CN120714106A - 一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种异种骨‑微孔金属植入物复合材料的制备方法，属于生物技术领域；将微孔金属植入物植入到异种动物松质骨中，经过12周时间，微孔金属植入物与异种动物松质骨进行骨整合连接，形成界面互穿结构，将微孔金属植入物取出，保留1mm‑10mm厚度的周围骨，再依次进行梯度脱钙和完全脱细胞处理，获得具有高骨诱导活性、强骨整合性和低免疫原性的异种骨‑微孔金属植入物复合材料；本发明将金属植入物材料转变为生物活性植入物复合材料，将金属植入物与移植骨的异质界面转变为宿主骨或移植骨与移植骨的同质界面，解决了移植骨与金属植入物界面骨整合不良的临床难题。

Description

一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法。

背景技术

伴有骨缺损的植入物植入手术包括人工关节翻修、种植牙、界面螺钉等等是骨科领域一项极具挑战性的临床问题。骨缺损的广泛性与复杂性不仅构成了手术操作的核心难点，更是影响植入物初始稳定性和远期骨整合效果的关键因素。骨移植是修复骨缺损的常用策略，但其与植入物难以像宿主骨一样实现骨整合。

为了解决这一问题，现有的临床策略主要为前期将移植骨填充至骨缺损部位，待其成活并再生为宿主骨后，进行植入物植入手术。临床上鲜有体内组织工程的方法，该方法基于CT扫描与计算机辅助设计构建个体化钛网笼以匹配骨缺损形态，其内填充由BMP-7与自体骨髓复合浸润的人工骨颗粒，移植到自体肌肉内异位成骨后，进行骨缺损部位的吻合血管移植。然而，该方案存在二次手术和额外副损伤大等问题，能否形成植入物骨整合尚需进一步实验验证。在骨缺损部位一次性植入移植骨和植入物方案，有动物实验证明局部应用骨形态发生蛋白可促进移植骨与金属植入物界面整合，但也有相反结论的报道，尚无临床应用。

发明人进行了自体骨-微孔金属植入物复合材料植入骨缺损部位实验，证实自体骨-微孔金属植入物骨整合界面在移植骨和宿主骨融合过程中能够维持骨整合状态。该实验的过程和结论于2024年发表在杂志《Frontiers in Bioengineering andBiotechnology》上，题目为《 “Metal-bone” scaffold for accelerated peri-implantendosseous healing》。但除了假体周围骨折外，这种方法因自体骨来源有限及其伴随的供区损伤，严重制约了该方法在临床的广泛应用。

上述实验研究为异种骨-微孔金属植入物复合材料修复骨缺损奠定了基础。最后，梯度脱钙、完全脱细胞处理可以实现低免疫原性、相对高成骨活性和较强的骨整合性，实验结果表明骨整合状态维持良好。

发明内容

本发明的目的是为了解决在伴有骨缺损的植入物植入手术中移植骨与金属植入物界面间骨整合不良的问题，提供一种具有高骨诱导活性、强骨整合性和低免疫原性的异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法。

本发明创新性地提出了异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备和移植应用策略：通过预先将微孔金属植入物植入到异种动物的松质骨内，利用其体内微环境促使微孔金属植入物与异种骨通过骨整合形成稳定的复合结构，继而将异种骨-微孔金属植入物复合材料取出，实施梯度脱钙和完全脱细胞处理，在维持原有骨整合的前提下获得兼具高骨诱导活性和低免疫原性的复合材料，最终将其植入到骨缺损部位。异种骨来源广泛，脱细胞异种骨极大地降低了免疫原性，植入骨缺损后可以与宿主骨形成有效融合，并被新生骨组织逐渐取代。

《Biomaterials Science》杂志（发表时间为2019年）发表的《A cancellous bonematrix system with specific mineralisation degrees for mesenchymal stem celldifferentiation and bone regeneration》，其中的研究表明，部分脱钙能够提升异种骨的骨诱导活性。

本发明将金属植入物材料转变为生物活性植入物复合材料，将金属植入物与移植骨的异质界面转变为宿主骨或移植骨与移植骨的同质界面，解决了移植骨与金属植入物界面骨整合不良的临床难题。

一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将微孔金属植入物植入到异种动物松质骨中，经过12周时间，微孔金属植入物与异种动物松质骨进行骨整合连接，形成界面互穿结构，将微孔金属植入物取出，保留1mm-10mm厚度的周围骨，得到初态异种骨-微孔金属植入物复合材料；

