CN120700011A

CN120700011A - 合成单萜的基因工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN120700011A
Application number: CN202510930601.0A
Authority: CN
Inventors: 吕镇梅; 付雪妮; 范思情; 陈虹宇
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2025-07-04
Filing date: 2025-07-04
Publication date: 2025-09-26

Abstract

本发明提供合成单萜的基因工程菌及其构建方法与应用，涉及生物工程领域，尤其涉及基因组合、表达载体、宿主及其应用。本发明提供的工程菌是以耐受多种单萜的Pseudomonasputida KT2440作为底盘细胞，敲除内切酶编码基因endA、endX，并引入异源香叶酸合成模块。在此基础上，通过筛选不同生物来源的关键限速酶基因模块以系统性强化内源MEP代谢通路。经上述代谢强化后，工程菌株成功实现香叶酸的异源生物合成，其产量较原始菌株获得较大提升。本发明首次通过系统性优化MEP途径提升了香叶酸的产量，为微生物法生产单萜类化合物提供了优化方案。本发明的重组恶臭假单胞菌构建方法高效简单，可操作性强。

Description

合成单萜的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及合成单萜的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

萜类是一个庞大而多样的家族，在医疗、农业、能源等领域均具有重要的应用价值，到2025年其全球市场规模预计超过10亿美元。香叶酸(Geranic acid)是一种高价值的单萜化合物，分子式为C₁₀H₁₆O₂，可用作化妆品中的增香剂，同时具有抗真菌、杀虫、抑制皮肤中黑色素合成的能力。此外，最近的研究表明，以香叶酸和胆碱为主要成分的离子溶液可用于治疗红斑痤疮、胰管腺癌。

目前萜类化合物的生产方式主要有植物提取、化学合成和生物合成三种。与植物提取和化学合成相比，开发微生物细胞工厂，利用可再生原料发酵生产萜类化合物的生物合成方式具有可持续、绿色、高滴度和高纯度等优势。然而，目前单萜化合物在微生物宿主中的生产水平普遍较低，大多数难以达到工业规模水平，单萜化合物的毒性被认为是阻碍其高效微生物生产的主要瓶颈。因此，开发更为稳健、产物耐受性更高的工程菌株，构建更为高效、稳定和多功能的微生物萜类化合物合成平台具有重要意义。

恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)是一种土壤细菌，作为模式生物之一，因其高安全性、非致病性、简单的营养需求、强大的环境适应性和鲁棒性，以及成熟的遗传操作工具，在生物制造领域展现出巨大潜力，目前已成为实验室和工业规模生产中的重要平台之一。与其他工业微生物相比，P.putida在高浓度萜类化合物的耐受性方面表现出显著优势，这一特性使其在大规模生产细胞毒性较高的萜类化合物方面具有巨大潜力。

尽管已有研究尝试利用P.putida进行紫苏酸、香叶酸等萜类物质的生物合成，但现有技术路径所获得的产物产量仍未达到工业化应用的要求。主要限制因素在于，该菌株通过内源性2-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphatepathway，MEP)途径合成萜类前体异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)的效率较低。在野生型菌株中，MEP途径关键酶编码基因的表达水平较低，导致代谢通量受限，前体供给不足，无法满足萜类化合物高效合成的需求。目前，关于萜类前体供应优化的研究主要集中于外源引入甲羟戊酸(mevalonate，MVA)途径，而针对内源MEP途径的强化研究较为有限。通过改造MEP途径以增强萜类化合物的合成潜力的策略，虽然已有一些探索，但效果仍然有限。因此，如何有效解除MEP途径的限速步骤，显著提高萜类前体的供给能力，是发挥P.putida等模式菌株在萜类合成中的潜力的核心突破点。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了合成单萜的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明提供的恶臭假单胞菌中香叶酸的合成途径如图1所示。本发明中产香叶酸的重组恶臭假单胞菌是基于敲除内切酶编码基因endA、endX的底盘细胞，增强了外源基因的稳定性。本发明中的重组恶臭假单胞菌实现了天然产物香叶酸的合成，重组菌KNGG发酵72h后能合成3.20mg/L香叶酸。在如前所述的重组菌KSE、KDE、KFE、KIE、KSD、KSC、KIB、KDP、KFP中，菌株KIB具有最高的香叶酸产量，发酵72h后能合成23.22mg/L香叶酸，比初始菌株KNGG提高了6.3倍。本发明首次通过系统性优化MEP途径提升了香叶酸的产量，在单萜合成方面具有良好的应用前景。本发明的重组恶臭假单胞菌构建方法高效简单，可操作性强。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了基因组合，包括：内源基因和外源基因；

所述内源基因包括：endA基因、endX基因、ispD基因和ispF基因中的一种或多种；

所述外源基因包括：GPPS基因、GES基因、dxs基因、ispD基因、ispF基因和idi基因中的一种或多种；

所述内源基因来源于：恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida KT2440)。

在本发明的一些实施方案中，上述基因组合中所述endA基因和所述endX基因采用敲除的步骤；所述ispD基因和所述ispF基因采用过表达的步骤。

在本发明的一些实施方案中，上述基因组合中所述外源基因中：

所述GPPS基因来源于：大冷杉(Abiesgrandis)；和/或

所述GES基因来源于罗勒(Ocimum basilicum)；和/或

所述dxs基因来源于大肠杆菌(E.coli K12 MG1655)、耐辐射奇球菌(Deinococcusradiodurans)和毛喉鞘蕊花(Coleusforskohlii)中的任意一种；和/或

所述ispD基因和所述ispF基因来源于大肠杆菌(E.coliK12 MG1655)；和/或

所述idi基因来源于大肠杆菌(E.coliK12 MG1655)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis subsp.subtilis str.168)。

在本发明的一些实施方案中，上述基因组合中，所述GPPS基因具有：

(1)、如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(2)、具有(1)所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(3)、与(1)所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(4)、如(1)、(2)或(3)所示序列的互补序列；和/或

所述GES基因具有：

(5)、如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

(6)、具有(5)所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(7)、与(5)所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(8)、如(5)、(6)或(7)所示序列的互补序列；和/或

所述dxs基因具有：

(9)、如SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:5任一所示的核苷酸序列；

(10)、具有(9)所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(11)、与(9)所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(12)、如(9)、(10)或(11)所示序列的互补序列；和/或

所述外源基因中的所述ispD基因具有：

(13)、如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

(14)、具有(13)所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(15)、与(13)所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(16)、如(13)、(14)或(15)所示序列的互补序列；和/或

所述外源基因中的所述ispF基因具有：

(17)、如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

(18)、具有(17)所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(19)、与(17)所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(20)、如(17)、(18)或(19)所示序列的互补序列；和/或

所述idi基因具有：

(21)、如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；

(22)、具有(21)所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(23)、与(21)所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(24)、如(21)、(22)或(23)所示序列的互补序列。

在本发明的一些实施方案中，上述基因组合中，SEQ ID NO:1的序列为：ATGTTCGACTTCAACAAGTACATGGACAGCAAGGCCATGACAGTCAACGAAGCCCTCAACAAAGCTATTCCCCTGCGCTACCCGCAGAAGATTTACGAGTCGATGCGCTATTCATTGCTAGCCGGCGGTAAGCGTGTTCGCCCGGTGCTGTGCATCGCTGCATGCGAGCTGGTGGGCGGCACCGAAGAGTTGGCCATCCCGACAGCCTGCGCCATCGAGATGATCCATACCATGAGCCTGATGCACGATGATTTGCCGTGCATCGACAACGACGACCTGCGGCGTGGTAAGCCGACCAACCACAAGATCTTCGGTGAAGACACGGCGGTAACGGCTGGCAACGCGCTGCACAGCTACGCCTTCGAGCACATCGCTGTCAGTACTTCCAAAACGGTGGGTGCCGATCGCATCTTGCGCATGGTCTCGGAACTGGGGCGTGCGACCGGCAGCGAGGGCGTGATGGGTGGCCAGATGGTGGACATCGCCAGCGAAGGCGACCCGTCGATAGACCTGCAGACCCTGGAGTGGATCCATATCCACAAGACCGCGATGCTGCTCGAATGCAGTGTGGTCTGTGGTGCCATTATCGGCGGGGCCTCCGAAATCGTGATCGAACGCGCCCGGCGTTATGCCCGCTGTGTCGGCCTGCTGTTCCAGGTGGTGGATGACATTCTGGACGTGACCAAAAGCAGTGATGAGCTGGGCAAAACTGCCGGCAAGGACCTGATCTCCGACAAGGCCACCTACCCCAAGCTGATGGGCCTGGAAAAAGCCAAGGAGTTTAGCGACGAATTGCTGAATCGGGCGAAGGGCGAGCTGTCCTGCTTCGATCCAGTTAAGGCGGCGCCACTGCTTGGGCTGGCCGACTACGTAGCATTTCGCCAGAACTAA。

