CN120775803A - 一种识别α-酮酸的Pictet-Spengler酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种识别α‑酮酸的Pictet‑Spengler酶及其应用。本发明从放线菌Amycolatopsis pittospori NRRL B‑65536^T中克隆得到Pictet‑Spengler酶基因apksB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长为960 bp，其编码的Pictet‑Spengler酶ApKslB的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共包含319个氨基酸；通过克隆Pictet‑Spengler酶基因apkslB并将其连接表达载体pET28a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达，纯化得到的Pictet‑Spengler酶ApKslB作为催化剂可催化L‑色氨酸和α‑酮戊二酸反应生产四氢β‑咔啉骨架kitasetalic acid。Pictet‑Spengler酶ApKslB的发现和功能鉴定对生物碱的大规模生产具有实际指导意义，可用于生物、医药、精细化工等领域。

Description

一种识别α-酮酸的Pictet-Spengler酶及其应用

技术领域

本发明属于微生物生理与生物化学领域，具体涉及一种Pictet-Spengler酶的功能鉴定及其应用。

背景技术

Pictet-Spengler（P-S）反应是指具有苯乙胺结构的化合物与醛或酮反应形成席夫碱，接着通过Friedel-Crafts 环化，形成异喹啉或β-咔啉生物碱类化合物的过程。该反应广泛应用于有机化学中天然产物和新型杂环物质的构建。它是1911年由Pictet和Spengler 首次发现的， 尽管它已有百年历史，至今仍是合成四氢异喹啉和β-咔啉衍生物的最为有效方法。自然界中，四氢异喹啉和β-咔啉是两种具有如抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗氧化等重要生物活性的生物碱。因此，作为多种生物碱合成过程中的基础反应，P-S 反应近年来受到广泛关注。P-S 反应在形成新的杂环体系中，原来的醛基碳原子成为一个新的手性中心，简单 P-S 反应得到的是外消旋混合物。然而，具有重要生物活性的物质往往是具有立体专一性的，因此，采用不同的不对称合成法，合成具有立体专一性的目标产物已成为P-S反应研究的热点，对于药物合成和天然产物全合成有十分重要的意义。由于自然界中存在具有立体专一性的天然产物，因此人们推测， 自然界中存在能手性催化该类反应的物质，而生物体内的酶无疑是目前最完善的不对称合成技术中的关键，它作为一种具有高度立体专一性的生物催化剂引起人们的重视。

由酶催化的P-S反应在自然界中相对较少，迄今，从植物及动物脑内仅纯化和鉴定得到少数几种能催化P-S反应的酶，该类酶物质统称为“Pictet-Spengler酶”。该类酶中，有些为抗癌植物生物碱合成代谢途径中的关键酶，另一些酶的研究显示与帕金森氏病（PD）的致病机理相关。因此，将该类酶分离纯化并开展其生物学特性研究，具有重要的医学价值和社会意义。同时，对生物碱的大规模生产具有实际指导意义。

然而，迄今为止，从细菌中鉴定功能的P-S酶已有多例，但大部分仅能识别醛类作为底物，仅有KslB可以识别α-酮戊二酸，其编码基因kslB在异源宿主Streptomycesavermitilis SUKA22 中表达时可产生四氢 β-咔啉类化合物kitasetalic acid，该化合物可以抑制人骨肉瘤细胞系U2OS和人宫颈癌细胞系HeLa中葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的表达，同时不会导致细胞死亡（Engineered production of kitasetalic acid, a newtetrahydro-β-carboline with the ability to suppress glucose-regulated proteinsynthesis, Shohei Ueda, Shigeru Kitani, Takushi Namba, Masayoshi Arai, HaruoIkeda, Takuya Nihira, The Journal of antibiotics, 71(10), 854–861），后续有可能作为与抗癌药物共同治疗的先导化合物进行研究。后续生化实验也证实KslB可以在体外催化L-色氨酸和α-酮戊二酸生产kitasetalic acid（In vitro characterization ofkitasetaline biosynthesis reveals a bifunctional P450 decarboxylase and avinyl β-carboline intermediate susceptible to nonenzymatic thiol addition.Ziyang Zheng, Heewon Choi, Hung-Wen Liu. Journal of the American ChemicalSociety, 2024,146, 41, 28553- 28560）。