步骤二、对步骤一中得到的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料依次进行梯度脱钙和完全脱细胞处理，获得具有高骨诱导活性、强骨整合性和低免疫原性的异种骨-微孔金属植入物复合材料。

所述的步骤二中梯度脱钙的方法为：将初态异种骨-微孔金属植入物复合材料置于EDTA-2Na溶液中，在超声波脱钙仪中脱钙72h，使初态异种骨-微孔金属植入物复合材料外层完全脱钙、内层部分脱钙。

所述的EDTA-2Na溶液的质量浓度为10%-12%；脱钙过程中，超声波脱钙仪中的温度设置为10-15度，超声波脱钙仪的超声功率设置为200-300W。

所述的步骤二中完全脱细胞处理的方法为：

1）、将梯度脱钙后的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料置于Tris-HCl溶液中，进行3-5个冻融循环，每个循环为-80度～37度；

所述的Tris-HCl溶液浓度为10-12mM，并用氢氧化钠溶液将其pH调整至7-8；

2）、再置于超临界二氧化碳萃取仪中处理8-10h，助溶剂为无水乙醇；

所述的超临界二氧化碳萃取仪的压力设置为300-350 bar，温度设置为35-40度；

3）、将经过上述步骤的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料放入含Triton X-100的缓冲液中，4度环境下震荡24-72h；

所述的Triton X-100的质量浓度为0.5%-1%。

所述的步骤一中的异种动物为大鼠或兔或猪或牛。

所述的微孔金属植入物采用微孔金属3D打印而成。

所述的微孔金属植入物材质为TPMS微孔钛合金。

通过本发明所述的方法制备的异种骨-微孔金属植入物复合材料经梯度脱钙和完全脱细胞处理后，异种骨与微孔金属植入物的骨整合界面依旧完整。

通过本发明所述的方法制备的异种骨-微孔金属植入物复合材料应用于伴有骨缺损的金属植入物植入手术。

通过本发明所述的方法制备的异种骨-微孔金属植入物复合材料直接与宿主骨接触或通过移植骨与宿主骨接触，充填骨缺损并获得稳定的生物学固定。

本发明的工作原理：

首先微孔金属植入物植入大鼠、兔、猪或牛等异种活体动物的松质骨内，利用其内在的微环境促进骨组织长入微孔金属植入物，并与之形成稳定可靠的骨整合。随后将微孔金属植入物连同周围1mm-10mm骨质一同取出，经梯度脱钙和完全脱细胞处理后获得具有强骨整合性、高骨诱导活性和低免疫原性的异种骨-微孔金属植入物复合材料。针对患处骨缺损的具体形态，采用 3D CAD/CAM 技术对复合材料中的骨组织进行精准雕刻，使其形状与缺损部位完全匹配。若骨缺损范围过大，可在宿主骨与复合材料之间填充经梯度脱钙和完全脱细胞处理的异种松质骨块，以实现缺损的完全匹配。植入后，宿主骨通过骨传导（沿移植材料表面生长）和骨诱导（诱导未分化细胞分化为成骨细胞）两种方式，在复合材料表面实现新骨形成与爬行替代，最终达成宿主骨、异种移植骨与微孔金属植入物之间的骨融合和骨整合，促进骨缺损的修复和植入物的牢固整合。

针对临床上伴有骨缺损的髋臼翻修手术，根据患者髋臼处骨缺损的具体形态，采用 3D CAD/CAM 技术对复合材料中的骨组织进行精准雕刻，使其形状与缺损部位完全匹配。随后将个体化定制的复合材料植入患者的髋臼处，并通过螺钉辅助固定。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法，通过该方法制备的异种骨-微孔金属植入物复合材料具有高骨诱导活性和低免疫原性，其核心优势在于提出了一种来源广泛且不会对人体造成副损伤的创新策略，有效解决了伴有骨缺损的植入物植入手术中“金属植入物-移植骨界面整合”这一关键难题。一方面，通过预先构建微孔金属植入物与异种骨的稳定复合结构，将移植骨与微孔金属植入物的异质界面转变为移植骨与宿主骨的同质界面，并实施梯度脱钙和完全脱细胞处理，使复合材料中的异种骨具有高骨诱导活性和低免疫原性，实现了宿主骨与移植骨的骨融合和移植骨与微孔金属植入物界面骨整合的维持；另一方面，异种骨骨量丰富、价格低廉。这种来源可靠、成本可控、适配性强的特性，使得本发明具有突出的临床应用潜力和广阔的临床转化价值。