在本发明的一些实施方案中，上述基因组合中，SEQ ID NO:2的序列为：ATGGAGGAGAGTAGCTCGAAGCGCCGCGAGTACCTGCTCGAAGAAACCACCCGCAAGCTGCAGCGTAACGACACGGAAAGTGTTGAGAAACTGAAGCTGATTGATAACATCCAGCAGCTGGGGATCGGCTACTACTTCGAGGACGCCATCAACGCCGTGCTGCGCAGCCCGTTCTCGACCGGGGAGGAAGACCTTTTTACTGCCGCTCTCCGTTTCCGCCTGCTCCGCCACAACGGGATTGAAATTAGCCCCGAGATCTTCCTGAAGTTCAAGGACGAACGCGGCAAATTCGACGAGTCCGATACACTCGGCCTGCTCAGCCTCTACGAGGCCAGCAACCTGGGGGTCGCTGGTGAAGAGATCTTGGAGGAGGCTATGGAGTTCGCCGAAGCTCGCCTGCGTCGCTCGTTGAGCGAGCCGGCTGCGCCGCTGCATGGCGAGGTGGCCCAGGCCCTGGACGTGCCGCGTCACCTGCGCATGGCCCGACTGGAAGCCCGGCGCTTCATCGAGCAGTATGGCAAGCAGAGCGACCACGATGGCGATTTGCTGGAGCTGGCGATCCTCGACTACAACCAGGTGCAGGCGCAGCATCAAAGCGAACTGACTGAGATCATCCGCTGGTGGAAGGAACTGGGCTTGGTCGACAAGCTCAGCTTCGGCCGTGACCGCCCACTGGAGTGCTTCTTGTGGACGGTCGGCCTGCTGCCAGAACCTAAGTACTCGTCGGTGCGCATTGAGCTGGCCAAGGCCATCTCCATCCTACTGGTCATCGATGATATCTTCGATACCTACGGCGAAATGGACGATTTAATTCTGTTCACCGACGCGATTCGTCGCTGGGACCTGGAGGCCATGGAAGGCCTGCCGGAGTACATGAAGATCTGCTATATGGCACTTTACAATACCACCAACGAAGTGTGCTACAAGGTCCTGCGGGATACCGGCAGGATCGTTCTGCTGAACTTGAAGAGCACCTGGATCGACATGATCGAGGGCTTCATGGAAGAAGCAAAGTGGTTCAACGGTGGATCTGCGCCGAAACTGGAAGAGTACATCGAAAACGGCGTCTCCACGGCAGGCGCCTACATGGCCTTTGCCCATATCTTCTTCCTGATCGGTGAGGGCGTTACGCACCAGAACAGCCAACTTTTCACTCAGAAACCCTATCCCAAGGTGTTCAGCGCCGCCGGTCGCATTCTGCGACTGTGGGACGACCTGGGCACCGCCAAAGAGGAACAGGAGCGCGGTGACCTGGCCAGTTGCGTGCAACTATTCATGAAAGAAAAGTCGCTGACCGAAGAAGAAGCCCGGTCCCGGATCCTCGAAGAAATAAAAGGCTTGTGGCGCGACCTGAATGGGGAGCTGGTGTACAACAAGAACCTGCCGCTGTCCATCATCAAGGTAGCCCTGAACATGGCGCGCGCGTCGCAGGTGGTGTATAAGCACGACCAGGACACCTATTTTAGTAGCGTAGACAACTACGTGGATGCCTTGTTCTTCACACAATAA。

在本发明的一些实施方案中，上述基因组合中，SEQ ID NO:3的序列为：ATGAGCTTTGACATCGCCAAGTACCCCACTCTGGCCCTAGTCGACAGCACCCAGGAGCTGCGCCTCCTGCCCAAAGAATCGCTGCCAAAGCTGTGCGACGAGCTGCGGCGCTATTTGCTGGACTCGGTGTCGCGTTCAAGTGGTCACTTCGCGTCCGGGCTGGGCACGGTCGAACTCACGGTAGCCCTTCATTATGTGTACAACACCCCGTTCGACCAACTGATCTGGGACGTCGGTCATCAGGCGTACCCCCACAAGATCCTCACCGGCCGTCGCGACAAGATTGGCACCATCCGCCAAAAGGGCGGCCTGCACCCGTTTCCGTGGCGCGGCGAAAGCGAGTACGACGTTCTGAGCGTGGGCCACTCGTCTACAAGTATTTCCGCTGGTATCGGCATCGCTGTTGCCGCCGAAAAGGAAGGCAAGAATCGCCGTACCGTGTGCGTGATAGGCGATGGAGCAATTACTGCCGGCATGGCCTTCGAAGCCATGAACCATGCCGGTGACATCCGACCGGACATGCTGGTGATCCTGAATGACAATGAAATGTCCATCAGCGAAAACGTCGGAGCGCTGAACAACCACCTGGCCCAGCTGTTGTCCGGGAAGCTGTATAGCTCACTGCGCGAAGGTGGCAAAAAAGTGTTCAGCGGCGTGCCTCCGATCAAGGAGCTACTTAAGCGCACCGAGGAGCATATCAAAGGCATGGTGGTCCCGGGCACGCTGTTCGAGGAATTGGGCTTCAACTACATCGGTCCTGTAGACGGCCATGACGTGCTGGGGCTGATCACCACCCTCAAGAACATGCGTGACCTGAAAGGCCCGCAGTTCCTGCATATCATGACCAAGAAGGGTCGGGGTTACGAGCCGGCGGAGAAGGACCCGATCACCTTCCACGCCGTGCCTAAGTTCGATCCGAGCAGTGGCTGCCTGCCCAAGAGCAGCGGCGGGCTCCCCAGCTACTCGAAAATCTTCGGCGACTGGCTCTGCGAGACCGCGGCTAAGGACAACAAGCTGATGGCGATTACGCCAGCGATGCGGGAGGGCAGCGGGATGGTAGAGTTCTCGAGGAAATTCCCGGATCGCTACTTCGATGTGGCCATTGCCGAGCAGCACGCAGTCACCTTCGCCGCAGGCCTGGCCATCGGCGGCTACAAGCCCATCGTGGCGATCTACTCGACCTTTCTGCAGCGCGCCTATGACCAGGTGCTGCACGATGTTGCGATCCAGAAGCTGCCGGTATTGTTTGCCATCGACCGGGCGGGCATCGTCGGGGCCGACGGCCAGACCCACCAGGGCGCATTCGATCTGTCCTACCTGCGTTGTATTCCCGAGATGGTCATCATGACTCCATCGGATGAAAACGAGTGCCGCCAGATGCTTTACACCGGCTACCACTACAACGACGGGCCGAGCGCCGTGCGCTATCCGCGGGGCAACGCGGTGGGTGTCGAGCTGACCCCGCTGGAAAAACTTCCAATCGGCAAGGGCATCGTCAAACGCCGCGGCGAGAAACTGGCGATTTTGAACTTCGGTACCCTGATGCCGGAAGCAGCCAAGGTCGCCGAGTCCTTGAATGCCACCCTGGTTGATATGCGCTTCGTCAAGCCTCTCGACGAAGCGTTAATTCTGGAGATGGCTGCCAGCCACGAGGCGCTGGTGACGGTGGAGGAGAACGCGATCATGGGCGGCGCAGGCTCGGGCGTCAACGAAGTGTTGATGGCCCACCGCAAGCCGGTGCCAGTGCTGAACATCGGCCTACCCGACTTCTTCATCCCGCAAGGCACCCAGGAAGAAATGCGTGCCGAACTGGGCCTGGATGCCGCCGGTATGGAAGCCAAGATCAAGGCCTGGCTGGCTTAA。

