方案中，其中所述癌症选自胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、脑癌、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、睾丸癌、子宫内膜癌、膀胱癌、横纹肌样瘤和/或神经胶质瘤。

在一些实施方案中，其中所述抗体或抗原结合片段与一种或多种额外治疗剂组合施用。

在一些实施方案中，其中所述一种或多种治疗剂选自太平洋紫杉醇或太平洋紫杉醇剂、多西他赛(docetaxel)、卡铂、拓扑替康(topotecan)、顺铂、伊立替康(irinotecan)、多柔比星(doxorubicin)、来那度胺(lenalidomide)或5-氮杂胞苷。

在一些实施方案中，其中所述一种或多种治疗剂为太平洋紫杉醇剂、来那度胺或5-氮杂胞苷。

在一些实施方案中，其中所述治疗剂为抗PD1或抗PDL1抗体。

在一些实施方案中，其中所述抗PD1抗体为替雷利珠单抗(Tislelizumab)。

在一些方面，本公开提供了一种编码如本文所公开的抗体或抗原结合片段的分离的核酸。

在一些方面，本公开提供了一种包含核酸的载体。

在一些方面，本公开提供了一种包含核酸或载体的宿主细胞。

在一些方面，本公开提供了一种用于产生如本文所公开的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括培养如本文所公开的宿主细胞并且从培养物回收所述抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，如本文所公开的抗体或抗原结合片段用于治疗癌症的方法中。

在一些方面，本公开提供了如本文所公开的抗体或抗原结合片段用于制造用于治疗癌症的药剂的用途。

在一些实施方案中，其中如本文所公开的药物组合物用于治疗癌症的方法中。

一种抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合于人类CLDN6的抗原结合域。

所述抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合域不结合于其他CLDN家族成员。

所述抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合域不结合于人类CLDN9。

所述抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合域相对于人类CLDN9具有高选择性。

所述抗体或抗原结合片段，其中特异性结合于人类CLDN6的所述抗原结合域包含：

(i).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:1的HCDR1，(b)SEQ ID NO:2的HCDR2，(c)SEQ ID NO:3的HCDR3，和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:4的LCDR1，(e)SEQ ID NO:5的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；

(ii).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:1的HCDR1，(b)SEQ ID NO:23的HCDR2，(c)SEQ ID NO:3的HCDR3，和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:4的LCDR1，(e)SEQ ID NO:5的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；

(iii).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:1的HCDR1，(b)SEQ ID NO:39的HCDR2，(c)SEQ ID NO:3的HCDR3，和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:40的LCDR1，(e)SEQ IDNO:5的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；或

(iv).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:1的HCDR1，(b)SEQ ID NO:45的HCDR2，(c)SEQ ID NO:3的HCDR3，和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:40的LCDR1，(e)SEQ IDNO:5的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3。

本发明的抗体或抗原结合片段，其中抗原结合域包含：

(i).重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列；

(ii).重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:24至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:12至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列；

(iii).重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:41至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和轻链可变区(VL)，其包含与SEQID NO:42至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列；

(iv).重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:43至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:44至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列；

(v).重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:46至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:47至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列；或

(vi).重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:46至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:42至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。

本发明的抗体或抗原结合片段，其中SEQ ID NO:7、8、12、24、41、42、43、44、46或47内的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸已被插入、缺失或取代。

本发明的抗体或抗原结合片段，其中抗原结合域包含：

(i).包含SEQ ID NO:7的重链可变区(VH)，和包含SEQ ID NO:8的轻链可变区(VL)；

(ii).包含SEQ ID NO:24的重链可变区(VH)，和包含SEQ ID NO:12的轻链可变区(VL)；

(iii).包含SEQ ID NO:41的重链可变区(VH)，和包含SEQ ID NO:42的轻链可变区(VL)；

(iv).包含SEQ ID NO:43的重链可变区(VH)，和包含SEQ ID NO:44的轻链可变区(VL)；

(v).包含SEQ ID NO:46的重链可变区(VH)，和包含SEQ ID NO:47的轻链可变区(VL)；或

(vi).包含SEQ ID NO:46的重链可变区(VH)，和包含SEQ ID NO:42的轻链可变区(VL)。

本发明的抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类工程化抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。

本发明的抗体，其中所述抗体为多特异性抗体。

本发明的抗体，其中所述抗体为双特异性抗体。

本发明的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。

本发明的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有减少的糖基化或无糖基化或为低岩藻糖基化的。

本发明的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含增加的平分型GlcNac结构。

本发明的抗体或抗原结合片段，其中所述Fc域为IgG1。

本发明的抗体或抗原结合片段，其中所述Fc域为效应功能降低的IgG1。

本发明的抗体或抗原结合片段，其中所述Fc域为IgG4。

一种包含本发明的抗体或抗原结合片段的药物组合物，其还包含药学上可接受的载剂。

所述药物组合物，其还包含组氨酸/组氨酸HCl、海藻糖二水合物和聚山梨醇酯20。

一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的本发明的抗体或抗原结合片段。

所述方法，其中所述癌症为胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。

所述方法，其中所述抗体或抗原结合片段与另一种治疗剂组合施用。

所述方法，其中所述治疗剂为太平洋紫杉醇或太平洋紫杉醇剂、多西他赛、卡铂、拓扑替康、顺铂、伊立替康、多柔比星、来那度胺或5-氮杂胞苷。

所述方法，其中所述治疗剂为太平洋紫杉醇剂、来那度胺或5-氮杂胞苷。

所述方法，其中所述治疗剂为抗PD1或抗PDL1抗体。

所述方法，其中所述抗PD1抗体为替雷利珠单抗。

一种编码本发明的抗体或抗原结合片段的分离的核酸。

一种包含本发明的核酸的载体。

一种包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。

一种用于产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养宿主细胞并且从培养物回收所述抗体或抗原结合片段。

在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含一个或多个互补决定区(CDR)，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:45。

在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区，其包含一个或多个互补决定区(HCDR)，所述一个或多个HCDR包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:45组成的组的氨基酸序列，和/或(b)轻链可变区，其包含一个或多个互补决定区(LCDR)，所述一个或多个LCDR具有选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:40组成的组的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区，其包含三个互补决定区(HCDR)，所述一个或多个HCDR为包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1；包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HCDR2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3，和/或(b)轻链可变区，其包含三个互补决定区(LCDR)，所述一个或多个LCDR为包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:40的氨基酸序列的LCDR1；包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。

在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)重链可变区，其包含三个互补决定区(HCDR)，其为

包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；

包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；

包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；或

包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；

和/或(b)轻链可变区，其包含三个互补决定区(LCDR)，其为

包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；或

包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。

在另一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含：抗原结合域，其包含：重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:1的HCDR1，(b)SEQ ID NO:2的HCDR2，(c)SEQ ID NO:3的HCDR3，和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:4的LCDR1，(e)SEQ ID NO:5的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3。

在另一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含：抗原结合域，其包含：重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:1的HCDR1，(b)SEQ ID NO:23的HCDR2，(c)SEQ ID NO:3的HCDR3，和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:4的LCDR1，(e)SEQ ID NO:5的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3。

在另一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含：抗原结合域，其包含：重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:1的HCDR1，(b)SEQ ID NO:39的HCDR2，(c)SEQ ID NO:3的HCDR3，和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:40的LCDR1，(e)SEQ ID NO:5的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3。

在另一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含：抗原结合域，其包含：重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:1的HCDR1，(b)SEQ ID NO:45的HCDR2，(c)SEQ ID NO:3的HCDR3，和轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:40的LCDR1，(e)SEQ ID NO:5的LCDR2，和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3。

在一个实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段包含：(a)具有表1中所列的HCDR或VH的氨基酸序列的重链可变区；和/或(b)包含表1中所列的LCDR或VL的氨基酸序列的轻链可变区。

在另一个实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段包含：(a)氨基酸序列，其包含表1中所列的HCDR或VH的氨基酸序列中的一个、两个或三个氨基酸取代；和/或(b)包含氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含表1中所列的LCDR或VL的氨基酸中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代。在另一个实施方案中，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。

在一个实施方案中，本公开的抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一个更特定实施方案中，本公开的抗体包含野生型人类IgG1(也称为人类IgG1wt或huIgG1)或IgG2的Fc域。

在一个实施方案中，本公开的抗体以1×10^-6M至1×10^-10M的结合亲和力(K_D)结合于CLDN6。在另一个实施方案中，本公开的抗体以约1×10^-6M、约1×10^-7M、约1×10^-8M、约1×10^-9M或约1×10^-10M的结合亲和力(K_D)结合于CLDN6。

在另一个实施方案中，本公开的抗人类CLDN6抗体显示出对食蟹猕猴CLDN6的跨物种结合活性。

在一个实施方案中，本公开的抗体具有强Fc介导的效应功能。所述抗体介导针对表达CLDN6的靶细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

附图说明

图1A、图1B、图1C、图1D、图1E、图1F、图1G、图1H、图1I和图1J显示chBG87P工程化变体的细胞结合活性。图1A显示与抗CLDN6嵌合BG87P(chBG87P)相比，第1轮BG87P人源化回复突变变体(BG87P-z0、BG87P-Bz0、BG87P-Bz1、BG87P-Bz2、BG87P-Bz3、BG87P-Bz4、BG87P-Bz5、BG87P-Bz6、BG87P-Bz7和BG87P-Bz8)针对HEK293T/人类CLDN6的结合活性。图1B显示与抗CLDN6嵌合BG87P(chBG87P)相比，组合人源化变体(BG87P-21、BG87P-22、BG87P-23和BG87P-24)针对HEK293T/人类CLDN6的细胞结合活性。图1C显示与抗CLDN6嵌合BG87P(chBG87P)相比，组合人源化变体(BG87P-25、BG87P-26和BG87P-27)针对HEK293T/人类CLDN6的细胞结合活性。图1D显示与抗CLDN6嵌合BG87P(chBG87P)相比，组合人源化变体(BG87P-21、BG87P-22、BG87P-23和BG87P-24)针对癌细胞系PA-1的细胞结合活性。图1E显示与抗CLDN6嵌合BG87P(chBG87P)相比，组合人源化变体(BG87P-25、BG87P-26和BG87P-27)针对癌细胞系PA-1的细胞结合活性。图1F显示与抗CLDN6嵌合BG87P(chBG87P)和BG87P-Bz0相比，翻译后修饰(PTM)去除工程化变体(BG87P-m1、BG87P-m2、BG87P-m3、BG87P-m4、BG87P-m5、BG87P-m6、BG87P-m7和BG87P-m8)针对HEK293T/人类CLDN6的细胞结合活性。图1G显示与抗CLDN6嵌合BG87P(chBG87P)相比，BG87P溶解度工程化变体(BG87P-21、BG87P-34和BG87P-33)针对HEK293T/人类CLDN6的细胞结合活性。图1H显示与抗CLDN6嵌合BG87P(chBG87P)相比，溶解度工程化变体(BG87P-21、BG87P-34和BG87P-33)针对HEK293T-人类CLDN9的非特异性结合活性。图1I显示与抗CLDN6嵌合BG87P(chBG87P)相比，人源化变体(BG87P-21、BG87P-34和BG87P-33)针对CHOK1-食蟹猕猴CLDN6的交叉反应性。图1J显示与抗CLDN6嵌合BG87P(chBG87P)相比，人源化变体(BG87P-21、BG87P-34和BG87P-33)针对CHOK1-小鼠CLDN6的交叉反应性。

图2描绘Schroedinger的嵌合BG87P同源模型中所预测的疏水补丁。预计HCDR3的I97-Y98-Y100-V100a与HCDR2的Y49-W50一起形成暴露的疏水补丁(Y49是轻链可变区的FR2的最后一个残基，而W50是LCDR2的第一个残基)。

图3显示工程化后选定人源化BG87P变体(BG87-33、BG87-34、BG87P-21)的疏水性，如由HIC-HPLC所测定。

图4A和图4B显示Hut78细胞中嵌合sp34与人源化sp34之间结合活性的比较。图4A显示在Hut78细胞中通过熔体流动指数(MFI)测量的嵌合sp34(ch-sp34)与人源化sp34BG53P(BG53P)之间结合亲和力的比较。图4B显示嵌合sp34(ch-sp34)、人源化sp34 BG53P(BG53P)与BG56P之间结合亲和力的比较。

图5显示人源化sp34 BG56P(BG56P)与人源化sp34 scFv BG561p(BG561P)之间结合活性的比较。

图6A、图6B和图6C显示Hut78细胞中人源化sp34 scFv之间结合亲和力的比较。图6A显示Hut78细胞中人源化sp34 scFv BG561p(BG561P)与人源化scFv BG562P(BG562P)之间结合亲和力的比较。图6B显示Hut78细胞中人源化scFv BG562P(BG562P)与人源化scFvBG563P(BG563P)之间结合亲和力的比较。图6C显示Hut78细胞中人源化scFv BG563P(BG563P)与人源化scFv BG564P(BG564P)之间结合亲和力的比较。

图7显示CLDN6×CD3 BsAb BG143P的示意图。

图8A和图8B显示CLDN6×CD3 BsAb BG143P的靶标结合活性。图8A显示表达CD3的Jurkat细胞中BG143P的CD3结合活性。图8B显示表达CLDN6的PA-1细胞中BG143P的CLDN6结合活性。

图9A、图9B和图9C显示具有不同CLDN6表达的肿瘤细胞系中CLDN6×CD3 BsAbBG143P的中靶功能活性。图9A显示根据细胞裂解测定的BG143P在表达CLDN6的PA-1细胞、Hutu80细胞、AGS细胞和NCI-H1299细胞中的重定向T细胞细胞毒性。图9B显示BG143P在表达CLDN6的PA-1细胞、Hutu80细胞、AGS细胞和NCI-H1299细胞中的IFN-γ诱导活性。图9C显示BG143P在表达CLDN6的PA-1细胞、Hutu80细胞、AGS细胞和NCI-H1299细胞中的IL-2诱导活性。