Triton X-100中文名称为曲拉通X-100或聚乙二醇叔辛基苯基醚。

Tris-HCl中文名称为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。

EDTA-2Na中文名称为乙二胺四乙酸二钠。

附图说明

图1为本发明实施例1中3D打印的TPMS微孔钛合金支架的横向视图。

图2为本发明实施例1的3D打印的TPMS微孔钛合金支架的纵向视图。

图3为本发明实施例1的3D打印TPMS微孔钛合金支架的扫描电镜图。

图4为本发明实施例1的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料的micro-CT照片。

图5为本发明实施例1的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料的组织学切片照片。

图6为本发明实施例1所制备的异种骨-微孔金属植入物复合材料的实物图片。

图7为本发明实施例1所制备的异种骨-微孔金属植入物复合材料的micro-CT照片。

图8为本发明中实施例1、对照例1和对照例2所制备的复合材料的扫描电镜和能谱分析图。

图9为本发明中实施例1中的未处理的初态复合材料、经脱钙-脱细胞后的复合材料以及对照例1、对照例2所制备的复合材料的力学拔出实验图。

图10为本发明中实施例1中的未处理的初态复合材料、经脱钙-脱细胞后的复合材料以及对照例1、对照例2所制备的复合材料的力学拔出实验结果对比图。

图11为本发明中实施例1中的未处理的初态复合材料、经脱钙-脱细胞后的复合材料以及对照例1、对照例2所制备的复合材料的DNA残量测定结果分析图。

图12为本发明中实施例1中的未处理的初态复合材料、经脱钙-脱细胞后的复合材料以及对照例1、对照例2所制备的复合材料的α-gal检测结果分析图。

图13为本发明中实施例1中的未处理的初态复合材料、经脱钙-脱细胞后的复合材料以及对照例1、对照例2所制备的复合材料的通过酶联免疫吸附试验 (ELISA) 定量检测BMP-2的结果分析图。

图14为本发明实施例1制备完成的复合材料植入兔骨12周后的micro-CT图像。

图15为本发明实施例1制备完成的复合材料植入兔骨12周后的硬组织切片图。

具体实施方式

请参阅图1至图7所示，为本发明的实施例1。

一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将3D打印的TPMS微孔钛合金支架（具体参数为：直径3mm、高度6mm、孔隙率70%、孔径500μm）植入大鼠股骨外侧髁松质骨。使用手术刀于股骨远端外侧作1 cm切口，通过钝性分离皮下肌肉、韧带及血管显露外侧髁。随后，采用直径3 mm的骨科钻头，在股骨远端建立深度6 mm的骨缺损腔，其尺寸与待植入的上述支架精确匹配。仔细清除缺损区骨碎屑，并以生理盐水冲洗。随后将上述支架压配植入股骨缺损腔内。逐层缝合切口。待植入后12周处死大鼠，将上述支架连带周围骨质一同取出，保留1mm厚度的周围骨，获得初态异种骨-微孔金属植入物复合材料。

步骤二、对步骤一中得到的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料依次进行梯度脱钙和完全脱细胞处理，获得具有高骨诱导活性、强骨整合性和低免疫原性的异种骨-微孔金属植入物复合材料。

所述的步骤二中梯度脱钙的方法为：将初态异种骨-微孔金属植入物复合材料置于质量浓度为12%的EDTA-2Na溶液中，在超声波脱钙仪中脱钙72h，其中每24小时更换一次脱钙液，使初态异种骨-微孔金属植入物复合材料外层完全脱钙、内层部分脱钙。脱钙过程中，超声波脱钙仪中的温度设置为15度，超声波脱钙仪的超声功率设置为250W。完成梯度脱钙。

所述的步骤二中完全脱细胞处理的方法为：

1）、将梯度脱钙后的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料置于10mM且pH=8的Tris-HCl溶液中，进行3个冻融循环，每个循环为-80度～37度；

2）、再置于超临界二氧化碳萃取仪中处理8h，助溶剂为无水乙醇；超临界二氧化碳萃取仪的压力设置为350 bar，温度设置为35-40度；

3）、将经过上述步骤的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料放入质量浓度为1%的Triton X-100的缓冲液中，4度环境下震荡24h；完成完全脱细胞处理。

至此，完成异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备。

如图4所示，通过micro-CT证实骨长入到金属微孔内，与金属支架形成了机械交锁。

如图5所示，通过组织学切片，进一步证实所制备的复合材料中异种骨与微孔金属植入物完成了骨整合，且其机制主要为骨传导。

对照例1：

根据上述实施例中步骤一制备出初态异种骨-微孔金属植入物复合材料后对其进行单纯脱细胞处理，具体步骤如下：

1）将初态异种骨-微孔金属植入物复合材料置于Tris-HCl溶液（10mM，pH=8）中，进行3个冻融循环，每个循环为-80度~37度；

2）置于超临界二氧化碳萃取仪（压力：350 bar，温度：35-40度）中处理8h，助溶剂为无水乙醇；

3）将将经过上述步骤的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料放入质量浓度为1%的 Triton X-100缓冲液中，4度环境下震荡24h。