在本发明的一些实施方案中，上述基因组合中，SEQ ID NO:4的序列为：ATGAATGAGTTACCTGGTACCAGCGACACCCCGCTGCTCGACCAGATCCATGGCCCCAAAGATTTAAAGCGCCTGAGCCGTGAGCAGCTGCCGGCTCTAACCGAAGAACTGCGCGGTGAGATCGTGCGGGTGTGCAGCCGCGGCGGGTTGCATCTGGCCAGTAGCCTGGGCGCGGTCGACATCATCACCGCCTTGCACTATGTGCTCGATAGCCCCCGTGACCGCATCCTGTTCGATGTTGGTCATCAGGCGTATGCACACAAGATCCTGACCGGCCGACGCGACCAGATGGCGGATATCAAGAAGGAGGGTGGCATCAGCGGCTTCACCAAGGTGTCAGAAAGCGAGCATGACGCTATTACAGTCGGGCACGCATCGACCTCGCTGGCCAACGCCCTGGGGATGGCCTTGGCCCGCGATGCGCAGGGTAAGGACTTCCACGTTGCAGCCGTGATCGGCGACGGCAGCCTGACCGGAGGCATGGCATTGGCGGCTCTCAACACCATCGGTGACATGGGCCGCAAGATGCTGATCGTACTGAACGACAACGAAATGAGCATCTCCGAAAACGTTGGCGCCATGAACAAGTTTATGCGTGGCCTGCAGGTACAGAAGTGGTTCCAGGAAGGCGAAGGCGCCGGCAAAAAGGCGGTCGAAGCCGTGTCCAAACCGCTCGCCGACTTCATGTCGCGAGCTAAAAACAGCACGAGGCACTTCTTCGACCCAGCCTCGGTCAACCCGTTCGCCGCGATGGGGGTGCGCTATGTGGGGCCAGTAGATGGCCATAACGTCCAAGAGCTTGTGTGGCTGCTGGAACGCCTGGTGGATCTAGATGGGCCAACCATTCTGCACATCGTGACTACTAAGGGCAAGGGGCTGTCTTATGCAGAGGCGGACCCGATTTACTGGCACGGCCCGGCCAAGTTCGACCCCGCCACCGGCGAGTACGTGCCATCCAGTGCCTACTCGTGGTCGGCAGCCTTCGGCGAAGCTGTCACCGAGTGGGCCAAGACCGACCCCCGGACGTTTGTCGTTACGCCTGCCATGCGCGAGGGCTCCGGTCTTGTGGAATTCAGCCGTGTGCACCCGCACCGGTACCTGGATGTGGGCATTGCCGAAGAGGTCGCGGTGACCACCGCTGCCGGCATGGCATTGCAAGGCATGCGCCCGGTGGTCGCTATCTACAGCACCTTCTTGCAGCGCGCCTACGACCAAGTGCTTCACGACGTCGCCATCGAGCACCTGAATGTAACATTCTGCATCGACCGGGCCGGTATCGTAGGGGCCGACGGGGCCACCCACAATGGTGTGTTCGACCTGAGTTTCCTGCGCAGCATCCCGGGCGTGCGTATAGGTTTGCCTAAAGACGCGGCCGAGCTGCGCGGCATGCTCAAGTACGCTCAGACGCACGACGGCCCGTTTGCCATTCGTTACCCGCGCGGCAACACCGCGCAGGTGCCGGCGGGCACCTGGCCCGACCTGAAATGGGGCGAATGGGAGCGCCTGAAAGGCGGCGACGATGTGGTGATTCTGGCGGGTGGCAAGGCCCTGGACTACGCGTTGAAGGCCGCCGAAGACCTGCCCGGCGTGGGCGTGGTCAATGCCCGCTTCGTCAAGCCTCTGGATGAGGAAATGCTGAGAGAAGTCGGTGGGCGCGCGCGCGCGCTTATCACGGTGGAAGACAACACGGTTGTCGGCGGATTTGGCGGCGCAGTGCTCGAGGCGCTGAACTCCATGAACCTGCATCCGACCGTGCGTGTCTTAGGTATCCCCGATGAGTTCCAGGAGCACGCCACAGCCGAATCGGTACATGCCCGTGCAGGAATCGATGCCCCGGCGATCCGGACCGTCCTCGCGGAGCTGGGCGTCGACGTGCCGATCGAAGTGTAA。

在本发明的一些实施方案中，上述基因组合中，SEQ ID NO:5的序列为：ATGGCTGCGCTGTACCAGGACAATACCAACGACGTGGTGCCCTCGGGCGAAGGCCTGACCCGCCAAAAACCGCGAACGCTGTCGTTCACCGGGGAAAAGCCGAGCACCCCGATCTTAGATACCATCAACTACCCTATTCATATGAAAAATTTATCTGTTGAAGAACTGGAAATCTTGGCTGATGAGTTGCGTGAGGAAATAGTCTACACCGTCTCCAAGACAGGTGGCCATCTTTCCAGCAGTCTCGGCGTGAGCGAGCTGACCGTCGCGCTGCACCACGTGTTCAACACCCCGGATGACAAGATCATCTGGGATGTGGGCCACCAGGCGTACCCGCATAAGATCCTGACCGGCAGGCGTTCGCGGATGCACACGATCCGCCAGACCTTCGGCCTCGCAGGGTTCCCTAAGCGCGACGAATCGCCGCATGATGCCTTTGGGGCCGGTCATTCCTCGACGTCGATAAGCGCCGGCCTGGGTATGGCAGTGGGGCGTGATCTGCTCCAAAAAAACAACCACGTAATCAGTGTGATTGGCGACGGTGCAATGACAGCCGGCCAGGCCTATGAAGCCATGAACAACGCAGGTTTCTTGGACAGTAACTTGATCATCGTGCTGAATGACAACAAACAAGTGAGCTTGCCTACCGCGACGGTTGACGGCCCAGCTCCCCCCGTCGGGGCCCTTAGCAAGGCCCTCACTAAGCTGCAGGCCTCCCGCAAGTTCCGCCAACTGCGCGAAGCCGCCAAGGGCATGACCAAGCAGATGGGTAACCAAGCTCACGAGATCGCCAGCAAAGTAGATACCTACGTGAAGGGCATGATGGGCAAGCCCGGTGCATCGTTGTTCGAAGAACTGGGCATCTACTACATTGGCCCTGTCGACGGGCATAACATCGAAGACCTGGTGTATATCTTTAAGAAGGTCAAGGAGATGCCGGCGCCGGGGCCGGTGCTAATCCACATCATTACCGAAAAAGGTAAAGGTTATCCGCCGGCCGAAGTGGCGGCCGACAAGATGCATGGCGTGGTGAAATTCGACCCGACCACGGGCAAGCAGATGAAGGTCAAGACTAAAACCCAAAGTTACACCCAGTACTTCGCGGAGTCTCTCGTGGCCGAGGCCGAACAGGATGAAAAGGTTGTAGCCATTCACGCCGCCATGGGGGGTGGTACTGGCCTGAACATCTTCCAGAAACGTTTCCCGGACCGCTGCTTCGACGTGGGCATTGCCGAGCAGCACGCCGTCACCTTCGCCGCGGGCCTGGCTACCGAGGGACTAAAGCCGTTCTGTACCATTTACTCGTCGTTTTTGCAGCGCGGCTACGACCAGGTCGTGCACGACGTGGACCTGCAGAAGCTGCCGGTGCGGTTCATGATGGACCGCGCCGGCCTCGTCGGCGCGGATGGCCCCACACACTGCGGCGCCTTCGATACGACCTACATGGCCTGCCTGCCCAACATGGTTGTCATGGCCCCGAGCGACGAGGCCGAGCTGATGCACATGGTAGCGACCGCTGCTGTGATCGACGACCGGCCCAGCTGCGTGCGCTATCCGCGTGGCAACGGCATCGGGGTACCACTGCCACCTAACAACAAGGGTATCCCGTTGGAGGTGGGCAAAGGCCGCATCCTGAAGGAGGGCAACCGCGTGGCTATTCTGGGCTTTGGCACCATCGTGCAGAACTGCCTGGCGGCGGCACAGCTGCTGCAGGAGCACGGCATCTCCGTCAGCGTGGCCGATGCACGCTTCTGCAAACCACTGGACGGGGACCTGATCAAGAACCTGGTTAAGGAACACGAGGTGCTGATCACCGTGGAGGAGGGCAGCATCGGTGGGTTTAGCGCCCATGTCTCGCACTTCCTGAGCCTGAATGGCCTGCTGGACGGTAATCTGAAGTGGCGCCCGATGGTCCTGCCCGACCGGTATATCGACCATGGCGCCTACCCAGATCAGATCGAGGAGGCGGGACTGAGCAGCAAGCACATCGCGGGCACGGTCTTGAGCCTGATCGGCGGCGGCAAGGACTCCCTCCACCTCATCAACATGTAA。