然而目前仅有1个P-S酶KslB能够识别α-酮酸，这严重制约了该家族酶的系统研究，并限制了其在生物、医药、精细化工等方面的应用。因此，未来应致力于新酶的发现，不断增添该家族的成员，并通过氨基酸或基因序列分析，以找出其序列同源性，为P-S酶的定向进化及系统研究打下基础。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种Pictet-Spengler酶及其编码基因。

本发明所提供的Pictet-Spengler酶，来源于放线菌Amycolatopsis pittosporiNRRL B-65536^T ，是如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）如SEQ ID NO.2所示的氨基酸组成的蛋白质

（b）由（a）的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有Pictet-Spengler酶活性的由（a）衍生的蛋白质。

其中，SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，由319个氨基酸组成，分子量约为36.42kDa。

上述（a）和（b）中的P-S酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

SEQ ID NO.1（序列表）所示序列的第1-960位的碱基序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。且第1-960位的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应（PCR）或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或DNA体外合成技术或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分SEQ ID NO.1所示序列的第1-960位中DNA序列的重组DNA载体的途径。

本发明所提供的核苷酸列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应（PCR）的方法或包含本发明SEQ ID NO.1所示序列的第1-960位的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与apkslB相似的基因。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被体内体外修饰或进行突变，包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过紫外线或化学试剂诱变等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性物质或产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、小单孢菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并了解它们在宿主代谢中的功能。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组载体以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得其他新型生物合成途径或者产生新的化合物。

本发明还提供了编码上述Pictet-Spengler酶的编码基因。

优选，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了含有上述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系和/或表达盒。

本发明还提供了上述Pictet-Spengler酶或其编码的基因在制备四氢β-咔啉骨架中的应；

所述的四氢β-咔啉骨架的结构式如下所示：

式（Ⅰ）。

优选，是Pictet-Spengler酶催化L-色氨酸 和α-酮戊二酸合成四氢β-咔啉骨架中的应用。

总之，本发明所提供的Pictet-Spengler酶ApKslB的基因和蛋白信息，可用于生产四氢β-咔啉骨架，增强人们对Pictet-Spengler酶的认识，为进一步遗传改造提供了材料和理论基础。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物、基因或蛋白。

本发明的假诺卡氏菌科（Pseudonocardiaceae）Amycolatopsis pittospori NRRLB-65536^T是放线菌新种，公开于非专利文献（Amycolatopsis pittospori sp. nov., anendophytic actinobacterium isolated from native apricot tree and genomemining revealed the biosynthesis potential as antibiotic producer and plantgrowth promoter. Onuma Kaewkla, Christopher Milton Mathew Franco. Antonie vanLeeuwenhoek. 2021年, 114卷, 4期, 365-377）。该菌株保藏于美国农业研究菌种保藏中心，本申请人也持有，并保藏自申请日起20年向公众提供。

附图说明

图1是四氢β-咔啉生物碱类kitasetalic acid(1)的化学结构。

图2是P-S酶ApKslB催化L-色氨酸(L-tryptophan)和α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)反应生成kitasetalic acid(1)的化学反应式。

图3是ApKslB纯化的SDS-PAGE分析结果。其中泳道1指标准蛋白Marker；泳道2是菌体破碎离心得到的上清液；泳道3是纯化得到的ApKslB蛋白。

图4 是ApKslB在不同pH条件下催化L-色氨酸和α-酮戊二酸反应产物的HPLC分析结果。(A) i：对照实验，煮沸灭活的ApKslB；ii–ix：反应pH分别为4、5、6、7、7.5、8、9和10；(B) i：对照实验，煮沸灭活的ApKslB；ii–xiii：反应pH分别为7、7.2、7.4、7.5、7.6、7.8、8.0；其中1代表图1所示的化合物

