CN120757600A - 环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP、制备方法及其在制备先天免疫激活剂中的应用 - Google Patents
环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP、制备方法及其在制备先天免疫激活剂中的应用Info
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Abstract
本发明涉及核苷、寡聚核苷酸的化学合成领域与先天免疫领域，本发明公开了一种环二核苷酸2′,3′‑cG4′‑MeAMP、制备方法及其在制备先天免疫激活剂中的应用，所述环二核苷酸2′,3′‑cG4′‑MeAMP的化学结构式为，与天然的环二核苷酸2′,3′‑cGAMP相比，2′,3′‑cG4′‑MeAMP具有更高的血清稳定性，对于携带失活型STING‑R232H突变体的人体细胞具有显著增强的先天免疫激活效果，显示出在STING功能缺陷相关疾病中的潜在治疗价值。
Description
技术领域
本发明涉及核苷、寡聚核苷酸的化学合成领域与先天免疫领域，涉及一种环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP、制备方法及其在制备先天免疫激活剂中的应用。
背景技术
环二核苷酸是cGAS（cGAMP合酶）-STING（干扰素基因刺激因子）固有免疫通路中的关键第二信使。在双链DNA刺激下，cGAS合成环二核苷，后者可结合并激活STING，进而诱导I型干扰素、炎性细胞因子及肿瘤坏死因子等的分泌，触发抗病毒、抗肿瘤及炎症等免疫应答（cGAS in action: Expanding roles inimmunity and inflammation, Science, 2019,363, eaat8657）。其中，2′,3′-环GMP-AMP二核苷酸（2′,3′-cGAMP）是哺乳动物STING的内源性配体，在哺乳动物细胞中展现出强效的免疫激活能力。因此2′,3′-cGAMP被认为是一种在感染、癌症以及自身免疫性疾病治疗中具有潜力的候选药物。
然而，2′,3′-cGAMP本身易被核酸酶降解，细胞膜通透性较差，且对人群中广泛存在的失活型STING突变体（如R232H）几乎无激活作用，严重限制了其作为直接药物的应用潜力。为改善2′,3′-cGAMP的成药性，研究者们尝试在其碱基、磷酸二酯键及2ʹ-H/OH等位点引入结构修饰，成为近年来较为常见的优化策略（2′,3′-Cyclic GMP-AMP Dinucleotidesfor STING-Mediated Immune Modulation: Principles, ImmunotherapeuticPotential, and Synthesis, ChemMedChem, 2022, 17, e202100671）。然而，目前尚未发现能够有效激活失活型STING突变体的环二核苷类似物。
发明内容
针对目前天然环二核苷酸2′,3′-cGAMP稳定性差、对于多种hSTING突变体（如hSTING-R232H突变体）免疫激活能力差等缺点，本发明公开了一种环二核苷酸2′,3′-cG4′- MeAMP、制备方法及其在制备先天免疫激活剂中的应用，环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP是新型环二核苷酸类似物，即含有C4′-甲基鸟苷修饰的2′,3′-cG4′-MeAMP。细胞实验结果表明，该分子对失活型STING-R232H突变体具有显著增强的激活效果，显示出在STING功能缺陷相关疾病中的潜在治疗价值。
本发明的技术方案是：
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种C4′-甲基鸟苷酸修饰的环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP，其中，该2′,3′-cG4′-MeAMP的化学结构式为：
。
本发明第二方面提供了一种所述环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP的制备方法，包括以下步骤：
（1）将三氮唑、三乙胺、2-氯苯基二氯磷酸酯和二氯甲烷形成第一混合溶液，1小时后将所述第一混合溶液与2-N-(乙酰基)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-β-D-鸟苷进行反应，所述三氮唑、三乙胺、2-氯苯基二氯磷酸酯、2-N-(乙酰基)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-β-D-鸟苷的摩尔量、二氯甲烷的体积量比例为1.6 mmol : 1.6 mmol : 0.6 mmol : 0.4mmol :1-3 mL；将反应后得到的溶液用二氯甲烷稀释后，洗涤、干燥、过滤、柱层析纯化得到2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-β-D-鸟苷；
（2）将步骤（1）得到的2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-β-D-鸟苷、1-（均三甲苯基-2-砜基）-3-硝基-1,2,4-三唑和无水吡啶进行第二混合，形成第二混合溶液；再将3-羟基丙腈与所述第二混合溶液进行反应，所述2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-β-D-鸟苷、1-（均三甲苯基-2-砜基）-3-硝基-1,2,4-三唑、3-羟基丙腈的摩尔量、无水吡啶体积量比例为1.0 mmol : 3.5mmol :2.0 mmol: 1-3 mL；反应后的溶液加入适量草酸溶液酸化，后用二氯甲烷稀释，洗涤、干燥、过滤得到粗品；
将粗品与二氯乙酸、二氯甲烷反应脱除二甲氧基三苯甲基，所述粗品的摩尔量、二氯乙酸和二氯甲烷的体积量比例为1.0 mmol : 0.3-1 mL : 10-20 mL，反应后的溶液加入适量饱和碳酸氢钠溶液中和，旋蒸除去溶剂后用二氯甲烷稀释后洗涤、干燥、过滤、柱层析分离得到2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基-2-腈乙基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷；