在本发明的一些实施方案中，上述基因组合中，SEQ ID NO:6的序列为：ATGGCGACCACCCACCTGGACGTGTGCGCCGTGGTGCCGGCGGCCGGCTTCGGGCGTCGCATGCAGACCGAGTGCCCGAAGCAATATCTGTCGATCGGCAACCAGACTATCCTGGAGCACAGCGTGCATGCCCTGTTGGCCCATCCCCGGGTGAAGCGCGTAGTGATCGCGATTAGCCCGGGGGATTCGCGCTTCGCCCAGCTGCCGCTCGCTAACCACCCCCAGATCACCGTCGTCGATGGTGGCGACGAACGTGCTGATAGTGTTCTCGCGGGTTTGAAAGCGGCCGGAGATGCACAGTGGGTGCTGGTGCATGACGCCGCCAGGCCTTGTCTGCATCAGGACGACTTGGCCCGCCTGCTGGCCCTATCCGAAACCAGCCGCACCGGCGGCATCCTTGCGGCTCCAGTGCGCGACACCATGAAACGTGCGGAGCCGGGCAAGAATGCCATCGCCCACACCGTCGACCGCAACGGCCTGTGGCACGCACTGACCCCTCAGTTCTTCCCGCGCGAGTTGCTGCACGACTGCCTGACACGAGCACTCAACGAAGGCGCAACGATTACCGACGAGGCCAGCGCCCTGGAATACTGCGGTTTTCACCCACAACTCGTCGAGGGCCGCGCCGACAACATCAAGGTCACGCGGCCCGAAGACCTGGCGCTGGCCGAGTTCTACCTGACTCGGACGATCCACCAGGAAAACACCTAA。

在本发明的一些实施方案中，上述基因组合中，SEQ ID NO:7的序列为：ATGCGCATTGGGCATGGGTTCGATGTGCATGCTTTTGGCGGCGAAGGCCCGATCATCATCGGTGGCGTGCGCATCCCTTATGAAAAAGGCCTGCTGGCCCACAGCGACGGTGATGTTGCCCTGCACGCACTGACCGATGCCTTGCTTGGAGCAGCTGCGCTCGGCGACATCGGCAAGCTGTTCCCGGACACCGACCCGGCCTTCAAGGGTGCCGACTCGCGTGAGCTGCTGCGCGAGGCCTGGCGCCGCATCCAGGCCAAGGGCTACACCCTGGGCAACGTCGATGTGACCATCATTGCGCAAGCGCCCAAGATGCTGCCACACATTCCCCAGATGCGTGTGTTCATCGCCGAAGACCTGGGCTGCCACATGGACGACGTCAACGTGAAGGCGACGACTACGGAGAAACTCGGGTTCACCGGCCGGGGTGAGGGCATCGCCTGCGAAGCCGTAGCGTTGCTGATCAAGGCCACCAAGTAA。

在本发明的一些实施方案中，上述基因组合中，SEQ ID NO:8的序列为：ATGCAAACCGAGCATGTCATTCTGCTCAATGCCCAGGGCGTGCCGACGGGTACCCTGGAGAAGTACGCCGCGCACACCGCCGACACCCGCCTGCACCTGGCCTTCAGCAGCTGGCTGTTCAACGCCAAGGGCCAGTTGCTGGTAACACGGCGTGCCTTGAGCAAGAAAGCCTGGCCGGGGGTGTGGACCAACAGCGTCTGCGGCCACCCGCAACTGGGCGAATCCAACGAAGATGCGGTGATTCGCCGCTGCCGCTACGAGCTGGGTGTGGAAATCACCCCCCCTGAAAGCATCTACCCGGACTTCCGCTATCGTGCGACCGACCCAAGTGGCATCGTCGAGAACGAGGTTTGTCCAGTGTTCGCCGCGCGGACCACGTCGGCTCTGCAGATCAACGACGATGAGGTCATGGACTACCAGTGGTGCGACCTGGCTGATGTGCTGCATGGCATCGACGCAACGCCGTGGGCCTTTTCGCCCTGGATGGTGATGCAGGCCACTAACCGCGAAGCACGCAAGCGTCTTTCCGCGTTCACCCAGCTCAAATAA。

在本发明的一些实施方案中，上述基因组合中，SEQ ID NO:9的序列为：ATGACCAGGGCCGAACGAAAGCGTCAGCACATCAACCACGCCCTTTCTATTGGCCAGAAGCGCGAGACTGGGCTGGACGACATCACCTTCGTGCATGTCTCGCTGCCAGACTTGGCCCTGGAACAGGTCGACATTTCGACAAAAATTGGCGAGCTGTCCTCCAGCAGCCCTATCTTCATCAATGCCATGACGGGGGGTGGGGGCAAGCTCACCTACGAGATCAACAAGTCCCTTGCGCGGGCAGCATCACAAGCGGGTATCCCGCTGGCAGTTGGCAGCCAGATGAGCGCTCTCAAGGACCCGAGTGAGCGCCTGAGCTACGAAATTGTGCGCAAGGAGAACCCCAACGGCTTGATTTTTGCCAACCTCGGTTCGGAAGCCACCGCCGCGCAGGCCAAGGAGGCGGTCGAAATGATAGGTGCAAATGCGCTGCAGATCCACCTGAACGTCATCCAGGAAATCGTGATGCCGGAAGGCGACCGCTCATTTTCCGGTGCGTTGAAACGCATCGAGCAGATCTGCAGCCGGGTCAGCGTGCCGGTAATCGTCAAGGAAGTGGGCTTCGGGATGTCCAAGGCGAGTGCCGGCAAGCTGTACGAGGCTGGCGCTGCGGCCGTAGATATCGGAGGCTACGGCGGCACTAACTTCAGCAAGATCGAAAACCTGCGCCGCCAACGCCAGATCAGCTTCTTCAACAGCTGGGGCATTAGTACGGCTGCCAGCCTGGCCGAGATCCGCAGCGAGTTCCCGGCCTCGACCATGATCGCTAGCGGCGGTTTGCAGGACGCCCTGGATGTGGCCAAGGCCATCGCGCTGGGCGCCAGCTGCACCGGCATGGCCGGCCATTTCCTGAAAGCCTTGACGGATTCGGGGGAAGAGGGCCTGCTGGAGGAGATTCAGCTGATCCTAGAAGAACTGAAACTGATCATGACCGTGCTGGGTGCCCGGACCATCGCCGACCTGCAAAAAGCGCCCCTGGTGATCAAGGGCGAAACCCACCACTGGCTGACCGAGCGTGGCGTGAACACCTCGTCTTATTCGGTGCGTTAA。