图10A、图10B和图10C显示CLDN6×CD3 BsAb BG143P针对人类CLDN6和CLDN9的功能特异性。图10A显示NCI-H1299细胞中BG143P针对人类CLDN6(左图)和CLDN9(右图)的结合特异性。图10B显示NCI-H1299细胞中BG143P针对人类CLDN6(左图)和CLDN9(右图)的杀伤特异性(细胞裂解活性)。图10C显示NCI-H1299细胞中BG143P针对人类CLDN6(左图)和CLDN9(右图)的细胞因子(IFN-γ)诱导。

图11A和图11B显示CLDN6×CD3 BsAb BG143P在PBMC人源化小鼠的OV-90异种移植模型中的体内功效。图11A显示肿瘤体积随时间的变化。小鼠未经治疗(无PBMC)、用PBS治疗(PBSi.p QW)、用0.01mg/kg的BG143P治疗(BG143P-0.01mg/kg，i.p)、用0.03mg/kg的BG143P治疗(BG143P-0.01mg/kg，i.p)或用0.1mg/kg的BG143P治疗(BG143P-0.1mg/kg，i.p)。治疗每周一次并且在X轴上以三角形表示。图11B显示在PBMC注射后第13天、第21天和第27天未经治疗(无PBMC)、用PBS治疗(PBSi.p QW)、用0.01mg/kg的BG143P治疗(BG143P-0.01mg/kg，i.p)、用0.03mg/kg的BG143P治疗(BG143P-0.01mg/kg，i.p)或用0.1mg/kg的BG143P治疗(BG143P-0.1mg/kg，i.p)的小鼠的外周血中hCD45+细胞的百分比，指示人类PBMC重建。

图12A和图12B显示CLDN6×CD3 BsAb BG143P在hCD3EDG转基因小鼠的B16F10/人类CLDN6同基因模型中的体内功效。图12A显示肿瘤体积随时间的变化。小鼠用PBS治疗(PBSi.p QW)、用0.01mg/kg的BG143P治疗(BG143P-0.01mg/kg，i.p)、用0.03mg/kg的BG143P治疗(BG143P-0.01mg/kg，i.p)或用0.1mg/kg的BG143P治疗(BG143P-0.1mg/kg，i.p)。治疗每周一次并且在X轴上以三角形表示。图12B显示在接种后第11天至第27天过程内用PBS治疗(PBS i.p QW)、用0.01mg/kg的BG143P治疗(BG143P-0.01mg/kg，i.p)、用0.03mg/kg的BG143P治疗(BG143P-0.01mg/kg，i.p)或用0.1mg/kg的BG143P治疗(BG143P-0.1mg/kg，i.p)的小鼠的体重，作为小鼠对抗体的耐受性的指标。

定义

除非在此文件中别处具体定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语都具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，包括在所附权利要求中，词语的单数形式例如“一个”、“一种”和“所述”包括其相应多个指示物。

如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则术语“或”用于意指术语“和/或”并且可与其互换使用。此外如本文所用，术语“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关列出项的任何和所有可能的组合，以及当以替代方式解释时缺乏组合(“或”)。

如本文所用，“约”当与数值一起使用时意指所述数值以及所述数值的±10％。例如，“约10”应理解为“10”和“9-11”。

如本文所用，“A/B”形式或“A和/或B”形式的短语意指(A)、(B)或(A和B)；“A、B和C中的至少一者”形式的短语意指(A)、(B)、(C)、(A和B)、(A和C)、(B和C)或(A、B和C)。

如本文所用的术语“抗癌剂”是指任何可用于治疗细胞增殖性病症如癌症的药剂，包括但不限于细胞毒性剂、化学治疗剂、放射疗法和放射治疗剂、靶向抗癌剂和免疫治疗剂。

术语“紧密连接蛋白6”或“CLDN6”是指CLDN家族的成员。CLDN6的分子量为23kDa。CLDN6具有四个跨膜域和位于细胞质羧基端的PDZ结合区。人类CLDN6的氨基酸序列可在UniPort ID P56747中找到。示例性人类CLDN6序列为SEQ ID NO:87。

术语“紧密连接蛋白9”或“CLDN9”是指CLDN家族的另一成员。CLDN9的分子量为23kDa，并且其氨基酸序列可在UniPort ID O95484中找到。示例性人类CLDN9序列为SEQ IDNO:88。

如本文所用的术语“分化簇3”或“CD3”是指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类动物(例如人类)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD3，除非另有说明，否则包括例如CD3ε、CD3γ、CD3α和CD3β链。所述术语涵盖“全长”、未加工的CD3(例如，未加工或未修饰的CD3ε或CD3γ)以及由细胞中加工产生的任何形式的CD3。所述术语也涵盖天然存在的CD3变体，包括例如剪接变体或等位基因变体。CD3包括例如长度为207个氨基酸的人类CD3ε蛋白(NCBIRefSeq No.NP_000724)和长度为182个氨基酸的人类CD3γ蛋白(NCBIRefSeq No.NP_000064)。

如本文所用的术语“施用(administration)”、“施用(administring)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”在应用于动物、人类、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，意指外源药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人类、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。细胞的治疗涵盖试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。术语“施用”和“治疗”也意指例如通过试剂、诊断剂、结合化合物或通过另一细胞对细胞的体外和离体治疗。本文中的术语“受试者”包括任何生物体。非限制性实例包括动物。在任何实施方案中，所述动物为哺乳动物(例如灵长类动物、高等灵长类动物、人类、大鼠、小鼠、狗、猫、兔)。在任何实施方案中，所述哺乳动物为人类。在任何实施方案中，受试者为患有本文所述的病症或有患本文所述的病症的风险的患者。在任何实施方案中，治疗任何疾病或病症是指改善疾病或病症(即，减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一方面，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指减轻或改善至少一个物理参数，包括患者可能无法辨别的那些参数。在另一方面，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指在身体上(例如，可辨别症状的稳定化)、生理上(例如，物理参数的稳定化)或两者上调节疾病或病症。在另一方面，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指预防或延迟疾病或病症的发作或发展或进展。在一个方面，如本文所用的关于癌症的术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”或“预防(prevention)”是指排除或降低患癌症的风险。预防也可指一旦初始癌症得到治疗或治愈，就预防复发或继发性癌症。

术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指任何个别哺乳动物受试者，例如牛、犬、猫、马或人类。在特定实施方案中，受试者、个体或患者为人类。

如本文所用的术语“亲和力”是指抗体与抗原之间的相互作用的强度。在抗原内，抗体的可变区经由非共价力在多个位点处与抗原相互作用。一般而言，相互作用越多，亲和力越强。

如本文所用的术语“抗体”是指可非共价地、可逆地和以特异性方式来结合相应抗原的免疫球蛋白家族的多肽。例如，天然存在的IgG抗体为包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的四聚体。每个重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个域CH1、CH2和CH3构成。每个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL或Vκ)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个域CL构成。VH和VL区域可进一步细分为穿插有称为框架区(FR)的更保守区域的被称为互补决定区(CDR)的高变区。每个VH和VL由从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个框架区(FR)构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)的宿主组织或因子的结合。

术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体。抗体可为任何同型/类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。

术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有含有Fc区的重链的抗体。

在一些实施方案中，所述抗CLDN6抗体包含至少一个抗原结合位点、至少一个可变区。在一些实施方案中，所述抗CLDN6抗体包含本文所述的CLDN6抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗CLDN6抗体是分离的或重组的。

本文中的术语“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”意指基本上均质抗体的群体，即，除了可少量存在的可能天然存在的突变以外，群体中包含的抗体分子在氨基酸序列方面是同一的。相比之下，常规(多克隆)抗体制剂通常包括许多不同抗体，所述抗体在其通常对于不同表位具有特异性的可变域，特别是其互补决定区(CDR)中具有不同氨基酸序列。修饰语“单克隆”指示获自基本上均质抗体群体的抗体的特性，并且不应理解为需要通过任何特定方法来产生抗体。单克隆抗体(mAb)可通过本领域技术人员已知的方法获得。参见例如Kohler等人,Nature1975 256:495-497；美国专利第4,376,110号；Ausubel等人,CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992；Harlow等人,ANTIBODIES:A LABORATORYMANUAL,Cold spring Harbor Laboratory 1988；和Colligan等人,CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY 1993。本文公开的抗体可为包括IgG、IgM、IgD、IgE、IgA的任何免疫球蛋白类别，和例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的其任何亚类。产生单克隆抗体的杂交瘤可在体外或体内培养。高滴度单克隆抗体可在体内产生中获得，其中来自个别杂交瘤的细胞经腹膜内注射至小鼠，例如初始预敏化Balb/c小鼠中以便产生含有高浓度的所需抗体的腹水。同型IgM或IgG的单克隆抗体可使用本领域技术人员众所周知的柱色谱方法从此类腹水或从培养物上清液纯化。

一般而言，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，各对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。重链的羧基末端部分可限定主要负责效应功能的恒定区。典型地，人类轻链分为κ轻链和λ轻链。此外，人类重链典型地分为α、δ、ε、γ或μ，并且将抗体的同型分别定义为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链也包括约10个以上氨基酸的“D”区。

每个轻链/重链(VL/VH)对的可变区形成抗体结合位点。因此，一般而言，完整抗体具有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体外，两个结合位点的一级序列通常相同。

典型地，重链和轻链的可变域都包含三个高变区，也称为“互补决定区”或“CDR，”其位于相对保守的框架区(FR)之间。CDR通常通过框架区对准，从而能够与特定表位结合。一般而言，从N末端至C末端，轻链和重链可变域都包含FR-1(或FR1)、CDR-1(或CDR1)、FR-2(FR2)、CDR-2(CDR2)、FR-3(或FR3)、CDR-3(CDR3)和FR-4(或FR4)。CDR和框架区的位置可使用本领域中的各种众所周知的定义，例如Kabat、Chothia、AbM和IMGT来确定(参见例如Johnso n等人,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature,342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992)；Al-Lazika ni等人,J.Mol.Biol.,273:927-748(1997)ImMunoGenTics(IMGT)numbering(Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案))。抗原结合位点的定义也描述于以下文献中：Ruiz等人,Nucleic Acids Res.,28:219-221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268-9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.,203:121-153(1991)；和Rees等人,Sternberg M.J.E.(编),Protein Structure Predicti on,Oxford University Press,Oxford,141-172(1996)。例如，根据Kabat，重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基被编号为31-35(HCDR 1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基被编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia，VH中的CDR氨基酸被编号为26-32(HCD R1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基被编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia的CDR定义，CDR由人类VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)以及人类VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。根据IMGT，VH中的CDR氨基酸残基被编号为大约26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，并且VL中的CDR氨基酸残基被编号为大约27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(根据Kabat编号)。根据IMGT，可使用程序IMGT/DomainG ap Align来确定抗体的CDR区。

术语“高变区”意指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变域中的LCDR1、LCDR2和LCDR3以及重链可变域中的HCDR1、HCDR2和HCDR3)。参见Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(通过序列定义抗体的CDR区)；也参见Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917(通过结构定义抗体的CDR区)。术语“框架”或“FR”残基意指除了在本文中定义为CDR残基的高变区残基以外的那些可变域残基。

除非另外指示，否则“抗原结合片段”意指抗体的抗原结合片段，即，保留特异性结合至由全长抗体结合的抗原的能力的抗体片段，例如，保留一个或多个CDR区域的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双链抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如单链Fv(ScFv)；纳米抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所用，抗体“特异性结合”于靶蛋白意指与其他蛋白相比，抗体表现出优先结合于所述靶标，但此特异性不需要绝对的结合特异性。抗体“特异性结合”或“选择性结合”在描述抗原(例如蛋白质)与抗体或抗原结合抗体片段之间的相互作用的上下文中使用，是指决定抗原在蛋白质和其他生物制品的异质群体中，例如在生物样品、血液、血清、血浆或组织样品中的存在的结合反应。因此，在某些指定免疫测定条件下，当与背景水平相比时，抗体或其抗原结合片段特异性结合于特定抗原至少两倍并且不以显著量特异性结合于样品中存在的其他抗原。在一方面，在指定免疫测定条件下，当与背景水平相比时，抗体或其抗原结合片段特异性结合于特定抗原至少十(10)倍并且不以显著量特异性结合于样品中存在的其他抗原。

如本文所用，“抗原结合域”包含至少三个CDR并且特异性结合于表位。多特异性抗体(例如双特异性抗体)的“抗原结合域”包含特异性结合于第一表位的第一抗原结合域和特异性结合于第二表位的也包含至少三个CDR的第二抗原结合域。多特异性抗体可为双特异性、三特异性、四特异性等，其抗原结合域针对每个特定表位。多特异性抗体可为多价的(例如双特异性四价抗体)，其包含多个抗原结合域，例如特异性结合于第一表位的2、3、4个或更多个抗原结合域和特异性结合第二表位的2、3、4个或更多个抗原结合域。

本文中的术语“人类抗体”意指仅包含人类免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果在小鼠、小鼠细胞或源自小鼠细胞的杂交瘤中产生，则人类抗体可含有鼠类碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别意指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。

术语“人源化”或“人源化抗体”意指含有来自非人类(例如鼠类)抗体以及人类抗体的序列的抗体形式。此类抗体含有最少的源自非人类免疫球蛋白的序列。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个并且典型地两个可变域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人类免疫球蛋白的那些高变环，并且所有或基本上所有的FR区是人类免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体任选地也包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地为人类免疫球蛋白的恒定区。必要时，在抗体克隆名称中添加前缀“hum”、“hu”、“Hu”或“h”，以区分人源化抗体与亲代啮齿类动物抗体。啮齿类动物抗体的人源化形式通常包含与亲代啮齿类动物抗体相同的CDR序列，尽管可包括某些氨基酸取代以增加亲和力、增加人源化抗体的稳定性、去除翻译后修饰或出于其他原因。