对照例2：

根据上述实施例中步骤一制备出初态异种骨-微孔金属植入物复合材料后对其进行脱蛋白处理，具体步骤如下：

1）将初态异种骨-微孔金属植入物复合材料置于质量浓度为20% 的过氧化氢溶液中72 h，其中每24 h换液一次；

2）用流水冲洗后，将将经过上述步骤的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料放入置于氯仿-甲醇（体积比1：1）溶液中，脱脂24 h。

请参阅图8至图13，根据实施例1、对照例1、对照例2分别制备出梯度脱钙和完全脱细胞异种骨-微孔金属植入物复合材料、脱细胞异种骨-微孔金属植入物复合材料和脱蛋白异种骨-微孔金属植入物复合材料，并对其进行表征。

首先进行力学拔出实验，表明经不同去免疫原性处理后，异种骨与微孔金属植入物的连接强度为：脱细胞组 > 梯度脱钙和完全脱细胞组 > 脱蛋白组。进一步的，通过扫描电镜评估经不同去免疫原性处理后骨-微孔金属植入物界面连接的变化。结果发现，脱蛋白处理后骨-微孔金属植入物界面出现明显裂隙，骨整合被破坏，而其它两种方式处理后骨整合界面依旧完整。能谱分析进一步揭示了骨-植入物界面的物质基础，即脱细胞处理保留了胶原纤维和羟基磷灰石；梯度脱钙的连接是胶原连接和少量羟基磷灰石；脱蛋白后失去了连接。

图8中，SEM为扫描电镜，EDS为能谱分析图。

图10、图11、图12、图13中，*表示统计显著性，*数目越多，表示统计显著性越强。

根据实施例1、对照例1、对照例2分别制备了梯度脱钙和完全脱细胞异种骨-微孔金属植入物复合材料、脱细胞异种骨-微孔金属植入物复合材料及脱蛋白异种骨-微孔金属植入物复合材料。为评估不同处理策略对异种骨免疫原性的影响，对各组材料进行了DNA残留量及α-gal抗原含量测定。分析结果显示，脱蛋白异种骨-微孔金属植入物复合材料组的免疫原性最低；梯度脱钙和完全脱细胞异种骨-微孔金属植入物复合材料材料的免疫原性残留次之，且与脱蛋白异种骨-微孔金属植入物复合材料组无统计学显著性差异；而脱细胞异种骨-微孔金属植入物复合材料组材料的免疫原性残留水平最高。进一步，通过ELISA定量检测骨形态发生蛋白-2 (BMP-2) 含量，以评价不同去免疫原性处理后异种骨的生物活性保留情况。检测数据表明，脱蛋白异种骨-微孔金属植入物复合材料组几乎检测不到BMP-2；脱细胞异种骨-微孔金属植入物复合材料组BMP-2含量亦处于较低水平；与之形成鲜明对比的是，梯度脱钙和完全脱细胞异种骨-微孔金属植入物复合材料组呈现出最高的BMP-2含量。

由于脱蛋白处理后破坏了骨与金属植入物的骨整合界面，因此不适用于异种骨-微孔金属植入物复合材料的去免疫原性处理；且与梯度脱钙和完全脱细胞异种骨-微孔金属植入物复合材料相比，脱细胞异种骨-微孔金属植入物复合材料的骨诱导活性较低，免疫原性残留相对较高。因此我们最终选择梯度脱钙和完全脱细胞异种骨-微孔金属植入物复合材料进行异种移植实验。

如图14和图15所示，将经过实施例1制备出的梯度脱钙和完全脱细胞后的异种骨-微孔金属植入物复合材料植入兔股骨外侧髁骨缺损处，12周后，对植入处进行micro-CT图像和硬组织切片图像可见，宿主骨与复合材料中的异种骨融合良好，无明显间隙，进一步证明，经梯度脱钙和完全脱细胞处理后的异种骨-微孔金属植入物复合材料具有低免疫原性，能够修复骨缺损并促进移植骨与植入物的骨整合。

