CN120818067A - 一种具有高阻尼性能及湿响应自修复特性的新型蛋白纤维材料制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物材料领域，尤其涉及一种具有高阻尼性能及湿响应自修复特性的新型蛋白纤维材料制备工艺。本发明提供了融合蛋白，包括：鱿鱼环齿蛋白、节肢弹性蛋白和富赖氨酸类弹性蛋白。本发明采用基因工程技术手段，实现不同结构模块的融合，构建重组质粒，表达，纯化，获得一种全新的三嵌段重组蛋白，随后通过湿法纺丝成型技术制备成蛋白纤维材料。基于纤维内部的动态化学键网络，本发明的蛋白纤维材料展现出优异的机械性能及高阻尼特性，并可通过环境湿响应实现内部动态化学键的修复及再生，表现出自修复特性。

Description

一种具有高阻尼性能及湿响应自修复特性的新型蛋白纤维材 料制备工艺

技术领域

本发明涉及生物材料领域，尤其涉及一种具有高阻尼性能及湿响应自修复特性的新型蛋白纤维材料制备工艺。

背景技术

蛋白纤维作为一种性能优异、应用广泛的新材料，因其高强度、高韧性、高延展性以及高生物相容性，展现出广阔的应用前景，未来有望取代传统纤维，成为下一代高新技术材料。然而，如何增强纤维内部的相互作用力，并利用动态结构实现纤维材料的自修复，从而提升重组蛋白纤维的机械性能和功能特性，仍然是一个亟待解决的挑战。

鱿鱼环齿蛋白富含晶体结构域，能够通过堆叠形成β-折叠结构，展现出高机械强度、柔韧性、导电导热性等优异的物理化学性质。节肢弹性蛋白Resilin是目前已知的最高效的弹性蛋白之一，广泛存在于节肢动物的多种结构和器官中，为这些生物的机械活性器官和组织提供柔软的橡胶弹性，具有制备成人造阻尼特性材料的巨大潜力；类弹性蛋白是一种具有Val-Pro-Gly-Xaa-Gly（VPGXG）重复氨基酸序列的蛋白质材料，X可以为除脯氨酸外的任意氨基酸。当X为赖氨酸（Lys）时，赖氨酸侧链上的伯胺基团提供了交联位点，有利于蛋白内部形成致密的交联网络。

尽管现有的一些技术方法，如基于二级交联体系制备增韧生物蛋白纤维的方法，通过引入多种交联剂构建纤维内部二级交联网络，有效提升蛋白纤维的机械特性；以及重组嵌合蛛丝蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法和应用，通过融合蛛丝蛋白的刚性结构域来增强生物蛋白纤维的力学性能，但这些工艺大多集中在表观机械的性能增强上，缺乏对纤维内部动态结构的深入构建和探索，难以满足生产应用中对仿生化材料制备的更高要求。

因此，对于人造生物蛋白纤维而言，在关注优化序列设计和成型工艺以提升其机械性能的同时，通过引入动态内部结构，深入探索生物蛋白纤维材料的功能特性，如阻尼特性、材料环境响应性以及自修复特性等，具有极为重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种具有高阻尼性能及湿响应自修复特性的新型蛋白纤维材料制备工艺。本发明通过理性设计蛋白分子的氨基酸序列及二级结构，调控不同模块间的相互作用，提升生物蛋白纤维材料的机械性能。同时，通过构建纤维内部动态化学键，实现纤维材料受力过程中的高能量耗散，构建一种具有高阻尼特性及自修复特性的蛋白纤维材料，提供一种新型生物蛋白纤维及其制备方法。本发明通过仿天然结构蛋白特性，通过引入鱿鱼环齿蛋白（SRT）的刚性结构域作为刚性模块，弹性蛋白Resilin作为弹性模块，富赖氨酸类弹性蛋白（KELP）作为柔性连接模块，随后引入末端内含肽序列促进蛋白分子间的有序组装，使其形成内部致密结构，并将其通过戊二醛交联纺成的新的蛋白纤维材料，通过内部动态亚胺键及氢键相结合，实现纤维的高机械性能、高阻尼特性、湿响应自恢复特性，获得了一种较现有技术而言，制备流程更为简易、力学性能更为优异的新型蛋白纤维材料。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了融合蛋白，包括：鱿鱼环齿蛋白、节肢弹性蛋白和富赖氨酸类弹性蛋白。

在本发明的一些实施方案中，上述融合蛋白中，所述鱿鱼环齿蛋白、所述节肢弹性蛋白和所述富赖氨酸类弹性蛋白依次串联连接；

所述鱿鱼环齿蛋白具有：

(1)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

(2)如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与(1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(3)与(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有80%同一性的氨基酸序列；和/或