术语“表位”是指抗体结合的抗原上的特定位点。抗体结合的抗原上的特定位点可例如通过晶体学来确定。也可使用例如羟基自由基蛋白质足迹和丙氨酸扫描诱变的方法，但分辨率可能较低。

术语“单特异性抗体”是指仅特异性结合于一种抗原的抗体。单特异性抗体可仅结合于抗原的一个表位或者可结合于抗原的两个或更多个表位。结合于抗原的两个或更多个表位的单特异性抗体为单特异性多表位抗体。

术语“多特异性抗体(multispecific antibody)”或“多特异性抗体(multi-specific antibody)”是指特异性结合于两种或更多种抗原的抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体等)。多特异性抗体的非限制性实例包括但不限于包含重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)的抗体，其中VH/VL单元具有多表位特异性；具有两个或更多个VL和VH域的抗体，其中每个VH/VL单元结合于不同表位；具有两个或更多个单一可变域的抗体，其中每个单一可变域结合于不同表位；双链抗体；三链抗体等，以及已共价或非共价连接的全长抗体和/或抗体片段。

术语“多表位抗体”和“具有多表位特异性的抗体”在本文中可互换使用，是指结合相同或不同抗原上的两个或更多个表位的抗体。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能会变化，但人类IgG重链Fc区通常定义为从Cys226位置处的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C端赖氨酸(根据Eu编号系统的残基447)可例如在抗体的生产或纯化过程中去除，或通过重组工程化编码抗体重链的核酸来去除。因此，完整抗体的组合物可包含所有Lys447残基被去除的抗体群体、无Lys447残基被去除的抗体群体、以及具有含和不含Lys447残基的抗体混合物的抗体群体。

“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的效应功能。示例性效应功能包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。此类效应功能通常需要Fc区与结合域(例如抗体可变域)组合，并且可使用本文所公开或本领域中另外已知的各种测定来评估。功能性Fc区可具有与野生型IgG基本相似的效应功能、与野生型IgG相比降低的效应功能、或与野生型IgG相比增强的效应功能。对于包含人类Fc区的抗体，典型地与野生型人类IgG1进行比较。

“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人类Fc区包括天然序列人类IgG1 Fc区(非A和A异型)；天然序列人类IgG2 Fc区；天然序列人类IgG3 Fc区；和天然序列人类IgG4 Fc区以及其天然存在的变体。

“变体Fc区”包含因至少一个氨基酸修饰(例如约一个至约十个氨基酸修饰，并且在一些实施方案中约一个至约五个氨基酸修饰)，优选地一个或多个氨基酸取代而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。本文的变体Fc区将优选与天然序列Fc区和/或亲代多肽的Fc区具有至少约80％同源性，优选与其具有至少约90％同源性，或优选与其具有至少约95％同源性。在一些实施方案中，与野生型IgG相比，变体Fc区可具有降低或增强的效应功能。对于包含人类Fc区的抗体，典型地与野生型人类IgG1进行比较。

如本文所用的术语“Fc组分”是指Fc区的铰链区、CH2域或CH3域。

术语“铰链区”通常定义为从IgG的约残基216至230(Eu编号)、从IgG的约残基226至243(Kabat编号)、或从IgG的约残基1至15(IMGT唯一编号)的延伸。

术语“抗体片段”是指除完整抗体之外的分子，其包含完整抗体的一部分，所述部分与完整抗体所结合的抗原结合。抗原结合片段的实例包括但不限于双链抗体、Fab、Fab'、F(ab')₂、F(ab)_c、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双链抗体(ds双链抗体)、三链抗体、四链抗体、单链抗体、scFv、scFv二聚体、单域抗体、单-域抗体和多价域抗体。典型地，结合片段与其所衍生的完整抗体竞争特异性结合。结合片段可通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶分离或化学分离来产生。

术语“Fab”是指由通过二硫键与单一重链的可变区和第一恒定区结合的单一轻链(可变区和恒定区两者)组成的抗体部分。

术语“Fab'”是指包括铰链区的一部分的Fab片段。

术语“F(ab')₂”是指Fab'的二聚体。F(ab')2抗体片段最初是作为其间具有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段产生。抗体片段的其他化学偶合也是已知的。

术语“Fv”是指具有完整抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由与单一重链可变区结合的单一轻链可变区组成。

术语“单链抗体”是指由接头连接的重链可变区和轻链可变区组成的抗体。在大多数情况下，但并非全部情况下，接头可为肽。接头的长度根据单链抗体的类型而变化。将两个或更多个单链抗体共价或非共价连接在一起会产生更高阶的形式。单链抗体和其高阶形式可包括但不限于单域抗体、多价域抗体、单链变体片段(scFv)、二价scFv(di-scFv)、三价scFv(tri-scFv)、四价scFv(tetra-scFv)、双链抗体、以及三链抗体和四链抗体。

术语“单链Fv抗体”和“scFv”在本文中可互换使用，是指由接头连接的重链可变区和轻链可变区组成的单链抗体。在大多数情况下，但并非全部情况下，接头可为肽。接头肽的长度优选为约5至30个氨基酸，或约10至25个氨基酸。典型地，接头可使可变域稳定，而不干扰正确折叠和活性结合位点的产生。在优选实施方案中，接头肽富含甘氨酸以及丝氨酸或苏氨酸。将两个或更多个scFv共价或非共价连接在一起产生更高阶形式di-scFv、tri-scFv、tetra-scFv等。高阶形式的每个scFv的抗原结合位点可靶向相同或不同的抗原或表位。

术语“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指由与Fc区连接的scFv组成的全长抗体。

“双链抗体”是由两个单链抗体组成的单链抗体的高阶变体。对于每个单链抗体，使用的接头过短而不允许在同一链上的两个域之间配对，迫使所述域与另一条链的互补域配对，从而产生两个抗原结合位点。在大多数情况下，但并非全部情况下，接头可为肽。抗原结合位点可靶向相同或不同的抗原或表位。可类似地产生三链抗体(组装形成三个抗原结合位点的三个单链抗体)、四链抗体(组装形成四个抗原结合位点的四个单链抗体)和更高阶变体。参见例如Holliger P.等人,Proc Natl Acad Sci USA.7月15日；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161。

“单域抗体”是指仅含有重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或更多个V_H域与肽接头共价接合以产生多价域抗体。多价域抗体的两个或更多个V_H域可靶向相同或不同的抗原或表位。

术语“重链抗体”是指由两条重链组成的抗体。重链抗体可为来自骆驼、美洲驼、羊驼、鲨鱼等的IgG样抗体，或为来自软骨鱼的IgNAR。参见例如Riechmann L.和MuyldermansS.,J Immunol Methods.12月10日；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,JBiotechnol.6月；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；或美国专利第6,005,079号。重链抗体最初源自骆驼科动物(骆驼、单峰驼和美洲驼)。尽管缺乏轻链，但骆驼化抗体具有真实的抗原结合库(Hamers-Casterman C.等人,Nature.6月3日；363(6428):446-8(1993)；Nguyen V.K.等人,“Heavy-chain antibodies in Camelidae；a case ofevolutionary innovation,”Immunogenetics.4月；54(1)：39-47(2002)；Nguyen V.K.等人,Immunology.5月；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变域(VHH域)代表由适应性免疫反应产生的已知最小抗原结合单元(Koch-Nolte F.等人,FASEB J.11月；21(13):3490-8.电子版2007年6月15日(2007))。

术语“相应人类种系序列”是指编码人类可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列，其与由人类种系免疫球蛋白可变区序列编码的所有其他已知可变区氨基酸序列相比与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高确定的氨基酸序列同一性。相应人类种系序列也可指与所有其他评价的可变区氨基酸序列相比与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性的人类可变区氨基酸序列或子序列。相应人类种系序列可为仅框架区、仅互补决定区、框架和互补决定区、可变区段(如上文所定义)、或包含可变区的序列或子序列的其他组合。序列同一性可使用本文所述的方法，例如使用BLAST、ALIGN或在本领域中已知的另一比对算法将两个序列比对来确定。相应人类种系核酸或氨基酸序列可与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。另外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也源自此类人类序列，例如人类种系序列、或人类种系序列的突变型式或包含源自人类框架序列分析的共同框架序列的抗体，例如在Knappik等人,J.Mol.Biol.296:57-86,2000中所述。

术语“平衡解离常数(KD，M)”是指解离速率常数(kd，时间-1)除以缔合速率常数(ka，时间-1，M-l)。平衡解离常数可使用本领域中任何已知的方法来测量。本公开的抗体通常将具有小于约10-7或10-8M的平衡解离常数，例如小于约10-9M或10-10M，在一些方面，小于约10-11M、10-12M或10-13M。

本文中的术语“癌症”或“肿瘤”具有如在本领域中理解的最广泛含义并且是指哺乳动物中典型地以不受调控细胞生长为特征的生理疾患。在本公开的上下文中，癌症不限于特定类型或位置。

在本公开的上下文中，当提及氨基酸序列时，术语“保守取代”是指用新氨基酸取代原始氨基酸，所述新氨基酸基本上不改变抗体或片段的化学、物理和/或功能特性，例如其对CLDN6的结合亲和力。特定而言，常见的氨基酸保守取代是本领域中众所周知的。

如本文所用的术语“杵入臼”技术是指在多肽相互作用的界面处，在体外或体内通过将空间突起(杵)引入一个多肽中并且将承窝或空腔(臼)引入另一多肽中，导引两个多肽配对在一起的氨基酸。例如，已将杵入臼引入抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CHI界面或VH/VL界面(参见例如US2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO98/050431，和Zhu等人,1997,Protein Science 6:781-788)。在一些实施方案中，杵入臼确保在多特异性抗体的制造过程中两条不同重链正确配对在一起。例如，在其Fc区中具有杵入臼氨基酸的多特异性抗体还可包含连接至每个Fc区的单一可变域，或者还包含与类似或不同轻链可变域配对的不同重链可变域。杵入臼技术也可用于VH或VL区，以确保正确配对。

如本文在“杵入臼”技术的上下文中使用的术语“杵”是指在多肽与另一多肽相互作用的界面处将突起(杵)引入多肽中的氨基酸变化。在一些实施方案中，其他多肽具有臼突变。

如本文在“杵入臼”的上下文中使用的术语“臼”是指在多肽与另一多肽相互作用的界面处将承窝或空腔(臼)引入多肽中的氨基酸变化。在一些实施方案中，其他多肽具有杵突变。

适合于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例为BLAST算法，其分别描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中。用于执行BLAST分析的软件可经由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。此算法涉及首先通过鉴别查询序列中的长度W的较短词语来鉴定高评分序列对(HSP)，所述词语在与数据库序列中的相同长度的词语进行比对时，匹配或满足一些正性值阈值分数T。T被称为邻近词语分数阈值。这些初始邻近词语命中充当启动搜寻以查找含有其的更长HSP的值。词语命中在沿着每个序列的两个方向上延伸直至可增加累积比对评分的程度。对于核苷酸序列，累积评分使用参数M(一对匹配残基的奖赏分数；总是>0)和N(不匹配残基的处罚分数；总是<0)来计算。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。在以下情况下，每个方向上的词语命中的延伸都停止：累积比对分数相比于其最大实现值下降了量X；由于一个或多个负分残基比对的累积，累积分数降至零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用默认字长(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及两个链的比较。对于氨基酸序列，BLAST程序默认使用字长3和期望值(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及两个链的比较。

BLAST算法也对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787,1993)。通过BLAST算法提供的相似性的一个量度为最小和概率(P(N))，其提供了偶然发生两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，则核酸被视为与参考序列类似。

两个氨基酸序列之间的同一性百分比也可使用E.Meyers和W.Miller,Comput.Appl.Biosci.4:11-17,(1988)的算法来确定，所述算法已并入ALIGN程序(版本2.0)中，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。此外，可使用Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:444-453,(1970)的算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，所述算法已并入GCG软件包中的GAP程序中，使用BLOSUM62矩阵或PAM250矩阵，并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，并且长度权重为1、2、3、4、5或6。

术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或经修饰主链残基或键联的核酸，其为合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且其以与参考核苷酸类似的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。

在核酸的上下文中，术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)区段之间的功能性关系。典型地，其是指转录调控序列与经转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列刺激或调节适当宿主细胞或其他表达系统中的编码序列的转录，则其可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接至经转录序列的启动子转录调控序列与经转录序列是物理上连续的，即，它们是顺式作用的。然而，一些转录调控序列，如增强子，不一定与其增强其转录的编码序列是物理上连续的或紧邻定位。

在一些方面，本公开提供了组合物，例如药学上可接受的组合物，其包括与至少一种药学上可接受的赋形剂一起配制的如本文所描述的抗CLDN6抗体。如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。赋形剂可适合于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、直肠、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。

本文公开的组合物可呈各种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如可注射和输注溶液)、分散液或悬浮液、脂质体和栓剂。适合的形式取决于预期施用模式和治疗应用。典型的适合的组合物呈可注射溶液或输注溶液的形式。一种适合的施用模式为胃肠外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)。在一些实施方案中，通过静脉内输注或注射施用抗体。在某些实施方案中，通过肌肉内或皮下注射施用抗体。

如本文所用的术语“治疗有效量”是指当向受试者施用以治疗疾病或者疾病或病症的临床症状中的至少一者时，足以实现疾病、病症或症状的此治疗的抗体的量。“治疗有效量”可随着抗体，疾病、病症，和/或疾病或病症的症状，疾病、病症的严重程度，和/或疾病或病症的症状，待治疗的受试者的年龄，和/或待治疗的受试者的体重而变化。在任何给定情况下，适当量对本领域技术人员是显而易见的或者可通过常规实验来确定。在组合疗法的情况下，“治疗有效量”是指用于有效治疗疾病、病症或疾患的组合物体的总量。