本发明还提供了表达模块，包括：上述基因组合以及可接受的表达元件。

在本发明的一些实施方案中，上述表达模块中所述可接受的表达元件包括：启动子；所述启动子包括：诱导型启动子。

在本发明的一些实施方案中，上述表达模块中所述诱导型启动子包括：JungleExpress和/或nahR/Psal。

在本发明的一些实施方案中，上述表达模块中所述Jungle Express的序列如SEQID NO:10所示：TCAATCCGTAAACAGGTCAAACATCAGTTGCCGCAACCAAATATTGGC TAGGTCCTTGTGGTACTTCGCATGCCAGAACATGTTGATGGCTATTTCAGGCAAGACGACTGGGTGCGGCAAGGCGCTTAGGCCGAAGGGCTCCACGCAGCAGTCGGCTAAACGTATCGGCACAGTGGCGAGCAGATCGGTGCGCTGGAGGATGTGGCCAACGGCGGCGAAGTGCGGCACTTCCAGACGGATGTCGCGCCGGATGCCGACCCGTGTCATGTACGTGTCCACCTCGCCGTGGCCGGTGCCAGCGGCGATGACACGCACGTGGCCGTAGGAACAGAAGCGCTCCAGAGTCAGGGGTTCGCGGGTGACTGGATGGTCCTTGCGACATAGGCACACGTAGTGATTCTGGAGCAGCCGGCGCTGAAAGAAGCCAGTTTGCAGATTGGGAAGCAGGCCCACGGCCAAGTCCACGGTTCCGTTCTGCAAGGCCTGCATCAGGCTCATCGAACTGTCGCGCACCGTACTGATCACGCAATTGGGGGCCTGGTGAGCCAGCACATCCATCAGCCGCGGCATGAAGTAGATCTCGCCAATGTCGGTCATGGCCAGGGTGAAGGTACGCTCGCTGGTCAGCGGATCGAAGCTTTCATGGTGCTGTAGGGCGTTGCGCAGTGCGTGCATGGCCGAAGTGACGGGCTCGGCCAGATGCGCGGCATAGGGTGTGGGTTCCATTCCCTGATGTGTGCGCACGAAGAGTGGGTCCTGTAGCGAGGTGCGCAGGCGTTTCAGCGCATTGCTCACGGCAGGCTGGGTCAGGCCCAGGTTCTCCGCAGTGATAGAGACGCGTCTGTCGACCAGCAACTGGTTGAACACCACCAGCAGGTTTAAATCCAGGTCACGCAGTTCCATGGGGCCTCGCTTGGGTTATTGCTGGTGCCCGGCCGGGCGCAATATTCATGTTGATGATTTATTATATATCGAGTGGTGTATTTATCAATATTGTTTGCTCCGTTATCGTTATTAACAAGTCATCAATAAAGCCATCA。

在本发明的一些实施方案中，上述表达模块中所述nahR/Psal的序列如SEQ IDNO:11所示：TTACGAAAATAACTCAAGCTGAATAACGTGCTGCAGGTGGCGGGTGAATGC GGCATCGTCTACCTCCGGCATTCCCAGCACGTAAATCCCGTCCAGTCCACAGACCAGCGAAATCAGCCGCCAGGCGATATTTTCGGCGCTATCGCGCAGGGTAAATTCGCCAGCGGCATGGCCCGCGCGAATGATCCTGACCGCTTCGTCATGCCACAGGTTCATGGTCAGCAGGTACGCGCTTTTGATTTCCGGATCGCTGTCGGCCAGCAGCTGCGCCTGGCGCCACAGGCGGATATAGGGCTCCAGCCGTCCGTCCTCGCTGCCGAGGGCGGAAAACAGCTGTTCACGCCAGCCGGCGGTGCGCGAAAGGCGCTGCAGATCCATCATCTCGCGGATCACGCGGATAAACGCCTGGGATTTTAGCTCGCCGGAGGAGGTGAAATGGTGGTGGACCTGGCCTGCGGCGACGCCCGCGGCGGTGGCGATGTTGCGGACCGTCATACCGGTAAACCCTTGATCCAGCGCGACGCGCATGGCGGCCTGCATGATGGTTTCCCGACGTTCTTCGCGATTCAGATAGCCCATATTGTCACCTCCTTATCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATGGGGAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCTCTTAAGTAAGTAAGAGTATACGTATATCGGCTAATAACGTATTAAGGCGCTTCGGCGCCTTTTTTTATGGGGGTATTTTCATCCCAATCCACACGTCCAACGCACAGCAAACACCACGTCGACCCTATCAGCTGCGTGCTTTCTATGAGTCGTTGCTGCATAACAAAAAACTGCAAAAAATAGTTTGACAGGACACGTGTCCAACTTTAAGATGTACCCAAAGTTGGACACGTGTCCAACTTTGAATTCAAAAGATCT。

本发明还提供了菌株，在底盘菌株中导入上述表达模块；

所述底盘菌株包括：恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)。

本发明还提供了上述基因组合、上述表达模块和/或上述菌株在制备单萜类化合物中的应用。

在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述单萜类化合物包括：香叶酸。

本发明还提供了单萜类化合物的制备方法，培养上述菌株，获得所述单萜类化合物。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法，包括如下步骤：

S1：将上述菌株的甘油菌接种于含有对应抗生素的6mL LB液体培养基中，180rpm、30℃活化24h，获得第一代活化菌液；

S2：将所述第一代活化菌液于含有对应抗生素的6mL LB液体培养基中再活化24h，获得第二代活化菌液；

S3：将所述第二代活化菌液于含有对应抗生素的6mL LB液体培养基中再活化24h，获得第三代活化菌液；

S4：将所述第三代的活化菌液以起始OD₆₀₀＝0.2接种于含有对应抗生素的50mLM9-Glucose液体培养基中，180rpm、30℃培养3h后加入相应诱导剂，180rpm、30℃培养72h。

在本发明的一些实施方案中，上述制备方法，所述M9-Glucose培养基含有：6g/LNa₂HPO₄、3g/L KH₂PO₄、1.4g/L(NH4)₂SO₄、0.5g/L NaCl、0.2g/L MgSO₄·7H₂O、2.5mL/L traceelements(0.31g/L H₃BO₃、0.05g/L ZnCl₂、0.0256g/L MnSO₄·H₂O、0.2g/LCoCl₂、0.079g/LCuCl₂、0.02g/L NiCl₂·6H₂O和0.0255g/L NaMnO₄)和70mM Glucose。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示恶臭假单胞菌内MEP前体途径以及下游香叶酸合成途径的示意图，蓝色标注的基因为本发明中强化表达或者异源引入的关键基因；其中，dxr基因编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶，ispE基因编码4-焦磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶，ispG基因编码4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸合酶，ispH基因编码4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸还原酶，ispA基因编码法尼基焦磷酸合酶。GSP：3-磷酸甘油醛；PYR：丙酮酸；DXP：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸；MEP：2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸；CDP-ME：4-焦磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇；CDP-MEP：4-焦磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸；MecPP：2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环焦磷酸；HMB-PP：4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸；GPP：香叶基焦磷酸；Geranic acid：香叶酸；

图2示Escherichia coli BL21、Pseudomonas putida KT2440、Yarrowialipolytica PO 1f、Saccharomyces cerevisiae BY4741对不同浓度典型单萜类化合物(1,8-桉油醇、柠檬烯、香叶酸、α-蒎烯)耐受能力测试的滴板实验结果图；

图3示Escherichia coli BL21、Pseudomonas putida KT2440、Yarrowialipolytica PO 1f、Saccharomyces cerevisiae BY4741对不同浓度典型单萜类化合物(香茅醇、香叶醇、芳樟醇、橙花醇)耐受能力测试的滴板实验结果图；

图4示质粒图谱：其中：a为重组质粒pNGG的结构图；b为装载MEP限速酶基因模块载体的结构图，图中以枯草芽孢杆菌基因idi的表达载体为例展示；

图5示导入异源香叶酸合成模块对重组菌香叶酸合成的影响；

图6示强化MEP途径关键限速酶基因对重组菌香叶酸合成及OD₆₀₀的影响。

具体实施方式

本发明公开了合成单萜的基因工程菌及其构建方法与应用。

应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。

应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。

本发明的目的是提供一种重组恶臭假单胞菌基因工程菌，用于合成香叶酸，并提高其产量。

本发明的再一目的是提供所述重组恶臭假单胞菌基因工程菌的构建方法，该方法高效且可操作性强。

本发明的再一目的是提供所述重组恶臭假单胞菌基因工程菌在合成香叶酸的应用。

本发明的目的采用以下技术方案实现：敲除Pseudomonasputida KT2440野生株内切酶编码基因endA、endX，并导入包含异源GPPS和异源GES的香叶酸表达模块，使工程菌获得香叶酸合成能力；引入并筛选不同物种来源的MEP途径限速酶Dxs、IspD、IspF、Idi构建表达模块，以提高香叶酸产量。