所述节肢弹性蛋白具有：

(4)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

(5)如(4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与(4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(6)与(4)或(5)所示的氨基酸序列至少有80%同一性的氨基酸序列；和/或

所述富赖氨酸类弹性蛋白包含n个串联的五肽序列（VPGX₁G）_i-（VPGX₂G）_j；其中：X₁和X₂分别独立地选自赖氨酸、缬氨酸或其它氨基酸；i和j为1~40之间的整数；n为1~40之间的整数。

在本发明的一些实施方案中，上述融合蛋白中，所述融合蛋白的数量为3~36之间的整数。

在本发明的一些实施方案中，上述融合蛋白中，所述融合蛋白的数量为12~24之间的整数。

在本发明的一些实施方案中，上述融合蛋白中，所述融合蛋白的数量为24。

在本发明的一些实施方案中，上述融合蛋白中，所述X₁为赖氨酸；X₂为缬氨酸。

在本发明的一些实施方案中，上述融合蛋白中，i为3~10之间的整数。

在本发明的一些实施方案中，上述融合蛋白中，i为5。

在本发明的一些实施方案中，上述融合蛋白中，j为1~10之间的整数。

在本发明的一些实施方案中，上述融合蛋白中，j为1或2。

在本发明的一些实施方案中，上述融合蛋白中，所述融合蛋白的氨基酸序列具有：

(7)如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或

(8)如(7)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与(7)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(9)与(7)或(8)所示的氨基酸序列至少有80%同一性的氨基酸序列。

本发明还提供了重组蛋白，包括：上述融合蛋白以及功能性表达元件；

所述功能性表达元件位于融合蛋白的N端和/或C端；

所述功能性表达元件包括：组氨酸标签和/或内含肽。

在本发明的一些实施方案中，上述重组蛋白中，所述内含肽的氨基酸序列如SEQID NO:5和如SEQ ID NO:6所示。

在本发明的一些实施方案中，上述重组蛋白中，所述重组蛋白具有：

(10)如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；或

(11)如(10)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与(10)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(12)与(10)或(11)所示的氨基酸序列至少有80%同一性的氨基酸序列。

本发明还提供了上述融合蛋白和/或上述重组蛋白在制备生物纤维中的应用。

本发明还提供了生物纤维的制备方法，将上述重组蛋白溶于溶液中获得蛋白溶液，将所述蛋白溶液挤出到凝固浴中固化，获得所述生物纤维。

在本发明的一些实施方案中，上述的制备方法中所述重组蛋白在蛋白溶液中的质量分数为150~200 mg/mL；和/或

所述凝固浴为0.5~5 %（v/v）的戊二醛-水溶液；和/或；

获得所述生物纤维后还包括对生物纤维的后拉伸，具体步骤包括：将所述生物纤维浸泡变软后，将所述生物纤维拉伸至原长的2~5倍，得后拉伸的所述生物纤维。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述重组蛋白在蛋白溶液中的质量分数为200 mg/mL；和/或

所述凝固浴为1 %（v/v）的戊二醛-水溶液。

本发明还提供了生物材料，包括：(A1)至(A5)中的至少一种：

(A1)编码上述融合蛋白或上述重组蛋白的核酸分子；

(A2)含有(A1)所述核酸分子的表达盒；

(A3)含有(A1)所述核酸分子或(A2)所述表达盒的重组载体；

(A4)转化和/或转染(A3)所述重组载体的宿主；

(A5)培养如(A4)所述宿主细胞获得的混合物。

在本发明的一些实施方案中，上述生物材料中，所述重组载体中的骨架质粒包括：pET25b质粒和/或pbluescript II ks质粒。

在本发明的一些实施方案中，上述生物材料中，所述宿主的的底盘菌株或细胞包括：重组大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞中的一种或多种。

本发明还提供了上述融合蛋白、上述重组蛋白、上述制备方法获得的生物纤维和/或上述生物材料在如下任意项中的应用；

(B1)运动和/或防护装备；

(B2)纸产品；

(B3)薄膜；

(B4)纺织品；

(B5)涂层；

(B6)医用材料或生物材料。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述纸产品包括包装纸、标牌和/或广告印刷纸中的一种或多种；和/或