图5 是ApKslB在不同温度下催化L-色氨酸和α-酮戊二酸反应产物的HPLC分析结果。

(A) i：对照实验，煮沸灭活的ApKslB；ii–xiii：分别为15 °C、20 °C、25 °C、30 °C、37 °C、42 °C和50 °C；(B) i：对照实验，煮沸灭活的ApKslB；ii–xii：分别为20°C、22°C、24°C、26°C、28°C、30°C；其中1代表图1所示的化合物。

图6 是ApKslB在不同反应时长下催化L-色氨酸和α-酮戊二酸反应产物的HPLC分析结果。

i：0 min；ii：5min；iii：10min； iv：20min； v：30min； vi： 40min；vii：50min；viii：60min； ix：90min；x：120min； xi：16 h；其中1代表图1所示的化合物。

图7 是ApKslB在不同辅因子存在条件下催化L-色氨酸和α-酮戊二酸反应产物的HPLC分析结果。i：对照实验，煮沸灭活的ApKslB；ii：ApKslB； iii：NAD/NADH；iv：NADP/NADPH； v：FAD/FADH₂；vi：ATP；vii：GTP；viii：CoA；其中1代表图1所示的化合物。

图8 是ApKslB在不同金属离子存在条件下催化L-色氨酸和α-酮戊二酸反应产物的HPLC分析结果。i：对照实验，煮沸灭活的ApKslB；ii：ApKslB；iii：Ca²⁺；iv：Mg²⁺；v：Cu²⁺；vi：Fe²⁺；vii：Co²⁺；viii：Cd²⁺；ix：Fe³⁺；其中1代表图1所示的化合物。

图9是L-色氨酸和α-酮戊二酸（结构见图1）作为底物在P-S酶ApKslB的催化作用下生成相应的四氢β-咔啉骨架化合物1的类似物的HPLC分析图（反应温度为26℃）。i：L-Trp标准品； ii：对照实验，煮沸灭活的ApKslB；i：ApKslB； iv：化合物1的标准品。其中1代表图1所示的化合物。

图10为化合物1的高分辨质谱结果。化合物1：HR-ESI-MS(+) m/z [M+H]⁺=333.10757（cacld for C₁₆H₁₇N₂O₆, 333.1081）。

图11和12分别是化合物1的¹H和¹³C的核磁共振谱的结果。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

1.已鉴定功能酶KslB的生物信息学分析。

通过对放线菌Kitasatospora setae NBRC 14216^T中kitasetaline生物合成基因簇中kslB的编码蛋白KslB进行Blast分析，从中得到一个与KslB的一致性为68%的ApKslB（登录号为WP_181770581.1），对应的编码基因命名为apkslB。设计引物对apkslB进行表达，得到的重组表达菌株为E. coli BL21（DE3）/pET28a（+）/apkslB。

2.ApKslB的体外酶反应和产物的鉴定。

对重组菌株E. coli BL21（DE3）/pET28a（+）/apkslB进行表达获得ApKslB粗酶液，通过镍亲和层析纯化、SDS-PAGE电泳、Bradford含量测定、体外酶反应及产物鉴定证明，酶ApKslB负责L-色氨酸和α-酮戊二酸的缩合反应，进而产生化合物1（图2），酶反应产物均通过高分辨质谱鉴定（图10）。进而通过高效液相色谱对目标化合物1进行制备，得到10 mg样品，进一步采用核磁共振波谱法进行鉴定（图11和12）