（3）将三氮唑、三乙胺、2-氯苯基二氯磷酸酯和二氯甲烷形成第三混合溶液，1小时后将所述第三混合溶液与2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷进行反应，所述三氮唑、三乙胺、2-氯苯基二氯磷酸酯、2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷的摩尔量、二氯甲烷的体积量比例为1.6 mmol : 1.6 mmol : 0.6 mmol : 0.4 mmol :1-3 mL，将反应后得到的溶液用二氯甲烷稀释后洗涤、干燥、过滤、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷；
（4）将步骤（2）得到的2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基-2-腈乙基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷和步骤（3）得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷与吡啶第四混合，形成第四混合溶液；再将所述第四混合溶液与1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑反应，所述2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基-2-腈乙基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷、2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷、1-（均三甲苯基-2-砜基）-3-硝基-1,2,4-三唑的摩尔量、吡啶的体积量比例为0.17 mmol : 0.22 mmol : 0.51mmol : 2 mL，反应后的溶液加入适量草酸溶液酸化，后用二氯甲烷稀释后洗涤、干燥得到粗产品；
将所述粗产品与二氯乙酸、二氯甲烷反应脱除二甲氧基三苯甲基，所述粗产品的摩尔量、二氯乙酸和二氯甲烷的体积量比例为3.0 mmol : 0.3 mL : 10 mL，反应后的溶液加入适量饱和碳酸氢钠溶液中和，旋蒸除去溶剂后用二氯甲烷稀释后洗涤、干燥、柱层析分离得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷-2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基-2-腈乙基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷二核苷酸；
（5）将步骤（4）得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷-2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基-2-腈乙基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷二核苷酸与叔丁胺和乙腈进行第五混合，形成第五混合溶液，反应脱除2-腈乙基，结束后旋干溶剂，接着再与1-（均三甲苯基-2-砜基）-3-硝基-1,2,4-三唑和无水吡啶环化反应，所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷-2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基-2-腈乙基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷二核苷酸和1-（均三甲苯基-2-砜基）-3-硝基-1,2,4-三唑的摩尔量、叔丁胺、乙腈、吡啶的体积量的比例为0.2 mmol : 1.1mmol:2 mL : 6 mL: 20 mL，反应结束后加入少量水淬灭反应。旋走溶剂，适量草酸溶液酸化，后用二氯甲烷稀释后洗涤、干燥、柱层析分离纯化得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷-2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷环二核苷酸；
（6）将步骤（5）得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷-2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷环二核苷酸与四甲基胍、吡啶-2-甲醛肟、1,4-二氧六环和水进行第六混合，形成第六混合溶液，所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷-2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷环二核苷酸、四甲基胍、吡啶-2-甲醛肟的摩尔量、1,4-二氧六环和水的体积用量的比例为0.26 mmol : 1.16 mmol : 1.16 mmol : 2 mL :2 mL，反应脱除2-氯苯基，结束后旋走部分溶剂，再将所述第六混合溶液与甲胺-乙醇溶液反应脱除乙酰基、苯甲酰基。
反应结束后，旋走部分溶液，重新加入三乙胺-三乙胺氢氟酸盐-吡啶的混合溶液，反应脱除叔丁基二甲基硅烷基，结束后旋蒸除去部分溶剂，搅拌下加入丙酮，离心收集沉淀，将洗涤后的沉淀加水溶解，液相滤膜过滤，液相纯化，得到环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP。
优选地，在步骤（1）中，所述反应的条件包括：氩气保护，温度为-1-1℃，时间为1-3小时，搅拌速度为250-500转/分钟，反应结束后加入2 mL 1 M TEAB缓冲溶液淬灭。进一步优选温度为0℃，时间为2小时。
优选地，在步骤（2）中，所述反应的条件包括：氩气保护，温度为24-26℃，时间为1-3小时，进一步优选2小时，搅拌速度为250-500转/分钟，反应结束后加入适量5%草酸溶液调节体系pH至3-4；脱除二甲氧基三苯甲基的条件包括：温度为-1-1℃，时间为8-20分钟，进一步优选温度为0℃，时间为10分钟，搅拌速度为250-500转/分钟，反应结束后加入饱和碳酸氢钠溶液中和。
优选地，在步骤（3）中，所述反应的条件包括：氩气保护，温度为-1-1℃，时间为1-3小时，进一步优选0℃，时间为2小时，搅拌速度为250-500转/分钟，反应结束后加入2 mL 1M TEAB缓冲溶液淬灭。