所述薄膜包括包装薄膜、偏光板保护膜和/或表面处理膜中的一种或多种；

所述纺织品包括纺织原料、家用纺织品和/或服装衣物中的一种或多种；

所述涂层包括液态涂层、涂料和/或导电漆中的一种或多种；

所述医用材料或生物材料包括弹性体材料、手术缝线、医用粘合剂和/或支架类材料中的一种或多种。

本发明的发明人发现，通过基因工程技术将鱿鱼环齿蛋白（SRT）-节肢弹性蛋白（Resilin）-富赖氨酸类弹性蛋白（KELP）三模块进行融合、随后在蛋白N端及C端引入内含肽末端促进分子间组装，得到的ISRK融合蛋白具有典型的β-折叠内部结构，通过湿法纺丝成型工艺制备得到的生物纤维材料展现出优异的力学特性。基于纤维内部动态亚胺键及氢键网络，生物纤维展现出高阻尼特性及湿响应特性，可以通过湿环境响应实现内部动态键网络结构的再生与恢复，进而实现纤维材料机械性能及阻尼特性的自恢复。

本发明的有益效果包括：

（1）本发明通过模块化组装策略，将鱿鱼环齿蛋白（SRT）-节肢弹性蛋白（Resilin）-富赖氨酸类弹性蛋白（KELP）三模块进行融合表达，形成仿天然蛛丝结构，利用鱿鱼环齿蛋白（SRT）的刚性β-折叠序列与柔性节肢弹性蛋白（Resilin）-富赖氨酸类弹性蛋白（KELP）交联网络协同作用，有助于材料内部结构的坚固与稳定。

（2）本发明通过在N端或/和C端引入内含肽末端，促进分子间组装，有利于材料内部结构紧密堆积。

（3）本发明在纤维成型过程中，通过引入动态亚胺键及β-折叠的动态氢键，稳定纤维内部结构，提高纤维力学性能，获得具有高强韧、高阻尼、自修复特性的重组蛋白纤维材料。

（4）本发明的纺丝工艺简便，制备流程简单、易重复，可实现大量制备且经过后拉伸之后更为长程有序。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明的制备例1的三嵌段SRT1-Resilin1-KELP1重组蛋白载体构建示意图；其中：A为SRT1-Resilin1-KELP1重组蛋白基因在pbluescript II ks (m13)载体上的多聚化构建示意图；B为SRT1-Resilin1-KELP1多聚重组蛋白基因由pbluescript II ks（m13）载体转移至pET25b上的构建示意图；

图2示本发明的制备例1的引入内含肽末端结构单元的ISRK重组蛋白载体构建示意图；其中：A为构建示意图，B为构建得到的质粒图；构建过程在pET25b载体上进行，分别在SRT1-Resilin1-KELP1 24聚体的N端及C端引入内含肽序列；

图3示本发明的制备例4的ISRK重组蛋白表达及纯化结果图；其中：A为ISRK重组蛋白筛选表达SDS-PAGE电泳图，红色箭头指示目的条带；B为纯化后ISRK重组蛋白SDS-PAGE电泳图，电泳图中分别显示出蛋白单体条带以及内含肽作用后的蛋白组装体条带；

图4示本发明的制备例5的ISRK重组蛋白荧光图；其中：A为ThT探针与ISRK重组蛋白共孵育后的荧光强度图；B为ANS探针与ISRK重组蛋白共孵育后的荧光强度图，ThT探针与ANS探针均为β-折叠结构检测试剂，在β-折叠结构存在时将产生明显荧光峰；

图5示本发明的验证例1的ISRK蛋白纤维外观图片（图中的亮黄色丝线为蛋白纤维）；

图6示本发明的验证例1的ISRK蛋白纤维多种类型制品图片；

图7示本发明的验证例1的ISRK蛋白纤维扫描电镜（SEM）图片；

图8示本发明的验证例1的ISRK蛋白纤维后拉伸处理后力学性能测试曲线图；

图9示本发明的验证例1的ISRK蛋白纤维后拉伸处理后力学性能计算柱形图；

图10示本发明的验证例2的ISRK蛋白纤维循环加载-卸载拉伸测试曲线图；

图11示本发明的验证例2的ISRK蛋白纤维循环加载-卸载拉伸测试过程中的阻尼能量及阻尼率计算结果图；

图12示本发明的验证例2的ISRK蛋白纤维的细胞毒性验证结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种具有高阻尼性能及湿响应自修复特性的新型蛋白纤维材料制备工艺。

应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。

应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。

第一方面，本发明提供一种ISRK融合蛋白生物纤维，其蛋白组成模块包括鱿鱼环齿蛋白（SRT）-节肢弹性蛋白（Resilin）-富赖氨酸类弹性蛋白（KELP）三结构单元，并进一步在其末端融合内含肽单元以促进蛋白分子间的进一步组装，通过湿法纺丝工艺戊二醛交联成型后经人工纺丝制得的蛋白纤维