术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗本公开中所描述的治疗疾患或病症。此类施用涵盖这些治疗剂以基本上同时方式共施用。此类施用也涵盖在多个容器或在单独容器(例如胶囊、粉末和液体)中针对每个活性成分共施用。粉末和/或液体可在施用前重构或稀释至所需剂量。另外，此类施用也涵盖在大约相同时间或不同时间，以顺序方式使用每个类型的治疗剂。在任一情况中，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的疾患或病症中的有益作用。

如本文所用，短语“与……组合”意指抗CLDN6xCD3多特异性抗体与施用额外治疗剂同时、恰好在其之前或恰好在其之后向受试者施用。在某些实施方案中，抗CLDN6xCD3多特异性抗体作为与额外治疗剂的共制剂施用。

具体实施方式

本公开提供了抗体、抗原结合片段和抗CLDN6抗体。此外，本公开提供了具有所需药物动力学特征和其他所需属性，并且因此可用于降低癌症的可能性或用于治疗癌症的抗体。本公开还提供了包含抗体的药物组合物以及制备和使用此类药物组合物用于预防和治疗癌症和相关病症的方法。

抗CLDN6抗体

本公开提供了特异性结合CLDN6的抗体或其抗原结合片段。本公开的抗体或抗原结合片段包括但不限于如下所述产生的抗体或其抗原结合片段。

本公开提供了特异性结合CLDN6的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含具有表1中所列的氨基酸序列的VH域。本公开也提供了特异性结合CLDN6的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有表1中所列的任一HCDR的氨基酸序列的HCDR。在一个方面，本公开提供了特异性结合CLDN6的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含一个、两个、三个或更多个具有表1中所列的任何HCDR的氨基酸序列的HCDR(或者由其组成)。

本公开提供了特异性结合CLDN6的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有表1中所列的氨基酸序列的VL域。本公开也提供了特异性结合CLDN6的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有表1中所列的任一LCDR的氨基酸序列的LCDR。特定而言，本公开提供了特异性结合CLDN6的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含一个、两个、三个或更多个具有表1中所列的任何LCDR的氨基酸序列的LCDR(或者由其组成)。

本公开的其他抗体或其抗原结合片段包括已被改变，但在CDR区中与表1中公开的CDR区具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些方面，其包括氨基酸改变，其中与表1中所述的序列中描绘的CDR区相比，CDR区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已发生变化。

本公开的其他抗体包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已被改变；但与表1中所述的序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的那些抗体。在一些实施方案中，氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些方面，其包括氨基酸序列的改变，其中与表1中所述的序列中描绘的可变区相比，可变区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已发生改变，同时保留基本上相同的治疗活性。

本公开也提供了编码特异性结合CLDN6的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。可优化此类核酸序列以用于在哺乳动物细胞中表达。

本公开提供了结合人类CLDN6的表位的抗体和其抗原结合片段。在某些方面，所述抗体和抗原结合片段可结合CLDN6的相同表位。

本公开也提供了与表1中所述的抗CLDN6抗体结合相同表位的抗体和其抗原结合片段。因此，额外抗体和其抗原结合片段可基于其在结合测定中与其他抗体交叉竞争(例如，以统计显著方式竞争性抑制其他抗体的结合)的能力来鉴定。测试抗体抑制本公开的抗体和其抗原结合片段结合于CLDN6的能力证明测试抗体可与所述抗体或其抗原结合片段竞争结合于CLDN6。不受任一理论束缚，此类抗体可结合于CLDN6上与其所竞争的抗体或其抗原结合片段相同或相关(例如，结构上相似或空间上邻近)的表位。在某一方面，与本公开的抗体或其抗原结合片段结合CLDN6上相同表位的抗体为人类或人源化单克隆抗体。此类人类或人源化单克隆抗体可如本文所述进行制备和分离。

在一个实施方案中，如本文所公开的抗CLDN6抗体可为抗CLDN6多特异性抗体。抗体分子为多特异性抗体分子，例如，其包含多个抗原结合域，其中至少一个抗原结合域序列特异性结合作为第一表位的CLDN6，并且第二抗原结合域序列特异性结合第二表位。在一个实施方案中，多特异性抗体包含第三、第四或第五抗原结合域。在一个实施方案中，多特异性抗体为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。在每个实例中，多特异性抗体包含至少一个抗CLDN6抗原结合域和至少一个抗CD3抗原结合域。

在一个实施方案中，多特异性抗体为双特异性抗体。如本文所用，双特异性抗体仅特异性结合两种抗原。双特异性抗体包含特异性结合CLDN6的第一抗原结合域和特异性结合另一表位的第二抗原结合域。这包括双特异性抗体，其包含特异性结合作为第一表位的CLDN6的重链可变域和轻链可变域以及特异性结合作为第二表位的CD3的重链可变域。双特异性抗体包含抗原结合片段，所述抗原结合片段可为Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv(ScFv)或scFv。

先前实验(Coloma和Morrison,Nature Biotech.15:159-163(1997))描述了通过将编码单链抗丹酰抗体Fv(scFv)的DNA融合在IgG3抗丹酰抗体的C端之后(CH3-scFv)或铰链之后(铰链-scFv)来工程化的四价双特异性抗体。本公开提供了具有至少两个抗原结合域的多价抗体(例如四价抗体)，其可通过编码抗体的多肽链的核酸的重组表达来容易地产生。本文中的多价抗体包含特异性结合至少两个抗原的三至八个、但优选四个抗原结合域。

接头

还应理解，双特异性四价抗体的多肽链的域和/或区可被各种长度的接头区分开。在一些实施方案中，抗原结合域通过接头区彼此分开，与CL、CH1、铰链、CH2、CH3或整个Fc区分开。例如，VL1-CL-(接头)VH2-CH1、VH-接头-VL。此类接头区可包含随机分类的氨基酸或一组受限的氨基酸。此类接头区可为柔性的或刚性的(参见US2009/0155275)。

多特异性抗体通过以下来构建：在使用或不使用柔性接头的情况下，遗传融合两个单链Fv(scFv)或Fab片段(Mallender等人,J.Biol.Chem.1994 269:199-206；Mack等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.199592:7021-5；Zapata等人,Protein Eng.1995 8.1057-62)；经由二聚化装置如亮氨酸拉链(Kostelny等人,J.Immunol.1992148:1547-53；deKruifetal J.Biol.Chem.1996 271:7630-4)和Ig C/CH1域(Muller等人,FEBS Lett.422:259-64)；通过双链抗体(Holliger等人,(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA.1998 90:6444-8；Zhu等人,Bio/Technology(NY)199614:192-6)；Fab-scFv融合(Schoonjans等人,J.Immunol.2000 165:7050-7)；和微型抗体格式(Pack等人,Biochemistry 1992.31:1579-84；Pack等人,Bio/Technology 1993 11:1271-7)。

如本文所公开的双特异性四价抗体在其抗原结合域、CL域、CH 1域、铰链区、CH2域、CH3域或Fc区中的一者或多者之间包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，氨基酸甘氨酸和丝氨酸包含接头区内的氨基酸。在另一个实施方案中，接头可为GS、GGS、GSG、SGG、GGG、GGGS、SGGG、GGGGS、GGGGSGS、GGGGSGS、GGGGSGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、AKTTPKLE EGEFSEAR、AKTTPKLEEGEFSEARV、AKTTPKLGG、SAKTTPKLGG、AKTTPKLEEGEFSEARV、SAKTTP、SAKTTPKLGG、RADAA P、RADAAPTVS、RADAAAAGGPGS、RADAAAA(G4S)4、SAKTT P、SAKTTPKLGG、SAKTTPKLEEGEFSEARV、ADAAP、ADAAPT VSIFPP、TVAAP、TVAAPSVFIFPP、QPKAAP、QPKAAPSVTLFPP、AKTTPP、AKTTPPSVTPLAP、AKTTAP、AKTTAPSVYPLAP、AST KGP、ASTKGPSVFPLAP、GENKVEYAPALMALS、GPAKELTPLKE AKVS和GHEAAAVMQVQYPAS或其任何组合(参见WO2007/024715)。

二聚化特异性氨基酸

在一个实施方案中，多价抗体包含至少一种二聚化特异性氨基酸变化。二聚化特异性氨基酸变化导致“杵入臼(knobs into holes)”相互作用，并且增加正确多价抗体的组装。二聚化特异性氨基酸可位于CH1域或CL域或其组合内。用于将CH1域与其他CH1域配对(CH1-CH1)以及将CL域与其他CL域配对(CL-CL)的二聚化特异性氨基酸可至少在WO2014082179、WO2015181805家族和WO2017059551的公开内容中找到。二聚化特异性氨基酸也可位于Fc域内并且可与CH1或CL域内的二聚化特异性氨基酸组合。在一个实施方案中，本公开提供了一种包含至少一个二聚化特异性氨基酸对的双特异性抗体。

Fc区框架的进一步改变

在其他方面，通过用不同的氨基酸残基代替至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应功能。例如，一个或多个氨基酸可被不同的氨基酸残基代替，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲代抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应配体可为例如Fc受体或补体的C1组分。此方法描述于例如都由Winter等人提申的美国专利第5,624,821号和第5,648,260号中。

在另一方面，一个或多个氨基酸残基可被一个或多个不同的氨基酸残基代替，使得抗体具有改变的C1q结合和/或减少或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法描述于例如Idusogie等人的美国专利第6,194,551号中。

在另一方面，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。此方法描述于例如Bodmer等人的公开WO 94/29351中。在一个特定方面，本公开的抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸通过IgG1亚类和κ同型的一个或多个异型氨基酸残基代替。异型氨基酸残基也包括但不限于IgG1、IgG2和IgG3亚类的重链的恒定区以及κ同型的轻链的恒定区，如Jefferis等人,MAbs.1:332-338(2009)所描述。

在另一方面，通过修饰一个或多个氨基酸，Fc区经修饰以便增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或增加抗体对于Fcγ受体的亲和力的能力。此方法描述于例如Presta的公开WO00/42072中。此外，已绘制人类IgG1上FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已描述具有经改善结合的变体(参见Shields等人,J.Biol.Chem.276:6591-6604,2001)。

在另一方面，多特异性抗体的糖基化经修饰。例如，可制备非糖基化抗体(即，所述抗体缺乏糖基化或具有减少的糖基化)。例如，可改变糖基化以增加抗体对“抗原”的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除所述位点处的糖基化。此类非糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。此方法描述于例如Co等人的美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中。

另外或替代地，可制备具有改变类型的糖基化的抗体，例如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。此类改变的糖基化模式已被证明可提高抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可通过例如在具有改变的糖基化途径的宿主细胞中表达抗体来实现。具有经改变糖基化途径的细胞已在本领域中描述并且可用作在其中表达重组抗体的宿主细胞，由此产生具有经改变糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能破坏FUT8基因的细胞系，所述基因编码岩藻糖基转移酶，以使得此细胞系中表达的抗体呈现低岩藻糖基化。Presta的公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖附接至Asn(297)连接碳水化合物的能力降低，也导致在所述宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields等人,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的WO99/54342描述了经工程化以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如β(1,4)-N乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系以使得工程化细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，导致抗体的ADCC活性增加(也参见Umana等人,Nat.Biotech.17:176-180,1999)。

在另一方面，如果需要减少ADCC，则在许多先前报告中显示人类抗体亚类IgG4具有仅适度ADCC并且几乎无CDC效应功能(Moore G L等人,2010MAbs,2:181-189)。然而，发现天然IgG4在应力条件下，例如在酸性缓冲液中或在升高的温度下不太稳定(Angal,S.1993Mol Immunol,30:105-108；Dall'Acqua,W.等人,1998Biochemistry,37:9266-9273；Aalberse等人,2002Immunol,105:9-19)。减少ADCC可通过将抗体可操作地连接至用变化的组合进行工程化的IgG4 Fc来实现，所述变化减少FcγR结合或C1q结合活性，由此减少或消除ADCC和CDC效应功能。考虑到抗体作为生物药物的物理化学特性，IgG4的不太理想的固有特性之一为其两条重链在溶液中动态分离而形成半抗体，其导致经由称为“Fab臂交换”的过程在体内产生双特异性抗体(Van der Neut Kolfschoten M等人,2007Science,317:1554-157)。位置228(EU编号系统)处的丝氨酸至脯氨酸的突变似乎对IgG4重链分离有抑制作用(Angal,S.1993MolImmunol,30:105-108；Aalberse等人,2002Immunol,105:9-19)。据报道，铰链和γFc区域中的一些氨基酸残基对于抗体与Fcγ受体的相互作用有影响(Chappel S M等人,1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9036-9040；Mukherjee,J.等人,1995FASEB J,9:115-119；Armour,K.L.等人,1999Eur J Immunol,29:2613-2624；Clynes,R.A.等人,2000Nature Medicine,6:443-446；Arnold J.N.,2007Annu Rev immunol,25:21-50)。此外，一些在人类群体中很少出现的IgG4同工型也可引起不同物理化学特性(Brusco,A.等人,1998Eur JImmunogenet,25:349-55；Aalberse等人,2002Immunol,105:9-19)。为产生具有低ADCC和CDC但具有良好稳定性的多特异性抗体，有可能修饰人类IgG4的铰链和Fc区域并且引入许多变化。这些经修饰IgG4 Fc分子可在Li等人的美国专利第8,735,553号中找到，所述专利通过引用并入本文。

抗体产生

抗体和其抗原结合片段可通过本领域中已知的任何方法产生，包括但不限于抗体四聚体的重组表达、化学合成和酶消化，而全长单克隆抗体可通过例如杂交瘤或重组产生获得。重组表达可来自本领域中已知的任何适当宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。

