CN120775817B - 糖基转移酶突变体、蔗糖合成酶突变体及其在合成莱鲍迪苷m中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及糖基转移酶突变体、蔗糖合成酶突变体及其在合成莱鲍迪苷M中的应用。本发明通过定向进化理论对野生型糖基转移酶、野生型蔗糖合成酶进行改造，获得糖基转移酶突变体和蔗糖合成酶突变体。通过糖基转移酶突变体和蔗糖合成酶突变体共表达菌株催化莱鲍迪苷D得到莱鲍迪苷M，催化效率优于野生酶。通过糖基转移酶突变体和蔗糖合成酶突变体共表达菌株完全催化110 g/L莱鲍迪苷D得到莱鲍迪苷M仅需要20 h，转化率达到97%，莱鲍迪苷M产量达到122 g/L，有效地提升了原料转化率、莱鲍迪苷M产率，同时缩短了合成时间。

Description

糖基转移酶突变体、蔗糖合成酶突变体及其在合成莱鲍迪苷M 中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及糖基转移酶突变体、蔗糖合成酶突变体及其在合成莱鲍迪苷M中的应用。

背景技术

甜叶菊是一种源于南美洲的菊科草本植物，其所含的甜菊糖苷具有甜度高、热量极低、稳定性好等特点，被誉为“第三代健康糖源”和“最佳天然甜味剂”。甜菊糖苷主要存在于甜叶菊叶片中，含量最多的为甜菊苷Stevioside（占叶片干重的5~10%）、莱鲍迪苷A（Rebaudioside A）（占叶片干重的2~4%）和莱鲍迪苷C（Rebaudioside C）（占叶片干重的1~2%），其余的50多种糖苷如莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷E等则含量极低。

甜菊糖苷甜度约为蔗糖的200~350倍，而热量仅为蔗糖的200~300分之一，是一种优质的甜味剂替代品，已被应用于巧克力、酸奶、果酱、饮料中。研究表明，甜菊糖苷在辅助治疗糖尿病、高血压、结肠炎、肝硬化等方面均有作用，故甜菊糖苷在食品、饮品及药物领域具备广阔应用空间。

甜菊糖苷具有共同的甜菊醇单元，在此结构上通过在甜菊醇单元的C-13和C-19位上添加不同数量和类型的糖基，形成口味及理化性质各异的多种甜菊糖苷。由于甜菊苷和莱鲍迪苷A具有后苦味，所以莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M被认为是较理想的甜味剂。而依据甜度及口感排序，莱鲍迪苷M要优于莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷A。

由于莱鲍迪苷M在植物中含量极低，故不能通过植物提取的方法进行提取，且化学合成法工艺复杂、耗能高且对环境有害，亦不利于莱鲍迪苷M的大规模生产。甜菊糖苷的生物转化法是目前实现甜菊糖苷工业化生产的最经济有效的方式，甜菊糖苷的生物转化的方法包括生物酶催化合成，然而，目前的生物酶催化合成需要外源加入昂贵的原料二磷酸尿苷葡萄糖（UDP-葡萄糖），在葡萄糖基转移酶的催化下合成莱鲍迪苷M；此外，葡萄糖基转移酶多为来源于植物细胞中的野生酶，往往存在酶活低的缺点，进一步加剧了大规模生产莱鲍迪苷M的成本。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供了糖基转移酶突变体、蔗糖合成酶突变体及其在合成莱鲍迪苷M中的应用。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了酶突变体，包括糖基转移酶突变体和蔗糖合成酶突变体，其中，糖基转移酶突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型糖基转移酶的第85位亮氨酸突变为甘氨酸、第136位丝氨酸突变为赖氨酸、第140位精氨酸突变为脯氨酸、第175位亮氨酸突变为天冬氨酸、第239位的丙氨酸突变为缬氨酸以及第422位的酪氨酸突变为谷氨酸；

蔗糖合成酶突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的野生型蔗糖合成酶的第61位甘氨酸突变为天冬氨酸、第112位缬氨酸突变为丙氨酸、第225位苏氨酸突变为精氨酸、第324位苯丙氨酸突变为丙氨酸、第459位谷氨酰胺突变为赖氨酸、第549位苏氨酸突变为脯氨酸以及第733位苏氨酸突变为半胱氨酸。