其中，重组蛋白包含SRT1-Resilin1-KELP1融合蛋白，其为下述A1)~A3)蛋白中任一种：

A1)其氨基酸序列包括：m个直接串联的表现形式如[SRT1-Resilin1-KELP1]所示的氨基酸序列单元，其中，SRT1表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，Resilin1表示如SEQID NO:2所示的氨基酸序列，KELP1为富含赖氨酸的类弹性蛋白序列，[SRT1-Resilin1-KELP1]表示SRT1序列、Resilin1序列、以及KELP1序列串联；m表示[SRT1-Resilin1-KELP1]序列的重复数，m为3-36之间的整数；

其中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为：PAATAVSHTTHHAP；SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列为：GGRPSDSYGAPGGGN。

A2）其氨基酸序列包括：A1)或A2）所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有相同或相近性质的蛋白质；

A3)其氨基酸序列包括：在A1)或A2)的N端和/或C端引入组氨酸标签。

A4)其氨基酸序列包括：在A1)或A2)或A3)的N端和/或C端引入内含肽末端氨基酸序列。

进一步地，在SRT1-Resilin1-KELP1融合蛋白中：m为3-36之间的整数，可选地为12-24之间的整数，可选地为24；

KELP1的氨基酸序列包含若干如SEQ ID NO:3：VPGXG所示的氨基酸序列串联而成的氨基酸序列，表现形式为（VPGX1G）i -（VPGX2G）j，其中，X1和X2分别独立地为赖氨酸或缬氨酸或其它氨基酸，可选地X1为赖氨酸，X2为缬氨酸；i为（VPGX1G）序列的重复数，i为1-40之间的整数，可选地i为3-10之间的整数，可选地i为5；j为（VPGX2G）序列的重复数，j为1-40之间的整数，可选地j为1-10之间的整数，可选地j为1或2；

可选地，氨基酸序列单元的氨基酸序列[SRT1-Resilin1-KELP1]如SEQ ID NO:4所示，序列如下：PAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVG。

当SRT1-Resilin1-KELP1融合蛋白为24聚体时，氨基酸序列包含以下序列：PAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVG。（如SEQ ID NO:9所示）

进一步地，在SRT1-Resilin1-KELP1融合蛋白的N端和/或C端融合内含肽单元，N端及C端的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示，序列如下：MAKTKMLKKILKIEELDERELIDIEVSGNHLFYANDILTHNSSSDVGT；

WKEFTRSGYCLDLKTQVQTPQGMKEISNIQVGDLVLSNTGYNEVLNVFPKSKKKSYKITLEDGKEIICSEEHLFPTQTGEMNISGGLKEGMCLYVKE。

可选地，ISRK融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示：MAKTKMLKKILKIEELDERELIDIEVSGNHLFYANDILTHNSSSDVGTMPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSHTTHHAPGGRPSDSYGAPGGGNVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGVGPAATAVSDIWPHHHHHHWKEFTRSGYCLDLKTQVQTPQGMKEISNIQVGDLVLSNTGYNEVLNVFPKSKKKSYKITLEDGKEIICSEEHLFPTQTGEMNISGGLKEGMCLYVKE。

第二方面，提供一种第一方面所述的生物纤维的制备方法，包括：

将所述ISRK融合蛋白溶于水溶液中制备蛋白溶液，利用注射泵将所述蛋白溶液挤出到凝固浴中固化成初生纤维。

进一步地，所述SRT1-Resilin1-KELP1融合蛋白在蛋白溶液中的质量分数为150~200 mg/mL，可选地为200 mg/mL；蛋白浓度过低可能会导致蛋白纤维不能成型，过高则可能会导致蛋白在针头处堵塞，对纤维成型过程有影响。

和/或，所述凝固浴为0.5~5 %（v/v）戊二醛-水溶液，可选地为1%（v/v）戊二醛-水溶液；

和/或，还包括对初生纤维的后拉伸：将初生纤维浸泡在拉伸浴中变软后，将其拉伸至原长的2~5倍，得后拉伸纤维。

第三方面，提供一种第一方面所述的生物纤维、或第二方面所述的制备方法制备的生物纤维相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：

B1)编码所述的SRT1-Resilin1-KELP1融合蛋白以及ISRK融合蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体，或含有B2)所述表达盒的重组载体；可选地，所述重组载体采用pET25b质粒或pbluescript II ks质粒；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组表达系统，或含有B2)所述表达盒的重组表达系统，或含有B3)所述重组载体的重组表达系统；可选地，所述表达系统为重组大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。