本公开进一步提供了编码本文所述的抗体的多核苷酸，例如编码包含如本文所述的互补决定区的重链或轻链可变区或区段的多核苷酸。在一些方面，编码重链可变区的多核苷酸与选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:64组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些方面，编码轻链可变区的多核苷酸与选自由SEQ ID NO:10、57、61或65组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。

本公开的多核苷酸可编码抗CLDN6抗体的可变区序列。其也可编码抗体的可变区和恒定区。一些多核苷酸序列编码包含示例性抗CLDN6抗体的重链和轻链可变区的多肽。

本公开也提供了用于产生抗CLDN6抗体的表达载体和宿主细胞。表达载体的选择取决于有待在其中表达载体的预期宿主细胞。典型地，表达载体含有可操作地连接至编码抗CLDN6抗体链或抗原结合片段的多核苷酸的启动子和其他调控序列(例如增强子)。在一些方面，采用诱导型启动子来防止插入序列的表达，除非在诱导条件的控制下。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。转化生物体的培养物可在非诱导条件下扩增，而不会使群体偏向表达产物更容易被宿主细胞耐受的编码序列。除了启动子之外，对于抗CLDN6抗体或抗原结合片段的有效表达也可能需要或期望其他调控元件。这些元件典型地包括ATG起始密码子和相邻核糖体结合位点或其他序列。另外，表达效率可通过包含适合于使用中的细胞系统的增强子来增强(参见例如Scharf等人,ResultsProbl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。

用于携带和表达抗CLDN6抗体链的宿主细胞可为原核的或真核的。大肠杆菌是一种适用于克隆和表达本公开的多核苷酸的原核宿主。其他适合使用的微生物宿主包括杆菌，例如枯草杆菌(Bacillus subtilis)，和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，例如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)和各种假单胞菌属物种。在这些原核宿主中，也可制得表达载体，其典型地含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，将存在任何数目的各种众所周知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子典型地任选地与操纵子序列一起控制表达，并且具有用于启动和完成转录和翻译的核糖体结合位点序列等。其他微生物如酵母也可用于表达抗CLDN6抗体。也可使用昆虫细胞与杆状病毒载体的组合。在其他方面，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本公开的抗CLDN6抗体。例如，其可为表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系或携有外源表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常的必死细胞或正常或异常的永生动物或人类细胞。例如，已开发能够分泌完整免疫球蛋白的多种合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HEK293细胞、骨髓瘤细胞系、转化B细胞和杂交瘤。使用哺乳动物组织细胞培养物来表达多肽通常论述于例如Winnacker,FromGenes to Clones,VCH Publishers,NY,N.Y.,1987中。哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(参见例如Queen等人,Immunol.Rev.89:49-68,1986)，和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。适合的启动子可为组成性、细胞类型特异性、阶段特异性和/或可调节或可调控的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(例如人类即刻早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域中已知的启动子-增强子组合。

双特异性抗体的产生

工程化异二聚抗体Fc域的当前标准为杵入臼(KiH)设计，所述设计在核心CH3域界面处引入突变。所得异二聚体具有降低的CH3解链温度(69℃或更低)。相反，ZW异二聚Fc设计具有81.5℃的热稳定性，与野生型CH3域相当。

检测和诊断方法

本公开的抗体或抗原结合片段可用于多种应用，包括但不限于用于检测CLDN6的方法。在一个方面，抗体或抗原结合片段可用于检测生物样品中CLDN6的存在。如本文所用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些方面，生物样品包含细胞或组织。在其他方面，此类组织包括相对于其他组织以更高水平表达CLDN6的正常和/或癌性组织。

在一个方面，本公开提供了一种检测生物样品中CLDN6的存在的方法。在某些方面，所述方法包括在容许抗体结合于抗原和检测是否在抗体与抗原之间形成复合物的条件下使生物样品与抗CLDN6抗体接触。所述生物样品可包括但不限于尿液、组织、唾液或血液样品。

还包括一种诊断与CLDN6表达相关的病症的方法。在某些方面，所述方法包括使测试细胞与抗CLDN6抗体接触；通过检测抗CLDN6抗体与CLDN6多肽的结合来确定测试细胞表达的CLDN6的表达水平(定量或定性)；以及将测试细胞的表达水平与对照细胞(例如，与测试细胞具有相同组织来源的正常细胞或非CLDN6表达细胞)中的CLDN6表达水平进行比较，其中与对照细胞相比测试细胞中更高水平的CLDN6表达表明存在与CLDN6表达相关的病症。

治疗方法

本公开的抗体或抗原结合片段可用于多种应用，包括但不限于用于治疗CLDN6相关病症或疾病的方法。在一个方面，所述CLDN6相关病症或疾病为癌症。

在一个方面，本公开提供了一种治疗癌症的方法。在某些方面，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的抗CLDN6抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述癌症为实体肿瘤。所述癌症可包括但不限于胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、脑癌、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、睾丸癌、子宫内膜癌、膀胱癌、横纹肌样瘤和/或神经胶质瘤。

如本文所公开的抗体或抗原结合片段可通过任何适合的方式施用，包括胃肠外、肺内和鼻内施用，以及必要时对于局部治疗，可通过病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可通过任何适合的途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，其部分取决于施用是短暂的或长期的。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在不同时间点单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。

本公开的抗体或抗原结合片段可以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在本上下文中考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个别患者的临床状况、病症的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用时间安排，以及开业医师已知的其他因素。抗体不需要但任选地与目前用于预防或治疗所讨论的病症的一种或多种药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型以及上述其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径，或本文所述剂量的约1％至99％使用，或以根据经验/临床确定为适当的任何剂量和任何途径使用。

对于疾病的预防或治疗，本公开的抗体或抗原结合片段的适当剂量将取决于待治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、抗体是出于预防或治疗目的而施用、既往疗法、患者的临床病史和对抗体的反应以及主治医师的判断。抗体适合一次或在一系列治疗中向患者施用。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至100mg/kg的抗体可为向患者施用的初始候选剂量，无论通过例如一次或多次单独施用，或通过连续输注。一个典型的日剂量范围可为约1μg/kg至100mg/kg或更多，具体取决于上述因素。对于几天或更长时间的重复施用，根据病情，治疗通常会持续至出现所需的疾病症状遏制为止。此类剂量可间歇地施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约二至约二十、或例如约六剂抗体)。可施用初始较高的负荷剂量，接着施用一个或多个较低剂量。然而，其他剂量方案也可能有用。此疗法的进展易于通过常规技术和测定来监测。

组合疗法

在一个方面，本公开的抗CLDN6抗体可与其他治疗剂组合使用。可与本公开的抗CLDN6抗体一起使用的其他治疗剂包括但不限于：化学治疗剂(例如太平洋紫杉醇或太平洋紫杉醇剂；(例如)、多西他赛；卡铂；拓扑替康；顺铂；伊立替康、多柔比星、来那度胺、5-氮杂胞苷、异环磷酰胺、奥沙利铂(oxaliplatin)、培美曲塞二钠(pemetrexeddisodium)、环磷酰胺、依托泊苷(etoposide)、地西他滨(decitabine)、氟达拉滨(fludarabine)、长春新碱(vincristine)、苯达莫司汀(bendamustine)、苯丁酸氮芥、白消安(busulfan)、吉西他滨(gemcitabine)、美法仑(melphalan)、喷司他丁(pentostatin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、培美曲塞二钠)、酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂(例如厄洛替尼(erlotinib))、多激酶抑制剂(例如MGCD265、RGB-286638)、CD-20靶向剂(例如利妥昔单抗(rituximab)、奥法木单抗(ofatumumab)、RO5072759、LFB-R603)、CD52靶向剂(例如阿仑单抗(alemtuzumab))、泼尼松龙(prednisolone)、阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)、来那度胺、Bcl-2抑制剂(例如奥利默森钠(oblimersen sodium))、极光激酶抑制剂(例如MLN8237、TAK-901)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米(bortezomib))、CD-19靶向剂(例如MEDI-551、MOR208)、MEK抑制剂(例如ABT-348)、JAK-2抑制剂(例如INCB018424)、mTOR抑制剂(例如替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus))、BCR/ABL抑制剂(例如伊马替尼(imatinib))、ET-A受体拮抗剂(例如ZD4054)、TRAIL受体2(TR-2)激动剂(例如CS-1008)、EGEN-001、Polo样激酶1抑制剂(例如BI 672)。

本公开的抗CLDN6抗体可与其他治疗剂，例如免疫检查点抗体组合使用。此类免疫检查点抗体可包括抗PD1抗体。抗PD1抗体可包括但不限于替雷利珠单抗、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)或纳武单抗(Nivolumab)。替雷利珠单抗公开于US 8,735,553中。帕博利珠单抗(以前称为MK-3475)公开于US 8,354,509和US 8,900,587中，并且是一种人源化IgG4-K免疫球蛋白，其靶向PD1受体并且抑制PD1受体配体PD-L1和PD-L2的结合。帕博利珠单抗已被批准用于转移性黑素瘤和转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的适应症，并且正在进行用于治疗头颈鳞状细胞癌(HNSCC)和难治性霍奇金淋巴瘤(cHL)的临床研究。纳武单抗(如Bristol-Meyers Squibb所公开)是一种全人类IgG4-K单克隆抗体。纳武单抗(克隆5C4)公开于美国专利第US 8,008,449号和WO 2006/121168中。纳武单抗被批准用于治疗黑素瘤、肺癌、肾癌和霍奇金淋巴瘤。

与抗CLDN6抗体组合的其他免疫检查点抗体可包括抗TIGIT抗体。此类抗TIGIT抗体可包括但不限于如WO2019/129261中所公开的抗TIGIT抗体。

与抗CLDN6抗体组合的其他免疫检查点抗体可包括抗OX40抗体。此类抗OX40抗体可包括但不限于如WO2019/223733中所公开的抗OX40抗体。

与抗CLDN6抗体组合的其他免疫检查点抗体可包括抗TIM3抗体。此类抗TIM3抗体可包括但不限于如WO2018/036561中所公开的抗TIM3抗体。

药物组合物和制剂

还提供了组合物，包括药物制剂，其包含抗CLDN6抗体或其抗原结合片段，或包含编码抗CLDN6抗体或抗原结合片段的序列的多核苷酸。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种抗CLDN6抗体或抗原结合片段，或一种或多种包含编码一种或多种抗CLDN6抗体或抗原结合片段的序列的多核苷酸。这些组合物还可包含适合的载剂，例如本领域中众所周知的药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂。

如本文所描述的抗CLDN6抗体或抗原结合片段的药物制剂是通过将具有所需纯度的此类抗体或抗原结合片段与一种或多种任选的药学上可接受的载剂混合来制备(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980))，呈冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药学上可接受的载剂还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性-活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人类可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(BaxterInternational,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利第US 7,871,607号和第2006/0104968号中。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。

在一个实施方案中，所述制剂由L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐一水合物、海藻糖和聚山梨醇酯20构成。在另一个实施方案中，以无菌注射用水配制后，抗CLDN6抗体药物产品的浓度是由10mg/mL抗CLDN6抗体、20mM组氨酸/组氨酸HCl、240mM海藻糖二水合物和0.02％聚山梨醇酯20(pH约5.5)组成的等渗溶液。

示例性冻干抗体制剂描述于美国专利第6,267,958号中。水性抗体制剂包括美国专利第6,171,586号和WO2006/044908中所描述的那些，后述制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，所述基质呈成形物品例如膜或微囊形式。

用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可轻松实现，例如通过经无菌过滤膜过滤。

序列表

本公开的序列表提供于下表1至表3中。

表1.序列表(Kabat编号)

表2.序列表(Kabat编号)

表3.序列表(Kabat编号)

实施例

实施例1.小鼠抗CLDN6抗体的产生

为产生针对CLDN6的抗体，用人类CLDN6过表达细胞(L929/人类CLDN6，内部制备)对20-25只BALB/C、SJL品系的近亲交配小鼠群组进行免疫，每个群组都接受包含CLDN6抗原、剂量、注射途径、佐剂和免疫时机的独特组合的免疫策略。对4-5个群组中的总计5只动物进行免疫接种。在0与56天之间的不同时段内，动物接受免疫接种。为监测免疫反应，典型地在21-56天的2-4次免疫接种之后，滴定血清通过FACS来筛选。筛选血清中与CLDN6过表达细胞CHOK1/人类CLDN6结合的抗体。测量每只动物的CLDN6特异性抗体反应，并且选择具有足够滴度的抗CLDN6 Ig的动物进行4天的最终加强。

从如上所述免疫接种的小鼠中分离包括脾脏和淋巴结的淋巴器官。通过基于PEG的融合，通过与源自SP2/0的永生化小鼠骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤。使用补充有用于选择杂交瘤的HAT的常规1640培养基，将所得细胞涂铺于96孔细胞培养板中。

实施例2.抗CLDN6抗体的筛选和选择

如实施例1中所述来产生杂交瘤。在培养和生长培养基更换10-13天后，从个别孔收集杂交瘤培养物上清液并且筛选以鉴定具有分泌的CLDN6特异性抗体的孔。所有上清液最初都针对至少两种过表达细胞系进行筛选，包括CHOK1/人类CLDN6和CHOK1/人类CLDN9(内部制备)。通过FACS测量过表达细胞系上的抗体结合。对来自4个杂交瘤融合物中超过大约20000个培养孔的上清液进行CLDN6抗体筛选。简而言之，将100μL杂交瘤培养物上清液与表达CLDN6的癌细胞系(例如PA-1或CHOK1/人类CLDN6稳定细胞系)或对照细胞(例如亲代CHOK1)共温育30-60min，洗涤，并与缀合至APC的抗小鼠IgG Fc二次抗体一起温育。温育和洗涤后，通过流式细胞术来测量荧光。