在本发明中，所述内切酶编码基因endA的GenBank登录号:AAN68979.1、endX的GenBank登录号：AAN68063.1。所述异源trGPPS来源于大冷杉，异源trGES来源于罗勒，且两者的核苷酸序列均针对恶臭假单胞菌进行了密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ IDNo:1、SEQ ID No:2所示；异源dxs来源于大肠杆菌、耐辐射奇球菌、毛喉鞘蕊花，针对恶臭假单胞菌进行密码子优化后导入，优化后的核苷酸序列如SEQ ID No:3、SEQ IDNo:4、SEQ IDNo:5所示；异源ispD和ispF来源于大肠杆菌，针对恶臭假单胞菌进行密码子优化后导入，优化后的核苷酸序列如SEQ ID No:6、SEQ ID No:7所示；异源idi来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，针对恶臭假单胞菌进行密码子优化后导入，优化后的核苷酸序列如SEQ ID No:8、SEQID No:9所示；内源ispD、ispF来源于恶臭假单胞菌，从基因组扩增后在菌株内进行强化表达，核苷酸序列GenBank登录号：AAN67235.1和GenBank登录号：AAN67239.1。

在本发明中，所述各基因模块中，香叶酸表达模块、MEP限速酶基因表达模块的启动子分别为诱导型启动子Jungle Express、nahR/Psal，序列分别如SEQ ID No:10、SEQ IDNo:11所示。

一些具体实施例中，所述重组恶臭假单胞菌(KNGG)的基因型为KT2440；ΔendA；ΔendX；pNGG

另一些具体实施例中，所述重组恶臭假单胞菌(KSE)的基因型为KT2440；ΔendA；ΔendX；pJ_EcDxs；pNGG

另一些具体实施例中，所述重组恶臭假单胞菌(KDE)的基因型为KT2440；ΔendA；ΔendX；pJ_EcIspD；pNGG

另一些具体实施例中，所述重组恶臭假单胞菌(KFE)的基因型为KT2440；ΔendA；ΔendX；pJ_EcIspF；pNGG

另一些具体实施例中，所述重组恶臭假单胞菌(KIE)的基因型为KT2440；ΔendA；ΔendX；pJ_EcIdi；pNGG

另一些具体实施例中，所述重组恶臭假单胞菌(KSD)的基因型为KT2440；ΔendA；ΔendX；pJ_DrDxs；pNGG

另一些具体实施例中，所述重组恶臭假单胞菌(KSC)的基因型为KT2440；ΔendA；ΔendX；pJ_CfDxs；pNGG

另一些具体实施例中，所述重组恶臭假单胞菌(KIB)的基因型为KT2440；ΔendA；ΔendX；pJ_BsIdi；pNGG

另一些具体实施例中，所述重组恶臭假单胞菌(KDP)的基因型为KT2440；ΔendA；ΔendX；pJ_PpIspD；pNGG

另一些具体实施例中，所述重组恶臭假单胞菌(KFP)的基因型为KT2440；ΔendA；ΔendX；pJ_PpIspF；pNGG。

本发明还提供了如前所述的重组恶臭假单胞菌的构建方法，包括敲除内切酶基因endA、endX，导入包含GPPS和异源GES的香叶酸表达模块，引入并筛选不同物种来源的Dxs、IspD、IspF和Idi这四种MEP途径限速酶基因的步骤。

本发明还提供所述重组菌在生产香叶酸中的应用，包括发酵上述重组菌，得到发酵产物香叶酸的步骤。

本发明提供一种产香叶酸的重组恶臭假单胞菌基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程以及基因工程领域。具体地，本发明选取能够耐受多种单萜化合物的Pseudomonas putida KT2440作为底盘细胞，敲除其内切酶编码基因endA、endX以提高外源基因稳定性；引入异源香叶酸合成模块。在此基础上，通过筛选不同生物来源的关键限速酶基因模块以系统性强化内源2-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway，MEP)代谢通路。经上述代谢强化后，工程菌株成功实现香叶酸的异源生物合成，其产量较原始菌株获得较大提升。本发明首次通过系统性优化MEP途径提升了香叶酸的产量，为微生物法生产单萜类化合物提供了优化方案。

本发明实施例中涉及的培养基具体配方如下：

1、LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，固体培养基添加15g/L琼脂。

2、YPD培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖，固体培养基添加20g/L琼脂。

3、LBS固体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，150g/L蔗糖，15g/L琼脂。

4、M9-Glucose培养基：6g/LNa₂HPO₄，3g/LKH₂PO₄，1.4g/L(NH₄)₂SO₄，0.5g/LNaCl，0.2g/L MgSO₄·7H₂O，2.5mL/Ltrace elements(0.31g/L H₃BO₃，0.05g/L ZnCl₂，0.0256g/LMnSO₄·H₂O，0.2g/L CoCl₂，0.079g/LCuCl₂，0.02g/LNiCl₂·6H₂O，0.0255g/LNaMnO₄)，70mMGlucose。

本发明实施例中涉及的抗生素浓度为：卡那霉素(Km)(50μg/L)、庆大霉素(Gm)(10μg/L)。

本发明实施例中菌株的来源：

Pseudomonasputida KT2440：实验室储存，保藏号为ATCC 47054；

Yarrowia lipolytica PO1f：法国国家农业食品与环境研究院Catherine Madzak博士惠赠，实验室储存，保藏号为ATCC MYA-2613；

Saccharomyces cerevisiae BY4741：实验室储存，保藏号为ATCC 4040002；本发明实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明实施例1～实施例3中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1合成香叶酸工程菌的构建

①、选取单萜合成底盘细胞

目前单萜化合物在微生物宿主中的生产水平普遍较低，单萜化合物的毒性被认为是阻碍其高效微生物生产的主要瓶颈。本发明选取了8种代表性单萜化合物，对常用的几种模式菌株：Escherichia coli BL21、Pseudomonasputida KT2440、Yarrowia lipolyticaPO1f、Saccharomyces cerevisiaeBY4741对单萜类化合物的耐受能力进行了检测，以筛选出最佳的单萜合成底盘细胞。具体方法如下：

将E.coli BL21、P.putida KT2440的甘油菌接种于6mLLB液体培养基中，分别以180rpm、30℃和180rpm、37℃的培养条件活化24h，取过夜活化菌液于6mLLB液体培养基中再活化24h；

将Y.lipolytica PO1f的甘油菌接种于6mLYPD液体培养基中，180rpm、30℃的培养条件活化24h，取过夜活化菌液于6mLYPD液体培养基中再活化24h；将S.cerevisiae BY4741的甘油菌接种于6mLYPD液体培养基中，180rpm、30℃的培养条件活化24h，取过夜活化菌液于YPD固体平板上划线，取单克隆于于6mLYPD液体培养基中，180rpm、30℃的培养条件活化24h。

取各自对应的活化菌液以起始OD₆₀₀＝0.6稀释到10^-3、10^-4、10^-5、10^-6在不同浓度的单萜平板上进行滴板实验。测试的单萜化合物为：柠檬烯(Limonene)、α-蒎烯(α-pinene)、香茅醇(Citronellol)、橙花醇(Nerol)、1，8-桉油醇(1,8-Cineole)、芳樟醇(Linalool)、香叶酸(Geranic acid)、香叶醇(Geraniol)，测试的浓度为：0％(v/v)、0.01％(v/v)、0.1％(v/v)、1％(v/v)、5％(v/v)，其中，香叶酸、香茅醇、香叶醇、芳樟醇、橙花醇以二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)为溶剂配置不同浓度的单萜平板，设置LB/YPD平板为空白对照，含有等体积DMSO的LB/YPD平板作为0％(v/v)的单萜平板；1,8-桉油醇、柠檬烯、α-蒎烯由于无法溶于DMSO，直接将对应体积的标准品加入LB或YPD中配置单萜平板，设置LB/YPD平板作为0％(v/v)的单萜平板。

E.coliBL21、P.putida KT2440于含有上述不同浓度的单萜化合物的LB平板上进行滴板实验，培养温度分别为37℃、30℃；Y.lipolytica PO1f、S.cerevisiaeBY4741于含有上述不同浓度的单萜化合物的YPD平板上进行滴板实验，培养温度为30℃。