优选地，在步骤（4）中，所述反应的条件包括：氩气保护，温度为24-26℃，时间为1-3小时，进一步优选2小时，搅拌速度为250-500转/分钟，反应结束后加入适量5%草酸溶液调节体系pH至3-4；脱除二甲氧基三苯甲基的条件包括：温度为-1-1℃，时间为8-15分钟，进一步优选温度为0℃，时间为10分钟，搅拌速度为250-500转/分钟，反应结束后加入饱和碳酸氢钠溶液中和。 优选地，在步骤（5）中，脱除2-腈乙基反应的条件包括：氩气保护，温度为24-26℃，时间为15-30分钟，进一步优选20分钟，搅拌速度为250-500转/分钟，反应结束后使用无水乙腈共旋三次，充分干燥；环化反应的条件包括：氩气保护，温度为24-26℃，时间为5-8小时，进一步优选6小时，搅拌速度为250-500转/分钟，反应结束后加入适量5%草酸溶液调节体系pH至3-4。
优选地，在步骤（6）中，脱除2-氯苯基反应的条件包括：氩气保护，温度为24-26℃，时间为16~19小时，进一步优选17小时，搅拌速度为250-500转/分钟；
脱除乙酰基、苯甲酰基反应的条件包括：氩气保护，温度为24-26℃，时间为2-4小时，进一步优选3小时，搅拌速度为250-500转/分钟；
脱除叔丁基二甲基硅烷基反应的条件包括：氩气保护，温度为40-60℃，时间为4-6小时，进一步优选5小时，搅拌速度为250-500转/分钟；反应结束后，旋蒸除去部分溶剂，趁热搅拌下加入预冷的丙酮30 mL，析出大量固体。24-26℃继续搅拌20 min，离心收集沉淀。
本发明第三方面提供一种所述的环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP在制备先天免疫激活剂中的应用。
本发明第四方面提供一种所述的环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP在制备治疗STING功能缺陷相关疾病的药物中的应用。
本发明的优点和有益效果是：
本发明通过向天然的环二核苷酸2′,3′-cGAMP中鸟嘌呤G的C4ʹ位引入甲基修饰，得到的环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP，可用于制备先天免疫激活剂，显著提高血清稳定性，尤其对携带失活型STING突变体R232H的人体细胞具有显著增强的先天免疫激活效果，在制备治疗STING功能缺陷相关疾病药物中具有潜在价值。
附图说明
图1为天然环二核苷酸2′,3′-cGAMP及环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP在胎牛血清中的稳定性测试图；
图2为天然环二核苷酸2′,3′-cGAMP及环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP在HEK293T细胞中通过激活STING诱导免疫因子干扰素的表达对比图，其中A）为2′,3′-cGAMP和2′,3′-cG4 ′-MeAMP激活野生型hSTING，B）为2′,3′-cGAMP和2′,3′-cG4′-MeAMP激活hSTING-R232H突变体。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
二氯甲烷（从天津市滨海新区广顺达化学试剂有限公司购买，货号A1040）；碳酸氢钠（从天津市滨海新区广顺达化学试剂有限公司购买，货号2049）；溶解乙腈（≤10 ppm）（从河北迪纳兴科生物科技有限公司购买，货号R1012-4）；无水硫酸镁(从天津市滨海新区广顺达化学试剂有限公司购买，货号S2509)；氯化钠（从天津市化学试剂供销公司购买，货号017）；甲醇（从北京百灵威科技有限公司购买，货号980290-500ML）；三乙胺（从北京伊诺凯公司购买，货号T9710）； 1,2,4-三氮唑（北京伊诺凯公司购买，货号45140A）；2-氯苯基二氯磷酸酯（从上海皓鸿生物医药科技有限公司购买，货号1275469-5g）；1-（均三甲苯基-2-砜基）-3-硝基-1,2,4-三唑（从上海阿拉丁生化科技股份有限公司购买，货号M109334-5g）；吡啶（从天津市滨海新区广顺达化学试剂有限公司购买，货号S2442）；二氯乙酸（从北京百灵威科技有限公司购买，货号140166）；草酸（从北京凯国科技有限公司购买，货号AP009571）；3-羟基丙腈（从安徽泽升科技股份有限公司购买，货号B040147）；叔丁胺（从北京百灵威科技有限公司购买，货号237824）；吡啶-2-甲醛肟（从北京百灵威科技有限公司购买，货号529268）；四甲基胍（从北京百灵威科技有限公司购买，货号940257）；1,4-二氧六环（从天津市滨海新区广顺达化学试剂有限公司购买，货号S2438）；甲胺-乙醇溶液（33% wt）（从北京伊诺凯公司购买，货号M433515-100ml）；三乙胺三氢氟酸盐（从北京百灵威科技有限公司购买，货号433417）。
实施例1
一种环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP的制备方法，合成工艺路线如下：
化合物1为2-N-(乙酰基)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-β-D-鸟苷；化合物1以D-核糖和鸟嘌呤为起始原料，参照文献合成得到（Synthesis of 4′-C-Methylnucleosides, Bioscience, Biotechnology andBiochemistry, 1993, 57, 1433）。
化合物2为2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-β-D-鸟苷；
化合物3为2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基-2-腈乙基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷；
化合物4为2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷；购买于上海毕得医药科技股份有限公司，货号BD215385。
化合物5为2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷；
化合物6为2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷-2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基-2-腈乙基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷二核苷酸；