将来自阳性孔的杂交瘤转移至含有新鲜培养基的24孔板中生长2-3天，然后再次通过流式细胞术进行筛选以确认抗体与食蟹猕猴CLDN6过表达细胞系和人类CLDN6阳性癌细胞系(PA-1)结合。通过流式细胞术测量抗体与食蟹猕猴CLDN6过表达细胞系和人类CLDN6阳性癌细胞系(PA-1)的结合。简而言之，将100μL杂交瘤培养物上清液与表达CLDN的癌细胞系(例如PA-1或CHOK1/人类CLDN6和CHOK1/人类CLDN9稳定细胞系)或对照细胞(例如亲代CHOK1)共温育30-60min，洗涤，并与缀合至APC的抗小鼠IgG Fc二次抗体一起温育。温育和洗涤后，通过流式细胞术来测量荧光。

实施例3.选定CLDN6 Ab分泌杂交瘤的亚克隆

将选定CLDN6抗体分泌杂交瘤亚克隆一次或两次以确保单克隆性。简而言之，将约80-100个活的杂交瘤细胞涂铺于6孔板中的3mL半固体甲基纤维素培养基(Stem CellTechnologies)中。7-10天后，将作为可见克隆的单细胞产生的杂交瘤集落挑至96孔板，并且在新鲜培养基中进一步培养2-4天。培养物上清液通过如前所述的ELISA和流式细胞术来筛选以确认人类和食蟹猕猴CLDN6结合。在体外培养稳定杂交瘤亚克隆以进行细胞冷冻保存、抗体产生以及抗体VH和VL基因克隆和测序。

实施例4.测定小鼠抗CLDN6抗体的CLDN6结合EC50值

将亚克隆后选定的分泌抗CLND6抗体的杂交瘤接种于含40ml补充有2％ FBS的新鲜1640培养基的T75烧瓶中用于抗体产生。培养7-10天后，收获杂交瘤上清液，用于使用蛋白A柱进行抗体纯化。然后使用流式细胞术表征小鼠抗CLDN6抗体与CLDN6阳性细胞的结合活性。克隆BG87P的EC50值呈现于表4-6中。数据表明克隆BG87P与人类CLDN6结合，但不与人类CLDN9结合。另外，BG87P与小鼠CLDN6和食蟹猕猴CLDN6结合。

表4.BG87P与表达人类CLDN6和人类CLDN9的CHOK1稳定细胞的结合活性

表5.BG87P与小鼠CLDN6和食蟹猕猴CLDN6的跨物种结合活性

表6.BG87P与内源性CLDN6表达的癌细胞系PA-1的结合活性

实施例5.抗体VH和VL基因克隆和测序

去除上清液后，通过在96孔圆底板中添加100mL RLT缓冲液来裂解亚克隆后选定的分泌CLDN6抗体的杂交瘤。随后将含有mRNA的裂解物转移至96孔深孔板中以进行mRNA分离、cDNA合成和通过标准测序技术(Sanger测序和下一代测序)的DNA测序。一般而言，细胞裂解物的总RNA是根据制造商说明书使用总RNA分离试剂盒制备的。根据制造商说明书，使用Super Script III第一链合成SuperMix通过mRNA逆转录来产生cDNA。BG87P的核酸和氨基酸序列示于图1中(SEQ ID NO:1-10)。

嵌合BG87P抗体(chBG87P)的生成

ChBG87P抗体是通过将小鼠BG87P的可变区(SEQ ID NO:7和8)亚克隆至内部开发的表达载体中而产生的，所述表达载体含有人类野生型IgG1和κ链的恒定区。通过将上述两种构建体共转染至HEK293T细胞中来表达抗体，并且使用蛋白A柱(目录号：17-5438-02，GELife)进行纯化。将纯化的嵌合抗体在PBS中浓缩至0.5-10mg/ml并且以等分试样储存于-80℃冷冻器中。

实施例6.抗CLDN6嵌合BG87P抗体(chBG87P)的人源化

[人源化方法

对于chBG87P的人源化，通过相对于IMGT中的人类免疫球蛋白基因数据库进行序列比较，针对与chBG87P可变区的蛋白序列共有高度同源性的序列来搜寻人类种系IgG基因。以高频率存在于人类抗体谱系中并且与chBG87P高度同源的人类IGHV和IGKV基因被选择为用于人源化的模板。

人源化变体的设计

人源化是通过CDR移植随后并入关键回复突变来执行。通过使用内部开发的表达载体，将人源化抗体工程化为人类IgG1野生型格式。在最初的第一轮人源化中，通过3D结构分析指导从鼠类可变区至人类框架区氨基酸残基的突变，并且在第一轮人源化设计中保留了对维持CDR规范结构具有结构重要性的鼠类框架残基。选择重链上的五个回复突变和轻链上的三个突变并且进行单点突变以探索关键回复突变：BG87P-Bz1(VH SEQ ID NO:15和VL：SEQ ID NO:14)、BG87P-Bz2(VH SEQ ID NO:16和VL：SEQ ID NO:14)、BG87P-Bz3(VH SEQID NO:17和VL：SEQ ID NO:14)、BG87P-Bz4(VH SEQ ID NO:18和VL：SEQ ID NO:14)、BG87P-Bz5(VH SEQ ID NO:19和VL：SEQ ID NO:14)、BG87P-Bz6(VH SEQ ID NO:13和VL：SEQ IDNO:20)、BG87P-Bz7(VH SEQ ID NO:13和VL：SEQ ID NO:20)和BG87P-Bz8(VH SEQ ID NO:13和VL SEQ ID NO:22)。BG87P-Bz0(VH：SEQ ID NO:13和VL：SEQ ID NO:14)是并有所有理论回复突变的变体，并且BG87P-Bz0的结合能力应与亲本chBG87P相当。结合数据的比较揭示了哪些回复突变显著影响结合。特定而言，将chBG87P(SEQ ID NO:4至6)的LCDR移植至具有A43S、L78V和Y87F鼠类框架残基的人类种系可变基因IGKV1-5和01-IGKJ4*01的框架中(结果为SEQ ID NO:14)。将chBG87P(SEQ ID NO:1至3)的HCDR移植至人类种系可变基因IGHV1-3和01-JH6c的框架中，保留V2I、T28S、I69L、R71V和Y91F鼠类框架残基(结果为SEQ ID NO:13)；BG87P-z0(VH:SEQ ID NO:11和VL:SEQ ID NO:12)是具有上述HCDR和LCDR移植，但不具有来自鼠类VH和VL框架的任何回复突变的所得人源化变体。

chBG87P和人源化抗体的表达和纯化

所有第一轮BG87P人源化变体(BG87P-z0、BG87P-Bz0、BG87P-Bz1、BG87P-Bz2、BG87P-Bz3、BG87P-Bz4、BG87P-Bz5、BG87P-Bz6、BG87P-Bz7和BG87P-Bz8)都使用内部开发的表达载体构建为人源化全长抗体，所述表达载体分别含有人类野生型IgG1和κ链的恒定区，具有易于适应的亚克隆位点。通过将上述两种构建体共转染至HEK293T细胞中来表达所有人源化变体，并且使用蛋白A柱(目录号：17-5438-02，GE Life Sciences)进行纯化。将纯化的抗体在PBS中浓缩至0.5-10mg/ml并且以等分试样储存于-80℃冷冻器中。

第1轮人源化BG87P变体(hBG87P)和PTM去除变体的细胞结合活性测定

为进行亲和力测定，使用CLDN6过表达HEK293T细胞和表达高水平人类CLDN6的癌细胞系PA-1来评价BG87P相关工程化变体的结合活性。将活细胞接种于96孔板中，并且与chBG87P和其工程化变体的一系列稀释液一起温育。使用山羊抗人类IgG作为二级抗体来检测抗体与细胞表面的结合。通过使用GraphPad Prism将剂量反应数据拟合至四参数逻辑模型，确定与表达CLDN6的细胞系剂量依赖性结合的EC50值。将第1轮BG87P人源化变体针对HEK293T/人类CLDN6的细胞结合活性与chBG87P进行比较并且显示于图1A中。将第1轮人源化变体的细胞结合亲和力(EC50)和Emax(MFI)相对于chBG87P归一化以用于直接比较和排名(表7)。

从chBG87P抗体和BG87P-Bz0开始，VH和VL的CDR区域都进行了一些额外氨基酸变化，以进一步改进用于人类的治疗剂的生物物理特性。考虑因素包括去除翻译后修饰(PTM)、改进热稳定性(Tm)，同时保持结合活性，所得变体为BG87P-m1(VH SEQ ID NO:31和VL SEQ ID NO:8)、BG87P-m2(VH SEQ ID NO:32和VL SEQ ID NO:8)、BG87P-m3(VH SEQ IDNO:33和VL SEQ ID NO:8)、和BG87P-m4(VH SEQ ID NO:34和VL SEQ ID NO:8)和BG87P-m5(VH SEQ ID NO:35和VL SEQ ID NO:14)、BG87P-m6(VH SEQ ID NO:36和VL SEQ ID NO14)、BG87P-m7(VH SEQ ID NO:37和VL SEQ ID NO:14)、和BG87P-m8(VH SEQ ID NO:38和VLSEQ ID NO:14)。将chBG87P和BG87P-Bz0相关PTM去除变体针对HEK293T/人类CLDN6的细胞结合活性分别与chBG87P和BG87-Bz0进行比较(图1F)。将细胞结合亲和力(EC50)和Emax(MFI)相对于chBG87P归一化以用于直接比较和排名(表7)。结果表明，除H33A突变导致BG87P-m4和BG87P-m8之外，潜在有害残基的其他替换保持了相应亲本残基的结合能力。

表7.人源化和PTM去除变体针对CLDN6过表达HEK293T的细胞结合活性的概述

表8.去除PTM的第2轮人源化变体针对癌细胞系PA-1的细胞结合活性

与PTM去除位点组合测定第2轮关键回复突变的细胞结合活性

综合分析第1轮人源化细胞结合数据的EC50和Emax(表7)后，四个关键回复突变位点VH:V2I、VH:T28S、VH:I69L、VH:Y91F被鉴定并且与PTM去除位点组合进行第2轮验证和最终人源化候选物的确定。PTM去除突变VH:V65G(所述位点在人类种系中G的流行度更高(G62％；V<1％)，表明对抗体框架稳定性具有潜在益处)涉及变体BG87P-m3，显示与图1F和表7中被纳入第2轮组合以进一步验证的chBG87P相比，Emax和EC50有所改善。所得第2轮人源化变体BG87P-21、BG87P-22、BG87P-23、BG87P-24、BG87P-25、BG87P-26和BG87P-27的VH和VL序列在表1中给出。

在鉴定人源化组合变体的细胞结合活性后，如在图1B和图1C中以HEK293T/人类CLDN6细胞和在图1D和图1E中以PA-1细胞所示，选择BG87P-21作为进一步考虑的最佳人源化候选物(VH和VL氨基酸序列分别为SEQ ID NO:24和12)。BG87P-21包括关键回复突变位点VH:T28S和PTM位点VH:V65G，其揭示了与chBG87P相比相当的细胞结合亲和力。HEK293T/人类CLDN6中的Emax降低了22％，并且PA-1中的Emax降低了40％(表7和表8)。

人源化抗CLDN6抗体的可开发性评价

对生物物理特性进行了分析，以鉴定最佳人源化抗CLDN6抗体。数据表明，BG87P-21显示出中度至高度的疏水性风险，随后为AC-SINS、B22KD和CIC读数所展现的PBS缓冲液中自相互作用的风险。(表9-表11)。

表9.BG87P-21和chBG87P的生物物理特性分析

为进行疏水性评估，用流动相A溶液(1.5M硫酸铵、50mM磷酸钠，pH 7.0)稀释50μg1mg/ml样品，以在分析前获得约1M的最终硫酸铵浓度。MABPac HIC-10柱以流动相A和流动相B溶液(50mM磷酸钠，pH 7.0)的线性梯度使用，历时29分钟，流速为0.5ml/min。在A280吸光度下监测峰保留时间。如表9中所指示，chBG87P和BG87P-21都显示出更高的疏水性性能，并且以IgG格式超过内部标准21.1min。

对于热稳定性评估，BG87P相关工程化变体的热稳定性是通过热去折叠转变中点Tm(℃)来描述，所述Tm是通过外在荧光测量。Tm是使用Applied Biosystems的QuantStudioTM 6Flex系统测定。将20μL的1mg/ml样品与20μL的40XSYPRO橙混合。将板以0.9℃/min的速率从25℃至95℃扫描。使用QuantStudioTM 6Flex系统分析软件的原始数据的一阶导数来指定Tm。结果概述于表9中，其指示chBG87P和人源化变体BG87P-21都显示出良好的热稳定性。

为确定BG87P相关工程化变体的聚集倾向，使用Uncle系统(Unchained Labs)测量静态光散射强度。在测量期间，将约8.8μL 1mg/ml的蛋白质样品装入比色皿中；样品在25℃下保温120秒，并且然后以0.3℃/min的速率升温至95℃。使用266nm激光波长以90°角收集散射数据。Tagg(聚集温度)是通过Uncle分析软件进行分析和计算。结果概述于表9中。chBG87P和人源化变体都显示出可接受的Tagg。

CIC是一种鉴定溶解度不佳或有非特异性结合倾向的候选抗体的技术。来自人类血清的IgG或其他配体与NHS活化的色谱树脂进行化学偶合。使用HPLC测试此树脂上蛋白质的保留时间，以评价蛋白质溶解度。与人类血清中的IgG进行柱偶合后，用流动相(PBS)将抗体样品和样品缓冲液稀释至0.1mg/mL。将稀释的样品和缓冲液转移至HPLC小瓶中进行LC-MS分析。表9中概述的结果指示chBG87P和BG87P-21都显示出可接受的与人类IgG的非特异性相互作用。