滴板实验结果表明(如图2和图3所示)，相较于常用的模式菌株(如E.coli BL21、Y.lipolytica PO1f和S.cerevisiaeBY4741)，P.putida KT2440对柠檬烯、α-蒎烯、香茅醇、橙花醇、芳樟醇、1,8-桉油醇、香叶酸和香叶醇均表现出更强的耐受性。这一特性为克服单萜合成中的关键瓶颈-单萜的细胞毒性-提供了解决方案。因此，本发明选择P.putidaKT2440作为单萜合成的底盘细胞。

②、恶臭假单胞菌底盘细胞的优化

本发明采取同源重组方法进行基因敲除。敲除野生株KT2440的内切酶I编码基因endA(GenBank登录号:AAN68979.1)、细胞外DNA内切酶编码基因endX(GenBank登录号：AAN68063.1)以提高后续导入的外源基因的稳定性。

1、敲除载体的构建

以P.putida KT2440甘油菌为模版，PCR扩增待敲除基因endA、endX的上下游同源臂，长度约1000bp，割胶回收得到同源臂片段。引物序列如表1中所示，其中：扩增基因endA上下游同源臂的引物分别为endA-up-kz-F/endA-up-kz-R、endA-down-kz-F/endA-do wn-kz-R，扩增基因endX上下游同源臂的引物分别为endX-up-kz-F/endX-up-kz-R、endX-down-kz-F/endX-down-kz-R。利用限制性内切酶FastDigest EcoR I、FastDigest HindⅢ对pK18mobsacB质粒进行双酶切，割胶回收线性化质粒。利用CloneExpressⅡ试剂盒连接上下游同源臂和线性化pK18mobsacB载体，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，挑取转化子，PCR并测序验证，得到敲除载体pK18ΔendA、pK18ΔendX。验证引物为敲除载体通用引物，对应表1中的pK18mobsacB-yz-F/pK18mobsacB-yz-R。

2、菌株KTΔendAΔendX的构建

将敲除载体pK18ΔendA转化至P.putida KT2440中，利用同源重组进行基因敲除，得到菌株KTΔendA。将敲除载体pK18ΔendX转化至KTΔendA中，利用同源重组进行基因敲除，得到菌株KTΔendAΔendX。具体方法如下：

P.putida KT2440于LB液体培养基中过夜活化。再取过夜活化菌液以1％接种量于LB液体培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6时制备电转感受态。取500ng的敲除质粒加入感受态细胞中，电转条件为1.2kv，4.0ms，孵育后于卡那霉素平板上过夜培养，挑取转化子，PCR验证是否发生单侧同源臂交换。

验证引物如表1中所示，验证在endA基因上游发生单交换的引物为endA-up-yz-F/end A-up-yz-R，下游发生单交换的引物为endA-down-yz-F/endA-down-yz-R；验证在endX基因上游发生单交换的引物为endX-up-yz-F/endX-up-yz-R，下游发生单交换的引物为endX-dow n-yz-F/endX-down-yz-R。

将发生单交换的转化子以1％接种量于LB液体培养基中过夜培养，取稀释后的菌液涂布于LBS平板上，挑选出具有蔗糖抗性而不具有卡那霉素抗性的转化子，PCR并测序验证是否为发生了双侧同源臂交换的敲除株。验证引物如表1中所示，验证endA基因敲除的引物为endA-up-yz-F/endA-down-yz-R，验证endX基因敲除的引物为endX-up-yz-F/endX-down-yz-R。

③、香叶酸合成模块的构建

1、相关基因元件的获得

委托金斯瑞生物科技有限公司对大冷杉Abies grandis的基因GPPS(GenBank登录号：AAN01134.1)、罗勒Ocimum basilicum基因GES(GenBank登录号：AY362553.1)进行密码子优化后人工合成DNA序列，再将DNA序列亚克隆至克隆载体pUC57(金斯瑞生物科技有限公司)中，得到质粒pUC57_GPPS、pUC57_GES。委托金斯瑞生物科技有限公司对nahR/Psal启动子序列进行人工合成。

以单胞菌自杀性质粒pJQ200SK为模版，PCR扩增得到庆大霉素抗性基因Gm^R。所用引物为表1中的Gm^R-kz-F/Gm^R-kz-R。

2、香叶酸合成载体pNGG的构建

重组质粒pNGG是以更换抗性基因为Gm^R的广宿主穿梭质粒pSEVA121为骨架，插入了nahR/Psal-trGPPS2-trGES的表达盒。重组质粒pNGG的结构见图4的a。

以浙江大学王宝俊老师教授惠赠的广宿主穿梭质粒pSEVA121(Wan X,Pinto F,YuL,Wang B.Synthetic protein-binding DNA sponge as a tool to tune geneexpression and mitigate protein toxicity.Nat Commun.2020Nov 24；11(1):5961.doi:10.1038/s41467-020-19552-9.)为模板进行PCR扩增，割胶回收得到线性化的pSEVA121载体骨架。线性化pSEVA121的扩增引物为表1中的pR-kz-F/pR-kz-R。利用CloneExpressⅡ试剂盒(诺唯赞)连接线性化载体骨架与Gm^R基因，将连接产物转入E.coliDH5α感受态细胞，挑取转化子，PCR并测序验证，得到质粒pRG。所用验证引物为表1中的pRG-yz-F/pRG-yz-R。

以上述质粒pRG为模板进行PCR扩增，割胶回收得到线性化的pRG载体骨架。线性化pRG的扩增引物为表1中的pRG-kz-F/pRG-kz-R。

以质粒pUC57_GPPS为模版，根据截短N端86个氨基酸残基同时加入起始密码子的序列设计表1中的扩增引物trGPPS-kz-F/trGPPS-kz-R，PCR扩增后割胶回收得到截短后的trGPPS基因。以质粒pUC57_GES为模版，根据截短N端66个氨基酸残基同时加入起始密码子的序列设计表1中的扩增引物trGES-kz-F/trGES-kz-R，PCR扩增后割胶回收得到截短后的trGES基因。

利用CloneExpressⅢ试剂盒连接上述trGPPS基因、trGES基因与线性化的pRG载体骨架连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，挑取转化子，PCR并扩增测序验证，得到质粒pGG。所用验证引物为表1中的pGG-yz-F/pGG-yz-R。委托金斯瑞生物科技有限公司将包含nahR/Psal启动子序列合成后插入到质粒pGG中trGPPS基因的5’端，得到香叶酸合成表达载体pNGG。

④、合成香叶酸的恶臭假单胞菌的构建

将香叶酸合成表达载体pNGG转化至菌株KTΔendAΔendX中，得到重组菌KNGG。

具体方法如下：

将上述获得的P.putida KTΔendAΔendX于LB液体培养基中过夜活化。再取过夜活化菌液以1％接种量于100mLLB液体培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6时制备电转感受态。取500ng的pNGG加入感受态细胞中，电转条件为1.2kv，4.0ms，孵育后于庆大霉素平板上过夜培养，挑取转化子，PCR并验证测序，得到重组菌KNGG。所用验证引物为表1中的pGG-yz-F/pGG-yz-R。

实施例2强化MEP途径限速酶的重组香叶酸工程菌的构建

本发明选取了枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、耐辐射奇球菌、毛喉鞘蕊花等不同物种来源的MEP途径的dxs、ispD、ispF、idi四个关键限速酶基因模块，通过强化这些异源的限速酶基因以及P.putida KT2440内源的关键酶基因，来改造香叶酸前体合成的MEP途径，以提升香叶酸的合成。装载MEP限速酶基因模块的重组质粒是以更换复制子元件为pBBR1、更换抗性基因为Km^R的广宿主穿梭质粒pSEVA121为骨架，插入了Jungle Express-MEP限速酶关键基因的表达盒。装载MEP限速酶基因模块载体的结构如图4的b所示，图中以枯草芽孢杆菌基因idi的表达载体为例展示，其他不同物种来源的MEP限速酶基因载体用相应核苷酸序列替代图中枯草芽孢杆菌基因idi片段即可，具体结构图在此不再赘述。