我们通过体外生化反应鉴定了ApKslB的功能，同时提供了一种通过酶反应制备四氢β-咔啉骨架（化合物1）的方法。

以下进一步提供实施例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限制本发明的应用范围。

实施例1

apkslB基因（SEQ ID NO.1所示1-960的序列）在 E. coli BL21（DE3）中的表达：

根据NCBI上Amycolatopsis pittospori NRRL B-65536^T菌株中已有apkslB（登录号为WP_181770581.1）的DNA序列，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因全合成，克隆至pET28a(+)载体（两端分别设计酶切位点Nde I和Hind III），得到重组表达载体pET28a（+）/apkslB，转化E. coli BL21 (DE3)从而得到重组表达菌株E. coli BL21（DE3）/pET28a（+）/apkslB。

实施例2

P-S酶ApKslB的表达、亲和层析纯化、SDS-PAGE电泳分析和Bradford法含量测定、体外生化反应及产物鉴定：

将E. coli BL21/pET28a（+）/apkslB过夜培养后，按体积比1%的接种量接入到1 L三角瓶（共计15个）的300 mL LB培养液体，于37 ℃摇床200 r/min培养至OD₆₀₀约为0.6时，往培养物中加入终浓度为0.04 mmol/L的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。再于16℃ 160 r/min继续培养20 h，4000 r/min离心10 min收集菌体，用20 mmol/L HEPES缓冲液（pH7.0）洗涤菌体两次，最后重悬于15-20 mL的Binding Buffer中（20 mmol/L HEPES，pH7.0，200 mmol/L NaCl，5 mmol/L imidazole， pH 8.0），0 ℃超声裂解菌体。待菌体裂解后，4 ℃、10000 r/min离心40 min。然后按照以下过程纯化蛋白：（1）装柱：上清加入Ni-NTA亲和柱中，收集滤液；（2）洗涤：加入5-15 mL Binding Buffer（大约5-15 柱体积），收集滤液加入10-20 mL Washing Buffer（大约15-20柱体积，20 mmol/L HEPES， pH 7.0， 200mmol/L NaCl， 50 mmol/L imidazole）洗去与Ni-NTA柱相结合的杂蛋白；（3）洗脱：加入3.5mL的Elution Buffer 1（20 mmol/L Tris-HCl， pH 8.0， 500 mmol/L NaCl， 250 mmol/Limidazole）把目的蛋白从Ni-NTA柱上洗脱下来，为防止目的蛋白与Ni-NTA柱过度结合，继续用1 mL Elution Buffer 2（20 mmol/L HEPES，pH 7.0，200 mmol/L NaCl，500 mmol/Limidazole）洗涤；（4）浓缩：将Elution Buffer I洗脱下来的3.5mL滤液转入15 mL 10 kD超滤管中，2500 r/min、4 ℃离心20min，浓缩至小于2.5 mL；（5）脱盐：将浓缩后的蛋白转入PD-10 脱盐柱脱盐，用2.5 mL的Storage Buffer洗脱（30% glycerol，20 mmol/L HEPES,pH 7.0， pH 7.0）把目的蛋白冲洗下来，再用10 kD超滤管浓缩，浓缩后的目的蛋白于-80℃或-20 ℃保存备用，由此得到基因apkslB编码的蛋白ApKslB（其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示）。

纯化后的蛋白ApKslB取出2-20 μL，补水至20 μL，加入5 μL 5×SDS PAGELoading Buffer，充分混匀后沸水煮10-15 mins，取3-8 μL上样SDS PAGE电泳（Tris-Glycin缓冲液系统），同时，纯化后的蛋白分别稀释1倍、2倍、10倍，补水至20 μL，加入1 mL1×Bio-Rad Protein Assay试剂，反应5-60 min，测定595 nm下的吸光度，通过和Bradford标准蛋白含量曲线比较，计算P-S酶ApKslB的浓度。