B22和KD测试方法的一般描述和预期用途。所述方法用于研究弱蛋白质-蛋白质相互作用，以预测聚集趋势、揭示制剂成分对分子间相互作用的影响和支持制剂缓冲液选择。将抗体与缓冲液交换样品稀释至1mg/mL，并以14000rpm离心30min，然后检查Tm、Tagg和DLS。将样品负载至Uni上。9μL/孔。每个样品设定一个双重复孔。遵循Uncle的指导设定设备参数并且运行实验。在此实验中，我们使用B22和Kd模式。运行信息：温度(℃)：25。温育时间(秒)：120。采集次数：4。采集时间(秒)：5。衰减器控制：自动。激光。控制：自动运行。对于kd：扩散相互作用参数，如果蛋白质的相互作用随着浓度的增加而增加(相互吸引)，则蛋白质的行为好像其变大并且扩散系数(KD)减小(负斜率)。对于B22：第二维里系数(virialcoefficient)，如果蛋白质相互作用随着浓度的增加而增加(相互吸引)，则蛋白质的行为好像其更大并且1/R90减小(负斜率)。数据表明，在PBS中，chBG87P和人源化变体都相互吸引，在此条件下倾向于聚集(表10)。

AC-SINS是获得样品自相互作用以预测聚集可能性的测定。它是基于将稀释溶液中的抗体浓缩在预涂有多克隆捕获物的金纳米粒子周围。固定化抗体之间的相互作用导致粒子间距离减小和等离子体波长(最大吸光度波长)增加，其可易于通过光学手段测量。用提供的缓冲液将抗体分别稀释至0.05mg/mL。金纳米粒子制备后，使用9:1体积比将金纳米粒子溶液与涂布溶液混合。室温温育1小时后，使用硫醇化PEG(最终浓度0.1uM)封闭AuNP中的空位点。然后在室温下再温育1小时。然后将颗粒溶液以15000rpm离心6分钟。丢弃上层溶液。使用起始体积的1/10的储存缓冲液重新溶解粒子。将10μL浓缩涂布粒子与100μL测试抗体溶液一起在室温下在聚丙烯板中温育2小时，然后将90μL所得溶液转移至聚苯乙烯UV透明板中。数据表明chBG87P和BG87P-21都显示出次优的自相互作用倾向(表9)。

表10.第2轮人源化变体和chBG87P的自相互作用风险测定

样品	kD(mL/g)	B₂₂(mol*mL/g²)	k D拟合优度	B₂₂拟合优度
					BG87P-21	-17.2	-1.1E-05	0.97	0.96
BG87P-22	-22.7	-2.5E-05	0.96	0.97
					BG87P-24	-21.1	-1.7E-05	0.95	0.94
BG87P-26	-17.5	-2.0E-05	0.95	0.96
					chBG87P	-18.5	2.1E-05	0.98	0.97

表11.四种人源化抗体都显示低于嵌合抗体的疏水性，但疏水性风险也相对较高

样品名称	保留时间(min)
		BG87P-21	21.48
BG87P-22	21.51
		BG87P-24	21.75
BG87P-26	21.83
		chBG87P	24.80

疏水补丁使得chBG87P的HIC保留时间超过25分钟，并且人源化BG87P-21的HIC保留时间为21.9分钟，两者都高于可接受阈值，即IgG格式的21.1分钟。根本原因是HCDR3中的疏水补丁，特别是轻链的FR2(框架区2)和LCDR2边缘处的I97-Y98-Y100-V100a部分以及Y49-W50(主要是W50)(图2A)。Schrodinger对BG87P聚集的自动抗体管线分析也显示较高聚集风险(表12)。

表12.聚集的自动抗体管线分析

实施例7.人源化抗CLDN6抗体的溶解度工程化

BG87P-21的溶解度工程化的整体策略

在前述描述中，chBG87P已经工程化为人源化抗体，并且我们已将BG87P-21鉴定为最终的最佳克隆。然而，由chBG87P的HCDR3驱动的疏水补丁的潜在可开发性风险尚未解决(图2)。考虑到chBG87P显示出有前景的结合活性和优异的CLDN6选择性(图1A、图1B、图1C、图1D、图1E、图1F、图1G和图1H)，已完成BG87P-21的额外工程化以去除疏水补丁，从而实现最佳可制造性并且减轻潜在的ADA风险。

使用两种主要策略来解决BG87P-21的溶解度问题：单点突变和框架交换。

表13.BG87P-21的溶解度工程化的整体概述

大量单点突变的设计是基于两个基本原理：一个基本原理是用更亲水的氨基酸取代疏水性氨基酸；并且另一基本原理是将人类抗体库中相同Kabat位置的罕见氨基酸突变为更常见的氨基酸。进行了第1轮筛选中的57个变体和第2轮筛选中的104个变体，发现七个位置可被其他更亲水的氨基酸取代，其结合亲和力与亲代BG87P-21相当，并且亲水性略有改善(表14)。将第1轮和第2轮筛选中的选定最佳突变组合起来以产生56个变体用于进一步验证。选择组合变体BG87P-31和BG87P-32(VH和VL氨基酸序列分别为SEQ ID NO:46和42)作为最佳候选物，其与BG87P-21具有相当的结合亲和力，并且HIC保留有所改善，BG87P-31为17.4分钟并且BG87P-32为18.49分钟，两者都优于亲代BG87P-21 22.3分钟(表14和图3)。

表14.chBG87P溶解度工程化变体的表征

然而，尽管在溶解度工程化的单点突变方法中减轻了疏水性，但通过AC-SICNS测定的自缔合风险仍显示为中等至高。此问题未解决的原因为疏水性风险主要反映在抗体表面上实际表现出的疏水补丁的量，而引发自相互作用的原因也涉及等电点问题、均匀电荷分布以及甚至一些未知的特异性相互作用。(Doi.org/10.1021/mp200566k)。因此，仅通过将疏水性残基替换为亲水性残基并不能减轻上述原因引发的自相互作用风险。此外，我们发现亲代chBG87P具有较高的HIC保留时间25分钟，同时表现出较低的自相互作用倾向，在PBS缓冲液中AC-SINS值约为12.85nm(表14)。另一个发现的现象是，chBG87P的计算净电荷比BG87P-21少得多，为2.9对8.8。因此，我们假定框架或净电荷可能对自缔合效应有影响。

我们测试了IGHV3-23和IGKV1-39的额外框架，基于新配对框架的回复突变和BG87P-21的溶解度工程化上的选定最佳点突变都被纳入(表13)。最终的最佳候选物BG87P-34在所有常规生物物理特性中都未显示危险信号(表14；VH和VL氨基酸序列分别为SEQ IDNO:43和44)。

此外，在框架交换为IGHV3-23和IGKV1-39后，原始人源化程序中丢失的BG87P-21的Emax已恢复(图1G)。这两种人源化程序中使用的关键回复突变鉴定原理是相同的，因此排除了在Emax责任的上一轮人源化中遗漏任何回复突变的可能性。对于通过框架交换来恢复细胞结合中的Emax的一种解释为，不同配对框架的VH-VL角度可能不同，而特定VH-VL角度可能有助于维持细胞结合的Emax。最终的先导克隆BG87P-34在不同物种中显示出良好的交叉反应性(图1I和图1J)。使用HEK293T/人类CLDN9进行与人类CLDN9的非特异性结合，数据表明相对于CLDN9，BG87P-34对人类CLDN6具有良好的选择性(图1H)。

实施例8.抗人类CD3抗体sp34的人源化和scFv工程化

广泛报道的小鼠克隆sp34(Blumberg 1990PNAS 87(18):7220–24)由于其食蟹猕猴CD3交叉反应性而为开发基于抗CD3的治疗剂的最佳克隆。对于sp34的人源化，通过对IMGT(http://www.imgt.or g/IMGT_vquest/share/textes/index.html)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)网站中的人类免疫球蛋白基因数据库进行blast分析来搜寻人类种系IgG基因，以寻找与sp34可变区的蛋白质序列(SEQ ID NO:48-57)具有高度同源性的序列。选择在人类抗体库中以高频率存在(Glanville 2009PNAS106:20216-20221)并且与sp34同源的人类IGVH和IGVK基因作为人源化的模板。

通过CDR移植进行人源化(Methods in Molecular Biology,第248卷:AntibodyEngineering,Methods and Protocols,Humana Press)，并且使用内部开发的表达载体将人源化抗体(hu-sp34)工程化为人类IgG1格式。在最初一轮人源化中，框架区中从鼠类至人类氨基酸残基的突变是由模拟的3D结构引导，并且对于维持CDR规范结构具有结构重要性的鼠类框架残基被保留在第1版人源化抗体sp34中。特定而言，将sp34 VL(SEQ ID NO:51～53)的CDR移植至人类种系可变基因IGVκ3-15的框架中，并且保留若干鼠类框架残基(Q1、A2、V4、V36、E38、L43、F44、T45、G46、G49、L66、D69、A71、I85和F87)。将sp34 VH(SEQ ID NO:48-50)的CDR移植至人类种系可变基因IGVH3-7的框架中，并且保留若干鼠类框架残基(D73、S76、M89、V93)。

使用内部开发的表达载体将人源化sp34(hu-sp34)和嵌合sp34(ch-sp34)构建成人类全长抗体格式，所述表达载体分别含有人类IgG1和κ链的恒定区，具有易于适应的亚克隆位点。人源化sp34和嵌合sp34抗体的表达和制备是通过将重链和对应轻链构建体共转染至293G细胞(内部开发)中并且使用蛋白A柱进行纯化来实现。将纯化的抗体在PBS中浓缩至0.5-5mg/mL，并且以等分试样储存于-80℃冷冻器中，以用于下列测定。

对于亲和力测定，抗体通过抗人类Fc表面来捕获，并且用于基于表面等离子体共振(SPR)技术的亲和力测定中。在基于FACS的测定中使用HuT78细胞评价人源化sp34与活细胞上的天然CD3结合的结合活性。将活HuT78细胞接种于96孔板中，并且与嵌合或人源化sp34的一系列稀释液一起温育。使用小鼠抗人类IgG作为二次抗体来检测抗体与细胞表面的结合。与人类天然CD3的剂量依赖性结合的EC50值是通过将剂量反应数据拟合至GraphPad Prism的四参数逻辑模型来确定。人源化sp34 BG53P(SEQ ID NO:48-53和58-61)在SPR测定和FACS测定中都显示出与ch-sp34相当的结合亲和力(表15和图4A)。

表15.通过SPR和FACS比较hu-sp34和ch-sp34与CD3的结合亲和力

基于人源化sp34 BG53P模板，我们进行了若干单一突变，将框架区中保留的鼠类残基转化为相应的人类种系残基，其中包括VH中的四个保留的鼠类残基(D73、S76、M89、V93)和VL中的十五个保留的鼠类残基(Q1、A2、V4、V36、E38、L43、F44、T45、G46、G49、L66、D69、A71、I85和F87)。所有人源化突变都使用含有特定位置处的突变的引物和定点诱变试剂盒(目录号FM111-02，TransGen,Beijing,China)进行。通过测序分析验证所需突变。这些hu-sp34变体抗体在如前所述的结合测定中进行了测试。与hu-sp34-1A-1f相比，VK上的V36Y、G46L和G49Y(Kabat编号)突变显著损害人源化变体的结合亲和力，而hu-sp34人源化变体的其余型式与hu-sp34-1A-1f具有相当的结合活性。VH中的D73N显著降低表达水平(数据未显示)。

总而言之，人源化单克隆抗体BG56P(SEQ ID NO:70-77和72-86)的充分工程化型式衍生自如上所述的突变过程，并且进行了详细表征(表16和图4B)。

表16.人源化sp34与CD3的结合亲和力的比较

实施例9.人源化sp34的ScFv工程化

为产生即插即用的双特异性格式并且避免轻链-重链错配，我们将BG56P抗体重新格式化为在VH与之间具有3xG4S接头的单链片段可变(scFv)格式。使用内部开发的具有易于适应亚克隆位点的表达载体，将重新格式化的scFv与人类IgG1 Fc区的N末端融合成scFv-Fc格式。通过将scFv-Fc构建体转染至293G细胞(内部开发)并且使用蛋白A柱进行纯化来实现亲代和重新工程化的hu-sp34 scFv-Fc的表达和制备。将纯化的scFv-Fc格式抗体在PBS中浓缩至0.5-5mg/mL，并且以等分试样储存于-80℃冷冻器中，以用于下列测定。scFv化的BG56P(称为BG561P，SEQ ID NO:48-53和62-65)在SPR和FACS中显示出与BG56P的抗体型式相当的结合亲和力(表17和图5)。

表17.通过SPR和FACS比较人源化sp34和scFv人源化sp34结合对CD3的亲和力

基于BG561P，我们在框架和CDR中进行了若干突变，以去除潜在的PTM位点并且提高热稳定性和胶体稳定性，以用于人类治疗用途。VL中L4V的突变(所得人源化scFv指定为BG562P，SEQ ID NO:48-53和69-70)显示聚集温度(Tagg)提高5度。VL中的L4V与VH中的A49G和D65G的组合(所得人源化scFv指定为BG563P)(SEQ ID NO:48、71、50、51-53、73和74)与BG561P相比显示出改善的热稳定性和胶体稳定性，而在FACS测定中显示与人类CD3的结合亲和力略有改善。潜在PTM位点包括FR1和HCDR1的连接区中的潜在脱酰胺位点N30(NT)(Kabat CDR定义)和HCDR3中的N100(NS)。每个N突变为S，以去除潜在脱酰胺位点。所有突变都使用含有特定位置处的突变的引物和定点诱变试剂盒(目录号FM111-02，TransGen,Beijing,China)进行。总而言之，人源化scFv BG564P(SEQ ID NO:48、71、75、51-53、77和78)的充分工程化型式衍生自上述突变过程，并且进行了详细表征。结果显示，与人源化scFv BG561P相比，人源化scFv BG564P保留对CD3的结合亲和力(表18–表20和图6)并且改善生物物理稳定性(表20)。