第四方面，提供一种第一方面所述的生物纤维、或第二方面所述的制备方法制备的生物纤维相关的生物材料或第三方面所述的生物材料的用途，所述用途包括以下C1)至C6)中的任一种或几种：

C1）运动和/或防护装备；

C2）纸产品，可选地包括包装纸、标牌或广告印刷纸；

C3）薄膜，可选地包括包装薄膜、偏光板保护膜或表面处理膜；

C4）纺织品，可选地包括纺织原料、家用纺织品或服装衣物；

C5）涂层，可选地包括液态涂层、涂料或导电漆；

C6）医用材料或生物材料，可选地包括弹性体材料、手术缝线、医用粘合剂或支架类材料。

此外，本发明的发明人发现，通过基因工程技术将鱿鱼环齿蛋白（SRT）-节肢弹性蛋白（Resilin）-富赖氨酸类弹性蛋白（KELP）三模块进行融合、随后在蛋白N端及C端引入内含肽末端促进分子间组装，得到的ISRK融合蛋白具有典型的β-折叠内部结构，通过湿法纺丝成型工艺制备得到的生物纤维材料展现出优异的力学特性。基于纤维内部动态亚胺键及氢键网络，生物纤维展现出高阻尼特性及湿响应特性，可以通过湿环境响应实现内部动态键网络结构的再生与恢复，进而实现纤维材料机械性能及阻尼特性的自恢复。

本发明制备例1~制备例5和验证例1~验证例3中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

制备例1 重组淀粉样多肽-类弹性蛋白表达载体构建

构建SRT1-Resilin1-KELP1重组蛋白3聚体单元的编码序列((ELP1蛋白编码序列+AP1蛋白编码序列)×3)，以及用于同源重组的同源臂序列1（CTGCAGGAATTCGTTATC（如SEQID NO:10所示））、同源臂序列2(CCAGCTGCCACAGCTGTCAGC（如SEQ ID NO:11所示）)、XbaI酶切位点(TCTAGA)、NdeI酶切位点(CATATG)、EcoRV酶切位点(GATATC)、组氨酸标签序列((CAC)6)、终止密码子对应的DNA编码序列(TGAGAT)和EcoRI酶切位点(GAATTC)，所有元件连接获得基因元件1(pbluescript II ks -三聚体基本单元)：XbaI+同源臂序列1+NdeI+ELP1-AP1蛋白三聚体单元的编码序列+同源臂序列2+EcoRV+(CAC)6+TGAGAT+EcoRI，基因元件1委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，并直接通过通过XbaI和EcoRV双酶切将基因元件1和m13质粒连接，获得SRT1-Resilin1-KELP1重组蛋白3聚体基本单元载体。基因元件1序列如SEQ ID NO:8所示：

TCTAGACTGCAGGAATTCGTTATCCATATGCCAGCTGCCACAGCTGTCAGCCACACCACCCATCATGCT CCTGGTGGACGCCCGTCTGATAGCTATGGCGCACCGGGGGGCGGTAACGTTCCGGGTAAGGGCGTTCCGGGCAAAGG TGTGCCAGGCAAGGGTGTTCCGGGTAAAGGTGTGCCGGGTAAAGGCGTGCCGGGTGTGGGTCCAGCTGCCACAGCTG TCAGCCACACCACCCATCATGCTCCTGGTGGACGCCCGTCTGATAGCTATGGCGCACCGGGGGGCGGTAACGTTCCG GGTAAGGGCGTTCCGGGCAAAGGTGTGCCAGGCAAGGGTGTTCCGGGTAAAGGTGTGCCGGGTAAAGGCGTGCCGGG TGTGGGTCCAGCTGCCACAGCTGTCAGCCACACCACCCATCATGCTCCTGGTGGACGCCCGTCTGATAGCTATGGCG CACCGGGGGGCGGTAACGTTCCGGGTAAGGGCGTTCCGGGCAAAGGTGTGCCAGGCAAGGGTGTTCCGGGTAAAGGT GTGCCGGGTAAAGGCGTGCCGGGTGTGGGTCCAGCTGCCACAGCTGTCAGCGATATCTGGCCGCACCACCACCACCACCACTGATAAGAATTC

其中，下划线部分为SRT1-Resilin1-KELP1重组蛋白3聚体单元的编码序列，加粗部分分别为同源臂1、2的序列。

重组SRT1-Resilin1-KELP1 6聚体载体(pbluescript II ks -6聚体载体)：通过XbaI和EcoRV双酶切从pbluescript II ks -三聚体基本单元载体上获得基因元件2，基因元件2与经过NdeI单酶切的pbluescript II ks三聚体基本单元载体的质粒线性化片段，在重组酶（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）的作用下，通过基因元件2首尾的同源臂序列1、2与质粒线性化片段进行同源重组连接，获得SRT1-Resilin1-KELP1重组蛋白6聚体载体(pbluescript II ks -6聚体)；