本发明的第二个方面，提供编码第一个方面中酶突变体的基因。

本发明的第三个方面，提供一种表达盒，包含第二方面所述的基因。

本发明的第四个方面，提供一种重组表达载体，包含第二方面所述的基因。

本发明的第五个方面，提供一种重组菌，包含第二方面所述的基因。

本发明的第六个方面，提供一种转基因细胞系，包含第二方面所述的基因。

本发明的第七个方面，提供第一方面所述的酶突变体或第二方面所述的基因或第五方面所述的重组菌在催化合成莱鲍迪苷M中的应用。

本发明的第八个方面，提供一种催化合成莱鲍迪苷M的方法，包括如下步骤：

以第五方面所述的重组菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体破碎提取的粗酶液为催化剂，以莱鲍迪苷D为底物，反应合成莱鲍迪苷M。

在一种或多种实施方式中，反应条件包括：反应液为pH为7~8的磷酸盐缓冲液，反应温度为35~45 ℃，优选为40 ℃；反应转速为200~500 rpm，优选为300 rpm。

在一种或多种实施方式中，催化剂的用量以湿菌体总重量计为5~45 g/L，所述底物的初始浓度为50~120 g/L。

在一种或多种实施方式中，加入蔗糖作为辅助底物，蔗糖的初始浓度为30~100 g/L。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明通过定向进化理论对野生型糖基转移酶、野生型蔗糖合成酶进行改造，获得糖基转移酶突变体和蔗糖合成酶突变体。通过糖基转移酶突变体和蔗糖合成酶突变体共表达菌株催化莱鲍迪苷D得到莱鲍迪苷M，催化效率优于野生酶，催化效率提升了15倍。

（2）目前生物酶催化法合成莱鲍迪苷M的方法通常需要外加昂贵的UDP-葡萄糖为底物，而本发明通过蔗糖合成酶突变体构建蔗糖合成酶-UDPG辅酶循环系统，以莱鲍迪苷D为底物，蔗糖为辅助底物，通过糖基转移酶突变体和蔗糖合成酶突变体共表达菌株完全催化110 g/L莱鲍迪苷D得到莱鲍迪苷M仅需要20 h，转化率达到97%，莱鲍迪苷M产量达到122g/L，有效地提升了原料转化率、莱鲍迪苷M产率，同时缩短了合成时间。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为E.coliBL21(DE3)/pETduet-SrUGT-L85G-S136K-R140P-L175D-A239V-Y422E-MsSUS-G61D-V112A-T225R-F324A-Q459K-T549P-T733C催化莱鲍迪苷D合成莱鲍迪苷M的反应进程图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

以下实施例中所使用的培养基配方以及高效液相色谱检测方法如下：

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L，溶剂为水，pH为7.4。

LB平板：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L，18 g/L琼脂，溶剂为水，pH为7.4。

样品处理：取20 μL反应结束的样品，稀释10倍，加入16 μL 2M的H₂SO₄溶液和160 μL 60%（体积比）的甲醇溶液终止反应，经0.22 μm滤膜过滤，进行HPLC检测。

高效液相色谱（HPLC）检测产物莱鲍迪苷M浓度，分析方法为：色谱柱型号：QS-C18，5 μm，4.6×250 mm；流动相为A（水）:B（乙腈）=68:32，进样量10 μL；检测波长210 nm；检测时间为：18 min；流速：0.5 mL/min；柱温：40 ℃。

实施例1

在NCBI数据库中挖掘来源于甜叶菊Stevia rebaudiana糖基转移酶，NCBI登录号为ACM47734.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。挖掘来源于甲基杆菌Methylocaldum szegediense蔗糖合成酶，NCBI登录号为WP_317963626.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成。

根据SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列以及pET-28a载体序列设计引物F1（SEQ ID NO.5）、R1（SEQ ID NO.6）、F2（SEQ ID NO.7）、R2（SEQ ID NO.8）、F3（SEQ IDNO.9）和R3（SEQ ID NO.10）。

以pET-28a质粒为表达载体，构建重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-SrUGT和E.coliBL21(DE3)/pET-28a-MsSUS。

重组质粒的构建：在引物F1/R1和F2/R2的引发下，以目的基因（SEQ ID NO.1）为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得带有同源臂的糖基转移酶基因序列，以pET-28a质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得线性化载体序列，并利用同源重组酶将该目的基因与线性化载体进行同源重组，构建重组质粒pET-28a-SrUGT。在引物F3/R3和F2/R2的引发下，以目的基因（SEQ ID NO.2）为模板，构建过程参考pET-28a-SrUGT，构建重组质粒pET-28a-MsSUS。