化合物7为2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷-2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷环二核苷酸；
化合物8为环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP。
具体步骤如下：
（1）制备化合物2：氩气保护下，称取三氮唑（115 mg, 1.60 mmol, 4.0 eq）于25mL圆底烧瓶中，加入干燥三乙胺（0.25 mL, 1.60 mmol, 4.0 eq）和1 mL 干燥DCM（二氯甲烷）溶解，0 ℃下搅拌，搅拌速度为300转/分钟，2-氯苯基二氯磷酸酯（157 mg, 0.64 mmol,1.6 eq）的二氯甲烷溶液（1 mL）以一秒一滴的速度滴加到反应体系中，形成第一混合溶液，0℃反应1h后，将化合物1（300 mg, 0.4 mmol, 1.0 eq）溶于1 mL干燥DCM（二氯甲烷）中，以一秒一滴的速度滴加到第一混合溶液中，0 ℃反应2h。TLC监测反应结束后移至26℃，加入2mL 1 M TEAB缓冲溶液，继续搅拌半小时，搅拌速度为300转/分钟。萃取分离有机相，分别用1 M TEAB 缓冲溶液和蒸馏水各洗涤两次，收集有机相，无水MgSO4干燥，旋干溶剂后柱层析纯化得到白色固体产物（化合物2）。
（2）制备化合物3：氩气保护下，称取化合物2（328 mg, 0.36 mmol, 1.0 eq）和1-（均三甲苯基-2-砜基）-3-硝基-1,2,4-三唑（373 mg, 1.26 mmol, 3.5 eq）于10 mL 圆底烧瓶中，加入1 mL 无水吡啶进行第二混合，形成第二混合溶液；在第二混合溶液中加入3-羟基丙腈（0.05 mL, 0.72 mmol, 2.0 eq），26℃反应2 h，搅拌速度为300转/分钟，TLC监测反应结束后加入少量水淬灭反应，减压旋干后重新溶于5 mL DCM中，加入适量5%草酸溶液调节体系pH至3-4，分离有机相，水相使用DCM萃取三次，合并有机相，饱和NaCl溶液洗涤一次，收集有机相无水MgSO4干燥，旋干溶剂，得到粗品。
将以上的粗品溶于10 mL DCM中，0oC下搅拌，搅拌速度为300转/分钟，加入0.3 mL二氯乙酸，保持冰浴下反应10 min，脱除二甲氧基三苯甲基。TLC监测反应结束后，加入几滴甲醇淬灭，并继续搅拌10 min，加入饱和NaHCO3溶液中和至无气泡冒出。萃取分离有机相，DCM多次萃取水相，合并有机相，饱和NaCl溶液洗涤两次，收集有机相无水MgSO4干燥。旋干溶剂，柱层析分离（甲醇/ 二氯甲烷, v/v, 1/50-1/30)。得到目标化合物3 143 mg，三步产率76%。
化合物3的核磁共振（NMR）分析结果如下：
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ (ppm): -7.87, -9.27;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 9.65 (br, 1H, -NHCO-), 8.48 (s, 1H, -NHCO-), 7.78 (s, 1H, -N=CH), 7.14-7.20 (m, 1H, -ArH), 6.89-7.08 (m, 3H, -ArH), 5.86 (t,J= 6.8 Hz, 1H, -H1′), 5.75-5.82 (m, 1H, -P-CH2), 4.45 (t,J= 4.1Hz, 1H, -P-CH2), 4.12-4.23 (m, 1H, -H3′), 4.07 (dd,J= 6.4, 13.9 Hz, 1H, -H2′), 3.63 (d,J= 12.5 Hz, 1H, -H5′), 3.34-3.45 (m, 1H, -H5′′), 2.65 (t,J= 5.8Hz, 1H, -CH2-CN), 2.51 (dd,J= 5.7, 12.0 Hz, 1H, -CH2-CN), 2.12 (s, 3H, Ac-CH3), 1.12 (s, 3H, C4′-CH3), 0.82 (s, 9H, -tBu), 0.03 (s, 3H, Si-CH3), 0.00(s, 3H, Si-CH3);
13C NMR (100.4 MHz, CDCl3) δ (ppm): 172.7, 172.7, 155.7, 155.5, 148.0,147.9, 147.7, 147.7, 146.0, 145.6, 145.7, 139.6, 139.5, 130.7, 130.6, 128.1,128.0, 126.6, 125.0, 125.0, 124.3, 124.2, 121.9, 121.0, 120.0, 116.6, 116.2,88.8, 86.7, 86.4, 78.6, 78.2, 72.7, 72.6, 67.3, 67.1, 63.4, 63.3, 63.1, 63.1,24.3, 24.3, 19.7, 19.6, 19.5, 19.5, 19.1, 19.0, 18.2, -4.5, -4.6, -4.8.
根据核磁结果可以证实，化合物3结构正确。
（3）制备化合物5：氩气保护下，称取三氮唑（174 mg, 2.52 mmol, 4.0 eq）和干燥三乙胺（0.35 mL, 2.52 mmol, 4.0 eq）于25 mL圆底烧瓶中，加入1 mL 干燥DCM溶解，0 ℃下搅拌，搅拌速度为300转/分钟，将2-氯苯基二氯磷酸酯（245 mg, 1.00 mmol, 1.6 eq）的DCM溶液（1 mL）以一秒一滴的速度滴加到反应体系中，形成第三混合溶液，0 ℃反应1h后，将化合物4（500 mg, 0.63 mmol, 1.0 eq）溶于1 mL干燥DCM中，以一秒一滴的速度滴加到第三混合溶液中，0 ℃反应2h。TLC监测反应结束后移至26℃，加入2 mL 1 M TEAB缓冲溶液，继续搅拌半小时。
反应体系用1 M TEAB 缓冲溶液和蒸馏水各洗涤两次，收集有机相，无水MgSO4干燥，旋走溶剂后得到白色固体产物，即为化合物5，干燥后直接用于下一步。
（4）制备化合物6：氩气保护下，将化合物5（210 mg, 0.22 mmol, 1.3 eq）、化合物3（110 mg, 0.17 mmol, 1.0 eq）与2 mL吡啶第四混合，形成第四混合溶液；再将第四混合溶液和1-（均三甲苯基-2-砜基）-3-硝基-1,2,4-三唑（150 mg, 0.51 mmol, 3.0 eq）反应，常温下搅拌2 h，搅拌速度为300转/分钟。待反应结束后加入1 mL水淬灭反应。旋干吡啶，残余物加入10 mL DCM溶解，使用5%草酸溶液将体系pH调节至3-4，收集有机相。水相用DCM萃取两次后弃之，合并有机相再用饱和NaCl溶液洗两次，收集有机相旋干得到粗产品，直接用于下一步。