按照上述方式可不断进行基因重组，最终获得重组淀粉样多肽-类弹性蛋白24聚体载体(pbluescript II ks -12聚体)，再通过NdeI和EcoRI双酶切连接到pET25b质粒上，形成表达载体pET25b-24聚体。构建流程图如图1A及图1B所示。

随后，为实现蛋白分子的更进一步组装，在pET25b-24聚体的N端及C端分别通过基因重组方式融合内含肽序列。其中，内含肽是一类具有自我剪接功能的蛋白质片段，可以引导两个蛋白分子之间形成组装，有利于蛋白分子内部结构的紧密排布。在重组酶的作用下，通过内含肽首尾添加的同源臂序列与质粒线性化片段进行同源重组连接，获得两端带有内含肽序列的SRT1-Resilin1-KELP1重组蛋白表达载体pET25b-24聚体。构建流程图如图2的A所示，构建得到的表达质粒如图2的B所示。

制备例2 优势菌株筛选及菌株保存

将制备例1最终获得的两端带有内含肽序列的SRT1-Resilin1-KELP1重组蛋白表达载体pET25b-24聚体转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli BLR(DE3)。挑取单克隆菌落，于10mL LB培养基(100 μg/mL氨苄西林钠)中于100mL摇瓶中培养9~10小时(37℃，220 rpm)；待菌液OD600至3~4时，将600μL菌液与400μL50%甘油混合，翻转摇匀8~10次放入-80℃冰箱保存；同时，将100μL菌液转移至10mL TB培养基(100 μg/mL氨苄西林钠)中于100mL摇瓶中培养2~3小时(37℃，220 rpm)；待菌液OD600至0.6~0.8时，添加诱导剂IPTG (isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside ,异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM，诱导蛋白表达，发酵培养过夜(28.5℃，220 rpm)；取培养过夜的菌液1 mL离心(6000 rpm，4℃，2 min)，弃去上清液，收集菌体；加入1 mL Ni Lysis Buffer (NaCl 500mM，Na₃PO₄ 50 mM，咪唑20 mM，pH7.8)混匀，使用φ3超声探头超声破碎(35 %功率，5~10 min)至溶液澄清；分别取全蛋白溶液以及离心(12000 rpm，4℃，5 min)后的上清液各50μL，加入10μL 6×Protein LoadingBuffer，混匀后98℃水浴加热10 min使蛋白变性；冷却10 min后取10 μL样品于已配置好的1 mm厚的聚丙烯酰胺凝胶上加样；设置参数160 V，400 mA电泳1.5h；电泳结束后将凝胶放入染色液中，震荡染色2~3h；染色结束后回收染色液，将凝胶放入脱色液中进行震荡脱色至条带清晰；表达的蛋白凝胶结果如图3A所示，在结果图中，可以观察到高于蛋白单体理论分子量的条带，证实内含肽末端可以在蛋白表达的同时在大肠杆菌内部发挥作用，促进蛋白分子单体间的组装；依据目的条带深浅，筛选优势菌株并保存。

制备例3 蛋白表达

取优势菌株1 mL，接种于100mL LB培养基(100 μg/mL氨苄西林钠)中培养6~7小时(37℃，220 rpm)；待菌液OD600至3~4时，取10 mL菌液接种于1 L TB培养基(100 μg/mL氨苄西林钠)中于5 L摇瓶中培养2~3小时(37℃，220 rpm)；待菌液OD600至0.6~0.8时，添加诱导剂IPTG (isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM，诱导蛋白表达，发酵培养过夜(28.5℃，220 rpm)；将培养过夜的菌液离心(6000 rpm，4℃，10 min)，弃去上清液保留菌体，于-80℃冰箱保存。