感受态细胞的制备：从-80 ℃冰箱中获得甘油管保藏的E.coliBL21（DE3）菌株，在无抗LB平板上划线，37 ℃培养10 h，获取单菌落；挑取LB平板的单菌落，接种至含5 mL的LB液体培养基的试管中，37 ℃、180 rpm培养9 h；从试管中取200 μL菌液，接种到50 mL的LB液体培养基中，37 ℃、180 rpm培养OD₆₀₀至0.4~0.6；将菌液在冰上预冷，取菌液至灭菌的离心管中，冰上放置10 min，4 ℃、5000 rpm离心10 min；将上清液倒出，注意防止染菌，用预冷的0.1 mol/L的CaCl₂水溶液重悬沉淀细胞，并在冰上放置30 min；4 ℃、5000 rpm离心10min，弃上清，用预冷的含15%（体积分数）甘油的0.1 mol/L的CaCl₂水溶液重悬沉淀细胞，取100 μL重悬细胞分装至灭菌的1.5 mL离心管中，保藏于-80 ℃冰箱，需要时取出。

重组大肠杆菌的构建：首先将储藏于-80 ℃的大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞在0℃冰浴10 min，然后在超净台内加入5 µL的连接产物，0 ℃冰浴30 min，42 ℃水浴中热击90 s，0 ℃冰浴2 min，加入600 µL的LB培养基，在37 ℃、200 rpm摇床培养1 h；涂布于含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37 ℃下培养8~12 h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/ pET-28a-SrUGT和E.coliBL21(DE3)/ pET-28a-MsSUS。

实施例2

含糖基转移酶基因和蔗糖合成酶基因的湿菌体：分别将实施例1获得的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/ pET-28a-SrUGT和E.coliBL21(DE3)/ pET-28a-MsSUS接种至含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37 ℃、200 rpm下培养12 h，再以1%（v/v）接种量接种至新鲜的含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37 ℃、200 rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6~0.8，加入终浓度为0.1 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），25 ℃下诱导培养16 h后，4 ℃、8000 rpm离心20 min，弃去上清液，收集沉淀，分别获得含糖基转移酶和蔗糖合成酶的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/ pET-28a-SrUGT和E.coliBL21(DE3)/pET-28a-MsSUS的湿菌体。将湿菌体加入pH为7.5、100 mM的磷酸盐缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎5 min，超声破碎条件：功率为200 W，破碎1 s，暂停2 s，获得粗酶液。

实施例3 糖基转移酶基因突变文库的建立

定点突变：以实施例1构建的E.coliBL21(DE3)/ pET-28a-SrUGT为出发菌株。通过定向进化理论方法进行改造，选择V20F、F65A、L85G、A111E、S136K、R140P、H153L、L175D、I234A、A239V、F265L、V339A、A376P、Y422E和Q425E位点进行定点突变，引物设计如表1和表2所示。

突变PCR体系（100 μL）为：2×Phanta Max 缓冲液25 μL，dNTPs 1 μL，突变上下游引物各1 μL，模板（出发菌株）1 μL，Pfu DNA聚合酶0.5 μL，补ddH₂O至50 μL。PCR条件为：95℃预变性3 min，经30个循环：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 7 min20 s，最后72 ℃终延伸10 min。PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，将PCR产物进行DpnI酶消化模板，37 ℃、1 h、200 rpm，65 ℃、1 min灭活，将PCR产物热击转化，并将大肠杆菌E. coliBL21(DE3)活化，置于37 ℃、200 rpm，培养1 h，涂布于含50 μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37 ℃倒置培养过夜。

表1 糖基转移酶定点突变引物设计

表2 糖基转移酶定点突变引物设计

实施例4 糖基转移酶基因突变文库的筛选

（1）将实施例3获得的平板上挑取单克隆，接种至含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37 ℃、200 rpm下培养12 h，保藏菌种并送至测序公司测序验证，测序验证正确后，将保藏菌种以0.2%（v/v）接种量接种至含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37 ℃、200 rpm下培养12 h，再以1%（v/v）接种量接种至新鲜的含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37 ℃、200 rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6~0.8，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，25 ℃下诱导培养16 h后，4℃、8000 rpm离心20 min，弃去上清液，收集沉淀，即获得糖基转移酶基因突变文库的湿菌体。将湿菌体加入pH为7.5、100 mM的磷酸盐缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎5 min，超声破碎条件：功率为200 W，破碎1 s，暂停2 s，获得SrUGT粗酶液。