将粗产品（496 mg, 3.0 mmol, 1.0 eq）溶于10 mL DCM中，0 ℃搅拌下加入0.3mL 二氯乙酸反应10 min，脱除二甲氧基三苯甲基。TLC监测反应结束后加入2 mL 甲醇淬灭，继续低温搅拌10 min，而后加入饱和NaHCO3溶液中和至无气泡冒出。有机相使用饱和NaCl溶液洗涤两次，水相被DCM萃取两次后弃之。合并有机相，减压旋干，柱层析分离(甲醇/二氯甲烷, v/v, 1/50-1/30)得到化合物6 250 mg，产率70%。
化合物6的核磁共振（NMR）分析结果如下：
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ (ppm): -7.39, -8.29, -8.35, -9.75;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 11.52 (s, 1H), 10.18 (s, 1H), 9.26(s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.04 (d,J= 7.5 Hz, 1H), 7.68 (d,J= 5.1Hz, 1H), 7.62 (t,J= 7.3 Hz, 1H), 7.53 (t,J= 7.5 Hz, 2H), 6.97-7.35 (m, 8H),6.73-6.85 (m, 1H), 6.52-6.61 (m, 1H), 6.01-6.21 (m, 3H), 5.91-5.95 (m, 1H),5.40-5.45 (m, 1H), 5.30 (s, 1H), 4.84 (s, 1H), 4.26-4.53 (m, 4H), 4.06 (d,J=11.5 Hz, 1H), 3.87 (t,J= 11.8 Hz, 1H), 2.72- 2.90 (m, 1H), 2.04 (s, 3H), 1.44(m, 3H), 1.03 (m, 9H), 0.74 (s, 9H), 0.27 (m, 3H), 0.21 (m, 3H), -0.12 (s,3H), -0.40 (m, 3H);
13C NMR (100.4 MHz, CDCl3) δ (ppm): 172.4, 164.5, 155.2, 154.9, 152.4,150.6, 148.0, 147.7, 147.2, 147.0, 145.5, 145.4, 145.3, 145.2, 144.9, 144.8,144.7, 143.1, 143.0, 139.8, 133.4, 133.0, 130.8, 130.5, 130.3, 128.9, 128.2,128.1, 128.0, 127.5, 127.4, 126.9, 126.0, 125.9, 125.8, 124.4, 123.7, 123.6,123.0, 122.9, 122.8, 120.9, 119.0, 116.6, 115.8, 90.7, 90.6, 86.7, 86.4,86.2, 86.1, 86.0, 85.8, 85.7, 85.6, 79.9, 79.8, 73.2, 73.1, 72.7, 72.6, 63.4,63.3, 63.3, 62.8, 62.7, 53.5, 29.7, 25.9, 25.8, 25.4, 23.7, 19.8, 19.7, 19.5,19.4, 19.2, 19.1, 18.4, 17.8, -4.3, -4.4, -4.6, -4.6, -5.1, -5.7, -5.8
HRMS (ESI): C57H72Cl2N11O16P2Si2[M+H]+, calc.1354.3549, found 1354.3563
根据核磁和质谱结果可以证实，化合物6结构正确，分子量正确。
（5）制备化合物7：25 mL圆底烧瓶中，将化合物6（30 mg, 0.022 mmol, 1.0 eq），溶于叔丁胺-乙腈混合溶剂中（1/3，V/V，共0.8 mL），常温搅拌反应20 min进行第五混合，形成第五混合溶液，反应脱除2-腈乙基。TLC监测反应结束后，减压浓缩，加入乙腈共旋三次并充分干燥。反应体系在氩气保护下加入1-（均三甲苯基-2-砜基）-3-硝基-1,2,4-三唑（33mg, 0.11 mmol, 5.0 eq）和2 mL 无水吡啶环化反应，26℃反应6 h，搅拌速度为300转/分钟。TLC监测反应结束后加入少量水淬灭反应。旋干溶剂，适量DCM溶解后加入5%草酸溶液将体系pH调至3-4，分出有机相，水相用DCM萃取两次，合并有机相后用饱和NaCl溶液洗两次，无水MgSO4干燥有机相，柱层析分离纯化(甲醇/ 二氯甲烷, v/v, 1/30)，得到化合物7 8mg，两步产率65%。
（6）制备化合物8：
1）将化合物7（300 mg, 0.26 mmol, 1.0 eq）溶于2 mL 1,4-二氧六环和2 mL水的混合溶剂中，加入四甲基胍（133 mg, 1.16 mmol, 4.5 eq）和吡啶-2-甲醛肟（141 mg,1.16 mmol, 4.5 eq），26℃搅拌17 h，搅拌速度为300转/分钟，进行第六混合，形成第六混合溶液。
2）旋干溶剂，加入10 mL甲胺-乙醇溶液（33% wt），26℃搅拌3 h，搅拌速度为300转/分钟，反应脱除乙酰基、苯甲酰基。
3）旋干溶剂，残余物用干燥吡啶（1.2 mL）-三乙胺（0.6 mL）的混合溶剂共旋三次后，溶于1 mL 无水吡啶、5 mL三乙胺、3 mL三乙胺-三氢氟酸盐的混合溶液中，50 ℃ 搅拌反应5 h，搅拌速度为300转/分钟，反应脱除叔丁基二甲基硅烷基。反应结束后，旋蒸除去部分溶剂，趁热搅拌下加入预冷的丙酮30 mL，析出大量固体。26℃继续搅拌20 min，离心收集沉淀。丙酮洗涤沉淀一次后，加入适量水溶解，液相滤膜过滤，液相纯化，得到化合物8，即环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP。
液相纯化条件：色谱柱型号Innoval ODS-2 C18柱（21.2×250 mm, 5 μm），紫外254 nm监测。流动相梯度：A相为50 mM TEAA水溶液，B相为乙腈。0-2 min 保持98% A-2% B，2-32 min 由98% A-2% B升至70% A-30% B，32-37 min 由70% A-30% B升至100% B，37-43min 保持100% B，流速10 mL/min。
化合物8的核磁共振（NMR）分析结果如下：