制备例4 蛋白纯化

按照1:5的比例(m/V)向菌体中加入Ni Lysis Buffer (NaCl 500mM，Na₃PO₄ 50mM，咪唑20 mM，pH 7.8)，搅拌均匀后加入MgCl₂ (20mM)、溶菌酶(1mg/mL)和DNA酶(5μg/mL)室温孵育30 min；使用φ20超声探头超声破碎(35 %功率，2~2.5 h)后离心(12000 rpm，4℃，40 min)，取上清过0.45μm滤膜；之后将离心、抽滤后的菌液通过Ni Lysis Buffer平衡后的镍柱，使蛋白的组氨酸标签与柱料里的镍离子结合，随后使用Ni Lysis Buffer再次平衡，经由Ni Elusion Buffer (NaCl 500mM，Na₃PO₄ 50 mM，咪唑350 mM，pH 7.8)竞争性结合镍柱上的镍离子，实现目的蛋白洗脱。随后将洗脱液在SP Lysis Buffer (NaCl 50mM，Na₃PO₄ 50 mM，pH 7.8)中透析2~3小时后过0.45μm滤膜，样品通过阳离子交换柱，随后使用SP Lysis Buffer平衡、经由SP Elusion Buffer (NaCl 2M，Na₃PO₄ 50 mM，pH 7.8)洗脱。随后，将阳离子交换层析洗脱液经过分子筛除盐，除去液体中的盐离子，最终获得经精细纯化后的蛋白溶液。将蛋白溶液于-80℃冷冻过夜后放入真空冷冻干燥机中冻干。对纯化后的融合蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳和分析，如图3的B所示，结果表明能够纯化获得两端带有内含肽序列的SRT1-Resilin1-KELP1重组蛋白（ISRK），并能成功检测到蛋白组装体条带的存在。

制备例5 重组ISRK蛋白纤维的制备

将制备例4制备的两端带有内含肽序列的SRT1-Resilin1-KELP1重组蛋白（ISRK）溶于水溶液中(200mg/mL)，制备成纺丝液；将纺丝液转移到1 mL注射器中，通过注射器针头挤入凝固浴(1 %戊二醛水溶液)中，使用注射泵调节推进速度为10μL/min、用收集毂以线速度为0.6 m/min的速度来收集纤维；将收集到的纤维在室温(25℃)下晾干30~60 min。制备获得两端带有内含肽序列的SRT1-Resilin1-KELP1蛋白纤维（简称ISRK蛋白纤维）。

验证例1 蛋白纤维力学性能测试

在水溶液中对制备例5获得的ISRK 蛋白纤维进行后拉伸处理，拉伸到原长的2~5倍，采用纤维拉伸仪进行纤维力学性能测试。对所有纤维测试时，拉伸速度为8 mm/min，夹距间距离为4 mm，检测纤维断裂强度、韧性和延展性，其中：

纤维强度断裂强度断裂时的拉伸的为应力除以横截面，应力直接从机器(Textechno, German)中获取，横截面积利用圆形公式。

纤维韧性为应力-应变曲线包围的面积。应力，应变直接从机器(Textechno,German)中获取。

杨氏模量为线性弹性变形范围内应力-应变曲线的斜率。所用数据处理均利用Origin 2024处理。不同组别之间的差异分析使用GraphPad Prism 8.0软件进行。

制备例5的ISRK蛋白纤维的纤维力学性能曲线如图8-9、表1所示，由力学性能测试结果计算可得，ISRK蛋白纤维断裂强度为580.57 ± 14.63 MPa，韧性为92.23 ± 29.19MJ/m³，模量为8.43 ± 0.83 GPa，展现出优异的力学特性。

表1 本发明纤维力学性能表

验证例2 蛋白纤维循环加载/卸载拉伸测试

在水溶液中对制备例5获得的ISRK 蛋白纤维进行后拉伸处理，拉伸到原长的2~5倍，采用纤维拉伸仪进行纤维加载-卸载拉伸测试。对所有纤维测试时，应力加载速度为8mm/min，卸载速度为2 mm/min，夹距间距离为4 mm，检测纤维在加载/卸载拉伸过程中的阻尼能力，其中：

阻尼能量的计算方式为，应力加载曲线与卸载曲线之间的回滞环面积。应力，应变直接从机器(Textechno, German)中获取。

阻尼率的计算方式为，应力加载曲线与卸载曲线之间的回滞环面积与应力加载曲线下的总面积之比。应力，应变直接从机器(Textechno, German)中获取。所用数据处理均利用Origin 2024处理。

在每次加载/卸载测试间，通过将纤维置于高湿度环境中，利用纤维的湿响应及动态结构修复特性，实现松弛纤维的回缩及内部结构的恢复与再生，再进行下一次加载/卸载测试。

制备例5的ISRK蛋白纤维的加载/卸载曲线及阻尼性能计算结果分别如图10-11所示。ISRK纤维表现为高阻尼性能材料，在加载/卸载过程中可以通过分子链的摩擦与滑移、内部动态化学键的断裂、以及内部结构的变化等方式来耗散能量，表现出明显的滞回曲线。由计算结果可以得知，ISRK蛋白纤维在20%应变下在首次加载/卸载过程中的阻尼率可达85.73 ± 3.08 %。在进行纤维湿响应修复后，可以实现纤维机械性能及阻尼性能的完美恢复，在第十个加载/卸载过程中的阻尼率仍可达到83.77 ± 2.74 %。