（2）SrUGT初筛：

配置反应液（200 μL）：终浓度50 g/L底物莱鲍迪苷D，2%（体积分数）的二甲基亚砜DMSO助融底物，终浓度为25 g/L的UDPG，催化剂用量以破碎前湿菌体总重量计10 g/L，以pH为7.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应液。反应条件：40 ℃、500 rpm的反应器上反应3 h后，反应结束后取20 μL反应结束的样品，稀释10倍，加入16 μL 2 M的H₂SO₄溶液和160 μL60%（体积分数）的甲醇溶液终止反应，经0.22 μm滤膜过滤，进行HPLC检测，检测结果如表3所示。

表3 初筛反应结果

（3）SrUGT复筛：

将初筛获得的菌株进行复筛，复筛组合突变体并送至测序公司测序验证，测序验证正确后，再进行活力验证。复筛配置反应液（5 mL）：终浓度100 g/L底物莱鲍迪苷D，3%（体积分数）的二甲基亚砜DMSO助融底物，终浓度为55 g/L的UDPG，催化剂用量以破碎前湿菌体总重量计10 g/L，以pH为7.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应液；反应条件：40℃、500rpm的反应器上反应2 h后，反应结束后取20 μL反应结束的样品，稀释20倍，加入16 μL 2M的H₂SO₄溶液和160 μL 60%（体积分数）的甲醇溶液终止反应，经0.22 μm滤膜过滤，进行HPLC检测，检测结果如表4所示，获得活力最高菌株E.coliBL21(DE3)/ Pet-28a-SrUGT-L85G-S136K-R140P-L175D-A239V-Y422E。

表4 复筛反应结果

实施例5

定点突变：以实施例1构建的E.coliBL21(DE3)/ pET-28a-MsSUS为出发菌株。通过定向进化理论方法进行改造，选择D8R、G61D、V112A、N162S、T225R、T270R、F324A、S397A、Q459K、M505L、T549P、V589T、T733C和M764C位点进行定点突变，引物设计如表5和表6所示。

突变PCR体系（100μL）为：2×Phanta Max 缓冲液25 μL，dNTPs 1 μL，突变上下游引物各1 μL，模板（出发菌株）1 μL，Pfu DNA聚合酶0.5 μL，补ddH₂O至50 μL。PCR条件为：95℃预变性3 min，经30个循环：95℃ 15 s，60℃ 15 s，72 ℃ 7 min20 s，最后72 ℃终延伸10 min。PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，将PCR产物进行DpnI酶消化模板，37 ℃，1 h，200 rpm，65 ℃，1 min灭活，将PCR产物热击转化，并将大肠杆菌E. coliBL21(DE3)活化，置于37 ℃、200 rpm，培养1 h，涂布于含50 μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜。

表5 蔗糖合成酶定点突变引物设计

表6 蔗糖合成酶定点突变引物设计

实施例6 蔗糖合成酶基因突变文库的筛选：

（1）将实施例3获得的平板上挑取单克隆，接种至含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37 ℃、200 rpm下培养12 h，保藏菌种并送至测序公司测序验证，测序验证正确后，将保藏菌种以0.2%（v/v）接种量接种至含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37 ℃、200 rpm下培养12 h，再以1%（v/v）接种量接种至新鲜的含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37 ℃、200 rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6~0.8，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，25 ℃下诱导培养16 h后，4 ℃、8000 rpm离心20 min，弃去上清液，收集沉淀，即获得蔗糖合成酶基因突变文库的湿菌体。将湿菌体加入pH为7.5、100 mM的磷酸盐缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎5 min，超声破碎条件：功率为200 W，破碎1 s，暂停2 s，获得MsSUS粗酶液。