1H NMR (600 MHz, D2O) δ (ppm): 8.25 (s, 1H, A-H8), 8.20 (s, 1H, A-H2),7.79 (s, 1H, G-H8), 6.11 (s, 1H, A-H1′), 5.84 (d, 1H,J= 8.5 Hz, G-H1′), 5.73(td, 1H,J= 4.4, 8.1 Hz, G-H2′), 4.99 (dd, 1H,J= 3.9, 9.1 Hz, A-H3′), 4.70 (m,1H, A-H2′), 4.42-4.43 (m, 2H, A-H4′, G-H3′), 4.40 (d,J= 13.0 Hz, A-H5′), 4.27(dd, 1H,J= 3.0, 11.2 Hz, G-H5′), 4.06 (dd, 1H,J= 2.0 Hz, 12.1 Hz, A-H5′′),3.87 (dd, 1H,J= 4.4, 11.2 Hz, G-H5′′), 1.25 (s, 3H, -CH3)；
31P-decoupling1H NMR (600 MHz, D2O) δ (ppm): 8.25 (s, 1H, A-H8), 8.20(s, 1H, A-H2), 7.79 (s, 1H, G-H8), 6.11 (s, 1H, A-H1′), 5.84 (d, 1H,J= 8.5Hz, G-H1′), 5.73 (dd, 1H,J= 4.3, 8.5 Hz, G-H2′), 4.99 ( dd, 1H,J= 3.9, 9.1Hz, A-H3′), 4.70 (m, 1H, A-H2′), 4.42-4.43 (m, 2H, A-H4′, G-H3′), 4.40 (d,J=12.1 Hz, A-H5′), 4.27 (d, 1H,J= 11.3 Hz, G-H5′), 4.06 (d, 1H,J= 11.7 Hz, A-H5′′), 3.87 (d, 1H,J= 11.2 Hz, G-H5′′), 1.25 (s, 3H, -CH3)；
13C NMR (150.6 MHz, D2O) δ (ppm): 158.9, 155.4, 152.9, 152.6, 147.8,138.8, 118.7, 89.7, 86.2, 86.1, 86.0, 85.9, 80.0, 79.9, 79.8, 74.5, 74.4,73.9, 72.1, 72.0, 70.6, 70.5, 70.1, 70.1, 62.1, 62.0, 61.4, 46.7, 18.7, 8.22
31P NMR (162 MHz, D2O) δ (ppm): -1.23, -2.27
HRMS (ESI): C21H25N10O13P2[M-H]-, calc.687.1078, found 687.1034
根据核磁和质谱结果可以证实，化合物8结构正确，分子量正确。
实施例2
环二核苷酸2ʹ,3ʹ-cG4ʹ-MeAMP在血清中的稳定性验证
其实验步骤如下：
200 μL 离心管中，20%的胎牛血清 (6 μL)，10 mM PBS buffer (pH 7.2 ~ 7.4)，5 mM MgCl2，0.1 μg/μL 环二核苷，总体积 30 μL，37 ℃恒温孵育器中孵育，每隔 0、1、2、6、12、24、36、48小时取样。30 μL样品体系加入 5 μL 0.5 M EDTA (pH 8.0) 缓冲液终止反应，加 50 μL 水稀释后，HPLC进样分析，进样体积30 μL。
纯化条件：仪器为 FLEXA Purification System HP-Q-100，色谱柱为 InnovalODS-2 C18柱（21.2 × 250 mm, 5μm），柱温 25 ℃，检测波长 254 nm。流动相梯度：A 相为10 mM TEAA 水溶液，B 相为乙腈，0 ~ 2 分钟保持100% A，2 ~ 12 分钟由 100% A 到 78%A/22 %B，12 ~ 13.5 分钟由 78% A/22% B 到 100 % B，13.5 ~ 15 分钟保持 100% B，15~ 17 分钟由 100% B 到 100% A，17 ~ 19 分钟保持 100% A。流速 1 mL/分钟。剩余完整环二核苷含量按峰面积计算，绘图分析，如图1所示。
从图1中可以看出，相较于修饰的2′,3′-cG4′-MeAMP来说，天然2′,3′-cGAMP的降解速率更快，半衰期为33小时左右。2′,3′-cG4′-MeAMP降解速度相对较慢，半衰期分别为大于90小时。即血清稳定性：2′,3′-cG4′-MeAMP远大于 2′,3′ - cGAMP。这是由于鸟苷C4ʹ-甲基的存在，使得相邻的磷酸二酯键附近存在一定的空间位阻，阻碍了底物与血清中核酸外切酶的结合，使得2′,3′-cG4′-MeAMP更难以被酶切割。因此，鸟苷引入C4′-甲基在很大程度上改善了环二核苷酸的血清稳定性，这有望改善环二核苷类药物药代动力学特性，从而提高其治疗潜力。
实施例3
环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP激活HEK293T细胞内干扰素表达测试：
由于 HEK293T 细胞缺乏内源性 STING 表达，因此用 hSTING-野生型或hSTING-R232H 表达载体以及两个双荧光素酶报告载体转染 HEK293T 细胞，其中一个载体编码IFN-β 启动子控制萤火虫荧光素酶，另一个载体编码海肾荧光素酶。培养 24 小时后，根据萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值对 IFN-β 启动子活性进行量化。
其实验步骤如下：
（1）HEK293T 细胞以1.5 × 105的密度平铺 24 孔细胞培养板中，37℃，5% CO2培养箱培养24 小时。
（2）使用 polyjet 试剂分别转染 pcDNA3.1-hSTING质粒（野生型或R232H突变体，50 ng/孔），pGL3-INFb 质粒（200 ng/孔）和 pGL4.74-Rluc-TK 质粒（50 ng/孔）。
（3）环二核苷酸转染：质粒转染 24 小时后，转染小分子，小分子两种转染方式：
1、直接转染：吸出培养板中DMEM培养液，环二核苷酸直接溶解在 37 ℃预热opti-DMEM中，每孔加入 500 μL，终浓度为每孔1 μM。继续培养4 小时后加入 1 mL 含有血清的正常DMEM 培养液继续培养24小时。
2、通透液处理：吸出培养板中DMEM培养液，将环二核苷酸直接溶解在 37 ℃预热的通透液中，每孔加入 500 μL，终浓度为每孔1 μM。30 分钟后，吸出通透液，换成 1 mL 含有血清的正常DMEM 培养液继续培养24小时。通透液组分为：50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸,100mM 氯化钾, 3mM 氯化镁, 0.1mM 二硫苏糖醇, 85mM 蔗糖, 0.2% 胎牛血清, 1mMATP, 0.1mM GTP, and 10μg/mL 洋地黄皂苷。