以牛骨作为异种骨进行实施例2。

一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将3D打印的TPMS微孔钛合金髋臼假体（具体参数为：直径54mm、孔隙率70%、孔径500μm）植入牛髋臼。采用后侧入路，逐层解剖。在大转子处切断外旋肌群，切开关节囊，将髋关节脱位。充分暴露髋臼窝，使用一系列从小到大、带弧度的髋臼锉磨削髋臼软骨和软骨下骨，直至露出均匀渗血的松质骨床，形成与假体匹配的半球形骨床，最终将上述髋臼假体植入骨床，通过螺钉辅助固定。待植入后12周进行手术，将上述假体连带周围骨质一同取出，保留假体周围10 mm厚度的骨组织，获得初态异种骨-微孔金属植入物复合材料。

步骤二、对步骤一中得到的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料依次进行梯度脱钙和完全脱细胞处理，获得具有高骨诱导活性、强骨整合性和低免疫原性的异种骨-微孔金属植入物复合材料。

所述的步骤二中梯度脱钙的方法为：将初态异种骨-微孔金属植入物复合材料置于质量浓度为12%的EDTA-2Na溶液中，在超声波脱钙仪中脱钙72h，其中每24小时更换一次脱钙液，使初态异种骨-微孔金属植入物复合材料外层完全脱钙、内层部分脱钙。脱钙过程中，超声波脱钙仪中的温度设置为15度，超声波脱钙仪的超声功率设置为250W。完成梯度脱钙。

所述的步骤二中完全脱细胞处理的方法为：

1）、将梯度脱钙后的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料置于10mM且pH=8的Tris-HCl溶液中，进行3个冻融循环，每个循环为-80度～37度；

2）、再置于超临界二氧化碳萃取仪中处理8h，助溶剂为无水乙醇；超临界二氧化碳萃取仪的压力设置为350 bar，温度设置为35-40度；

3）、将经过上述步骤的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料放入质量浓度为1%的Triton X-100的缓冲液中，4度环境下震荡24h；完成完全脱细胞处理。

至此，完成异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备。

针对临床上伴有骨缺损的髋臼翻修手术，根据患者髋臼处骨缺损的具体形态，采用 3D CAD/CAM 技术对复合材料中的骨组织进行精准雕刻，使其形状与缺损部位完全匹配。随后将个体化定制的复合材料植入患者的髋臼处，并通过螺钉辅助固定。

Claims (8)

1.一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一、将微孔金属植入物植入到异种动物的松质骨中，经过12周时间，微孔金属植入物与异种动物的松质骨进行骨整合连接，形成界面互穿结构，将微孔金属植入物取出，保留1mm-10mm厚度的周围骨，得到初态异种骨-微孔金属植入物复合材料；

步骤二、对步骤一中得到的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料依次进行梯度脱钙和完全脱细胞处理，获得具有高骨诱导活性、强骨整合性和低免疫原性的异种骨-微孔金属植入物复合材料。

2.根据权利要求1所述的一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法，其特征在于：所述的步骤二中梯度脱钙的方法为：将初态异种骨-微孔金属植入物复合材料置于EDTA-2Na溶液中，在超声波脱钙仪中脱钙72h，使初态异种骨-微孔金属植入物复合材料外层完全脱钙、内层部分脱钙。

3.根据权利要求1所述的一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法，其特征在于：所述的步骤二中完全脱细胞处理的方法为：

1）、将梯度脱钙后的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料置于Tris-HCl溶液中，进行3-5个冻融循环，每个循环为-80度～37度；

2）、再置于超临界二氧化碳萃取仪中处理8-10h，助溶剂为无水乙醇；

3）、将经过上述步骤的初态异种骨-微孔金属植入物复合材料放入含Triton X-100的缓冲液中，4度环境下震荡24-72h。

4.根据权利要求2所述的一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法，其特征在于：所述的EDTA-2Na溶液的质量浓度为10%-12%；脱钙过程中，超声波脱钙仪中的温度设置为10-15度，超声波脱钙仪的超声功率设置为200-300W。

5.根据权利要求3所述的一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法，其特征在于：

所述的Tris-HCl溶液浓度为10-12mM，并用氢氧化钠溶液将其pH调整至7-8；

所述的超临界二氧化碳萃取仪的压力设置为300-350 bar，温度设置为35-40度；

所述的Triton X-100的质量浓度为0.5%-1%。

6.根据权利要求1所述的一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法，其特征在于：所述的步骤一中的异种动物为大鼠或兔或猪或牛。

7.根据权利要求1所述的一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法，其特征在于：所述的微孔金属植入物采用微孔金属3D打印而成。

8.根据权利要求1所述的一种异种骨-微孔金属植入物复合材料的制备方法，其特征在于：所述的微孔金属植入物材质为TPMS微孔钛合金。