蛋白ApKslB的SDS-PAGE如图3所示，纯化后得到的ApKslB蛋白的浓度约为40 μM。

实施例3

P-S酶ApKslB的体外生化反应及产物鉴定：

我们首先考察了酶ApKslB分别在不同pH（4、5、6、7、7.5、8、9、10以及 7、7.2、7.4、7.5、7.6、7.8、8.0）、不同温度（15 °C、20 °C、25 °C、30 °C、37 °C、42 °C和50 °C；以及 20°C、22°C、24°C、26°C、28°C、30°C）和不同反应时长下（0 min、5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、90min、120min和16 h）催化L-色氨酸和α-酮戊二酸反应形成产物的情况，结果分别见图4、图5和图6，发现酶ApKslB在pH为7.6 （HEPES缓冲液），温度为26℃，反应2 h可达最大转化效率。此外，在辅因子（NAD/NADH、iNADP/NADPH、FAD/FADH2、ATP、GTP、CoA）和离子（Ca²⁺、iMg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Fe³⁺）添加的情况下，不影响ApKslB的转化效率（图7和图8）。

接着对P-S酶ApKslB的体外反应进行了测试，条件如下：

1 mmol/L L-色氨酸 + 2 mmol/L α-酮戊二酸（α-ketoglutarate）+ 6 μmol/L 酶ApKslB+50 mmol/L pH7.6 HEPES缓冲液，26℃反应2 h，用100 μL甲醇终止反应，离心过滤后取30μL进行HPLC分析。用Waters Alliance e2695 HPLC分析产物，通过高分辨质谱初步鉴定产物。HPLC检测条件为Agilent Zorbax SB-C18（150×4.6 mm，5 μm）反相柱，流动相A相为ddH₂O，含体积分数0.1%乙酸，流动相B相为100%乙腈，含体积分数0.1%乙酸；流速为0.4mL/min，检测波长为215 nm和276nm。HPLC程序：0 - 8 min，5% - 95% B相；8–16 min，95% B相；16 - 18 min，95%-5% B相；18 – 29min为5% B相。

结果如图9所示，图9中，i：L-Trp标准品对照；ii：对照；iii：L-色氨酸与α-酮戊二酸反应得到的产物1；iv：化合物1的标准品。其中1代表图1中的式1表示的化合物，式1的分离可以从HPLC制备得到，然后进行高分辨质谱鉴定；化合物1的高分辨质谱如图10所示，化合物1的¹H和¹³C 的核磁共振谱的结果如图11和12所示，化合物1的NMR 数据如表1所示。由此鉴定化合物1的结构如图1中的式1所示。

表1：化合物1的NMR数据（500/125 MHz, TMS 为内标, ppm，溶剂为DMSO）

由图9可以看出，酶ApKslB负责L-色氨酸和α-酮戊二酸的缩合反应，进而产生化合物1（图2），化合物1属于四氢β-咔啉生物碱。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQ ID NO.1