验证例3 蛋白纤维细胞相容性测试

对制备例5中的ISRK蛋白纤维进行细胞相容性测试。3T3细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）在高葡萄糖DMEM培养基中培养，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）。在测试之前，ISRK纤维在紫外灭菌柜中灭菌12小时。处理后的纤维被放置在6孔板中，并与浓度为每皿1×10⁵个细胞的3T3细胞共培养。共培养24小时后，移除培养基，并用PBS缓冲液洗涤细胞三次。随后，分别加入1 µL钙黄绿素-AM（用于标记活细胞）和1 µL碘化丙啶（PI，用于标记死细胞），并与细胞共同孵育10~20分钟。与ISRK蛋白纤维共培养的细胞通过共聚焦显微镜（Nikon C2）在488 nm和561 nm的激发波长下进行观察。结果如图12所示。在视野中可以观察到3T3细胞在纤维周边及纤维表面正常生长，未发现死亡细胞。这表明ISRK蛋白纤维具有较高的生物相容性，无细胞毒性，具有作为生物医用材料的应用潜力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.融合蛋白，其特征在于，包括：鱿鱼环齿蛋白、节肢弹性蛋白和富赖氨酸类弹性蛋白。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述鱿鱼环齿蛋白、所述节肢弹性蛋白和所述富赖氨酸类弹性蛋白依次串联连接；

所述鱿鱼环齿蛋白具有：

(1)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

(2)如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与(1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(3)与(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有80%同一性的氨基酸序列；和/或

所述节肢弹性蛋白具有：

(4)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

(5)如(4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与(4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(6)与(4)或(5)所示的氨基酸序列至少有80%同一性的氨基酸序列；和/或

所述富赖氨酸类弹性蛋白包含n个串联的五肽序列（VPGX₁G）_i-（VPGX₂G）_j；其中：X₁和X₂分别独立地选自赖氨酸、缬氨酸或其它氨基酸；i和j为1-40之间的整数；n为1-40之间的整数。

3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列具有：

(7)如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或

(8)如(7)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与(7)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(9)与(7)或(8)所示的氨基酸序列至少有80%同一性的氨基酸序列。

4.重组蛋白，其特征在于，包括：如权利要求1至3任一项所述的融合蛋白以及功能性表达元件；

所述功能性表达元件位于融合蛋白的N端和/或C端；

所述功能性表达元件包括：组氨酸标签和/或内含肽。

5.如权利要求4所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白具有：

(10)如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；或

(11)如(10)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基获得的氨基酸序列，且与(10)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(12)与(10)或(11)所示的氨基酸序列至少有80%同一性的氨基酸序列。

6.如权利要求1至3任一项所述的融合蛋白和/或如权利要求4或5所述的重组蛋白在制备生物纤维中的应用。

7.生物纤维的制备方法，其特征在于，将如权利要求4或5所述的重组蛋白溶于溶液中获得蛋白溶液，将所述蛋白溶液挤出到凝固浴中固化，获得所述生物纤维。

8.如权利要求7所述的的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白在蛋白溶液中的质量分数为150~200 mg/mL；和/或

所述凝固浴为0.5~5 %（v/v）的戊二醛-水溶液；和/或；

获得所述生物纤维后还包括对生物纤维的后拉伸，具体步骤包括：将所述生物纤维浸泡变软后，将所述生物纤维拉伸至原长的2~5倍，得后拉伸的所述生物纤维。

9.生物材料，其特征在于，包括：(A1)至(A5)中的至少一种：

(A1)编码如权利要求1至3任一项所述融合蛋白或如权利要求4或5所述重组蛋白的核酸分子；

(A2)含有(A1)所述核酸分子的表达盒；

(A3)含有(A1)所述核酸分子或(A2)所述表达盒的重组载体；

(A4)转化和/或转染(A3)所述重组载体的宿主；

(A5)培养如(A4)所述宿主细胞获得的混合物。

10.如权利要求1至3任一项所述融合蛋白、如权利要求4或5所述重组蛋白、如权利要求7或8所述制备方法获得的生物纤维和/或如权利要求9所述生物材料在如下任意项中的应用；

(B1)运动和/或防护装备；

(B2)纸产品；

(B3)薄膜；

(B4)纺织品；

(B5)涂层；

(B6)医用材料或生物材料。