表18.通过SPR比较不同型式的人源化sp34 scFv-Fc对CD3的结合亲和力

表19.通过FACS比较人源化sp34 scFv-Fc与CD3的结合亲和力

表20人源化sp34 scFv-Fc的热稳定性和胶体稳定性比较

scFv-Fc	Tm(℃)	Tagg(℃)
			BG561P	58.1	45.5
BG562P	59.0	50.8
			BG563P	59.9	50.9
BG564P	61.6	51.2

熔融温度(Tm)是使用高通量MicroCal^TMVP-Capillary DSC(MalvernInstruments,Northampton,MA)来确定。使用90℃/h的扫描速率，获得每个蛋白质(在0.5mg/mL下，350μL)从20℃至100℃的热分析图。从每个蛋白质样品中减去单独缓冲液的热分析图。所获得的结果显示样品的转变温度(Tm)和量热焓(ΔH)的中点值，其表明BG564P的Tm与BG561P相比有所改善(表20)。

聚集温度Tagg(℃)代表样品的胶体稳定性并且通过使用UNCLE^TM(Unchained lab,Pleasanton,CA)，通过SLS266来监测聚集的起始而获得。将样品负载至Uni中，并且使温度从15℃匀升至95℃。背反射光学器件不能检测通过蛋白聚集物的近UV光散射，并且因此仅非散射光到达检测器。因此，背反射光的减少是样品中聚集的直接量度，其表明BG564P的Tagg与BG561P相比有所改善(表20)。

实施例10.CLDN6×CD3 BsAb BG143P的生成

激动性抗CD3抗体已在临床环境中表现出毒性，其可能表明全身FcγR交联对于CD3活化并不理想。目的是在肿瘤部位实现有效的CD3刺激，而无需对多种癌症进行全身性CD3活化。为克服FcγR交联的依赖性，生成具有以下特征的CLDN6×CD3 BsAb BG143P，如图7中所示。这种特异性构建体BG143P包括模块比为1:1的IgG融合样多特异性抗体格式、与CLDN6结合的充分工程化Fab片段BG87P-34和在CH2的N末端与CD3融合物结合的BG564P的scFv，以及不具有FcγR结合，但保留FcRn结合的huIgG1的Fc空型式。Fc中也引入杵入臼(KIH)以增加异二聚化。BG143P的序列信息列于SEQ ID NO:79-84中。

实施例11.CLDN6×CD3 BsAb BG143P的靶标结合活性

使用SPR测量CLDN6×CD3 BsAb BG143P的结合动力学。SPR用于测量CDεγ重组蛋白抗体的缔合速率常数(k_a)和解离速率常数(k_d)，并且然后确定亲和常数(K_D)。结果表明，CLDN6×CD3 BsAb与人类CDεγ具有很强的结合亲和力，如表21中所示。

表21.CLDN6×CD3 BsAb BG143P的氨基酸和DNA序列

FACS结果进一步证实BG143P与CD3和CLDN6的结合活性。BsAb以剂量反应性方式显示与表达CD3的Jurkat的强结合活性，EC₅₀为6.98nM(图8A)。类似地，BG143P以剂量反应方式显示与表达CLDN6的PA-1的强结合活性，EC₅₀为81.26nM(图8B)。

实施例12.CLDN6×CD3抗体的体外功能活性

[中靶T细胞重定向细胞毒性和细胞因子释放

BG143P针对PA-1(具有高CLDN6表达的癌细胞系)、Hutu80(具有中等CLDN6表达的癌细胞系)、AGS(具有低且异质性CLDN6表达的癌细胞系)和NCI-H1299(CLDN6表达阴性的癌细胞系)的T细胞重定向细胞毒性是使用人类PBMC作为效应细胞来评价。为测量细胞毒性，靶标癌细胞系经工程化以表达Nano-luciferase。将约10000个靶细胞和25000个人类PBMC(E/T＝2.5)接种至96孔U形底板的每个孔中，并且与各种浓度的抗体在37℃和5％ CO₂下温育48小时。收集上清液用于细胞因子检测。通过Nano-Glo检测试剂盒(Promega)测量靶细胞杀伤。使用下式计算抗体的细胞毒性活性(％)。细胞毒性活性(％)＝(A-B)/(A-C)*100％。“A”代表仅具有未经处理的靶细胞的孔的平均发光信号，“B”代表具有抗体和PBMC的孔的平均发光信号，并且“C”代表具有用Triton-X100完全裂解的靶细胞的孔的平均发光信号。通过HTRF试剂盒(Cisbio)检测上清液中的IFN-γ和IL-2。

如图9中所示，BG143P以pM EC50水平以剂量依赖性方式显示出有效的T细胞重定向杀伤和细胞因子释放诱导效力。

针对人类CLDN6和CLDN9的功能特异性

人类CLDN6和CLDN9的氨基酸序列高度保守，胞外域中仅存在3个氨基酸差异。CLDN9在人类正常组织中广泛表达，因此CLDN6与CLDN9之间的结合特异性很重要，并且通过FACS分析进行检查。

人类CLDN6和CLDN9的表达载体是通过将合成的编码cDNA的相应序列插入哺乳动物表达载体中而建立。通过转染相应质粒产生表达人类CLDN6和CLDN9的NCI-H1299稳定细胞。将细胞以1×10⁶个细胞的浓度悬浮于FACS缓冲液(2％FBS，1×PBS)中，并且将细胞悬浮液分配至U形底96孔板(100μL/孔)中。以100nM的最终最高浓度向其中添加抗体并且2×稀释11个稀释度，然后与细胞混合并在4℃下温育1小时。离心后，去除反应溶液，并且用200μL/孔的FACS缓冲液洗涤细胞两次。然后，将APC-抗人类Fcγ用FACS缓冲液稀释500倍，并且作为二次抗体添加至细胞中。将细胞在4℃下温育30分钟，然后如上所述洗涤两次，并且悬浮于100μL FACS缓冲液中。对细胞悬浮液进行流式细胞术。

使用人类PBMC通过Nano-Glo测定评价NCI-H1299-CLDN6/CLDN9上BG143P的杀伤，将约10000个靶细胞和25000个人类PB MC(E/T＝2.5)接种至96孔U形底板的每个孔中，并且与各种浓度的抗体在37℃和5％ CO₂下温育48小时。收集上清液用于细胞因子检测。通过Nano-Glo检测试剂盒(Promega)测量靶细胞杀伤。使用下式计算抗体的细胞毒性活性(％)。细胞毒性活性(％)＝(A-B)/(A-C)*100％。“A”代表仅具有未经处理的靶细胞的孔的平均发光信号，“B”代表具有抗体和PBMC的孔的平均发光信号，并且“C”代表具有用Triton-X100完全裂解的靶细胞的孔的平均发光信号。通过HTRF试剂盒(Cisbio)检测IFN-γ。

如图10中所示，BG143P是针对人类CLDN6而非人类CLDN9具有特异性结合(图10A)、细胞杀伤(例如裂解)(图10B)和IFN-γ诱导活性(图10B)的抗体。

实施例13.CLDN6×CD3 BsAb BG143P在OV90异种移植模型中的体内功效

在PBMC人源化小鼠的异种移植模型中评价了CLDN6×CD3BsAb BG143P的体内抗肿瘤功效。向NCG(NOD/ShiLtJGpt-Prkdc^em26Cd52Il2rg^em26Cd22/Gpt)小鼠皮下接种表达人类CLDN6的人类卵巢癌细胞系OV-90(ATCC)，并且在第二天向小鼠静脉内注射人类PBMC。当肿瘤体积达到约200mm³时，将荷瘤小鼠随机分至治疗组，以接受抗体或作为对照的媒介物(PBS)的施用。抗体/媒介物每周施用一次。每周测量三次每只小鼠的肿瘤块长度(L)和宽度(W)以及体重。并且肿瘤体积(TV)计算如下：TV＝(L x W²)/2。图11A显示BG143P的体内抗肿瘤功效，其在0.03mg/kg和0.1mg/kg时显示出强功效，TGI％(肿瘤生长抑制比，％)为115.43％和125.92％。

在注射PBMC后第2周、第3周和第4周检查小鼠中hPBMC的重建。外周血中活细胞中的hCD45+细胞在第2周为20％，并且在第4周增加至60％。图11B展示hPBMC重建。

实施例14.CLDN6×CD3 BsAb BG143P在B16F10-/hCLDN6同基因模型中的体内功效

实施另一个类型的功效模型来评价CLDN6×CD3 BsAb BG143P的体内功效。构建人类CLDN6表达质粒并且在B16F10细胞系中稳定转染，并且所得B16F10/人类CLDN6细胞系被证实能够在人类CD3EDG转基因小鼠中生长，并且在肿瘤形成后保留hCLDN6表达。为建立此模型，将B16F10/人类CLDN6细胞皮下接种至hCD3EDG转基因小鼠中，其中小鼠CD3基因被人类对应基因代替。在肿瘤体积达到约100mm³后将小鼠随机分组。每周向小鼠腹膜内注射测试品或PBS。每周测量三次每只小鼠的肿瘤块长度(L)和宽度(W)以及体重。肿瘤体积(TV)计算如下：TV＝(L x W2)/2。BG143P在0.1mg/kg时表现出强功效，TGI％为93.54％，如图12A中所示。如图12B中所说明，在研究中未观测到明显的体重减轻。

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22.Stadler,C.R.，et al.，Elimination of large tumors in mice by mRNA-encoded bispecific antibodies.Nat Med,2017.23(7):p.815-817.

Claims

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含特异性结合于人类紧密连接蛋白6(CLDN6)的抗原结合域。

2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合域不结合于其他紧密连接蛋白(CLDN)蛋白质家族成员。

3.如权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合域不结合于人类紧密连接蛋白9(CLDN9)。

4.如权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合域对人类CLDN6比对人类CLDN9具有高选择性。

5.如前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中特异性结合于人类CLDN6的所述抗原结合域包含：

(a)重链可变区，其包含(i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链互补决定区(HCDR)1，(ii)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HCDR2，(iii)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(iv)具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链互补决定区(LCDR)1，(v)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2，和(vi)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；

(b)重链可变区，其包含：(i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1，(ii)具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的HCDR2，(iii)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(iv)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1，(v)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2，和(vi)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；

(c)重链可变区，其包含：(i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1，(ii)具有SEQ IDNO:23的氨基酸序列的HCDR2，(iii)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(iv)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1，(v)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2，和(vi)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；或

(d)重链可变区，其包含(i)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1，(ii)具有SEQ IDNO:45的氨基酸序列的HCDR2，(iii)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；和轻链可变区，其包含：(iv)具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的LCDR1，(v)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2，和(vi)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。

6.如前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合域包含：

(a)重链可变区，其具有与SEQ ID NO:43至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和轻链可变区，其具有与SEQ ID NO:44至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列；

(b)重链可变区，其具有与SEQ ID NO:7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和轻链可变区，其具有与SEQ ID NO:8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列；

(c)重链可变区，其具有与SEQ ID NO:24至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和轻链可变区，其具有与SEQ ID NO:12至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列；

(d)重链可变区，其具有与SEQ ID NO:41至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和轻链可变区，其具有与SEQ ID NO:42至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列；

(e)重链可变区，其具有与SEQ ID NO:46至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和轻链可变区，其具有与SEQ ID NO:47至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列；或

(f)重链可变区，其具有与SEQ ID NO:46至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，和轻链可变区，其具有与SEQ ID NO:42至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。

7.如前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中SEQ ID NO:7、8、12、24、41、42、43、44、46或47的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸已被插入、缺失或取代。

8.如前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合域包含：

(a)具有包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链可变区，和具有包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链可变区；

(b)具有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区，和具有包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区；

(c)具有包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区，和具有包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区；

(d)具有包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区，和具有包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区；

(e)具有包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区，和具有包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链可变区；或

(f)具有包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区，和具有包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区。

9.如前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类工程化抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。

10.如前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体为多特异性抗体。

11.如前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体为双特异性抗体。

12.如前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。

13.如前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有减少的糖基化或无糖基化或为低岩藻糖基化的。

14.如前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含增加的平分型GlcNac结构。

15.如前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中Fc域为IgG1。

16.如前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述Fc域为效应功能降低的IgG1。

17.如前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述Fc域为IgG4。

18.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段，还包含药学上可接受的载剂。

19.如权利要求18所述的药物组合物，所述药物组合物还包含组氨酸/组氨酸HCl、海藻糖二水合物和/或聚山梨醇酯20。

20.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的权利要求1至17所述的抗体或抗原结合片段。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述癌症为实体癌症。

22.如权利要求20所述的方法，其中所述癌症选自胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、脑癌、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、睾丸癌、子宫内膜癌、膀胱癌、横纹肌样瘤和/或神经胶质瘤。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段与一种或多种额外治疗剂组合施用。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂选自太平洋紫杉醇或太平洋紫杉醇剂、多西他赛、卡铂、拓扑替康、顺铂、伊立替康、多柔比星、来那度胺或5-氮杂胞苷。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂为太平洋紫杉醇剂、来那度胺或5-氮杂胞苷。

26.如权利要求23所述的方法，其中所述治疗剂为抗PD1或抗PDL1抗体。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述抗PD1抗体为替雷利珠单抗。

28.一种分离的核酸，所述核酸编码权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段。

29.一种载体，所述载体包含权利要求28所述的核酸。

30.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求28所述的核酸或权利要求29所述的载体。

31.一种用于产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养权利要求30所述的宿主细胞并且从培养物回收所述抗体或抗原结合片段。

32.如权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段，或如权利要求18或19所述的药物组合物，其用于药物或疗法中。

33.如权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段，或如权利要求18或19所述的药物组合物，其用于治疗癌症的方法中。

34.如权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段用于制造用于治疗癌症的药剂的用途。