atgtccgccg catacccaga tctcaaggaa tccgcatttc ccgatctcaa ggaattcacc 60

cggaaactgg cggccgagga accgtcggag attcgacaga tgcgcaccgg aacgctcaat 120

gaagcgcctg gatcctatga ccagtacttc accacgtggg atttcgcgaa cggcatcgtt 180

cgtgactatt cgatgaatct ctatcagctg gtccggatgg cccacgacga gagcctgccc 240

gtcgagaacg tgttgacggt cttccggacg tgggacccga tctacagcaa gtacctcggc 300

tacagcggtt tcccgacgct ggccgaatac gccgagcgga tccacgcccc cgtggcggac 360

cgcagcgagc tcgtggacag gctggccacc ttcaccgaat acgtcaaccg gctgaccgct 420

tggtcgcacc actatttccc ctggcacgtg ggcgagcact atcgctacaa ctcgagcgag 480

ctcgcgctcc ggcaggagta cacccccacg ccggtcagcg tcgcggagga gccgtcacgg 540

cgcattccca tccggctcac ctgggagccg ctcggtctga gcgtcgacgc cgagctcgcc 600

tgcgacctca acgagcggct gtgcgaggac ttcctcgcct gcctgccgtt caccgtgctg 660

caggaccacg ccgtggtcag cggcgagtcc atgtacgcgt gggcgccgtt ggtcagcgtc 720

gcgccgacgc cggtgaccga gcgcatctgc gacgcgccac ccggcaggct ccgtttcagc 780

caggcgaccg gcaacaagct catcgtccaa tacggaccga cgacggagac cctgcgcgga 840

cccgttctcg gcaaggtggt cgacgagcac atcgaccggc tgcccaaggt cggccaggcg 900

gtctgggaaa gcaccttccg cacgaaggac ctcatctgga tcaccgcgga acgcctctga 960

SEQ ID NO.2

Met Ser Ala Ala Tyr Pro Asp Leu Lys Glu Ser Ala Phe Pro Asp Leu

1 5 10 15

Lys Glu Phe Thr Arg Lys Leu Ala Ala Glu Glu Pro Ser Glu Ile Arg

20 25 30

Gln Met Arg Thr Gly Thr Leu Asn Glu Ala Pro Gly Ser Tyr Asp Gln

35 40 45

Tyr Phe Thr Thr Trp Asp Phe Ala Asn Gly Ile Val Arg Asp Tyr Ser

50 55 60

Met Asn Leu Tyr Gln Leu Val Arg Met Ala His Asp Glu Ser Leu Pro

65 70 75 80

Val Glu Asn Val Leu Thr Val Phe Arg Thr Trp Asp Pro Ile Tyr Ser

85 90 95

Lys Tyr Leu Gly Tyr Ser Gly Phe Pro Thr Leu Ala Glu Tyr Ala Glu

100 105 110

Arg Ile His Ala Pro Val Ala Asp Arg Ser Glu Leu Val Asp Arg Leu

115 120 125

Ala Thr Phe Thr Glu Tyr Val Asn Arg Leu Thr Ala Trp Ser His His

130 135 140

Tyr Phe Pro Trp His Val Gly Glu His Tyr Arg Tyr Asn Ser Ser Glu

145 150 155 160

Leu Ala Leu Arg Gln Glu Tyr Thr Pro Thr Pro Val Ser Val Ala Glu

165 170 175

Glu Pro Ser Arg Arg Ile Pro Ile Arg Leu Thr Trp Glu Pro Leu Gly

180 185 190

Leu Ser Val Asp Ala Glu Leu Ala Cys Asp Leu Asn Glu Arg Leu Cys

195 200 205

Glu Asp Phe Leu Ala Cys Leu Pro Phe Thr Val Leu Gln Asp His Ala

210 215 220

Val Val Ser Gly Glu Ser Met Tyr Ala Trp Ala Pro Leu Val Ser Val

225 230 235 240

Ala Pro Thr Pro Val Thr Glu Arg Ile Cys Asp Ala Pro Pro Gly Arg

245 250 255

Leu Arg Phe Ser Gln Ala Thr Gly Asn Lys Leu Ile Val Gln Tyr Gly

260 265 270

Pro Thr Thr Glu Thr Leu Arg Gly Pro Val Leu Gly Lys Val Val Asp

275 280 285

Glu His Ile Asp Arg Leu Pro Lys Val Gly Gln Ala Val Trp Glu Ser

290 295 300

Thr Phe Arg Thr Lys Asp Leu Ile Trp Ile Thr Ala Glu Arg Leu

305 310 315

Claims (6)

1.Pictet-Spengler酶，是如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）如SEQ ID NO.2所示的氨基酸组成的蛋白质

（b）由（a）的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有Pictet-Spengler酶活性的由（a）衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的Pictet-Spengler酶的编码基因。

3.根据权利要求1所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系和/或表达盒。

5.权利要求1所述的Pictet-Spengler酶或其编码的基因在制备四氢β-咔啉骨架中的应用；

所述的四氢β-咔啉骨架的结构式如下所示：

式（Ⅰ）。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是Pictet-Spengler酶催化L-色氨酸和α-酮戊二酸合成四氢β-咔啉骨架中的应用。