（2）MsSUS初筛：

配置反应液（200 μL）：终浓度50 g/L底物莱鲍迪苷D，终浓度40 g/L辅底物蔗糖，2%（体积分数）的二甲基亚砜DMSO助融底物，终浓度以破碎前湿菌体总重量计25 g/L的E.coliBL21(DE3)/ Pet-28a-SrUGT-L85G-S136K-R140P-L175D-A239V-Y422E，MsSUS突变体催化剂用量以破碎前湿菌体总重量计15 g/L，以pH 7.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应液。反应条件：40 ℃、500 rpm的反应器上反应5 h后，反应结束后取20 μL反应结束的样品，稀释10倍，加入16 μL 2 M的H₂SO₄溶液和160 μL 60%（体积分数）的甲醇溶液终止反应，经0.22 μm滤膜过滤，进行HPLC检测，检测结果如表7所示。

表7 初筛反应结果

（3）MsSUS复筛：

将初筛获得的菌株进行复筛，复筛组合突变体并送至测序公司测序验证，测序验证正确后，再进行活力验证。复筛配置反应液（5 mL）：终浓度100 g/L底物莱鲍迪苷D，终浓度80 g/L辅底物蔗糖，3%（体积分数）的二甲基亚砜DMSO助融底物，终浓度以破碎前湿菌体总重量计25 g/L的E.coliBL21(DE3)/ Pet-28a-SrUGT-L85G-S136K-R140P-L175D-A239V-Y422E，MsSUS突变体催化剂用量以破碎前湿菌体总重量计15 g/L，以pH 7.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应液。反应条件：40 ℃、500 rpm的反应器上反应5 h后，反应结束后取20μL反应结束的样品，稀释20倍，加入16 μL 2M的H₂SO₄溶液和160 μL 60%（体积分数）的甲醇溶液终止反应，经0.22 μm滤膜过滤，进行HPLC检测，检测结果如表8所示，获得活力最高菌株E.coliBL21(DE3)/ Pet-28a-MsSUS- G61D-V112A-T225R-F324A-Q459K-T549P-T733C。

表8 复筛反应结果

实施例7 糖基转移酶SrUGT-L85G-S136K-R140P-L175D-A239V-Y422E与蔗糖合成酶MsSUS- G61D-V112A-T225R-F324A-Q459K-T549P-T733C共表达菌株的构建：

为降低生产成本，构建糖基转移酶和蔗糖合成酶共表达菌株，通过将实施例4获得的活力最高的糖基转移酶SrUGT-L85G-S136K-R140P-L175D-A239V-Y422E与实施例6获得活力最高的蔗糖合成酶MsSUS-G61D-V112A-T225R-F324A-Q459K-T549P-T733C共表达菌株。

根据SrUGT-L85G-S136K-R140P-L175D-A239V-Y422E和MsSUS-G61D-V112A-T225R-F324A-Q459K-T549P-T733C核苷酸序列以及pET-Duet载体序列设计引物F4（SEQ IDNO.11）/R4（SEQ ID NO.12）、F5（SEQ ID NO.13）/R5（SEQ ID NO.14）、F6（SEQ ID NO.15）/R6（SEQ ID NO.16）、F7（SEQ ID NO.17）/R7（SEQ ID NO.18）。利用同源重组将SrUGT-L85G-S136K-R140P-L175D-A239V-Y422E构建到pET-Duet载体第一克隆位点NcoI-NotI酶切位点之间，表达质粒的构建：在引物F4/R4的引发下，以目的基因为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得带有同源臂的SrUGT-L85G-S136K-R140P-L175D-A239V-Y422E基因序列，在引物F5/R5的引发下，以pETduet质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得线性化载体序列，并利用同源重组酶将该目的基因与线性化载体进行同源重组，重组产物转化过程参考实施例1，经过测序验证，获得质粒pETduet-SrUGT-L85G-S136K-R140P-L175D-A239V-Y422E。第二个克隆位点(NdeI-XhoI)MsSUS-G61D-V112A-T225R-F324A-Q459K-T549P-T733C的构建参考pETduet-SrUGT-L85G-S136K-R140P-L175D-A239V-Y422E质粒的构建。