（4）双荧光报告检测：环二核苷酸转染 24 小时后，吸出培养液。每孔使用1 mL预冷的 PBS 缓冲液清洗后，加入 100 μL Passive Lysis 裂解液，26℃、水平摇床孵育 20分钟，转移至备好的 1.5 mL EP 管中，13000 rpm 离心 10 分钟，吸取上清至黑色 96 孔板中，每孔 20 μL。
每孔加入Luciferase Assay buffer混合液20 μL，酶标仪读取第一次荧光数据Luc值。再加入Stop&Glo buffer混合液20 μL，酶标仪读取第二次荧光数据Ren值。计算两次荧光强度比值（Luc值/Ren值），以空白组（正常转染三种质粒，不转染环二核苷酸）的荧光强度比值做归一化处理得到最终活性数据。每个数据重复三次，做误差分析。如图2所示。
在转染了hSTING-野生型的HEK293T（HEK293T/hSTING-WT）细胞中，用2′,3′-cGAMP直接处理后，IFN-β 表达活性只增加了1.6倍。而使用通透液处理后，则增加了4倍（图2中A）。与此相反，用2′,3′-cG4′-MeAMP处理后，无论是否使用通透液处理，IFN-β 表达活性只略微增加了1.4-1.8倍。这些结果进一步证实，2′,3′-cGAMP 是hSTING-野生型的有效激动剂，但在HEK293T 细胞中的膜渗透性较差；而2′,3′-cG4′-MeAMP激活 hSTING-野生型的能力较弱。
在转染了hSTING-R232H的HEK293T（HEK293T/hSTING-R232H）细胞中，用2′,3′-cGAMP 处理只导致IFN-β表达活性的轻微增加，且与通透液处理无关（图2中B）。相反，即使在没有通透液的情况下，2′,3′-cG4′-MeAMP诱导的IFN-β 表达激活也显著增强了2.3倍。这些结果表明，与哺乳动物细胞中的原生2′,3′-cGAMP相比，2′,3′-cG4′-MeAMP能更有效地激活hSTING-R232H变体，诱导天然免疫反应。这与2′,3′-cG4′-MeAMP更好的渗透性及更优秀的血清稳定性相关。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP，其特征在于，其化学结构式为：
。
2.一种如权利要求1所述的环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将三氮唑、三乙胺、2-氯苯基二氯磷酸酯和二氯甲烷形成第一混合溶液，1小时后将所述第一混合溶液与2-N-(乙酰基)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-β-D-鸟苷进行反应；所述三氮唑、三乙胺、2-氯苯基二氯磷酸酯、2-N-(乙酰基)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-β-D-鸟苷的摩尔量、二氯甲烷的体积量比例为1.6 mmol : 1.6 mmol : 0.6 mmol : 0.4 mmol : 1-3mL，将反应后得到的溶液用二氯甲烷稀释后，洗涤、干燥、过滤、柱层析纯化得到2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-β-D-鸟苷；
（2）将步骤（1）得到的2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-β-D-鸟苷、1-（均三甲苯基-2-砜基）-3-硝基-1,2,4-三唑和吡啶进行第二混合，形成第二混合溶液；再将3-羟基丙腈与所述第二混合溶液进行反应，所述2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-β-D-鸟苷、1-（均三甲苯基-2-砜基）-3-硝基-1,2,4-三唑、3-羟基丙腈的摩尔量、吡啶体积量比例为1.0 mmol : 3.5 mmol : 2.0mmol: 1-3 mL，反应后的溶液加入适量草酸溶液酸化，后用二氯甲烷稀释，洗涤、干燥、过滤得到粗品；
将粗品与二氯乙酸、二氯甲烷反应脱除二甲氧基三苯甲基，所述粗品的摩尔量、二氯乙酸和二氯甲烷的体积量比例为1.0 mmol : 0.3-1 mL : 10~20 mL，反应后的溶液加入适量饱和碳酸氢钠溶液中和，旋蒸除去溶剂后用二氯甲烷稀释后洗涤、干燥、过滤、柱层析分离得到2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基-2-腈乙基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷；
（3）将三氮唑、三乙胺、2-氯苯基二氯磷酸酯和二氯甲烷形成第三混合溶液，1小时后将所述第三混合溶液与2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷进行反应，所述三氮唑、三乙胺、2-氯苯基二氯磷酸酯、2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷的摩尔量、二氯甲烷的体积量比例为1.6 mmol : 1.6 mmol : 0.6 mmol : 0.4 mmol :1-3 mL，将反应后得到的溶液用二氯甲烷稀释后洗涤、干燥、过滤得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷；
（4）将步骤（2）得到的2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基-2-腈乙基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷和步骤（3）得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷与吡啶第四混合，形成第四混合溶液；再将所述第四混合溶液与1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑反应，所述2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基-2-腈乙基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷、2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-5′-O-(二甲氧基三苯甲基)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷、1-（均三甲苯基-2-砜基）-3-硝基-1,2,4-三唑的摩尔量、吡啶的体积量比例为0.17 mmol : 0.22 mmol : 0.51 mmol :2 mL，反应后的溶液加入适量草酸溶液酸化，后用二氯甲烷稀释后洗涤、干燥、过滤得到粗产品；