①、装载不同来源限速酶基因模块载体的构建

以pBBR1MCS2质粒为模版进行PCR扩增，割胶回收得到pBBR1复制子元件。所用扩增引物为表1中的pBBR1-kz-F/pBBR1-kz-R。利用CloneExpressⅡ试剂盒连接实施例1中的线性化的pSEVA121载体骨架与pBBR1复制子元件，将连接产物转入E.coliDH5α感受态细胞，挑取转化子，PCR并验证测序，得到质粒pBA。所用验证引物为表1中的pBA-yz-F/pBA-yz-R。以上述pBA质粒为模版进行PCR扩增，割胶回收得到线性化pBA的载体骨架。所用扩增引物为表1中的pK-kz-F/pK-kz-R。

以实验室保藏的pHGR18670质粒(Wang X,Wang L,Wang Y,Fu X,Wang X,Wu H,Wang H,Lu Z.sRNA molecules participate in hyperosmotic stress responseregulation in Sphingomonas melonis TY.Appl Environ Microbiol.2024Feb 21；90(2):e0215823.doi:10.1128/aem.02158-23.Epub 2024Jan 30.)为模版进行PCR扩增，割胶回收得到卡那霉素抗性基因Km^R。所用扩增引物为表1中的Km^R-kz-F/Km^R-kz-R。利用CloneExpressⅡ试剂盒连接线性化pBA载体骨架与Km^R基因，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，挑取转化子，PCR并验证测序，得到质粒pBK。所用验证引物为表1中的pBK-yz-F/pBK-yz-R。

委托金斯瑞生物科技有限公司将包含Jungle Express启动子序列合成后插入到质粒pBK中SpeⅠ酶切位点的5’端，得到载体pJ。

委托金斯瑞生物科技有限公司对于大肠杆菌E.coli K12 MG1655的基因dxs(GeneID：945060)、基因ispD(GeneID：948269)、基因ispF(GeneID：945057)、基因idi(GeneID：949020)，耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans的基因dxs(GeneID：1800297)，毛喉鞘蕊花Coleusforskohlii的基因dxs(GenBank登录号：KP889115.1)，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168的基因idi(GeneID：938985)进行密码子优化后人工合成DNA序列，依次将DNA序列亚克隆至载体pJ中，得到质粒pJ_EcDxs、pJ_EcIspD、pJ_EcIspF、pJ_EcIdi、pJ_DrDxs、pJ_CfDxs、pJ_BsIdi。

根据NCBI上提供的P.putida KT2440中的ispD基因(GenBank登录号：AAN67235.1)、ispF基因(GenBank登录号：AAN67239.1)的核苷酸序列，以P.putida KT2440甘油菌为模版分别扩增ispD、ipF基因，割胶回收得到基因片段。所用扩增引物依次为表1中的PpIspD-kz-F/PpIspD-kz-R、PpIspF-kz-F/PpIspF-kz-R。以pJ为模板进行PCR扩增，割胶回收得到线性化的pJ载体骨架。所用扩增引物为表1中的pJ-kz-F/pJ-kz-R。利用CloneExpressⅡ试剂盒分别连接线性化载体骨架与ispD、ipF基因，将连接产物分别转入E.coli DH5α感受态细胞，挑取转化子并测序验证，得到质粒pJ_PpIspD、pJ_PpIspF。所用验证引物为pJ上的通用验证引物，对应表1中的pJ-yz-F/pJ-yz-R。

②、强化MEP关键限速酶基因的香叶酸工程菌的构建

将不同来源限速酶的表达载体pJ_EcDxs、pJ_EcIspD、pJ_EcIspF、pJ_EcIdi、pJ_DrDxs、pJ_CfDxs、pJ_BsIdi、pJ_PpIspD、pJ_PpIspF以及空载pJ分别转化至实施例1获得的重组菌KNGG中，依次得到重组菌KSE、KDE、KFE、KIE、KSD、KSC、KIB、KDP、KFP以及空白对照菌株KCK。具体方法如下：

重组菌KNGG甘油菌于含有庆大霉素的LB液体培养基中过夜活化。再取过夜活化菌液以1％接种量于100mL含有庆大霉素的LB液体培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6时制备电转感受态。分别取500ng的pJ_EcDxs、pJ_EcIspD、pJ_EcIspF、pJ_EcIdi、pJ_DrDxs、pJ_CfDxs、pJ_BsIdi、pJ_PpIspD、pJ_PpIspF、pJ加入感受态细胞中，电转条件为1.2kv，4.0ms，孵育后于含有卡那霉素、庆大霉素平板上过夜培养，挑取转化子，利用表中对应的引物PCR并验证测序，得到重组菌KSE、KDE、KFE、KIE、KSD、KSC、KIB、KDP、KFP以及空白对照菌株KCK。所用验证引物为pJ上的通用验证引物，对应表1中的pJ-yz-F/pJ-yz-R。

表1引物序列

实施例3重组工程菌的摇瓶发酵与产物的提取和测定

①、重组菌的发酵及产物提取

分别采用初始实施例1中的重组菌KNGG和空白对照菌株KTΔendAΔendX，实施例2中的重组菌KSE、KDE、KFE、KIE、KSD、KSC、KIB、KDP、KFP以及空白对照菌株KCK发酵生产香叶酸。具体方法如下：

将重组菌的甘油菌接种于含有对应抗生素的6mL LB液体培养基中，180rpm、30℃活化24h，获得第一代活化菌液；取第一代活化菌液于含有对应抗生素的6mL LB液体培养基中再活化24h，获得第二代活化菌液；取第二代活化菌液于含有对应抗生素的6mL LB液体培养基中再活化24h，获得第三代活化菌液。取第三代的活化菌液以起始OD ₆₀₀＝0.2接种于含有对应抗生素的50mL M9-Glucose液体培养基中，180rpm、30℃培养3h后加入相应诱导剂，180rpm、30℃培养72h。发酵结束后，先取40μL发酵液稀释至合适浓度于紫外分光光度计(UV-3100)测定OD₆₀₀，再于剩余发酵液中加入50mL无水乙醇，混匀后取1mL发酵液于1.5mL离心管中，14800rpm离心2分钟，取上清液备用。

其中，各重组菌对应的诱导剂为：KTΔendAΔendX，不添加诱导剂，作为空白对照；重组菌KNGG，不添加诱导剂/加入0.2mM水杨酸钠，水杨酸钠浓度依次对应诱导型启动子nahR/Psal本底水平、高强度表达；重组菌重组菌KSE、KDE、KFE、KIE、KSD、KS C、KIB、KDP、KFP以及空白对照菌株KCK，加入0.2mM水杨酸钠以及0.05μM/0.1μM/0.75μM结晶紫，结晶紫浓度依次诱导Jungle Express启动子调控限速酶基因低、中、高强度表达。

②、香叶酸的定性定量分析

配制香叶酸标准品(购于Sigma)的50％乙醇溶液。将各重组菌发酵后用乙醇处理并收集的上清液用0.45μm PES滤膜过滤，产物用HPLC检测。色谱柱为HC C-18，流动相为乙腈：水(含0.5％(v/v)3M磷酸)＝55:45(v:v)；香叶酸测定波长为217mm；温度为30℃；流速为1mL/min。

结果表明(如图5所示)，异源香叶酸模块成功赋予了工程菌香叶酸合成能力，初始菌株KNGG发酵72h后合成了3.20mg/L香叶酸。

结果表明(如图6所示)，通过工程化强化MEP途径的关键限速酶(PpIspD、EcIsp D、PpIspF、EcIspF或BsIdi)，均能提高香叶酸的产量。其中，最佳的MEP限速酶基因模块分别为：来源于枯草芽孢杆菌的idi基因(重组菌KIB)、恶臭假单胞菌内源的ispF基因(重组菌KFP)以及大肠杆菌来源的ispD基因(重组菌KDE)。发酵72h后，KIB、KFP和KDE菌株的香叶酸产量分别达到23.22mg/L、18.95mg/L和7.18mg/L。表现最优的工程菌株KIB的产量(23.22mg/L)相比初始菌株KNGG(3.20mg/L)实现了6.3倍的提升。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.基因组合，其特征在于，包括：内源基因和外源基因；