实施例6 共表达菌株在催化合成莱鲍迪苷M中的应用

将实施例5获得的共表达菌株E.coliBL21(DE3)/ pETduet-SrUGT-L85G-S136K-R140P-L175D-A239V-Y422E-MsSUS-G61D-V112A-T225R-F324A-Q459K-T549P-T733C接种到含终浓度50 μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养9 h，作为种子液，以体积浓度3.5%的接种量接入装有3 L发酵培养基的5 L的发酵罐中培养。在37 ℃、500 rpm培养3~4 h左右，菌种密度OD为6~8达到要求，将发酵罐温度降至25 ℃后，加入终浓度为5 g/L的乳糖作为诱导剂加入，然后在25 ℃、500 rpm培养12 h；将培养好的发酵液8000 rpm离心10min，获得共表达菌株E.coliBL21(DE3)/ pETduet-SrUGT-L85G-S136K-R140P-L175D-A239V-Y422E-MsSUS-G61D-V112A-T225R-F324A-Q459K-T549P-T733C的湿菌体，所获得的湿菌体利用高压匀浆机进行破碎。

其中，发酵罐培养基组成：胰蛋白胨45 g、酵母提取物36 g、氯化钠30 g、磷酸二氢钾4.08 g、丙三醇（甘油）45 g、三水合磷酸氢二钾6.84 g、硫酸铵15 g、硫酸镁1.125 g、消泡剂4 g，加入蒸馏水定容至3 L进行溶解。

催化剂用量以高压匀浆之前湿菌体总重量计40 g/L，终浓度110 g/L底物莱鲍迪苷D，终浓度为80 g/L的蔗糖，3%（体积分数）的二甲基亚砜DMSO助融底物，以pH为7.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应液总体积为1 L；反应条件：40 ℃、500 rpm反应20 h，反应结束后取20 μL反应结束的样品，稀释20倍，加入16 μL 2M的H₂SO₄溶液和160 μL 60%（体积分数）的甲醇溶液终止反应，经0.22 μm滤膜过滤，进行HPLC检测，反应进程曲线如图1所示，反应结束后莱鲍迪苷M的浓度达到122 g/L，转化率达到97%。

对比例：原始共表达菌株E.coliBL21(DE3)/ pETduet-SrUGT-MsSUS（没有经过突变），催化剂用量以高压匀浆之前湿菌体总重量计40 g/L，终浓度110 g/L底物莱鲍迪苷D，终浓度为80 g/L的蔗糖，3%（体积分数）的二甲基亚砜DMSO助融底物，以pH为7.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应液总体积为1 L；反应条件：40 ℃、500 rpm反应20 h，反应结束后取20 μL反应结束的样品，稀释20倍，加入16 μL 2M的H₂SO₄溶液和160 μL 60%（体积分数）的甲醇溶液终止反应，经0.22 μm滤膜过滤，进行HPLC检测，反应结束后莱鲍迪苷M的浓度达到8.2 g/L，转化率达到6.5 %。

通过糖基转移酶突变体和蔗糖合成酶突变体共表达菌株催化莱鲍迪苷D得到莱鲍迪苷M，催化效率优于野生酶，催化效率提升了15倍。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.酶突变体，其特征在于，包括糖基转移酶突变体和蔗糖合成酶突变体；其中，糖基转移酶突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型糖基转移酶的第85位亮氨酸突变为甘氨酸、第136位丝氨酸突变为赖氨酸、第140位精氨酸突变为脯氨酸、第175位亮氨酸突变为天冬氨酸、第239位的丙氨酸突变为缬氨酸以及第422位的酪氨酸突变为谷氨酸；

蔗糖合成酶突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的野生型蔗糖合成酶的第61位甘氨酸突变为天冬氨酸、第112位缬氨酸突变为丙氨酸、第225位苏氨酸突变为精氨酸、第324位苯丙氨酸突变为丙氨酸、第459位谷氨酰胺突变为赖氨酸、第549位苏氨酸突变为脯氨酸以及第733位苏氨酸突变为半胱氨酸。

2.编码权利要求1所述的酶突变体的基因。

3.一种表达盒，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。

4.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。

5.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。

6.一种转基因细胞系，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。

7.权利要求1所述的酶突变体或权利要求2所述的基因或权利要求5所述的重组菌在催化合成莱鲍迪苷M中的应用。

8.一种催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，包括如下步骤：

以权利要求5所述的重组菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体破碎提取的粗酶液为催化剂，以莱鲍迪苷D为底物，反应合成莱鲍迪苷M。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，反应条件包括：反应液为pH为7~8的磷酸盐缓冲液，反应温度为35~45 ℃；反应转速为200~500 rpm。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，催化剂的用量以湿菌体总重量计为5~45 g/L；所述底物的初始浓度为50~120 g/L；

加入蔗糖作为辅助底物，蔗糖的初始浓度为30~100 g/L。