将所述粗产品与二氯乙酸、二氯甲烷反应脱除二甲氧基三苯甲基，所述粗产品的摩尔量、所述二氯乙酸和二氯甲烷的体积量比例为3.0 mmol : 0.3 mL : 10 mL，反应后的溶液加入适量饱和碳酸氢钠溶液中和，旋蒸除去溶剂后用二氯甲烷稀释后洗涤、干燥得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷-2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基-2-腈乙基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷二核苷酸；
（5）将步骤（4）得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷-2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基-2-腈乙基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷二核苷酸与叔丁胺、乙腈进行第五混合，形成第五混合溶液，反应脱除2-腈乙基，结束后旋干溶剂，接着再与1-（均三甲苯基-2-砜基）-3-硝基-1,2,4-三唑和吡啶环化反应，所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷-2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基-2-腈乙基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷二核苷酸、1-（均三甲苯基-2-砜基）-3-硝基-1,2,4-三唑的摩尔量、所述叔丁胺、乙腈、吡啶的体积量的比例为0.2 mmol : 1.1mmol:2mL:6 mL: 20 mL，反应结束后加入少量水淬灭反应，旋走溶剂，适量草酸溶液酸化，后用二氯甲烷稀释后洗涤、干燥、柱层析分离纯化得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷-2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷环二核苷酸；
（6）将步骤（5）得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷-2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷环二核苷酸与四甲基胍、吡啶-2-甲醛肟、1,4-二氧六环和水进行第六混合，形成第六混合溶液，所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-6-N-(苯甲酰基)-β-D-腺苷-2-N-(乙酰基)-2′-O-(2-氯苯基磷酸酯)-3′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-(甲基)-β-D-鸟苷环二核苷酸、四甲基胍、吡啶-2-甲醛肟的摩尔量、所述1,4-二氧六环和水的体积用量的比例为0.26 mmol : 1.16 mmol : 1.16 mmol : 2 mL: 2 mL，反应脱除2-氯苯基，结束后旋走部分溶剂，再将所述第六混合溶液与甲胺-乙醇溶液反应，反应脱除乙酰基、苯甲酰基，结束后，旋走部分溶液，重新加入三乙胺-三乙胺氢氟酸盐-吡啶的混合溶液，反应脱除叔丁基二甲基硅烷基，结束后旋蒸除去部分溶剂，搅拌下加入丙酮，离心收集沉淀，将沉淀加水溶解，液相滤膜过滤，液相纯化，得到环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述反应的条件包括：氩气保护，温度为-1-1℃，时间为1-3小时，反应结束后加入TEAB缓冲溶液淬灭。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述反应的条件包括：氩气保护，温度为24-26℃，时间为1-3小时，反应结束后加入5%草酸溶液调节体系pH至3-4；脱除二甲氧基三苯甲基的条件包括：温度为-1-1℃，时间为8-20分钟。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述反应的条件包括：氩气保护，温度为-1-1℃，时间为1-3小时，反应结束后加入TEAB缓冲溶液淬灭。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述反应的条件包括：氩气保护，温度为24-26℃，时间为1-3小时，反应结束后加入适量5%草酸溶液调节体系pH至3-4；脱除二甲氧基三苯甲基的条件包括：温度为-1-1℃，时间为8-15分钟。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤（5）中，脱除2-腈乙基反应的条件包括：氩气保护，温度为24-26℃，时间为15-30分钟，反应结束后使用无水乙腈共旋，充分干燥；环化反应的条件包括：氩气保护，温度为24-26℃，时间为5-8小时，反应结束后加入适量5%草酸溶液调节体系pH至3-4。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤（6）中，脱除2-氯苯基反应的条件包括：氩气保护，温度为24-26℃，时间为16~19小时；脱除乙酰基、苯甲酰基反应的条件包括：氩气保护，温度为24-26℃，时间为2-4小时；脱除叔丁基二甲基硅烷基反应的条件包括：氩气保护，温度为40-60℃，时间为4-6小时。
9.一种如权利要求1所述的环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP或如权利要求2-8任一项所述的制备方法制备得到的环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP在制备先天免疫激活剂中的应用。
10.一种如权利要求1所述的环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP或如权利要求2-8任一项所述的制备方法制备得到的环二核苷酸2′,3′-cG4′-MeAMP在制备治疗STING功能缺陷相关疾病的药物中的应用。
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